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Julio-diciembre de 2004UNIVERSITAS SCIENTIARUMRevista de la Facultad de CienciasPONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Vol. 9, No. 2, 43-48

FORMACIÓN DE PORO EN MEMBRANA CELULAR PORMEDIO DE LA PEQUEÑA GLICOPROTEÍNA DE

SECRECIÓN DEL VIRUS DE EBOLA ZAIRE

Nury EsperanzaVargas-Alejo1; Clara Andrea Rincón-Cortés1;Edgar Antonio Reyes-Montaño2

1 Facultad de Ciencias y Educación, Proyecto Curricular de Licenciatura en Química,KR 3 N° 26-40, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá D.C.

2 Facultad de Ciencias, Departamento de Bioquímica y Nutrición, Grupo de Investigación BioquímicaComputacional y Estructural, Pontificia Universidad Javeriana

Cra. 7ª N° 42-27, Bogotá D.C.

ereyes@javeriana.edu.co; rinconc@javeriana.edu.co

RESUMEN

Uno de los patógenos capaces de inducir fiebres hemorrágicas es el virus de Ebola, clasificado en lafamilia filoviridae con cuatro subtipos, de los cuales el más analizado es el subtipo de Ebola Zaire,identificando en su genoma siete proteínas estructurales y una de secreción denominada pequeñaglicoproteína de secreción del virus de Ebola Zaire.

Utilizando las herramientas de bioinformática y los diferentes estudios realizados al virus de Ebola Zairea escala estructural y funcional, se logró predecir la estructura terciaria de su pequeña glicoproteína desecreción (SSGP EBO-Z). Basados en esta estructura se generó un posible modelo del mecanismo deentrada del virus de Ebola Zaire a la célula huésped, donde juegan un papel importante los receptores yligandos de la membrana celular; permitiendo a la vez explicar los daños patológicos encontrados en lospacientes.

Palabras clave: bioinformática, célula, estructura, glicoproteína, ligando, proteína, receptores, virus

ABSTRACT

One of the pathogens able to produce haemorrhagic fevers is Ebola virus, classified in the Filovirideaefamily, which has four sub-types, the most analyzed of which is the Zaire sub-type. The genome of thisvirus contains the information of seven structural proteins and one non-structural glycoprotein calledSmall Secretion Glycoprotein of the Ebola Zaire virus (SSGP). Using bioinformatic tools and previousstudies about the Ebola virus, we predicted the tertiary structure of the small secretion glycoprotein (SSGPEBO-Z), and based on that, we generated a model to explain the mechanism by which the virus enters hostcells, where receptors of the cell surface play an important role. This provided an explanation for thesymptoms and pathological damage found in patients.

Key words: bioinformatics, cell, glycoprotein, protein, receivers, structure, tiing, virus

INTRODUCCIÓN

Las fiebres hemorrágicas son producidaspor varios patógenos virales, uno de estos

es el virus de Ebola (EBO); clasificado enla familia Filoviridae, con un solo géneroFilovirus, perteneciente al ordenMononegaviral. De este virus se han esta-

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blecido cuatro subespecies: Ebola Sudan,Ebola Reston, Ebola Zaire y Ebola Tai(Caddell et al., 1997).

Estos virus producen una enfermedad quese ha encontrado en humanos y primates,presentando una mortalidad entre el 50 y90% de las personas infectadas (Volchkovet al., 1998).

El genoma del virus de Ebola consiste enuna cadena negativa de RNA simple nosegmentada (NNS-RNA) no poliadenilada,con un arreglo lineal de genes y con ocu-rrencia de solapamientos. El orden delgenoma es: 3’-región sin traducir,Nucleoproteína (NP), Proteína Viral estruc-tural VP35, VP40, Glicoproteína (GP), VP30,VP24, Polimerasa L, 5’- región sin traducir.Con respecto a su GP, se caracteriza por seruna proteína de superficie, sintetizadacomo una molécula precursora que estáunida a dos subunidades, la GP

1 y la GP

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probablemente asociadas por enlacedisulfuro, su gen es el cuarto (de siete) pre-sentando dos marcos abiertos de lectura(ORFs); el cual produce una proteína desecreción, denominándose “PequeñaGlicoproteína de Secreción no Estructuraldel virus de Ebola (SSGP)” reportada porSánchez con el número accessionAAC57990 (Sánchez et al., 1998).

La estructura secundaria y posible funciónde la SSGP se logró establecer en el año de1999 cuando Reyes y Lareo de la PontificiaUniversidad Javeriana de Colombiautilizaron las herramientas de BiologíaMolecular Computacional, para la identi-ficación de las características de la SSGP.

METODOLOGÍA

Una de las necesidades primordiales parael desarrollo de este trabajo es hallar la se-cuencia de aminoácidos o estructura pri-maria de la SSGP-EBOZ, la cual se obtienepor medio de su código de accession

AAC57990. Una vez obtenida la secuenciacorrespondiente de la SSGP-EBOZ realizarel alineamiento por medio de BLASTP,determinando las secuencias de aminoácidosproteínas con mayor similaridad a SSGP-EBOZ. Posteriormente con base a los resul-tados obtenidos en BLASTP predecircaracterísticas estructurales como el pesomolecular, punto isoeléctrico, péptido se-ñal, su comportamiento hidrofóbico y ac-cesible y los motivos funcionales (Printy Block) tanto para la SSGP-EBOZ comopara sus proteínas similares determinadasanteriormente, por medio de Expasy yMotif respectivamente, seleccionando lasproteínas con mayor similaridad a la SSGP-EBOZ.

Posteriormente con ayuda de las proteínasmás similares al SSGP-EBOZ, predecir suestructura tridimensional, identificando losdominios que posean interacciones con losreceptores de membrana celular, y así ge-nerar y/o plantear un posible mecanismode entrada y posterior infección del virusEbola - Zaire a la célula huésped, destacan-do el papel de la SSGP-EBOZ.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La secuencia usada de la PequeñaGlicoproteína de Secreción del Virus deEbola Zaire en está investigación es la re-portada por Anthony Sánchez, la cual cons-ta de 364 aminoácidos, identificando elpéptido señal, para obtener la proteína ma-dura que consta de 338 aminoácidos, conun peso molecular de 38KDa, un puntoisoeléctrico de 8,98 y mostrando diferen-tes comportamientos de hidrofobicidad yaccesibilidad a lo largo de su estructura.

El siguiente paso fue la determinación debloques y prints, posteriormente se realizóuna selección de las proteínas con mayorsimilaridad a SSGP-EBO-Z, teniendo encuenta, la cantidad de aminoácidos, pe-sos moleculares, puntos isoeléctrico,

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hidrofobicidad, accesibilidad, alineamientoen Laling, bloques y dominios de cada unade las proteínas.

En el diseño de la posible estructuratridimensional de la SSGP EBO-Z se reali-zó con la búsqueda de la estructuratridimensional de cada uno de los segmen-tos más similares por medio de SwissModel. Posteriormente se realizaron mu-taciones correspondientes a cada uno deestos segmentos a través de SwisPDB-Viwer, en el cual también se logró unircada segmento hasta obtener la estructuratridimensional de la SSGP EBO-Z comple-ta (figura 1).

Teniendo como base la posible estructuratridimensional (3D) de SSGP EBO-Z, sepuede observar cómo se conservan las pro-piedades de accesibilidad e hidrofobicidadconfirmándose en la estructura 3D ya queen esta región se observan hélices alfa ex-plicando este comportamiento. Mientrasque los aminoácidos más accesibles sonpredominantemente expuestas al medio,confirmándose que su estructura 3D es prin-cipalmente en los extremos hojas beta yVueltas al Azar. Reafirmándose la predic-ción de la estructura secundaria, donde lamayor parte de las secuencias tiene tenden-cia a hojas beta y en la parte central hélicesalfa (Reyes et al., 1999).

Con base en la posible estructura 3D deSSGP EBO-Z se puede predecir un me-canismo de entrada del virus de EbolaZaire a célula huésped mediado por estaglicoproteína, debido a que en su estructu-ra se presentan varios dominios o seg-mentos que ayudan al mecanismo de lainteracción con membrana, los cuales son(figura 2):

1. Reconocimiento, unión al receptor dela matriz extracelular e inactactivacióndel factor de crecimiento endotelial porparte del dominio de desintegrina.

2. Formación del complejo CTLA-4, elcual desvía e inhibe la respuesta inmu-ne de la célula huésped.

3. Interacción de los dominios de integrinacon los receptores de la membrana ce-lular permitiendo la desestabilizaciónde la laminina.

4. Perforación de la membrana celular porparte del dominio de citolisina.

5. Una vez abierto el poro se permite laentrada del virus y la fácil movilizacióndentro de la célula por la desestabiliza-ción de la laminina.

6. Activación del factor de crecimientoendotelial, y posterior cierre del poropor parte del dominio de desintegrina.

7. Llegada del virus al sitio de replicaciónuniéndose al RNA mensajero del hués-ped por interacción con los extremoscohesivos.

8. Se producen varias copias del virus, elcual utiliza la membrana celular delhuésped para poder infectar otras célu-las sin ser atacado por el sistema in-mune del huésped, ayudado por lasinteracciones celulares en el tejido.

9. Separación celular por medio del descen-so en el nivel de cadherina y grave dañoal tejido, debido a la alteración de losreceptores celulares modificando así elmecanismo de coagulación sanguínea.

10.Manifestaciones clínicas. Reflejándo-se con hemorragia, fiebre, epidermolosisampollosa, daño hepático, renal,vascular y en la retina ocular, debido ala separación celular en los tejidos.

Según las funciones establecidas para cadadominio presente en la posible estructuratridimensional de SSGP EBO-Z se puedecomprobar su acción: como desintegrinaal separar las células entre sí, como una

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citolisina al encontrar células “fantasmas”y espacios sin ninguna célula en un campovisual (foto 1), su acción sobre cualquiertipo de célula sin ser específica (Reyes etal., 1999), puede interactuar con el sistemainmune a un nivel celular y humoral, don-de los anticuerpos de alta afinidad son diri-gidos contra la porción NH

2-Terminal de la

GP (Sánchez et al., 1996).

CONCLUSIÓN

Cada uno de los dominios pertenecientes ala estructura tridimensional de la SSGPEBO-Z, desempeñan conjuntamente fun-ciones específicas que permiten la entradadel virus a la célula huésped y la poste-rior infección ya que funcionan comointegrinas, citolisinas, desintegrina, factorde crecimiento y su capacidad de formarun complejo con los linfocitos citotóxicosT, por lo cual las manifestaciones clínicasdebido a la infección por este virus puedenser ocasionadas por su proteína de secre-ción.

AGRADECIMIENTOS

A Leonardo Lareo, por la colaboración pres-tada durante el desarrollo del trabado, igual-mente el grupo de investigación BioquímicaEstructural Computacional y Bioinformá-tica de la Facultad de Ciencias, PontificiaUniversidad Javeriana, por su interés fren-te al tema, por último al proyecto curricularde Licenciatura en Química de la Facultadde Ciencias y Educación, por capacitarnosy llevar a cabo este trabajo en la Universi-dad Distrital Francisco José de Caldas.

LITERATURA CITADA

CADDELL, A. 1997. Ebola WHO Press Release.Heslth Communications and Public

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REYES, E.; LAREO L. 1999. Predicción de es-tructura y función de la pequeñaglicoproteína de secreción del virusde Ebola. Tesis de maestría. PontificiaUniversidad Javeriana, Bogotá, Co-lombia.

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Recibido: 17-09-2004Aceptado: 18-08-2004

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FIGURA 1. Primera estructuratridimensional propuesta de laSSGP EBO-Z.

Color negro indica las hojas beta,color gris las hélices alfa, gris y ne-gro intercalado indican las vueltasal azar

A. Acción del dominio de desintegrina. B. Formación del complejo CTLA-4.

C. Acción del dominio de integrina D. Acción de la citolisina.

FIGURA 2. Mecanismo de entrada del virus de Ebola Zaire a célula huésped, mediadopor la SSGP BO-Z.

E. Entrada del virus Ebola Zaire a la célula huésped.

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FOTO 1. Acción sobre la SSGP EBO-Z sobre cultivos celulares En la foto se muestra cultivocelular VERO, procedente de riñón mono verde africano. Izquierda se observa un cultivocelular sin la expresión de la proteína y a la derecha el efecto producido por la proteína enel cultivo. (Reyes et al., 1999).