UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS -...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

RAFAELA DA SILVA MARINELI CAMPOS

EVALUATION OF CHIA SEED AND OIL (SALVIA HISPANICA L.) POTENTIAL IN

THE PREVENTION AND TREATMENT OF OBESITY AND COMORBIDITIES

INDUCED BY HIGH FAT AND HIGH CARBOHYDRATE DIET IN VIVO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DA SEMENTE E DO ÓLEO DE CHIA (SALVIA

HISPANICA L.) NA PREVENÇÃO E NO TRATAMENTO DA OBESIDADE E

COMORBIDADES INDUZIDAS POR DIETA HIPERLIPÍDICA E HIPERGLICÍDICA

IN VIVO

CAMPINAS

2016

RAFAELA DA SILVA MARINELI CAMPOS

EVALUATION OF CHIA SEED AND OIL (SALVIA HISPANICA L.) POTENTIAL IN

THE PREVENTION AND TREATMENT OF OBESITY AND COMORBIDITIES

INDUCED BY HIGH FAT AND HIGH CARBOHYDRATE DIET IN VIVO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DA SEMENTE E DO ÓLEO DE CHIA (SALVIA

HISPANICA L.) NA PREVENÇÃO E NO TRATAMENTO DA OBESIDADE E

COMORBIDADES INDUZIDAS POR DIETA HIPERLIPÍDICA E HIPERGLICÍDICA

IN VIVO

Thesis presented to the Faculty of Food Engineering of the

University of Campinas in partial fulfillment of the

requirements for the degree of Doctor in Food and

Nutrition, in the area of Experimental Nutrition applied to

Food Technology.

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos

da Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em

Alimentos e Nutrição, na Área de Nutrição Experimental e

Aplicada à Tecnologia de Alimentos.

Prof. Dr. MÁRIO ROBERTO MARÓSTICA JUNIOR

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR RAFAELA DA SILVA MARINELI CAMPOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. MÁRIO ROBERTO MARÓSTICA JUNIOR.

CAMPINAS

2016

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/23813-4

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosClaudia Aparecida Romano - CRB 8/5816

Campos, Rafaela da Silva Marineli, 1986- C157e CamEvaluation of chia seed and oil (Salvia Hispanica L.) potential in the

prevention and treatment of obesity and comorbidities induced by high fat andhigh carbohydrate diet in vivo / Rafaela da Silva Marineli Campos. – Campinas,SP : [s.n.], 2016.

CamOrientador: Mario Roberto Marostica Junior. CamTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Engenharia de Alimentos.

Cam1. Chia. 2. Ácidos graxos ômega-3. 3. Obesidade. 4. Estresse oxidativo. 5.

Resistência à insulina. I. Marostica Junior, Mario Roberto. II. UniversidadeEstadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Avaliação do potencial da semente e do óleo de chia (SalviaHispanica L.) na prevenção e no tratamento da obesidade e comorbidades induzidas pordieta hiperlipídica e hiperglicídica in vivoPalavras-chave em inglês:ChiaOmega-3 fatty acidsObesityOxidative stressInsulin resistanceÁrea de concentração: Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de AlimentosTitulação: Doutora em Alimentos e NutriçãoBanca examinadora:Mario Roberto Marostica Junior [Orientador]Júlia Laura Delbue BernardiMariana Battaglin Villas Boas AlvaroRenato GrimaldiStanislau Bogusz JuniorData de defesa: 16-05-2016Programa de Pós-Graduação: Alimentos e Nutrição

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Junior (Orientador)

Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP

Prof. Dr. Renato Grimaldi (Titular)


Prof. Dr. Stanislau Bogusz Junior (Titular)

Instituto de Química de São Carlos – USP

Prof. Dra. Júlia Laura Delbue Bernardi (Titular)

Faculdade de Nutrição – PUC CAMPINAS

Prof. Dra. Mariana Battaglin Villas Boas Alvaro (Titular)

Faculdade de Nutrição - UNIP

Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado (Suplente)


Prof. Dra. Elisa de Almeida Jackix (Suplente)

Faculdade de Nutrição – PUC CAMPINAS

Prof. Dra. Glaucia Maria Pastore (Suplente)


A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do aluno

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e tudo que sou.

À minha Mãe, pelo amor, incentivo e apoio incondicional.

Ao meu pai pela educação e empenho à minha formação.

Ao meu marido, pelo amor, apoio e paciência.

À minha irmã, pelo apoio e admiração.

Ao Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Jr, pela orientação e por todo ensinamento e

estímulo ao desenvolvimento das minhas habilidades e competências para a

pesquisa.

Às minhas queridas amigas e parceiras nestes anos de trabalho, Érica Aguiar

Moraes e Sabrina Alves Lenquiste, por todos os momentos vividos, pelas alegrias

das conquistas, pelo ombro amigo nos momentos mais difíceis, pelas longas

conversas, viagens, e principalmente pela amizade construída. Sentirei saudades!

À Dra. Soely Maria Pissini Machado Reis, pelo apoio técnico, ajuda, profissionalismo

e amizade durantes todos esses anos.

À Maria Susana Corrêa Alves da Cunha por todo auxílio técnico indispensável

durante os ensaios biológicos.

À aluna de Iniciação Científica, Marcela Perez, pelo estágio prestado e ajuda

durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Laboratório do Pâncreas Endócrino do Instituto de Biologia, em especial

Everardo Magalhães Carneiro e seus alunos pela assistência nas análises

desenvolvidas em parceria.

Ao Laboratório de Óleos e Gorduras, em especial ao Prof. Dr. Renato Grimaldi pelos

ensinamentos e assistência nas análises dos óleos.

Ao Prof. Dr. Stanislau Bogusz Junior, pelos ensinamentos, apoio, dedicação e por

todo auxílio técnico nas análises desenvolvidas em parceria.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pela

concessão do auxílio financeiro.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela

bolsa de estudos concedida.

Aos membros da Banca Examinadora pelas sugestões e críticas convenientes ao

aprimoramento do Trabalho.

Aos amigos do grupo de pesquisa ―Compostos Bioativos, Nutrição e Saúde‖, pelos

momentos alegres e difíceis convividos.

A todos os colegas e funcionários do Departamento de Alimentos e Nutrição que

contribuíram de forma importante para a realização desse Trabalho.

Aos amigos e família que de uma forma ou de outra estavam sempre presentes e

interessados, incentivando o meu crescimento profissional e torcendo pelo meu

sucesso.

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), pela oportunidade de realizar

este sonho.

A todos que contribuíram para a execução de mais esta etapa em minha vida.

― Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina ‖

(Cora Coralina)

― Não tenha medo do caminho, tenha medo de não caminhar ‖

(Augusto Cury)

" Ninguém é tão grande que não possa aprender, nem tão pequeno que não possa

ensinar "

(Esopo)

RESUMO

A diversidade de compostos bioativos presentes nos alimentos e sua ampla

aplicação terapêutica justificam a busca por conhecimentos relacionados às

propriedades fisiológicas ou funcionais dos mesmos. A chia (Salvia hispanica L.) é

uma antiga planta herbácea, com alto teor de óleo, principalmente ácido graxo α-

linolênico, proteína, fibra dietética e outros compostos bioativos. Ela tem sido

recentemente estudada por sua importante composição nutricional, possível

aplicação em alimentos, potencial funcional e por seus efeitos benéficos à saúde. O

objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da ingestão da semente e do óleo de

chia sobre mecanismos fisiológicos e bioquímicos na prevenção e no tratamento da

obesidade e comorbidades, induzida por dieta em modelo animal. Foi realizado um

ensaio biológico, com 60 ratos machos Wistar, divididos em 6 grupos (n=10): Grupo

1, controle magro alimentado com dieta padrão AIN-93M; grupo 2, controle obeso

alimentado com dieta hiperlipídica (35%) e adicionada de frutose (20%) (HFF); grupo

3 e 4: animais alimentados com dieta HFF adicionada de semente de chia em longo

(12 semanas) e curto (6 semanas) tempo; grupo 5 e 6: animais alimentados com

dieta HFF adicionada de óleo de chia em longo (12 semanas) e curto (6 semanas)

tempo. Foram avaliados: ingestão alimentar, ganho de peso, peso de tecidos

adiposos e órgãos, perfil lipídico e hormonal séricos, perfil de ácidos graxos

plasmático, marcadores inflamatórios séricos, conteúdo de lipídeo hepático e fecal,

resistência à insulina, tolerância à glicose, estresse oxidativo, peroxidação lipídica,

capacidade antioxidante plasmática e hepática; assim como a caracterização

química e a capacidade antioxidante das matérias-primas. Os dados foram

submetidos à análise de variância ANOVA e as médias comparadas pelo teste T

e/ou Tukey, com limite de significância de P ≤ 0,05. A semente de chia apresentou

alta concentração de óleo, proteína, fibra dietética, ácidos graxos ômega-3,

compostos bioativos e importante capacidade antioxidante in vitro. A ingestão da

dieta obesogênica (HFF) induziu a obesidade, resistência à insulina, intolerância à

glicose, dislipidemia, inflamação, estresse oxidativo e peroxidação lipídica nos

animais. A adição da semente e do óleo de chia, como substituição do óleo de soja

nas dietas experimentais, não reverteu a obesidade, mas normalizou o estado

inflamatório sérico, a dislipidemia, a intolerância à glicose, a resistência à insulina,

aumentou a concentração plasmática dos ácidos graxos da família ômega-3, α-

linolênico (ALA), eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenoico (DHA), reduziu a

razão dos ácidos graxos n-6/n-3, reduziu a peroxidação lipídica e o estresse

oxidativo, e aumentou a capacidade antioxidante no plasma e no fígado de animais

obesos induzidos por dieta. Os efeitos benéficos foram encontrados tanto no período

de prevenção (12 semanas) quanto de tratamento (6 semanas). Visto que os

produtos estudados têm comprovado efeito biológico e potencial funcional e por isso

podem beneficiar o estado de saúde da população, seja via suplementação ou por

enriquecimento de alimentos, o trabalho de pesquisa em questão forneceu subsídios

à introdução destes compostos na dieta habitual da população, como coadjuvante

na prevenção e no controle de desordens metabólicas crônicas, incentivando

pesquisas clínicas a este respeito.

Palavras-chave: Chia, Salvia hispanica, ácidos graxos ômega-3, obesidade,

estresse oxidativo, resistência à insulina, peroxidação lipídica, inflamação.

ABSTRACT

The diversity of bioactive compounds present in foods and its therapeutic application

justify the search for knowledge related to its physiological or functional properties.

Chia (Salvia hispanica L.) is an ancient herbal plant with high oil content, specially α-

linolenic fatty acid, protein, dietary fiber and bioactive compounds. It has been

recently studied for its important nutritional composition, possible application in food,

functional potential and for its beneficial effects on health. The aim of this study was

to evaluate the effects of chia seed and oil intake on physiological and biochemical

mechanisms in the prevention and treatment of obesity and comorbidities in diet-

induced animal model. A biological assay was done using 60 male Wistar rats, which

were divided into 6 groups (n = 10): Group 1, lean control fed with AIN-93M diet;

Group 2, obese control fed with high-fat (35%) and high-fructose diet (20%) (HFF);

Group 3 and 4: HFF diet added with chia seed in short (6-weeks) and long (12-

weeks) treatments; Group 5 and 6: HFF diet added with chia oil in short (6-weeks)

and long (12-weeks) treatments. Food intake, weight gain, adipose tissues and

organs weight, hormonal and lipid profile, plasma fatty acid profile, serum

inflammatory markers, hepatic and fecal lipids content, insulin resistance, glucose

tolerance, oxidative stress, lipid peroxidation, plasma and hepatic antioxidant

capacity, as well as the chemical and antioxidant capacity of raw materials were

evaluated. Data was submitted to analysis of variance ANOVA and means compared

by Tukey and/or T test. The limit of significance was set at P ≤ 0.05. Chia seed

showed a high content of oil, protein, dietary fiber, omega-3 fatty acids, bioactive

compounds and important antioxidant capacity in vitro. HFF diet intake induced

obesity, insulin resistance, glucose intolerance, dyslipidemia, inflammation, oxidative

stress and lipid peroxidation in animals. Addition of chia seed and oil, as a

replacement for soybean oil on the experimental diets did not reverse obesity, but

normalized serum inflammatory state, dyslipidemia, glucose intolerance, insulin

resistance, increased plasma omega-3 fatty acid concentration, α-linolenic acid

(ALA), eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), reduced n-

6/n-3 ratio, reduced lipid peroxidation and oxidative stress, and increased plasma

and hepatic antioxidant capacity in diet-induced obese rats. Beneficial effects were

found in both prevention (12 weeks) and treatment (6 weeks) periods. Since the

products studied have proven biological effect and functional potential, and therefore

can benefit population health status, either through supplementation or food

fortification, the present research provided subsidies to the introduction of these

compounds in the usual diet of the population as an aid in the prevention and control

of chronic metabolic disorders, encouraging clinical research in this regard.

Key words: Chia, Salvia hispanica, omega-3 fatty acids, obesity, oxidative stress,

insulin resistance, lipid peroxidation, inflammation.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

INTRODUÇÃO

Fluxograma resumido das atividades do trabalho .................................................... 22

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1. Esquema relacionando obesidade, alterações na secreção de adipocinas e

desenvolvimento da resistência à insulina ............................................................... 26

Figura 2. Vias metabólicas da biossíntese de PUFA a partir de ácidos graxos

insaturados da dieta ................................................................................................. 33

Figura 3. Esquema dos efeitos benéficos e mecanismos moleculares em diferentes

tecidos a partir da ingestão da semente de chia (Salvia hispanica L.) in vivo ......... 47

ARTIGO I

Figure 1. GC chromatogram (fatty acid profile) of chia oil (Salvia hispanica L.) ….. 84

Figure 2. TAG fingerprints obtained by EASI(+)-MS of chia oil (Salvia hispanica L.)

………………………………………………………………………………………….....… 85

Figure 3. Polyphenols fingerprints obtained by EASI(-)-MS of chia seed extract and

chia oil (Salvia hispanica L.) ………………………………....….................................. 88

ARTIGO II

Figure 1. Total food intake, total energy intake and total weight gain of rats fed on

different diets …………………………………………….…………………………...... 109

Figure 2. Plasma antioxidant enzymes: catalase (CAT) activity, superoxide

dismutase (SOD) activity, glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase

(GRd), and Thiol groups (GSH) in plasma of rats fed on different diets ………... 111

Figure 3. Liver antioxidant enzymes: catalase (CAT) activity, superoxide dismutase

(SOD) activity, glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GRd) and Thiol

groups (GSH) in liver of rats fed on different diets …………………………..……... 113

Figure 4. Lipid peroxidation by 8-isoprostane assay in plasma and TBARS assay in

plasma and liver of rats fed on different diets ……………………………………..... 115

Figure 5. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay in plasma and liver of

rats fed on different diets ………………………………………………………..…….. 116

ARTIGO III

Figure 1. Glucose AUC during intraperitoneal glucose tolerance test (iGTTAUC),

Mean blood glucose levels after intraperitoneal infusion of glucose solution, KITT

during intraperitoneal insulin tolerance test, Mean blood glucose levels after

intraperitoneal infusion of insulin in rats fed on different diets ……………………... 141

Figure 2. Pancreatic islet glucose-stimulated insulin secretion at 2.8 mmol/L and 16.7

mmol/L glucose in rats fed on different diets …………………………..……………...142

Figure 3. Total cholesterol (TC), HDL-c, LDL-c and Triacylglycerol (TAG) in serum of

rats fed on different diets ………………………………………………….....................143

Figure 4. Leptin, Insulin, Ghrelin, Adiponectin, TNF-α, MCP-1 and C-reactive protein

in serum of rats fed on different diets …………………….........................................145

LISTA DE TABELAS


Tabela 1. Estudos realizados em animais com a semente e óleo de chia (Salvia

hispanica L.) ............................................................................................................. 49

Tabela 2. Estudos realizados em humanos com a semente de chia (Salvia hispanica

L.) ............................................................................................................................. 55

ARTIGO I

Table 1. Proximate composition of Chilean chia seed (Salvia hispanica L.) (g/100 g)

…............................................................................................................................... 81

Table 2. Fatty acid profiles of Chilean chia oil (Salvia hispanica L.) ....................... 83

Table 3. Main TAG ions detected by EASI-MS in chia oil (Salvia hispanica L.) ….. 85

Table 4. Values of peroxide index and malondialdehyde of chia seed and chia oil

(Salvia hispanica L.) ………………………………………………………………….….. 86

Table 5. Identified phenolic compounds in chia seed and oil (Salvia hispanica L.)

analyzed by EASI-MS …………………………………………….……………………… 88

Table 6. Antioxidant activity of Chilean chia seed (Salvia hispanica L.) …..……….. 89

ARTIGO II

Table 1. Ingredients and fatty acid composition of experimental diets ……….…. 104

ARTIGO III

Table 1. Experimental diets ingredients and fatty acid composition .......................134

Table 2. Food and energy intake, weight gain, organs weight and metabolic

parameters of rats fed on different diets ..................................................................139

Table 3. Plasma fatty acid composition (%) of rats fed on different diets .…………147

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL .........................................................................................19

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................24

2.1 OBESIDADE: ASPECTOS GERAIS ...............................................................24

2.1.1 Obesidade: tecido adiposo, inflamação e resistência à insulina ..............25

2.1.2 Obesidade e estresse oxidativo ...............................................................29

2.2 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3..........................................................................31

2.3 CHIA (SALVIA HISPANICA L.) ........................................................................35

2.3.1 Origem, histórico e produção ...................................................................35

2.3.2 Composição química e valor nutricional ..................................................37

2.3.3 Influência da adição de chia em alimentos ..............................................41

2.3.4 Efeitos biológicos da semente e do óleo de chia .....................................44

REFERÊNCIAS .........................................................................................................57

CAPÍTULO I ...............................................................................................................71

Artigo I: Chemical characterization and antioxidant potential of Chilean chia seeds

and oil (Salvia hispanica L.) ………………………………………………….…...………72

Abstract ..............................................................................................................73

Introduction .........................................................................................................74

Materials and Methods .......................................................................................75

Results and Discussion ......................................................................................80

Conclusions ........................................................................................................90

References .........................................................................................................91

CAPÍTULO II ..............................................................................................................97

Artigo II: Antioxidant potential of dietary chia seed and oil (Salvia hispanica L.) in diet-

induced obese rats ……………..................................................................................98

Abstract ..............................................................................................................99

Introduction …...................................................................................................100

Materials and Methods .....................................................................................101

Results ..............................................................................................................108

Discussion ........................................................................................................117

References .......................................................................................................122

CAPÍTULO III ...........................................................................................................128

Artigo III: Dietary intake of chia seed and oil (Salvia hispanica L.) normalizes

dyslipidemia, inflammation and insulin resistance in diet-induced obese rats ….…129

Abstract ............................................................................................................130

Introduction .......................................................................................................131

Materials and Methods .....................................................................................132

Results ..............................................................................................................138

Discussion ........................................................................................................149

Conclusions ......................................................................................................154

References …....................................................................................................155

DISCUSSÃO GERAL ..............................................................................................160

CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................168

REFERÊNCIAS........................................................................................................170

ANEXOS...................................................................................................................176

Anexo A.........................................................................................................176

Anexo B.........................................................................................................177

Anexo C.........................................................................................................178

18

INTRODUÇÃO GERAL

19

1. INTRODUÇÃO GERAL

O aumento da expectativa de vida aliado às mudanças dos hábitos

alimentares da população e à incidência cada vez maior de doenças crônicas, como

obesidade, hipertensão, dislipidemias, doenças cardiovasculares, diabetes e câncer,

levou a maior preocupação por parte da população e dos órgãos públicos de saúde

na promoção de práticas alimentares saudáveis. O papel da alimentação equilibrada

em prol da saúde vem despertando o interesse da comunidade científica, que tem

produzido diversos estudos com o intuito de comprovar a influência de determinados

alimentos na redução do risco de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT)

(SWINBURN et al., 2011; GORTMAKER et al., 2011).

Os alimentos funcionais têm sido, nos últimos anos, discutidos em

eventos científicos de âmbito nacional e internacional, sendo de interesse crescente

para os consumidores e indústrias de alimentos. A diversidade de compostos

bioativos presentes nos alimentos e a ampla aplicação terapêutica destes, justificam

a busca por conhecimentos relativos às suas propriedades fisiológicas ou funcionais

(TRIGUEROS et al., 2013).

A Salvia hispanica L., cujo nome comum é chia, é uma antiga planta

herbácea, que pertence à família Lamiaceae, nativa do sul do México e norte do

Guatemala (COATES; AYERZA, 1996) que tem sido recentemente comercializada

como uma cultura na América do Sul (AYERZA; COATES, 2011). Seu consumo

pode ocorrer na forma de sementes inteiras, farinha, mucilagem e óleo de sementes.

O renascimento do interesse na semente de chia é devido a sua composição

nutricional, principalmente ao seu alto teor de óleo (25-39%), sendo uma fonte rica

em ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) da família ômega-3, com a maior

concentração de α-linolênico (ALA) dentre as fontes botânicas conhecidas

(AYERZA, 1995). As sementes também são ótimas fontes de proteína e fibras

dietéticas, solúveis e insolúveis (WEBER et al, 1991; REYES-CAUDILLO et al.,

2008; VÁZQUEZ-OVANDO et al., 2009; CAPITANI et al., 2012). Além disso, também

tem sido identificada a atividade antioxidante da chia, possivelmente devido à

20

presença de compostos fenólicos, fitosteróis e tocoferóis (REYES-CAUDILLO et al.,

2008; ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008; VÁZQUEZ-OVANDO et al., 2009; IXTAINA et

al., 2011; CAPITANI et al., 2012; MARTÍNEZ-CRUZ; PAREDES-LÓPEZ, 2014).

Estudos mostram que é possível utilizar o óleo de chia, ou seus

derivados, para a alimentação de animais, com o objetivo de obtenção de produtos

(como ovos, leite e carnes) enriquecidos em PUFA e consequente melhor valor

nutricional (AYERZA; COATES, 2002; AYERZA et al. 2002; COATES, AYERZA,

2009). Além disso, pesquisas em modelos animais (AYERZA; COATES, 2005, 2007;

ESPADA et al., 2007; CHICCO et al., 2009; POUDYAL et al., 2012) e em humanos

(VUKSAN et al. 2007, 2010) têm demonstrado os efeitos fisiológicos benéficos a

partir da ingestão das sementes ou óleo de chia, principalmente relacionadas à ação

deste composto na melhora de marcadores relacionados à dislipidemia, inflamação,

doenças cardiovasculares, homeostase da glicose, resistência à insulina, esteatose

hepática e composição corporal, sem a presença de efeitos adversos.

Dessa forma, as propriedades físico-químicas e funcionais da fração

lipídica das sementes de chia, assim como de seus subprodutos, motivam o uso

destes como ingredientes na indústria de alimentos. Considerando a atual tendência

para um aumento do consumo de alimentos funcionais e o alto potencial nutricional

e tecnológico da semente de chia e seus subprodutos, estes também podem ser

utilizados para produção de ingredientes funcionais com aplicações comerciais em

alimentos (REYES-CAUDILLO et al., 2008; ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008;

SEGURA-CAMPOS et al., 2013).

Visto que o alimento citado tem comprovado efeito biológico e por isso

pode beneficiar o estado de saúde da população, seja via suplementação ou por

enriquecimento de alimentos, o objetivo desta tese de doutorado foi investigar os

possíveis efeitos causados pela ingestão da semente e do óleo de chia (Salvia

hispanica L.) na prevenção e no tratamento da obesidade e comorbidades induzidas

por dieta hiperlipídica e adicionada de frutose em modelo animal. A partir disso,

foram enfocados neste trabalho, os seguintes objetivos específicos:

Determinou-se a composição centesimal das sementes de chia e das

dietas experimentais;

21

Determinou-se a composição de ácidos graxos da semente, do óleo de

chia e das dietas experimentais;

Avaliou-se o potencial antioxidante das sementes e do óleo de chia por

métodos in vitro.

Identificou-se os compostos fenólicos da semente e óleo de chia;

Avaliou-se e monitorar a ingestão dietética e ganho de peso dos animais;

Determinou-se o perfil lipídico sérico (colesterol total, lipoproteína de alta

densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), triglicérides e ácidos

graxos livres) e hormonal sérico (insulina, leptina, adiponectina e grelina) dos

animais;

Quantificou-se os marcadores inflamatórios séricos (proteína

quimioatrativa de macrófagos-1 (MCP-1), fator de necrose tumoral α (TNF-α),

proteína C-reativa (PCR)) nos animais;

Determinou-se o perfil de ácidos graxos no plasma dos animais;

Determinou-se o grau de resistência à insulina e intolerância à glicose pela

glicemia, Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT) e Teste de

Tolerância à Insulina intraperitoneal (ipITT), nos animais;

Avaliou-se a capacidade secretória de insulina de ilhotas isoladas in vitro

do pâncreas dos animais;

Determinou-se o perfil oxidativo e a capacidade antioxidante no plasma e

no fígado dos animais a partir dos marcadores de oxidação lipídica, da

atividade de enzimas antioxidantes e do ensaio de poder antioxidante redutor

de ferro (FRAP, do inglês ―Ferric Reducing Antioxidant Power‖).

22

Segue abaixo, um Fluxograma resumido das atividades do trabalho.

23


24

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 OBESIDADE: ASPECTOS GERAIS

A obesidade é uma doença crônica de origem multifatorial, que pode ser

definida como o acúmulo excessivo de gordura corporal, desenvolvida pela interação

entre fatores comportamentais, sociais, fisiológicos, psicológicos e genéticos

(ROMERO; ZANESCO, 2006; FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011). O excesso de

peso está associado a efeitos negativos sobre a longevidade e a qualidade de vida,

além de favorecer o desenvolvimento de outras complicações, incluindo a Diabetes

Mellitus tipo 2 (DM2), doenças cardiovasculares, dislipidemias, alguns tipos de

câncer e outros problemas de saúde que estão relacionados às altas taxas de

morbidade e mortalidade (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011; SWINBURN et al.,

2011).

A prevalência da obesidade vem aumentando consideravelmente nos últimos

anos e tornou-se um dos maiores problemas de saúde pública mundial. Dados das

Estatísticas Mundiais de Saúde de 2012 demonstraram que a obesidade é a causa

de morte de 2,8 milhões de pessoas por ano (WHO, 2012). Baseado em dados de

diversos países, a Organização Mundial de Saúde relata que a prevalência de

obesidade mais do que duplicou entre 1980 e 2014, sendo que no ano de 2014, 39%

da população adulta estava em sobrepeso e 13% da população mundial foi

considerada obesa (WHO, 2015). A epidemia da obesidade representa não somente

uma ameaça para a saúde da população, mas também um fardo substancial para

muitos sistemas de saúde referente às doenças associadas, que impõem elevados

custos médicos de tratamento e perdas de produtividade (WANG et al., 2011).

As mudanças, demográficas, culturais e socioeconômicas ocorridas

permitiram alterações nos padrões alimentares. Por isso, nas últimas décadas,

verifica-se um processo de transição nutricional no Brasil, caracterizado pela

diminuição progressiva da desnutrição e aumento da obesidade (SCHMIDT et al.,

2011). O aumento do consumo energético, principalmente de alimentos

processados, com elevado teor de açúcares simples e gorduras saturadas,

25

associado ao menor gasto energético atribuído à redução da atividade física,

explicam a tendência crescente de sobrepeso e obesidade na população brasileira,

e das DCNT associadas (SCHMIDT et al., 2011; SWINBURN et al., 2011).

2.1.1 Obesidade: tecido adiposo, inflamação e resistência à insulina

A obesidade está associada a um estado crônico de inflamação de baixo

grau, caracterizado pela produção anormal de citocinas e a ativação de vias de

sinalização inflamatórias no tecido adiposo branco (HOTAMISLIGIL, 2006). O tecido

adiposo é um órgão endócrino que tem papel fundamental na regulação da

homeostase metabólica através da secreção de várias adipocinas biologicamente

ativas com diferentes funções e efeitos em tecidos periféricos e centrais

(FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011).

A expansão do tecido adiposo na obesidade leva ao aumento da infiltração de

macrófagos e marcadores biológicos da inflamação, com aumento da produção de

citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-6

(IL-6), inibidor de ativador do plasminogênio-1 (PAI-1), proteína quimioatrativa de

macrófagos-1 (MCP-1), acompanhado por um aumento na liberação de ácidos

graxos livres (AGL) e secreção desregulada de leptina, adiponectina, resistina e

proteína 4 ligadora de retinol (RBP4). Em conjunto, estas substâncias derivadas de

adipócitos e macrófagos podem atuar de forma autócrina ou parácrina para

exacerbar a inflamação no tecido adiposo. Em nível sistêmico, a secreção alterada

de adipocinas pode levar ao aumento da ingestão de alimentos e redução do gasto

energético por meio de ações no hipotálamo e decréscimo da sensibilidade à

insulina no músculo e no fígado através do aumento da deposição de lipídeos e

inflamação (GALIC, OAKHILL, STEINBERG, 2010) (Figura 1).

26

Figura 1. Esquema relacionando obesidade, alterações na secreção de

adipocinas e desenvolvimento da resistência à insulina. Adaptado de Galic et al.

(2010).

A adiponectina é uma proteína de 247 aminoácidos, secretada pelo tecido

adiposo. Esse hormônio desempenha, em seres humanos e animais, um papel

importante na regulação da obesidade, homeostase energética, modulação do

metabolismo de glicose e lipídios em tecidos sensíveis à insulina, protegendo contra

desordens metabólicas e inflamação, e também aumenta a ação da insulina,

promovendo proteção à resistência deste hormônio. Ao contrário da maioria das

adipocinas, a expressão e os níveis séricos de adiponectina são negativamente

correlacionados com a gordura corporal e circunferência da cintura, estando

diminuídos em indivíduos obesos (LAGO et al., 2009; VÁZQUEZ-VELA; TORRES;

TOVAR, 2008).

27

A leptina é um hormônio sintetizado pelos adipócitos e secretado no plasma,

que regula o apetite e o gasto de energia, via sistema hipotalâmico. A quantidade de

leptina produzida e sua concentração plasmática são dependentes do conteúdo de

gordura corporal e da ingestão de alimentos, estando aumentada no período pós-

prandial. Seus efeitos também se estendem ao metabolismo lipídico, com aumento

da lipólise e inibição da lipogênese, além do seu papel inflamatório. Os níveis de

leptina têm sido associados positivamente com a quantidade de gordura corporal,

sendo que uma redução no peso corporal pode conduzir a uma redução nos níveis

desse hormônio, porém no estado clínico da obesidade, a resistência à este

hormônio também tem sido relatada (ROMERO; ZANESCO, 2006; VÁZQUEZ-VELA;

TORRES; TOVAR, 2008; LAGO et al., 2009).

A grelina, outra adipocina composta por 28 aminoácidos, sintetizada e

secretada principalmente pelas células oxínticas da mucosa do estômago, tem sido

estudada quanto a sua ação reguladora sobre a secreção de insulina e metabolismo

de glicose, além das funções biológicas relacionadas ao controle do apetite e da

fome. Estudos em modelos animais indicam que esse hormônio orexígeno,

desempenha importante papel na sinalização dos centros hipotalâmicos que

regulam a ingestão alimentar e o balanço energético (ERDMANN et al., 2004;

NAKAZATO et al., 2001).

O TNF-α é uma potente citocina que induz a produção de IL-6 e está

envolvido na resposta inflamatória sistêmica, além de ter efeitos sobre o transporte

de glicose, metabolismo de lipídeos, e ação da insulina. Tem sido relatado que, em

indivíduos obesos e em modelos animais, os níveis de TNF-α e IL-6 estão

persistentemente elevados, e uma redução da massa adiposa leva a uma redução

nos níveis de expressão desses marcadores que são relacionados com o

desenvolvimento da resistência à insulina, obesidade e diabetes (KERN et al., 2001;

GALIC, OAKHILL, STEINBERG, 2010). Além disso, o TNF-α pode também modular

a secreção de leptina, aumentando a expressão de genes e os níveis circulantes, da

mesma forma que o TNF-α e IL-6 são potentes inibidores da expressão e secreção

de adiponectina (LAGO et al., 2009; GALIC, OAKHILL, STEINBERG, 2010).

A insulina é um hormônio polipeptídico anabólico produzido pelas células β

pancreáticas, cuja síntese e secreção são ativadas pelo aumento dos níveis

28

circulantes de glicose e aminoácidos após as refeições. Este hormônio é

responsável por diversos efeitos metabólicos relacionados aos carboidratos, lipídeos

e proteínas e age diretamente em vários tecidos periféricos, incluindo músculo,

fígado, tecido adiposo e sistema nervoso central. No hipotálamo, este hormônio

desempenha função destacada no controle da ingestão alimentar, atuando de

maneira anorexigênica (XU et al, 2005; TILG; MOSCHEN, 2006).

Durante a obesidade, também há um aumento de AGL circulantes,

principalmente saturados, que são liberados pelo tecido adiposo e favorecem o

desenvolvimento da esteatose hepática não alcoólica, inflamação e lipotoxicidade

(FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011; HELLMANN et al., 2013). Os AGL também

são tóxicos para as células pancreáticas que são sensíveis à oxidação e induzem

alterações na liberação de insulina, podendo levar à resistência à insulina e

consequentemente ao desenvolvimento da DM2 (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al.,

2011).

A resistência à insulina pode ser definida como um fenômeno biológico no

qual há uma diminuição da capacidade da insulina endógena ou exógena em

estimular a utilização celular de glicose, e assim manter as respostas metabólicas a

este hormônio (DIAS; SANTOS; COUTINHO, 2009). Entretanto, a resistência à

insulina tem como mecanismo compensador a hiperinsulinemia, resultante da

capacidade adaptativa das células β, que mantêm a homeostase glicêmica. Porém,

quando há falência nestas células, surge então a intolerância à glicose e,

posteriormente, o estabelecimento da DM2 (OLEFSKY; GLASS, 2010). Esse quadro

pode ser um fator agravante ou causal na obesidade.

Os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) são

receptores de ácidos graxos que regulam a expressão dos genes, que por sua vez,

afetam a homeostase energética e as funções imunes. Foram identificadas 3

isoformas desse receptor nuclear, PPAR α, PPAR β e PPAR γ1 e γ2, as quais são

codificadas por genes diferentes e expressas de forma distinta em diversos tecidos,

mas todas envolvidas na regulação do metabolismo de lipídeos e glicose, na

diferenciação celular, bem como no desenvolvimento do câncer e no controle da

resposta inflamatória. Basicamente, os PPARs α e β estão envolvidos no

metabolismo de lipídeos e glicose e o PPAR γ está envolvido na diferenciação de

29

adipócitos, sendo considerado o principal ativador de genes lipogênicos e importante

fator de transcrição envolvido na adipogênese (ATAROD; KEHRER, 2004;

VÁZQUEZ-VELA, TORRES, TOVAR, 2008).

Dessa forma, a produção e secreção de adipocinas em excesso ou

deficiência, influenciam significativamente a sensibilidade à insulina, metabolismo da

glicose e lipídeos, inflamação e arteriosclerose, podendo fornecer uma ligação

molecular entre o aumento da adiposidade e o desenvolvimento de DM2, resistência

à insulina, e doenças cardiovasculares (GALIC, OAKHILL, STEINBERG, 2010).

2.1.2 Obesidade e estresse oxidativo

Os radicais livres são moléculas altamente reativas com elétrons

desemparelhados em sua última camada, que se ligam rapidamente a outras

moléculas e desempenham importante papel na defesa e na regulação da

homeostase de oxirredução do organismo (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são encontradas em todos os sistemas

biológicos, formadas a partir do metabolismo celular aeróbio. Dentre as principais,

podemos destacar: ânion-radical superóxido (O2•–), peróxido de hidrogênio (H2O2),

radicais peroxila (RO2•), alcoxila (RO•), oxigênio singlete (1O2) e radical hidroxila

(•OH), sendo esse último reconhecido por ser um dos mais reativos e mais lesivos

dentre os radicais livres conhecidos (VASCONCELOS et al., 2007).

Neste contexto, inserem-se as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) que

também são radicais livres de destaque. Baixas concentrações de radicais livres

(EROs e ERNs) são importantes para manter o estado redox normal das células,

função tecidual e o processo de sinalização intracelular. Em contrapartida, o excesso

de radicais livres pode danificar as macromoléculas, como lipídeos, proteínas e

DNA, e comprometer a função celular (YU, 1994). Dentre os prejuízos causados

pelas ERONs, destaca-se a peroxidação lipídica, que ocorre geralmente a partir do

ataque do radical livre a ácidos graxos poli-insaturados, que são parte estrutural das

membranas celulares. A peroxidação lipídica leva a uma modificação das

características físico-químicas das membranas celulares, com alteração de sua

fluidez e permeabilidade, provocando risco de ruptura e consequente morte celular

(VASCONCELOS et al., 2007; HALLIWELL, 1994).

30

O combate ao dano oxidativo é mediado endogenamente pelo sistema

antioxidante enzimático, composto basicamente pelas enzimas superóxido

dismutase (SOD), glutationa redutase (GRd), glutationa peroxidase (GPx) e catalase,

que são responsáveis pela remoção ou inativação das ERONs produzidas em

condições fisiológicas ou anormais, como doenças. Além da proteção endógena, o

organismo conta com os antioxidantes alimentares, como as vitaminas C e E, os

carotenóides, os polifenóis e alguns minerais que possuem a propriedade de

prevenir e amenizar os danos celulares causados pelos radicais livres (HALLIWELL,

1994; YU, 1994; SIES, 1991).

O desequilíbrio entre agentes pró-oxidantes e antioxidantes é chamado de

estresse oxidativo, que se caracteriza pela capacidade insuficiente dos sistemas

biológicos em neutralizar a produção excessiva de radicais livres, que pode ser

induzido principalmente por fatores ambientais. O estresse oxidativo tem sido

implicado na etiologia de diversas doenças crônicas, tais como a aterosclerose,

doenças cardiovasculares, diversos tipos de câncer, obesidade, diabetes, resistência

à insulina e doenças neurodegenerativas (KULKARNI; KUPPUSAMY; PARINANDI,

2007; SIES, 1991; PANDEY; RIZV, 2010).

Tem sido relatado que a obesidade pode induzir o estresse oxidativo

sistêmico que, por sua vez, está associado com uma produção irregular de

adipocinas e citocinas pró-inflamatórias, contribuindo para o desenvolvimento da

síndrome metabólica (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011). A alteração de

citocinas junto ao estado de hiperglicemia e elevação dos níveis de AGL são

estimuladores potentes da produção de oxigênio e nitrogênio reativos, sendo,

portanto, responsáveis pelo aumento do estresse oxidativo, resistência à insulina e

inflamação no tecido adiposo (KING; LOEKEN, 2004).

Patel e colaboradores (2007) demonstraram que uma dieta com alta

densidade de gordura saturada e carboidratos induz um aumento significativo no

estresse oxidativo e inflamação em indivíduos com obesidade. Estudos têm

demonstrado que o consumo de dietas com alta densidade de açúcares afeta

negativamente o balanço entre a defesa antioxidante e a produção de radicais livres

em animais, levando ao aumento da suscetibilidade à peroxidação lipídica

(BUSSEROLLES et al., 2002; REDDY et al., 2009). Segundo Feillet-Coudray e

31

colaboradores (2009), em animais obesos há uma elevada produção de espécies

reativas de oxigênio, e esse dano oxidativo é um importante iniciador da patogênese

da diabetes e outras complicações.

A obesidade também compromete o sistema de defesa antioxidante a partir

da redução das enzimas antioxidantes, como SOD, GPx e catalase, além de afetar o

sistema antioxidante não enzimático, como vitaminas, minerais, polifenois, entre

outros. A sensibilidade dos biomarcadores do dano oxidativo, assim como o nível de

peroxidação lipídica estão aumentados em indivíduos obesos e se correlacionam

diretamente com o índice de massa corporal (IMC), percentual de gordura corporal,

oxidação do LDL-colesterol, concentrações sanguíneas de triacilgliceróis (TG) e

colesterol. Em contraste, os marcadores de defesa antioxidante estão reduzidos de

acordo com a quantidade de gordura corporal e de obesidade central (FERNÁNDEZ-

SÁNCHEZ et al., 2011).

2.2 ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3

Os lipídeos dietéticos estão entre os compostos bioativos que têm recebido

atenção especial, em termos quantitativos e qualitativos, como modulador importante

da morbidade e mortalidade de doenças relacionadas com o estilo de vida. Os

ácidos graxos com duas ou mais duplas ligações são denominados ácidos graxos

poli-insaturados (PUFA), os quais têm sido reportados por fornecer benefícios

adicionais para a saúde humana, além de suas funções básicas, como produção de

energia, produção hormonal, sinalização, e parte da estrutura da membrana celular

(TRIGUEROS et al., 2013; GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON, 2014).

Estudos epidemiológicos descrevem correlações entre o tipo de lipídeo

consumido na dieta, a composição de ácidos graxos no tecido adiposo, a

concentração destes no sangue e a incidência de certas doenças metabólicas

(WARENSJÖ et al., 2006). Dietas ricas em ácidos graxos saturados aumentam a

resistência à insulina e a incidência de doenças cardiovasculares, principalmente

devido a sua implicação na inflamação, pela indução de citocinas pró-inflamatórias,

estresse oxidativo, liberação de AGL, alteração de lipídeos circulantes, dislipidemia,

entre outros. Por sua vez, aquelas ricas em alguns ácidos graxos mono e poli-

32

insaturados protegem contra o desenvolvimento dessas doenças e complicações

(QUEIROZ et al., 2009; GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON, 2014).

Os seres humanos podem sintetizar os ácidos graxos saturados e

monoinsaturados, mas não podem sintetizar os PUFA da família ômega-3 (também

designado por ω-3 ou n-3) e ômega-6 (também designado por ω-6 ou n-6). Isto

porque os seres humanos como outros animais, não possuem as enzimas

necessárias para produzir os ácidos graxos α-linolênico (ALA) e linoleico (LA), sendo

assim, considerados essenciais, devendo ser fornecidos pela dieta (TAPIERO et al.,

2002).

O ácido linoleico (18:2 n-6, 9,12-octadecadienoico, LA) é metabolicamente

convertido em ácido araquidônico (20:4 n-6, 5,8,11,14-eicosatetraenoico, AA). Já o

ácido α-linolênico (18:3 n-3, cis-9,12,15-octadecatrienoico, ALA), é precursor de

importantes ácidos graxos da família n-3, como o eicosapentaenoico (20:5 n-3, cis-

5,8,11,14,17-eicosapentaenoico, EPA) e docosahexaenoico (22:6 n-3, cis-

4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico, DHA), os quais são formados no organismo a

partir da ação de enzimas dessaturases e alongases (ALABDULKARIM et al., 2012)

(Figura 2). Porém, a eficiência da conversão de ALA em EPA e de ALA em DHA é

baixa e estimada em cerca de 8% a 21% e de 0% a 9%, respectivamente, sendo

bastante variável e modulada por diversos processos, incluindo estado fisiológico,

dieta, idade e sexo. Tem sido observado um nível maior de conversão em mulheres,

e esta diferença atribuída à possível influência do estrogênio sobre a atividade das

enzimas dessaturases (BURDGE, 2004; GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON,

2014).

O AA, da família n-6, é precursor de eicosanoides pró-inflamatórios, como

prostaglandina E2, tromboxano A2 e leucotrienos da série 3 e 4. Enquanto, os ácidos

graxos n-3 são responsáveis pela formação de precursores eicosanoides anti-

inflamatórios, como tromboxano A3, prostaciclina I3, prostaglandinas 3 e leucotrienos

da série 5, os três primeiros via cicloxigenase e os últimos via lipoxigenase

(ALABDULKARIM et al., 2012; MARTIN et al., 2006). Tanto os prostanóides como os

leucotrienos agem de forma autócrina e parácrina, influenciando inúmeras funções

celulares que controlam mecanismos fisiológicos e patológicos no organismo

(SMITH, 1992). O LA e ALA competem pelas mesmas enzimas de conversão para

33

formação de AA e EPA, respectivamente. Da mesma forma, o EPA compete com o

AA via cicloxigenase na formação dos eicosanoides, e produz inibição da agregação

plaquetária, estimula a vasodilatação e apresenta propriedade anti-inflamatória

(ALABDULKARIM et al., 2012) (Figura 2). Embora o ALA seja o substrato preferido

pela delta-6 dessaturase, o excesso de LA típico de dietas dos seres humanos e

animais biológicos conduz a uma maior conversão de LA em comparação ao ALA,

assim como, de seus principais derivados (AA e EPA) (BURDGE, 2004).

Figura 2. Vias metabólicas da biossíntese de PUFA a partir de ácidos graxos

insaturados da dieta. Setas contínuas indicam reações enzimáticas individuais, setas

tracejadas indicam múltiplos processos enzimáticos, e setas cheias apontam para a

ação biológica dos compostos. PG = prostaglandinas, LT = leucotrienos. Adaptado

de Ganesan et al. (2014).

34

Em função dessas diferenças fisiológicas tem-se proposto que a produção

excessiva de prostanóides da série 2, advindos de ácidos graxos da família n-6, está

relacionada com a ocorrência de desordens imunológicas, doenças cardiovasculares

e inflamatórias, sendo recomendado aumentar a ingestão de ácidos graxos n-3 para

elevar a produção de prostanóides da série 3 (SIMOPOULOS, 2004).

Os ácidos graxos n-3 são essenciais para o crescimento e desenvolvimento

normal do organismo, e podem desempenhar função importante no tratamento

adjuvante de doenças cardíacas, hipertensão, dislipidemia, e DM2 (SIMOPOULOS,

1999; WU et al., 2012; GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON, 2014). Esses

ácidos graxos são reguladores da expressão de genes envolvidos no metabolismo

de lipídeos e glicose e na adipogênese, atuando via PPARs (JUMP, 2002).

O DHA é necessário em altos níveis no cérebro e na retina como um nutriente

fisiologicamente essencial para garantir ótimas funções neurais e visuais, já que

possui efeito benéfico para acuidade visual e cognição, assim como para o

desenvolvimento cerebral e neural, principalmente durante a gestação e os primeiros

anos de vida (GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON, 2014). Também têm sido

relatados, por diversos estudos epidemiológicos, os benefícios da ingestão de DHA

e EPA na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares, fatores de risco

associados, bem como de outras doenças crônicas. Os efeitos cardiovasculares

protetores têm sido atribuídos à capacidade de afetar favoravelmente vários fatores

de risco para doença cardiovascular, incluindo propriedades anti-inflamatória,

antitrombótica, antiarrítmica, vasodilatadora, e de redução de lipídeos sanguíneos

(SIMOPOULOS, 1999; QUEIROZ et al., 2009).

Evidências epidemiológicas e clínicas sugerem que um maior consumo de

ALA também está associado com a redução do risco de doenças cardiovasculares,

dislipidemia, inflamação, resistência à insulina e diabetes (DE LORGERIL et al.,

1994; ALBERT et al., 2005; Wu et al., 2012), bem como com a redução da

lipogênese e aumento da β-oxidação de ácidos graxos (IDE, 2000; QUEIROZ et al.,

2009).

O ALA é essencialmente de origem vegetal, presente em diversas sementes,

nozes, e em óleos vegetais, como linhaça, chia, canola, soja, linho e vegetais

folhosos verdes escuros; enquanto o EPA e DHA são encontrados em algas,

35

animais marinhos, óleo de peixes e peixes, devido à ingestão de algas marinhas

(ALABDULKARIM et al., 2012). O LA está presente em alimentos de origem animal,

como leite, carne e ovos, e em óleos vegetais, como cártamo, girassol e soja

(MARTIN et al., 2006). Nos países industrializados, a dieta da maior parte da

população apresenta baixo teor de PUFA n-3, principalmente devido ao baixo

consumo de pescados e ao uso excessivo de óleo vegetal rico em LA, estando a

razão dos ácidos graxos n-6:n-3 em torno de 20-25:1. O equilíbrio entre os ácidos

graxos n-6 e n-3 é alterado no caso de doenças crônicas, sugerindo que as

alterações neste equilíbrio se correlacionam com maior risco de doenças. Dessa

forma, a proporção recomendada dos ácidos graxos n-6:n-3 na dieta humana é de 5-

1:1 (SIMOPOULOS, 2004; 2011; GANESAN; BROTHERSEN; MCMAHON, 2014).

Diante disso, faz-se necessário encontrar alternativas nutricionais capazes de

evitar o surgimento e progressão da obesidade e de DCNT, tais como os compostos

bioativos presentes naturalmente em alimentos e que possuem importante ação

biológica.

2.3 CHIA (SALVIA HISPANICA L.)

2.3.1 Origem, histórico e produção

A Salvia hispanica L., cujo nome comum é chia, é uma planta herbácea anual,

que pertence à família Lamiaceae, nativa do sul do México e norte do Guatemala

(COATES; AYERZA, 1996). A chia, juntamente com o milho, o feijão e o amaranto,

era um componente essencial na dieta de civilizações pré-colombianas da América

Central, incluindo as populações maias e astecas (SAHAGUN, 1989).

Além da importância como fonte de alimento básico, o óleo extraído das

sementes possuía vários usos artísticos e todas as partes da planta eram utilizadas

como ingredientes em várias receitas astecas medicinais. Relatam-se também

algumas propriedades curativas das sementes, como por exemplo, para o

tratamento de obstruções dos olhos, infecções, problemas de pele, doenças

respiratórias e gastrointestinais. O uso culinário da chia se destinava as sementes

inteiras, farinha, mucilagem e óleo de sementes. As sementes embebidas em água

36

ou suco de frutas foram e ainda são consumidas em algumas regiões como uma

bebida refrescante (CAHILL, 2003).

Nos últimos anos a chia vem sendo cultivada comercialmente no México,

Bolívia, Argentina, Equador, Guatemala, Peru e Colômbia, e o período e época do

seu cultivo variam de acordo com a região (AYERZA; COATES, 2005; MUÑOZ et al.,

2013). Embora as plantas sejam pouco tolerantes a geadas, podem ser cultivadas

em estufas em algumas partes da Europa. A chia tem sido, recentemente,

comercializada na América do Sul, onde é considerada como uma cultura alternativa

para ajudar na diversificação e estabilização da economia local, em regiões áridas e

semi-áridas, onde a disponibilidade de água é a principal limitação para a produção

de culturas e plantio de oleaginosas (COATES; AYERZA, 1996). Apesar de ser uma

cultura antiga, a chia tem sido investigada como uma "nova" cultura devido aos

séculos de seleção e adaptação de cultivo a que foi submetida. Além disso, nos

últimos anos, a chia e seus derivados estão disponíveis comercialmente nas

Américas, Austrália, Europa e Sudeste asiático (MOHD ALI et al., 2012).

No Brasil, as regiões do oeste Paranaense e noroeste do Rio Grande do Sul

começaram a investir no cultivo de chia nas últimas safras, apresentando bons

resultados, apesar de ser uma cultura pouco explorada no país (MIGLIAVACCA et

al., 2014).

A planta produz pequenas sementes brancas e escuras que amadurecem no

outono. A sua forma é oval, medindo 2,0 mm x 1,5 mm. A maioria dos cultivares de

chia atualmente contém uma baixa porcentagem de sementes brancas. Em geral,

existe uma pequena diferença de tamanho entre estas sementes, sendo as brancas

um pouco maiores do que as negras (AYERZA; COATES, 2005). Além disso,

existem algumas diferenças no teor de proteína e de ácidos graxos entre as

sementes escuras e brancas (IXTAINA et al., 2008).

Além disso, os resultados do cultivo comercial de sementes de chia

proveniente de três países (Bolívia, Equador e Argentina) também indicam que se

deve ter cuidado antes de introduzi-la como uma cultura em uma nova área, uma

vez que a localização pode ter um impacto significativo sobre a composição das

sementes (AYERZA; COATES, 2011). Cahill (2004) sugere uma ligeira perda de

diversidade acompanhando a domesticação das variedades comerciais modernas.

37

Os fatores predominantes que influenciam a diversidade genética da Salvia

hispanica L. são os atributos biológicos das espécies e sua distribuição geográfica,

sendo que a seleção humana atua como um terceiro fator que influencia padrões de

diversidade.

2.3.2 Composição química e valor nutricional

A investigação sobre a chia tem-se centrado na composição química das

sementes (WEBER et al., 1991; AYERZA; COATES, 2004a; REYES-CAUDILLO et

al., 2008; VÁZQUEZ-OVANDO et al., 2009; CAPITANI et al., 2012), óleo da semente

(AYERZA, 1995; AYERZA; COATES, 2011; ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008;

IXTAINA et al., 2011; 2012), mucilagem da semente (LIN et al., 1994; MUÑOZ et al.,

2012) e óleo essencial da folha (TING et al . 1996).

As sementes têm sido investigadas e recomendadas devido ao seu teor de

óleo, proteínas, antioxidantes, e teor de fibra dietética. A semente possui,

aproximadamente, 25 a 39% de óleo, e contém uma das maiores concentrações

conhecidas do ácido graxo α-linolênico (até 67,8%) (AYERZA, 1995; COATES;

AYERZA, 1996). A composição em ácidos graxos do óleo de chia apresenta cerca

de 90% de ácidos graxos insaturados, principalmente o ácido graxo α-linolênico

(ALA, C18: 3 n-3, 54-68%), linoleico (LA, C18: 2 n-6; 17-26%) e oleico (C18:1 n-9, 6-

7,3%), com baixas concentrações de ácidos graxos saturados, como o palmítico

(C16:0) e esteárico (C18:0) (9-11%), além de apresentar uma boa proporção entre

os ácidos graxos n-6/n-3 (AYERZA, 1995, COATES; AYERZA, 1996; AYERZA;

COATES, 2004a). O óleo da semente de chia é obtido por prensagem a frio, e é

comercializado como óleo bruto sob os nomes comerciais e marcas específicas em

vários países da América Latina e América do Norte (IXTAINA et al., 2010).

O teor de proteínas (19-26%) das sementes de chia é mais elevado quando

comparado a outras culturas tradicionais, tais como trigo, (Triticum aestivum L.),

milho (Zea mays L.), arroz (Oryza sativa L.), aveia (Avena sativa L.) e cevada

(Hordeum vulgare L.) (WEBER et al., 1991; IXTAINA et al., 2008). A semente de chia

foi caracterizada recentemente como uma potencial fonte de peptídeos

biologicamente ativos (bioativos) (SEGURA-CAMPOS et al., 2013) e contém todos

os aminoácidos essenciais, além de apresentar um bom balanço destes, em

38

particular, de metionina e cisteína (SANDOVAL-OLIVEROS; PEREDES-LÓPEZ,

2013).

A chia também possui um alto teor de fibra dietética total que varia entre 47,1

e 59,8% (WEBER et al., 1991), mas não contém elementos tóxicos ou compostos

antinutricionais (BUSHWAY et al., 1981, WEBER et al., 1991, LIN et al., 1994).

Pesquisadores avaliaram o teor de fibras de sementes de chia de duas regiões

diferentes do México e reportaram valores de 37-41% para fibra dietética total, sendo

que desta 33-35% foi composta por fibra insolúvel, e 6-7% por fibra solúvel (REYES-

CAUDILLO et al., 2008). Em estudo subsequente, uma fração rica em fibras obtida

por secagem da farinha desengordurada de sementes de chia mexicana apresentou

cerca de 56% de fibra dietética total, das quais 53% de fibra dietética insolúvel e 3%

de fibra dietética solúvel; a fração fibrosa teve alta capacidade de retenção e

absorção de água (VÁZQUEZ-OVANDO et al., 2009). Da mesma forma, Capitani e

colabroradores (2012) avaliaram amostras da fração fibrosa e resíduos obtidos após

a extração do óleo da semente de chia argentina por prensagem ou solvente (n-

hexano) e encontraram um alto teor de fibra dietética total (52%), composta de fibra

insolúvel (47,5%) e fibra solúvel (4,5%), sendo o teor de celulose, hemicelulose e

lignina em torno de 25-28%, 30%, e 5,5-8%, respectivamente. Ambas as frações

fibrosas apresentaram alta capacidade de retenção e absorção de água, sugerindo

seu uso como possível agente emulsionante e estabilizante em alimentos.

A camada externa da semente de chia contém mucilagem que incha e a

envolve na forma de uma camada espessa quando embebida em água. Nesta

mucilagem gelatinosa, a xilose, glicose e ácido glucurônico metílico foram

identificados formando um polissacarídeo ramificado de alto peso molecular (LIN et

al., 1994). Essa característica seria responsável pela saciedade atribuída ao

consumo das sementes em humanos (VUKSAN et al., 2010), indicando um grande

potencial como um ingrediente funcional para ser utilizado como agente espessante

em alimentos (MUÑOZ et al., 2012).

A semente de chia também possui teores significativos de alguns minerais,

como por exemplo, potássio (653 mg/100g), cálcio (631 mg/100g), fósforo (770

mg/100g), ferro (7,72 mg/100g), zinco (5,68 mg/100g), magnésio (334,50 mg/100g),

manganês (3,28 mg/100g), cobre (1,66 mg/100g) e selênio (55,2 μg/100g)

39

(COATES, 2012; MUÑOZ et al., 2013). Além disso, a composição nutricional da chia

também se destaca pela presença de vitaminas, como a vitamina A (53,86 IU/100g),

vitamina C-ácido ascórbico (1,61 mg/100g), vitamina B1 (0,62 mg/100g), vitamina B2

(0,17 mg/100g), vitamina B3 (8,83 mg/100g) e folato (49,0 μg/100g) (COATES, 2012;

MUÑOZ et al., 2013).

Também tem sido identificada a atividade antioxidante da chia, tanto do óleo

quanto da fração desengordurada das sementes, sendo principalmente devida à

presença de polifenóis, como ácidos caféico e clorogênico, mericetina, quercitina,

kaempferol entre outros (TAGA et al., 1984; REYES-CAUDILLO et al., 2008;

VÁZQUEZ-OVANDO et al., 2009; IXTAINA et al., 2011; CAPITANI et al., 2012,

MARTÍNEZ-CRUZ; PAREDES-LÓPEZ, 2014). Porém, o conteúdo de polifenóis pode

variar dependendo dos métodos de extração utilizados e locais de cultivo das

sementes.

Um importante estudo avaliou a atividade antioxidante e o conteúdo de

fenólicos de extratos brutos (com etanol) e hidrolisados (com ácido clorídrico e

etanol) de sementes de chia de duas regiões diferentes do México. Os principais

compostos identificados foram quercetina e kaempferol, enquanto que os ácidos

caféico e clorogênico estavam presentes em baixas concentrações. O conteúdo

médio de fenólicos encontrado foi em torno de 0,9 mg/g dos extratos de semente de

chia, expresso como equivalente de ácido gálico (GAE) (REYES-CAUDILLO et al.,

2008). Os resultados deste estudo demonstram atividade antioxidante consistente e

comparável ao Trolox em todos os modelos de ensaio analisados, sugerindo que o

isolamento e a preparação de compostos bioativos a partir de sementes de chia

poderiam ser utilizados para produzir potentes antioxidantes naturais ou ingredientes

funcionais com aplicações comerciais.

Em sequência, Vázquez-Ovando e colaboradores (2009) avaliaram a

atividade antioxidante de uma fração rica em fibras obtida por secagem da farinha

desengordurada das sementes de chia de diferentes regiões do México e verificaram

que a atividade antioxidante avaliada foi de 489 umol de Trolox equivalentes

(TEAC)/g, sendo considerada elevada em relação à muitos cereais e bebidas tais

como vinho, chá, café e suco de laranja. Da mesma forma, Capitani e colaboradores

(2012) encontraram uma alta atividade antioxidante nas amostras de fração fibrosa e

40

resíduo obtidos após a extração do óleo da semente de chia argentina por

prensagem ou solvente (n-hexano). As amostras apresentaram uma maior atividade

antioxidante do que a encontrada no farelo de trigo, grãos de sorgo e cevada,

possivelmente devido aos compostos polifenólicos e à presença de tocoferóis totais,

com aproximadamente 470-545 mg/kg de óleo, onde γ-tocoferol foi o componente

principal (95%), seguido por α- e δ-tocoferol, mas o β-tocoferol não foi detectado.

Ixtaina e colaboradores (2011) também identificaram a concentração de

tocoferóis (238-427 mg/kg) no óleo de chia da Argentina e Guatemala extraído por

prensagem ou solvente (n-hexano), sendo composto principalmente por γ-tocoferol

(>85%), com δ-tocoferol e α-tocoferol encontrado em concentrações variáveis,

enquanto o β-tocoferol também não foi detectado. Os métodos de extração

influenciaram significativamente o rendimento do óleo, obtendo-se cerca de 30%

mais óleo por solvente do que por prensagem. A relação dos ácidos graxos n-3/n-6

variou entre 3,18-4,18, sendo significativamente maior do que o relatado para outros

óleos vegetais. Os principais compostos fenólicos identificados e quantificados no

óleo de chia foram os ácidos clorogênico e caféico, mericetina, quercetina, e

kaempferol, estando suas concentrações significativamente maiores quando o óleo

foi extraído por prensagem em relação ao método por solvente.

Álvarez-Chávez e colaboradores (2008) identificaram o teor de fitosteróis no

óleo de chia de variedades mexicanas, que variou entre 12,6 e 8,15 g/kg, sendo o β-

sitosterol responsável por até 74% da fração total insaponificável. O teor de esteróis

individuais, β-sitosterol, estigmasterol e estigmastanol foram superiores à de colza,

amendoim, cártamo, sésamo, girassol e óleos não refinados (PHILLIPS et al., 2002),

caracterizando a chia como uma fonte atrativa também de fitosteróis.

Apesar do teor considerável de componentes bioativos, como polifenóis,

tocoferóis, esteróis, carotenóides e fosfolipídios, o alto nível de insaturação do óleo

de chia determina a sua baixa estabilidade oxidativa (IXTAINA et al., 2011).

Entretanto, Ixtaina e colaboradores (2012) verificaram que o óleo de chia apresentou

boa estabilidade oxidativa após 225 dias quando armazenado a 4 °C, e entre 60 e

120 dias quando armazenado a 20 °C. Além disso, a estabilidade oxidativa do óleo

de chia pode ser considerada maior quando são comparados os valores de índice de

peróxido de amostras do óleo de chia (IXTAINA et al., 2012) e óleo de linhaça

41

quando submetidos a diferentes métodos de extração (KHATTAB; ZEITOUN, 2013)

ou quando adicionados ou não de antioxidantes (RUBILAR et al., 2012).

Recentemente, Martínez-Cruz e Paredes-López (2014) identificaram, em

sementes de chia do México, diferentes compostos fenólicos como, ácidos

rosmarínico, protocatecuico, caféico, gálico, ferúlico, entre outros, estando o ácido

rosmarínico em maior concentração. Além disso, isoflavonas como a genisteína,

daidzeína e gliciteína também foram identificadas.

As variações na composição nutricional das sementes e óleo de chia são,

provavelmente, devido às condições ambientais. A produtividade da chia, como

muitas culturas, é sensível ao tempo e à data de plantio. Dessa forma, alguns

estudos relatam que o teor de óleo, a composição de ácidos graxos, bem como a

produção de sementes são afetados pelo clima, localização e práticas de produção

no noroeste da Argentina (COATES; AYERZA, 1996; 1998). O mesmo ocorreu em

estudos realizados no México (ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008) e Equador

(AYERZA, 2010).

A avaliação da composição da chia cultivada em seis ecossistemas tropicais e

subtropicais da América do Sul indicou que a localização do plantio afetou a

composição das sementes, com uma diferença significativa no conteúdo de proteína

e óleo, índice de peróxido e composição de ácidos graxos, presumivelmente devido

a um ou mais fatores ambientais, como a temperatura, luz, condições climáticas, tipo

de solo e os nutrientes disponíveis (AYERZA; COATES, 2004a; 2004b).

2.3.3 Influência da adição de chia em alimentos

As propriedades físico-químicas e funcionais da fração lipídica das sementes

de chia, assim como de seus subprodutos, motivam o uso deste alimento com

potencial nutricional e tecnológico, considerando a atual tendência no aumento do

consumo de alimentos funcionais, tornando-os importantes ingredientes para uso

industrial na produção de sobremesas, bebidas, pães, geleias, emulsões, biscoitos,

alimentos cozidos e fritos, entre outros (CAPITANI et al., 2012; VÁZQUEZ-OVANDO

et al., 2009; ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008).

42

Dessa forma, diversos estudos têm relatado a vantagem nutricional da

utilização da chia ou de seus derivados, na alimentação animal, em relação às

outras fontes de PUFA. A adição de chia em dietas de aves para produção de ovos

(AYERZA; COATES, 1999, 2000, 2001, 2002) e produção de carne (AYERZA et al.,

2002), na dieta de vacas para a produção de leite (AYERZA; COATES, 2006), e nas

dietas de coelhos (PEIRETTI; MEINERI, 2008) e porcos para produção de carnes

(COATES; AYERZA, 2009) trazem consequentes benefícios aos consumidores

quanto a qualidade nutricional desses produtos, caracterizando a chia como uma

das fontes mais eficientes de PUFA n-3 para o enriquecimento de alimentos.

Além do potencial como fonte de nutrientes viável para alimentação animal,

as sementes de chia e seus derivados têm crescente interesse para indústrias

alimentícias. As sementes também são usadas como suplementos nutricionais, bem

como na fabricação de barras de cereais, cereais matinais e cookies, nos EUA,

América Latina e Austrália com mercado promissor (DUNN, 2010). Em 2009, foi

aprovado como novo alimento pelo Parlamento Europeu e pelo Conselho Europeu

(COMMISSION, E.U., 2009). Não há evidência de efeitos adversos ou de

alergenicidade causada pela ingestão de sementes de chia inteiras ou moídas

(EFSA, 2005; 2009).

Ainda que não haja evidências sobre efeitos adversos da chia, vale ressaltar

que o US Dietary Guidelines recomenda que o consumo de chia não exceda 48

g/dia e que o Conselho Europeu aprova o uso de semente de chia em produtos de

panificação até o limite de 5%. Embora os produtos de panificação sejam os mais

comuns e viáveis tecnologicamente para o enriquecimento, a chia é amplamente

utilizada nas indústrias alimentícias de diversos países, até mesmo em produtos

aparentemente improváveis de serem enriquecidos como sucos de fruta e iogurte

(BORNEO et al., 2010; MOHD ALI et al., 2012).

Olivos-Lugo e colaboradores (2010) estudaram as principais frações proteicas

da chia e demonstraram excelentes propriedades tecnológicas como capacidade de

retenção de água e capacidade de retenção de óleo constituindo ótimas alternativas

para produtos de panificação e emulsões. Um estudo demonstrou que a inclusão de

hidrolisados enzimáticos de frações ricas em proteína de chia no pão branco e

creme de cenoura aumentou o potencial biológico sem afetar a qualidade dos

43

produtos (SEGURA-CAMPOS et al., 2013). Outro estudo determinou a aceitação

geral, as características sensoriais, propriedades funcionais e quantidade de

nutrientes de bolos formulados utilizando gel de chia (mucilagem gelatinosa, ou seja,

produto obtido quando sementes de chia são imersas em água) como um substituto

para óleo ou ovos, nas concentrações de 25%, 50% e 75%. Os resultados indicaram

que a substituição com 25% de gel de chia nos bolos não foi significativamente

diferente do controle para aspectos como cor, sabor, textura e aceitabilidade geral. A

substituição do óleo com 50% do gel de chia, em comparação com o controle,

promoveu a redução de quilocalorias e gordura nas formulações, demonstrando que

a utilização dessa substituição em preparações comuns pode gerar um produto mais

nutritivo mantendo suas características funcionais e sensoriais (BORNEO et al.,

2010).

Recentemente, Coelho e Salas-Mellado (2015) adicionaram semente e

farinha de chia em pães de farinha de trigo reduzindo o teor de gordura vegetal

hidrogenada nas formulações. Os autores encontraram, nas formulações

modificadas, redução de gordura saturada, aumento dos teores de gordura poli-

insaturada, principalmente ômega-3, além do aumento dos teores de fibras

apresentando características de produtos funcionais. Porém, a qualidade tecnológica

dos pães foi afetada pela adição de chia nas formulações, levando a uma diminuição

no volume específico. Na avaliação sensorial, os pães apresentaram elevados níveis

de aceitabilidade e planos de compra, demonstrando a viabilidade comercial desses

produtos.

A farinha de chia tem sido utilizada também como alternativa para produtos

isentos de glúten. Costantini e colaboradores (2014) demonstraram que a adição de

10% de farinha de chia em formulações de pães com trigo sarraceno melhorou o

valor nutricional dos pães sem afetar os parâmetros tecnológicos. Dessa forma, os

pães elaborados com farinha de chia e trigo sarraceno podem ser indicados para

pacientes celíacos, diabéticos e obesos devido à isenção de glúten, ao baixo teor de

carboidratos, alto teor de proteínas, fibras insolúveis e ácidos graxos ômega-3.

Porém, a aceitabilidade sensorial das formulações não foi avaliada nesse estudo.

Embora a chia esteja em ascensão quanto à sua utilização como ingrediente

funcional na indústria alimentícia, a sua incorporação na dieta habitual ainda é um

44

desafio por alguns motivos, a citar o custo final do produto e o hábito alimentar da

população. Uma forma interessante e bastante recente de apresentação da chia é a

composição com outros alimentos funcionais, na forma de grãos/sementes ou

farinhas. Encontra-se disponível no mercado opções de composição da chia com

linhaça, amaranto e quinoa, constituindo mais uma alternativa de inclusão desta

semente na alimentação habitual. Ademais, as expectativas de aumento do uso da

chia e dos produtos enriquecidos com ela pela população são muito positivas, visto

que o seu cultivo é de fácil manejo e rentável até mesmo para pequenos produtores.

2.3.4 Efeitos biológicos da semente e do óleo de chia

Pesquisas recentes têm mostrado os efeitos fisiológicos benéficos do

consumo das sementes e/ou óleo de chia em modelos animais (AYERZA; COATES,

2005, 2007; ESPADA et al., 2007; CHICCO et al., 2009; POUDYAL et al., 2012;

GONZÁLEZ-MAÑÁN et al., 2012; ROSSI et al., 2013; OLIVA et al., 2013;

VALENZUELA et al., 2014; SIERRA et al., 2015) (Tabela 1) e em humanos

(VUKSAN et al., 2007, 2010; NIEMAN et al., 2009, 2012; JIN et al., 2012) (Tabela 2).

Ayerza e Coates (2005) iniciaram as pesquisas relacionadas aos efeitos

biológicos da suplementação com produtos de chia in vivo. Animais alimentados com

óleo e/ou semente de chia apresentaram uma redução significativa nos níveis

séricos de triacilglicerois (TG) e colesterol total, um aumento nos níveis de HDL-

colesterol, sem alteração na concentração de LDL-colesterol sérico. Também houve

um aumento nas concentrações séricas de ALA e DHA, e uma melhor proporção dos

ácidos graxos n-6/n-3 a partir da suplementação com os produtos de chia em

relação ao controle, sem causar efeito adverso sobre o crescimento dos animais.

Posteriormente, Ayerza e Coates (2007) seguindo o mesmo delineamento

experimental, também observaram uma melhora no perfil lipídico sérico e na

composição de ácidos graxos plasmáticos após a ingestão de semente ou óleo de

chia durante 4 semanas.

Os resultados do estudo de Espada e colaboradores (2007) mostraram que

uma dieta rica em ácidos graxos poli-insaturados n-3, a partir da semente de chia, foi

capaz de inibir o crescimento e formação do tumor de glândula mamária e o número

de metástases, ligado a um aumento da apoptose e uma redução da mitose

45

encontradas em tecidos tumorais. As células neoplásicas apresentaram baixos

níveis de AA e ambos eicosanoides derivados da via lipoxigenase (ácido 12-

hidroxieicosatetraenoico, 12-HETE) e cicloxigenase (ácido 12-

hidroxiheptadecatrienoico, 12-HHT), em comparação com os controles. A infiltração

de linfócitos T também foi mais elevada em relação às outras dietas.

Chicco e colaboradores (2009) investigaram os benefícios da ingestão da

semente de chia sobre a dislipidemia e resistência à insulina (RI), induzida pela

ingestão de uma dieta rica em sacarose (62,5%) (SRD) em ratos Wistar. Os autores

observaram que a suplementação com as sementes de chia (36,2%) preveniu o

aparecimento de dislipidemia e RI em ratos alimentados com a dieta SRD durante 3

semanas, sem alteração da glicemia. Em longo prazo (5 meses) houve normalização

da dislipidemia e RI e redução da adiposidade visceral quando a semente de chia

substituiu a gordura dietética durante os últimos dois meses do período

experimental. Além disso, o presente estudo forneceu dados sobre o efeito benéfico

da semente de chia sobre o perfil lipídico e homeostase da glicose em um modelo

experimental de dislipidemia e RI.

Posteriormente, Poudyal e colaboradores (2012) avaliaram a suplementação

com as sementes de chia (5%) por 8 semanas, após 56 dias de indução da

obesidade a partir de uma dieta hiperlipídica (24%) e hiperglicídica (52%), com 25%

de frutose na água de beber, em ratos Wistar. Os autores observaram melhora da

sensibilidade à insulina e da tolerância à glicose, redução da adiposidade visceral e

da esteatose hepática, diminuição da inflamação e fibrose cardíaca e hepática, sem

alterações na concentração dos lipídeos plasmáticos e na pressão sanguínea. Além

disso, houve melhora na razão n-3/n-6 no plasma, coração, fígado e tecido adiposo

dos animais, depleção do ácido graxo linoleico e seus produtos em todos os tecidos,

sugerindo aumento da oxidação mitocondrial, inibição da estearoil-CoA dessaturase

(enzima chave que catalisa a produção de ácido graxo insaturado a partir dos

saturados) pelo ácido graxo ALA, induzindo uma redistribuição lipídica associada

com cardioproteção e hepatoproteção.

Outro estudo demonstrou que a adição de 10% de óleo de chia nas dietas de

ratos Sprague-Dawley saudáveis aumentou a concentração de ALA, EPA e DHA no

plasma, fígado e tecido adiposo, melhorou a proporção dos ácidos graxos n-6/n-3,

46

além de aumentar a expressão do PPAR-α e enzimas lipolíticas no fígado,

responsáveis por aumentar a b-oxidação de ácidos graxos, o que pode ser uma

possível explicação para os efeitos hipolipidêmicos da chia (GONZÁLEZ-MAÑÁN et

al., 2012).

Recentemente, Rossi et al (2013) e Oliva et al (2013) têm buscado elucidar

alguns dos mecanismos responsáveis pelas alterações metabólicas e pela

prevenção, melhora e/ou reversão da dislipidemia, esteatose hepática e resistência à

insulina em ratos Wistar induzidos por dieta. Dentre os seus achados destacam-se:

(i) no fígado, aumento da expressão gênica e da atividade de enzimas chave na

oxidação de ácidos graxos, promovendo o deslocamento do equilíbrio do

metabolismo de ácido graxo a favor da oxidação ao invés do armazenamento;

redução da expressão e da atividade de enzimas lipogênicas hepáticas; (ii) no tecido

adiposo, redução da atividade de enzimas lipogênicas, redução da lipólise basal e

da hipertrofia celular no tecido adiposo epididimal, aumento da sensibilidade do

adipócito à ação antilipolítica da insulina; (iii) no músculo, redução do

armazenamento de lipídeo e aumento da fosforilação e oxidação da glicose e da

sensibilidade à insulina. Tais mecanismos contribuem para a melhora/normalização

da disfunção do tecido adiposo, homeostase da glicose, esteatose hepática,

dislipidemia e resistência à insulina periférica, além da redução da lipotoxicidade.

Estes efeitos podem estar relacionados às alterações subsequentes no conteúdo de

ácidos graxos em fosfolipídios de membrana de tecidos alvo da insulina, devido às

interações competitivas no metabolismo dos ácidos graxos poli-insaturados da

família n-6 e n-3, o que poderia, por sua vez, melhorar a sensibilidade à insulina.

Valenzuela e colaboradores (2014) demonstraram que a ingestão de

diferentes óleos vegetais (ricos em ALA), incluindo o óleo de chia, alterou a

composição de ácidos graxos em diversos tecidos de ratos Wistar saudáveis. O óleo

de chia foi capaz de aumentar as concentrações de EPA nos eritrócitos, fígado, rins,

intestino delgado, coração e músculo, mas não no cérebro. Os níveis de DHA foram

aumentados no fígado, intestino e cérebro. Dessa forma, os autores sugerem que a

conversão de ALA em ácidos graxos poli-insaturados da família ômega-3 é efetiva,

mas bastante seletiva dependendo do tecido estudado.

47

A Figura 3 ilustra os efeitos metabólicos e os mecanismos moleculares em

diferentes tecidos a partir da ingestão da semente ou óleo de chia em animais

experimentais (AYERZA; COATES, 2005, 2007; CHICCO et al., 2009; POUDYAL et

al., 2012; GONZÁLEZ-MAÑÁN et al., 2012; ROSSI et al., 2013; OLIVA et al., 2013;

VALENZUELA et al., 2014).

Figura 3. Esquema dos efeitos benéficos e mecanismos moleculares em diferentes

tecidos a partir da ingestão da semente de chia (Salvia hispanica L.) in vivo. AA:

ácido graxo araquidônico; ACC: acetil CoA carboxilase; ALA: ácido graxo α-

linolênico; CPT: carnitina palmitoil transferase; CT: colesterol total; DAG:

diacilglicerol; DHA: ácido graxo docosahexaenoico; DPA: ácido graxo

docosapentaenoico; EPA: ácido graxo eicosapentaenoico; FAO: ácido graxo

oxidase; FAS: ácido graxo sintase; FFA: ácido graxo livre; G6-P: glicose 6-fosfato; G-

6-PDH: glicose-6-fosfato desidrogenase; GLUT-4: transportador de glicose

48

dependente de insulina; HDL-c: lipoproteína de alta densidade; LCA-CoA: acil-

Coenzima A de cadeia longa; n-6/n-3: razão entre os ácidos graxos n-6 e n-3; PCR:

proteína C-reativa; PDHc: complexo piruvato desidrogenase; PPARα: receptor

ativado por proliferadores de peroxissoma; SAT: ácido graxo saturado; SREBP-1c:

proteína 1c ligadora do elemento regulatório de esterol; TG: triacilglicerol. Adaptado

de MARINELI et al., (2015).

49

Tabela 1. Estudos realizados em animais com a semente e óleo de chia (Salvia hispanica L.).

Modelo

experimental N Tratamento Duração Resultados Referência

Ratos Wistar

saudáveis 24

Dietas isocalóricas derivadas do

óleo de milho (controle); 15% de

semente de chia; e 5% de óleo de

chia

4 semanas

Redução dos níveis séricos de TG e CT,

aumento nos níveis de HDL-c. Aumento

na concentração sérica de ALA e melhor

proporção dos ácidos graxos n-6/n-3

Ayerza e

Coates (2005)

Ratos Wistar

saudáveis 32

Dietas isocalóricas derivadas do

óleo de milho (controle); 16% de

semente de chia inteira; 16% de

semente de chia moída; e 5% de

óleo de chia

4 semanas

Aumento nos níveis séricos de HDL-c e

redução dos níveis de TG. Aumento da

concentração plasmática de ácidos graxos

n-3 (ALA, EPA e DHA) e redução dos

ácidos graxos n-6 (LA e AA), com melhor

proporção dos ácidos graxos n-6/n-3

Ayerza e

Coates (2007)

Camundongos

BALB/c inoculados

com adenocarcinoma

de glândula mamária

60

Dieta comercial (controle); 6% óleo

de chia; e 6% óleo de cártamo. Após

3 meses os animais foram

transplantados com adenocarcinoma

mamário com capacidade

metastática moderada

3 meses

(dieta) e

45-50 dias

(tumor)

Inibição do crescimento, número de

metástases e formação do tumor de

glândula mamária

Espada et al.

(2007)

50

Modelo


Ratos Wistar

dislipidêmicos e

resistentes à insulina

induzidos por dieta

72

96

Dieta comercial (controle); dieta rica

em sacarose (62,5%); dieta com

semente de chia (36,2%)

3 semanas

5 meses

Prevenção da dislipidemia e resistência à

insulina

Normalização da dislipidemia, resistência

à insulina e redução da adiposidade

visceral

Chicco et al.

(2009)

Ratos Wistar obesos

induzidos por dieta

48

Dieta a base de amido de milho

(controle); dieta controle com

semente de chia (5%); dieta

hiperlipídica (24%) e hiperglicídica

(52%), com 25% de frutose na água

de beber (obesogênica); dieta

obesogênica com sementes de chia

(5%)

8 semanas

Melhora da sensibilidade à insulina e da

tolerância à glicose, redução da

adiposidade visceral e da esteatose

hepática, diminuição da inflamação e

fibrose cardíaca e hepática. Melhor

proporção dos ácidos graxos n-3/n-6 no

plasma, coração, fígado e tecido adiposo

Poudyal et al.

(2012)

Ratos Sprague-

Dawley saudáveis 27

Dieta experimental com óleo de

girassol (10%) (controle), óleo de

rosa mosqueta (10%) e óleo de chia

(10%)

21 dias

Aumento da concentração de ALA, EPA e

DHA no plasma, fígado e tecido adiposo

com melhor proporção dos ácidos graxos

n-6/n-3. Aumento da expressão de genes

lipolíticos

González-

Mañán et al.

(2012)

51

Modelo


Ratos Wistar

dislipidêmicos e


induzidos por dieta

24

40




3 semanas

5 meses

Prevenção (3 semanas) ou

melhora/normalização (5 meses) da

dislipidemia, esteatose hepática e

homeostase da glicose a partir de

alterações no metabolismo de ácidos

graxos hepáticos (lipogênese/oxidação)

Rossi et al.

(2013)

Ratos Wistar

dislipidêmicos e


induzidos por dieta

18




6 meses

Redução da hipertrofia de adipócitos,

melhora na atividade de enzimas

lipogênicas. Normalização do

armazenamento e oxidação de lipídeos no

músculo esquelético. Reversão da

resistência à insulina e dislipidemia

Oliva et al.

(2013)

Ratos Wistar

saudáveis 60

Dietas experimentais suplementadas

com 10% de óleo de girassol,

canola, Rosa canina, sacha inchi e

óleo de chia

21 dias

Melhora do perfil de ácidos graxos em

diversos tecidos. Aumento da

concentração de EPA nos eritrócitos,

fígado, rins, intestino delgado, coração e

músculo; e de DHA no fígado, intestino

delgado e cérebro. A concentração de

ALA foi maior em todos os tecidos

estudados, exceto no cérebro

Valenzuela et

al. (2014)

52

Modelo


Coelhos saudáveis e

dislipidêmicos

induzidos por dieta

32

Dieta comercial (controle); dieta com

óleo de chia (10%); dieta com

colesterol (1%); dieta com colesterol

(1%) e óleo de chia (10%)

5-6

semanas

Melhora da função vascular contra efeitos

deletérios da hipercolesterolemia e

aumento da concentração de ALA no

plasma

Sierra et al.

(2015)

Ácido graxo α-linolênico (ALA); Ácido graxo araquidônico (AA); Ácido graxo linoleico (LA); Ácido graxo eicosapentaenoico (EPA); Ácido graxo

docosahexaenoico (DHA); Colesterol total (CT); HDL-colesterol (HDL-c); Triacilglicerol (TG). Adaptado de MARINELI et al. (2015).

53

Alguns grupos de pesquisa também têm avaliado os efeitos fisiológicos da

ingestão das sementes de chia em humanos. Em 2007, Vuksan e colaboradores

utilizaram o ―grão integral‖ Salba - uma marca utilizada para descrever duas

variedades brancas registradas, Sahi Alba 911 e 912, que são o resultado de

cruzamentos seletivos a partir do grão preto da chia (Salvia hispanica L.) - como

ingrediente na formulação de pães. Vinte indivíduos com DM2 consumiram cerca de

37g por dia de Salba ou farelo de trigo (controle) durante 12 semanas, mantendo

suas terapias convencionais do diabetes. Comparado ao controle, a Salba reduziu a

pressão arterial sistólica, as concentrações de proteína C-reativa, com reduções

significativas na hemoglobina glicosilada e fibrinogênio em relação aos valores

basais (inicial) no grupo Salba, mas não em relação ao controle. Não houve

mudanças nos parâmetros de segurança, incluindo fígado, rins e função

hemostática, ou peso corporal. As concentrações plasmáticas dos ácidos graxos n-3,

ALA e EPA foram aumentadas com o consumo da Salba. Dessa forma, os autores

concluíram que a suplementação com os grãos de Salba, em longo prazo, atenuou

importante fator de risco cardiovascular e fatores emergentes, mantendo adequado

controle lipídico e glicêmico em indivíduos com DM2 controlada.

Em 2010, Vuksan e colaboradores avaliaram a ingestão de grãos integrais de

Salba na redução da glicemia pós-prandial em indivíduos saudáveis. No estudo

agudo, randomizado, duplo-cego e controlado, 11 indivíduos saudáveis receberam

0, 7, 15 ou 24 g de Salba no pão branco. A diminuição da glicemia pós-prandial foi

observada para todas as doses de Salba ingeridas, assim como o aumento da

saciedade. Estes achados sugerem que a ingestão de doses crescentes de Salba

melhorou a glicemia pós-prandial de maneira dose-dependente, fornecendo uma

possível explicação para as melhorias na pressão arterial, coagulação e marcadores

inflamatórios previamente observados após 12 semanas de suplementação com

Salba em diabéticos do tipo 2 (VUKSAN et al., 2007).

Apesar dos diversos efeitos benéficos relatados acima, Nieman e

colaboradores (2009) avaliaram a eficácia da ingestão de sementes de chia (50 g/dia

54

misturados com 250 mL de água, divididos em duas porções, antes das principais

refeições) na promoção da perda de peso e alteração de fatores de risco de doença

em 76 adultos com sobrepeso, durante 12 semanas e não verificaram melhora da

perda de peso, alteração da composição corporal, atenuação da inflamação

(proteina C-reativa, IL-6, MCP-1, TNF-α), aumento da capacidade antioxidante,

melhora do perfil lipídico sanguíneo ou da pressão arterial em homens e mulheres

com sobrepeso. Entretanto, a concentração plasmática de ALA aumentou 24,4% no

grupo suplementado em comparação com uma redução de 2,8% no controle.

No estudo de Jin e colaboradores (2012), dez mulheres na pós-menopausa

ingeriram cerca de 25 g/dia de semente de chia moída, durante 7 semanas, e

apresentaram aumento significativo da concentração plasmática de ALA, após uma

semana de suplementação, que permaneceu 138% acima dos níveis basais até o

final do estudo. A concentração plasmática de EPA aumentou 30% e foi

correlacionada ao longo do tempo com o ALA. Porém, não houve alteração

significativa na concentração de ácido docosapentaenoico (DPA), enquanto o nível

de DHA diminuiu ligeiramente até ao final do estudo e não foi relacionado ao

aumento de ALA. Pesquisadores do mesmo grupo de pesquisa avaliaram, em

estudo duplo-cego, a ingestão de 25 g/dia de semente de chia (inteira ou moída) ou

placebo (semente de papoula) em 56 mulheres na pós-menopausa com sobrepeso

durante 10 semanas e encontraram um aumento na concentração plasmática de

ALA e EPA em 58% e 39%, respectivamente, no grupo que recebeu semente de

chia moída em comparação aos grupos que receberam semente de chia inteira ou

placebo, sem alterações na inflamação ou fatores de risco de doenças avaliados por

diferentes parâmetros (NIEMAN et al., 2012).

Tendo em vista a importante composição química, o valor nutricional, o

potencial funcional e tecnológico, e os efeitos benéficos atribuídos a chia in vivo e in

vitro, são necessárias investigações mais detalhadas que avaliem os mecanismos

fisiológicos e moleculares, bem como o impacto biológico da sua suplementação, a

longo prazo, para que este composto possa ser utilizado como estratégia segura e

eficaz na prevenção e/ou tratamento de DCNT.

55

Tabela 2. Estudos realizados em humanos com a semente chia (Salvia hispanica L.).

Modelo N Tratamento Duração Resultados Referências

Indivíduos com

diabetes mellitus

tipo 2 (DM2)

20

Ingestão de 37 g/dia de

semente de chia ou

farelo de trigo (controle)

12

semanas

Redução da pressão arterial sistólica, da concentração de

proteína C-reativa, hemoglobina glicosilada e fibrinogênio.

Aumento das concentrações plasmáticas dos ácidos graxos n-3

(ALA e EPA). Atenuação de importante fator de risco

cardiovascular e fatores emergentes, mantendo adequado

controle lipídico e glicêmico

Vuksan et al.

(2007)

Indivíduos com

sobrepeso

76

Ingestão de sementes

de chia (50 g/dia com

250 mL de água) duas

vezes por dia

12

semanas

Aumento da concentração plasmática de ALA (24,4%). Não

apresentou alterações na composição corporal ou nos fatores

de risco de doença avaliados

Nieman et al.

(2009)

Indivíduos

saudáveis 11

Ingestão de 0, 7, 15 ou

24 g de semente de chia

no pão branco

5 dias Redução e melhora da glicemia pós-prandial de maneira dose-

dependente e aumento da saciedade

Vuksan et al.

(2010)

Mulheres na pós-

menopausa 10


semente de chia moída

7

semanas

Aumento das concentrações plasmáticas de ALA (138%) e

EPA (30%), sem alteração de nos níveis de DPA e DHA

Jin et al.

(2012)

56

Modelo N Tratamento Duração Resultados Referências

Mulheres na pós-

menopausa 56


semente de chia (inteira

ou moída) ou placebo

(semente de papoula)

10

semanas

Aumento das concentrações plasmáticas de ALA (58%) e EPA

(39%) somente no grupo que recebeu semente de chia moída.

Não apresentou alterações no perfil inflamatório ou nos fatores

de risco de doença avaliados.

Nieman et al.

(2012)

Ácido graxo α-linolênico (ALA); Ácido graxo eicosapentaenoico (EPA); Ácido graxo docosahexaenoico (DHA); Ácido graxo docosapentaenoico

(DPA) (MARINELI et al., 2015).

57

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71

CAPÍTULO I

72

ARTIGO I

Artigo publicado em revista internacional: LWT - Food Science and

Technology, 59, (2014), p. 1304-1310. http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2014.04.014

Chemical characterization and antioxidant potential of Chilean chia seeds and

oil (Salvia hispanica L.)

Rafaela da Silva Marineli a, Érica Aguiar Moraes a, Sabrina Alves Lenquiste a,

Adriana Teixeira Godoy b, Marcos Nogueira Eberlin b, Mário Roberto Maróstica Jr a,*

a Department of Food and Nutrition, Faculty of Food Engineering, University of

Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.

b ThoMSon Mass Spectrometry Laboratory, Institute of Chemistry, University of

Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.

*Corresponding author. Email address: [email protected] Tel.: +55 19 3521-

4059; fax: +55 19 3521-4060. Address: Monteiro Lobato st., 80, zip code 13083-862,

Campinas, São Paulo, Brazil.

1 Abbreviations

AOAC (Association of Official Analytical Chemists), ALA (α-Linolenic acid), EASI-MS (easy

ambient sonic-spray ionization mass spectrometry), FAME (fatty acids methyl esters), FID

(flame ionization detector), GC (Gas chromatography), IDF (Insoluble dietary fiber), MDA

(Malondialdehyde), PUFA (Polyunsaturated fatty acids), SDF (Soluble dietary fiber), TAG

(Triacylglycerols), TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances), TDF (Total dietary

fiber), 3,4-DHPEA-EDA (3,4-dihydroxyphenylethanol-elenolic acid dialdehyde).

http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2014.04.014

mailto:[email protected]

73

Abstract

The objective of this study was to chemically and nutritionally characterize the

commercial chia seeds and oil from Chile and investigate their antioxidant potential

by different in vitro methods. The chia seed presented a good source of protein

(25.32 g/100 g), oil (30.22 g/100 g) and total dietary fiber (37.50 g/100 g), with

predominant insoluble fiber (35.07 g/100 g). The main fatty acids, ranked order of

abundance, were α-linolenic acid > linoleic acid > palmitic acid ~ oleic acid > stearic

acid. The triacylglycerols (TAG) in chia oil were identified by direct mass

spectrometry using the easy ambient sonic-spray ionization (EASI-MS) technique

and linolenic acid (Ln) was present in the most TAG found. The oil also presented a

low peroxide index value (2.56 mEq peroxide/kg). The samples exhibited a high

antioxidant activity by the various in vitro methods evaluated; it is due to the

presence of phenolic compounds in the seed or oil, which were, mainly, myricetin,

quercetin, kaempferol, chlorogenic acid and 3,4-dihydroxyphenylethanol-elenolic acid

dialdehyde (3,4-DHPEA-EDA). Our results therefore suggest that Chilean chia seeds

and oil should be considered as functional ingredients with high antioxidant potential

in food products with commercial applications.

Key words: Chia, Salvia hispanica, Omega-3 fatty acid, Phenolic compounds,

Antioxidant activity

74

1. Introduction

Chia (Salvia hispanica L.) is an annual herbaceous plant that belongs to the

Lamiaceae family. This plant is native from southern Mexico and northern Guatemala

(Ayerza, 1995), and has recently been marketed as a crop in South America (Ayerza

& Coates, 2011). The use of chia may be in the form of whole seeds, flour, mucilage

and oil seed. The chia seed has been described as a good source of oil, protein,

dietary fiber, minerals and polyphenolic compounds (Ayerza & Coates, 2004; Reyes-

Caudillo, Tecante & Valdivia-López, 2008; Capitani et al., 2012). The revival of

interest in chia seed is due to their oil content, which provides rich source of

polyunsaturated fatty acids (PUFA). The chia oil is unique since it contains the

highest proportion of omega-3-linolenic acid (ALA) of any known natural source

(Ayerza, 1995; Coates & Ayerza, 1996). ALA plays an important role in health and is

used in several foods and cosmetics. Many studies have provided evidence that

regular consumption or dietary supplementation with long chain n-3 PUFA brings

numerous health benefits, including the prevention of cardiovascular diseases,

hypertension and inflammatory diseases (Albert et al., 2005; Garg et al., 2006).

In addition, chia seed and oil contain a rich pool of natural antioxidants such

as tocopherols, phytosterols, carotenoids (Álvarez-Chávez et al., 2008; Ixtaina et al.,

2011) and phenolic compounds, including chlorogenic acid, caffeic acid, myricetin,

quercetin and kaempferol (Reyes-Caudillo et al., 2008; Capitani et al., 2012), which

protects consumers against many diseases and also promotes beneficial effects on

human health (Nijveldt et al., 2001).

Chia seed and oil are important raw materials to functional foods due to its

bioactive components, offering advantages over other available n-3 sources (Coates

& Ayerza, 1996). Previous studies have shown that the oil, or their by-products, can

be used for animal feed industries, to obtain PUFA enriched animal products and

consequent better nutritional value (Ayerza, Coates & Lauria, 2002; Coates &

Ayerza, 2009). The benefits of chia seed has recently been described for human

health and nutrition because their bioactive components were found to promote

health benefits (Vuksan et al. 2007, 2010), improving biological markers related to

75

dyslipidemia, inflammation, cardiovascular disease, glucose homeostasis, and insulin

resistance, without promote adverse effects.

The previous studies have characterized chia seed and oil mainly in Mexico

(Reyes-Caudillo et al., 2008; Vázquez-Ovando et al., 2009), Argentina (Ixtaina et al.,

2011; Capitani et al., 2012), and other countries in South America (Ayerza & Coates,

2011), but, to the best of our known, there are to date no reports on chia seed and oil

from Chile. Geographical origin is known to have significant impacts on seed

composition and concentration of bioactive compounds (Ayerza & Coates, 2011).

There is also little information available regarding the antioxidant potential of chia

seed and oil and few methods have been explored.

The purpose of this study was therefore to chemically and nutritionally

characterize the commercial chia seeds and oil from Chile and investigate their

antioxidant potential by different in vitro methods in order to assess their potential as

functional ingredients in food products.

2. Materials and methods

2.1. Seeds, oil and chemicals

Fresh chia seed (two different batches, 4.5 kg each) and chia oil (two different

batches, 5.0 L each) from FTP S.A. Santiago, Chile were purchased from R&S

Blumus Comercial de Produtos Alimentícios Ltda, Brazil. According to the producer,

chia oil was obtained by cold pressing and stored at 2-8 °C until use in amber glass

bottles without head space. All solvents were analytical grade from J.T. Baker

(Phillipsburg, NJ, USA). Total dietary fiber assay kit (TDF-100A), 6-hydroxy-2,5,7,8-

tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox), 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)

dihydrochloride (AAPH), 2,4,6- tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), 2-thiobarbituric acid

(TBA), 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Folin–Ciocalteu's reagent and gallic

acid were all obtained from Sigma-Aldrich (Sigma Co., St. Louis, MO, USA).

Fluorescein sodium salt was purchased from Vetec Química Fina (Sao Paulo, Brazil).

76

2.2. Flours

The seeds were grounded in a laboratory impact mill (Marconi MA 630/1) and

passed through a 0.850 mm sieve. This flour was used to estimate the raw proximate

composition and malondialdehyde (MDA) assay. Defatting with n-hexane was carried

out in a Soxhlet apparatus. The defatted flour was stored in dark-tightly closed bottles

and stored at 2-8 °C until the analysis. The defatted flour was used for the analysis of

dietary fiber and for the preparation of the ethanolic extract.

2.3 Proximate composition

Protein was determined by the semi-micro Kjeldahl method and ashes were

quantified by means of sample incineration in a muffle furnace as described by

Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2000). Total lipids were

determined by the method of Bligh and Dyer (1959), and moisture in an oven at 105

± 1 °C. Carbohydrates were calculated by difference using Eq. (1). Total energy

value was estimated using the isoperibol automatic calorimeter (PARR 1261) with

oxygen pump (PARR 1108).

Carbohydrate = 100 - (Ash + Moisture + Protein + Lipids). Eq. (1).

2.4. Total, soluble and insoluble dietary fiber

Total dietary fiber (TDF), soluble dietary fiber (SDF) and insoluble dietary fiber

(IDF) were determined using the enzymatic-gravimetric AOAC method (Prosky et al.,

1988).

2.5. Fatty acid profiles of chia oil

The fatty acid composition of the chia oil was determined by gas

chromatography (GC) (Kramer et al., 1997) using a capillary GC Agilent 6850 Series

GC System, capillary column DB-23 Agilent (50% cyanopropyl‐methylpolysiloxane,

60 m x 0.25 mm×0.25 μm), with flame ionization detector (FID). Oven temperature

was 110 °C for 5 min, 110–215 °C (5 °C/min), 215 °C for 24 min; detector

temperature: 280 °C; injector temperature: 250 °C; carrier gas: helium; split ratio

77

1:50; injection volume: 1.0 uL. Oil samples were saponified in 0.5 mol/L methanolic

KOH. The fatty acids methyl esters (FAME) were prepared as described by Maia and

Rodriguez-Amaya (1993). FAMEs were identified by comparison of retention times

with FAME standard mixture under the same conditions (FAME Mix GLC-68A; Nu-

Chek-Prep, INC, Elysian, MN, USA) and quantified using area normalization.

2.6. Triacylglycerol composition of chia oil

Profiles of major TAG were obtained directly from the chia oil via easy ambient

sonic-spray ionization mass spectrometry work in positive ion mode (EASI(+)-MS)

(Simas et al., 2010). The EASI(+)-MS data were collected in the positive ion mode

using a unit mass resolution compact single-quadrupole mass spectrometer

(Shimadzu LCMS 2010, Japan) equipped with a homemade EASI source, which is

described in detail elsewhere (Haddad, Sparrapan & Eberlin, 2006). A tiny droplet of

the chia oil sample (2 μL) was dipped directly onto a paper surface (brown Kraft

envelope paper). Experimental EASI parameters were as follow: methanol flow rate

of 20 μL/min, N2 as the nebulizing gas at 3 L/min, and paper/source entrance angle

of ∼30°. Mass spectra were accumulated over 30 s and scanned over the m/z

100−1000 range.

2.7. Lipid autoxidation products

2.7.1. Peroxide Index

Peroxide index determination in chia oil was performed according to the official

Association of Official Analytical Chemists method (AOAC, 2000), which is based on

the oxidation of iodine in the presence of potassium iodide by the peroxide present in

the sample, assuming that all oxidizing substances in the sample are peroxides.

Results were expressed as mEq peroxide/kg sample.

2.7.2. Malondialdehyde

Determination of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) was done in

fresh chia seed samples (250 mg each) and chia oil samples (115 mg each) using

78

the method proposed by Sinnhuber and Yu (1958). The method is based in the

formation of a pink-red pigment composed of 2 molecules of thiobarbituric acid (TBA)

and 1 molecule of MDA. Absorbance was read in visible light with a wavelength of

535 nm, using a 1% solution of 2-thiobarbituric acid for calibration. Results were

expressed as mg MDA/kg sample using Eq. (2):

Dilution factor = (100 (mL) / sample weight (g)) / 100 %

―TBA value‖ = [(Absorbance x Dilution factor) / bucket diameter (1 cm)] x 46 mg de

malondialdehyde

2.8. Extraction with ethanol

Extraction of phenolic compounds was carried out according to Capitani et al.

(2012), with some modifications. One gram of defatted flour was extracted with 10

mL of ethanol at room temperature for 3h under mechanical shaking. The mixture

was centrifuged at 3000g for 15 min. The supernatant was evaporated using a

rotavapor apparatus and dissolved in 1 mL ethanol. This extract was used for all

analyzes below.

2.9. Total phenolic content

The total phenolic content of chia seed extract was determined according to

Folin–Ciocalteu's method (Swain & Hillis, 1959), with some modifications. In a vial,

50 μL of extract, 800 μL distilled water and 25 μL (0.25 N) Folin–Ciocalteu's reagent

were mixed and incubated at room temperature for 3 min. Then, 100 μL sodium

carbonate solution (1 N) was added and further incubated for 2 h at room

temperature. The absorbance was read at 725 nm in a microplate reader SynergyHT,

Biotek (Winooski, USA); with Gen5™2.0 data analysis software spectrophotometer.

Gallic acid was used in a standard curve (16–500ug gallic acid/mL water) and the

results were expressed in terms of gallic acid equivalent (GAE/g).

79

2.10. Polyphenol analysis

Identification of the phenolic compounds in chia oil and in chia seed ethanolic

extract was carried out using EASI(-)-MS. The data was collected in the negative ion

mode and the equipment conditions were described in 2.6. section.

2.11. Antioxidant potential in chia seed extract

The readings of absorbance and fluorescence were done in a microplate

reader Synergy HT, Biotek (Winooski, USA); with Gen5™ 2.0 data analysis software

spectrophotometer.

2.11.1. DPPH free radical scavenging activity

The free radical scavenging activity of the extracts was determined based on

the DPPH method (Rufino et al., 2007). The extract (33 μL) was added in 1.3 mL

DPPH solution diluted in methanol (0.024 mg/mL), shaking and incubated for 30 min

in dark, and absorbance was measured at 515 nm. The Trolox standard curve was

made (5–600 μmol TE). Results were expressed in μmol Trolox equivalent (TE)/g.

2.11.2. FRAP assay (ferric reducing antioxidant power)

The ferric reducing ability was determined by FRAP method (Benzie & Strain,

1996), with adaptations. Under dark conditions, FRAP reagent was prepared with

300 mmol/L acetate buffer (pH 3.6), 10 mmol/L 2,4,6- tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)

in a 40 mmol/L HCl solution and 20 mmol/L FeCl3. Sample or standard solutions,

ultrapure water and FRAP reagent were mixed and kept in a water bath for 30 min at

37 °C. After cooling to room temperature, samples and standard were read at 595

nm. The Trolox standard curve was made (5–600 μmol TE). Results were expressed

in μmol Trolox equivalent (TE)/g.

80

2.11.3 Lipophilic and Hydrophilic ORAC assay (Oxygen Radical Absorbance

Capacity)

Lipophilic (L-ORAC) – chia oil – and hydrophilic (H-ORAC) – chia seed

ethanolic extract – ORAC assays were based on the method described previously

(Prior et al., 2003). Analyses were conducted in phosphate buffer pH 7.4 and the

peroxyl radical was generated by 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)

dihydrochloride (AAPH) solution, prepared just before the analysis and fluorescein

was used as the substrate. The microplate reader was adjusted (fluorescent filters,

excitation wavelength, 485 nm; emission wavelength, 520 nm) and Trolox was used

as standard. The fluorescence was read at every 1 min, for 80 min. The data were

calculated in the microplate reader, which calculated the area under the curve, the

linear regression and the dilution factor. ORAC values were expressed as µmol

Trolox equivalent (µmol TE) per gram of sample by using the standard curves (2.5 -

50.0 µmol TE) (Davalos, Gomez-Cordoves, & Bartolome, 2004). Total antioxidant

capacity (TAC) was calculated by summing the L-ORAC and H-ORAC (Wu et al.,

2004).

2.12. Statistical analysis

All determinations were done at least in triplicate. Statistical analysis was done

to determine the central tendency of the data and standard deviation using the

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA) software.

3. Results and discussion

3.1. Proximate composition and total, soluble and insoluble dietary fiber of chia seeds

Proximate composition and dietary fiber analysis are presented in Table 1.

Chilean chia seeds contain an important nutritional source of protein (25.32 g/100 g)

and oil (30.22 g/100 g), and these results are similar with those found in chia seeds

of other countries of South America (Coates & Ayerza, 1998; Ayerza & Coates,

2004). Although chia seed is not commercially grown as a protein source, the protein

content is higher than those of traditional crops such as wheat, corn, rice and oats

81

(Coates & Ayerza, 1996). A recent study also demonstrated that chia is a potential

source of biologically-active (bioactive) peptides, suggesting that this seed can be

incorporated into human diets to produce a more balanced protein source (Segura-

Campos et al., 2013).

TDF content in the seed was 37.50 g/100 g, with most of this content

represented by IDF (35.07 g/100 g) and the remainder by SDF (2.43 g/100 g) (Table

1), which is in accordance with other studies (Craig & Sons 2004; Reyes-Caudillo et

al., 2008) and markedly higher than wheat flours and whole grain cereals found by

Ragaee et al. (2006). Furthermore, dietary fiber has an essential role in intestinal

health, nutritional and physiological effects in consumers, and appears to be

significantly associated with a lower risk of developing coronary heart disease,

hypertension, diabetes and obesity (Willem van der Kamp et al., 2010).

Table 1. Proximate composition of Chilean chia seed (Salvia hispanica L.) (g/100 g)

Components Chia seed a

Moisture 5.82 ± 0.04

Ash 4.07 ± 0.02

Protein (N = 6.25) 25.32 ± 0.21

Lipids 30.22 ± 0.08

Carbohydrates b 34.57 ± 0.26

TDF 37.50 ± 1.07

IDF 35.07 ± 0.90

SDF 2.43 ± 0.30

Energy value c 576.50 ± 9.60

a Data are expressed as means values ± standard deviation (n = 4). b By difference. c

The energy value was expressed as Kcal/100 g. TDF: total dietary fiber, SDF: soluble

dietary fiber, IDF: insoluble dietary fiber.

3.2. Fatty acid profiles of chia oil

Table 2 shows the fatty acid composition of chia oil, which is found to contain

mainly α-linolenic, linoleic, oleic, palmitic and stearic acids, with a predominant

82

amount of α-linolenic acid (62.8%) (Fig. 1). These findings are in agreement with

those reported in earlier studies (Ayerza, 1995; Coates & Ayerza, 1998, Ayerza &

Coates, 2004). Chia oil shows higher quantities of ALA compared with flaxseed oil

(up to 57%) (Khattab & Zeitoun, 2013).

The n-6/n-3 fatty acid ratio of Chilean chia oil (0.29) is comparable to chia

seed oil of Argentina (Ayerza, 2010) and markedly lower than that of most vegetable

oils, such as maize (76.57), rapeseed (2.26), soybean (6.68), sunflower (30.77) and

olive (17.86) (Tuberoso et al., 2007). The use of chia seed oil in human daily diet

seems indeed beneficial since the use of vegetable oils with high contents of PUFAs

have been shown to provide several health benefits (Ganesan, Brothersen &

McMahon, 2014). Low n-6/n-3 fatty acid ratio has also been associated with the

reduction of cardiovascular disease risk (Simopoulos, 2004).

83

Table 2. Fatty acid profiles of Chilean chia oil (Salvia hispanica L.)

Fatty acids Chia oil (g/100 g) a

C14:0 0.07

C15:0 0.05

C16:0 7.07

C16:1 0.08

C17:0 0.07

C17:1 0.03

C18:0 3.36

C18:1 7.04

C18:2 trans 0.16

C18:2 18.23

C18:3 trans 0.40

C18:3 62.80

C20:0 0.29

C20:1 0.14

C22:0 0.09

C24:0 0.12

SFA 11.12

MUFA 7.29

PUFA 81.59

n-6/n-3 ratio 0.29

a Data are expressed as relative percentages of total methyl esters (n = 3). SFA:

saturated fatty acid, MUFA: monounsaturated fatty acid, PUFA: polyunsaturated fatty

acid.

84

Figure 1. GC chromatogram (fatty acid profile) of chia oil (Salvia hispanica L.). Major

peaks and relative retention times: a palmitic acid (C16:0): 22.174 min; b stearic acid

(C18:0): 25.107 min; c,d oleic acid (C18:1): 25.557 and 25.668 min; e linoleic acid

(C18:2): 26.380 min; f α-linolenic acid (C18:3): 27.437 min.

3.3. Triacylglycerol composition of chia oil

Figure 2 shows a typical EASI(+)-MS TAG profile of the chia oil whereas Table

3 summarizes the observed TAG composition of the chia oil. Different TAG were

found in chia oil, in which the most abundant [TAG + Na]+ ions are those of m/z 895,

897, 899 corresponding to LnLnLn, LLnLn, LLLn, respectively, whereas the other

ions identified are also abundant. The same TAG identified as [TAG + Na]+ were also

identified as [TAG + K]+, however such ions displayed low abundance. Predominance

of [TAG + K]+ ions of LnLnLn, LLnLn, LLLn were also observed which corresponded

to those of m/z 911, 913, 915, respectively. Linolenic acid is present in the most TAG

found, which is in agreement with findings reported by Ixtaina et al. (2011) in chia oil

from Argentina and Guatemala. Furthermore, results obtained by EASI(+)-MS are in

agreement with the fatty acid composition of chia oil obtained by GC (Table 2). The

85

knowledge of the TAG profile of oil is useful to direct its proper use by the chemical,

food and pharmaceutical industries (Haddad et al., 2006).

Figure 2. TAG fingerprints obtained by EASI(+)-MS of chia oil (Salvia hispanica L.).

Table 3. Main TAG ions detected by EASI-MS in chia oil (Salvia hispanica L.)

TAG a Elemental

composition

[TAG + Na]+

m/z

[TAG + K]+

m/z

LnLnP C55H94O6 873 889

LLnP C55H96O6 875 891

LLP/LnOP C55H98O6 877 893

LnLnLn C57H92O6 895 911

LLnLn C57H94O6 897 913

LLLn/LnLnO C57H96O6 899 915

LLL/LLnO/LnLnO C57H98O6 901 917

LLO/LLnS/LnOO C57H100O6 903 919

a L = linoleic acid, Ln = linolenic acid, O = Oleic acid, P = palmitic acid and S = stearic

acid.

3.4. Lipid autoxidation products

Table 4 shows the values of peroxide index and MDA of chia seed and oil.

Peroxide index value of Chilean chia oil (2.56 mEq peroxide/kg) was similar to those

reported by Ayerza and Coates (2004) in chia oil of South America (2.7 – 3.8 mEq

86

oxygen/kg) and by Ixtaina, Nolasco and Tomás (2012) in Argentina chia oil (1.0 mEq

peroxide/kg). Additionally, the samples from Chile presented lower values than

flaxseed oil (Khattab & Zeitoun, 2013). An important finding was to observe that none

of the samples exceeded the upper limit of peroxide index value (10.0 mEq active

oxygen /kg oil) established by the Codex Alimentarius (1999).

Chia oil contains bioactive components, such as tocopherols, polyphenols and

carotenoids (Ixtaina et al., 2011), which may be responsible for keeping low peroxide

values and consequently may present a good oxidative stability.

Regarding the secondary lipid autoxidation product, MDA value of Chilean

chia oil (17.46 mg MDA/kg) was higher than those reported by Martysiak-Żurowska

and Stołyhwo (2006) in soybean oil (9.17 mg MDA/kg) and in rapeseed oil (11.12 mg

MDA/kg). However, mean absorbance of chia oil at 535nm (0.044) was markedly

lower than canola oil (0.53) found by Hawrysh et al. (1988). Furthermore, the MDA

value (9.58 mg MDA/kg) or mean absorbance (0.052) found in Chilean chia seeds

were lower than those mentioned above.

Although the TBA test is one of the most commonly used chemical assays to

determine secondary oxidation products, this method has limitations, such as lack of

specificity and sensitivity. In addition to MDA, some other substances may react with

the TBA reagent and contribute to absorption, causing an overestimation of the

intensity of color complex (Pignitter & Somoza, 2012).

Table 4. Values of peroxide index and malondialdehyde of chia seed and chia oil

(Salvia hispanica L.) a

PI MDA

(mEq

peroxide/kg)

Absorbance

(535nm)

TBA

(mg MDA/kg)

Chia Seed - 0.052 ± 0.001 9.58 ± 0.19

Chia oil 2.56 ± 0.11 0.044 ± 0.002 17.46 ± 0.62

a Data are expressed as means values ± standard deviation (n = 4). PI: peroxide

index, MDA: malondialdehyde, TBA: 2-thiobarbituric acid.

87

3.5. Total phenolic content

Regarding the total phenolic content, previous reports are also consistent with

our results. Chia seed from two different regions in Mexico showed values between

0.88 to 0.92 mg GAE/ g (Reyes-Caudillo et al., 2008), which is similar with that found

for our samples from Chile (0.94 mg GAE/ g) (Table 6).

3.6. Polyphenol analysis

Table 5 shows the major phenolic compounds identified in chia seed and chia

oil.

3.6.1 Chia seed

Chia seed extract evidenced the presence of chlorogenic acid, quercetin,

myricetin and decarboxymethyl elenolic acid linked to hydroxytyrosol (3,4-DHPEA-

EDA) by EASI(-)-MS (Table 5, Figure 3.A), which is in agreement with some findings

from other studies (Capitani et al., 2012; Reyes-Caudillo et al., 2008) despite the

presence of the 3,4-DHPEA-EDA and absence of caffeic acid and kaempferol in our

samples. These differences may occur due to different extraction and identification

techniques, losses during processing, in addition to the location variation of seeds,

which, in turn could have a significant impact on concentration of bioactive

compounds (Ayerza & Coates, 2011). Recently, Reyes-Caudillo et al. (2008) found

that the major phenolic components of Mexican chia seed crude extracts are

glycosides of quercetin and kaempferol, furthermore, hydrolyzed extracts showed

significant amounts of the same aglycon phenolic compounds.

3.6.2 Chia oil

Myricetin, quercetin, kaempferol and chlorogenic acid were identified in chia oil

(Table 5, Figure 3.B). These compounds are the same substances found by Ixtaina,

et al. (2011) and this makes the oil quite stable in spite of its high PUFA content

(Ixtaina et al., 2012). It is interesting to note that most of the phenolic compounds

found in chia oil are not present in other oilseeds (Tuberoso et al., 2007).

88

Table 5. Identified phenolic compounds in chia seed and oil (Salvia hispanica L.)

analyzed by EASI-MS

Compounds Elemental

composition

[M - H]-

m/z Chia seed Chia oil

Quercetin C15H10O7 301.04 X X

Chlorogenic acid C16H18O9 353.09 X X

Kaempferol C15H10O6 285.05 X

Myricetin C15H10O8 317.04 X X

3,4-DHPEA-EDA C19H22O8 377.13 X

( X ) Means that the compound is present in sample.

Figure 3. Polyphenols fingerprints obtained by EASI(-)-MS of (A) chia seed extract

and (B) chia oil (Salvia hispanica L.).

3.7. Antioxidant potential of chia seeds

Table 6 displays antioxidant activity of chia seeds. All the methods evaluated

in this study provided quite similar results to the ones reported by Capitani et al.

89

(2012) for Argentina chia meals (557.2 TEAC, µmol/g) and fibrous fractions (446.4

TEAC, µmol/g) obtained by pressing extraction; and by Vázquez-Ovando et al.

(2009) for a Mexican chia fibrous fraction (488.8 TEAC, µmol/g).

The samples also displayed higher antioxidant activity than that found in wheat

flour, barley and sorghum whole grain cereals (8.3, 14.9 and 51.7 TEAC, µmol/g)

(Ragaee et al., 2006) and were similar to that of sorghum bran with high tannin

content (512.0 TEAC, µmol/g) (Awika et al., 2003). Chia seeds might therefore have

the same health beneficial effects attributed to other grains and vegetables.

Table 6. Antioxidant activity of Chilean chia seed (Salvia hispanica L.)

Antioxidant activity Results a

Total phenolic content 0.94 ± 0.06 mg GAE/g

ORAC hydrophilic 517.30 ± 9.09 µmol TE/g

ORAC lipophilic 6.48 ± 0.47 µmol TE/g

TAC 523.78 µmol TE/g

DPPH 436.61 ± 9.67 µmol TE/g

FRAP 405.71 ± 6.55 µmol TE/g

a Data are expressed as means values ± standard deviation (n = 4). TAC: total

antioxidant capacity.

Results regarding inhibition of lipid peroxidation in crude extract of the Sinaloa

and Jalisco chia seeds suggest that the phenols in both extracts have an important

activity as oxygen singlet quenchers, which could explain the antioxidant potential

found in chia seeds extract (Reyes-Caudillo et al., 2008).

Wu et al. (2004) investigated lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities

using ORAC assay in different nuts. For H-ORAC, the lowest value found was 4.43

µmol TE/g for pine nut and the highest value was 175.2 µmol TE/g for pecan. For L-

ORAC, the lowest value found was 1.72 µmol TE/g for almonds and the highest

value was 5.57 µmol TE/g for Brazil nuts. The present results show that Chilean chia

seeds (H-ORAC) and oil (L-ORAC) have a high antioxidant capacity compared to the

previous study that used the same in vitro methodologies (Table 6). This could be

90

due to a high content of polyphenolic compounds (Reyes-Caudillo et al., 2008) and

lipophilic compounds, such as tocopherols, polyphenols, carotenoids and

phospholipids already found in chia seed oils from Argentina and Guatemala (Ixtaina,

et al., 2011).

Total antioxidant capacity, as measured by ORAC or any other in vitro

methods, could provide no information on in vivo antioxidant effects. Many other

issues such as metabolism, absorption and physicochemical properties should also

be considered (Wu et al., 2004).

The antioxidant activity of a bioactive compound has been attributed to various

mechanisms, among which are prevention of chain initiation, binding of transition

metal ion catalysts, decomposition of peroxides, prevention of continued hydrogen

abstraction and radical scavenging protecting against oxidative damage to DNA,

proteins, and lipids (Halliwell, 1994). In this way, the consumption of Chilean chia

seed and oil could be interesting for health improvement.

4. Conclusions

The Chilean chia seeds and oil are important sources of protein, dietary fiber,

omega-3 PUFA and bioactive compounds with nutritional and technological potential.

The main fatty acid was α-linolenic acid, which was present in the most TAG found in

chia oil. Chia seeds and oil also contains polyphenols, mainly, myricetin, quercetin,

kaempferol, chlorogenic acid and 3,4-DHPEA-EDA, that contributed to the high

antioxidant capacity and low levels of lipid autoxidation products found in the

samples, which could be used to produce functional ingredients in dietetic products

with commercial applications. The consumption of Chilean chia seed and oil can

therefore be an important alternative to improve consumer‘s health suggesting its use

as a functional food in human daily diet.

Conflicts of interest

This work does not present conflicts of interest.

All authors participated in protocol development, conception and design of the study,

result evaluation, writing, editing and have approved the final version of the

91

manuscript. None of the authors had any financial or personal interest in any

company or organization sponsoring the research.

Acknowledgments

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP, 2012/23813-4) and Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq 140386/2012-2 and 300533/2013-6).

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97

CAPÍTULO II

98

ARTIGO II

Artigo publicado em revista internacional: Food Research International, 76,

(2015), p. 666-674. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2015.07.039

Antioxidant potential of dietary chia seed and oil (Salvia hispanica L.) in diet-

induced obese rats

Rafaela da Silva Marineli a, Sabrina Alves Lenquiste a, Érica Aguiar Moraes a, Mário

Roberto Maróstica Jr a,*


Campinas – UNICAMP, Campinas, Sao Paulo, Brazil.



Campinas, Sao Paulo, Brazil.

Abbreviations

AIN, American Institute of Nutrition; ALA, alpha-linolenic acid; CAT, catalase; FAME,

fatty acids methyl esters; FRAP, ferric reducing antioxidant power; GC, gas

chromatography; GPx, glutathione peroxidase; GRd, glutathione reductase; GSH,

reduced thiol; HFF, high-fat and high-fructose diet; LDL, low-density lipoprotein;

MDA, malondialdehyde; PB, phosphate buffer; ROS, reactive oxygen species; SOD,

superoxide dismutase; TBA, 2-thiobarbituric acid; TBARS, thiobarbituric acid reactive

substances; TCA, trichloroacetic acid.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2015.07.039

99

Abstract

This study aimed to investigate the effects of dietary chia seed and oil on plasma and

liver oxidative status in diet-induced obese rats. Thirty-six Wistar rats were divided in

six groups (6 animals each): control group was fed the American Institute of Nutrition

(AIN)-93M diet; HFF group was fed a high-fat and high-fructose (HFF) diet; chia seed

short (6-weeks) and long (12-weeks) treatments received an HFF diet with chia

seed; chia oil short (6-weeks) and long (12-weeks) treatments received an HFF diet

with chia oil. Plasma and hepatic biomarkers of lipid peroxidation, endogenous

enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems and antioxidant capacity were

determined. HFF diet induced weight gain, oxidative stress and lipid peroxidation in

plasma and liver of animals. Compared to HFF group chia seed and chia oil (12 and

6 weeks) intake increased plasma reduced thiol (GSH) levels, plasma catalase

(CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities. In the liver glutathione reductase

(GRd) activity was enhanced, while CAT and GPx activities did not change. There

were no differences in plasma and liver superoxide dismutase activity among chia

diets and HFF group. Chia (seed and oil) intake did not modify liver lipid

peroxidation, but was able to reduce plasma thiobarbituric acid reactive substances

(TBARS) and 8-isoprostane levels increased by HFF group. Plasma and hepatic

antioxidant capacity values were increased in chia seed and oil groups about 35%

and 47%, respectively, compared to HFF group. Chia groups presented similar

antioxidant potential, regardless of treatment time. Dietary chia seed and oil reduced

oxidative stress in vivo, since it improved antioxidant status and reduced lipid

peroxidation in diet-induced obese rats.

Keywords: Chia (Salvia hispanica), Omega-3 fatty acid, Oxidative stress, Lipid

peroxidation, Antioxidant enzymes, Rats.

100

1 Introduction

Obesity has become a worldwide epidemic and may be a state of chronic

oxidative stress, which consists in an imbalance between protector endogenous

antioxidant systems and free radicals generation (Fernández-Sánchez et al., 2011).

The reactive oxygen species (ROS) excess can damage cell proteins, lipids and

DNA, which might result in loss of function and even cellular death. This mechanism

has been linked to many diseases, such as cardiovascular disease,

neurodegeneration, cancer and diabetes (Brambilla et al., 2008; Pandey & Rizv,

2010). Furthermore, obesity impairs the enzymatic antioxidant system, with reduction

of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and

glutathione reductase (GRd) activities, and also affects the non-enzymatic

antioxidant systems (reduced thiol, minerals, vitamins and polyphenols) which play

essential roles in many antioxidant mechanisms (Brambilla et al., 2008; Fernández-

Sánchez et al., 2011).

Many investigations have shown that consumption of natural dietary sources

(fruits, nuts, vegetables) with antioxidant bioactive compounds (polyphenols,

tocopherols, carotenoids, vitamins) may support the prevention of oxidative stress

and could be a natural alternative for preventing and controlling chronic diseases

(Bullo et al., 2011; Avignon et al., 2012; Landete, 2012). Several mechanisms have

been proposed for this health protection, such as the improvement of antioxidant

defense system which protects and reduces ROS damage in the organism

(Brambilla et al., 2008; Avignon et al., 2012). Therefore, the evaluation of potential

functional foods that may improve antioxidant systems efficacy or alleviate reactive

oxygen and nitrogen species formation could be a strategy to prevent obesity

complications.

In this context, chia (Salvia hispanica L.) is an herbaceous plant that belongs

to Lamiaceae family native from southern Mexico and northern Guatemala (Ayerza,

1995). Today it is commercially available for human consumption as whole seeds,

flour, and oil in the Americas, Australia, Europe and Southeast Asia (Mohd Ali et al.,

2012). Chia seed is the richest known botanical source of omega-3 α-linolenic acid

(C18:3, ALA, up to 68%) (Ayerza, 1995) compared to flaxseed (50.6%), rapeseed

(8.1%), soybean (7.6%) and sunflower (1.8%) oils (Tuberoso et al., 2007); and has

101

been also described as an important source of protein, dietary fiber, minerals and

bioactive compounds (Reyes-Caudillo, Tecante & Valdivia-López, 2008; Marineli et

al., 2014). Literature data indicates that chia seed and oil possess high antioxidant

potential confirmed by different in vitro assays (Reyes-Caudillo et al., 2008;

Martínez-Cruz & Paredes-López, 2014; Marineli et al., 2014). Chia seed and chia oil

are considered new sources of natural antioxidants, due to the content of

tocopherols, phytosterols, carotenoids (Álvarez-Chávez et al., 2008; Ixtaina et al.,

2011) and phenolic compounds (Reyes-Caudillo et al., 2008; Martínez-Cruz &

Paredes-López, 2014), which have the potential to protect consumers against many

diseases and also promotes beneficial effects on human health (Avignon et al., 2012;

Landete, 2012). Chia lipids could be an omega-3 alternative source to vegetarians

and people with fish allergies, since chia seed and oil have not shown problems

associated with other nutritional sources such as flaxseed and marine products,

including fish flavor, animal weight loss and digestive problems (Mohd Ali et al.,

2012).

Our previous study (Marineli et al., 2015) reported that chia ingestion induced

heat shock protein expression and restored SOD and GPx expression in skeletal

muscle, with a higher potential of oil relative to seed. However, chia seed and oil has

been little explored from a scientific point of view, especially in relation to its

antioxidant potential in vivo. To the best of our knowledge, this is the first report

about antioxidant effects in liver and plasma after chia seed and oil intake. We

hypothesized that dietary chia seed and chia oil could protect against oxidative

stress by improving antioxidant defenses and reducing lipid peroxidation in diet-

induced obese rats, due to the content of bioactive compounds. Therefore, the

present study aimed to evaluate the effects of dietary chia seed and chia oil on

oxidative stress and antioxidant biomarkers of plasma and liver in diet-induced obese

Wistar rats.

2 Materials and methods

2.1 Chemical, chia seed and oil

Solvents were all analytical grade from J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA).

Metaphosphoric acid was purchased from Vetec Química Fina (Sao Paulo, Brazil). L-

102

Glutathione reduced, glutathione reductase, glutathione oxidized form disodium salt,

β-nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate

(NADPH), 5′5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), albumin from bovine serum

(BSA), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox), 2,4,6-

tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), 2-thiobarbituric acid (TBA) were all obtained from

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Trichloroacetic acid (TCA) was purchased from

Synth Laboratorios (Sao Paulo, Brazil), Bradford reagent was purchased from

BioAgency (Sao Paulo, Brazil) and malondialdehyde (MDA) was purchased from

Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Fresh chia seed and chia oil

from FTP S.A. Santiago, Chile were purchased from R&S Blumos Comercial de

Produtos Alimentícios Ltda, Brazil. According to the producer, chia oil was obtained

by cold pressing (< 40 °C) and stored at 2-8 °C until use in amber glass bottles

without head space. Seeds were ground in a laboratory impact mill (Marconi MA

630/1, Piracicaba – Sao Paulo, Brazil) and passed through a 0.850 mm sieve.

Chemical analysis and antioxidant activity of Chilean chia seed and oil samples used

in this study were previously determined by Marineli et al. (2014) in the same raw

material.

2.2 Animals, diets and interventions

This work was approved by the Ethics Commission on Animal Use (CEUA/

UNICAMP, protocol no. 2936-1) and followed the University guidelines for the use of

animals in experimental studies. Thirty-six male Wistar rats aged 21 to 23 days were

obtained from Multidisciplinary Center for Biological Investigation, University of

Campinas. Animals remained in individual cages for growth with free access to water

and chow diet for 4 weeks and were maintained under controlled conditions (22 ± 1

ºC, 60-70% humidity, 12 hours light/dark cycle). After growth, animals (234.08 g ±

19.12) were randomly divided in six experimental groups (n=6/group) for 12 weeks.

Diets were based on the American Institute of Nutrition (AIN)-93M diet

(Reeves, Nielsen & Fahey, 1993) with protein concentration of 12%. Control group

received the standard diet (AIN-93M); High-fat and high-fructose (HFF) group

received a diet containing 4% (w/w) soybean oil, 31% (w/w) lard and 20% fructose

(w/w) (Shapiro et al., 2011); chia seed short and long treatments received an HFF

103

diet with 13.3% (w/w) of chia seed; chia oil short and long treatments received an

HFF diet with 4% (w/w) of chia oil. There were a long (12 weeks) and a short (6

weeks) treatment with chia seed or chia oil. Animals from the long treatment were

fed only an HFF diet containing chia seed or chia oil for 12 weeks. Short groups were

initially fed only an HFF diet for the first 6 weeks, followed by an additional 6 weeks

with an HFF diet containing chia seed or chia oil. Soybean oil for both chia seed and

oil diet was replaced by the oil content of chia seed or chia oil. Chia diets were

formulated to provide equal quantities of oil and ALA from chia (Ayerza & Coates,

2007). The seeds contained 30.2% of oil (Marineli et al., 2014). Protein and dietary

fiber content in HFF-chia seed groups was balanced taking into account the amount

of such nutrients present in chia seed (Marineli et al., 2014). Diets composition is

presented in Table 1. Diets were prepared monthly and packed in dark polyethylene

bags and stored at -20 ºC to minimize the oxidation of fatty acids. Weight gain was

monitored weekly and food intake every 2 days.

2.2.1 Diet analyses

Calorie values of diets were determined using isoperibol automatic calorimeter

(PARR 1261) instrument equipped with oxygen bomb (PARR 1108). (Instrument Co,

Moline, IL, USA). Lipids were extracted according to the method of Bligh and Dyer

(1959) and samples were saponified in 0.5 mol/L methanolic KOH. Fatty acids

methyl esters (FAME) were prepared as previously described by Maia and

Rodriguez-Amaya (1993). The fatty acid composition of the experimental diets was

determined by gas chromatography (GC) (Kramer et al., 1997) using a capillary GC

Agilent 6850 Series GC System (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA),

capillary column DB-23 Agilent (50% cyanopropyl-methylpolysiloxane, 60 m × 0.25

mm × 0.25 mm) (Wilmington, DE, USA), with flame ionization detector (FID). Oven

temperature was 110 °C for 5 min, 110-215 °C (5 °C/min), 215 °C for 24 min;

detector temperature: 280 °C; injector temperature: 250 °C; carrier gas: helium; split

ratio 1:50; injection volume: 1.0 µL. FAME were identified by comparison of retention

times with FAME standard mixture under the same conditions (FAME Mix GLC-68A;

Nu-Chek-Prep, INC, Elysian, MN, USA) and quantified using area normalization.

104

Table 1. Ingredients and fatty acid composition of experimental diets

AIN-93M HFF Chia seed Chia oil

Ingredients (g/kg diet)

Casein a 139.53 139.53 106.53 139.53

Maltodextrin 155.0 45.40 45.40 45.40

Corn starch 465.69 136.44 123.44 136.44

Sucrose 100.0 29.32 29.32 29.32

Soybean oil 40 40 - -

Chia oil - - - 40

Chia seed - - 133 -

Lard - 310 310 310

Fructose - 200 200 200

Cellulose 50 50 3.6 50

Mineral mixture 35 35 35 35

Vitamin mixture 10 10 10 10

L-Cystine 1.8 1.8 1.8 1.8

Choline bitartrate 2.5 2.5 2.5 2.5

tert-Butyl hydroquinone 0.008 0.008 0.008 0.008

Energy density (kcal/g

diet) 3.74 5.89 5.84 5.88

Fatty acids b

SFA 7.38 127.86 125.35 125.99

MUFA 10.20 146.94 138.87 140.11

PUFA 22.42 71.10 81.11 79.54

Linoleic (C18:2n-6) 19.89 66.74 54.97 53.53

α-Linolenic (C18:3n-3) 2.20 4.06 25.88 25.73

n-6/n-3 ratio 9.04 16.44 2.12 2.08

a Amount was calculated based on protein content equal to 86% to provide 12 g of

protein/100 g of diet. b Fatty acids expressed as g/kg diet. AIN-93M group: control

standard diet; HFF group: high-fat and high-fructose diet; Chia seed groups: HFF diet

plus 13.3% (w/w) chia seed; Chia oil groups: HFF diet plus 4% (w/w) chia oil. SFA:

105

saturated fatty acids, MUFA: monounsaturated fatty acids, PUFA: polyunsaturated fatty

acids.

2.3 Blood and tissue collection

Animals were euthanized by decapitation preceded by 12-hour-fasting after 12

weeks of experimental period. Blood samples were collected in polyethylene tubes

with EDTA anticoagulant to obtain plasma. Tubes were centrifuged at 3000 g (15

min, 4 ºC). Plasma was separated and stored in polypropylene microtubes at -80 °C

until analysis. Liver was removed, washed, frozen in liquid nitrogen and stored at -

80ºC. Liver homogenates were prepared in a ratio of about 100 mg wet tissue per 1

mL of 50 mmol/L phosphate buffer (PB) (pH 7.4) or 5% trichloroacetic acid (TCA)

solution using a homogenizer (MA102/Mini, Marconi, Piracicaba – Sao Paulo, Brazil).

PB and TCA homogenates were used in the enzymatic antioxidant activities and

GSH assays, respectively (Batista et al., 2014). Liver was also freeze-dried,

manually ground with mortar and pistil and kept at -80 °C until analysis of lipid

peroxidation.

2.4 Biochemical analyses

Absorbance readings were done in a microplate reader Synergy HT, Biotek

(Winooski, VT, USA); with Gen5™ 2.0 data analysis software spectrophotometer.

2.4.1 Endogenous enzymatic and non-enzymatic antioxidant system

The protein concentration of tissue homogenates was determined by Bradford

method (Bradford, 1976).

2.4.1.1 Reduced thiol (GSH) content

GSH levels were determined in plasma and liver TCA homogenates by

Ellman's reaction using DTNB (Faure & Lafond, 1995). GSH solution (2.5–500 nmol

GSH/mL) was used as standard curve and absorbance was read at 412 nm. Results

were expressed as nmol GSH/µg protein or nmol GSH/mL plasma.

106

2.4.1.2 Glutathione reductase (GRd) activity

GRd activity was measured in plasma and liver PB homogenates by the

method described by Carlberg and Mannervik (1985). The decrease in absorbance

was monitored at 340 nm after induction with 1 mmol/L oxidized glutathione in the

presence of 0.1 mmol/L NADPH in PB. Results were expressed as nmol NADPH

consumed/min/mg protein or nmol NADPH consumed/min/mL plasma.

2.4.1.3 Glutathione peroxidase (GPx) activity

GPx activity was quantified in plasma and liver PB homogenates according to

Flohe and Gunzler (1984). This assay is based on the oxidation of 10 mmol/L

reduced glutathione by GPx coupled to the oxidation of 4 mmol/L NADPH by 1 unit

(U) enzymatic activity of GRd in the presence of 0.25 mmol H2O2. The rate of

NADPH oxidation was monitored by the decrease in absorbance at 365 nm. Results

were expressed as nmol NADPH consumed/min/mg protein or nmol NADPH

consumed/min/mL plasma.

2.4.1.4 Catalase (CAT) activity

CAT activity was analyzed in plasma and liver PB homogenates using

commercial assay kits (#707002, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

The method is based on reaction of the enzyme with methanol in the presence of an

optimal concentration of H2O2. The formaldehyde produced is measured

colorimetrically with 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald) as the

chromogen. Results were expressed as nmol CAT activity/min/g protein or nmol CAT

activity/min/mL plasma.

2.4.1.5 Superoxide dismutase (SOD) activity

SOD activity was analyzed in plasma and liver PB homogenates using

commercial assay kits (#706002, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

The method utilizes a tetrazolium salt for detection of superoxide radicals generated

by xanthine oxidase and hypoxanthine. SOD assay measures all three types of SOD

107

(Cu/Zn, Mn, and FeSOD). One unit of SOD is defined as the amount of enzyme

needed to exhibit 50% dismutation of the superoxide radical. Results were

expressed as U SOD activity/mg protein or U SOD activity/mL plasma.

2.4.2 Lipid peroxidation

2.4.2.1 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) assay

TBARS determinations were done in plasma and liver according to Ohkawa,

Ohishi, and Yagi (1979), with adaptations. Hepatic freeze-dried tissue (10 mg/mL)

was sonicated for 30 min in a 300 mmol/L acetate buffer solution (pH 3.6). Plasma

samples (100 µL) were used without previous preparation. Working solution was set

with 2-thiobarbituric acid (TBA), acetic acid (20%) and sodium hydroxide (5%) at

ratio of 1:100:100 (w:v:v). One hundred microliters of 8.1% sodium dodecyl sulfate

solution and 4 mL of work solution were homogenized with samples and standard

and heated at 95 °C for 60 min. Samples were cooled in an ice bath for 10 min and

then centrifuged at 10,000 g (10 min, 4 °C). The supernatant was read at 532 nm

using a 96-well microplate. Standard curve (0.625–85 nmol MDA/mL) was obtained

using malondialdehyde standard (MDA) (#10009202, Cayman Chemical Company,

Ann Arbor, MI, USA). Results were expressed as nmol MDA/mg tissue or nmol

MDA/mL plasma.

2.4.2.2 8-isoprostane assay

8-Isoprostane was determined in plasma samples by an enzyme

immunoassay (EIA) kit (#516351, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI,

USA). The method is based on the competition between 8-isoprostane and an 8-

isoprostane-acetylcholinesterase (AChE) conjugate (marker) for a limited number of

8-isoprostane-specific rabbit antiserum binding sites. Results were expressed as pg

8-Isoprostane/mL plasma.

108

2.4.3 Antioxidant capacity measured by ferric reducing antioxidant power (FRAP)

assay

Plasma samples and liver PB homogenates were treated with

ethanol:ultrapure water (2:1) and 0.75 mol/L metaphosphoric acid (Batista et al.,

2014). Samples were centrifuged at 14000 g for 5 min at 4 °C and the supernatant

removed. The ferric reducing ability of plasma and liver extracts was determined by

FRAP method (Benzie & Strain, 1996), with adaptations. Under dark conditions,

FRAP reagent was prepared with 10 mmol/L TPTZ, 20 mmol/L FeCl3 and 300

mmol/L acetate buffer (pH 3.6) following the 1:1:10 ratio. Samples or standard

solutions, ultrapure water and FRAP reagent were mixed in 1:3:30 ratios and kept in

a water bath for 30 min at 37 °C. After cooling to room temperature, samples and

standard were read at 595 nm. Trolox standard curve was made (5–400 μmol/L).

Results were expressed as μmol Trolox equivalent (TE)/g protein or μmol TE/L

plasma.

2.5 Statistical analysis

Data are expressed as mean values ± standard deviation. Differences

between AIN-93M and HFF group were tested by T test. Differences among HFF,

chia seed 12 weeks, chia seed 6 weeks, chia oil 12 weeks and chia oil 6 weeks

groups were tested by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's

test using the GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA)

software. P<0.05 was considered statistically significant.

3 Results

3.1 Food intake and weight gain

Total food intake was lower (Fig. 1A) and total energy intake was higher (Fig.

1B) in HFF-fed animals compared to AIN-93M group. These parameters did not differ

among the chia (seed or oil) and HFF groups. Animals fed on the HFF diet showed

an increase in weight gain compared to AIN-93M group (Fig. 1C). Chia (seed or oil)

intake did not attenuate rat‘s weight gain, regardless of treatment time, when

compared to HFF group.

109

Figure 1. Total food intake (A), Total energy intake (B) and Total weight gain (C) of

rats fed on different diets: control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose

(HFF) diet; HFF diet plus 13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed 12-wk) or 6

weeks (chia seed 6-wk); HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk) or 6

weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean significant differences

110

between AIN-93M and HFF group according to T test (P<0.05). Different small letters

(a-b) mean significant differences between HFF, chia seed and chia oil groups by

one-way analysis of variance followed by Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as

mean ± standard deviation (n = 6/group).

3.2 Enzymatic antioxidant activities and GSH levels

Animals fed with HFF diet showed the lowest plasma and liver CAT activity

when compared to AIN-93M group (Fig. 2A and Fig. 3A, respectively). All chia seed

and chia oil groups presented higher plasma CAT activity and no changes in liver

CAT activity in relation to HFF group. Although plasma SOD activity did not differ

among the experimental groups (Fig. 2B), HFF group presented lower liver SOD

activity compared to AIN-93M group (Fig. 3B). However, the groups that consumed

chia seed or chia oil diet did not show differences in liver SOD activity compared to

HFF group.

Plasma and liver GSH values decreased in HFF-fed animals compared to

AIN-93M group (Fig. 2E and Fig. 3E, respectively). Chia groups (seed and oil)

showed an increase in plasma GSH level compared to HFF group. Moreover, the

group that received chia seed diet for 12 weeks showed a higher GSH level in liver

(28%) compared to HFF group and also compared to other chia groups.

HFF-fed animals decreased plasma and liver GPx and GRd activities

compared to AIN-93M group (Fig. 2C,D and Fig. 3C,D respectively). Chia groups

(seed and oil) showed an increase in plasma GPx and liver GRd activities, but not in

plasma GRd and liver GPx activities compared to HFF group.

111

Figure 2. Plasma antioxidant enzymes: catalase (CAT) activity (A), superoxide

dismutase (SOD) activity (B), glutathione peroxidase (GPx) (C), glutathione

reductase (GRd) (D), and Thiol groups (GSH) (E) in plasma of rats fed on different

diets: control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF

diet plus 13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed

112

6-wk); HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-

wk). Different capital letters (A-B) mean significant differences between AIN-93M and

HFF group according to T test (P<0.05). Different small letters (a-b) mean significant

differences between HFF, chia seed and chia oil groups by one-way analysis of

variance followed by Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as mean ± standard

deviation (n = 6/group).

113

Figure 3. Liver antioxidant enzymes: catalase (CAT) activity (A), superoxide

dismutase (SOD) activity (B), glutathione peroxidase (GPx) (C), glutathione

reductase (GRd) (D) and Thiol groups (GSH) (E) in liver of rats fed on different diets:

control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus

13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk);

114

HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk).

Different capital letters (A-B) mean significant differences between AIN-93M and

HFF group according to T test (P<0.05). Different small letters (a-b) mean significant

differences between HFF, chia seed and chia oil groups by one-way analysis of

variance followed by Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as mean ± standard

deviation (n = 6/group).

3.3 Lipid peroxidation

HFF-fed animals increased plasma 8-isoprostane levels and plasma and liver

TBARS compared to AIN-93M group (Fig. 4A,B and C, respectively). Chia (seed or

oil) intake did not modify liver TBARS levels in comparison to HFF group. On the

other hand, chia diets were able to reduce plasma TBARS and 8-isoprostane levels

compared to HFF group.

3.4 Antioxidant capacity by FRAP assay

HFF diet promoted a decrease in plasma and liver antioxidant values

compared to AIN-93M group (Fig. 5A,B). The addition of chia (seed or oil) to the

diets reversed the effect caused by the HFF diet. Plasma FRAP values were

increased in chia groups about 35% and liver FRAP values were higher in chia

groups about 47% as compared to HFF group.

115

Figure 4. Lipid peroxidation by 8-isoprostane assay in plasma (A) and TBARS assay

in plasma (B) and liver (C) of rats fed on different diets: control standard diet (AIN-

93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus 13.3% chia seed during 12

weeks (chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus 4% chia oil during

12 weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B)

116

mean significant differences between AIN-93M and HFF group according to T test

(P<0.05). Different small letters (a-b) mean significant differences between HFF, chia

seed and chia oil groups by one-way analysis of variance followed by Tukey‘s test

(P<0.05). Data expressed as mean ± standard deviation (n = 6/group).

Figure 5. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay in plasma (A) and liver

(B) of rats fed on different diets: control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-

fructose (HFF) diet; HFF diet plus 13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed 12-

wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-

wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean significant

differences between AIN-93M and HFF group according to T test (P<0.05). Different

small letters (a-b) mean significant differences between HFF, chia seed and chia oil

groups by one-way analysis of variance followed by Tukey‘s test (P<0.05). Data

expressed as mean ± standard deviation (n = 6/group).

117

4 Discussion

Excessive energy intake from saturated fatty acids leads to an increase in

energy storage as fat, accompanied by an elevation in mitochondrial macronutrient

oxidation, favoring an excessive production of free radicals and oxidative stress

(Avignon et al., 2012). Obesity and more specifically visceral fat are associated with

oxidative stress in humans, which may contribute to metabolic syndrome

development (Fernández-Sánchez et al., 2011).

Our data show that a HFF diet intake induced lipid peroxidation, reduced

antioxidant capacity and enzyme activities involved in the antioxidant defense

system in plasma and liver of rats. These findings are in agreement with those

reported in earlier animals (Feillet-Coudray et al., 2009; Laissouf et al., 2013) and

humans studies (Patel et al., 2007), which demonstrated that high-fat and high-

carbohydrate diets are able to induce oxidative stress. Furthermore, previous studies

showed that high-fructose diet intake negatively affects the balance between

antioxidant defense and free radical production in rats, leading to increased lipid

susceptibility to peroxidation (Busserolles et al., 2002). The increasing of fructose

catabolism causes a reduction in total glutathione levels and the suppression of

hepatic antioxidant enzyme activities, such as CAT, SOD and GPx (Reddy et al.,

2009).

In the present study, a daily consumption of chia seed and oil diets enhanced

plasma antioxidant status through CAT and GPx activity and GSH levels reduction.

However, no effect was observed in SOD and GRd activities, regardless of treatment

time. It is important to consider that different nutrients such as natural antioxidants

and other substances should not necessarily affect all enzymes of redox system in

the same fashion and to the same extent. Antioxidant enzymes respond

independently to different inducing radicals and therefore we should not expect these

enzymes respond identically (Kohen & Nyska, 2002).

Although plasma and liver SOD activity did not differ statistically after chia

ingestion, our previous study showed a restored SOD expression in skeletal muscle

after chia seed and oil intake. These results suggest that tissues respond differently

to the same diet intervention. Furthermore, we should highlight that different

methodologies were used in both experiments (Marineli et al., 2015). A previous

118

study (Laissouf et al., 2013) found that flaxseed oil diet (2.5 and 5%) intake

attenuated lipid and protein oxidation in different tissues and improved antioxidant

status reducing CAT and GPx in obese aged rats.

With regard to effects of chia seed and oil intake on lipid peroxidation, we

found a significant reduction in plasma 8-isoprostane and TBARS levels, suggesting

that both seed and oil could act as antioxidant agents and counteract the pro-

oxidative effect caused by HFF consumption. 8-isoprostane is a specific lipid

peroxidation product formed via a non-enzymatic mechanism which involves free

radical-catalyzed peroxidation of arachidonic acid and is the most specific biological

indicator for the assessment of oxidative stress in vivo (Musiek et al., 2005). In this

way, the dietary intake of chia prevents plasma 8-isoprostane increase in rats fed

with HFF diet which endorse the beneficial effect of chia seed and oil in reducing this

non-enzymatic product of lipid oxidation in vivo.

Dietary contribution of antioxidant compounds affects the overall resistance of

lipoproteins to lipid peroxidation (Shinitzky, 1984). In this way, the reduction in

plasma lipid peroxidation may be involved to hypolipidemic effect of chia seed and

chia oil previous shown by Ayerza & Coates, 2007 and Poudyal, et al., 2012. This

effect is associated with reduced susceptibility of low-density lipoprotein (LDL) to

oxidation, apparently due to the reduction in plasma LDL-cholesterol levels.

Although lipid peroxidation reduction demonstrated in plasma through TBARS

levels, it was not reversed in hepatic tissue, since liver TBARS levels remained

unchanged in chia seed and oil groups in both 6 and 12weeks of treatment

compared to HFF group. Lipid peroxidation is a basic cellular deteriorating process

induced by oxidative stress and occurs readily in the tissues rich in highly oxidizable

polyunsaturated fatty acids (PUFA), as in the liver (Halliwell, 1994). Furthermore,

investigations have shown that different types of fatty acids intake affect fatty acid

composition in a tissue-specific manner (Valenzuela et al., 2014). It indicates that

metabolic rate may be slower in the liver than in the plasma, which the plasma may

respond more readily to metabolizing fatty acids (Kang & Choi, 2008).

Interestingly, despite the non-reversal of lipid peroxidation in rats liver, chia

seed and oil groups showed an increase in liver GRd activity and no change in liver

GPx activity. In addition, only the group that received chia seed diet for 12 weeks

119

increased liver GSH levels. An increase in liver GRd activity may occur to recover

reduced glutathione involved in glutathione cycle. However, there are several

interactions among enzymes and substrates variations in glutathione cycle which

could explain the change or not of the enzymes of this cycle (Kohen & Nyska, 2002).

Moreover, the potential effect of daily chia consumption on these biomarkers is still

recent and not enough studied.

Plasma and liver antioxidant capacity expressed by FRAP assay was

markedly higher in chia seed and oil-fed animals, which seemed to contribute to an

improvement in the endogenous antioxidant defenses. In addition to the assay

validity itself, special attention has to be paid to confounding factors from sample

matrix when biological samples are measured. Many other issues such as

metabolism, absorption and other physiological activities should also be considered

(Huang, Ou & Prior, 2005). These limitations represent difficulties to be overcome in

further studies about bioavailability of bioactive compounds and their antioxidant

capacity in vivo.

Furthermore, higher plasma and liver antioxidant status found in chia groups

could explain previous studies that showed increased cardio and hepatoprotective

parameters in obese rats fed with chia seed diet (Poudyal et al., 2012).

Literature data show that different types of fatty acids have variable effects on

free radical production and each fatty acid acts direct on ROS scavenging and

indirect on antioxidant enzymes induction (Bullo et al., 2011). Chia seed oil is a rich

source of ALA (Ayerza, 1995) and previous studies with the same fatty acid from

other source (Pal & Ghosh, 2012a, 2012b) corroborates to our present results on the

antioxidant status in vivo. These authors found that dietary intake of 0.5-1.0% ALA,

extracted from linseed oil, attenuated organic mercury-induced oxidative stress in

liver, kidney and blood of rats. ALA presented antioxidant effects by reducing lipid

peroxidation and restoring antioxidant enzymes such as CAT, SOD and GPx (Pal &

Ghosh, 2012a, 2012b). Thus, it may be possible that in in vivo conditions ALA might

reduce the hydroperoxides formation by scavenging free radicals and PUFA

peroxidation that occurs in lipids.

Our results seem to indicate that the protective effects against oxidative stress

caused by HFF diet might be due to either natural antioxidants present in chia

120

(Marineli et al., 2014; Martínez-Cruz & Paredes-López, 2014) or to PUFA action,

especially ALA, that give a greater mobility in cell membranes and therefore greater

membrane access to the antioxidants (Shinitzky, 1984). A recent study (Valenzuela

et al., 2014) demonstrated that dietary ALA intake from different vegetable oils,

including chia oil, caused important modifications in fatty acid composition of

phospholipids extracted from the various tissues of rats. However, the metabolites

absorption extension in plasma or tissues was not assessed in this present study.

The endogenous antioxidant system is supplemented by exogenous nutrients,

i.e. vitamins, minerals, polyphenols and others. Additionally, previous study

demonstrated that chia seed and oil could be a rich source of bioactive compounds,

due to an elevated content of polyphenolic compounds, including chlorogenic acid,

caffeic acid, myricetin, quercetin and kaempferol, and lipophilic compounds, such as

tocopherols, phytosterols, carotenoids and phospholipids (Reyes-Caudillo et al.,

2008; Ixtaina et al., 2011; Martínez-Cruz & Paredes-López, 2014). Therefore, these

compounds may be responsible for the high antioxidant potential in vitro as we

previously found in Chilean chia seed and oil (Marineli et al., 2014), which could also

explain our present findings. The antioxidant activity of a bioactive compound has

been attributed to several mechanisms, among which are chain initiation prevention,

binding of transition metal ion catalysts, peroxides decomposition, prevention of

continued hydrogen abstraction and radical scavenging (Halliwell, 1994). Dietary

antioxidants, mainly polyphenolic compounds, are exposed to an intensive in vivo

metabolism which affects their chemical structure, bioavailability, tissue retention and

subsequently bioactivity (Landete, 2012). A previous study (Gladine et al., 2007)

investigated the effect of plant extracts rich in polyphenols on different tissues of rats

fed omega-3 rich diets. These authors demonstrated that tissues are differently

affected by polyphenols and suggested that PUFA supplements did not sensibilize

tissues in a similar extension and that hepatic metabolism of polyphenols could have

reduced their activity. Nevertheless, it is necessary to evaluate the antioxidant

potential of chia seed and oil against oxidative injury including phenolic compounds

absorption mechanism and bioactivity in vitro and in vivo assays.

Another important finding was to observe the same antioxidant status

improvement and oxidative stress reversion after ingestion of both, chia seed and

chia oil, as well as the treatment time which the animals were submitted. The

121

absence of significant differences between both treatments time could suggest that 6

weeks is the enough time to observe significant changes in plasma and/or tissue

biomarkers. Furthermore, a possible explanation for the similar effects of oil and

seed intake may be related to different food matrices (seed vs. oil), since nutrients

interaction between compounds present in chia seed and the complexity of food

matrix synergism should be considered. The nutrient releasing from food matrix,

interactions with other food components, presence of cofactors and stable

compounds formation influence the nutrient bioavailability (Parada & Aguilera, 2007).

Therefore, the matrix state of natural foods may favor or hinder their nutritional

response in vivo, since the mode of action is more relevant than the total amount

present in the original food.

However, we previously found that dietary ingestion of chia seed and oil

showed different responses in heat shock protein and antioxidant enzymes

expression in skeletal muscle, depending on the treatment time and the ingredient

(seed or oil) added to the diet (Marineli et al., 2015). These findings lead to the

discussion that chia may influence the oxidative stress process in different ways, and

this influence is dependent on the biomarker used, including its tissue and

determination method. Moreover, considering the lack of studies assessing the

antioxidant potential of dietary chia seed and oil in vivo, determination of bioactive

compounds and their main in vivo metabolites in plasma, urine and tissues by

specific analytical techniques are absolutely crucial. The results presented in this

study are a good starting point for further investigations that should conduct further

analysis to clarify the bioactivity and mechanisms of action related to the beneficial

effects of chia intake.

In summary, the present study show that a daily consumption of chia seed

and oil diets enhanced plasma and liver antioxidant status, reduced plasma lipid

peroxidation and promote a protective effect against oxidative stress arising from

obesity. Chia seed and oil presented similar in vivo antioxidant properties,

independent of treatment time, probably due to the presence of polyphenols, ALA

and other active compounds. Thus, chia seed and oil intake could possibly improve

antioxidant defense system in diet-induced obese rats, protecting against cellular

oxidative damage and obesity related diseases. Caution is warranted before

extrapolating these results to humans, since the amount of chia tested in the present

122

study should be further evaluated in clinical studies for chia oil diet replacement or

introduction of chia seed in usual human diet.

Acknowledgments

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo (FAPESP, 2012/23813-4) and Conselho Nacional de Desenvolvimento


Conflict of interest

This work does not present conflicts of interest.

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and chia oils may increase ALA accretion and its conversion into n-3 LCPUFA in

diverse tissues of the rat. Food & Function, 5, 1564-1572.

128

CAPÍTULO III

129

ARTIGO III

Artigo em processo de submissão na revista Journal of Functional Foods

Chia seed and oil (Salvia hispanica L.) dietary intake normalizes dyslipidemia,

inflammation and insulin resistance in diet-induced obese rats

RUNNING HEAD: “Beneficial effects of chia in obese rats”

Rafaela da Silva Marineli a, Érica Aguiar Moraes a, Sabrina Alves Lenquiste a, Renato

Chaves Souto Branco b, Rafael Ludemann Camargo b, Everardo Magalhães Carneiro

b, Stanislau Bogusz Jr c, Mário Roberto Maróstica Jr a,*


Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil

b Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, University of

Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil

c Institute of Chemistry of São Carlos (IQSC), University of São Paulo (USP), São

Carlos, SP, Brazil



Campinas, São Paulo, Brazil.

130

Abstract

Objective: This study investigated the effects of dietary chia seed and chia oil on

obesity parameters and associated complications in diet-induced obese rats.

Methods: Sixty Wistar rats were divided in six groups: control (AIN-93M), high-fat and

high-fructose (HFF) diet, HFF diet added with chia seed or chia oil in short (6-weeks)

and long (12-weeks) treatments. Biochemical markers, lipid and hormonal profile,

inflammatory markers, glucose and insulin tolerance, insulin secretion by pancreas

islet isolation as well as plasma FAME content were determined. Results: HFF diet

induced weight gain, dyslipidemia, inflammation, glucose intolerance, insulin

resistance and altered parameters related to obesity complications. Chia seed and

chia oil intake did not reduce weight gain, adipose tissues weight and hepatic fat

accumulation, but was able to reduce total cholesterol, LDL-cholesterol and

triacylglycerol and increase HDL-cholesterol levels as well as fecal lipids excretion.

Chia diets intake also reduced tumor necrosis factor alpha (TNF-α), monocyte

chemoattractant protein-1 (MCP-1) and C-reactive protein concentrations and

increased adiponectin levels; improved glucose and insulin tolerance and reduced

insulin secretion by the pancreatic islets. Additionally, chia seed and oil intake did not

reduce plasma saturated fatty acids content, but increased α-linolenic acid (ALA),

eicosapentaenoic acid (EPA), docosapentaenoic acid (DPA) and docosahexaenoic

(DHA) plasma concentrations, and consequently reduced the n-6/n-3 ratio compared

to HFF group. Chia groups presented similar physiological effects, regardless of

treatment time. Conclusion: Dietary chia seed and chia oil were able to normalize

dyslipidemia, inflammation, glucose intolerance, insulin resistance and improve

plasma fatty acid profiles in diet-induced obese rats.

Key words: Chia, Salvia hispanica, Omega-3 fatty acid, obesity, insulin resistance,

glucose tolerance, inflammation.

131

1. Introduction

Obesity is an epidemic condition and is considered the largest public health

problem worldwide. The global obesity rise has increased the prevalence of

cardiovascular diseases, type 2 diabetes mellitus, cancer and others health

problems, which can lead to further morbidity and mortality (Swinburn et al., 2011).

As a chronic disease of multifactorial origin, an excessive energy intake from

saturated fatty acids and refined carbohydrates leads to an increase in energy

storage as fat, accompanied by metabolic disorders, which may contribute to

metabolic syndrome development (Fernández-Sánchez et al., 2011). High-fat and

high fructose diet (HFF) consumption have been related with the increase in obesity,

glucose intolerance, insulin resistance, inflammation and nonalcoholic fatty liver

disease in animals (Poudyal et al., 2012; Shapiro et al., 2011).

Recent studies have been suggested that changes in the diets composition

and functional foods addition are important environmental determinants in the

prevention or improvement of obesity related diseases (Trigueros et al., 2013).

Health benefits of regular consumption or dietary supplementation with long chain n-

3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) are widely acknowledged, especially in relation

to cardiovascular diseases, dyslipidemia, inflammation and diabetes (Baranowski et

al., 2012; Wu et al., 2012; Ganesan et al., 2014). Therefore, the evaluation of

potential functional foods rich in n-3 PUFA could be a strategy to obesity

complications management.

Chia (Salvia hispanica L.) is an herbaceous plant that belongs to Lamiaceae

family native from southern Mexico and northern Guatemala (Ayerza, 1995). Today it

is commercially available for human consumption as whole seeds, flour, and oil in the

Americas, Australia, Europe and Southeast Asia (Mohd Ali et al., 2012). Chia seed is

the richest known botanical source of omega-3 α-linolenic acid (C18:3 n-3, ALA, up

to 68%) (Ayerza, 1995) and has been also described as an important source of

protein, dietary fiber, minerals and polyphenolic compounds (Reyes-Caudillo,

Tecante & Valdivia-López, 2008; Marineli et al., 2014). Moreover, chia lipids could

also be an omega-3 alternative source to vegetarians and people with fish allergies

(Mohd Ali et al., 2012).

132

Additionally, the effects of chia seed ingestion has been recently described

for human health and nutrition because their bioactive components were found to

promote health benefits (Vuksan et al., 2007; Chicco et al., 2009; Poudyal et al.,

2012) without promote adverse effects. Our previous studies reported that chia intake

increased tissue protection-associated proteins expression, restored antioxidant

system in skeletal muscle (Marineli et al., 2015a) and reduced oxidative stress and

lipid peroxidation in diet-induced obese rats (Marineli et al., 2015b). However, chia

seed and oil has been little explored from a scientific point of view, especially in

relation to its in vivo inflammatory potential. We hypothesized that dietary chia seed

and chia oil, due to the content of bioactive compounds and n-3 PUFA, could protect

against obesity related diseases by improving glucose and insulin tolerance,

inflammation and dyslipidemia in diet-induced obese rats. Moreover, there was an

interest in determining whether the oil alone would produce the same response as

the seed. Therefore, the present study aimed to evaluate the beneficial effects of

dietary chia seed and chia oil ingestion on obesity parameters and associated

complications in high-fat and high-fructose diet-induced obese Wistar rats.

2. Materials and methods

2.1. Chia seed and oil

Fresh chia seed and chia oil from FTP S.A. Santiago, Chile were purchased

from R&S Blumos Comercial de Produtos Alimentícios Ltda, Brazil. According to the

producer, chia oil was obtained by cold pressing and stored at 2-8 °C until use in

amber glass bottles without headspace. Seeds were ground in a laboratory impact

mill (Marconi MA 630/1, Piracicaba – São Paulo, Brazil) and passed through a 0.850

mm sieve. Chemical analysis and antioxidant activity of Chilean chia seed and oil

samples used in this study were previously determined by Marineli et al. (2014).

2.2 Animals, diets and interventions

This work was approved by the Ethics Commission on Animal Use (CEUA/

UNICAMP, protocol no. 2936-1) and followed the University guidelines for the use of

133

animals in experimental studies. Sixty male Wistar rats, aged 21 to 23 days, were

obtained from Multidisciplinary Center for Biological Investigation, University of

Campinas. Animals remained in individual cages for growth with free access to water

and chow diet for 4 weeks and were maintained under controlled conditions (22 ± 1

ºC, 60-70% humidity, 12 hours light/dark cycle). After growth, animals (226.52 g ±

18.74) were randomly divided in six experimental groups (n=10/group) for 12 weeks.

Diets were based on the American Institute of Nutrition (AIN-93M) (Reeves,

Nielsen & Fahey, 1993) with protein concentration of 12%. Control group received

the standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) group received a diet

containing 4% (w/w) soybean oil, 31% (w/w) lard and 20% fructose (w/w) (Marineli et

al., 2015a); chia seed short and long treatments received an HFF diet with 13.3%

(w/w) of chia seed; chia oil short and long treatments received an HFF diet with 4%

(w/w) of chia oil. There were a long (12 weeks) and a short (6 weeks) treatment with

chia seed or chia oil. Animals from long treatment were fed only an HFF diet

containing chia seed or chia oil for 12 weeks. Short groups were initially fed only an

HFF diet for the first 6 weeks, followed by an additional 6 weeks with an HFF diet

containing chia seed or chia oil. Soybean oil for both chia seed and chia oil diet was

replaced by the oil content of chia seed or chia oil. Chia diets were formulated to

provide equal quantities of oil and ALA from chia (Ayerza & Coates, 2007). According

to Marineli et al., 2014 chia seeds contained 30.2% of lipids. Protein and dietary fiber

content in HFF-chia seed groups was balanced taking into account the amount of

such nutrients present in chia seed (Marineli et al., 2014). Diets composition is

presented in Table 1. Diets were prepared monthly and packed in dark polyethylene

bags and stored at -20 ºC to minimize the oxidation of fatty acids. Weight gain was

monitored weekly and food intake every 2 days.

134

Table 1. Experimental diets ingredients and fatty acid composition

Ingredients (g/kg diet) AIN-93M HFF Chia seed Chia oil

Casein 1 139.53 139.53 106.53 139.53

Maltodextrin 155.0 45.40 45.40 45.40

Corn starch 465.69 136.44 123.44 136.44

Sucrose 100.0 29.32 29.32 29.32

Soybean oil 40 40 - -

Chia oil - - - 40

Chia seed - - 133 -

Lard - 310 310 310

Fructose - 200 200 200

Cellulose 50 50 3.6 50

Mineral mixture 35 35 35 35

Vitamin mixture 10 10 10 10

L-Cystine 1.8 1.8 1.8 1.8

Choline bitartrate 2.5 2.5 2.5 2.5

tert-Butyl hydroquinone 0.008 0.008 0.008 0.008

Energy density (kcal/g

diet) 3.75 5.89 5.85 5.88

Fatty acids 2

SFA 7.38 127.86 125.35 125.99

MUFA 10.20 146.94 138.87 140.11

PUFA 22.42 71.10 81.11 79.54

Linoleic (C18:2n-6) 19.89 66.74 54.97 53.53

α-Linolenic (C18:3n-3) 2.20 4.06 25.88 25.73

n-6/n-3 ratio 9.04 16.44 2.12 2.08

1 Amount was calculated based on protein content equal to 86% to provide 12 g of

protein/100 g of diet. 2 Fatty acids expressed in g/kg diet was determined by gas

chromatography according to Maia & Rodriguez-Amaya, 1993 and Kramer et al, 1997.

AIN-93M group: control standard diet; HFF group: high-fat and high-fructose diet; Chia

seed groups: HFF diet plus 13.3% (w/w) chia seed; Chia oil groups: HFF diet plus 4%

135

(w/w) chia oil. SFA: saturated fatty acids, MUFA: monounsaturated fatty acids, PUFA:

polyunsaturated fatty acids.

2.2 Intraperitoneal glucose tolerance test (iGTT) and insulin tolerance test (ITT)

An intraperitoneal glucose tolerance test (iGTT) and insulin tolerance test (ITT)

were performed on food-deprived (12 h) rats after 10 and 11 weeks of experiment,

respectively. Blood glucose levels were measured with a FreeStyle Lite® handheld

glucometer (Abbott Diabetes Care, Abbott Laboratorios do Brazil LTDA) using

appropriate test strips. For the iGTT, a solution of 50% D-glucose (2 g/kg body

weight) was administered into the peritoneal cavity. Blood samples were collected

from the tail vein at 30, 60, 90 and 120 min for the determination of glucose

concentrations. The AUC of glucose was calculated. For the ITT, glucose blood

levels were sampled at 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min following intraperitoneal injection

of human insulin (0.75 U/kg body weight, Novolin R, Novo Nordisk® Farmacêutica do

Brazil LTDA). The constant rate for glucose disappearance during the ITT (KITT

%/min) was calculated using the formula [0.693 / (t1/2)]. The glucose t1/2 was

calculated from the slope of the least-square analysis of the glucose concentrations

during the linear phase (Bonora et al., 1987).

2.3 Blood and tissue collection

Animals were euthanized by decapitation preceded by 12-hour-fasting. Blood

samples were collected in polyethylene tubes with or without EDTA anticoagulant to

obtain plasma and serum, respectively. Tubes were centrifuged at 3000 g (15 min, 4

ºC). Serum and plasma were separated and stored in polypropylene microtubes at -

80 °C until analysis. Liver, heart, kidneys, spleen, epididymal, mesenteric and

retroperitoneal adipose tissues were removed and weighed. Liver was frozen in liquid

nitrogen and stored at -80 ºC for subsequent analysis. Relative organs weights were

calculated [RWL= (wet organ weight (g) x 100) / final body weight (g)]. Pancreatic

islet samples were isolated from the rats by the collagenase method, as described

previously (Rezende et al., 2007).

136

2.4 Evaluation of pancreatic islet glucose-stimulated insulin secretion

Batches of five islets were pre-incubated for 1 h at 37 C in Krebs–Henseleit

buffer solution (KHBS) containing 0.5 g/L bovine serum albumin and 5.6 mM glucose

and equilibrated at 95% O2 and 5% CO2 (pH 7.4). The medium was discarded, and

the islets were incubated for an additional 1 h in 1 mL of KHBS containing 2.8 or 16.7

mM glucose. Subsequently, the supernatant fraction was collected to evaluate insulin

secretion which was measured by radioimmunoassay (RIA) (Rezende et al., 2007).

2.5 Serum determinations

Serum total cholesterol (TC) (1220001), high-density lipoprotein cholesterol

(HDL-c) (1220223), triacylglycerol (TAG) (1780105), glucose (1400106) (Wiener lab.,

Argentina), uric acid (700320) and free fatty acid (FFA) (700310) (Cayman Chemical

Company, Ann Arbor, MI, USA) were determined using commercial enzymatic

colorimetric assays kits following manufacturer's protocol. Low-density lipoprotein

cholesterol (LDL-c) level was estimated using the Friedewald formula [LDL-c = (TC –

HDL-c) – (TAG/5)] (Friedewald et al., 1972). Serum adiponectin (EZRADP-62K),

ghrelin (EZRGRT-91K), insulin (EZRMI-13K), leptin (EZRL-83K) and C-Reactive

Protein (CRP) (CYT294) were analyzed using enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) method (Millipore, MA, USA) following manufacturer's protocol. Absorbance

readings were done in a microplate reader Synergy HT, Biotek (Winooski, VT, USA);

with Gen5™ 2.0 data analysis software spectrophotometer. Tumor necrosis factor

alpha (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were determined

using Rat Metabolic Magnetic Bead Panel (RMHMAG-84K) (Millipore, MA, USA)

following manufacturer's protocol.

2.6 Hepatic and fecal lipids content

Liver was freeze-dried, manually ground with mortar and pistil and kept at -80

°C until analysis. Feces were collected for 7 days during the last experimental week

to determine wet and dry weight by incubation for 24 hours at 60 C. Then, feces

were milled and stored at -20 C. Hepatic and fecal total lipids content were

determined by the method of Bligh and Dyer extraction (Bligh & Dyer, 1959).

137

2.7 Plasma fatty acid methyl esters (FAME)

Fatty acids methyl esters (FAME) were prepared as previously described by

(Glaser et al., 2010) with adaptations. A total of 100 µL of plasma, 100 µL of internal

standard (Pentadecanoic methyl ester; Nu-Chek-Prep, INC, Elysian, MN, USA) and

600 µL methanol (precooled to 5 °C) were combined in glass tubes and shaken for

30 s. Precipitated proteins were separated from the methanolic phase by

centrifugation at 900 g for 5 min. Methanolic supernatant, which contained mainly

polar lipids, was transferred into another glass tube. Twenty-five µL sodium

methoxide solution (25% in methanol) were added to the supernatant, then the tubes

were shaken at room temperature. The reaction was stopped after 3 min by adding

75 µL methanolic HCl (3N). FAME were extracted by adding 300 µL hexane and

shaking for 30 s. Upper hexane phase was transferred into a 2 mL vial. The

extraction was repeated and combined extracts were dried under nitrogen flow at

room temperature. Dry residue was taken up in 500 µL hexane (containing 2 g/L

butylated hydroxytoluene) for gas chromatography analysis. All analyses were

carried out in triplicate.

Chromatographic conditions

FAME were analyzed by gas chromatography using an Agilent 6890N

equipment with an autosampler N10149 and flame ionization detector (Agilent, CA,

USA). The separation was performed in a 100 m × 0.25 mm i.d. × 0.20 µm, CP-Sil 88

capillary column (Agilent, DE, USA). The chromatographic conditions were: injector

and detector temperatures, 250 and 270 °C; injected volume, 1 µL in splitless mode;

carrier gas, hydrogen at 1.7 mL/min; oven, 78 °C for 10 min, with an increase of 8

°C/min to 180 °C, then 3 °C/min until 205 °C and finally 10 °C/min to 240 °C. FAME

were identified by comparison with authentic standards FAME Mix GLC-85 (Nu-

Chek-Prep, INC, Elysian, MN, USA), methyl cis-5,8,11,14,17 eicosapentaenoate

(EPA), methyl cis-7,10,13,16,19 docosapentaenoate (DPA) and cis-4,7,10,13,16,19

docosahexaenoic (DHA) (Supelco, Bellefonte, PA, USA). The quantification was

expressed as percentage of total fatty acid content.

2.8. Statistical analysis

138

Data are expressed as mean values ± standard deviation. Differences

between AIN-93M and HFF group were tested by T test. Differences among HFF,

chia seed 12 wk, chia seed 6 wk, chia oil 12 wk and chia oil 6 wk groups were tested

by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's test using the

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA) software. P<0.05

was considered statistically significant.

3. Results

Food intake, weight gain and organs weight

Food intake, energy intake, weight gain, and organs weight are shown in

Table 2. Food intake was lower and energy intake was higher in HFF-fed animals

compared to AIN-93M group. These parameters did not differ among chia (seed or

oil) and HFF groups. Animals fed on HFF diet showed an increase in weight gain

compared to AIN-93M group. Chia seed and oil intake did not attenuate rat‘s weight

gain when compared to HFF group. Weight of epididymal, mesenteric and

retroperitoneal adipose tissues in HFF-fed animals were higher than those in AIN-

93M group. Chia seed and chia oil diet intake did not show differences in adipose

tissues weight compared to HFF group. Kidneys of group that consumed chia seed

for 12 weeks were smaller than those in HFF group. There was no difference in heart

and spleen weight among the experimental groups. Animals fed on HFF diet showed

an increase in liver weight when compared to AIN-93M group. Only groups that

consumed chia seed (6 and 12 wk) showed a decrease in liver weight compared to

HFF and chia oil groups. Hepatic lipids content was higher in HFF-fed animals

compared to AIN-93M group. However, chia seed and chia oil intake did not reduce

hepatic fat accumulation in animals. HFF group showed an increase in fecal lipids

content when compared do AIN-93M group. Groups that consumed chia seed (6 and

12 wk) showed higher fecal lipids content compared to HFF group (Table 2). Uric

acid concentration was higher in HFF group compared to AIN-93M group. There was

no difference in uric acid concentration among HFF and chia groups. FFA levels

showed the same behavior among experimental groups. No alteration was observed

for serum glucose concentration (Table 2).

139

Table 2. Food and energy intake, weight gain, organs weight and metabolic parameters of rats fed on different diets1

AIN-93M HFF Chia seed 12 wk Chia seed 6 wk Chia oil 12 wk Chia oil 6 wk

Food intake (g/day) 24.78 1.39A 20.47 0.95B a 19.37 0.51a 19.30 0.81a 19.69 0.84a 19.25 0.86a

Energy intake (kcal/day) 92.93 5.23B 120.50 5.63A a 113.30 3.04a 112.90 4.75a 115.80 4.98a 113.20 5.06a

Weight gain (g/day) 3.16 0.27B 3.89 0.25A a 3.91 0.19a 4.02 0.35a 3.97 0.38a 3.98 0.40a

Epididymal fat (g/100g) 2.90 0.55B 4.02 0.64A a 4.33 0.56a 4.06 0.32a 3.78 0.41a 3.97 0.91a

Retroperitoneal fat

(g/100g) 3.92 0.99B 5.56 0.71A a 6.09 1.01a 5.42 1.10a 5.76 0.60a

5.38 0.83a

Mesenteric fat (g/100g) 1.99 0.50B 3.15 0.50A a 3.58 0.38a 3.35 0.56a 3.09 0.60a 3.17 0.90a

Liver (g/100g) 2.73 0.23B 3.21 0.22A a 2.80 0.26b 2.87 0.15b 3.16 0.34a 3.31 0.28a

Kidneys (g/100g) 0.54 0.06A 0.54 0.07A a 0.46 0.03b 0.49 0.03ab 0.50 0.03ab 0.50 0.03ab

Spleen (g/100g) 0.19 0.02A 0.18 0.02A a 0.16 0.02a 0.18 0.02a 0.18 0.02a 0.19 0.03a

Heart (g/100g) 0.26 0.02A 0.25 0.03A a 0.24 0.02a 0.25 0.01a 0.25 0.02a 0.24 0.02a

Hepatic lipids (g) 2 26.82 3.83B 50.05 9.44A a 47.35 4.57a 47.03 5.27a 48.05 3.49a 51.44 9.68a

Fecal lipids (g) 2 2.52 0.31B 5.66 0.94A b 9.46 2.18a 9.13 2.74a 6.63 1.62ab 6.16 1.26ab

Glucose (mg/dL) 108.42 3.97A 114.93 7.0A a 119.69 10.17a 111.99 11.49a 115.82 4.08a 111.59 7.91a

Uric acid (µM/mL) 27.76 14.38B 64.86 19.61A a 55.50 23.02a 62.08 19.91a 49.65 13.46a 48.22 19.16a

FFA (µM/mL) 613.15 18.3B 679.55 7.82A a 645.05 21.2a 667.91 13.3a 644.64 32.4a 661.48 31.6a

1 Control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus 13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed

12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different

140

capital letters (A-B) mean significant differences between AIN-93M and HFF group according to T test (P<0.05). Different small

letters (a-b) mean significant differences between HFF, chia seed and chia oil groups by one-way analysis of variance followed by

Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as mean ± standard deviation (n = 8/group). 2 Values expressed in dry basis. FFA: free fatty

acid.

141

Glucose and Insulin Tolerance Tests

Glucose and insulin tolerance tests are shown in Figure 1. HFF diet intake

induced glucose and insulin intolerance compared to AIN-93M group (Figure 1). All

groups that consumed chia seed and chia oil diets (6 and 12 wk) improved glucose

and insulin tolerance compared to HFF group. Chia groups were more glucose

tolerant, as revealed by a glucose tolerance test (iGTT) (Fig. 1 B) and reflected by a

lower AUC of glucose during the iGTT (Fig. 1 A). Additionally, chia groups were more

insulin sensitive, as revealed by the lower blood glucose values observed during the

ITT (Fig. 1 D) and increased KITT (Fig. 1 C).

Figure 1. (A) Glucose AUC during intraperitoneal glucose tolerance test (iGTTAUC),

(B) Mean blood glucose levels after intraperitoneal infusion of glucose solution, (C)

KITT during intraperitoneal insulin tolerance test, (D) Mean blood glucose levels after

142

intraperitoneal infusion of insulin in rats fed on different diets: control standard diet

(AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus chia seed during 12

weeks (chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus chia oil during 12

weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean

significant differences between AIN-93M and HFF group according to T test




Static insulin secretion

Evaluation of pancreatic islet glucose-stimulated insulin secretion is shown in

Figure 2. Animals fed on HFF diet showed an increase in insulin secretion by the

pancreatic islets compared to AIN-93M group. Additionally, the pancreatic islets of

chia groups (seed and oil) secreted less insulin under both sub-stimulatory (2.8

mmol/L) and supra-stimulatory (16.7 mmol/L) glucose conditions (Fig. 2 A and B,

respectively).

Figure 2. Pancreatic islet glucose-stimulated insulin secretion at 2.8 mmol/L (A) and

16.7 mmol/L (B) glucose in rats fed on different diets: control standard diet (AIN-

93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus chia seed during 12 weeks

(chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus chia oil during 12 weeks

143

(chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean





Lipid profile

Lipid profile results are shown in Figure 3. HFF diet intake reduced HDL-c

levels and increased LDL-c and TAG levels compared to AIN-93M animals. All

groups that consumed chia seed or chia oil showed a reduction in TC, LDL-c and

TAG levels and also showed an increase in HDL-c levels compared to HFF group

(Fig. 3).

Figure 3. (A) Total cholesterol (TC), (B) HDL-c, (C) LDL-c and (D) Triacylglycerol

(TAG) in serum of rats fed on different diets: control standard diet (AIN-93M); high-fat

and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus chia seed during 12 weeks (chia seed 12-

144

wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk)

or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean significant differences

between AIN-93M and HFF group according to T test (P<0.05). Different small letters

(a-b) mean significant differences between HFF, chia seed and chia oil groups by

one-way analysis of variance followed by Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as

mean ± standard deviation (n = 8/group).

Hormonal and Inflammatory markers

Inflammatory markers results are shown in Figure 4. Animals fed on HFF diet

showed an increase in serum leptin and insulin concentrations compared to AIN-93M

group (Fig. 4 A and B, respectively). Chia seed and chia oil groups were not able to

reduce HFF-induced hyperinsulinemia and hyperleptinemia. Ghrelin concentrations

were higher in HFF group in relation to AIN-93M group. There was no difference in

ghrelin concentrations among HFF and chia groups (Fig. 4 C). HFF diet intake

showed a reduction in adiponectin concentration compared to AIN-93M group. Chia

seed and chia oil groups displayed increased serum adiponectin concentration in

relation to HFF group (Fig. 4 D). Furthermore, TNF-α, MCP-1 and C-reactive protein

concentrations were increased in HFF-fed animals when compared to AIN-93M

group, whereas all chia groups were able to reduce these inflammatory markers

compared to HFF group (Fig. 4 E-G, respectively).

145

Figure 4. (A) Leptin, (B) Insulin, (C) Ghrelin, (D) Adiponectin, (E) TNF-α, (F) MCP-1

and (G) C-reactive protein in serum of rats fed on different diets: control standard diet

(AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus chia seed during 12

weeks (chia seed 12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus chia oil during 12

146

weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different capital letters (A-B) mean





FAME contents

Results of plasma fatty acid composition, as a percentage of total fatty acid

content, are shown in Table 3. Animals fed with HFF diet showed a reduction in

C16:0 and C16:1 n-7 plasma concentrations compared to AIN-93M group and no

changes were found in chia groups when compared to HFF group. Linoleic acid

(C18:2 n-6, LA) plasma concentrations showed the same behavior among

experimental groups. No alteration was found for C11:0, C12:0, C13:0, C17:0, C18:1

n-9, C18:1 n-9T, C20:2 n-6, C20:4 n-6 and C22:1 n-9 among experimental groups.

HFF diet intake increased plasma concentration of C18:0, C20:0 and C20:3 n-6 in

relation to AIN-93M group, and no changes were found in chia groups when

compared to HFF group. C17:1 n-7 and C20:1 n-9 plasma concentrations were

higher in chia seed and oil groups compared to HFF group. Additionally, all chia

groups increased concentration of C18:3 n-3 (ALA), C20:5 n-3 (EPA) and C22:5 n-3

(DPA) in relation to HFF group. DHA (C22:6 n-3) concentration was lower in HFF-fed

animals compared to AIN-93M group. However, chia seed and chia oil intake

increased plasma DHA concentration compared to HFF group, as occurred with n-3

FAME contents. PUFA and n-6 FAME contents were lower in HFF-fed animals

compared to AIN-93M group and no changes were found in chia groups when

compared to HFF group. Groups that received chia seed or chia oil showed a

markedly reduction in n-6/n-3 ratio compared to HFF group. Furthermore, SFA

contents were higher in HFF group in relation to AIN-93M. The same occurred with

chia groups compared to HFF group. However, no alterations were found in MUFA

contents among experimental groups.

147

Table 3. Plasma fatty acid composition (%) of rats fed on different diets1

FAME AIN-93M HFF Chia seed 12 wk Chia seed 6 wk Chia oil 12 wk Chia oil 6 wk

C11:0 0.19 ± 0.06A 0.22 ± 0.06A a 0.42 ± 0.11a 0.34 ± 0.09a 0.55 ± 0.20a 0.31± 0.15a

C12:0 0.08 ± 0.01A 0.12 ± 0.03A a 0.10 ± 0.004a 0.09 ± 0.004a 0.11 ± 0.02a 0.12 ± 0.01a

C13:0 0.18 ± 0.01 A 0.14 ± 0.04A a 0.20 ± 0.08a 0.15 ± 0.03a 0.15 ± 0.02a 0.22 ± 0.06a

C16:0 31.00 ± 0.68A 25.10 ± 0.48B a 25.00 ± 0.40a 25.29 ± 0.61a 26.05 ± 0.27a 26.60 ± 0.68a

C16:1 n-7 1.93 ± 0.32A 0.30 ± 0.03B a 0.31 ± 0.03a 0.30 ± 0.02a 0.30 ± 0.02a 0.27 ± 0.01a

C17:0 0.49 ± 0.02A 0.45 ± 0.02A a 0.43 ± 0.01a 0.43 ± 0.004a 0.44 ±0.004a 0.46 ±0.008a

C17:1 n-7 0.16 ± 0.05A 0.19 ± 0.02A b 0.52 ± 0.15a 0.45 ± 0.09a 0.66 ± 0.25a 0.55 ± 0.18a

C18:0 19.86 ± 1.09B 29.46 ± 1.25A a 30.43 ± 0.65a 29.92 ± 0.99a 28.78 ± 0.62a 29.37 ± 0.80a

C18:1 n-9 1.13 ± 0.15A 1.10 ± 0.04A a 0.80 ± 0.13a 0.73 ± 0.12a 0.74 ± 0.20a 0.97 ± 0.18a

C18:1 n-9T 7.56 ± 0.92A 8.51 ± 0.66A a 7.24 ± 0.54a 7.98 ± 0.67a 7.73 ± 0.65a 7.39 ± 0.57a

C18:2 n-6 (LA) 18.33 ± 0.64A 16.07 ± 0.19B a 15.32 ± 0.60a 14.83 ± 0.35a 15.84± 0.43a 14.95 ± 0.21a

C18:3 n-3 (ALA) 0.25 ± 0.02A 0.23 ± 0.04A b 0.58 ± 0.22a 0.36 ± 0.04 a 0.44 ± 0.04 a 0.38 ± 0.03 a

C20:0 0.10 ± 0.004B 0.14 ± 0.01A a 0.12 ± 0.04a 0.13 ± 0.04a 0.11 ± 0.02a 0.12 ± 0.02a

C20:1 n-9 0.33 ± 0.04A 0.29 ± 0.03A b 0.81 ± 0.09a 0.62 ± 0.08a 0.69 ± 0.08a 0.62 ± 0.19a

C20:2 n-6 0.18 ± 0.01A 0.18 ± 0.02A a 0.20 ± 0.01a 0.19 ± 0.01a 0.19 ± 0.02 a 0.20 ± 0.01a

C20:3 n-6 0.33 ± 0.02A 0.21 ± 0.03B a 0.25 ± 0.02a 0.24 ± 0.02a 0.24 ± 0.01a 0.24 ± 0.01a

C20:4 n-6 (AA) 16.00 ± 0.80A 15.62 ± 0.54A a 14.11 ± 0.48a 14.97 ± 0.42a 13.97 ± 0.66a 14.68 ± 0.68a

C20:5 n-3 (EPA) 0.22 ± 0.06A 0.36 ± 0.10A b 0.64 ± 0.21a 0.52 ± 0.04 a 0.54 ± 0.06 a 0.51 ± 0.04 a

148

FAME AIN-93M HFF Chia seed 12 wk Chia seed 6 wk Chia oil 12 wk Chia oil 6 wk

C22:0 Nd 0.06 1.94 Nd 1.94 nd

C22:1 n-9 0.65 ± 0.11A 0.70 ± 0.07 A a 0.75 ± 0.06 a 0.71 ± 0.02 a 0.79 ± 0.06 a 0.82 ± 0.07 a

C22:5 n-3 (DPA) 0.28 ± 0.02A 0.26 ± 0.01A b 0.56 ± 0.01a 0.54 ± 0.04a 0.48 ± 0.03a 0.52 ± 0.04a

C22:6 n-3 (DHA) 1.54 ± 0.08A 1.08 ± 0.05B b 1.35 ± 0.07a 1.37 ± 0.09a 1.30 ± 0.08a 1.40 ± 0.10 a

SFA 51.76 ± 1.23B 55.50 ± 0.89A a 56.94 ± 0.75a 56.29 ± 0.41a 56.42 ± 0.87a 57.12 ± 0.30a

MUFA 11.29 ± 1.44A 10.65 ± 0.95A a 10.33 ± 0.55a 10.73 ± 0.85a 10.91 ± 0.80a 10.53 ± 0.97a

PUFA 36.82 ± 0.59A 33.86 ± 0.55B a 32.72 ± 0.57a 33.00 ± 0.71a 32.67 ± 0.59a 32.35 ± 0.91a

n-6 34.53 ± 0.64A 31.92 ± 0.59B a 29.72 ± 0.48a 30.23 ± 0.67a 30.03 ± 0.49a 29.92 ± 0.75a

n-3 2.28 ± 0.10A 1.94 ± 0.08B b 3.01 ± 0.66a 2.77 ± 0.13a 2.65 ± 0.15a 2.43 ± 0.19a

n-6/n-3 15.14 ± 0.78A 16.45 ± 0.81A a 9.87 ± 1.06b 10.91 ± 0.89b 11.33± 0.73b 12.31 ± 1.25b

1 Control standard diet (AIN-93M); high-fat and high-fructose (HFF) diet; HFF diet plus 13.3% chia seed during 12 weeks (chia seed

12-wk) or 6 weeks (chia seed 6-wk); HFF plus 4% chia oil during 12 weeks (chia oil 12-wk) or 6 weeks (chia oil 6-wk). Different

capital letters (A-B) mean significant differences between AIN-93M and HFF group according to T test (P<0.05). Different small

letters (a-b) mean significant differences between HFF, chia seed and chia oil groups by one-way analysis of variance followed by

Tukey‘s test (P<0.05). Data expressed as mean ± standard deviation (n = 8/group). nd: Not detected. SFA: saturated fatty acids,

MUFA: monounsaturated fatty acids, PUFA: polyunsaturated fatty acids.

149

4. Discussion

Our data show that a HFF diet intake induced obesity, dyslipidemia, hepatic fat

accumulation, inflammation and impaired glucose and insulin tolerance in Wistar rats.

These findings are in agreement with those reported in earlier studies, which

demonstrated that high-fat and high-carbohydrate diets are able to mimic many signs

of human metabolic syndrome associated with obesity development (Poudyal et al.,

2012; Shapiro et al., 2011). In addition, fructose intake could influence carbohydrate

and lipid metabolism, which is associated with metabolic abnormalities in humans

and animals (Tappy et al., 2010).

In the present study, a daily consumption of chia seed and oil did not reduce

weight gain or adipose tissues weight after 6 or 12-weeks of experimental period.

These results are consistent with previous reports using chia seed (Chicco et al.,

2009 and Oliva et al., 2013) which demonstrated that chia intake did not affect body

weight gain in high sucrose-fed rats. However, these authors found a reduction in

adipose tissues weight and visceral adiposity in rats that consumed chia seed, which

was not found in the current study. These outcomes were related to improvement in

basal lipolysis and lipogenic enzyme activities such as a reduction in fatty acid

synthase (FAS) and acetyl-CoA carboxylase (ACC) in adipose tissue (Oliva et al.,

2013). Furthermore, it is needed to emphasize that different diets‘ compositions were

used in both studies, since chia seed was added to those diets almost 3 times more

(36.2%) than in the present study (13.3%), which may influence the results found.

Although chia seed showed a decrease in liver weight, chia seed and oil intake

did not reduce hepatic fat accumulation in animals. On the other hand, previous

studies found that chia seed ingestion reduced hepatic steatosis in diet-induced

obese rats (Poudyal et al., 2012; Rossi et al., 2013). Rossi et al (2013) explain this

result by the alterations in key enzymes activities involved in lipogenesis and

oxidative mitochondrial fatty acid oxidation, accompanied by changes in the sterol

regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) and peroxisome proliferator-

activated receptor-α (PPARα) expression in the liver. Moreover, Poudyal et al (2012)

also found a reduction in portal inflammatory cell infiltration and fibrosis in the liver of

150

obese rats fed with chia seed diet. However, liver histology or hepatic TAG

accumulation were not evaluated in the present research.

Current study demonstrates that chia seed and chia oil intake was able to

normalize dyslipidemia as well as increase fecal lipids excretion in obese rats. In this

regard, some animal studies have shown a reduction in serum or plasma total

cholesterol, TAG and an increase in HDL-cholesterol when chia was used as a fat

dietary source in healthy or dyslipidemic rats (Ayerza & Coates 2007; Chicco et al.,

2009), which corroborates with our findings. Moreover, hypolipidemic effects found in

chia groups could explain previous studies that showed an increase in

cardioprotective parameters in obese rats fed with chia seed diet (Poudyal et al.,

2012). Nevertheless, our results show that FFA concentrations were not altered with

chia diets intake. Poudyal et al (2012) found an increase in FFA concentrations in

obese rats when chia was added to the diets at 5%. On the other hand, other studies

demonstrated a reduction in this marker when chia seed was added to the diets at

36.2% in dyslipidemic rats (Oliva et al., 2013; Rossi et al., 2013).

High dietary fiber content in chia seed could play a role in lowering circulating

lipid levels since the hypocholesterolemic effect of dietary fiber is widely reported

(Willem van der Kamp et al., 2010). Additionally, ALA, the major fatty acid present in

the chia, was converted to long-chain n-3 PUFA, mainly to EPA and DHA in the liver

(González-Mañán et al., 2012). The effectiveness of this bioconversion can

determine its effect on plasma lipids. In this way, chia, as a precursor of EPA and

DHA, could modify fatty acid metabolism in the liver through PPARα activation and

SREBP-1c down-regulation, leading to a decrease in circulating lipids (Rossi et al.,

2013). Similar results were found by González-Mañán et al (2012) in relation to fatty

acid oxidation and biomarkers expression involved in lipogenesis after chia oil

ingestion in health rats. It could also explain the hypolipidemic effects of chia oil

intake in the present study. Furthermore, Sierra et al (2015) demonstrated that chia

oil can improve vascular function under hypercholesterolaemic conditions in rabbits.

Chia seed and oil groups improved glucose and insulin tolerance and reduced

insulin secretion by the pancreatic islets, although fasting plasma insulin

concentration was not affected. Similar results were reported by Chicco et al (2009)

when chia seed provided dietary fat during the last 2 months of feeding period in

151

dyslipidemic rats. They found an improvement in insulin resistance and glucose

homeostasis without changes in insulinemia. In addition, chia seed intake normalized

the decrease capacity of glucose phosphorylation and glucose oxidation during the

euglycemic–hyperinsulinemic clamp, as well as improved peripheral insulin

insensitivity in high sucrose-fed rats (Oliva et al., 2013). In this regard, long-chain n-3

PUFA have shown to prevent or normalize peripheral insulin resistance in both high-

carbohydrate and high-fat-fed animals (Lombardo & Chicco 2009). In addition, long-

chain n-3 PUFA affect the membrane lipid composition and this, in turn, moderates a

wide range of eicosanoid- and non-eicosanoid-mediated effects upon the metabolic

process and could directly affect insulin action (Chicco et al., 2009). Moreover, it has

been shown that dietary ALA or flaxseed oil improved insulin sensitivity and glycemic

responses in animal models and moderately improved fasting plasma glucose and

insulin resistance markers in humans (Wu et al., 2012).

Furthermore, in our previous study (Marineli et al., 2015a) we suggest that

chia seed and oil effect on increasing heat shock proteins (HSP) and restoring

antioxidant defense expression was an important factor in the improvement of

glucose tolerance, either coming from oxidative stress or from the mitochondrial

dysfunction that obesity may cause. Additionally, the antioxidant agents use, before

or after the onset of obesity, may ease glucose intolerance (Henriksen et al., 2011).

This could also explain our present findings, since chia seed and oil intake improved

antioxidant status in plasma and liver in diet-induced obese rats (Marineli et al.,

2015b). It is important highlight that insulin receptors and insulin signaling via should

be further addressed in vivo studies with chia to explain these outcomes in a

molecular way.

Chia seed and chia oil intake was able to normalize serum inflammation

caused by HFF-fed diet, since chia promote a decrease in pro-inflammatory markers

such as TNF-α, MCP-1 and C-reactive protein and an increase in adiponectin, an

anti-inflammatory marker. Adiponectin plays a protective role against insulin

resistance by regulating glucose and lipid metabolism and has potent angiogenic,

antiatherogenic and anti-inflammatory properties (Galic et al., 2010). However, there

are a few studies about chia effects on hormone and inflammatory markers linked to

obesity.

152

Obesity has been linked with a low-grade, chronic inflammatory response,

characterized by altered production of adipokines and increases in biological

inflammation markers, such as TNF-α, MCP-1 and interleukin-6 among other (Galic

et al., 2010; Fernández-Sánchez et al., 2011). TNF-α is involved in the systemic

inflammatory response and it has also been linked with development of insulin

resistance, obesity and diabetes (Galic et al., 2010). C-reactive protein is the most

extensively studied systemic inflammation marker in humans and its elevated levels

has been associated with cardiovascular risk factors, including insulin resistance,

diabetes, metabolic syndrome, hypertension and dyslipidemia (Fernández-Sánchez

et al., 2011). Long-term supplementation with chia seed (37g/day) reduced C-

reactive protein levels, while maintained a good glycemic and lipid control in type 2

diabetes individuals (Vuksan et al., 2007). Poudyal et al (2012) also found a

reduction in plasma C-reactive protein in obese rats fed with chia seed diet, which

corroborates with our findings.

In addition, an increased fat mass and larger adipocytes lead to elevated

circulating leptin concentrations and leptin, in turn, exerts pro-inflammatory actions by

activating various immune cells (Fernandez-Riejos et al., 2010). It is consistent with

our findings related to metabolic damage caused by HFF diet. However, chia groups

did not reduce serum hyperleptinemia, although the reduction in serum inflammatory

markers. Moreover, the potential effect of daily chia consumption on these

biomarkers is still recent and not enough studied.

Based on animal experimental studies, n-3 PUFA can improve several

metabolic abnormalities and such effects include insulin-sensitizing improvement

through increasing adipocytokines production and secretion; and potential prevention

of insulin resistance via anti-inflammatory effects (Wu et al., 2012).

Baranowski et al (2012) demonstrated that dietary interventions with ALA-rich

flaxseed oil promote a reduction in the adipose tissue protein levels of several

inflammatory markers in obese Zucker rats. Additionally, the cardioprotective effects

of ALA are mediated in part by a reduction in inflammatory cytokines production

(Zhao et al., 2007). The mechanism whereby n-3 fatty acids alter gene expression is

multi-fold. It has been postulated that fatty acids alter inflammatory responses by

inhibiting nuclear factor kappaB (NF-kB) activity/signaling, which regulates the

153

induction of cytokine gene expression (Zhao et al., 2007). In this way, Jangale et al

(2013) demonstrated that flaxseed oil ingestion (rich in ALA) down-regulated the

expression of hepatic inflammatory genes in diabetic rats including transcription

factors such as NF-kB. However, inflammatory markers modulation in adipose and

hepatic tissues by chia ingestion has not yet been studied.

In the present research, chia seed and chia oil intake increased plasma n-3

PUFA, ALA, EPA, DPA and DHA concentrations and also markedly reduced n-6/n-3

ratio in animals. Similar results were found in serum when chia seed was added at

16% (Ayerza & Coates 2007) or 36.2% (Chicco et al., 2009) to the diets in healthy

and dyslipemic rats. The same occurred in plasma, liver and adipose tissue of

healthy rats when chia oil was added at 10% to the diets (González-Mañán et al.,

2012). These outcomes indicate that chia seed or oil potential benefit occurred

independently of supplemented chia amount used in previous studies. In this way, it

is important to further assess the minimum amount of chia enough to alter the fatty

acid composition in vivo.

Low n-6/n-3 fatty acid ratio has also been associated with the reduction of

cardiovascular disease risk (Simopoulos, 2004). In addition, a cardioprotective effect

of long-term ALA intake has been suggested by a number of epidemiological studies,

and an additive effect of ALA with n-3 long-chain PUFA from fish and fish oil has

been observed (Vedtofte et al., 2011). EPA and DHA, which are products of

elongation and desaturation of ALA, are also involved in biological mechanisms

related to fatty acids cardioprotective potential. It could also explain the hypolipidemic

effects found in chia groups in the current study. However, chia groups did not

reduce plasma SFA concentration increased by HFF diet, which is in agreement with

previous reports using chia seed (Chicco et al., 2009; Poudyal et al., 2012) and chia

oil (González-Mañán et al., 2012).

A recent study (Valenzuela et al., 2014) demonstrated that dietary ALA intake

from different vegetable oils, including chia oil (10%), caused important modifications

in fatty acid composition extracted from the various tissues of healthy rats. These

authors showed that EPA concentrations were increased in erythrocytes, liver,

kidney, small intestine, heart and quadriceps, but not in the brain. Furthermore, DHA

was increased in the liver, small intestine and brain tissues. These results leading to

154

the suggestion that ALA metabolism and its conversion into n-3 long-chain PUFA is

effective but markedly selective depending on the tissues studied (Valenzuela et al.,

2014). However, in the present study we did not evaluate the hepatic bioconversion

of ALA to EPA and DHA, and their accumulation in tissues.

In this regard, it has been reported that chia ingestion also modifies plasma

fatty acid profile in humans. Vuksan et al (2007) demonstrated that a long-term

supplementation with chia seed (37 g/day) increased plasma ALA and EPA

concentrations in people with well-controlled type 2 diabetes. Jin et al (2012) also

show that an ingestion of 25 g/day milled chia seed by postmenopausal women for

seven weeks increased plasma ALA and EPA concentrations, but not DPA or DHA.

Moreover, it should be highlighted that the conversion rate of ALA to EPA, especially

to DHA, in humans is generally low and it is modulated by several processes

including physiological status, diet, gender and age (Ganesan et al., 2014). In this

way, caution is warranted before extrapolating our results to humans.

In the current research, we observed the same effects and metabolic

improvement after ingestion of both, chia seed and chia oil, as well as in treatment

time which the animals were submitted. The absence of significant differences

between both treatments time could suggest that 6 week of chia intake is enough

time to observe significant changes in biomarkers related to obesity complications.

We previously found the same behavior in antioxidant status improvement and

oxidative stress reversion after chia seed and oil intake in diet-induced obese rats

(Marineli et al., 2015b). The results presented in this study are a good starting point

for further investigations that should conduct further analysis to clarify the bioactivity

and mechanisms of action related to the beneficial effects of chia intake.

5. Conclusion

In summary, the present study shows that a daily consumption of chia seed

and oil did not reduce weight gain or adiposity but was able to normalize

dyslipidemia, inflammation, glucose intolerance and insulin resistance caused by

HFF-fed diet. Chia diets also improved plasma n-3 PUFA levels and lowered the n-

6/n-3 ratio. In addition, similar physiological effects could be observed regardless of

treatment time. Therefore, our results suggest that chia seed and oil could be used

155

as a functional food and may be a dietary strategy to prevent or control obesity

related diseases. Moreover, the present findings warrant further research on the use

of chia seed and oil as a complimentary therapy for treating some signs of metabolic

syndrome in humans.

Acknowledgments

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP, 2012/23813-4) and Conselho Nacional de Desenvolvimento


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160

DISCUSSÃO GERAL

Levando em consideração os resultados obtidos a partir da caracterização

química e nutricional das sementes e óleo de chia podemos destacar que as

amostras apresentaram um conteúdo significativo de proteína, óleo, fibra dietética

(principalmente fibra insolúvel) e compostos bioativos, assim como reportado em

estudos anteriores (AYERZA; COATES, 2004; REYES-CAUDILLO et al., 2008).

Deve-se destacar o teor de ácido graxo α-linolênico (ALA, C18:3 n-3) presente no

óleo de chia, seguido por ordem decrescente, os ácidos graxos linoleico, oleico,

palmítico e esteárico. O óleo da semente de chia tem sido amplamente estudado por

apresentar a maior concentração de ALA dentre as fontes botânicas estudadas

(AYERZA, 1995). Além disso, a razão de ácidos graxos n-6/n-3 do óleo de chia é

expressivamente menor em relação a outros óleos vegetais (TUBEROSO et al.,

2007), uma importante característica do alimento, já que a baixa razão de ácidos

graxos n-6/n-3 está relacionada à redução do risco de desenvolvimento de doenças

cardiovasculares (SIMOPOULOS, 2004).

A dieta da maior parte da população, nos países industrializados, apresenta

baixo teor de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) ômega-3, principalmente devido

ao baixo consumo de pescados e alimentos vegetais fontes de ALA e ao uso

excessivo de óleo vegetal rico em ácido graxo linoleico (LA) (SIMOPOULOS, 2004;

GANESAN et al., 2014). A Sociedade Brasileira de Cardiologia estimula o consumo

de ácidos graxos ômega-3 de origem vegetal, como parte de uma dieta saudável,

sendo recomendado para reduzir o risco cardiovascular (SANTOS et al., 2013).

Dessa forma, a semente de chia pode ser considerada um alimento com uma

proporção interessante de ácidos graxos conforme recomendado pela referida

Sociedade para pacientes que apresentam síndrome metabólica, já que o óleo de

chia possui baixa concentração de ácidos graxos saturados e monoinsaturados, e

alta concentração de ácidos graxos poli-insaturados, sendo principalmente da família

n-3 (ALA) e pouco atribuído à família n-6 (LA) (SBC, 2005; SANTOS et al., 2013).

Estudos têm relatado a vantagem nutricional da utilização da semente de

chia ou de seus derivados, na alimentação animal, em relação às outras fontes de

PUFA (COATES; AYERZA, 2009; AYERZA; COATES, 2002, 2006; AYERZA et al.,

161

2002). Além do potencial como fonte de nutrientes viável para alimentação animal,

as sementes de chia e seus derivados têm crescente interesse para indústrias

alimentícias devido a sua importante composição nutricional e potencial funcional.

As amostras de semente e óleo de chia também apresentaram alta atividade

antioxidante dentre os métodos in vitro avaliados, o que pode ser devido

principalmente à presença de compostos fenólicos como, mericetina, quercitina,

kaempferol e ácido clorogênico nas amostras estudadas. Vale ressaltar que seria

importante, também, a quantificação destes compostos na semente e óleo de chia,

uma vez que, no presente trabalho, os compostos fenólicos foram somente

identificados nas amostras de chia. Estudos anteriores também reportaram a alta

capacidade antioxidante da chia (REYES-CAUDILLO et al., 2008; IXTAINA, et al.,

2011; CAPITANI et al., 2012) e justificam esta propriedade não somente aos

compostos fenólicos, mas também a presença de compostos lipofílicos, como,

tocoferóis, carotenoides e fosfolipídeos encontrados no óleo de chia. A presença

desses compostos contribuem para a estabilidade oxidativa do óleo, apesar do alto

conteúdo de PUFA deste alimento, já que o valor de peróxido do óleo de chia (2.56

mEq/kg) foi considerado significativamente baixo quando comparado com outros

óleos vegetais (KHATTAB; ZEITOUN, 2013) e também com o recomendado pela

resolução n. 270 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para óleos

brutos extraídos a frio, em que o máximo é de 15 mEq/kg (BRASIL, 2005). Além

disso, é importante ressaltar que os compostos fenólicos encontrados no óleo de

chia não estão presentes em outros óleos de sementes (TUBEROSO et al., 2007).

Dessa forma, a semente de chia pode ter os mesmos efeitos benéficos à

saúde atribuídos a outros grãos e vegetais, já que o teor de fibra dietética, e sua

atividade antioxidante são muitas vezes maior ou semelhante a outros grãos e

farinhas (RAGAEE et al., 2006). A importante composição nutricional e propriedades

funcionais da semente de chia, assim como de sua fração lipídica, motivam o uso

destes como uma importante fonte de alimento, considerando a atual tendência para

um aumento do consumo de alimentos funcionais e seu alto potencial nutricional e

tecnológico, já que também podem ser utilizados para produção de ingredientes

funcionais com aplicações comerciais em alimentos (REYES-CAUDILLO et al., 2008;

ÁLVAREZ-CHÁVEZ et al., 2008; SEGURA-CAMPOS et al., 2013).

162

A partir disso, avaliamos a ingestão da semente e óleo de chia na prevenção

e no tratamento da obesidade e comorbidades induzida por dieta em modelo animal.

Em relação aos resultados do ensaio in vivo podemos destacar que a ingestão da

dieta HFF (hiperlipídica e adicionada de frutose) induziu a obesidade e promoveu

diversas alterações metabólicas relacionadas a esta, como resistência à insulina,

intolerância à glicose, dislipidemia, inflamação, acúmulo de lipídeo hepático,

estresse oxidativo e peroxidação lipídica nos animais.

O excessivo consumo energético, principalmente a partir de carboidratos

simples e ácidos graxos saturados leva ao aumento do armazenamento de energia

na forma de gordura, acompanhado por desordens metabólicas que contribuem para

o desenvolvimento da síndrome metabólica associada à obesidade (FERNÁNDEZ-

SÁNCHEZ et al., 2011). Tem sido relatado que o consumo de dietas ricas em

gorduras e açúcares está relacionado com o aumento da obesidade, intolerância à

glicose, resistência à insulina, inflamação, estresse oxidativo e esteatose hepática

em modelos animais (FEILLET-COUDRAY et al., 2009; LAISSOUF et al., 2013;

POUDYAL et al., 2012; SHAPIRO et al., 2011). Devido às suas propriedades

lipogênicas, o excesso de frutose na dieta pode causar má absorção de glicose,

maiores elevações de triglicerídeos, colesterol e ácidos graxos livres em

comparação a outros carboidratos. Estes distúrbios metabólicos estão relacionados

à indução da resistência à insulina e leptina geralmente observada a partir da

ingestão de alta concentração de frutose em seres humanos e modelos animais

(JOHNSON et al., 2007; SAMUEL, 2011). O estado de resistência à insulina induzida

pela frutose é normalmente caracterizado por uma dislipidemia metabólica profunda,

que parece resultar da superprodução hepática e intestinal de partículas de

lipoproteínas aterogênicas responsáveis pelo desenvolvimento da doença hepática

gordurosa não alcoólica (esteatose hepática) (BASCIANO et al., 2005).

Em contrapartida, nossos resultados demonstraram que a adição da semente

e do óleo de chia, como substituição do óleo de soja nas dietas experimentais, não

reverteu a obesidade, mas foi capaz de promover a normalização de quase todas as

alterações metabólicas ocasionadas pela ingestão da dieta HFF.

Em relação ao perfil oxidativo, a ingestão da semente e óleo de chia

melhorou o sistema de defesa antioxidante no plasma e no fígado, reduziu a

163

peroxidação lipídica plasmática, promovendo, dessa forma, um efeito protetor contra

o estresse oxidativo advindo da obesidade. Desse modo, a redução da peroxidação

lipídica plasmática pode estar envolvida com o efeito hipolipidêmico observado após

a ingestão da semente e óleo de chia, que está associada à redução da

suscetibilidade do LDL-colesterol a oxidação, aparentemente devido à redução

plasmática desta lipoproteína. Além disso, a melhora do status antioxidante

encontrada nos grupos que receberam chia podem explicar estudos anteriores que

demonstraram efeito hepato e cardioprotetor em ratos obesos alimentados com

semente de chia durante 8 semanas (POUDYAL et al., 2012).

Dados da literatura indicam que diferentes tipos de ácidos graxos têm efeitos

variáveis na produção de radicais livres podendo agir diretamente na remoção das

espécies reativas de oxigênio e indiretamente na indução de enzimas antioxidantes

(BULLO et al., 2011). Conforme demonstrado, a semente de chia é rica em ALA, e

estudos anteriores que utilizaram o mesmo ácido graxo de outras fontes vegetais

(PAL; GHOSH, 2012a, 2012b) corroboram com nossos resultados sobre a melhora

do status antioxidante in vivo. É possível que, em condições in vivo, o ALA pode

reduzir a formação de hidroperóxidos pela eliminação de radicais livres e redução da

peroxidação de PUFA.

Tendo em vista que o sistema antioxidante endógeno é suplementado por

nutrientes exógenos, por exemplo, vitaminas, minerais, polifenóis, dentre outros, o

efeito protetor da chia contra o estresse oxidativo pode ser devido não somente a

ação do ALA, mas também aos antioxidantes naturais presentes na semente e óleo

de chia, conforme demonstrado pelos resultados da capacidade antioxidante in vitro

do presente estudo e por outros estudos que também reportaram o importante

conteúdo de compostos bioativos e potencial antioxidante da semente e óleo de chia

(REYES-CAUDILLO et al, 2008; IXTAINA et al, 2011; MARTÍNEZ-CRUZ;

PAREDES-LÓPEZ, 2014). No entanto, é necessário avaliar o potencial antioxidante

da semente e óleo de chia contra o estresse oxidativo incluindo mecanismos de

absorção de compostos fenólicos e bioatividade em ensaios in vitro e in vivo, já que

antioxidantes dietéticos, principalmente os polifenóis, são expostos a um intenso

metabolismo in vivo que afeta a sua estrutura química, biodisponibilidade e

bioatividade (LANDETE, 2012).

164

Nossos resultados também demonstraram que a ingestão da semente e óleo

de chia foi capaz de normalizar a dislipidemia, bem como aumentar a excreção de

lipídios fecais nos animais. A este respeito, alguns estudos em animais têm

mostrado a redução sérica ou plasmática de colesterol total, triacilgliceróis e

aumento nos níveis de HDL-colesterol quando a chia foi utilizada como fonte

dietética de gordura em ratos saudáveis ou dislipidêmicos (AYERZA; COATES

2007; CHICCO et al., 2009), o que corrobora com nossos achados. Além disso,

Sierra e colaboradores (2015) demonstraram que o óleo de chia pode melhorar a

função vascular em condições hipercolesterolêmicas em coelhos.

O alto teor de fibra alimentar das sementes de chia pode desempenhar um

papel na redução dos níveis de lipídios circulantes, já que o efeito

hipocolesterolêmico da fibra dietética é amplamente relatado (WILLEM VAN DER

KAMP et al., 2010). Além disso, o ALA, principal ácido graxo presente na chia, é

convertido principalmente em eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenoico (DHA)

no fígado (GONZÁLEZ-MAÑÁN et al., 2012). A eficácia dessa bioconversão pode

determinar o seu efeito sobre os lipídios plasmáticos. Desta forma, a chia, como um

precursor de EPA e DHA, pode modificar o metabolismo dos ácidos graxos no

fígado através da ativação do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma

alpha (PPARα) e da baixa regulação da proteína de ligação ao elemento de

resposta a esterol (SREBP-1c), levando a uma diminuição da circulação de lipídios

(ROSSI et al., 2013). Resultados semelhantes foram encontrados por González-

Mañán e colaboradores (2012), em relação à oxidação de ácidos graxos e

expressão de biomarcadores envolvidos na lipogênese após a ingestão de óleo de

chia em ratos saudáveis.

No presente estudo, os animais que receberam semente ou óleo de chia

também apresentaram melhora da tolerância à glicose e à insulina, segundo os

testes de GTT e ITT, além da redução da secreção de insulina pelas ilhotas

pancreáticas. Porém, a concentração de insulina plasmática não foi afetada.

Resultados semelhantes foram relatados por Chicco e colaboradores (2009) quando

ratos dislipidêmicos receberam semente de chia nos últimos 2 meses do

experimento. Eles encontraram uma melhora na resistência à insulina e homeostase

da glicose, sem alterações na insulinemia. Além disso, a ingestão da semente de

chia normalizou a diminuição da capacidade de fosforilação e oxidação da glicose,

165

bem como melhorou a insensibilidade à insulina periférica em ratos alimentados

com dieta rica em sacarose (OLIVA et al., 2013). A este respeito, estudos têm

demonstrado que ácidos graxos poli-insaturados da família ômega-3 podem prevenir

ou normalizar a resistência à insulina periférica em animais alimentados com dieta

rica em gordura ou carboidratos (LOMBARDO; CHICCO, 2009). Também tem sido

relatado que a ingestão de ALA ou de alimentos ricos neste ácido graxo melhora a

sensibilidade à insulina e respostas glicêmicas em modelos animais e humanos (WU

et al., 2012). No entanto, é importante destacar a necessidade de estudos que

avaliem a ação da chia ou de seus compostos nos receptores de insulina, assim

como na via de sinalização da insulina, para elucidar os mecanismos relacionados à

melhora da resistência à insulina.

Os resultados do presente estudo também demonstraram que a ingestão da

semente ou óleo de chia foi capaz de normalizar a inflamação sérica causada pela

dieta HFF, uma vez que a chia promoveu a redução de marcadores pró-

inflamatórios, como TNF-α, MCP-1 e proteína C-reativa, além do aumento nos níveis

de adiponectina, um marcador anti-inflamatório. A adiponectina desempenha um

papel protetor contra a resistência à insulina através da regulação do metabolismo

da glicose e lipídeos, apresentando propriedades angiogênicas, antiaterogênicas e

anti-inflamatórias (GALIC et al., 2010). No entanto, existem poucos estudos sobre os

efeitos da chia em hormônios e marcadores inflamatórios relacionados à obesidade.

A proteína C-reativa está associada à fatores de risco cardiovascular,

incluindo resistência à insulina, diabetes, síndrome metabólica, hipertensão e

dislipidemia (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011). A suplementação com a

semente de chia (37 g/dia) em indivíduos diabéticos tipo 2 reduziu os níveis de

proteína C-reativa, enquanto manteve um bom controle glicêmico e lipídico

(VUKSAN et al., 2007). Poudyal e colaboradores (2012) também encontraram uma

redução nos níveis de proteína C-reativa no plasma de ratos obesos alimentados

com sementes de chia, o que corrobora com nossos achados.

Segundo estudos experimentais realizados em animais, ácidos graxos poli-

insaturados da família ômega-3 podem melhorar diversas anormalidades

metabólicas e esses efeitos incluem a melhora da sensibilidade à insulina através do

aumento da produção e secreção de adipocitocinas e potencial prevenção da

166

resistência à insulina através dos efeitos anti-inflamatórios (WU et al., 2012).

Baranowski e colaboradores (2012) demonstraram que intervenções dietéticas com

óleo de linhaça (rico em ALA) promoveram uma redução em diversos marcadores

inflamatórios no tecido adiposo de ratos obesos. Além disso, os efeitos

cardioprotetores do ALA são mediados, em parte, por uma redução na produção de

citocinas inflamatórias (ZHAO et al., 2007). Têm sido relatado que os ácidos graxos

podem alterar as respostas inflamatórias através da inibição da atividade do fator

nuclear kappa B (NF-kB), o qual regula a indução da expressão de citocinas (ZHAO

et al., 2007). Desta forma, Jangale e colaboradores (2013) demonstraram que a

ingestão do óleo de linhaça regulou a expressão de genes inflamatórios hepáticos

em ratos diabéticos, incluindo o NF-kB. No entanto, a modulação de marcadores

inflamatórios no tecido adiposo e hepático após a ingestão de chia ainda não foi

estudada. Dessa forma, mais estudos que avaliem a ingestão da semente de chia

precisam ser realizados com o objetivo de elucidar os mecanismos de ação pelos

quais a chia exerce tal efeito.

Levando em consideração que grande parte das alterações metabólicas e

efeitos benéficos observados a partir da ingestão da semente e óleo de chia podem

ser explicados pela presença do ALA ou da sua conversão em outros ácidos graxos

da família ômega-3, é importante ressaltar que a ingestão da semente e do óleo de

chia aumentou as concentrações plasmáticas dos ácidos graxos ALA, EPA e DHA

nos animais, além de reduzir a razão n-6/n-3. Resultados semelhantes foram

encontrados quando a semente de chia foi adicionada a 16% (AYERZA; COATES

2007) ou 36,2% (CHICCO et al., 2009) nas dietas de ratos saudáveis e

dislipidêmicos. O mesmo ocorreu em diversos tecidos de ratos saudáveis quando o

óleo de chia foi adicionado a 10% nas dietas experimentais (GONZÁLEZ-MAÑÁN et

al., 2012; VALENZUELA et al., 2014). Estes resultados indicam que a semente ou

óleo de chia podem alterar a composição de ácidos graxos independentemente da

quantidade ingerida. Deste modo, é importante avaliar a quantidade mínima de chia

suficiente para alterar o perfil de ácidos graxos in vivo.

Além disso, deve-se destacar que em humanos a taxa de conversão de ALA

em EPA, e especialmente em DHA, é geralmente baixa e pode ser modulada pelo

estado fisiológico, dieta, sexo e idade (GANESAN et al., 2014). Jin e colaboradores

(2012) demonstraram que a ingestão de chia (25 g/dia) durante 7 semanas

167

aumentou as concentrações plasmáticas de ALA e EPA, mas não de DHA em

mulheres na pós menopausa. Dessa forma, é preciso cuidado antes de extrapolar os

resultados para humanos.

No presente estudo, foi possível observar efeitos benéficos similares a partir

da ingestão tanto do óleo quanto da semente de chia, bem como do tempo de

tratamento em que os animais foram submetidos. A ausência de diferença

significativa entre o tempo de tratamento (6 ou 12 semanas) sugere que 6 semanas

de ingestão de chia é tempo suficiente para observar mudanças significativas nos

biomarcadores relacionados às complicações da obesidade. Além disso, uma

possível explicação para os efeitos similares do óleo e da semente de chia pode ser

devido as concentrações similares de ALA que estes forneceram às dietas, ou

também pode estar relacionada às diferentes matrizes alimentares (semente x óleo),

uma vez que a interação de nutrientes entre os compostos presentes na semente

chia e a complexidade do sinergismo da matriz alimentar deve ser considerada. A

liberação de nutrientes a partir da matriz alimentar, as interações com outros

componentes alimentares, assim como a presença de cofatores, podem influenciar a

biodisponibilidade de nutrientes (PARADA; AGUILERA, 2007). Portanto, o estado da

matriz alimentar pode favorecer ou dificultar a sua resposta in vivo, uma vez que o

modo de ação pode ser mais relevante do que a quantidade total presente no

alimento. O que também pode explicar o fato da semente de chia não ter

apresentado melhores resultados em relação ao óleo de chia.

Os resultados apresentados nessa pesquisa são um bom ponto de partida

para investigações futuras que devem realizar uma análise mais aprofundada para

esclarecer os mecanismos de ação relacionados aos efeitos benéficos da ingestão

de chia. É necessária precaução antes de extrapolar estes resultados para

humanos, uma vez que a quantidade de chia testada no presente estudo deve ser

avaliada em estudos clínicos como substituição do óleo ou introdução da semente

como alimento funcional na dieta da população.

168

CONCLUSÃO GERAL

Como conclusão geral do trabalho, podemos destacar que a ingestão da dieta

obesogênica (HFF) induziu a obesidade, resistência à insulina, intolerância à glicose,

dislipidemia, inflamação, estresse oxidativo e peroxidação lipídica nos animais,

sendo que tais alterações podem indicar a influência da frutose e do alto teor de

gordura sobre o estado metabólico destes animais. A adição da semente e do óleo

de chia, como substituição do óleo de soja nas dietas experimentais, não reverteu a

obesidade, mas normalizou o estado inflamatório sérico, a dislipidemia, a

intolerância à glicose e a resistência à insulina, aumentou a concentração plasmática

de ácidos graxos da família ômega-3, reduzindo, dessa forma, a razão dos ácidos

graxos n-6/n-3, também reduziu a peroxidação lipídica e o estresse oxidativo, e

aumentou a capacidade antioxidante no plasma e no fígado de animais obesos

induzidos por dieta. Os efeitos benéficos foram encontrados tanto no período de

prevenção (12 semanas) quanto no de tratamento (6 semanas). Tais efeitos podem

ser explicados pelos compostos bioativos e ácido graxo ômega-3 presentes na

semente e no óleo de chia, assim como pelo potencial antioxidante in vitro

encontrado nesses alimentos.

Visto que os produtos estudados tem comprovado efeito biológico e potencial

funcional e por isso podem beneficiar o estado de saúde da população, seja via

suplementação ou por enriquecimento de alimentos, o trabalho de pesquisa em

questão forneceu subsídios à introdução destes compostos na dieta habitual da

população, como coadjuvante na prevenção e no controle de desordens metabólicas

crônicas. Porém, é preciso precaução antes de extrapolar os resultados para

humanos ou estipular quantidades de recomendação de ingestão. Dessa forma,

estimula-se a realização de estudos em humanos baseados em diferentes ensaios

clínicos para confirmação dos resultados.

Após a experiência adquirida com a elaboração deste trabalho, é possível

destacar algumas ideias ou sugestões a serem observados em futuras pesquisas:

- Avaliar os efeitos da semente e do óleo de chia em estudos clínicos como

substituição do óleo da dieta ou introdução da semente como alimento funcional.

169

- Avaliar, com base em estudos clínicos, a quantidade mínima de óleo e/ou

semente de chia consumida que seja necessária para promover efeitos benéficos.

- Avaliar o potencial antioxidante da semente e do óleo de chia contra o

estresse oxidativo incluindo mecanismos de absorção de compostos fenólicos e

bioatividade em ensaios in vitro e in vivo.

- Avaliar a ação da chia ou de seus compostos nos receptores de insulina,

assim como na via de sinalização da insulina, para elucidar os mecanismos

relacionados à melhora da resistência à insulina.

- Avaliar os efeitos da chia e seus compostos em hormônios e marcadores

inflamatórios relacionados à obesidade e seu mecanismo de ação.

- Estudar a viabilidade tecnológica e elaboração de produtos adicionados com

o óleo ou a semente de chia, como iogurtes, sucos, pães, bolos, barras de cerais,

biscoitos, cereais em geral, sobremesas, entre outros.

170

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176

ANEXOS

ANEXO A: ESQUEMA DO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL DO ENSAIO

BIOLÓGICO

177

ANEXO B: PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NA EXPERIMENTAÇÃO

ANIMAL

178

ANEXO C: AUTORIZAÇÃO DA EDITORA PARA INCLUSÃO DOS ARTIGOS

PUBLICADOS

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