UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

Gustavo Pagotto Borin

ANÁLISE DA CO-REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL E IDENTIFICAÇÃO DE GENES

DE INTERESSE BIOTECNOLÓGICO EM Trichoderma reesei

TRANSCRIPTIONAL CO-REGULATION ANALYSIS AND IDENTIFICATION OF

GENES OF BIOTECHNOLOGICAL INTEREST IN Trichoderma reesei

CAMPINAS/SP 2019

Gustavo Pagotto Borin

ANÁLISE DA CO-REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL E IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE INTERESSE

BIOTECNOLÓGICO EM Trichoderma reesei

TRANSCRIPTIONAL CO-REGULATION ANALYSIS AND IDENTIFICATION OF GENES OF

BIOTECHNOLOGICAL INTEREST IN Trichoderma reesei

TESE apresentada ao Instituto de Biologia da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor

em Genética e Biologia Molecular, na área de

Microbiologia.

THESIS presented to the Biology Institute of the

University of Campinas in partial fulfillment of the

requirements for the degree of Doctor in Genetics and

Molecular Biology, in the area of Microbiology.

Orientador: Profª. Drª. Juliana Velasco de Castro Oliveira

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA

DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GUSTAVO

PAGOTTO BORIN, E ORIENTADO PELA PROFª. DRª.

JULIANA VELASCO DE CASTRO OLIVEIRA.

CAMPINAS/SP 2019

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de BiologiaMara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Borin, Gustavo Pagotto, 1991- B644a BorAnálise da co-regulação transcricional e identificação de genes de interesse

biotecnológico em Trichoderma reesei / Gustavo Pagotto Borin. – Campinas,SP : [s.n.], 2019.

BorOrientador: Juliana Velasco de Castro Oliveira. BorTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Biologia.

Bor1. Trichoderma reesei. 2. Bagaço de cana. 3. Etanol. 4. Redes reguladoras

de genes. 5. Hidrólise enzimática. 6. Metabolômica. I. Oliveira, Juliana Velascode Castro. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III.Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Transcriptional co-regulation analysis and identification of genes ofbiotechnological interest in Trichoderma reeseiPalavras-chave em inglês:Trichoderma reeseiBagasseEthanolGene regulatory networksEnzymatic hydrolysisMetabolomicsÁrea de concentração: MicrobiologiaTitulação: Doutor em Genética e Biologia MolecularBanca examinadora:Juliana Velasco de Castro Oliveira [Orientador]Anete Pereira de SouzaRafael Silva RochaRichard John WardMarcelo Mendes BrandãoData de defesa: 27-08-2019Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7087-4780- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/8099480322803211

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

COMISSÃO EXAMINADORA

Profª. Drª. Juliana Velasco de Castro Oliveira

Presidente

Profª. Drª. Anete Pereira de Souza

Profº. Drº. Marcelo Mendes Brandão

Profº. Drº. Rafael Silva Rocha

Profº. Drº. Richard John Ward

A Ata da Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema

de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

Gostaria de dedicar este trabalho a todos aqueles que me ajudaram a

conquistar mais esta grande conquista em minha vida!

A todos vocês, meu muito obrigado!

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente à pesquisadora Drª. Juliana Velasco de

Castro Oliveira, por esses sete anos e meio de orientação. Obrigado pela sua paciência,

dedicação, confiança depositada em mim e contribuição teórico-científica para minha

formação profissional. Agradeço por tantas vezes em que desceu de sua sala para o

laboratório, para me ensinar um protocolo ou me ajudar a realizar algum experimento

grande. Agradeço pelos “toques” construtivos para eu melhorar e ser cada vez mais um

pesquisador responsável, comprometido com minhas responsabilidades e de pensamento

crítico. Obrigado por me ajudar a planejar os experimentos, pelas inúmeras correções de

relatórios e qualificações, e por facilitar a nossa vida de bolsista resolvendo as questões

burocráticas, que muitas vezes não temos nem ideia. Também gostaria de pedir desculpas

por algum desentendimento ou discussão desnecessária da minha parte. À minha

orientadora, meu profundo agradecimento.

Meus agradecimentos aos bioinformatas Drº. Diego Mauricio Riaño-Pachón e

Drº. Marcelo Falsarella Carazzolle. Ao Drº. Riaño-Pachón pela orientação de parte do meu

trabalho, que me permitiu alcançar um dos objetivos da tese. Agradeço pelos ensinamentos

de bioinformática e toda atenção dedicada a me ajudar. Ao Drº. Carazzolle também, meu

muito obrigado. Agradeço por ter sido membro da minha banca de qualificação, por todas as

correções, direcionamento e sugestões feitas para que nosso trabalho pudesse ser

melhorado.

De modo especial, gostaria de agradecer também a meus pais, Eduardo e Ângela,

meus irmãos, Tais e Felipe, e ao meu cunhado Thiago. Obrigado por terem me dado força, se

interessarem pelo que eu faço e serem meu porto seguro. Obrigado pelo apoio emocional e

financeiro, que me permitiram seguir em frente mesmo nos momentos mais difíceis. Pais,

muito obrigado por me apoiarem. Vocês servem de exemplo para mim.

Agradeço à minha linda namorada Ludmilla, que me aguenta e me ajuda a ser

uma pessoa melhor. Obrigado pelas inúmeras discussões sobre ciência e a vida. Você é uma

pessoa inspiradora e uma grande mulher.

Agradeço aos professores Drª. Priscila da Silva Delabona e Drº. Renato Vicentini

dos Santos, por terem aceitado fazerem parte da minha banca de qualificação, por todas as

correções e discussão do meu projeto.

Ao Profº. Drº. André Damásio e Profº. Drº. Roberto Do Nascimento Silva, por

serem solícitos e permitirem que eu realizasse alguns experimentos em seus laboratórios. À

Drª. Mari Zubieta, à Msc. Jaque Gerhardt e ao Drº. Renato Graciano por toda ajuda,

discussões produtivas, paciência e gentileza.

À Profº. Drª. Astrid Mach-Aigner e Drº. Robert Mach-Aigner, por abrirem as

portas do seu laboratório para que eu pudesse realizar parte de meu doutorado no exterior.

Agradeço também aos pesquisadores do seu grupo Drº. Christian Derntl e Thiago Mello-de-

Sousa, por todo suporte e orientação na realização dos experimentos.

Aos pesquisadores Drº. Maurício Luís Sforça e Drª. Silvana Aparecida Rocco, pelo

suporte técnico do experimento de espectrometria por RMN e ajuda na análise dos dados.

À MSc. Juliana Aparecida Aricetti, por todo suporte na preparação,

processamento e análise das amostras de metabolômica.

À pesquisadora Drª. Camila Caldana, por ter se disponibilizado a me ajudar no

delineamento de um dos experimentos teste de metabolômica. Ao Profº. Drº. Gustavo

Goldman, pelo envio de cepas, protocolos e por toda ajuda oferecida. À pesquisadora Drª.

Carla Pólo, pela troca de conhecimento e dicas de protocolo. Ao Msc. Lucas Salera Parreiras,

por ter se disponibilizado a me ajudar nas transformações de T. reesei.

Aos meus amigos do LNBR (antigo CTBE), Aline, Amanda, Bruno, Carlinha,

Sabrina e Josi, por toda ajuda, companheirismo, incentivo e momentos bons compartilhados

ao longo de todo esse tempo. Vocês me deram motivação e foram os responsáveis por

tornarem o dia a dia mais leve e alegre. Um agradecimento especial também à Rebeca, pela

amizade, ajuda nos experimentos e por tornar o ambiente de trabalho mais agradável.

Agradeço ainda a todos os outros amigos do LNBR e “ex-LNBR”, Ana Maria, Atilio, Camys,

Carol Montebelo, Claudinha, Djalma, Douglas, Eduardo, Emerson, Eli, Evandro, Felipe Pará,

Fer Mandeli, Gabi Persinoti, Gisele, Gui Furlan, Guilherme Masiero, Ju Aricetti, Laerte, Lari,

Liliane, Lívia, Lucélia, Lúcia, Luciane, Naty Coutoné, Naty Araújo, Octávio, Renan, Robertinha,

Thamy, por toda ajuda e momentos bons vividos juntos.

Aos amigos da UNICAMP, Agnes, Carol, Casseta, Ferzinha, João Johnny, Marcelo

Zig, Naty, Robson, Thiaguinho, por toda ajuda na realização dos experimentos, amizade e

incentivo.

Aos meus amigos Denola, Faber, Luli, Neto, Rafa, Rica e Zana, pela amizade de

sempre, barzinhos e churrascos, pela ajuda nos momentos difíceis, conversas aleatórias e

pela troca de conhecimento. Vocês são grandes amigos.

Aos meus amigos de Porto Feliz, que mesmo após vários anos desde que nos

formamos, continuam sendo os mesmos amigos de sempre, em quem posso confiar, me

apoiar e pedir ajuda.

À UNICAMP e ao LNBR pela minha formação acadêmica e por terem me

proporcionado todo conhecimento científico que tenho hoje. À FAPESP (Processos nº

2015/08222-8 e 2017/18987-7) e ao CNPq (Processo nº 141574/2015-1), pelo suporte

financeiro indispensável para realização deste trabalho.

Agradeço ainda a todas as outras pessoas que tornaram possível a realização do

meu projeto de doutorado. Sou muito grato a todos vocês.

Por fim, mas não menos importante, agradeço a Deus por ter alcançado mais

esta conquista, por não me desamparar e sempre me surpreender!

Qual é a tarefa mais difícil do mundo? Pensar.

Ralph Waldo Emerson

RESUMO

Os biocombustíveis, em particular o etanol de segunda geração (2G), são hoje uma das principais alternativas sustentáveis à substituição dos combustíveis fósseis em direção à consolidação de uma bioeconomia circular. No Brasil, o etanol 2G é produzido a partir do bagaço e palha da cana-de-açúcar, que são resíduos lignocelulósicos gerados em abundância na cadeia produtiva do setor sucroenergético. Esta tecnologia, entretanto, apresenta ainda algumas limitações econômicas, como o custo elevado dos coquetéis enzimáticos necessários à hidrólise da biomassa lignocelulósica. O fungo filamentoso Trichoderma reesei é considerado a principal plataforma biológica da produção e secreção de celulases e hemicelulases que compõem os coquetéis enzimáticos. Embora o sistema celulolítico e regulação transcricional de T. reesei sejam muito estudados, ainda é necessário investigar o conjunto total de genes relacionados com a degradação de biomassa lignocelulósica por este fungo. Assim, os objetivos principais deste estudo foram a inferência de uma rede de co-expressão gênica baseada no transcriptoma de T. reesei RUT-C30 e a caracterização de alguns genes identificados com potencial biotecnológico em cepas mutantes knockout. A inferência da rede separou os genes hiper-expressos em bagaço (BEX) em diversos módulos, de acordo com o perfil de expressão gênica. Vários genes de (hemi)celulases, transportadores de açúcar, fatores de transcrição e proteínas hipotéticas foram co-expressos nos mesmos módulos. Genes centrais destes módulos (hubs) foram identificados, e incluíram fatores de transcrição e proteínas hipotéticas ainda não caracterizados. A predição in silico de sítios de ligação ao DNA na região promotora para XYR1, o principal ativador de celulases, revelou ainda genes interessantes que podem ser regulados por este fator de transcrição. A partir da análise de rede, seis genes foram escolhidos para serem deletados e caracterizados em T. reesei. Quatro deles foram deletados com sucesso e um gene codificando para um fator de transcrição hipotético do tipo zinc finger mostrou ter papel positivo sobre a degradação de bagaço, uma vez que sua deleção diminuiu significativamente as atividades de celobiohidrolase (pNPC) e β-glicosidase (pNPG) nesta fonte de carbono. Dados de expressão gênica por qPCR demonstraram também que este gene é alvo da repressão catabólica por carbono mediada pelo regulador CRE1. Adicionalmente, o perfil metabólico de T. reesei e Aspergillus niger crescidos em glicose, celulose solúvel (CMC), lactose e bagaço pré-tratado foi investigado por RMN para avaliar as vias metabólicas utilizadas por estes dois fungos industriais. A fonte de carbono utilizada foi a maior responsável pela variação dos dados, sugerindo que ambos os fungos adotam estratégias semelhantes para crescerem e se adaptarem aos substratos avaliados, mesmo tendo evoluído independemente. Metabólitos de reserva de energia (manitol e trealose), de metabolismo de fosfolipídeos (glicerol-3-fosfocolina) e de aminoácidos (glutamina, alanina e glutamato) foram significativamente mais abundantes em todas as condições amostradas para ambos os fungos. T. reesei assimilou de forma mais eficiente o açúcar lactose, e também parece ativar a via alternativa do TCA (glyoxalate shunt) em CMC como estratégia para produzir energia pela gliconeogênese. A. niger, por outro lado, mostrou níveis mais altos de glicerol e GABA em CMC e lactose. Em BEX, A. niger teve as maiores atividades enzimáticas para celulase e hemicelulase, contribuindo para maior ativação da via glicolítica. Como conclusões deste trabalho, a análise da rede de co-expressão gênica permitiu a identificação de um grande número de genes com potencial biotecnológico na degradação de bagaço de cana. A caracterização dos mutantes knockout levou à descoberta de um suposto ativador transcricional de celulases, mas estudos adicionais devem ser realizados para compreender melhor sua atuação sobre a regulação gênica em T. reesei. O perfil

metabólico de T. reesei e A. niger revelou ainda que ambos os fungos utilizam estratégias parecidas com poucas diferenças na utilização de diferentes fontes de carbono, e contribuiu para a maior compreensão da fisiologia dos fungos em condições que induzem a produção de enzimas hidrolíticas. Por fim, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para o maior entendimento do sistema celulolítico em T. reesei e podem ajudar a reduzir os custos associados ao etanol 2G.

Palavras chave: Trichoderma reesei; bagaço de cana-de-açúcar; lignocelulose; etanol 2G; rede de co-expressão gênica; coquetel enzimático; metabolômica.

ABSTRACT

Biofuels, especially second generation (2G) ethanol, are today one of the main sustainable alternatives to the replacement of fossil fuels towards the consolidation of a circular bioeconomy. In Brazil, 2G ethanol is produced from bagasse and sugarcane straw, which are lignocellulosic residues generated in abundance in the sugar-energy industry. This technology, however, still presents some economic limitations, such as the high cost of the enzymatic cocktails necessary for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. The filamentous fungus Trichoderma reesei is considered the main biological platform of the production and secretion of cellulases and hemicellulases that compose enzymatic cocktails. Although the cellulolytic system and transcriptional regulation of T. reesei are well studied, efforts are still needed to investigate the entire set of genes related to the degradation of lignocellulosic biomass by this fungus. Thus, the main objectives of this study are the inference of a gene co-expression network based on the T. reesei RUT-C30 transcriptome and the characterization of a few genes with biotechnological potential in mutant knockout strains. The co-expression network analysis separated the upregulated genes in bagasse (BEX) into several modules, according to the gene expression profile. Several genes encoding (hemi)cellulases, sugar transporters, transcription factors and hypothetical proteins were coexpressed in the same modules. Central genes from these modules (hubs) were identified, and included transcription factors and hypothetical proteins still not characterized. The in silico prediction of DNA binding sites in the promoter region for XYR1, the major cellulase activator, has also revealed interesting genes that can be regulated by this transcription factor. From the network analysis, six genes were chosen to be deleted and characterized in T. reesei. Four of them were deleted successfully and one gene encoding a hypothetical zinc finger transcription factor was shown to play a positive role in bagasse degradation, since its deletion significantly decreased the activities of cellobiohydrolase (pNPC) and β-glucosidase (pNPG) at this carbon source. Gene expression data by qPCR have also demonstrated that this gene is targeted by the CRE1-mediated catabolite repression. In addition, the metabolic profile of T. reesei and Aspergillus niger grown on glucose, soluble cellulose (CMC), lactose and pretreated bagasse was investigated by NMR to evaluate the metabolic pathways employed by these two industrial fungi. The carbon source used was the major responsible for the data variation, suggesting that both fungi adopt similar strategies to grown and adapt to the substrates evaluated, even they had evolved in an independent way. Metabolites of energy reserves (mannitol and trehalose), phospholipids (glycerol-3-phosphocholine) and amino acid metabolites (glutamine, alanine and glutamate) were significantly more abundant in all conditions for both fungi. T. reesei assimilated lactose more efficiently, and it seems to activate the TCA alternative cycle (glyoxalate shunt) in CMC as strategy to produce energy by gluconeogenese. On the other hand, A. niger showed higher levels of glycerol and GABA in CMC and lactose. In BEX, A. niger had greater cellulase and hemicellulase activity, contributing to the activation of glycolysis. As conclusions of this work, the gene co-expression network analysis allowed the identification of a large number of genes with biotechnological potential in the degradation of sugarcane bagasse. The characterization of the knockout mutants led to the discovery of a putative transcriptional activator of cellulases, but additional studies must be conducted to better understand its role in T. reesei gene regulation. The metabolic profile of T. reesei and A. niger had also revealed that both fungi use similar strategies with a few differences in the assimilation of different carbon sources, and contributed to a better understanding of fungal physiology under conditions that induce the production of hydrolytic enzymes. Finally, the results obtained in this work

contributed to a better understanding of the T. reesei cellulolytic system and may help to reduce the costs associated with 2G ethanol. Key words: Trichoderma reesei; sugarcane bagasse; lignocellulose; 2G ethanol; gene co-expression network; enzymatic cocktail; metabolomics.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Matriz energética brasileira (ano base 2017) e mundial (2016) (EPE, 2019a).................................................................................................................... ...........27 Figura 2. Fluxograma simplificado da cadeia produtiva do etanol 2G da cana....................33 Figura 3. Esquema simplificado dos principais componentes da lignocelulose presente na parede celular vegetal.......................................................................................................36 Figura 4. Micro e macrofibrilas e a arquitetura da unidade básica da parede celular da cana..................................................................................................................................37 Figura 5. Modelo aceito de desconstrução da celulose por celulases (EGL, CBH, BGL), CDH e LPMO................................................................................................................................44 Figura 6. Degradação da celulose e hemicelulose por enzimas classificadas pelo CAZy........................................................................................................................... ......47 Figura 7. Mutagênese e seleção das cepas mutantes de Trichoderma reesei................................................................................................................................52 Figura 8. Esquema simplificado dos componentes da rede regulatória complexa de T. reesei................................................................................................................................61 Figura 9. Construção do cassete de deleção do gene da hidrofobina................................112 Figura 10. Principais passos da clonagem por clivagem e ligação do vetor pJET-pyrG para construção dos cassetes de deleção................................................................................114 Figura 11. Exemplo de recombinação homóloga e deleção gênica...................................116 Figura 12. Confirmação por PCR da construção dos cassetes de deleção..........................122 Figura 13. Seleção dos transformantes de T. reesei..........................................................123 Figura 14. Confirmação das deleções gênicas por PCR, utilizando três combinações de oligos................................................................................................................. .............124 Figura 15. Esquema da integração do cassete de deleção no locus gênico da cepa parental QM6a e membrana revelada do southern blotting..........................................................126 Figura 16. Avaliação de crescimento por massa seca (A) e quantificação de proteína total secretada no meio extracelular (B)..................................................................................128

Figura 17. Atividades de CMCase (A) e xilanase (B) normalizadas por proteína total das cepas controle e mutantes de T. reesei, crescidas em diferentes fontes de carbono...........................................................................................................................129 Figura 18. Atividades enzimáticas de pNPCase (B) e pNPGase (B) quantificadas para as cepas QM6a e mutantes de T. reesei crescidos em BEX após 192 h..................................130 Figura 19. Expressão normalizada dos genes alvos de deleção em diferentes cepas de T. reesei crescidas em glicose e soforose.............................................................................131 Figura 20. Análise comparativa do perfil metabólico encontrado nas amostras de T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc, G), CMC e lactose (Lac, L).........................142 Figura 21. Distribuição dos scores dos principais metabólitos responsáveis pelas diferenças encontradas entre T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac).............................................................................................................................. ..144 Figura 22. Heatmap dos metabólitos identificados em T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac)..............................................................146 Figura 23. Heatmap dos 40 metabólitos com maior diferença significativa somente entre as amostras de T. reesei (Tr) (A) ou A. niger (An) (B) crescidos em glicose (Gluc, G), CMC e lactose (Lac, L).................................................................................................................149 Figura 24. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em glicose por 48 h................................................................................................................................. ....152 Figura 25. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em CMC por 48 h.....................................................................................................................................155 Figura 26. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em lactose por 48 h.....................................................................................................................................160 Figura 27. Esquema simplificado das principais vias metabólicas utilizadas por T. reesei e A. niger quando crescidos em glicose, CMC e lactose...........................................................162 Figura 28. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em BEX por 48 h.....................................................................................................................................163 Figura 29. Atividades enzimáticas aferidas para os sobrenadantes de T. reesei e A. niger crescidos em glicose, CMC, lactose e BEX........................................................................165

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Principais biorefinarias de etanol 2G, capacidade de produção e custo de instalação……………............................................................................................................34 Tabela 2. Principais tópicos investigados e estudos recentes com T. reesei........................53 Tabela 3. Genes alvos escolhidos para construção dos mutantes de T. reesei..................105 Tabela 4. Relação dos microrganismos e plasmídeos utilizados neste capítulo................108 Tabela 5. Oligos utilizados para clonagem e caracterização genômica dos mutantes de T. reesei..............................................................................................................................110 Tabela 6. Combinações de oligos utilizados nas reações de PCR para confirmar as deleções gênicas em T. reesei........................................................................................................117 Tabela 7. Relação dos oligonucleotídeos utilizados nas análises de PCR..........................122

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1G, 2G Primeira, segunda geração AA Atividade auxiliar ABF Arabinofuranosidase AES Acetil esterase AFEX Ammonia fiber expansion AGL α-galactosidase AmpR Gene de resistência a ampicilina AXE Acetilxilano esterase BEX Bagaço explodido de cana-de-

açúcar BGL β-glicosidase

BXL β-xilosidase cAMP Adenosina 3',5'-

monofosfato cíclico CAZy Carbohydrate-active enzymes

database CBH Celobiohidrolase CBio Crédito de descarbonização por

biocombustíveis CBM Domínio de ligação a carboidrato CDH Celobiose desidrogenase CE Carboidrato esterase CMC Carboximetilcelulose CNPEM Centro Nacional de Pesquisa em

Energia e Materiais CTBE Laboratório Nacional de Ciência e

Tecnologia do Bioetanol CTNBio Comissão Técnica Nacional de

Biossegurança D2O Água deuterada DEG Gene diferencialmente expresso DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico DyP Dye-decolorizing peroxidase EC Enzyme commission number EGL Endoglucanase FC Fold change FT Fator de transcrição

Fw Forward GABA Ácido γ-aminobutírico GEEs Gases do efeito estufa GFP Green fluorescent protein GH Glicosil hidrolase GLR α-glucuronidase GO Gene ontology GT Glicosil transferase

IAC Índice de acessibilidade de cromatina

iRNA RNA de interferência kb Kilobase KOG Eukaryotic orthologous groups LC Cromatografia líquida LHW Liquid hot water LiP Peroxidase de lignina LNBR Laboratório Nacional de

Biorrenováveis LPMO Lytic polysaccharide

monooxygenase MAN Mananase MnP Peroxidase dependente de

manganês MS Espectrometria de massa NTG Nitroguanidina OGMs Organismos geneticamente

modificados OMP Orotidine 5'-monophosphate pb Par de base PC Componente principal PCA Análise de componente principal PCR Polymerase chain reaction

pNP ρ-nitrophenol pNPA 4-nitrophenyl α-L-

arabinofuranoside pNPC 4-nitrophenyl β-D-cellobioside pNPG 4-nitrophenyl β-D-

glucopyranoside pNPX 4-nitrophenyl β-D-xylopyranoside QR Quinona redutase RCC Repression carbon catabolite RMN Ressonância magnética nuclear Rv Reverse TCA Ácido tricarboxílico (ou Krebs) tep Tonelada equivalente de petróleo

TMSP Trimethylsilylpropanoic acid UDP Uridine diphosphate UMP Uridine monophosphate UV Ultravioleta WGCNA Weighted correlation network

analysis XBS Xyr1-binding site XYN Xilanase

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

€ Euro

°C Grau Celsius

•OH Radical hidroxil

A Adenosina

C Citosina

Cys Cisteína

G Guanosina

IU Atividade enzimática

IU/mg Unidades (atividade) por miligrama

pH Potencial de hidrogênio

R Adenosina ou guanina

S Guanosina ou citosina

T Timina

™ Marca registrada

USD Dólar americano

W Adenosina ou timina

Y Citosina ou timina

Zn Zinco

γ Gama (radiação)

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................20

1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................................ 23 1.1.1 Sustentabilidade, bioeconomia e biocombustíveis .............................................................................. 23 1.1.2 Etanol de segunda geração (2G) .......................................................................................................... 28 1.1.3 Lignocelulose e parede celular da cana ............................................................................................... 35

1.1.3.1 Celulose ...........................................................................................................................................................37 1.1.3.2 Hemicelulose ...................................................................................................................................................38 1.1.3.3 Lignina ............................................................................................................................................................40 1.1.3.4 Bagaço de cana-de-açúcar .............................................................................................................................41

1.1.4 Desconstrução de biomassa vegetal por enzimas e proteínas acessórias ........................................... 41 1.1.4.1 Celulases .........................................................................................................................................................43 1.1.4.2 Hemicelulases .................................................................................................................................................46 1.1.4.3 Enzimas envolvidas na degradação da lignina ...............................................................................................48 1.1.4.4 Disrupting proteins e degradação não-enzimática .........................................................................................49

1.1.5 Trichoderma reesei .............................................................................................................................. 50 1.1.5.1 Aspectos gerais e desenvolvimento de cepas hipercelulolíticas ......................................................................50 1.1.5.2 Enzimas descontrutoras da parede celular vegetal ........................................................................................54 1.1.5.3 Principais reguladores das enzimas lignocelulolíticas .....................................................................................55

1.1.5.3.1 Reguladores específicos da expressão de CAZymes ...............................................................................56 1.1.5.3.2 Outros reguladores transcricionais .........................................................................................................58

1.1.5.3 Rede de co-expressão gênica ..........................................................................................................................62 1.2 MOTIVAÇÃO E HIPÓTESE ............................................................................................................................. 65 1.3 OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 66

1.3.1 Objetivo geral ...................................................................................................................................... 66 1.3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................................ 66

CAPÍTULO 2 – REDE DE CO-EXPRESSÃO GÊNICA REVELA NOVOS GENES COM POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM TRICHODERMA REESEI RUT-C30 ..............................................................67

2.1 INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 69 2.2 MATERIALS AND METHODS ....................................................................................................................... 71

2.2.1 Fungal strain and culture conditions ................................................................................................... 71 2.2.2 Gene co-expression network analysis .................................................................................................. 72 2.2.3 Prediction of the Xyr1-binding sites ..................................................................................................... 73

2.3 RESULTS ..................................................................................................................................................... 74 2.3.1 Construction of a weighted gene co-expression network .................................................................... 74 2.3.2 Identification of subclusters and GO enrichment ............................................................................... 76 2.3.3 Hub genes identification ..................................................................................................................... 77 2.3.4 Prediction of the Xyr1-binding sites in the promoter region .............................................................. 81 2.3.5 Xyr1 and co-expressed genes in the coral1 module ........................................................................... 84

2.4 DISCUSSION ............................................................................................................................................... 87 2.5 CONCLUSION.............................................................................................................................................. 93

CAPÍTULO 3 – CONSTRUÇÃO, CONFIRMAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE MUTANTES KNOCKOUT DE TRICHODERMA REESEI .................................................................................................................................. 103

3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 104 3.2 MÉTODOS .................................................................................................................................................. 107 3.2.1 MICRORGANISMOS E CONDIÇÕES DE CULTIVO ................................................................................................... 107

3.2.2 Clonagem e construção dos cassetes ................................................................................................. 108 3.2.2.1 Cassete da hidrofobina – construção in vivo por recombinação homóloga ..................................................111 3.2.2.2 Demais cassetes – construção por clivagem e ligação in vitro......................................................................113

3.2.3 Transformação de T. reesei ................................................................................................................ 115 3.2.4 Confirmação das deleções gênicas por PCR ....................................................................................... 116 3.2.5 Southern blotting ............................................................................................................................... 117 3.2.6 Teste de crescimento por massa seca ................................................................................................ 119 3.2.7 Quantificação de proteína total ......................................................................................................... 119 3.2.8 Atividade enzimática ......................................................................................................................... 119

3.2.10 Expressão gênica por RT-qPCR ......................................................................................................... 120 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................................................ 122

3.3.1 Transformação de T. reesei ................................................................................................................ 122 3.3.2 Caracterização fenotípica de T. reesei ............................................................................................... 127 3.3.3 Expressão gênica dos genes alvos em glicose e soforose .................................................................. 130

3.4 CONCLUSÃO .............................................................................................................................................. 132

CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE TRICHODERMA REESEI E ASPERGILLUS NIGER CRESCIDOS EM DIFERENTES FONTES DE CARBONO ....................................................................................... 134

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 134 4.2 MÉTODOS .................................................................................................................................................. 137

4.2.1 Microrganismos e condições de cultivo ............................................................................................. 137 4.2.2 Extração dos metabólitos .................................................................................................................. 138 4.2.3 Processamento e análise dos dados .................................................................................................. 139 4.2.4 Quantificação de proteína total ......................................................................................................... 139 4.2.5 Atividade enzimática ......................................................................................................................... 140

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................................................ 141 4.3.1 Comparação do perfil metabólico global de T. reesei e A. niger ....................................................... 141 4.3.2 T. reesei versus A. niger ..................................................................................................................... 148 4.3.3 Perfil metabólico por fonte de carbono ............................................................................................. 151 4.3.4 Atividade enzimática ......................................................................................................................... 164

4.4 CONCLUSÃO .............................................................................................................................................. 166

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................................................... 168

REFERÊNCIAS ................................................................................................................................................ 170

ANEXO I ........................................................................................................................................................ 203

ANEXO II ....................................................................................................................................................... 207

ANEXO III ...................................................................................................................................................... 208

ANEXO IV ...................................................................................................................................................... 209

ANEXO V ....................................................................................................................................................... 211

ANEXO VI ...................................................................................................................................................... 213

ANEXO VII ..................................................................................................................................................... 214

ANEXO VIII .................................................................................................................................................... 215

ANEXO IX ...................................................................................................................................................... 216

ANEXO X ....................................................................................................................................................... 217

ANEXO XI ...................................................................................................................................................... 218

ANEXO XII ..................................................................................................................................................... 219

20

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

O avanço na viabilidade econômica e incentivo aos biocombustíveis e outras

fontes de energia renováveis estão hoje entre as principais pautas na agenda mundial de

energia em direção ao desenvolvimento de uma economia sustentável e circular

(bioeconomia). Estima-se que até 2050 a população mundial será de nove bilhões de

habitantes, os quais irão compartilhar dos mesmos recursos naturais finitos (PHILP, 2015).

Com o crescimento populacional desenfreado, aumenta-se a demanda por matérias-primas

e, consequentemente, as emissões de gases do efeito estufa (GEEs) e o uso não racional dos

recursos naturais. Dessa forma, dentre várias outras questões pertinentes, a segurança

energética desponta como uma das principais dentro desta temática. Por essa razão, é de

fundamental importância que novas políticas públicas de promoção aos biocombustíveis

sejam criadas e de que as já existentes sejam aplicadas com rigor. Nesse sentido, os acordos

internacionais (Protocolo de Kyoto e Acordo de Paris, por exemplo) e as diretrizes

energéticas (RenovaBio no Brasil, Renewable Energy Directive na União Europeia, Renewable

Fuel Standard Program nos EUA, entre outros) são exemplos de iniciativas firmadas na

promoção dos biocombustíveis e minimização das mudanças climáticas (UNITED NATIONS,

1998, 2015a; EUROPEAN UNION, 2009; PHILP, 2015; MME, 2017a; EPA, 2019).

O Brasil se destaca no cenário mundial em relação à predominância de fontes

renováveis de energia em sua matriz energética, sendo 17 % da oferta interna de energia

gerados por derivados da cana-de-açúcar (cana) (EPE, 2018). Atualmente, o Brasil é o maior

produtor de cana e o segundo maior na produção de etanol (AMORIM et al., 2011; RFA,

2019). Além de etanol, açúcar e eletricidade, subprodutos são gerados a partir da moagem

da cana, como o bagaço e a vinhaça. O bagaço é um material lignocelulósico muito

abundante e representa atualmente uma das principais matérias-primas para produção do

etanol de segunda geração (2G) (ELISEU NICULA DE CASTRO et al., 2019). Diante da sua

posição estratégica, pioneirismo no setor sucro-energético e grande disponibilidade de

matéria-prima, o Brasil se apresenta como um país na vanguarda da transição de mercado

em direção a uma bioeconomia apoiada, principalmente, na produção de etanol 1G e 2G

(ELISEU NICULA DE CASTRO et al., 2019).

Apesar de vários obstáculos em relação ao desenvolvimento de tecnologias de

pré-tratamento, hidrólise e fermentação de pentoses já terem sido superados, e das

21

unidades industriais existentes, a conversão da biomassa para produção de biocombustíveis

2G ainda não é um processo totalmente viável do ponto de vista econômico (PAULA; PAULA;

CONTIERO, 2018), caso contrário não haveria tantas linhas de pesquisa, colaborações

científicas e recursos financeiros para o avanço desta área do conhecimento. Os coquetéis

enzimáticos utilizados são de alto custo e cada biomassa lignocelulósica apresenta

composição e características particulares que requerem a ação de conjuntos diferentes de

enzimas para sua total conversão (LOPES; FERREIRA FILHO; MOREIRA, 2018). Por essa razão,

a otimização de um coquetel enzimático eficiente, de baixo custo e customizado é de

extrema relevância (KIM; LEE; KIM, 2017).

Trichoderma reesei é a principal espécie de fungo filamentoso utilizada na

produção industrial de celulases para conversão de biomassa e produção de biocombustível.

Ao longo das últimas décadas, T. reesei vem sendo alvo de extensa pesquisa científica,

abrangendo desde os estudos com ‘ômicas’ em diversas biomassas até o engenheiramento

genético para maior secreção de enzimas (DRUZHININA; KUBICEK, 2017). Contudo, o

entendimento da sua capacidade em desconstruir, em especial, a biomassa vegetal de cana

pode ser mais explorado a fim de melhorar o custo-benefício dos coquetéis enzimáticos. O

presente trabalho teve como objetivo principal a identificação e caracterização de genes

com potencial biotecnológico de T. reesei na sacarificação da parede celular do bagaço e que

ainda não foram caracterizados. O projeto buscou complementar os estudos anteriores

realizados pelo grupo (BORIN et al., 2015, 2017), de modo a integrar os diferentes dados

gerados e contribuir para um conhecimento mais aprofundado sobre o fungo e seu arsenal

celulolítico, em resposta ao crescimento em bagaço.

A fim de inteirar o leitor desta tese sobre o assunto abordado, apresentar os

resultados alcançados e as discussões feitas de forma didática e seguindo uma linha de

raciocínio lógica, esta tese foi estruturada em cinco capítulos:

CAPÍTULO 1: revisão bibliográfica com os trabalhos mais relevantes e recentes

na área, motivação do trabalho realizado, e objetivos gerais e específicos propostos;

CAPÍTULO 2: artigo publicado pelo grupo de pesquisa do doutorando acerca

da construção de uma rede de co-expressão gênica de T. reesei e identificação de novos

genes com potencial biotecnológico;

CAPÍTULO 3: conjunto de resultados obtidos da deleção gênica e

caracterização fenotípica dos mutantes de T. reesei;

22

CAPÍTULO 4: perfil metabólico identificado em T. reesei e A. niger crescidos

em diferentes fontes de carbono por espectrometria de ressonância magnética nuclear

(RMN);

CAPÍTULO 5: conclusões gerais com principais contribuições deste trabalho e

perspectivas futuras do que ainda pode ser explorado com base nos dados obtidos.

Na seção de anexos, segue o material suplementar dos dados de metabolômica

(ANEXOS I-IV), o termo da comissão de bioética (ANEXO V) e a declaração de direitos

autorais (ANEXO VI), bem como as capas dos seis capítulos de ebooks escritos pelo

doutorado em colaboração com demais autores (ANEXOS VII-XII). Estes capítulos não estão

diretamente ligados ao projeto de doutorado, mas suas temáticas abrangem tópicos

estudados neste trabalho.

23

1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1.1 Sustentabilidade, bioeconomia e biocombustíveis

Os conceitos de sustentabilidade e bioeconomia estão em alta atualmente não

somente nos fóruns e encontros de agências multilateriais que tratam de temas importantes

como mudanças climáticas e economia, mas também estão atrelados (ou deveriam estar)

diretamente às novas políticas públicas necessárias para o desenvolvimento sustentável das

nações. O termo ‘desenvolvimento sustentável’ começou a ser empregado na década de 80

pela Comissão de Meio Ambiente e Desenvolvimento das Nações Unidas e, por definição,

refere-se ao desenvolvimento que satisfaz as necessidades atuais sem comprometer a

capacidade das gerações futuras em atender suas próprias necessidades (WCED, 1987).

Alguns anos mais tarde, em 1997, o conceito bioeconomia foi introduzido por dois

geneticistas - Juan Enriquez Cabot e Rodrigo Martinez – em um encontro da Associação

Americana para o Avanço da Ciência (GOTTWALD, 2016; BIRNER, 2018). Segundo Enriquez

(1998), a genômica estaria causando uma revolução molecular de modo a forçar as

indústrias e empresas a se reinventarem dentro de um novo setor econômico baseado nas

ciências da vida. O avanço das ciências biológicas e da biotecnologia levaria então à

transformação dos processos de produção industrial. Apesar do termo bioeconomia não ter

sido mencionado no texto, a ideia já havia sido pensada pelos dois geneticistas e, em um

futuro bem próximo, estaria então disseminada entre a comunidade científica internacional.

O termo bioeconomia – mais especificamente “biobased economy” – surgiu

então a partir de um documento entitulado “Biotechnology for Sustainable Growth and

Development” em um encontro realizado pela Organização para a Cooperação e

Desenvolvimento Econômico (OCDE)1 em 2004 (IL BIOECONOMISTA, 2015). Neste

documento, os autores definiram o termo como uma economia que utiliza recursos

renováveis, bioprocessos eficientes e ramos eco-industriais para produzir bioprodutos

sustentáveis, e gerar emprego e renda (OECD, 2004). Na época, Christian Patermann

ocupava o cargo de diretor do departamento de Biotecnologia, Agricultura e Nutrição da

“Directorate General for Research, Science and Education” da União Europeia, e foi um dos

1 Organização internacional formada por 36 países (diversos países da União Europeia, EUA, Canadá, Austrália e

Japão) que tem como objetivos promover políticas de melhoria socioeconômica para as populações e estimular o progresso das nações (OECD, 2019). É informalmente conhecida como organização dos “países ricos”, e o Brasil, inclusive, fez uma tentativa recente de entrar nesse bloco, mas sua adesão permanece em aberto (BBC NEWS BRASIL, 2019).

24

grandes defensores da promoção desta ideia, sendo considerado o ‘pai’ da bioeconomia (IL

BIOECONOMISTA, 2015; BIRNER, 2018).

Mais recentemente, a União Europeia, através do seu órgão de Pesquisa e

Inovação, divulgou um documento atualizando as diretrizes estratégicas voltadas ao

desenvolvimento e consolidação de uma economia sustentável. Neste relatório, o conceito

de bioeconomia foi definido como:

The bioeconomy covers all sectors and systems that rely on biological

resources (animals, plants, micro-organisms and derived biomass,

including organic waste), their functions and principles. It includes

and interlinks: land and marine ecosystems and the services they

provide; all primary production sectors that use and produce

biological resources (agriculture, forestry, fisheries and aquaculture);

and all economic and industrial sectors that use biological resources

and processes to produce food, feed, bio-based products, energy and

services. To be successful, the European bioeconomy needs to have

sustainability and circularity at its heart. This will drive the renewal of

our industries, the modernisation of our primary production systems,

the protection of the environment and will enhance biodiversity.

(EUROPEAN COMMISSION, 2018)

Como se pode notar, trata-se de um conceito mais abrangente que o primeiro

divulgado pela OCDE em 2004, e mostra o maior engajamento das nações envolvidas em

tentar estabelecer e firmar políticas que: i) assegurem a segurança alimentar e nutricional, ii)

regulamentem o uso sustentável dos recursos naturais e diminuam a dependência dos

combustíveis fósseis, e iii) reduzam a emissão de gases do efeito estufa (GEE) (EUROPEAN

COMMISSION, 2018).

O Brasil também acompanha essa tendência global, e a bioeconomia é um dos

temas centrais de um conjunto de medidas conhecido como “Estratégia Nacional de Ciência,

Tecnologia e Inovação (2016-2022)” (MCTIC, 2016). Segundo o documento:

25

[...] o Brasil declara seu interesse em promover o desenvolvimento

sustentável, transformando os recursos de que o País dispõe em

conhecimento científico e em produtos inovadores com maior valor

agregado e densidade tecnológica para os mercados nacionais e

internacionais, em consonância com a proteção do meio ambiente e a

mitigação dos impactos causados pela emissão dos gases do efeito

estufa (GEE). (MCTIC, 2016)

Com o avanço das mudanças climáticas, problemas relacionados ao crescimento

populacional, aumento da demanda energética global e outras questões relacionadas, vários

acordos internationais foram firmados por diversos países para frear as consequências do

uso desenfreado dos recursos naturais e as emissões de GEEs. Dentre os principais,

destacam-se: o Protocolo de Kyoto em 1997 e a Emenda de Doha em 2015, o Acordo de

Copenhague em 2009, e o Acordo de Paris durante a Conferência das Nações Unidas sobre

as Mudanças Climáticas de 2015 (COP21). Este último foi um marco no cenário das

mudanças climáticas uma vez que, pela primeira vez, 195 países mais a União Europeia

concordaram em assinar um documento ratificando a necessidade de diminuir as emissões

de GEE. O acordo também enfatizou a necessidade urgente de se realizar esforços para

limitar o aumento da temperatura a 1,5 °C acima dos níveis pré-industriais (UNITED

NATIONS, 1998, 2015b, 2016; UNFCC, 2019).

Seguindo essa conjuntura, novas diretrizes energéticas de incentivo aos

biocombustíveis e às fontes renováveis de energia foram criadas e postas em prática. Na

União Europeia, por exemplo, a política do Renewable Energy Directive acordada em 2016 e

revisada em 2018, estabelece que 10 % da oferta de energia devem ser providos pelos

biocombustíveis até 2020, e que a quota de energia renovável consumida deve ser de pelo

menos 32 % até 2030 (EUROPEAN UNION, 2009, 2018).

Os Estados Unidos (EUA), um dos principais produtores e consumidores de

combustíveis fósseis (responsáveis por 14 e 21 % da produção e consumo mundial,

respectivamente) (RENEWABLE FUELS ASSOCIATION, 2017a), também estabeleceram um

plano de metas para os biocombustíveis. Segundo o Renewable Fuel Standard (RFS), os EUA

devem misturar cada vez mais biocombustíveis com os combustíveis utilizados pelo setor de

transporte, e a expectativa é que sejam consumidos até 136 bilhões de litros (36 bilhões de

26

galões) de combustível renovável até 2022 (UNICA, 2010). Em relação ao etanol 2G, ou seja,

o combustível produzido a partir da biomassa lignocelulósica, a meta era de 20,8 bilhões de

litros em 2018, mas a agência reguladora (EPA) da RFS se viu obrigada a baixá-la para apenas

1,1 bilhão de litros devido à dificuldade de produção comercial do etanol a partir dessa

biomassa (MME/EPE, 2018).

Na mesma direção, a política do RenovaBio, recentemente aprovada no Senado

e sancionada pelo ex-presidente Michel Temer (lei n° 13.576/17), é um programa crucial

para impulsionar e fortalecer o setor sucroenergético do Brasil (MME, 2017b). Entre outros

objetivos, o programa RenovaBio pretende até 2030: i) diminuir a emissão de GEE em 43 %

em relação a 2005, e ii) aumentar a participação de fontes renováveis na matriz energética

para 45 % (ADDINGTON, 2017; MME, 2017b). De modo simplificado, os produtores de

biocombustíveis receberão créditos de descarbonização (CBios), que serão negociados em

bolsa de valores na forma de títulos. As distribuidoras serão obrigadas a comprar esses

títulos para compensar a venda de combustíveis fósseis, reduzindo então as emissões e

contribuindo para que o país atinja suas metas de desenvolvimento sustentável e consolide

o ramo dos biocombustíveis.

De acordo com as previsões do “Plano Decenal de Expansão de Energia 2027” do

Ministério de Minas e Energia – que tem como objetivos mostrar o panorama energético

atual, indicar as perspectivas futuras de expansão do setor energético e ajudar no

planejamento estratégico do governo federal – o produto interno bruto (PIB) brasileiro deve

ter uma taxa média de crescimento de 2,8 % ao ano no período de 2017 a 2027. Neste

cenário, estima-se que a população brasileira irá aumentar de 208 para 221 milhões de

habitantes no mesmo período, havendo um acréscimo de aproximadamente 25 % no

consumo de energia (de 260 para 325,3 x 106 tep2, entre 2017 e 2027). Atualmente o setor

industrial e de transporte são os maiores consumidores dessa energia, sendo cada um

responsável por 33 % de todo esse consumo (MME/EPE, 2018).

O Brasil é um dos principais players no setor energético e serve de exemplo para

outros países que buscam diversificar sua matriz energética para fontes renováveis

(PEREIRA; ROITMAN; GRASSI, 2018). Estas fontes representam hoje 43 % de toda energia

produzida e disponibilizada no país, dos quais 17 % provêm de derivados da cana, como

2 Tonelada equivalente de petróleo. Unidade de medida utilizada para contabilizar energia de diferentes fontes

(EPE, 2019b).

27

bagaço, palha e biogás, seguidos dos recursos hídricos (12 %). De acordo com o “Plano

Decenal de Expansão de Energia” (MME/EPE, 2018), a geração de energia elétrica oriunda de

fontes renováveis poderá chegar a 88 % em 2027. Fazendo um comparativo com a matriz

energética global, os combustíveis fósseis ocupam a principal parcela da oferta de energia e

totalizam 86 % contra apenas 14 % das fontes renováveis (EPE, 2019a) (Figura 1).

Figura 1. Matriz energética brasileira (ano base 2017) e mundial (2016) (EPE, 2019a).

É notável a grande diferença de uso dos recusos naturais existentes para geração

de energia no Brasil e nos demais países. Em grande parte essa diferença se deve à criação

de um programa nacional de incentivo à produção e uso do álcool pela frota automotiva

brasileira na década de 1970. O programa conhecido como Proálcool surgiu frente à

necessidade de desenvolver outro combustível líquido que pudesse substituir a gasolina,

cujo preço estava supervalorizado na época (LEITE et al., 2009). Essa nova política energética

consolidou o setor sucroenergético brasileiro, rendendo hoje o segundo lugar no ranking dos

maiores produtores de etanol e contribuindo com a produção de 28 % deste combustível no

mundo, atrás apenas dos EUA (RFA, 2019).

Atualmente, outros fatores estão propiciando um cenário otimista e inovador

para o avanço dos biocombustíveis no Brasil, como: a criação do Renovabio e seu

alinhamento com o programa Rota 20303 (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017; GRASSI;

3 Programa do governo federal que tem como objetivo apoiar o desenvolvimento tecnológico, aumentar a

eficiência energética dos veículos, promover o uso de biocombustíveis e garantir a expansão do setor

28

PEREIRA, 2019); o desenvolvimento de linhagens comerciais de cana mais resistentes a

pragas (CTC20BT e CTC9001BT) (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017; CTC, 2018), com alto

teor de fibras (cana-energia) e linhagens com maior digestibilidade enzimática (DE SOUZA et

al., 2019); a diversificação das ténicas de plantio da cana (mudas pré-brotadas e sementes

obtidas por técnicas de clonagem) e a implantação da cultura de milho para produção de

etanol no centro-oeste brasileiro (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017). Cabe então aos

governantes, empresas, refinarias e agências reguladoras estimularem e protegerem o setor

a fim de fortacê-lo ainda mais e de diminuir a resistência daqueles que acreditam que os

biocombustíveis competem com as culturas voltadas à produção de alimentos ou que sua

produção emite a mesma quantidade de GEE que a queima dos combustíveis fósseis

(PEREIRA; ROITMAN; GRASSI, 2018).

1.1.2 Etanol de segunda geração (2G)

Além do etanol 1G produzido, por exemplo, a partir do caldo extraído da cana, o

2G é uma das alternativas mais promissoras para satisfazer as necessidades de aumento da

produção de biocombustíveis. De acordo com a Empresa de Pesquisa Energética (2016),

estima-se que a produção total de etanol brasileira deverá alcançar um volume de 54 bilhões

de litros em 2030, sendo 2,5 bilhões provenientes do etanol 2G. Em um cenário otimista,

acredita-se que o volume somado de etanol 1G e 2G pode ser aumentado em 50 %

utilizando-se bagaço e palha a partir da mesma quantidade de matéria-prima de cana

(JAGGER, 2009; BASSO et al., 2013; DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017). O etanol 2G da cana

reduz em até 86 % as emissões de GEE em comparação com a gasolina, e, do ponto de vista

ambiental, é mais eficiente em termos de emissão que o etanol 1G, que reduz 78 %. Em

contrapartida, o etanol 1G proveninente do milho, principal matéria-prima dos EUA para

este combustível, reduz apenas 19 % das emissões (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017).

O etanol 2G pode ser produzido por diversas matérias-primas lignocelulósicas

disponíveis em praticamente todos os países, como resíduos de madeira ou papel, resíduos

sólidos municipais e industriais, biomassa vegetal oriunda da cadeia produtiva de culturas

agrícolas (bagaço e palha de cana, de arroz, trigo, milho) e ainda biomassa de culturas

destinadas à produção de energia (gramíneas switchgrass, Miscanthus sp. e cana-energia, e

automobilístico, que é responsável por 22 % do PIB industrial brasileiro (BORGES, 2018; FELIX; MATSUBARA, 2018; KUTNEY, 2019) (Lei Nº 13.755, 10 de dezembro de 2018).

29

plantas lenhosas willow, poplar e pinheiro) (HO; NGO; GUO, 2014; SAINI; SAINI; TEWARI,

2015; GRASSI; PEREIRA, 2019). Muitos desses resíduos são encontrados em abundância por

serem gerados como subprodutos de cadeias produtivas e por ainda não serem muito

aproveitados como insumo na produção de outros produtos. Nesta transição para uma

economia mais verde e circular, estes resíduos - que até pouco tempo atrás eram

considerados como “lixo” - hoje são reconhecidos como uma fonte extremamente rica para

geração de vários produtos de alto valor agregado (SHARMA; ARORA, 2015).

A lignocelulose é o elemento estrutural comum a todos estes resíduos, e é

formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina (HO; NGO; GUO, 2014). A

conversão total da lignocelulose em açúcares fermentescíveis requer as etapas de pré-

tratamento e hidrólise enzimática, e é uma das peças-chave da produção do etanol 2G

(KRICKA; FITZPATRICK; BOND, 2014). A primeira etapa reduz a recalcitrância da parede

celular vegetal e permite o acesso de enzimas hidrolíticas e oxidativas aos componentes da

lignocelulose. A hidrólise enzimática converte os polissacarídeos celulose e hemicelulose em

açúcares mais simples como glicose e xilose, que são então fermentados e convertidos em

etanol por microrganismos industriais (SILVEIRA et al., 2015). Estas duas etapas limitam a

viabilidade econômica do etanol 2G, e o desenvolvimento de novas tecnologias e de

processos mais eficientes são necessários para torná-lo mais atrativo economicamente

(BORNSCHEUER; BUCHHOLZ; SEIBEL, 2014; GUPTA; VERMA, 2015; JUNQUEIRA; CAVALETT;

BONOMI, 2016). No Brasil, estudos apontam que integrar biorefinarias 1G com 2G pode ser

uma saída estratégica para compensar os custos associados ao etanol 2G, aproveitando a

infraestrutura de 1G e reduzindo as emissões de GEE (DIAS et al., 2012; JUNQUEIRA et al.,

2017).

Existem hoje diversos pré-tratamentos que podem ser empregados para reduzir

a recalcitrância de diferentes tipos de biomassa, incluindo métodos físicos, químicos, físico-

químicos e biológicos. Dentre os principais, pode-se citar: irradiação e moagem mecânica

para pré-tratamentos físicos; tratamento ácido (HCl, H2SO4, HNO3) ou básico (NaOH,

Ca(OH)2, NH4OH), tratamento com solventes orgânicos (mistura de etanol, metanol, benzeno

e outros com água), líquidos iônicos e fluidos supercríticos, delignificação oxidativa com O3 e

H2O2 para pré-tratamentos químicos; explosão a vapor ou explosão com SO2 ou CO2, AFEX

(ammonia fiber explosion) e LHW (liquid hot water, ou auto-hidrólise) para pré-tratamentos

físico-químicos; e biodegradação de lignocelulose realizada por fungos de podridão branca,

30

marrom e soft para pré-tratamentos biológicos. Além dessa grande variedade de pré-

tratamentos, vale ressaltar que outras tecnologias emergentes estão sendo investigadas e se

mostram promissoras dependendo da biomassa e da finalidade desejada, como o uso de

irradiação por micro-ondas, ultrassom, radiação e feixe de elétrons; uso de campo elétrico

pulsado, alta pressão hidrostática e alta pressão de homogeneização (SAINI; SAINI; TEWARI,

2015; HASSAN; WILLIAMS; JAISWAL, 2018).

Estes pré-tratamentos podem ser utilizados de forma isolada ou em conjunto

para maior eficiência da separação dos compostos que se deseja obter, de forma a

minimizar custos operacionais, produção de produtos tóxicos e de inibidores enzimáticos (a

hidrólise enzimática é quase sempre o passo subsequente do pré-tratamento para produção

do etanol 2G). Não existe um pré-tratamento universal que atenda aos requisitos de

degradação de todos os tipos de biomassa. No entanto, entre a grande variedade de

possibilidades, a explosão a vapor é amplamente utilizada nos pré-tratamentos físico-

químicos, e o básico e ácido diluído em pré-tratamentos químicos (SILVEIRA et al., 2015).

O pré-tratamento de explosão a vapor é econômico por ter demanda moderada

de energia para reduzir o tamanho das partículas sólidas e custo baixo de investimento. É

ecologicamente correto por não utilizar reagantes químicos, e já foi utilizado em escala

industrial. Dentre as desvantagens estão a formação de inibidores enzimáticos, destruição

parcial do xilano (principal componente da hemicelulose da cana) e menor eficiência para

softwood4. O pré-tratamento alcalino usa hidróxido de sódio, potássio e amônio como

reagentes, e é um método vantajoso devido à remoção eficiente de lignina (de 24 a 55 %

para hardwood4, e menor para softwood) e hemicelulose (até 50 % de hidrólise) com menor

degradação de açúcares que o pré-tratamento ácido. O pré-tratamento com ácido diluído

solubiliza entre 80-100 % da fração hemicelulósica e permite uma alta recuperação de xilose

(75-90 %), porém é desvantajoso por causa do alto custo dos reatores e químicos utilizados,

não é eco-friendly e forma compostos inibitórios (GUO; SONG; BUHAIN, 2015; GUPTA;

VERMA, 2015; SAINI; SAINI; TEWARI, 2015; SILVEIRA et al., 2015; AUXENFANS et al., 2017;

THOMAS et al., 2017; HASSAN; WILLIAMS; JAISWAL, 2018).

4 Softwood e hardwood são tipos de biomassa de madeira característicos de gimnospermas (pinheiro e abeto,

por exemplo) e angiospermas (eucalipto, bétula, por exemplo), respectivamente. A biomassa do tipo hardwood possui maior composição de xilano e menor de manano do que softwood, e é menos recalcitrante à ação de enzimas (ÁLVAREZ; REYES-SOSA; DÍEZ, 2016).

31

A escolha do pré-tratamento e análise técnica dos equipamentos e materiais

necessários são de extrema relevância no processo industrial de produção de etanol 2G a

fim de se evitar problemas que possam prejudicar as operações. Particularmente no Brasil,

que possui duas usinas de etanol 2G (GranBio e Raízen), o pré-tratamento de explosão a

vapor do bagaço e palha da cana com alto teor de impurezas minerais (terra, areia e pedras)

causaram erosão e abrasão dos equipamentos. Isso porque o maquinário foi adaptado

daquele utilizado pelas indústrias de papel e celulose que empregam a madeira como

matéria-prima. Assim, foram necessárias melhorias técnicas na parte mecânica e de

engenharia dos equipamentos utilizados na produção de etanol 2G para não comprometer

as atividades destas usinas (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017; GRASSI; PEREIRA, 2019).

A hidrólise enzimática é a etapa seguinte do processo de produção do etanol 2G

e também um dos principais gargalos industriais em razão do tempo de hidrólise e custo dos

coquetéis utilizados (HURON et al., 2016). Após o pré-tratamento, os polissacarídeos

complexos estão mais acessíveis para serem convertidos em açúcares simples pela ação de

diferentes enzimas, como celulases (celobiohidrolase, endoglucanase e β-glicosidase) e

hemicelulases (xilanase, β-xilosidase, α-arabinofuranosidase, acetilxilanoesterase, feruloil

esterase, xiloglicanase e α-glucuronidase) (BARR; MERTENS; SCHALL, 2012; GUPTA; VERMA,

2015; DONDELINGER et al., 2016). Mais recentemente, também foi demonstrado que

enzimas oxidativas conhecidas como lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) podem

aumentar a ação de enzimas hidrolíticas, resultando em uma maior degradação sinérgica da

(hemi)celulose (CRAGG et al., 2015). Estas enzimas já foram inclusive adicionadas aos

coquetéis enzimáticos comerciais Cellic® CTec2 e Ctec3 (Novozymes, Dinamarca) junto com

celulases e hemicelulases, contribuindo assim para aumento da sua eficiência e do custo-

benefício, uma vez que com uma menor quantidade de enzimas é alcançada maior

desconstrução dos polissacarídeos da lignocelulose (JOHANSEN, 2016). Contudo, apesar dos

avanços conquistados, os coquetéis que já são utilizados em escala industrial ainda não são

capazes de degradar completamente a biomassa vegetal, havendo a necessidade de explorar

novas enzimas e de entender melhor seus mecanismos de ação (COUTURIER et al., 2018).

Essas enzimas e outras proteínas importantes para a desconstrução da lignocelulose são

produzidas na natureza por diversos microrganismos, incluindo fungos, leveduras e bactérias

que, através de seu papel de decompositores, promovem naturalmente a reciclagem do

carbono na biosfera (ANDLAR et al., 2018).

32

Dando sequência à produção do etanol 2G, os açúcares liberados das etapas de

pré-tratamento e hidrólise enzimática – principalmente glicose e xilose – são então

fermentados e convertidos em etanol por leveduras industriais. A principal delas,

Saccharomyces cerevisiae, vem sendo utilizada há décadas na produção de etanol 1G, graças

a sua eficiência e robustez. Para realizar a tarefa de fermentar os açúcares do hidrolisado da

biomassa, as leveduras precisam ser robustas para suportar várias condições adversas

presentes nas dornas de fermentação, como altas concentrações de etanol, temperatura

elevada, ambiente ácido, presença de inibidores tóxicos e competição com microrganismos

contaminantes (DOS SANTOS et al., 2016; SHARMA et al., 2017).

A adaptação e seleção das cepas de S. cerevisiae utilizadas hoje permitiram as

características necessárias para superação dos estresses da fermentação do etanol 1G, mas

ainda não foram suficientes para que elas fermentassem xilose e arabinose, um dos desafios

biotecnológicos essenciais da cadeia do etanol 2G. Através da engenharia genética, genes de

transportadores e do catabolismo de xilose de vários outros microrganismos

(Scheffersomyces stipitis, Candida intermedia, Neurospora crassa, Aspergillus niger,

Orpinomyces sp.) foram então inseridos no genoma de S. cerevisiae, dando origem a cepas

promissoras quanto ao consumo de pentose e rendimento de etanol. Em 2009, por exemplo,

cinco organismos geneticamente modificados (OGMs) desenvolvidos direta ou

indiretamente para a produção de etanol 2G foram registrados e aprovados pelo órgão

regulador CTNBio para serem comercializados no Brasil (DOS SANTOS et al., 2016; KO; LEE,

2018). Assim, acredita-se que a etapa de fermentação dos açúcares presentes no hidrolisado

lignocelulósico não é mais um ponto crítico para a produção de etanol 2G, embora existam

melhorias que possam ser realizadas (DELGADO; ROITMAN; SOUSA, 2017; GRASSI; PEREIRA,

2019).

A Figura 2 mostra simplificadamente um fluxograma do processo de produção do

etanol 2G a partir da biomassa da cana, com as etapas de pré-tratamento e hidrólise

enzimática da biomassa, e subsequente fermentação dos açúcares pelas leveduras. Os

obstáculos para melhoria das etapas do processo industrial também são apresentados, como

maior produtividade e resistência a patógenos da cana, identificação ou engenheiramento

de enzimas mais eficientes, e leveduras mais robustas aos estresses da dorna de

fermentação. A combinação de várias “ômicas” é uma estratégia de extrema importância e

deve ser empregada a fim de superar estes gargalos da indústria do etanol 2G (Figura 2). A

33

etapa de pré-tratamento também requer melhorias, como a criação de equipamentos mais

resistentes à corrosão e abrasão provocada pelas cinzas da palha e bagaço da cana (não

representado). Para redução do custo de produção, a lignina extraída da lignocelulose pode

ainda ser aproveitada para gerar calor e energia elétrica nas usinas, ou ainda para gerar

novos produtos de valor agregado, como polímeros, compostos orgânicos e/ou aromáticos,

benzeno, álcoois, entre outros (DASHTBAN; SCHRAFT; QIN, 2009).

Figura 2. Fluxograma simplificado da cadeia produtiva do etanol 2G da cana. Neste processo, o bagaço e a palha podem ser utilizados e devem passar por um pré-tratamento seguido de hidrólise enzimática para liberação dos açúcares que são fermentados pelas leveduras. Algumas limitações e necessidade de melhorias apresentados no esquema ainda dificultam a viabilidade econômica da produção do etanol 2G (DE CARVALHO et al., 2019).

34

Dentre os maiores produtores de etanol 2G, tem-se a DuPont (EUA), Abengoa

(EUA), Granbio (Brasil), POET-DSM (EUA), e Raízen (Brasil). Estas empresas são responsáveis

pela maior parcela do biocombustível produzido no mundo, e utilizam resíduos de milho,

trigo e cana como matéria-prima (Tabela 1).

Tabela 1. Principais biorefinarias de etanol 2G, capacidade de produção e custo de instação (GUO; SONG; BUHAIN, 2015; ARAÚJO, 2016; DOS SANTOS et al., 2016; LYND et al., 2017; RENEWABLE FUELS ASSOCIATION, 2017a).

Companhia Localização da planta

piloto Ano de

instalação

Capacidade de produção (milhões

galões/ano)

Matéria-prima

Custo da instalação (milhões)

DuPont Nevada (IA), EUA 2015 30 palha de milho

USD 225

Abengoa Hugoton (KS), EUA 2014 25 palha de milho, de trigo e gramíneas

USD 504

GranBio São Miguel dos Campos (AL), Brasil

2014 21,6 bagaço e palha de cana

USD 195

POET-DSM Emmetsburg (IA), EUA 2014 20 palha e espiga de milho

USD 250

Raízen Piracicaba (SP), Brasil 2015 10,6 bagaço e palha de cana

USD 100

A primeira usina em escala comercial foi construída pela empresa Beta

Renewables operada pelo grupo italiano Mossi Guisolfi (MG), em 2013. Esta unidade tinha

uma produtividade de etanol de 13,4 milhões de galões por ano, usando palha de trigo,

arroz e cana-do-reino como matéria-prima. A empresa desenvolveu uma tecnologia

chamada PROESA™, que consiste em pré-tratar a biomassa lignocelulósica e quebrar os

polissacarídeos utilizando enzimas da Novozymes (Dinamarca). A licença da tecnologia foi

vendida para a Granbio no início das operações da unidade em Alagoas com o objetivo de

solucionar as etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática do bagaço e palha da cana.

Contudo, uma série de problemas operacionais e de planejamento levou à dissolução do

acordo comercial. A empresa Beta Renewables prometia, por exemplo, a hidrólise dos

resíduos da cana em apenas 19 horas, enquanto a tecnologia atual requer entre 48 e 96

horas. Além disso, o pré-tratamento de explosão a vapor da tecnologia PROESA™ causou

corrosão e avarias quase diárias aos equipamentos, forçando a Granbio a adotar o pré-

tratamento LHW seguido de uma etapa de tratamento mecânico das fibras para superar

35

esse obstáculo. Em 2017, a gigante italiana Mossi Guisolfi entrou em recuperação judicial e

encerrou as atividades da planta instalada na Itália (PEREIRA et al., 2015; FALCÃO, 2018;

MARQUES, 2018).

A Raízen, formada da fusão entre a brasileira Cosan e a multinacional Shell,

também enfrentou diversos problemas técnicos na operação da sua unidade industrial,

como corrosão dos equipamentos por causa da sílica da palha da cana e necessidade de

novos investimentos na compra de filtros e centrífugas. A integração das tecnologias de

produção 1G e 2G na mesma usina, no entanto, está permitindo a superação desses

entraves técnicos e a projeção é de produzir 40 milhões de litros neste ano (MARQUES,

2018).

1.1.3 Lignocelulose e parede celular da cana

A lignocelulose é o material orgânico renovável mais abundante do mundo e o

maior componente estrutural das plantas, correspondendo de 50 a 90 % de toda biomassa

vegetal. Estima-se que a produção mundial desta biomassa seja de 2 x 10¹¹ milhões de

toneladas por ano, das quais 8-20 x 10⁹ milhões são potencialmente acessíveis para serem

processadas e convertidas em produtos de valor agregado (KRICKA; FITZPATRICK; BOND,

2014).

Em média, a lignocelulose é composta por 30-50 % de celulose, 20-30 % de

hemicelulose e 15-25 % de lignina (KRICKA; FITZPATRICK; BOND, 2014) (Figura 3). Pequenas

quantidades de cinzas, lipídios, proteínas, açúcares solúveis, minerais e pectina também

estão presentes em diferentes graus, de acordo com a fonte da biomassa. As

macromoléculas de celulose, hemicelulose e lignina são encontradas predominantemente na

parede celular secundária das células vegetais, a qual é depositada após a expansão celular

no processo de crescimento da planta (MEENTS; WATANABE; SAMUELS, 2018). Elas são

organizadas de forma hierárquica e se apresentam em uma configuração estrutural em

forma de matriz, cujos elementos interagem entre si através de diferentes tipos de ligações

(covalente, iônica e pontes de hidrogênio). A proporção destas ligações e a força de cada

uma delas são de fundamental importância para maior eficiência da conversão de diferentes

biomassas, e têm sido alvo de extensa pesquisa (BUCKERIDGE; GRANDIS; TAVARES, 2019).

36

A arquitetura dessa matriz é estruturalmente complexa, e confere suporte físico

às células vegetais e fortalece o transporte de água e nutrientes realizado pelo xilema

(MEENTS; WATANABE; SAMUELS, 2018). Além disso, sua estrutura é responsável pela

recalcitrância da parede celular ao ataque de patógenos e suas enzimas (BOMBLE et al.,

2017) (Figura 3).

Figura 3. Esquema simplificado dos principais componentes da lignocelulose presente na parede celular vegetal. A celulose constitui o cerne da estrutura, sendo envolvida pela hemicelulose e lignina. Acima, as unidades repetidas de glicose formando uma cadeia de celulose. Abaixo, os polifenóis que compõem a lignina e os resíduos de hexose e pentose da hemicelulose (modificado de WAKERLEY et al., 2017).

No caso do bagaço da cana, principal resíduo após a moagem do colmo para

extração do caldo (BASSO et al., 2013), a lignocelulose é composta por 38,8-45,5 % de

celulose, 22,7-27,0 % de hemicelulose, 19,1-32,4 % de lignina, 4,6-9,1 % de extrativos (cera,

aromáticos e açúcares) e uma pequena quantidade de cinzas (1,0-2,8 %) (MASARIN et al.,

2011; CANILHA et al., 2013; DE SOUZA et al., 2013). A elucidação de sua arquitetura não é

totalmente conhecida, mas é consenso que as fibras da cana são organizadas em macro e

microfibrilas (BUCKERIDGE; GRANDIS; TAVARES, 2019). Do interior da estrutura para fora,

acredita-se que aproximadamente a cada 36 moléculas de celulose que se alinham de forma

paralela formando uma estrutura linear cristalina, é formada uma microfibrila de celulose

envolta por uma fina camada de xilano e xiloglicano. A reunião de sete destas microfibrilas

dá origem à macrofibrila, que é recoberta por uma matriz de arabinoxilanos ramificados

(resíduos de arabinose e acetil éster) e β-glicanos. Finalmente, estas macrofibrilas são

embebidas em outra matriz de pectina e β-glicanos (DE SOUZA et al., 2013; BUCKERIDGE;

GRANDIS; TAVARES, 2019). A lignina está ligada à pectina através de um dos seus elementos

37

(provavelmente ramonogalacturonano I) e ao ácido ferúlico esterificado na cadeia do

arabinoxilano. Este, junto com o xiloglicano, parecem se ligar à celulose de forma randômica

e específica, respectivamente (Figura 4).

Figura 4. Micro e macrofibrilas e a arquitetura da unidade básica da parede celular da cana. As microfibrilas de celulose estão arranjadas no interior de uma matriz de hemicelulose, e o conjunto de sete microfibrilas dá orgem a uma macrofibrila. As matrizes da micro e macrofibrilas são compostas por xilano e xiloglicano, e arabinoxilano e β-glicano, respecivamente. A lignina se encontra permeada entre as cadeias de hemicelulose, conferindo resistência mecânica e recalcitrância junto com os demais elementos (modificado de BUCKERIDGE; GRANDIS; TAVARES, 2019).

1.1.3.1 Celulose

A celulose é o polissacarídeo mais abundante no mundo e o maior constituinte

de todas as plantas, correspondendo a um polímero linear composto por unidades de D-

glicose ligadas umas às outras por ligações glicosídicas do tipo β-1,4 (MEENTS; WATANABE;

SAMUELS, 2018). Cada molécula de glicose está posicionada de modo reverso (180°) à outra

molécula adjacente (KUBICEK, 2013), e o número de unidades presentes nas cadeias pode

variar de centenas até 10.000 (HORN et al., 2012). A ligação das cadeias de celulose

adjacentes por pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e forças de Van der Waal5 faz

com que as cadeias fiquem alinhadas paralelamente, formando as microfibrilas de celulose

(MEENTS; WATANABE; SAMUELS, 2018). A celulose pode ser quebrada por ácidos ou

celulases em monômeros de glicose, que são fermentados e convertidos em etanol, butanol,

ácido lático ou ácido succínico. Quanto a sua morfologia, a celulose é constituída por 70 %

5 Somatória de forças atrativas ou repulsivas, que não sejam causadas por ligações covalentes ou da interação

eletrostática de íons (LUZ, 2019).

38

de domínios cristalinos altamente compactados e o restante de regiões amorfas

desorganizadas (ADSUL et al., 2011; SEGATO et al., 2014). A celulose cristalina é altamente

resistente à hidrólise porque sua estrutura compactada impede a entrada não somente de

enzimas mas também de pequenas moléculas, como a água e outros solventes (ARANTES;

SADDLER, 2010; GHASEMI; TSIANOU; ALEXANDRIDIS, 2017). Por outro lado, a região amorfa

da celulose está exposta de tal maneira que permite a formação de pontes de hidrogênio

com a água, sendo hidrolisada mais rapidamente que a celulose cristalina por ação de

celulase ou ácido (MITTAL et al., 2011; GONG et al., 2017). Ademais, a celulose vem

recebendo atenção como fonte de nanocristais de celulose, que pelas suas propriedades

únicas (biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa densidade, transparência óptica)

possuem diversas aplicações na área biomédica, farmacêutica, eletrônica etc (TRACHE et al.,

2017).

1.1.3.2 Hemicelulose

A hemicelulose é o segundo polímero mais abundante da parede celular vegetal,

e pode ser isolado da matriz lignocelulósica através de tratamentos alcalinos e ácidos. Sua

composição é variável e dependente da biomassa (KRICKA; FITZPATRICK; BOND, 2014), mas

basicamente trata-se de um heteropolímero altamente ramificado composto por pentoses

(xilose e arabinose), hexoses (manose, glicose e galactose) e por açúcares ácidos (ácido

glucurônico, galacturônico e metilgalacturônico) (ADSUL et al., 2011; SEGATO et al., 2014).

Outros açúcares como ramose e fucose também podem estar presentes em pequenas

quantidades. As hemiceluloses são classificadas de acordo com a composição de seus

polissacarídeos, e as mais comuns são xilano, xiloglicano e manano (HORN et al., 2012;

NAIDU; HLANGOTHI; JOHN, 2018).

O xilano é o polímero mais comum na hemicelulose e é abundante em gramíneas

e angiospermas (cana, trigo e Miscanthus). Esse polímero consiste em uma cadeia de xilose

com ligações do tipo β-1,4 com cadeias laterais que se ligam e conferem ao xilano variados

graus de ramificações (HORN et al., 2012). Embora a maioria dos xilanos seja ramificada,

polissacarídeos lineares já foram isolados. Monômeros de arabinose e galactose também

podem estar ligados à xilose (KUBICEK, 2012).

O xiloglicano está presente em muitas angiospermas e é formado por uma cadeia

de resíduos de glicose com ligações do tipo β-1,4 com uma alta porcentagem desses

39

resíduos ligados à xilose na posição do carbono 6. Os xiloglicanos interagem com as

microfibrilas de celulose pela formação de pontes de hidrogênio, e contribuem para a

integridade da estrutura da celulose. Tanto xilano quanto xiloglicano apresentam ainda

grupos acetil ligados aos seus resíduos (HORN et al., 2012; SEGATO et al., 2014).

A hemicelulose do manano se apresenta em quatro tipos diferentes de estrutura

e composição: manano linear não-ramificado, galactomanano, glicomanano e

galactoglicomanano. O manano linear é formado por uma cadeia principal de resíduos de

manose e é encontrado no endosperma de algumas leguminosas. O galactomanano é similar

ao manano mas com a diferença de possuir unidades de galactose α-1,6 ligadas às unidades

de manose. Os glicomananos são encontrados em espécies de plantas lenhosas e são

formados por glicose e manose com ligações β-1,4. Por fim, o galactoglicomanano possui a

mesma configuração do glicomanano com resíduos de galactose α-1,6 ligados às unidades

de manose e glicose (NAIDU; HLANGOTHI; JOHN, 2018). As pentoses e hexoses que são

ligadas por ligações 1,3, 1,4 e 1,6 são muitas vezes acetiladas e formam uma estrutura

hidrofílica que age como uma espécie de “cola” entre a celulose e a lignina. Mananos e

glicomananos são normalmente poucos abundantes em gimnospermas e angiospermas,

onde outras hemiceluloses parecem tê-los substituídos (SCHELLER; ULVSKOV, 2010; ADSUL

et al., 2011).

Na parede celular da cana, os três tipos principais de hemicelulose são

arabinoxilano, β-glicano e xiloglicano. O primeiro pode ser ramificado com resíduos de xilose

ligados a arabinose, acetil éster e mais escassamente a ácido glucurônico, ou não ramificado.

O resíduo de arabinose é ainda esterificado com ácido ferúlico, ao qual está ligada a maioria

da lignina. O β-glicano está presente na matriz que envolve as macrofibrilas junto dos

arabinoxilanos ramificados (Figura 4), e ambos os tipos de hemicelulose ligam-se

randomicamente às microfibrilas de celulose, ao contrário do xiloglicano que se liga

especificamente (BUCKERIDGE; GRANDIS; TAVARES, 2019; TERRETT; DUPREE, 2019).

Devido à grande diversidade de açúcares que constituem a hemicelulose, são

necessárias diversas enzimas para hidrolisá-la completamente em monômeros (SEGATO et

al., 2014). As hemiceluloses são geralmente mais fáceis de serem quebradas que a celulose,

mas alguns oligômeros conferem recalcitrância a esse material por causa do perfil complexo

de ramificação e acetilação das cadeias (HORN et al., 2012). Diferentemente da

despolimerização da celulose que produz apenas glicose, a degradação de hemicelulose

40

produz uma mistura de diferentes açúcares, em sua maioria pentoses que só podem ser

assimiladas por leveduras geneticamente modificadas, já que naturalmente Saccharomyces

cerevisiae não é capaz de metabolizar xilose e arabinose (KRICKA; FITZPATRICK; BOND,

2015).

1.1.3.3 Lignina

O terceiro componente da lignocelulose é a lignina, uma macromolécula

presente em todas as plantas vasculares e que representa a segunda fonte de carbono mais

abundante do mundo. A lignina é um heteropolímero aromático complexo altamente

resistente à degradação química e biológica. Sua composição consiste em três álcoois

aromáticos - p-coumaril, coniferil e sinapil – derivados dos aminoácidos tirosina e

fenilalanina. Estes álcoois são polimerizados pela ação de lacases e peroxidases, dando

origem às três unidades principais da lignina: p-hidroxifenil (H), guaiacil (G), e siringil (S),

respectivamente (BARROS et al., 2019; DOS SANTOS et al., 2019). A lignina está presente na

lamela média da parede vegetal e age como um cimento entre as células. Junto com as

hemiceluloses, ela forma uma matriz amorfa na qual as microfibrilas de celulose ficam

embebidas e protegidas da biodegradação (ADSUL et al., 2011). Além disso, a

macromolécula da lignina está ligada de forma cruzada com os carboidratos da parede

vegetal por ligações do tipo éter ou éster, e esta associação com os demais componentes é

que confere a maior parte da recalcitrância da parede vegetal (ADSUL et al., 2011).

Ao contrário da degradação de celulose e hemicelulose que libera açúcares

fermentescíveis, a degradação da lignina produz compostos fenólicos com diversas

aplicações de alto valor agregado, incluindo a produção de espuma, borracha, plástico,

adesivos e agentes aromatizantes da indústria de alimentos (MATHEWS; GRUNDEN;

PAWLAK, 2016). Por outro lado, a lignina e seus componentes influenciam negativamente a

hidrólise enzimática da fração (hemi)celulósica e a fermentação dos açúcares. Celulases,

como celobiohidrolase e β-glicosidase, são adsorvidas à estrutura da lignina de forma não

produtiva e são inibidas por ela. Seus compostos fenólicos são tóxicos para os

microrganismos, desestabilizando a membrana plasmática e a entrada de açúcares,

causando quebras no DNA, e inibindo a síntese de RNA e proteínas (KIM, 2018; DOS SANTOS

et al., 2019).

41

1.1.3.4 Bagaço de cana-de-açúcar

Com 641 milhões de toneladas moídas na safra de 2017/2018, o Brasil é o maior

produtor de cana e o segundo maior na produção de etanol (UNICA, 2019). Como mostrado

acima, 17 % da oferta interna de energia brasileira são gerados por produtos derivados da

cana, como o bagaço e a palha (EPE, 2018). Estima-se que a cada tonelada moída são

gerados 270-280 kg de bagaço (com 50 % de umidade) (ROCHA et al., 2012). A grande

maioria (cerca de 90 %) é queimada nas usinas para geração de eletricidade e calor (BASSO

et al., 2013; BUCKERIDGE; GRANDIS; TAVARES, 2019), mas estima-se que se o restante fosse

utilizado para produção do etanol 2G, haveria um aumento significativo no rendimento

deste combustível por hectare (de 6.000 para 8.200 litros) (BUCKERIDGE; GRANDIS;

TAVARES, 2019). O bagaço já é utilizado pelas duas usinas de etanol 2G brasileiras mas seu

potencial pode ser mais explorado para maior produção de etanol.

1.1.4 Desconstrução de biomassa vegetal por enzimas e proteínas acessórias

A reciclagem de carbono e nutrientes na biosfera é realizada por microrganismos

espalhados por todo o globo. Bactérias e fungos são os maiores especialistas desta tarefa,

ocupando diversas comunidades (rúmen de mamíferos e insetos, solo, ambiente marinho) e

formando várias relações ecológicas inter e intra-espécie (mutualismo, parasitismo,

comensalismo, competição) (AUER et al., 2017; BOMBLE et al., 2017). Como maiores

decompositores, as bactérias e fungos possuem uma capacidade inata de realizar a

conversão de biomassa lignocelulósica eficientemente através de basicamente duas

estratégias de sacarificação: celulossomo e por secreção de enzimas. O celulossomo é um

complexo multi-enzimático produzido por um grupo pequeno de bactérias anaeróbicas (por

exemplo, Clostridium thermocellum, Acetivibrio cellulolyticus, Pseudobacteroides

cellulosolvens), e sua estrutura pode estar aderida à parede celular das bactérias ou ser

liberada para o meio extracelular como um bloco enzimático. Acredita-se que esse complexo

altamente organizado e eficiente tenha surgido como uma resposta à limitação de energia

que essas bactérias têm em produzir proteínas (ARTZI; BAYER; MORAÏS, 2017). O sistema por

secreção de enzimas é realizado por fungos aeróbicos e bactérias, que produzem celulases,

hemicelulases e outros tipos de enzimas para o meio extracelular onde se encontra o

substrato recalcitrante. Devido à sua grande capacidade de produzir e secretar enzimas, os

42

fungos filamentosos dos filos Ascomycota (Trichoderma reesei, Aspergillus sp., Fusarium sp.,

Penicillium sp., Neurospora crassa) e Basidiomycota (Phanerochaete chrysosporium,

Oligoporus (Postia) placenta) são de fundamental importância biotecnológica e vêm sendo

estudados para domesticação de seu potential celulolítico e produção de químicos de alto

valor agregado (AMIN et al., 2017; BOMBLE et al., 2017; MARTÍNEZ et al., 2017).

De modo especial, os basidiomicetos são conhecidos por causarem dois tipos de

podridão de madeira: a branca e a marrom. As estratégias utilizadas em cada tipo de

podridão são diferentes, e vêm sendo utilizadas como base para o entendimento da

degradação da lignocelulose e, consequentemente, para a elaboração de coquetéis

enzimáticos eficientes. A podridão branca é realizada por 90 % dos basidiomicetos, e a

marrom por apenas 7 % (BOMBLE et al., 2017). Na podridão branca (por exemplo, P.

chrysosporium, P. carnosa, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus, Botrytis cinerea,

Stropharia coronilla, Trametes versicolor), a lignina é despolimerizada e mineralizada de

forma seletiva por ação de várias enzimas oxidativas, como lacases e peroxidases. Neste tipo

de podridão, a celulose é menos modificada que as frações da hemicelulose e lignina, por

isso o aspecto de cor branca. Os basidiomicetos de podridão branca são considerados

decompositores naturais de lignina. A podridão marrom (Gloephyllum trabeum, Coniophora

puteana, Postia placenta, Fomitopsis palustrisse) é caracterizada pela rápida

despolimerização de celulose e hemicelulose, enquanto que a lignina não é modificada de

forma significativa (AMIN et al., 2017; HERMOSILLA et al., 2018). Fungos desta podridão

utilizam a reação não enzimática de Fenton (H2O2 + Fe2+ + H+ → H2O + Fe3+ + •OH) para gerar

radicais livres que atacam os elementos da parede vegetal (BOMBLE et al., 2017). Por causa

do padrão de degradação, a madeira apresenta uma cor mais acastanhada e as fibras são

quebradas em fragmentos cúbicos. Acredita-se que os basidiomicetos desta podridão

tenham evoluído dos basidiomicetos de podridão branca, tendo perdido vários genes de

degradação de lignocelulose ao longo da evolução. Além disso, fungos de podridão marrom

são, de modo geral, mais especialistas no ataque de gimnospermas, enquanto que a

podridão branca é mais observada em angiospermas (AMIN et al., 2017; HERMOSILLA et al.,

2018; KRAH et al., 2018; KUMAR; KAMESHWAR; QIN, 2018; SHARMA; XU; QIN, 2019).

As ferramentas moleculares utilizadas por esses microrganismos para degradar

os elementos da lignocelulose consistem basicamente em enzimas, que são classificadas

pelo banco de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy) (http://www.cazy.org/), de

43

acordo com a similaridade de sequências, mecanismo catalítico e função (LOMBARD et al.,

2014). Segundo o CAZy, as enzimas são classificadas em: glicosil hidrolases (GHs), que fazem

a hidrólise e/ou transglicosilação de ligações glicosídicas com adição de uma molécula de

água, e representam quase metade (47 %) das enzimas classificadas no banco; esterases de

carboidrato (CEs), que removem grupamentos éster presentes nos mono, oligo e

polissacarídeos, e facilitam a ação das GHs; proteínas com atividade auxiliar (AAs), que

compreendem enzimas oxidativas; liases de carboidrato (PLs), que clivam as ligações

glicosídicas de polissacarídeos contendo ácido urônico; e proteínas com módulos de ligação

à carboidrato (CBMs) (LOMBARD et al., 2014). Os CBMs reconhecem especificamente os

polissacarídeos alvos, aproximam o domínio catalítico dos substratos insolúveis, criam

microrupturas nas microfibrilas de celulose e ainda aumentam a eficiência hidrolítica das

celulases (BERNARDES et al., 2019). O CAZy classifica ainda as glicosil transferases (GTs), mas

estas enzimas não atuam na sacarificação de biomassa, e sim na transferência de

grupamentos químicos entre elementos da parede celular dos microrganismos (LOMBARD et

al., 2014).

Como já supracitado, os elementos da lignocelulose devem ser fracionados e

despolimerizados a fim de liberar os açúcares fermentescíveis utilizados na produção do

etanol 2G. Assim, a lignina precisa ser modificada e/ou removida para permitir o acesso das

enzimas à celulose e hemicelulose. A seguir são apresentados os principais tipos de enzimas

envolvidas neste processo.

1.1.4.1 Celulases

A degradação da celulose pela via clássica envolve a ação sinérgica de três

classes de enzimas: endo-1,4-β-glucanase (EGL) (EC 3.2.1.4), celobiohidrolase (CBH) (EC

3.2.1.91; 3.2.1.176); β-glicosidase (BGL) (EC 3.2.1.21) (LOPES; FERREIRA FILHO; MOREIRA,

2018) (Figura 5). As EGLs iniciam a degradação da celulose clivando randomicamente

ligações glicosídicas em sítios localizados na região amorfa ao longo da cadeia de celulose

(Figura 5). Esse ataque promove uma rápida diminuição no grau de polimerização da

celulose e expõe novas extremidades das cadeias (KRICKA; FITZPATRICK; BOND, 2014). As

endoglucanases estão presentes nas famílias das GHs 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 45 e 74. São

também chamadas de CMCases por causa da hidrólise do substrato sintético Na-CMC

(carboximetilcelulose) (ANDLAR et al., 2018).

44

Figura 5. Modelo aceito de desconstrução da celulose por celulases (EGL, CBH, BGL), CDH e LPMO. EGLs iniciam a fragmentação das cadeias de celulose clivando as ligações glicosídicas na região amorfa e liberando celooligossacarídeos. CBHs atacam as extremidades redutoras (CBH1) e não-redutoras (CBH2) da celulose cristalina liberando celobiose que é clivada em duas moléculas de glicose por ação das BGLs. A LPMO aumenta a despolimerização da celulose oxidando as ligações glicosídicas após ter sido ativada pela transferência dos elétrons da CDH e/ou do ácido ascórbico, na presença de oxigênio ou peróxido de hidrogênio. CDH também pode oxidar celobiose (não mostrado) (ANDLAR et al., 2018).

45

As CBHs atacam progressivamente as extremidades redutoras (CBH1, GH7) e

não-redutoras (CBH2, GH6) da celulose geradas anteriormente pelas EGLs, iniciando sua

ação na extremidade da cadeia e continuando ao longo dessa até o seu final. Como produto,

as CBHs liberam oligossacarídeos e, principalmente, celobiose, um dissacarídeo de glicose

que inibe as celobiohidrolases (Figura 5). As CBHs produzidas pelo fungo T. reesei são

empregadas em coquetéis enzimáticos comerciais e correspondem em até 80% das

proteínas totais (ROSGAARD et al., 2007). Quanto a sua distribuição, estão presentes nas

famílias GHs 5, 6, 7, 9 e 48 (SEGATO et al., 2014; ANDLAR et al., 2018).

Por fim, as BGLs hidrolisam a ligação glicosídica β-1,4 da celobiose e de

oligossacarídeos para liberar unidades de glicose, diminuindo assim o produto da inibição

das CBHs (SEGATO et al., 2014) (Figura 5). As BGLs podem ser encontradas nas famílias das

GHs 1, 3, 5, 9, 30 e 116, mas a maioria das BGLs empregadas para hidrólise da celulose

pertence à família GH3 (KRICKA; FITZPATRICK; BOND, 2014; ANDLAR et al., 2018).

Além das celulases clássicas, celobiose desidrogenase (CDH) e LPMOs são outras

enzimas muito importantes para a despolimerização da celulose. As CDHs (EC 1.1.99.18) da

família AA3 oxidam celobiose a celobionolactona com o ganho de dois elétrons. Estes

elétrons são transferidos do domínio FAD (flavin adenine dinucleotide) da CDH para o grupo

heme do domínio do citocromo. A CDH reduz então as LPMOs através da doação de elétrons

para seu sítio ativo de Cu2+. As LPMOs agora reduzidas se tornam ativas e, na presença de

oxigênio molecular ou peróxido de hidrogênio, realizam a clivagem oxidativa das ligações

glicosídicas da celulose na posição do carbono C-1, C-4, e C-6 (SEGATO et al., 2014). Além

desse mecanismo de ativação, as LPMOs podem receber ainda os elétrons por sistemas não

enzimáticos, como compostos orgânicos de baixo peso molecular derivados da lignina e

fenóis da parede vegetal, e sistemas fotocatalíticos (clorofila, por exemplo) (CANNELLA et al.,

2016; FILIATRAULT-CHASTEL et al., 2019; LAURENT et al., 2019) (Figura 5). LPMOs ativas

contra celulose são encontradas nas famílias AA9, 10, 15 e 16, mas outros membros da

classe das LPMOs oxidam substratos não-celulósicos, como quitina (AA11), xilano (AA14) e

amido (AA13) (FORSBERG et al., 2019).

Uma característica em comum da maioria das celulases é a presença do

domínio CBM, que faz a ligação da celulose à superfície da celulose e facilita a hidrólise

desse polissacarídeo por aproximar o domínio catalítico ao substrato. A presença dos CBMs

é particularmente importante para o início e processividade das celobiohidrolases (TEERI et

46

al., 1998), que é essencial para degradar as regiões cristalinas da celulose (EIJSINK et al.,

2008).

1.1.4.2 Hemicelulases

Hemicelulases são enzimas que hidrolisam a cadeia principal das hemiceluloses,

removem as ramificações com os resíduos de açúcar e os grupamentos químicos, como

ácido ferúlico e O-acetil (SEGATO et al., 2014). O polissacarídeo do xilano e suas variações

(arabinoxilano na cana, por exemplo) são clivados por ação de endo-β-1,4-xilanases (EC

3.2.1.8) em pequenos xilooligossacarídeos, que são então hidrolisados em monômeros de

xilose por β-1,4-xilosidases (EC 3.2.1.37). Devido às ramificações e dos grupamentos

químicos ligados à cadeia do xilano, várias outras hemicelulases são necessárias para sua

despolimerização, como: acetil xilano esterase (EC 3.1.1.6, 3.1.1.72), feruloil esterase (EC

3.1.1.73), ρ-coumaril esterase (EC 3.1.1.73), α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) e α-

glucuronidase (EC 3.2.1.-). Estas enzimas são responsáveis por clivar grupos O-acetil,

resíduos de ácido ferúlico, ρ-coumaril, arabinose de ligações α-1,2, α-1,3 e α-1,5, e ácido

glucurônico de ligação α-1,2, respectivamente (SEGATO et al., 2014; ANDLAR et al., 2018;

LOPES; FERREIRA FILHO; MOREIRA, 2018). O xiloglicano é clivado por vários tipos de

enzimas, como endo-transglicosilase/hidrolase (EC 2.4.1.207), β-galactosidase (EC 3.2.1.23) e

α-fucosidase (EC 3.2.1.51, 3.2.1.63) específicas de xiloglicano, e α-xilosidase (EC 3.2.1.37).

O manano é o substrato de β-mananases e β-manosidases que liberam

oligossacarídeos e monômeros de manose, respectivamente, através da clivagem das

ligações β-1,4. Outras enzimas também são requeridas para hidrolisar as ramificações e

grupamentos químicos ligados à cadeia principal dos vários tipos de manano, como β-

glicosidase (EC 3.2.1.21), acetil manano esterase (EC 3.1.1.6) e α-galactosidase (EC 3.2.1.22).

A β-glicosidase cliva resíduos de glicose β-1,4 da extremidade não redutora dos

oligossacarídeos liberados do glicomanana e galactoglicomanano. Acetil manano esterase

remove os grupos acetil do galactoglicomanano, e a α-galactosidase cliva as unidades de

galactose α-1,6 ligadas às cadeias do galactomanano e galactoglicomanano (SEGATO et al.,

2014; LOPES; FERREIRA FILHO; MOREIRA, 2018).

De forma geral, as xilanases estão presentes nas famílias de GHs 5, 8, 10, 11, 30,

43 e 51, e as β-xilosidases, nas famílias 1, 3 (maioria), 30, 39, 43, 51, 52, 54, 116 e 120. As β-

mananases pertencem às famílias de GHs 5, 26 e 113, e as β-manosidases, às famílias 1, 2 e

47

5. As xiloglicanases estão presentes nas famílias de GHs 5, 9, 12, 16, 44 e 74 (VAN DEN

BRINK; DE VRIES, 2011; CAZY, 2019). A Figura 6 mostra um esquema simplificado das

enzimas envolvidas na hidrólise dos elementos da lignocelulose, e suas famílias classificadas

pelo banco de dados CAZy.

Figura 6. Degradação da celulose e hemicelulose por enzimas classificadas pelo CAZy. Devido à presença de um grande número de ramificações das cadeias e da composição mais heterogênea, a hemicelulose é despolimerizada pela ação de um número maior de enzimas que a celulose. Enquanto da celulose são liberados apenas monômeros de glicose, da hemicelulose são clivados xilose, arabinose, glicose, manose, dentre outros. Açúcares: X, xilose; A, arabinose; Gc, ácido glucurônico; M, manose. Hexágonos abertos, ácido ferúlio; círculos fechados, grupos acetil (SEGATO et al., 2014).

48

1.1.4.3 Enzimas envolvidas na degradação da lignina

A degradação da lignina – o componente mais recalcitrante da parede celular

vegetal – ocorre por uma reação oxidativa realizada principalmente por basidiomicetos de

podridão branca. A conversão da lignina é atribuída principalmente ao metabolismo

secundário, e não é realizada normalmente como fonte de carbono e energia. As principais

enzimas envolvidas são: lacases, peroxidases dependentes de manganês (MnP), peroxidases

de lignina (LiP), peroxidases versáteis (VP) e mais recentemente dye-decolorizing

peroxidases (DyP). As lacases e as peroxidases utilizam O2 e H2O2 como aceptores de

elétrons na oxidação dos elementos da lignina (ANDLAR et al., 2018).

As lacases (EC 1.10.3.2, AA1) oxidam compostos fenólicos e não-fenólicos. As LiPs

(EC 1.11.1.14, AA2) oxidam lignina por um mecanismo baseado na formação de radicais que

atacam compostos aromáticos não-fenólicos. Na presença de H2O2, as MnPs (EC 1.11.1.13,

AA2) oxidam o ion Mn2+ a Mn3+, que é altamente reativo e precisa ser estabilizado pela

quelação com oxalato ou malato. O complexo formado de Mn3+, agora quelado, consegue

então se difundir pela matriz lignocelulósica e atacar compostos fenólicos da lignina. As

MnPs conseguem também oxidar compostos não fenólicos através da peroxidação de

lipídeos que são gerados no processo de degradação da lignina. As VPs (EC 1.11.1.16, AA2)

combinam as especificidades pelos substratos das LiPs e MnPs, e são específicas para um

determinado substrato (CHEN; WAN, 2017; FALADE et al., 2017; ANDLAR et al., 2018). As

DyPs foram recentemente descobertas e são diferentes das peroxidases mencionadas

anteriormente, em termos de sequência de aminoácidos, estrutura terciária e resíduos

catalíticos. Estão presentes em fungos (principalmente de podridão branca) e bactérias, e

oxidam compostos derivados de lignina e corantes do tipo antraquinona (DUAN et al., 2018).

Ademais, a degradação da lignina pode ser aumentada com a participação de

outras enzimas oxidativas, como aril álcool oxidases (AAOs, EC 1.1.3.7, AA3), glioxilato

oxidase (GOx, EC 1.2.3.5), glicose 1-oxidase (EC 1.1.3.4, AA3). Estas enzimas catalisam

reações que geram peróxido de hidrogênio, que é utilizado pelas peroxidases para oxidar os

compostos da lignina ou participar da reação química de Fenton (ver adiante). Aril-álcool

desidrogenases fúngicas (AAD; EC 1.1.1.90), quinona redutases (QR, EC 1.6.99.2), tirosinases

(EC 1.14.18.1), catecol oxidases (EC 1.10.3.1) e CDH também estão envolvidas na

desconstrução da lignina (ANDLAR et al., 2018).

49

1.1.4.4 Disrupting proteins e degradação não-enzimática

Dadas as propriedades intrínsecas da matriz lignocelulósica, como recalcitrância

e composição heterogênea de açúcares, proteínas e sistemas não-enzimáticos também são

importantes na conversão da lignocelulose. As swoleninas de fungos e expansinas de origem

vegetal são exemplos de proteínas não-enzimáticas com capacidade de modificar a

superfície da celulose, tornando-a mais exposta e suscetível à ação de celulases (GUO et al.,

2017; LOPES; FERREIRA FILHO; MOREIRA, 2018). Como o próprio nome diz, as swoleninas

são proteínas que expandem os elementos da lignocelulose, e possuem um papel no

afrouxamento da parede vegetal, uma vez que quebram as pontes de hidrogênio entre os

polissacarídeos, desorganizando as microfibrilas de celulose e facilitando a entrada de água

na matriz (MCQUEEN-MASON; COSGROVE, 1994; VERMA et al., 2013). Recentemente, foi

demonstrado que swolenina aumenta a hidrólise de avicel (celulose microcristalina) quando

adicionada antes da aplicação de celulases (GUO et al., 2017), além de ter efeito sinérgico

com uma xilanase comercial na degradação de xilano (SANTOS et al., 2017).

Dentre os sistemas não-enzimáticos conhecidos, a reação química de Fenton e a

mediada por quelante têm recebido destaque ao longo dos últimos anos. Na podridão

marrom, por exemplo, as hifas dos fungos produzem e secretam oxalato em altas

concentrações no meio extracelular. Esta molécula atua como um forte agente quelante de

ferro em meio ácido próximo às hifas (pH ~2,0), solubilizando o ferro que se encontra

naturalmente nos tecidos vegetais na forma de óxido insolúvel. O complexo solúvel oxalato-

Fe3+ se difunde então para a matriz lignocelulósica, distante da hifa. Neste microambiente, a

quantidade de oxalato disponível é menor e o pH maior (pH ~4,5), fazendo com que o íon

Fe3+ seja sequestrado e reduzido a Fe2+ por agentes redutores/quelantes de ferro de maior

afinidade, como moléculas de baixo peso molecular (derivados de fenolato e hidroquinona,

e glicopeptídeos) e proteínas e enzimas de homeostase de ferro produzidas pelo fungo

(ferroxidases, permeases e redutases de ferro, quinona redutases e transportador de

quinato) (KAMESHWAR; QIN, 2018). Finalmente, o íon ferroso reage com peróxido de

hidrogênio – que pode ser produzido por oxidases das famílias AA2 e AA3, por exemplo – e

forma radicais hidroxil (•OH) que atacam a matriz lignocelulósica. Esta hipótese é bastante

aceita e satisfaz a premissa de que esses radicais devem ser produzidos a certa distância da

hifa para que o próprio fungo não seja prejudicado (ARANTES et al., 2011; ARANTES;

JELLISON; GOODELL, 2012; ANDLAR et al., 2018).

50

1.1.5 Trichoderma reesei 1.1.5.1 Aspectos gerais e desenvolvimento de cepas hipercelulolíticas

T. reesei é um fungo filamentoso, mesofílico e saprofítico que cresce

aerobicamente sobre biomassa vegetal morta, entre outros substratos. Taxonomicamente é

classificado como da divisão Ascomycota, classe Sordariomycetes, ordem Hypocreales,

família Hypocreaceae e gênero Trichoderma. Até o momento, são conhecidas mais de 200

espécies desse gênero, sendo a maioria saprofítica (SCHUSTER; SCHMOLL, 2010; MUKHERJEE

et al., 2013). Existem algumas espécies de patógenos de plantas e cogumelos (T. koningii),

bem como espécies que se alimentam de outros fungos (T. viride, T. harzianum e T.

atroviride) (SCHUSTER; SCHMOLL, 2010). Dentre as várias aplicações destas espécies, pode-

se citar controle biológico e produção de enzimas para as indústrias têxtil, de alimentos e de

biocombustíveis (KUNAMNENI et al., 2014; PURANEN; ALAPURANEN; VEHMAANPERÄ, 2014;

DE PAULA et al., 2018a). Para se ter uma ideia da importância econômica e industrial deste

fungo, dentre todas as hemicelulases e celulases produzidas mundialmente, 22,7 e 26,9 %

são provenientes da espécie T. reesei, respectivamente (BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016).

T. reesei é utilizado para produção de celulases e hemicelulases nativas, mas

também para produção de proteínas heterólogas. T. reesei tem servido como fungo modelo

para estudos da degradação de lignocelulose, sendo que diversas das primeiras celulases e

hemicelulases identificadas e caracterizadas são provenientes dele (SHOEMAKER et al.,

1983; PENTTILÄ et al., 1986; TEERI et al., 1998). Adicionalmente, T. reesei também é utilizado

como plataforma industrial para produção de lipases, proteases, amilases e outras enzimas

de alto valor (BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016).

T. reesei foi isolado originalmente nas Ilhas Salomão, na Segunda Guerra

Mundial, em 1944, colonizando barracas de algodão e roupas do exército americano (SEIDL

et al., 2008). O isolado foi identificado inicialmente como T. viride e a cepa nomeada como

QM6a (MANDELS; REESE, 1957). Mais tarde, esta cepa foi reconhecida como sendo diferente

da espécie T. viride, sendo então reclassificada como T. reesei em homenagem ao

pesquisador Elwyn T. Reese (BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016).

Em um período de aumento do preço dos combustíveis fósseis e necessidade de

estimular fontes alternativas de energia, o poder celulolítico de T. reesei QM6a atraiu a

atenção dos pesquisadores da época, dando início a programas de desenvolvimento de

51

mutantes mais hipercelulolíticos com aplicação industrial (PAYNE et al., 2015). Estes

programas estavam espalhados em centros de pesquisa, universidades e empresas, como o

Laboratório Natick, a Universidade Rutgers, e a empresa Cetus Corporation, nos EUA.

As primeiras cepas melhoradas – QM9413 e QM9414 – foram obtidas a partir da

parental QM6a após radiação por aceleração linear. Foi observado que a cepa QM9414

produz duas vezes mais celulases que a QM9413, e foi utilizada no laboratório americano

Natick para desenvolvimento da cepa MCB-77. Esta possui o triplo da produtividade

volumétrica de celulase quando comparada com a cepa QM9414 (90 contra 30 IU/L/h). Na

Universidade Rutgers (por isso a sigla ‘RUT’), a cepa QM9414 foi também melhorada através

de irradiação por UV seguida do tratamento químico com N-nitroguanidina (NTG), dando

origem às cepas M-7 (e outros mutantes da série M) e NG-14, respectivamente.

Montenecour e Eveleigh obtiveram então a cepa industrial RUT C30 a partir da NG-14,

induzindo mutações por UV e realizando a seleção dos mutantes com alta atividade

celulolítica e resistência ao metabólito 2-deoxiglicose. O mutante obtido produz duas vezes

mais proteína extracelular em relação à cepa NG-14, chegando a produzir 30 g/L de proteína

em fermentação industrial utilizando lactose como fonte de carbono (MONTENECOURT;

EVELEIGH, 1977, 1979; EVELEIGH, 1982; FITZ; WANKA; SEIBOTH, 2018). Além disso, RUT C30

possui de quatro a seis vezes mais atividade de BGL que a cepa parental QM6a (PAYNE et al.,

2015). Na década de 80, outras iniciativas também deram origem a outras cepas de T. reesei,

a exemplo dos programas desenvolvidos nos laboratórios do VTT (Finlândia) e Cayla

(França), e na empresa Kyowa Hakko Kogyo (Japão) (PAYNE et al., 2015) (Figura 7).

52

Figura 7. Mutagênese e seleção das cepas mutantes de Trichoderma reesei. Após o isolamento da cepa parental QM6a na Segunda Guerra Mundial, vários programas de desenvolvimento de cepas hipercelulolíticas foram iniciados. UV: radiação por luz ultra-violeta; NTG: N-nitroguanidina (PAYNE et al., 2015).

A cepa RUT-C30 é uma das principais cepas industriais destinadas à produção de

celulases. Atualmente, é utilizada como um chassi genético para desenvolvimento de novas

cepas industriais, e tem sido alvo de extensa pesquisa na área de conversão de biomassa e

produção de biocombustíveis e produtos de alto valor agregado (DRUZHININA; KUBICEK,

2017). Com o avanço das ténicas de biologia molecular e sequenciamento em larga escala,

foi possível demonstrar que o fenótipo hipercelulolítico da cepa industrial RUT-C30 é

atribuído, de forma considerável, ao truncamento do gene cre1, principal responsável pela

ativação da repressão catabólica por carbono (RCC). Esta resposta ocorre na presença de

açúcares prontamente metabolizáveis (glicose, por exemplo), que reprimem a síntese de

enzimas de catabolismo energético e asseguram assim a utilização preferencial da fonte de

carbono menos custosa energicamente. Dessa forma, a célula economiza energia ou pode

utilizá-la para realizar outros processos biológicos (ILMÉN; THRANE; PENTTILÄ, 1996;

RUIJTER; VISSER, 1997; PORTNOY et al., 2011a).

Além do truncamento de cre1, a cepa RUT-C30 possui também uma mutação no

gene gls2α da subunidade alpha da glicosidase II envolvida na glicosilação protéica (GEYSENS

et al., 2005) e uma deleção de 85 kb no genoma, que eliminou 29 genes em relação à cepa

QM6a, como transportadores, fatores de transcrição (FTs) e enzimas do metabolismo

primário (SEIDL et al., 2008). A análise da glicômica da cepa RUT-C30 mostrou evidências de

que as hidrolases extracelulares têm um perfil atípico de glicosilação não visto na glicômica

53

da parental QM6a (PETERSON; NEVALAINEN, 2012), causada pela mutação no gene gls2α,

específica das cepas RUT-C30 e NG14 (STALS et al., 2004; GEYSENS et al., 2005).

Ao longo dos últimos anos, as linhas de pesquisa com T. reesei têm focado

principalmente na exploração de seu potencial biotecnológico para produzir enzimas de

degradação de lignocelulose e identificação de novos reguladores transcricionais para maior

expressão dessas enzimas. Outros estudos, porém, abordam outras temáticas interessantes,

como metabolismo secundário, bioremediação e novas estratégias de manipulação gênica. A

seguir, um breve resumo dos tópicos recentemente investigados com as referências dos

trabalhos (Tabela 2).

Tabela 2. Principais tópicos investigados e estudos recentes com T. reesei.

Tópicos investigados Referências

Uso de substratos de baixo custo (palha e farelo de trigo, bagaço de cana) para produzir CAZymes

(DEY et al., 2018) (ELLILÄ et al., 2017) (JIANG et al., 2017) (BORIN et al., 2015)

Identificação e caracterização de novos reguladores transcricionais e transportadores associados à

degradação de lignocelulose

(HITZENHAMMER et al., 2019) (WANG et al., 2019a)

(NOGUEIRA et al., 2018) (BENOCCI et al., 2018)

(CAO et al., 2017) (DERNTL et al., 2017)

(LIU et al., 2017)

Descoberta de novos indutores da expressão de celulases

(DARANAGAMA et al., 2019) (CHEN et al., 2019)

(XIA; YANG; XIA, 2018a) (HUANG; WAGES, 2016)

(SATYAMURTHY et al., 2016)

Padrão de glicosilação e sua influência na eficiência catalítica de enzimas

(WANG et al., 2019b) (RANAEI SIADAT; MOLLASALEHI;

HEYDARZADEH, 2016)

Sistema de ativação de enzimas oxidativas (LPMOs) por transferência de elétrons catalisada enzimaticamente

(celobiose desidrogenase)

(SILVA; LOPES, 2018) (WANG; LU, 2016)

Influência do engenheiramento de fatores de transcrição e promotores sobre a produção de celulase

(ZHANG et al., 2018a) (KIESENHOFER; MACH; MACH-

AIGNER, 2018) (RASSINGER et al., 2018) (HIRASAWA et al., 2018) (XIA; YANG; XIA, 2018b)

54

(Continuação)

Ferramentas de manipulação gênica (CRISPR-Cas9, iRNA)

(RANTASALO et al., 2019) (HAO; SU, 2019)

(RANTASALO et al., 2019) (HAO; SU, 2019)

(WANG et al., 2018a) (ZHANG et al., 2018b)

(LIU et al., 2015) (OUEDRAOGO et al., 2015)

Influência da luz sobre a expressão e produção de celulases

(SCHMOLL, 2018a) (SCHMOLL, 2018b)

(STAPPLER et al., 2017) (BAZAFKAN et al., 2017b) (BAZAFKAN et al., 2017a)

Sinalização celular mediada por cátions (Ca2+, Mn2+), cAMP e MAP quinases

(MARTINS-SANTANA et al., 2019) (CHEN et al., 2018)

(WANG et al., 2018b) (DE PAULA et al., 2018b)

(NGUYEN et al., 2016) (CHEN et al., 2015)

(NOGUEIRA et al., 2015)

Redes gênicas (BORIN et al., 2018) (HORTA et al., 2018)

Produção de metabólitos secundários (FRISVAD et al., 2018) (LI et al., 2018)

(BANSAL; MUKHERJEE, 2016) (ATANASOVA et al., 2013)

Bioremediação de compostos tóxicos (HASSAN NAZIFA et al., 2018) (YAO et al., 2015)

(TENG et al., 2015)

1.1.5.2 Enzimas descontrutoras da parede celular vegetal

Recentemente, as sequências dos genomas de T. reesei QM6a e da linhagem

RUT-C30 foram disponibilizadas e comparadas. Cada genoma contém 9.129 (MARTINEZ et

al., 2008) e 9.852 genes (KOIKE et al., 2013), respectivamente, e até o momento foram

anotadas 240 enzimas descontrutoras de polissacarídeos em T. reesei QM6a (JGI, 2019a), e

239 para RUT-C30 (JGI, 2019b). Desse total, 200 e 199 genes são de GHs para QM6a e RUT-

C30, respectivamente. Ambas as cepas possuem ainda 22 genes de CEs, 5 PLs e 13 AAs (JGI,

2019a, 2019b). T. reesei QM6a produz pelo menos duas celobiohidrolases (CBH1/CEL7A e

CBH2/CEL6A), cinco endoglucanases (EG1/CEL7B, EG2/CEL5A, CEL5B, EG3/CEL12A, EG45/

CEL45A), duas β-glicosidases já caracterizadas (BGL1/CEL3A e BGL2/CEL1A) e mais cinco

preditas (CEL3B, CEL3D, CEL1B, CEL3C, CEL3E) (HÄKKINEN et al., 2012). As CBHs e EGs podem

55

compor juntas até 90 % do número total de enzimas secretadas, sendo que CBH1 e CBH2

constituem até 60 % e 20 % desse total, respectivamente (RAHMAN et al., 2009). As BGLs

representam apenas 1 % do total de enzimas secretadas (MARGEOT et al., 2009). Além

dessas celulases, estão presentes outras proteínas envolvidas com a degradação de celulose,

como a swolenina (SALOHEIMO et al., 2002), hidrofobinas (KUBICEK et al., 2008) e LPMOs da

família AA9, citadas anteriormente (HÄKKINEN et al., 2012).

O genoma de T. reesei possui ainda vários genes de hemicelulases, incluindo

cinco endo-1,4-β-xilanases (XYN1, 2 e 5, GH11; XYN3, GH10; XYN4, GH30), uma mananase

(MAN1, GH5), uma acetilxilano esterase caracterizada (AXEI, CE5) e outra predita (AXEII,

CE5), uma acetil esterase (AES1, CE16), uma α-glucuronidase (GLRI, GH67), uma

arabinofuranosidase caracterizada (ABFI, GH54) e duas preditas (ABFII, GH62; ABFIII, GH54),

três α-galactosidases (AGLI, GH27; AGLII, GH36; AGLIII, GH27) e uma β-xilosidase (BXLI, GH3)

(MARTINEZ et al., 2008; HÄKKINEN et al., 2012; CAZY, 2019). Esterases de carboidratos da

família CE15 também têm um papel na degradação da lignocelulose. T. reesei codifica, por

exemplo, uma glucuronoil esterase (CIP2, CE15) que ajuda na dissociação da lignina da

hemicelulose pela clivagem de ligações covalentes entre estes dois elementos da parede

(FOREMAN et al., 2003; LI et al., 2007; BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016).

1.1.5.3 Principais reguladores das enzimas lignocelulolíticas

A regulação da expressão gênica das CAZymes ocorre a nível transcricional de

modo coordenado e é dependente da presença de indutores (KUBICEK, 2013). Foi

demonstrado que uma variedade de açúcares induz a produção de celulases e

hemicelulases, como soforose, celobiose, xilose, xilobiose, xilo-oligossacarídeos, arabitol,

galactose e lactose (ILMÉN et al., 1997; STRICKER; MACH; DE GRAAFF, 2008), além de outras

moléculas recentemente descobertas, como éster de soforose, N,N-dimetilformamida e

trichodermapepsina (HUANG; WAGES, 2016; CHEN et al., 2019; DARANAGAMA et al., 2019)

(Tabela 2). Dentre estes açúcares, a soforose é considerada o principal indutor natural de

celulases, sendo formada durante a hidrólise de celulose através de uma reação de

transglicosilação (ZOU et al., 2018). Na presença de indutores, a regulação é feita por FTs

específicos que se ligam à região promotora, ativando ou inibindo a expressão de genes que

codificam celulases, hemicelulases e outras CAZymes.

56

Recentemente novos FTs e outros reguladores transcricionais foram

identificados em T. reesei (Tabela 2), mas até o momento os mais específicos da regulação

de celulases e hemicelulases são os ativadores XYR1, ACE2 e ACE3, e os repressores CRE1 e

ACE1. RXE1 foi recentemente identificado e apesar de outros estudos serem necessários

para revelar seu completo regulon6 gênico, trata-se de um FT aparentemente específico de

celulases e hemicelulases (WANG et al., 2019a). O complexo HAP2/3/5, a metiltransferase

LAE1 e os FTs XPP1 e PAC1 também influenciam a expressão destas enzimas, mas são

considerados reguladores globais da transcrição gênica por seus alvos não terem função

exclusivamente associada à desconstrução de biomassa (HÄKKINEN et al., 2014; BISCHOF;

RAMONI; SEIBOTH, 2016; SHIDA; FURUKAWA; OGASAWARA, 2016).

1.1.5.3.1 Reguladores específicos da expressão de CAZymes

XYR1 (xylanase regulator 1) é o ativador transcricional mais importante dos

genes que codificam celulases e hemicelulases, dentre eles xyn1, xyn2, bxl1, cbh1, cbh2,

egl1, abf2 e bgl1 (PORTNOY et al., 2011b; CASTRO et al., 2014). Trata-se de um FT do tipo

Zn(II)₂Cys₆ que se liga a motivos arranjados de forma repetida e invertida espaçados uns dos

outros com uma distância de 10 a 12 bases na região promotora de xyn1 e xyn2 (RAUSCHER

et al., 2006). Mais recentemente, o motivo de ligação 5’-GGCWWW-3’ (onde W pode ser as

bases nitrogenadas adenina ou timina) foi proposto e comprovado como sequência

consenso de XYR1 (FURUKAWA et al., 2009; SILVA-ROCHA et al., 2014). Ortólogos deste gene

também foram encontrados em outros fungos desconstrutores de biomassa

desempenhando papel semelhante, como XlnR em A. niger (VAN PEIJ; VISSER; DE GRAAFF,

1998) e XLR-1 em N. crassa (SUN et al., 2012). Foi demonstrado que a deleção de xyr1 cessa

a indução de celulases e hemicelulases na presença de celulose e soforose, e prejudica a

indução de hemicelulases envolvidas na degradação de xilano e arabinano, destacando seu

papel essencial na indução desses genes (STRICKER; MACH; DE GRAAFF, 2008; AKEL et al.,

2009). A expressão de xyr1 é regulada transcricionalmente pelo repressor catabólico CRE1

(PORTNOY et al., 2011a) e pelo FT ACE1 na presença de glicose e xilose (SALOHEIMO et al.,

2000; ARO et al., 2003). Apesar de análises feitas in silico predizendo sítios de ligação para

6 Definido como um conjunto de genes sujeito à regulação de um ou mais reguladores, cujo efeito pode ou não

ser o mesmo para o mesmo FT (REGULONDB, 2019). Em T. reesei, por exemplo, XYR1 ativa a transcrição de vários genes ao mesmo tempo na presença de celulose, incluindo celulases, transportadores de açúcar e outros FTs. Assim, XYR1 ativa seus alvos como se todos fizessem parte de um grande “bloco” de genes.

57

esses reguladores (RIES, 2013), não foi confirmada experimentalmente a ligação deles no

promotor de xyr1.

Analisando possíveis reguladores da transcrição de cbh1, ARO e colaboradores

(2001) identificaram ACE2 como sendo uma proteína ativadora de celulases que se liga a um

motivo encontrado no promotor deste gene. Este motivo também é reconhecido por XYR1

(FURUKAWA et al., 2009), o que sugere uma interação desses dois fatores em mediar a

expressão gênica de enzimas hidrolíticas. Além de cbh1, ACE2 também regula positivamente

outros genes de enzimas na presença de celulose, como cbh2, egl1, egl2, bgl2 e xyn2 (ARO et

al., 2003; VERBEKE et al., 2009). Foi demonstrado que a deleção de ace2 diminuiu a

transcrição das principais celulases cbh1, cbh2, egl1 e egl2, e reduziu de 30 a 70 % a

atividade celulolítica de T. reesei quando crescido em celulose (ARO et al., 2001). Ademais, a

superexpressão de ace2 aumentou as atividades enzimáticas de celulase e hemicelulase, e

também a expressão de seis outros reguladores hipotéticos (dois FTs do tipo Zn(II)₂Cys₆,

duas proteínas com domínio WD40, uma proteína com bromodomain e uma

acetiltransferase GCN5-related) (BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016). Juntamente com o

repressor ACE1, acredita-se ainda que ACE2 faça a fina regulação da expressão de xyr1 em T.

reesei (MACH-AIGNER et al., 2008; STRICKER et al., 2008).

Recentemente, ACE3 foi identificado como mais um regulador positivo da

expressão de celulases e hemicelulases. HÄKKINEN e colaboradores (2014) verificaram que a

atividade celulolítica de CBH1 e EGL1 de T. reesei aumentou significativamente quando

superexpressaram ace3. De modo inverso, a deleção desse gene levou à drástica redução da

atividade e expressão de celulases e hemicelulases, o que apoia o papel de ACE3 como

grande indutor dessas enzimas (HÄKKINEN et al., 2014).

A regulação da expressão de celulases e hemicelulases é alvo da RCC mediada

pela proteína CRE1. CRE1 e seus ortólogos em outros fungos filamentosos são FTs do tipo

Cys₂His₂ de grande importância para o metabolismo energético da célula. Este FT atua

basicamente de três formas: 1) reprimindo diretamente seus genes alvo pela ligação ao sítio

5’-SYGGRG-3 (onde S pode ser guanina ou citosina; Y, citosina ou timina; R, adenina ou

guanina) presente na região promotora; 2) reprimindo o principal ativador de enzimas

celulolíticas XYR1, na presença de glicose; e 3) reposicionando os nucleossomos e mudando

a conformação da cromatina de regiões regulatórias (MELLO-DE-SOUSA et al., 2014).

Dependendo da fonte de carbono utilizada, o regulon de CRE1 é composto de genes de

58

degradação de polissacarídeos da parede vegetal, transportadores de açúcar e nitrogênio,

proteínas oxidativas e proteínas de remodelamento da cromatina (PORTNOY et al., 2011a;

RASSINGER et al., 2018).

Apesar da deleção completa de cre1 para aumentar a transcrição e produção de

celulases ser atrativa, não se trata de uma estratégia válida em termos de aplicação

industrial. CRE1 é um FT com múltiplos genes alvo, e sua deleção causa efeitos pleiotrópicos,

reduzindo de forma severa seu crescimento (MELLO-DE-SOUSA et al., 2016). O gene cre1

truncado na cepa RUT-C30, por outro lado, é mais vantajoso e foi demonstrado que seu

produto de 96 aminoácidos ainda é capaz de se ligar ao DNA, aumentando a produção de

celulase em T. reesei (MELLO-DE-SOUSA et al., 2014). Uma das razões para esse aumento é a

abertura da cromatina mediada por CRE1 truncado, que torna os promotores acessíveis

mesmo na presença de glicose (MELLO-DE-SOUSA et al., 2014).

Por último, ACE1 é outro regulador negativo de celulases e hemicelulases. ACE1

possui três zinc fingers do tipo Cys₂His₂ e pode se ligar aos motivos 5’-AGGCA-3’ e 5’-

GGCTAA-3’ encontrados na região promotora dos seus genes alvos (SHIDA; FURUKAWA;

OGASAWARA, 2016). Em celulose, a deleção de ace1 resultou no melhor crescimento de T.

reesei devido ao aumento na produção de celulase. Na presença de celulose e soforose, a

deleção de ace1 mostrou uma maior expressão de celulases (cbh1, cbh2, egl1 e egl2) e

hemicelulases (xyn1 e xyn2). ace1 é transcrito na presença de diferentes fontes de carbono e

é independente de ACE2 e da RCC, embora 11 supostos sítios de ligação para CRE1 tenham

sido encontrados dentro da sua região promotora (ARO et al., 2003). Além disso, seus

ortólogos caracterizados apontam para um papel mais genérico de ACE1. O ortólogo stzA de

A. nidulans, por exemplo, está relacionado com a resposta a estresses abióticos, como altas

concentrações de NaCl e arginina, e exposição à radiação UV (SHIDA; FURUKAWA;

OGASAWARA, 2016).

1.1.5.3.2 Outros reguladores transcricionais

O complexo HAP2/3/5 (heme activator protein) é formado pelas subunidades

HAP2, HAP3 e HAP5, que modulam a expressão de vários genes, incluindo os genes de

acetamidase (amdS) e biossíntese de penicilina em A. nidulans, glutamato desidrogenase em

N. crassa, celulases e hemicelulases em T. reesei (SHIDA; FURUKAWA; OGASAWARA, 2016).

HAP2/3/5 liga-se à sequência 5’-CCAAT-3’ na região promotora de vários genes, como cbh1,

59

cbh2, xyn1 e xyn2 (LIU et al., 2008), e acredita-se que esse complexo aumente a transcrição

gênica pelo remodelamento da cromatina (ZEILINGER et al., 2003; RIES, 2013).

Outro regulador global da expressão gênica de T. reesei é a metiltransferase

LAE1. Trata-se de um regulador positivo da expressão de celulases, hemicelulases e outras

CAZYmes, que também modula genes de metabolismo secundário encontrados em clusters

gênicos (BISCHOF; RAMONI; SEIBOTH, 2016). Analisando a expressão gênica do mutante

Δlae1, SEIBOTH e colaboradores (2012) verificaram uma significativa diminuição da

expressão de várias celulases (CBHs, EGLs e BGLs), hemicelulases (xilanase,

arabinofuranosidase, manosidase, galactosidase), e proteínas acessórias e oxidativas (CIP1,

swolenina, LPMOs da família AA9). Por outro lado, a superexpressão de lae1 levou a um

aumento significativo na transcrição de celulases (SEIBOTH et al., 2012).

O metabolismo secundário também é regulado pelo FT XPP1, que atua como

uma espécie de “interruptor” dos metabolismos primário e secundário. Na presença de

glicose e xilose, a deleção de xpp1 aumenta as atividades xilanolíticas e a expressão das

xilanases xyn1, xyn2 e bxl2, mas não tem influência na expressão de celulases (cbh1 e egl1).

XPP1 reduz ainda a secreção de pigmentos de metabolismo secundário em CMC, lactose e

glicose. Dessa forma, XPP1 é um regulador negativo do metabolismo secundário e um

repressor específico de xilanases (DERNTL et al., 2015a, 2017).

Alterações de pH também afetam diretamente o tipo e quantidade de proteínas

secretadas por fungos filamentosos. Os fungos se adaptam a essas alterações ativando uma

via de transdução de sinal modulada por PAC1 e outras seis proteínas conhecidas como

“pal”. PAC1 é um FT do tipo zinc finger envolvido na regulação da expressão e produção de

celulases, e também no crescimento vegetativo de T. reesei. A deleção de pac1 aumenta a

atividade enzimática e expressão das principais celulases (cbh1, egl1, bgl1), e a secreção de

proteínas extracelulares em pH neutro (6,5). Curiosamente, sua deleção também levou a um

aumento na expressão de xyr1 e ace2, mas não de ace1, sugerindo uma rede de regulação

intrincada com vários reguladores participantes (HE et al., 2014). A análise transcricional do

mutante Δpac1 revelou ainda um grande número de genes responsivos à mudança de pH,

incluindo celulases, hemicelulases, transportadores e proteínas de sinalização celular

(HÄKKINEN et al., 2015).

Mais recentemente, outro FT do tipo Cys2His2 foi identificado como ativador da

expressão de celulases e hemicelulases, e também como modulador da expressão de xyr1.

60

Utilizando uma estratégia knockdown por RNAi, WANG e colaboradores (2018a) observaram

vários efeitos negativos após o silenciamento do gene xre1 (regulator 1 of xyr1 expression),

como severa redução de conídios, diminuição de atividade celulolítica e xilanolítica, e

também da expressão de vários genes importantes, como celulases (cbh1, egl1 e bgl1),

xilanases (xyn1 e xyn2) e ativadores transcricionais (xyr1 e vel1). A análise de

imunoprecipitação de cromatina (ChIP) também revelou uma redução significativa da

ocupação dos promotores de celulases pelo ativador XYR1 (WANG et al., 2019a). Estudos in

vivo e in silico são necessários para demonstrar os sítios de ligação de RXE1 à região

promotora de XYR1, mas os resultados observados colocam RXE1 como mais um modulador

da expressão de XYR1 ao lado de CRE1, CRZ1 e ACE1 (CHEN et al., 2016a; WANG et al.,

2019a).

A fim de se ter uma visão geral dos mecanismos moleculares relacionados à

regulação da transcrição de genes de resposta a açúcares simples e complexos, a Figura 8

apresenta um esquema simplificado com os principais FTs e outros reguladores de T. reesei.

Apesar do vasto conhecimento científico gerado por extensa pesquisa na área, a rede

regulatória de T. reesei e de outros fungos não é totalmente elucidada. A identificação e

caracterização destes genes são cruciais para o desenvolvimento de novas cepas

hipercelulolíticas de T. reesei através de engenharia genética, e diversas abordagens

moleculares têm sido empregadas neste sentido (DRUZHININA; KUBICEK, 2017).

61

Figura 8. Esquema simplificado dos componentes da rede regulatória complexa de T. reesei. Na presença de celulose, di ou monossacarídeos, açúcares são internalizados por ação de transportadores de membrana. No meio intracelular, moléculas indutoras (soforose, celobiose e celotriose) e repressoras (glicose) ativam então a transcrição de reguladores positivos (XYR1, ACE2, ACE3, complexo HAP2/3/5, LAE1 e componentes VELVET) e negativos (CRE1 e ACE1), respectivamente. Estes reguladores transcricionais modulam a expressão de celulases, hemicelulases, proteínas não hidrolíticas, transportadores e outros FTs envolvidos na resposta celular (GUPTA et al., 2016).

62

1.1.5.3 Rede de co-expressão gênica

O microambiente celular é um sistema biológico complexo formado por

interações entre vários genes e proteínas. Estas interações são coordenadas por elementos

regulatórios de ajuste fino envolvidos em inúmeros processos celulares, como síntese

proteica, reparo de DNA e vias metabólicas. Redes de co-expressão gênica têm se mostrado

uma importante ferramenta para detectar e quantificar estas interações, e são compostas

por nós (genes) e arestas7 (interações) (GYSI et al., 2018). A construção destas redes permite

unir os dados massivos gerados pelas várias “ômicas” e identificar genes funcionalmente

relacionados sendo corregulados frente a uma determinada condição (VINKO, 2013).

Na rede de co-expressão gênica, parte-se do pressuposto de que genes

envolvidos na mesma resposta celular – degradação da parede celular vegetal, por exemplo

– apresentam o mesmo perfil de expressão gênica e podem estar altamente conectados

entre si formando módulos (clusters). Este tipo de análise fornece “pistas” de quais genes (e

consequentemente seus produtos) estão sendo recrutados para que o microrganismo se

adapte àquelas condições nas quais está inserido. Espera-se então que genes de função

desconhecida ou ainda não caracterizada sejam co-expressos com genes de função

conhecida no mesmo módulo, abrindo perspectivas para a identificação e caracterização de

novos genes alvos. Vale ressaltar que outras análises in silico, como a predição de elementos

regulatórios nos promotores, podem também complementar as redes gênicas, contribuindo

para que as conclusões baseadas nestes dados sejam mais precisas e próximas da realidade.

No caso de T. reesei, a construção da rede de co-expressão gênica pode desvendar genes

ainda não estudados quanto a sua relação na resposta do fungo frente a uma biomassa

vegetal, mas com grande potencial a ser explorado. O aumento da eficiência de coquetéis

enzimáticos já disponíveis e o desenvolvimento de um personalizado para biomassa de cana

seriam algumas das contribuições esperadas após a caracterização desses novos alvos.

Até o momento, são escassos os trabalhos explorando redes de co-expressão

gênica em T. reesei. HORTA e colaboradores (2018), por exemplo, investigaram o

transcriptoma e exoproteoma de T. reesei QM9414, T. harzianum e T. atroviride crescidos

em celulose e glicose. Baseados na construção de uma rede de co-expressão com os genes

diferencialmente expressos (DEGs) e as proteínas secretadas, os autores encontraram um

conjunto de 80 genes sendo compartilhados entre as três espécies em celulose. Este 7 Também chamadas de links ou edges.

63

conjunto de genes representaria então um sistema comum de degradação de celulose

(HORTA et al., 2018). Em outro trabalho, DOS SANTOS CASTRO e colaboradores (2014)

realizaram o RNA-Seq de T. reesei QM9414 crescido em soforose, celulose e glicose, e

encontraram vários DEGs exclusivos em cada uma das três fontes de carbono. A partir da

rede construída com os 2.060 DEGs identificados, foi possível verificar que 75 e 107 genes

foram regulados especificamente em soforose e celulose, respectivamente (DOS SANTOS

CASTRO et al., 2014). Anteriormente, VINKO (VINKO, 2013) também havia utilizado a

estratégia de inferir rede gênica a partir de dados de transcriptoma para identificar novos

genes alvo em T. reesei. Neste estudo, 95 candidatos de reguladores de celulase foram

identificados, mas não foram caracterizados.

A inferência de redes gênicas em outros fungos filamentosos também não é

extensa, mas alguns trabalhos ilustram bem a importância da construção das redes de co-

expressão e seu poder de predizer funções de genes ainda não caracterizados.

Recentemente, SCHÄPE e colaboradores (2019) realizaram um extenso trabalho de predição

da função de proteínas desconhecidas em A. niger. Os autores realizaram uma meta-análise

de 283 arquivos de dados de microarray abrangendo 155 condições de cultivo de A. niger. A

rede de co-expressão pôde predizer a função de aproximadamente metade (2.970) de um

total de aproximadamente 6.000 genes hipotéticos, sendo que alguns deles foram validados

e confirmados experimentalmente quanto à produção de metabólitos secundários (SCHÄPE

et al., 2019). MUSUNGU e colaboradores (2016) investigaram a resposta de milho à infecção

por A. flavus através de RNA-Seq, e encontraram módulos de co-expressão agrupando vários

genes de resposta em ambas as espécies. De modo similar, redes gênicas também foram

inferidas para a interação entre o patógeno Botrytis cinerea e tomate (VEGA et al., 2015),

Fusarium graminearum e trigo (GUO et al., 2016), e Candida albicans e células dendríticas de

camundongo (TIERNEY et al., 2012).

A metodologia adotada para construção das redes também é importante, e

atualmente uma série de pacotes estão disponíveis, como Weighted Gene Co-expression

Network (WGCNA) (LANGFELDER; HORVATH, 2008), Differentially Co-expressed Genes and

Links (DCGL) (YANG et al., 2013), Gene Set Co-expression Analysis (GSCA) (CHOI;

KENDZIORSKI, 2009), Co-Expression Modules identification Tool (CEMiTool) (RUSSO et al.,

2018), petal (PETEREIT et al., 2016), entre outros. O WGCNA tem se mostrado uma

ferramenta muito útil para identificação de clusters de genes com alta conectividade, ou

64

seja, aqueles que apresentam estatisticamente um perfil de expressão semelhante e que

podem estar sendo corregulados na resposta do organismo à determinada condição de

crescimento. Este método já foi utilizado por trabalhos envolvendo diversos organismos,

desde plantas a células humanas (RAWAT et al., 2015; CHEN et al., 2016; HOPPER et al.,

2016), e representa uma abordagem estratégica e robusta para analisar perfis transcricionais

e ajudar na anotação funcional de genes ainda não caracterizados (Y UE et al., 2016). Por

essas razões, o pacote WGCNA foi escolhido para identificar os módulos de genes co-

expressos no presente trabalho.

65

1.2 MOTIVAÇÃO E HIPÓTESE

Desde seu ingresso no Laboratório Nacional de Biorrenováveis (LNBR, antigo

CTBE) ainda como estagiário, o doutorando sempre esteve em contato com linhas de

pesquisa voltadas a superar os desafios da cadeia produtiva e rentabilidade do etanol 2G.

Em seu estágio, por exemplo, o aluno investigou o secretoma dos fungos filamentosos T.

reesei e A. niger, crescidos em colmo e bagaço de cana. Os resultados geraram um dos

primeiros trabalhos a fazer comparação do secretoma dos dois fungos em biomassas

vegetais de cana (BORIN et al., 2015). No mestrado, analisou por RNA-Seq o transcriptoma

de T. reesei crescido em bagaço de cana (BORIN et al., 2017). Uma série de DEGs foram

identificados em bagaço, como CAZymes, transportadores de açúcar, genes de

metabolismo energético, e vários outros tendo apenas a anotação predita.

Assim, diante da grande quantidade de dados gerados e da possibilidade de

prospectar e explorar novos genes de interesse biotecnológico, foi proposta a construção

de uma rede gênica de co-expressão neste projeto de doutorado. Espera-se que genes

ainda não caracterizados, mas com potencial biotecnológico principalmente na degradação

de bagaço, sejam co-expressos com genes codificantes de CAZymes e transportadores de

açúcar, por exemplo. Alguns destes genes podem então ser escolhidos para ter sua função

investigada através da construção de mutantes knockout e sua caracterização fenotípica em

relação à produção de enzimas e sacarificação de biomassa de cana.

Assim, este projeto é uma continuação dos estudos que foram realizados

anteriormente e visa unir diferentes ferramentas de bioinformática com dados

experimentais a fim de validar a hipótese citada. A possibilidade de trabalhar com

bioinformática, e entender como o passo a passo do dado gerado até a extração da

informação biológica é feito, foi uma das motivações que levaram o doutorando a

desenvolver seu projeto. Este projeto incluiu ainda várias técnicas e análises “ômicas” que

até então não eram familiares para o doutorando, contribuindo assim para sua formação

científica e profissional.

66

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo geral

Construir e analisar uma rede de co-expressão gênica a partir dos DEGs no

transcriptoma de T. reesei RUT-C30, identificar genes de interesse biotecnológico e

caracterizá-los pela construção de cepas mutantes knockout desse fungo.

1.3.2 Objetivos específicos

1) Construir e analisar uma rede de co-expressão com os DEGs no transcriptoma

de T. reesei RUT-C30 crescido em bagaço de cana, e identificar módulos de genes altamente

conectados entre si;

2) Analisar in silico os motivos regulatórios do ativador transcricional XYR1 nas

regiões promotoras dos genes de T. reesei RUT-C30, e junto com a rede de co-expressão,

identificar novos genes alvos com interesse biotecnológico;

3) Construir mutantes da cepa T. reesei QM6a deletada para os genes alvos

escolhidos e caracterizar os mutantes quanto a sua capacidade em degradar bagaço através

de atividade enzimática, crescimento em massa seca de micélio e proteína total secretada;

4) Realizar e analisar o perfil de metabólitos produzidos/consumidos nas células

do fungo por espectrometria de RMN quando crescido em fontes de carbono simples e

recalcitrantes, como glicose e bagaço, respectivamente.

67

CAPÍTULO 2 – REDE DE CO-EXPRESSÃO GÊNICA REVELA NOVOS GENES COM POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM Trichoderma reesei RUT-C30

Como já destacado anteriormente, foi realizada a inferência de uma rede de co-

expressão gênica a partir dos dados de RNA-Seq gerados e analisados pelo candidato em seu

projeto de mestrado (BORIN et al., 2017). Após uma análise in silico de motivos regulatórios

para o principal ativador transcricional XYR1 na região promotora dos genes de T. reesei,

buscou-se identificar novos genes ainda não caracterizados com algum papel na

desconstrução da parede celular do bagaço. Os dados obtidos demonstram o grande

potencial de T. reesei ainda a ser explorado, não somente no ramo da bioenergia como em

diversas outras aplicações biotecnológicas. Os resultados foram publicados no tópico

especial “Advances in the Regulation and Production of Fungal Enzymes by Transcriptomics,

Proteomics and Recombinant Strains Design” da revista Frontiers in Bioengineering and

Biotechnology (fator de impacto: 5,122), em outubro de 2018, com o título “Gene co-

expression network reveals potential new genes related to sugarcane bagasse

degradation” (doi: 10.3389/fbioe.2018.00151).

68

69

2.1 INTRODUCTION

Over the previous years, the development of new sustainable alternatives to

fossil fuels has become critical to mitigate greenhouse gas emissions and to avoid the

exhaustion of natural sources. Among the biofuels, second generation (2G) ethanol has

emerged as one of the most promising substitutes for gasoline since it can be produced from

lignocellulosic feedstocks, including agroindustrial residues and municipal waste (LYND et al.,

2017).

The United States and Brazil are the world’s largest 1G ethanol producers and

are responsible for 57% and 27% of its global production, respectively (RENEWABLE FUELS

ASSOCIATION, 2017b). In Brazil, the 1G ethanol production system is well established and is

based on sugarcane milling and sugar-rich juice fermentation with generation of bagasse and

straw as byproducts. Currently bagasse is used to produce steam and energy in the sugar-

ethanol biorefineries, and the straw is left on the soil to prevent erosion and enhance the

organic carbon content (DA ROSA, 2013; PEREIRA et al., 2015; LISBOA et al., 2017). These

residues have already been used as feedstocks for 2G ethanol in Brazilian industrial plants

(GranBio and Raízen), and they have a high potential to be explored more thoroughly in an

integrated process with 1G ethanol technology (JUNQUEIRA et al., 2017; LYND et al., 2017).

2G ethanol technology primarily consists of three major steps: pretreatment,

enzymatic hydrolysis and sugar fermentation, being pretreatment and enzymatic hydrolysis

the major limitations for the economic feasibility of 2G ethanol. In this context, a cost-

effective process is required to make this biofuel more attractive and competitive

(BORNSCHEUER; BUCHHOLZ; SEIBEL, 2014; GUPTA; VERMA, 2015).

Trichoderma reesei is the primary fungal source of the industrial cellulases

present in enzymatic cocktails for lignocellulose degradation and the production of 2G

ethanol. Due to its remarkable capacity to produce and secrete enzymes that are active on

carbohydrates, T. reesei has been used as a microbial factory for the breakdown of

lignocellulose and a host for heterologous expression (SCHMOLL et al., 2016). These

enzymes and other accessory proteins are collectively named as Carbohydrate-Active

enZymes (CAZymes) (LOMBARD et al., 2014) and their genes are under control of several

transcriptional regulators, which are activated or repressed according to sugar (xyr1 and

cre1, for example) and nitrogen (areA) availability, pH alteration (pacC), light (env1) and

other factors (STRICKER et al., 2006; RASSINGER et al., 2018; SCHMOLL, 2018a). In this

70

context, some of them have been target of studies of genetic manipulation involving

deletion and overexpression of transcription factors in order to enhance the cellulolytic

phenotype of T. reesei (MENG et al., 2018; RASSINGER et al., 2018; ZHANG; ZHAO; BAI,

2018).

In the last few years, several advances have been achieved in different research

fields and contributed to a better understanding of the physiology and key features behind

the T. reesei hypercellulolytic capacity. Such advances include the development of new tools

for genetic manipulation (DERNTL et al., 2015b; LIU et al., 2015), transcriptomic and

proteomic studies using lignocellulosic residues (DOS SANTOS CASTRO et al., 2014; BORIN et

al., 2015, 2017; DALY et al., 2017; ELLILÄ et al., 2017; COLOGNA et al., 2018), the discovery of

new transcription factors (TFs) and regulatory elements (DERNTL et al., 2016, 2017;

STAPPLER et al., 2017; ZHENG et al., 2017b; BENOCCI et al., 2018), promoter characterization

(ZHENG et al., 2017a; KIESENHOFER; MACH; MACH-AIGNER, 2018) and structural studies of

cellulases (LI et al., 2015b; BODENHEIMER; MEILLEUR, 2016; EIBINGER et al., 2016;

BORISOVA et al., 2018; MA et al., 2018).

However, despite all of the studies conducted and the knowledge acquired, the

biotechnological potential of T. reesei has not been completely explored since various genes

identified by different “omic” approaches have still not been characterized. These genes

represent interesting new targets, because several were found either activated or repressed

in culture media having complex carbon sources (HÄKKINEN et al., 2012; BORIN et al., 2017;

DALY et al., 2017; HORTA et al., 2018). In this context, the gene co-expression network

analysis has become a valuable bioinformatic toolkit for data integration and the

identification of new candidate genes related to a biological process of interest (GONZALEZ-

VALBUENA; TREVIÑO, 2017). Only a few studies have inferred gene networks from the

transcriptome of T. reesei. T. reesei RUT-C30 is a well-known industrial strain able to

abundantly produce and secrete cellulases, and it has been used as a genetic background to

develop other industrial strains. RUT-C30 was isolated following three rounds of

mutagenesis and screening from the ancestral QM6a strain, and its hypercellulolytic

phenotype is attributed in part to the truncation of cre1, the main player of carbon catabolic

repression. Since then, RUT-C30 strain has been the target of numerous studies on the

conversion of biomass into biofuels and other high-value products (MARX et al., 2013;

MELLO-DE-SOUSA et al., 2014; DRUZHININA; KUBICEK, 2017).

71

Previously, Borin et al. (2017) investigated the transcriptome of T. reesei RUT-

C30 grown on steam-exploded sugarcane bagasse (referred to as “bagasse” from this point

on) in a time course of 6, 12 and 24 hours as well as on fructose after 24 hours. Interestingly,

a set of cellulase, hemicellulase, TF and sugar transporter coding genes were activated in

bagasse along with genes encoding hypothetical or uncharacterized proteins. Based on the

assumption that co-expressed genes tend to share similar expression patterns and that they

could be co-regulated by the same elements, such as the carbon source and pH (VAN DAM

et al., 2017), this study attempts to identify new genes related to the T. reesei lignocellulose

degradation response using a Weighted Correlation Network Analysis (WGCNA)

(LANGFELDER; HORVATH, 2008). WGCNA estimates the co-expression similarity between the

genes and constructs a weighted correlation matrix following a scale-free topology. In scale-

free networks, a few nodes (genes) have a high degree (links), while most nodes have a small

number of interactions (edges). These highly connected genes (hubs) play a central role in

the network stability against perturbations, and they are very important in diverse cellular

processes (HAN et al., 2004; LUSCOMBE et al., 2004).

In addition, an in silico prediction of the DNA binding sites for Xyr1, the master

activator of cellulases (STRICKER et al., 2006), was performed using the promoters to find

genes of unknown function that could be regulated by this TF. To our knowledge, this is the

first report of the use of a network approach combined with regulatory motif analyses to

reveal new genes of biotechnological interest in T. reesei RUT-C30. In this study, an extensive

number of genes were found to be co-expressed in bagasse, and they could be the target of

new studies to evaluate their role in lignocellulose degradation.

2.2 MATERIALS AND METHODS

2.2.1 Fungal strain and culture conditions

Gene co-expression network analysis was performed based on a RNA-Seq

dataset from a previous study conducted by our research group (Borin et al., 2017). Briefly,

T. reesei RUT-C30 spores were first cultivated in potato dextrose agar for 7-10 days at 29°C,

and harvested in sterile distilled water. The spore suspensions were inoculated to a final

concentration of 1 × 106 spores per 30 mL of basic culture medium (BCM) (pH 5.5) composed

of 0.05% yeast extract (w/v), 50 mL/L salt solution (6 g/L NaNO3, 1.5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L KCl

and 0.5 g/L MgSO4), 200 μL/L trace elements (10 g/L ethylenediaminetetraacetic acid, 4.4 g/L

72

ZnSO4·7 H2O, 1.0 g/L MnCl2·4H2O, 0.32 g/L CoCl2·6H2O, 0.315 g/L CuSO4·5H2O, 0.22 g/L

(NH4)6Mo7O24·4H2O), 1.47 g/L CaCl2·2H2O and 1 g/L FeSO4·7H2O), with 1% fructose (w/v) as

the carbon source at 29°C, 200 rpm for 48 h. The pre-grown mycelia were transferred to

fresh BCM (without yeast extract) with 0.5% bagasse (w/v) as the carbon source for 6, 12

and 24 h, and to 1% fructose (w/v) for 24 h. Fructose was used as control condition in the

RNA-Seq experiment as it is an inert sugar, which neither induces nor suppresses overall

expression of lignocellulolytic enzymes (AMORE; GIACOBBE; FARACO, 2013). The cultures

were grown under continuous light exposure, as it influences positively cellulase gene

expression (SCHMOLL, 2018b). Mycelia were harvested by filtration, washed with sterile

water and immediately ground into powder in liquid nitrogen. Frozen material was then

used for the RNA extraction.

2.2.2 Gene co-expression network analysis

The reads obtained by Borin et al. (2017) (BioProject accession PRJNA350272)

were size-filtered (minimum of 40 bp) and selected by quality (Q > 20) using AlienTrimmer

software (CRISCUOLO; BRISSE, 2013). The filtered reads were mapped to the T. reesei RUT-

C30 v1.0 genome available in the JGI Genome Portal (9,852 gene models) (LE CROM et al.,

2009; NORDBERG et al., 2014) using TopHat2 (KIM et al., 2013). The mapped reads were

counted with the featureCounts function from the Rsubread v1.12.6 package (LIAO; SMYTH;

SHI, 2014). Low abundance genes were filtered out, keeping only genes with a cpm ≥ 1 in at

least three samples. RPKM values were calculated following TMM normalization using the

edgeR package v3.12.1 (Bioconductor) (ROBINSON; MCCARTHY; SMYTH, 2010) within the R

environment (R CORE TEAM, 2018). Only DEGs with two-fold change cutoff (SEB 6, 12 or 24 h

versus fructose 24 h) were considered, i.e., log2-fold change ≥ 1 (upregulated) or ≤ - 1

(downregulated). The identification of the genes from T. reesei was based on RUT-C30 strain

retrieved from JGI database.

Gene co-expression network analysis was then performed using the RPKM values

and the WGCNA package v1.51 (LANGFELDER; HORVATH, 2008). Briefly, a softpower β was

chosen using the function pickSoftThreshold to fit the signed network to a scale-free

topology. Next, an adjacency matrix was generated as follows: adj = (0.5 * (1+cor))β, where

adj, cor and β are adjacency, pairwise Pearson correlation and softpower value, respectively.

Topological Overlap Matrix (TOM) was used as an input in the function hclust (“average”

73

method) to construct a hierarchical clustering tree (dendrogram). TOM is a measure that

quantifies the topological similarity between the genes within a network, i.e., it evaluates

whether two or more nodes share links within the network and groups them into the same

module (RAVASZ et al., 2002; LANGFELDER, 2013). A threshold of 0.15 (correlation > 85%)

was chosen to merge similar modules, and only modules having at least 30 genes were kept.

Network visualization and analyses for the highly connected genes (absolute Pearson

correlation > 0.8, adj = 0.064) were carried out in Cytoscape v3.3.0. The entire R script used

in the WGCNA analysis is available in Figure S1.

The MCODE (v1.4.2) plugin (BADER; HOGUE, 2003) of Cytoscape was used to

identify subclusters of genes densely connected within each module with the parameters set

to default (degree cutoff = 2, node score cutoff = 0.2, K-core = 2, maximum depth = 100,

haircut method). Genes with high connectivity within the modules, i.e., nodes with degree

values higher than 90% of the entire degree distribution, were considered to be hubs (LIANG

et al., 2012; BI et al., 2015). The individual betweenness centrality of the nodes generated by

Cytoscape was also compared to the corresponding degree value in order to confirm the

centrality of the hubs. Hub genes tend to demonstrate a positive correlation between these

two parameters (POTAPOV et al., 2005; LEE, 2006; LI et al., 2015a). Biological process and

molecular function annotation from the Gene Ontology (GO) consortium was obtained from

the JGI database (https://genome.jgi.doe.gov/TrireRUTC30_1/TrireRUTC30_1.home.html)

and used for the enrichment analysis using Cytoscape’s plugin BiNGO v3.0.3 (MAERE;

HEYMANS; KUIPER, 2005) configured to perform hypergeometric test and adjust p-values for

multiple testing using the Benjamini & Hochberg's false discovery rate (FDR) method (p ≤

0.05). To completely annotate the function of the T. reesei proteins, KEGG and KOG

annotations were retrieved from the JGI database. In addition, manually curated annotation

of the QM6a strain based on the trichoCODE pipeline (DRUZHININA et al., 2016) was also

transferred to the RUT-C30 strain using clusters of 1:1 orthologs generated by applying

OrthoMCL pipeline (LI; STOECKERT; ROOS, 2003).

2.2.3 Prediction of the Xyr1-binding sites

The promoter region of the T. reesei RUT-C30 genes was searched for Xyr1-

binding sites (XBS) according to a modified pipeline developed by Silva-Rocha et al. (2014).

The 1.5 kb sequences immediately upstream from the start codon ATG of 22 cellulase genes

74

regulated directly by Xyr1 (CASTRO et al., 2014) were retrieved from the JGI database

according to an in-house Biopython script available online

(https://github.com/SantosRAC/UNICAMP_RACSMaster/tree/master/GFFTools). For motif

discovery, these sequences were used as input in the MEME program (BAILEY et al., 2009)

using the following parameters: i) zero or one occurrence per sequence at the forward and

reverse strand, ii) a minimum of 10 motifs, and iii) a minimum and maximum motif width of

6 and 10, respectively. The frequency matrix of the motif most similar to the Xyr1 consensus

sequence 5’-GGC(A/T)3-3’ (RAUSCHER et al., 2006) was chosen to be sought in the promoter

of the network genes using the matrix-scan tool from the RSAT server (p-value ≤ 1.00E-04)

(http://rsat-tagc.univ-mrs.fr/rsat/matrix-scan_form.cgi). KOG annotation was used to

identify the functional groups of genes that have the predicted XBS, and a hypergeometric

test was applied to enrich the statistically significant KOG groups (p-value ≤ 1.00E-03) using

KOG annotation for all the genes as background. P-values were adjusted for multiple testing

corrections using Benjamini & Hochberg's false discovery rate (FDR) method (p ≤ 0.05).

2.3 RESULTS

2.3.1 Construction of a weighted gene co-expression network

Recently, the transcriptome of T. reesei RUT-C30 grown on bagasse after a time

course of 6, 12 and 24 hours as well as on fructose after 24 hours was investigated (BORIN et

al., 2017). Several DEGs were identified, including CAZymes, genes encoding sugar

transporters and uncharacterized TFs and proteins. Using this dataset, a gene co-expression

network was inferred to identify new targets related to the cell wall degradation of bagasse.

From 9,852 genes, 8,402 were kept for further analyses after gene expression

filtering and normalization. The data was imported into the WGCNA package, and a

softpower β of 26 (R² = 0.85) was chosen to fit the scale independence to a scale-free

topology and taking into account the connectivity between the genes based on their

expression (Figure S2). Genes having similar expression patterns were grouped into

modules, and highly connected modules were merged (Figure S2).

In total, 28 different modules were formed with the genes highly co-expressed

(Pearson correlation > 0.8). The DEGs identified and annotated by Borin et al. (2017) were

sought within each module generated using the WGCNA package, and approximately 70% of

75

all of the up and downregulated genes were identified in the T. reesei network (Table 1;

Table S1).

Table 1. Modules of co-expressed genes in the T. reesei network and number of DEGs found within each module. Genes were up or downregulated in at least one time point of T. reesei grown on sugarcane bagasse. Nodes and edges represent genes and pairwise interactions, respectively.

Set Module Nodes Edges Up (% total)ᶲ Down (% total)

ᶲ

Down Brown 1676 1149157 - 672 (44.8)

Up Coral1 1173 482242 386 (26.2) -

Up Black 875 335415 157 (10.6) 2 (0.1)

Up Darkorange 683 156692 270 (18.3) -

Down Darkolivegreen4 615 136748 - 144 (9.6)

Up Darkred 607 124171 170 (11.5) -

Coral2 375 45234 16 (1.1) 10 (0.7)

Down Grey60 370 53283 - 130 (8.7)

Down Lightcyan1 332 35644 - 27 (1.8)

Brown2 291 28624 - 6 (0.4)

Navajowhite2 159 8570 5 (0.3) 8 (0.5)

Bisque4 135 6022 10 (0.7) -

Royalblue 117 4724 - 22 (1.5)

Darkgreen 116 4704 - 1 (0.1)

Yellowgreen 91 895 - -

Plum1 85 1537 2 (0.1) 3 (0.2)

Ivory 79 1641 - -

Brown4 72 743 6 (0.4) -

Darkslateblue 71 1258 - -

Thistle2 66 1552 - 4 (0.3)

Lavenderblush3 62 1464 - 1 (0.1)

Darkseagreen4 59 1464 - -

Orangered3 52 1143 4 (0.3) -

Lightsteelblue 49 579 2 (0.1) 3 (0.2)

Lightcoral 48 470 3 (0.2) -

Firebrick4 45 548 - -

Blue2 43 378 3 (0.2) -

Darkviolet 41 671 2 (0.1) -

Total 8387 2585573 1036 (70.1) 1033 (68.9) ᶲ The percentage was calculated based on the total number of up (1475) and downregulated (1500) genes expressed in the transcriptome of T. reesei (BORIN et al., 2017).

76

Genes encoding CAZymes, TFs, sugar transporters and uncharacterized proteins

with secretion signal peptides were gathered in a few modules. Most of the upregulated

genes of these functional classes were found in four modules: coral1, darkorange, black and

darkred (Figure 1A; Table S1), while most of the downregulated genes were in additional

four modules: brown, darkolivegreen4, grey60, and lightcyan1 (Figure 1B; Table S1). The

first four modules will be designated the “up set” and the latter four the “down set”. These

different classes of DEGs are of major importance to the identification of new targets related

to bagasse deconstruction and other processes associated, as they cover enzymes for the

lignocellulose breakdown, transcriptional regulators of the gene expression, transport of

inducer-acting molecules and other unknown players. Taken together, these modules

represented more than half of all the DEGs in the T. reesei transcriptome. For this reason,

further analyses focused only on them.

Figure 1. DEGs identified in the modules of the T. reesei network encoding CAZyme, sugar transporter, transcription factor and unknown proteins with signal peptide. Most of the upregulated (A) and downregulated (B) genes in sugarcane bagasse were found in a few modules.

2.3.2 Identification of subclusters and GO enrichment

Subclusters of co-expressed genes were identified using the MCODE algorithm to

identify protein coding genes acting together during the process of lignocellulose

deconstruction from bagasse. Each of the modules previously identified was partitioned, and

a few subclusters were formed for each module from the up and down sets (Table S2). Next,

77

a GO enrichment was conducted with the genes within each subcluster. Only subclusters

having at least 10 genes were considered for GO enrichment (Table S3).

Overall, subclusters of coral1, black, darkorange and darkred modules presented

26 GO terms enriched, including cellulose binding (GO:0030248) and hydrolase activity

(GO:0004553, 0016798), transferase activity (GO:0016758, 0016740), carbohydrate

transport (GO:0008643) and regulation of transcription (GO:0006355), and transcription

factor activity (GO:0003700), respectively (Table S3). As already described, these modules

had the largest number of upregulated genes of the whole T. reesei network and gathered a

significant share of the CAZyme and predicted sugar transporter genes (Figure 1A).

Therefore, it is not surprising that the enrichment of these GO terms were identified for

these modules and shows that our analyses were directed towards the identification of the

genes of unknown function, which were co-expressed with known players in lignocellulose

degradation and/or sugar transport.

Alternatively, the down set demonstrated only 15 GO terms enriched, such as

threonine-type endopeptidase activity (GO:0004298) (module brown), carbohydrate

biosynthetic process (GO:0016051) (darkolivegreen4), DNA conformation change

(GO:0071103) and electron carrier activity (GO:0009055) (grey60), and anion binding

(GO:0043168) (lightcyan1) (Table S3). The difference between the GO terms enriched in the

up and down sets could be explained by the carbon sources used in the culture media.

Bagasse is a complex recalcitrant structure that must be broken down by the combined

action of CAZymes. The sugars released in this process are transported to the intracellular

environment, where they are utilized in carbohydrate catabolism to produce energy. These

sugars, including cellobiose and xylose, can also act as inducers of cellulase and

hemicellulase expression (MACH-AIGNER; PUCHER; MACH, 2010; ZHOU et al., 2012; ZHANG

et al., 2013). In contrast, the disaccharide fructose is a readily assimilable sugar that does not

require cellulase enzymes to be utilized by the fungus. Therefore, it is evident that T. reesei

adapts its metabolism according to the available carbon source.

2.3.3 Hub genes identification

Important genes for a biological process tend to be central in a gene co-

expression network and share a high number of co-expressed neighbors having a lower

degree (VILLA-VIALANEIX et al., 2013). In this study, hubs were defined as the genes at the

78

top of the degree distribution and those that demonstrated a positive correlation between

the degree and betweenness centrality (Table S4). In total, 321 and 294 hubs were identified

in the up and down sets, respectively (Table S5). Among the 321 hubs, 129 (40%) were

upregulated in bagasse in at least one time point (6, 12 or 24 hours), and 191 (65%) out of

294 genes were downregulated in the down set. Various genes encoding proteins that have

different functions were found to be hubs in all eight modules investigated, including sugar,

ion and amino acid transporters; CAZymes; TFs; proteins of chromatin remodeling; enzymes

from carbohydrate, amino acid, lipid and nucleotide metabolism; chaperones and

hypothetical proteins without annotated function (Table S5).

For simplification purposes, only a few hubs are shown in Table 2. In the up set, 3

CAZymes, 9 sugar transporters, 6 TFs and 5 genes encoding unknown proteins with a

predicted secretion signal peptide were found to be hub genes. A few TFs and other proteins

having a putative regulatory function in gene transcription were identified as hub genes, and

most were only characterized in their corresponding fungal orthologs, including the PRO1

Zn2Cys6 transcriptional regulator (jgi|136533, module darkorange) (MASLOFF; PÖGGELER;

KÜCK, 1999), the PRO41 protein (jgi|8730, module coral1) (NOWROUSIAN et al., 2007) and

the AMA1 activator (jgi|114362, module coral1) (DIAMOND et al., 2009) (Table 2).

Interestingly, two genes encoding methyltransferases (jgi|79832, module darkred;

jgi|72465, module coral1) and one gene encoding a GCN5-acetyltransferase (jgi|133861,

module coral1) were also identified as hub genes. Among the hub genes encoding proteins

of unknown function with signal peptides, the genes (jgi| 124417, 128655) were co-

expressed in the module coral1 and darkorange, respectively, and were upregulated in

bagasse. The trichoCODE annotation indicated that their orthologous genes in T. reesei

QM6a encode small secreted cysteine-rich proteins (SSCRPs), and therefore they could be

acting in the extracellular environment (Table 2, Table S5). However, the true evidence that

they are pivotal to T. reesei response when grown on bagasse still needs to be evaluated.

Similar to the up set, various hub genes encoding different proteins were found

in the down set. In total, 7 CAZymes, 5 sugar transporters, 8 TFs and 4 proteins of unknown

functions that have predicted secretion signal peptide were found to be downregulated in

bagasse. In addition to the identification of the hub genes that have a putative regulatory

role in the gene expression, such as TFs, chromatin remodeling and signal transduction

79

proteins, several genes encoding unknown proteins significantly downregulated were also

found, especially in the brown module (Table 2, Table S5).

80

Table 2. Hub genes found in the up and down sets that were differently expressed in sugarcane bagasse (BORIN et al., 2017).

1 Trichoderma reesei RUT C30 v1.0 database from JGI was used to recover the T. reesei proteins ID; 2 QM6a ortholog genes; 3 Functional annotation according to KEGG, KOG and Druzhinina et al.’s work (2016); 4 Log2 fold change (FC), B: sugarcane bagasse.

RUT-C30 ID1 QM6a ID2 Description3 Module Degree log₂FC4

B6h B12h B24h

Up

se

ts

23456 122048 Sec61 beta subunit of ER translocase black 859 - - 1.09

103979 81884 Translocon-associated protein (TRAP) black 859 - - 1.06

133861 111236 GCN5-related N-acetyltransferase coral1 1106 3.29 3.18 4.12

8730 57737 PRO41 protein coral1 1086 2.03 1.27 2.69

114362 67408 AMA1 activator coral1 1097 - - 1.11

139402 121107 Zn2Cys6 transcriptional regulator coral1 1104 - - 1.38

95791 120698 C2H2 transcriptional regulator PacC darkorange 652 2.28 2.15 1.94

136533 76590 Zn2Cys6 transcriptional regulator Pro1 darkorange 650 2.01 2.00 2.09

79832 5366 S-adenosyl-L-methionine-dependent Methyltransferase

darkred 558 1.93 1.71 -

38522 103158 Zn2Cys6 transcriptional regulator darkred 572 2.12 1.99 -

Do

wn

se

ts

98900 78688 Heat shock factor-type DNA-binding domain-containing protein

brown 1642 -1.69 -1.53 -2.29

140865 106171 HET protein brown 1640 -4.10 -2.82 -4.99

124027 122943 SWI-SNF chromatin-remodeling complex protein

brown 1639 - -1.10 -1.28

77229 106259 Zn2Cys6 transcriptional regulator brown 1643 -2.18 -1.86 -2.86

139518 124228 GT2 chitin synthase darkolivegreen4 572 - - -1.28

86800 66606 Zn2Cys6 transcriptional regulator darkolivegreen4 577 - - -1.11

139776 21255 bHLH transcriptional regulator grey60 347 -1.12 -1.05 -

131957 53893 Hypothetical protein grey60 353 -2.17 -2.79 -1.55

105289 82667 ThrB Homoserine kinase lightcyan1 307 -1.22 -1.17 -

96918 120953 Unknown secreted protein lightcyan1 310 -3.29 -3.04 -

81

2.3.4 Prediction of the Xyr1-binding sites in the promoter region

Previously, Castro et al. (2014) showed that 22 genes encoding cellulases and

hemicellulases of the T. reesei QM9414 strain are regulated directly by the master activator

Xyr1 (jgi|98788). This TF is essential for the induction of cellulase and hemicellulase genes,

and it has been the target of various studies aiming to improve the hypercellulolytic

phenotype of T. reesei using genetic manipulation (WANG et al., 2013; LV et al., 2015b;

ZHANG et al., 2017).

To predict the presence of a specific DNA binding motif for the RUT-C30 strain,

the promoter regions (1.5 kb immediately upstream the start codon) of the orthologous

genes between the RUT-C30 and QM9414 strains were used to seek motifs that were similar

to the Xyr1 consensus sequence 5’-GGC(A/T)3-3’ (RAUSCHER et al., 2006) and the motif used

in the study of Silva-Rocha et al. (2014). As a result, only one putative XBS of 10 nucleotides

resembling the Xyr1 motifs was chosen for further analyses (Figure 2). The frequency matrix

of the motif chosen was then retrieved from the MEME server and used as a model in the

identification of XBS predicted within the promoter of the genes from the up and down sets.

The complete list of the motifs predicted in the promoter of the 22 CAZymes and the

frequency matrix is available in Table S6.

Figure 2. Putative XBS predicted in the promoter of 22 genes encoding cellulases and hemicellulases and chosen to be sought in the gene promoter regions of T. reesei. Only this XBS was found to resemble the Xyr1 consensus sequence 5’-GGC(A/T)3-3’ and the motif used by Silva-Rocha et al. (2014).

To validate the motifs found in silico, they were compared with the motifs

already characterized in the promoters of the CAZyme genes (cbh1 and xyn1) of other T.

82

reesei strains. Cellobiohydrolase 1 (Cbh1/Cel7a) is one the most produced and secreted

enzymes from T. reesei (KIESENHOFER; MACH; MACH-AIGNER, 2018), and endo-β-1,4-

xylanase 1 (Xyn1) is a hemicellulase with important role in xylan deconstruction (LIU et al.,

2017). The comparison of the motifs showed that our pipeline could predict XBS that had

been previously described and characterized (Figure S3 and S4) (RAUSCHER et al., 2006;

FURUKAWA et al., 2009; RIES et al., 2014; KIESENHOFER; MACH; MACH-AIGNER, 2018),

similarly to the prediction of Silva-Rocha et al. (2014).

Next, the predicted XBS found in the promoter of the genes from the up and

down sets were investigated (Table S7). In total, 245 upregulated and 210 downregulated

genes had at least one XBS predicted in the promoter region. This represented 24% and 22%

of the entire set of DEGs present in the up and down sets, respectively. Considering only the

number of DEGs in each module, coral1 (45.5%) and grey60 (40.4%), were the modules

having the largest percentage of genes with predicted XBS (Table S1).

KOG functional annotation of the genes having predicted XBS from up and down

sets was also investigated (Figure 3). The hypergeometric test and multiple testing

correction showed that the KOG classes metabolism, carbohydrate transport and

metabolism, and information storage and processing were statistically significant in the up

set, while secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism was the only class

enriched in the down set (Figure 3). This difference stresses the diversity of genes encoding

proteins with several functions that could be modulated by the activator Xyr1, in addition to

other elements.

Analyzing the hub genes of the up set, 30 genes (23.3%) demonstrated at least

one XBS in their promoter, including one Zn2Cys6 transcriptional regulator, transporters

from the Major Facilitator Superfamily (MFS) and one putative calcium transporter, one Ras

GTPase, one putative SWI-SNF chromatin-remodeling complex protein, one polyketide

synthase (PKS) and various hypothetical proteins with unknown function (Table S5). In the

down set, 33 (17.3%) hub genes had XBS predicted in this study, including two CAZymes

(chitin synthase and glucan endo-1,3-β-glucosidase), one ABC transporter family protein, one

putative nonribosomal peptide synthase (NRPS), one putative SWI-SNF chromatin-

remodeling complex protein and several uncharacterized proteins (Table S5).

83

Figure 3. KOG function classification of the DEGs identified in the up and down sets that had at least one predicted XBS. KOG classes significantly enriched (p-value ≤ 1.00E-03) are shown with an asterisk (*).

84

2.3.5 Xyr1 and co-expressed genes in the coral1 module

As already described, Xyr1 is critical for the activation of cellulases and

hemicellulases, and it was expressed in bagasse more highly than fructose during the entire

time course (Log2FC: 6 h: 0.48; 12 h: 0.99; 24 h: 1.65). Along with the other 385 upregulated

genes, xyr1 was grouped into the coral1 module which had the largest number of CAZyme

genes upregulated in bagasse (Figure 1A). Thus, it is worth investigating the genes that were

co-expressed with this activator, since they could be involved in the fungal response to the

lignocellulosic biomass.

From the pairwise edges of the coral1 module, 858 neighbor nodes to Xyr1 were

retrieved. A total of 338 out of 858 genes were upregulated in bagasse, and only 115 had at

least one XBS in the promoter. Among these genes, 35 CAZymes were found to be co-

expressed with xyr1, including cellobiohydrolases (cbh1 and cbh2), endoglucanases (egl1,

egl2, egl3, and egl5), β-glucosidases (bgl1 and bgl2), endo-β-1,4-xylanases (xyn2, xyn3, xyn4,

and xyn5) and monooxygenases from the AA9 family (cel61a and cel61b) (Figure 4A, Table

S8).

Interestingly, swo1 (jgi|104220) and cip1 (jgi| 121449) were found as neighbor

nodes to xyr1, and they were under strong activation in bagasse during the entire time

course (6, 12 and 24 hours) (Table S8). Swo1 acts synergistically with xylanases to remove

the hemicellulosic fraction of the lignocellulose (GOURLAY et al., 2013), and Cip1 appears to

be important to the hydrolysis of the lignocellulosic biomass (LEHMANN et al., 2016). Both

proteins have a carbohydrate-binding domain that belongs to family 1 (CBM1), and one XBS

was predicted in each gene promoter. Therefore, they play a role in bagasse deconstruction

and are transcriptionally regulated by Xyr1, as reported previously (REITHNER et al., 2014;

MA et al., 2016). In addition, 14 putative sugar transporters, three Zn2Cys6 transcriptional

regulators, one putative GCN5-acetyltransferase, one methyltransferase and several other

genes were also co-expressed with xyr1 and had XBS in their promoters (Figure 4A, Table

S8).

Finally, hub genes that were neighbor nodes to the master activator Xyr1

(represented in the coral1 module) and that had XBS in their promoter were also identified.

The list of hubs included 14 genes encoding one MFS transporter, one Zn2Cys6

85

transcriptional regulator, one protein with an ankyrin repeat, and several other genes still

not characterized (Figure 4B, Table S8).

86

Figure 4. A) Upregulated genes encoding proteins of different functions being co-expressed with the activator xyr1 in the coral1 module. B) Hub genes identified in the same module having at least one predicted XBS in the promoter region. The nodes are identified with the T. reesei RUT-C30 ID retrieved from JGI database. The complete list of co-expressed genes with xyr1 is shown in Table S8.

87

2.4 DISCUSSION

The construction of a gene co-expression network allows us to identify clusters

of genes that have a similar expression pattern and to assess the biological information that

is relevant to a specific phenotype. Hitherto there were only a few studies investigating gene

co-expression network in T. reesei. Dos Santos Castro et al. (2014), for instance, performed

RNA-Seq of T. reesei QM9414 strain grown on sophorose, cellulose and glucose, and their

analysis revealed specific differentially expressed genes (DEGs) in sophorose and cellulose.

More recently, Horta et al. (2018) examined the transcriptome and exoproteome of T.

reesei, T. harzianum and T. atroviride grown on cellulose and glucose. Based on their co-

expression network, they found a set of 80 genes shared between the three Trichoderma

species that could represent a common cellulose degradation system. However, no research

has been reported exploring the gene co-expression network of T. reesei RUT-C30 grown on

sugarcane bagasse. In this study, the recently published transcriptome of T. reesei RUT-C30

grown on bagasse after 6, 12 and 24 hours was used to determine the modules of co-

expressed genes. As a result, 28 modules of co-expressed genes were formed, and only eight

were chosen for further analysis due to the largest number of up and downregulated genes

encoding CAZymes, TFs, sugar transporters and other genes of unknown function that were

co-expressed (Figure 1).

After the MCODE clustering, the GO enrichment showed that several terms

related to lignocellulose breakdown, including polysaccharide (GO:0030247) and cellulose

binding (GO:0030248), and hydrolase activities (GO:0004553 and GO:0016798), were

enriched in the subcluster 1 of the coral1 module (Table S3) where the master activator Xyr1

was also found. The presence of 50 upregulated CAZy genes encoding cellulases,

hemicellulases and oxidative enzymes in the coral1 module (Table S1), along with the co-

expression of xyr1, allows us to hypothesize that soon after xyr1 is expressed in bagasse, its

protein product regulates the transcription of the (hemi)cellulolytic genes. In addition, 36

out of the CAZy 50 genes demonstrated at least one XBS in their promoter, which is

consistent with previous studies (CASTRO et al., 2014; SILVA-ROCHA et al., 2014) and

highlights the ability of our approach to identify the Xyr1 target genes. In addition to coral1,

the darkorange module had the carbohydrate transport (GO:0008643) term enriched (Table

S3), revealing that several genes encoding transporters were grouped in this module. Most

of them belonged to the MFS family, and its members are thought to transport a vast array

88

of small molecules, such as sugar, inorganic ions, siderophores and amino acids (YAN, 2015;

QUISTGAARD et al., 2016). Some studies have also shown that MFS transporters can still

mediate the induction of cellulases in T. reesei (ZHANG et al., 2013; HUANG et al., 2015;

NOGUEIRA et al., 2018), clarifying the importance of these putative sugar transporters in the

induction of CAZymes and lignocellulose degradation.

Distinct GO terms were enriched in the down set, such as threonine-type

endopeptidase activity (GO:0004298) and carbohydrate biosynthetic process (GO:0016051)

(Table S3). The latter was enriched in the darkolivegreen4, and interestingly, this GO term

consisted of seven enzymes possibly involved in fungal cell wall biosynthesis, including three

glycosyl transferases, one α-amylase, one rhamnose reductase, one pyruvate carboxylase

and one glucose 6-phosphate isomerase (GPI) (Table S3). Fungal cell wall is primarily

composed of β-1,3-glucan, β-1,6-glucan, mixed β-1,3-/ β-1,4-glucan, α-1,3-glucan, chitin and

glycoproteins. They are organized in a complex backbone, and it is thought that glycosyl

hydrolases and glycosyl transferases are fundamentally important in cell wall biosynthesis

(FREE, 2013). Genes encoding enzymes from the gluconeogenesis pathway, such as pyruvate

carboxylase and GPI, could also provide hexose phosphates as building blocks for the cell

wall biosynthesis (ENE et al., 2012). Considering that fructose is a simpler sugar than the

bagasse lignocellulose, the fungus must be utilizing this readily assimilable carbon source to

grow, and consequently it has to remodel its cell wall. Although most of those genes were

downregulated and highly co-expressed, the engagement of these genes in this process

remains elusive.

Hub genes were also sought out within the main modules, and a large number of

new targets that were co-expressed were discovered (Table 2; Table S5). For example, the

PRO1 coding gene (jgi|136533) was found as a hub node within the darkorange module, and

it was upregulated in the three time points analyzed (6, 12 and 24 hours). PRO1 is a member

of the Zn2Cys6 transcription factors, and several orthologs had already been characterized in

ascomycetes. In Neurospora crassa, the ortholog Adv-1 (NCU07392; identity: 66%) regulates

cell-to-cell fusion and sexual development (CHINNICI et al., 2014; DEKHANG et al., 2017),

and in Sordaria macrospora (CAB52588.2; identity: 66%), PRO1 has a pivotal role in various

different processes, including the regulation of genes involved in cell wall integrity, the

NADH oxidase pathway and pheromone signaling (MASLOFF et al., 2002; STEFFENS et al.,

2016).

89

Steffens et al. (2016) demonstrated that, in addition to Adv-1, N. crassa requires

the pH response transcription regulator PacC to activate its female development.

Intriguingly, its ortholog gene pac1 (jgi|95791) in T. reesei RUT-C30 was also identified to be

a hub node (Table 2; Table S5). pac1 was upregulated in bagasse and co-expressed with the

pro1 gene in the same module. He et al. (2014) functionally characterized pac1 in T. reesei,

and they observed increased cellulase transcription and production in the Δpac1 mutants at

neutral pH. They also noted that the pac1 deletion impaired fungal growth and

development. In total, the results point to possible crosstalk between PRO1, Pac1 and other

genes involved in an intricate regulatory network.

As already described, two putative methyltransferase coding genes (jgi|79832,

module darkred; jgi|72465, module coral1) and a GCN5-acetyltransferase coding gene

(jgi|133861, module coral1) were also identified as hubs in the up set (Table S5). These

classes of enzymes are thought to be responsible for DNA methylation and histone

modification, respectively, and epigenetically regulate various important cellular processes,

such as the silencing of transposable elements and the activation of gene transcription (XIN

et al., 2013; SU; LU; LIU, 2016; LYKO, 2017). Intriguingly, recent studies have suggested that

methyltransferases are also implicated in lignin degradation in the basidiomycete

Phanerochaete chrysosporium, broadening the functions of these enzymes (KORRIPALLY et

al., 2015; THANH MAI PHAM; KIM, 2016; KAMESHWAR; QIN, 2017). In addition, five genes

encoding unknown proteins that have secretion peptide signal were considered to be hubs

in the up set (Table S5). Among them, two (jgi|124417, 128655) had their QM6a orthologs

annotated as SSCRPs using trichoCODE. In general, SSCRs are related to interactions

between the microorganisms and the environment, including biocontrol, the induction of

plant resistance and adhesion (SHCHERBAKOVA et al., 2015; QI et al., 2016). The presence of

a predicted secretion signal peptide allows us to hypothesize that these proteins could be

secreted to support the bagasse-fungal adhesion. In total, the identification of these hub

genes shows that they could be acting as regulatory players or accessory proteins in the

bagasse degradation response.

Other putative regulators were also identified as hub nodes in the up and down

sets, and some of them were not characterized in T. reesei, only in its homologs (Table S5).

For example, the gene encoding the AMA1 activator (jgi|114362) was found in the coral1

module having an XBS in the promoter, and its putative ortholog in Saccharomyces

90

cerevisiae (YGR225W; identity: 33%) encodes a meiosis-specific activator related to spore

morphogenesis (OKAZ et al., 2012; SCHMOLL et al., 2016). One gene encoding the

developmental regulatory protein WetA (jgi|9281) was found in the same module being

upregulated during the entire time course. In Fusarium graminearum, the putative ortholog

WetA (I1S0E2.2; identity: 43%) is necessary for conidiogenesis and conidial maturation, and

the wetA mutants produced conidia that were more sensitive to oxidative and heat stress

(SON et al., 2014). Intriguingly, Wu et al. (2017) suggested that the Aspergillus flavus

ortholog WetA (EED47149.1; identity: 57%) could be a global player in the regulation of

conidial development, acting during the fungal cell wall biogenesis and regulating the

secondary metabolic pathways. In addition, the putative TF (jgi|98900) was one of the hub

genes of the brown module, and its corresponding orthologs encode the heat shock

transcription factor 1 (Hsf1) (SCHMOLL et al., 2016), the master stress response regulator in

eukaryotes (ZHENG et al., 2016) and the activator of virulence in the pathogen Candida

albicans (NICHOLLS et al., 2011) (Table 2; Table S5). Another four and seven putative TF

coding genes were also found to be hubs in the up and down set, respectively (Table S5).

The search for their orthologous genes in other ascomycetes revealed that none had been

characterized, and therefore, their function remains to be elucidated. The relevant role of

the characterized ortholog hub genes identified in this study highlights the central position

of these nodes in the up and down sets and support the necessity of investigating their

putative regulatory influence on the T. reesei response in bagasse.

Finally, other genes encoding proteins of different functions were also identified

as hub nodes in the up and down sets (Table S5). In the up set, three CAZymes (jgi|97768,

75420, 128705), two small secreted cysteine-rich proteins (SSCRPs) (jgi|124417, 128655),

the translocon-associated protein (TRAP) (jgi|103979) and the Sec61 beta subunit

(jgi|23456) from the endoplasmic reticulum (ER) translocon, ion and amino acid

transporters, and various unknown proteins were found. In the down set, other hubs were

discovered, including seven CAZymes (jgi|24326, 104519, 103899, 124897, 97721, 139518,

104242), six proteases (jgi|90298, 135507, 75405, 82006, 138263, 87936), a SWI-SNF

chromatin-remodeling complex protein (jgi|124027) and unknown proteins (Table 2; Table

S5). This vast array of hub genes demonstrates that the great diversity of genes is central in

the co-expressed modules. However, most of them are still not characterized, and efforts

are required to elucidate their function in fungal physiology.

91

The prediction of XBS based on the promoter of cellulase and hemicellulase

coding genes was used in this study to verify the genes possibly regulated by Xyr1 in the

presence of a complex lignocellulosic biomass. Xyr1 is the key transcriptional regulator of the

CAZymes involved in cell wall deconstruction, and it is regulated by the carbon catabolite

repressor Cre1, which is truncated and confers a hypercellulolytic phenotype in the RUT-C30

strain (ILMÉN; THRANE; PENTTILÄ, 1996; SILVA-ROCHA et al., 2014). To validate our pipeline

of regulatory motif predictions, the XBS predicted in the cbh1 and xyn1 promoters were

compared with those from other studies.

According to Ries et al. (2014), there are two XBS in the positions -733 and -320

in relation to the start codon ATG of the cbh1 gene (Figure S3). The -733 motif (5’-TTTGCC-

3’) was predicted by the pipeline of Silva-Rocha et al. (2014). However, it was not predicted

in this study. Alternatively, we identified four XBS in the promoter region of cbh1 at positions

-508, -748, -771 and -1376 that were not identified in the study by Silva-Rocha et al. (2014).

This was likely to be due to the differences between the strains and pipelines. Using a

labeled Xyr155-195 probe, Furukawa et al. (2009) found that two of these predicted sequences

(positions -508 and -748) showed strong binding to the probe. In addition, Kiesenhofer et al.

(2018) replaced the promoter of the glycine oxidase (goxA) reporter gene with the cbh1

promoter containing deletions in three different regions and observed a significant decrease

in the GoxA activity when the mutant strains were grown on different carbon sources,

including lactose, carboxymethylcellulose (CMC) and pretreated wheat straw. Two of these

regions spanned the XBS predicted in this study at positions -748 and -771 (Figure S3).

In addition to cbh1, the XBS predicted in the xyn1 promoter were also compared

with the ones previously reported (RAUSCHER et al., 2006; FURUKAWA et al., 2009;

KIESENHOFER; MACH; MACH-AIGNER, 2018). Two XBS were predicted at positions -417 and -

621 being the first one identified and characterized in other studies (Figure S4). For example,

Rauscher et al. (2006) investigated a 217-bp region (-321 to -538) inside the xyn1 promoter

and discovered that Xyr1 was able to bind to two sequences at positions -404 and -420.

Point mutations in each of these two motifs caused a substantial decrease in the reporter

activity of the gene glucose oxidase and showed that they are critical for the transcriptional

activation of xyn1 in the presence of xylan, one of the primary sugar inducers of

hemicellulases (RAUSCHER et al., 2006). Some years later, Furukawa et al. (2009) analyzed

three XBS (-80, -420 and -887) in the xyn1 promoter and discovered that only the XBS at

92

position -420 showed strong binding to the Xyr1 probe. Finally, Kiesenhofer et al. (2018)

recently demonstrated that the deletion of these XBS at positions -404 and -420 abolished

the GoxA activity under control of the xyn1 promoter even in the presence of 0.5 mM xylose

(Figure S4). In summary, the previous studies indicate that some of the XBS predicted in this

study could be functional in T. reesei RUT-C30 and therefore, are important for the

transcriptional regulation of CAZyme genes and probable additional genes. In addition to the

cbh1 and xyn1, the promoter of the cbh2 gene also had two XBS predicted in this study that

were shared with its homologs in other T. reesei strains (data not shown).

Based on the assumption that Xyr1 is essential to the induction of the CAZymes

and sugar transporters, it was not surprising that genes related to carbohydrate transport

and metabolism, such as CAZymes and putative sugar transporters, were the most abundant

upregulated genes that had XBS in the KOG analyses. Alternatively, the XBS were enriched in

the genes of secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism class in the down

set (Figure 3), which suggests that Xyr1 participates in the regulation of secondary

metabolism.

To verify the putative targets of Xyr1, the direct co-expressed neighbors of the

xyr1 node were retrieved from module1, and we searched for the XBS in the gene promoters

(Table S8). From a total of 115 Xyr1-partner genes having a predicted XBS, almost half

encode CAZymes and putative sugar transporters. Three Zn2Cys6 transcription factors

(jgi|139402, 77124, 141251) were also found, and one (jgi|141251) demonstrated 55% and

72% identity to the NirA ortholog in F. fujikuroi (KLO85312.1) and A. nidulans (AN0098),

respectively (Table S8). NirA is a nitrate-specific transcription factor that modulates nitrogen

metabolite repression (NMR), and this TF accumulates in the nucleus in the presence of

nitrate or nitrite and a low concentration of assimilable nitrogen sources, such as

ammonium. The nitrogen metabolism regulator AreA interacts physically with NirA, and the

complex formed activates the genes for nitrate assimilation (GALLMETZER et al., 2015;

PFANNMÜLLER; BOYSEN; TUDZYNSKI, 2017). The T. reesei ortholog areA (jgi|140814) was

not differentially expressed in bagasse, and therefore it is curious to note the upregulation

of the T. reesei ortholog nirA in this carbon source and its co-expression with xyr1.

Three genes (jgi|126063, 73493, 92240) encoding putative transporters of non-

sugar solutes were co-expressed with xyr1 and had XBS in their promoters (Table S8). The

gene (jgi|73493) encodes a putative calcium transporter with 10 transmembrane domains,

93

and it was found as a hub in the coral1 module (Table S8). It has already been reported that

metal ions, such as Ca2+ and Mn2+, have a positive effect on the mycelial growth of T. reesei

and cellulase production, and this molecular signaling mechanism is mediated by the Mn2+

transporters TPHO84-1 and TPHO82-2, a Ca2+/ Mn2+ ATPase (TPMR1) and the components of

the Ca2+/calmodulin signal transduction, including the TF Crz1 (CHEN et al., 2016a, 2018).

Therefore, it is worth investigating the role of this putative calcium transporter in the

induction of the genes responsive to lignocellulose degradation, since it could transport

cations that activate gene expression.

In addition to the non-sugar transporters, 15 putative sugar transporter coding

genes were co-expressed with xyr1 and demonstrated at least one XBS predicted at their

promoter region (Table S7). One of them was considered to be a hub gene encoding a

protein annotated as allantoate permease (jgi|93149), but its participation in the fungal

response towards the biomass deconstruction remains unclear. Most of these putative

transporters are members of the MFS superfamily, and therefore, could transport a variety

of solutes, including sugar and amino acids. Sloothaak et al. (2016) developed a hidden

Markov model (HMM) to identify new xylose transporters in T. reesei and A. niger. Several

candidates were identified, and one (RUT-C30: jgi| 7811; QM6a ortholog: jgi| 106330) was

found upregulated and co-expressed with xyr1 in this study (Table S7). Unexpectedly, this

putative xylose transporter coding gene had one XBS predicted in the promoter and showed

an increasing expression profile in bagasse. The prediction of an XBS in the promoter region

of this gene suggests that it could be regulated by Xyr1 and could be involved in the xylose

assimilation after the hemicellulose breakdown of bagasse.

2.5 CONCLUSION

The T. reesei gene co-expression network analysis grouped several differentially

expressed genes into modules based on their expression patterns in steam-exploded

sugarcane bagasse. A large number of interesting genes encoding CAZymes, putative sugar

and ion transporters, as well as TFs and proteins with a putative regulatory role were highly

co-expressed within some modules. The prediction of XBS in the promoters confirmed the

influence of Xyr1 in the CAZy coding genes regulation and enabled the identification of new

putative targets of this master regulator. Hub nodes were also found within the modules,

and many of them had not been characterized. Several CAZymes, accessory proteins and

94

uncharacterized protein coding genes were co-expressed with xyr1. Finally, this study

provided an extensive number of genes that were co-expressed in bagasse. These genes

have the potential to contribute to the lignocellulose degradation and to the development of

T. reesei hypercellulolytic strains, and they should be studied in more detail.

Author Contributions GPB performed the analyses, and RACS carried out the data processing. DMRP

and MFC supervised the study and performed the analyses. JVCO supervised the study and

planned the analyses. All the authors wrote the draft and approved its final version.

Funding

This study received financial support from the Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo (FAPESP processes n° 2014/15799-7, 2014/11766-7, 2015/08222-8

and 2017/18987-7) and from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq process number 141574/2015-1).

Acknowledgements

We would like to thank the Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do

Bioetanol (CTBE) and the Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) for

the computational facility.

Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no competing interests.

Supplementary Material

The Supplementary Material for this article can be found online at:

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2018.00151/full#supplementary-

material

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103

CAPÍTULO 3 – CONSTRUÇÃO, CONFIRMAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE MUTANTES KNOCKOUT DE Trichoderma reesei

Neste capítulo serão apresentados os resultados alcançados em relação à

construção dos mutantes knockout de T. reesei. A técnica de transformação neste fungo foi

um dos maiores desafios técnicos enfrentados e superados pelo doutorando, devido

principalmente à falta de experiência prévia do grupo e a dificuldade de se obter mutantes

verdadeiros. Por essa razão, o aluno fez um estágio de seis meses no exterior (BEPE nº

2017/18987-7) no grupo da pesquisadora Drª. Astrid Mach-Aigner, na Áustria. Os resultados

apresentados demonstram a influência de um gene codificando um FT putativo na

degradação de bagaço de cana, e merece ser melhor investigado quanto a seu papel de

ativador transcricional de CAZymes em T. reesei.

104

3.1 INTRODUÇÃO

Recentemente, o transcriptoma da cepa T. reesei RUT-C30 cultivada em meio

contendo bagaço pré-tratado como fonte exclusiva de carbono foi investigado por nosso

grupo (BORIN et al., 2017). De acordo com os dados de RNA-Seq, vários DEGs foram

encontrados sendo hiper-expressos em bagaço, incluindo CAZymes, transportadores de

açúcar, TFs e genes não caracterizados codificando proteínas com peptídeo sinal (BORIN et

al., 2017). Muitos desses genes foram altamente co-expressos entre si e tiveram ainda

motivos de ligação para XYR1 preditos em suas regiões promotoras (Capítulo 2). Com base

nesses resultados, uma extensa lista de genes foi gerada (Tabela S1, Capítulo 2), cujos

candidatos precisam ser avaliados futuramente para confirmar a real participação de seus

produtos gênicos na degradação de biomassa.

No presente trabalho, seis genes foram escolhidos para construção dos mutantes

knockout e avaliação de suas possíveis funções na degradação da biomassa lignocelulósica:

dois FTs hipotéticos, duas CAZymes das famílias AA2 e AA3, uma hidrofobina e uma proteína

hipotética com homologia com uma small secreted cysteine-rich protein (SSCRP) de T.

parareesei (Tabela 3). Apesar dos genes terem sido escolhidos a partir do transcriptoma e

rede gênica da cepa industrial RUT-C30, eles foram deletados na cepa parental QM6a e, por

essa razão, a identificação utilizada no restante do texto das mesmas será referente a desta

cepa.

105

Tabela 3. Genes alvos escolhidos para construção dos mutantes de T. reesei.

QM6a ID

‡

RUT-C30 IDᵞ

Descrição Família CAZyᶲ

log₂FC⁺

Móduloᵠ Presença de XBSᵝ

Presença de

peptídeo sinalᵟ

B6h B12h B24h

60565 77124 proteína com domínio Zn(2)-C6 fungal-type DNA-binding

- 1.78 2.57 2.99 coral1 Sim -

105520 74374 proteína com domínio fungal specific transcription factor

- 1.8 1.56 1.99 darkorange - -

123978 115868 álcool desidrogenase AA3_3 4.22 3.77 4.67 coral1 - -

70803 93070 catalase-peroxidase bifuncional

AA2 1.84 1.57 2 coral1 - Sim

123967 125146 hidrofobina 3 - - - 1.19 black - Sim

104227 72373 ortóloga à proteína SSCRP de T. parareesei

- 3.33 3.48 5.72 - Sim Sim

ᵞ Identidade da proteína baseada no banco de dados do JGI T. reesei RUT-C30 v1.0. ‡

Identidade das proteínas homólogas de RUT-C30 em QM6a segundo o banco de dados do JGI T. reesei v2.0. ᶲ Família CAZy predita em BORIN et al., 2018. ⁺ Log do fold change da condição bagaço (6, 12 e 24 h) em relação à condição frutose 24 h (BORIN et al., 2017). Cores de vermelho mais escuro indicam valores mais altos de expressão. ᵠ Módulo de co-expressão identificado pelo pacote WGCNA (ver CAPÍTULO 2). ᵝ Predição de pelo menos um sítio de ligação para XYR1 (XBS) na região promotora (ver CAPÍTULO 2). ᵟ Peptídeo sinal predito em BORIN et al., 2018.

Como comentado anteriormente, apesar de vários FTs de diferentes vias

metabólicas já terem sido caracterizados (HÄKKINEN et al., 2014; BENOCCI et al., 2017;

DERNTL et al., 2017; KUNITAKE; KOBAYASHI, 2017), muitos deles continuam sem ter suas

funções avaliadas, especialmente genes regulados em biomassa lignocelulósica como bagaço

de cana. Por essa razão, dois FTs hipotéticos foram selecionados para serem deletados em T.

reesei (Tabela 3). Adicionalmente, duas CAZymes ainda não caracterizadas em T. reesei

foram escolhidas (Tabela 3). Este grupo de enzimas oxidativas (AA2 e AA3) é carente de

trabalhos, e seu papel na lignocelulose pode estar relacionado à doação de elétrons para as

LPMO, por exemplo, – que inclusive foram hiper-expressas em bagaço - ou ajudando GHs a

acessar a (hemi)celulose, removendo parte da lignina.

O gene da hidrofobina também foi escolhido (Tabela 3) pois pode contribuir para

a adesão de T. reesei ao bagaço e maior degradação de sua parede vegetal, como

demonstrado em A. nidulans (BROWN et al., 2016). Neste trabalho, as hidrofobinas

induziram a formação de biofilme ao redor do bagaço, retendo celulases e hemicelulases em

um microambiente mais próximo e favorável à degradação de lignocelulose (BROWN et al.,

2016). São proteínas pequenas secretadas pelas extremidades da hifa e, pela propriedade de

106

se auto-reunirem entre a parede celular do fungo e superfícies hidrofóbicas, mediam a

adesão do fungo ao substrato (WÖSTEN; SCHOLTMEIJER, 2015).

O último gene selecionado apresentou alta similaridade (query cover: 99%,

identity: 97.30%, e-value: 5e-98) com uma small secreted cysteine-rich protein (SSCRP) de T.

parareesei (Tabela 3). Tem sido proposto que esta proteína pode estar relacionada às

interações entre os microorganismos e o meio ambiente, incluindo biocontrole, indução de

resistência de plantas, e adesão. Esta classe de proteínas inclui swolenina, hidrofobina,

cerato-platanina e outras (SHCHERBAKOVA et al., 2015; QI et al., 2016; GUZMÁN-GUZMÁN

et al., 2017). A deleção desse gene poderia, assim, ajudar a avaliar seu papel no crescimento

de T. reesei em bagaço.

A hiper-expressão dos genes alvos em outras fontes de carbono, como, por

exemplo, palha de trigo, apoia ainda a hipótese de que seus produtos podem ser requeridos

para auxiliar na resposta do fungo em degradar diferentes resíduos lignocelulósicos. No

trabalho de DALY e colaboradores (2017), com exceção do gene 70803, todos os genes

tiveram valores de RPKM maiores em palha de trigo em comparação com a condição glicose.

Um destaque foi a maior abundância dos transcritos do gene da hidrofobina em palha de

trigo, atingindo um foldchange de mais de 30 vezes nessa comparação. No trabalho anterior,

o mesmo grupo de pesquisa mostrou ainda que cinco dos seis genes alvos (jgi|60565,

105520, 123978, 70803 e 123967) foram reprimidos quando o micélio de T. reesei QM6a

crescido em palha de trigo era transferido para glicose por 5 h (RIES et al., 2013). Isso indica

que os genes devem sofrem o fenômeno da RCC mediada por CRE1, de forma semelhante à

regulação transcricional de alguns genes de celulases e hemicelulases conhecidos por

atuarem sobre a lignocelulose. Em outro trabalho, DOS SANTOS CASTRO e colaboradores

(2014) também mostraram que soforose e/ou avicel são fortes indutores da expressão dos

genes 60565, 123978, 70803, 123967 e 104227. Os genes da CAZyme da família AA3

(jgi|123978) e da hidrofobina (jgi|123967), por exemplo, foram 130 e 320 vezes mais

expressos em soforose e avicel, respectivamente, em relação à glicose. Ademais, o

transcriptoma da cepa Δxyr1 nas mesmas condições revelou que alguns deles devem ser

regulados positivamente pelo ativador XYR1, como o gene da CAZyme da família AA3

(jgi|70803) e da proteína ortóloga SSCRP (jgi|104227), que tiveram uma redução de mais de

80 % no número de reads de celulose em relação à cepa selvagem (DOS SANTOS CASTRO et

107

al., 2014). A presença do elemento XBS na região promotora do gene 104227 (Tabela 3)

reforça o resultado observado nesse trabalho.

A construção de mutantes knockout é uma das estratégias mais utilizadas para se

investigar genes de funções desconhecidas, e o efeito de seu produto sobre determinada

resposta ou processo celular (KARLSSON et al., 2001; SEIBOTH et al., 2012; DERNTL et al.,

2017). Um dos objetivos propostos neste trabalho foi a construção de cepas deletadas para

os genes escolhidos. Em seguida, foi proposto caracterizá-las para avaliar uma possível

relação dos genes alvos com alterações da capacidade celulolítica do fungo em degradar a

parede celular do bagaço.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Microrganismos e condições de cultivo

Os microrganismos e plasmídeos utilizados neste capítulo estão listados na

Tabela 4. A levedura S. cerevisiae SC9721 e as bactérias Escherichia coli DH5α e TOP10 foram

utilizadas para montagem dos cassetes de deleção e propagação dos vetores,

respectivamente. A cepa S. cerevisiae SC9721 foi crescida em meio YPD líquido (20 g/L

peptona, 10 g/L extrato de levedura e 20 g/L glicose) a 30 °C, ou plaqueada em meio sólido

YNB ura- (7 g/L YNB (Yeast Nitrogen Base without amino acids), 20 g/L glicose e 20 g/L ágar)

suplementado com os aminoácidos histidina, leucina, triptofano e lisina. As bactérias foram

crescidas em meio líquido Luria-Bertani (LB) (10 g/L NaCl, 10 g/L triptona e 5 g/L extrato de

levedura) a 37 °C sob agitação de 200 rpm. Se aplicável, ampicilina foi adicionada a uma

concentração final de 100 mg/mL.

As cepas T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4, T. reesei QM6a Δtmus53, T. reesei

QM6a Δtmus53 Δxyr1 e T. reesei QM6a Δcre1 foram mantidas em meio MEX sólido (30 g/L

extrato de malte, 1 g/L peptona e 20 g/L ágar) e crescidas à 30 °C durante 5-7 dias, ou até

que houvesse esporulação suficiente. Se aplicável, uridina foi adicionada a uma

concentração final de 5 mM.

O meio Mandels-Andreotti (MA) (MANDELS; ANDREOTTI, 1978) foi utilizado na

transformação e seleção das cepas deletadas, e é composto de 20 mL/L de solução de

oligoelementos 50x (0,25 g/L FeSO4·7H2O, 0,085 g/L MnSO4·H2O, 0,07 g/L ZnSO4·7H2O, 0,1

g/L CaCl2·2H2O), 250 mL/L de solução mineral 2x (5,6 g/L (NH4)2SO4, 8,0 g/L KH2PO4, 1,2 g/L

MgSO4·7H2O, 1,6 g/L CaCl2·2H2O), 500 mL/L de tampão citrato-fosfato (0,1 M Na2HPO4, pH

108

5,0 ajustado com ácido cítrico 0,2 M), 1 mL/ L de uréia 5 M e uma concentração pré-

determinada da fonte de carbono (10 g/L D-glicose, 10 g/L glicerol ou 2 mM soforose).

Tabela 4. Relação dos microrganismos e plasmídeos utilizados neste capítulo.

Nome Genótipo Referência

Plasmídeos pRS426 ampR lacZ URA3 TEEPE et al., 2007

pJET-pyrG ampR, pyrG (A. fumigatus) DERNTL et al., 2016

Cepas

S. cerevisiae SC9721 MATa his 3-D200 URA 3-52 leu2D1 lys 2D202 trp 1D63

FGSC, 2006

E. coli DH5α F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-

Thermo Fisher Scientific, EUA

E. coli TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ( araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Thermo Fisher Scientific, EUA

T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4

Δtmus53 Δpyr4 DERNTL et al., 2015b

T. reesei QM6a Δtmus53 Δtmus53 STEIGER et al., 2011

T. reesei QM6a Δtmus53 Δxyr1 Δtmus53 Δxyr1 MELLO-DE-SOUSA et al., 2015

T. reesei QM6a Δtmus53 Δcre1 Δtmus53 Δcre1 NAKARI-SETÄLÄ et al., 2009

T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4 Δ105520::pyrG

Δtmus53 Δpyr4 Δ105520::pyrG Este trabalho

T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4 Δ60565::pyrG

Δtmus53 Δpyr4 Δ60565::pyrG Este trabalho

T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4 Δ123978::pyrG

Δtmus53 Δpyr4 Δ123978::pyrG Este trabalho

T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4 Δ123967::pyr4

Δtmus53 Δpyr4 Δ123967::pyr4 Este trabalho

3.2.2 Clonagem e construção dos cassetes

Foram utilizadas duas abordagens diferentes para clonagem e construção dos

cassetes de deleção. Na primeira, o cassete de deleção para o gene da hidrofobina foi

montado in vivo na levedura S. cerevisiae SC9721 por recombinação homóloga com o

plasmídeo pRS426. As leveduras transformadas foram selecionadas, o vetor com o cassete

purificado e transformado em E. coli DH5α para propagação. Os demais genes tiveram seus

cassetes construídos a partir de uma segunda abordagem, que consistiu na clivagem e

109

ligação do plasmídeo pJET-pyrG aos fragmentos das regiões flanqueadores do gene alvo,

com subsequente transformação na cepa E. coli TOP10 para propagação do vetor.

O vetor pJET-pyrG foi construído anteriormente pelo grupo da pesquisadora Drª.

Astrid Mach-Aigner (DERNTL et al., 2016) e possui o gene da orotidina-5'-fosfato

decarboxilase (pyrG, Afu2g08360) de A. fumigatus como marcador de seleção da

transformação de T. reesei. pyrG é ortólogo de pyr4 de T. reesei, que também foi utilizado no

cassete da hidrofobina, e os produtos destes genes catalisam a decarboxilação da orotidina

monofosfato (OMP) para formar uridina monofosfato (UMP) da via da biossíntese de

nucleotídeos. Assim, cepas transformadas com o cassete de deleção serão capazes de

crescer em meio não suplementado com uridina, enquanto que as não transformadas

continuarão a ser auxotróficas, uma vez que a cepa hospedeira (QM6a Δtmus53 Δpyr4)

possui o gene ortólogo pyr4 deletado.

A construção do cassete in vivo foi utilizada para a hidrofobina porque esse

protocolo estava já bem estabelecido em nosso grupo de pesquisa, e também porque foi um

dos primeiros genes escolhido para ser deletado. A montagem in vitro por clivagem e ligação

foi escolhida para os demais genes pois foi realizada no laboratório da Prof. Astrid, onde

esse protocolo era o mais utilizado.

Para a construção dos cassetes de deleção, sequências flanqueadoras de

aproximadamente 1.000 pares de base (pb) nas extremidades 5’ (5’UTR) e 3’ (3’UTR) do

gene a ser deletado foram primeiro amplificadas para cada gene escolhido (Tabela 4),

utilizando DNA polimerase Q5 High-Fidelity (New England Biolabs Inc., EUA) e o DNA

genômico de T. reesei QM6a como template nas reações de PCR. Para o gene da hidrofobina

(123967), tags com homologia para o plasmídeo pRS426 e para o marcador de seleção pyr4

(3.500 pb) de T. reesei foram adicionadas aos oligonucleotídeos (oligos) do gene da

hidrofobina. Para os demais genes, sítios de enzimas de restrição foram adicionados aos

oligos (Tabela 5). Outros oligos mencionados adiante também são apresentados na Tabela 5.

110

Tabela 5. Oligos utilizados para clonagem e caracterização genômica dos mutantes de T. reesei. Nucleotídeos marcados em negrito e sublinhados representam tags de homologia para o plasmídeo pRS426 e marcador pyr4. Nucleotídeos em negrito e itálico são sítios de enzimas de restrição.

Oligonucleotídeo Sequência (5' -> 3') Aplicação

123967_pRS426_Fw CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAAGGTCCATCTCTTTTGCA

Clonagem

123967_pyr4_Rv AAACGGACGGCAACAATCAACCGTTTGGCGGTGATGATGTTGTAAC

123967_pyr4_Fw GGTGCTCTGTTGGAGACGGGACGAAGAGCTCACCAGTCCTATTCCTG

123967_pRS426_Rv GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCCGTTTAGCCGCTGGCATCAC

104227 _5'UTR_Fw_ClaI AAATCGATATATTTGCGACGTTGACGAGCAT

104227 _5'UTR_Rv_NsiI AAATGCATTATGGCAGATGAAGCTCTCACG

104227 _3'UTR_Fw_SacI AAGAGCTCGGAATCTCGGAAGATAAAGGGA

104227 _3'UTR_Rv_NotI AAGCGGCCGCCGCTGGTGTTTGATCAGGGGG

105520 _5'UTR_Fw_ClaI AAATCGATAGACTGGTCCAATGATTCAGG

105520 _5'UTR_Rv_NsiI AAATGCATGTTCCGGTTACCTCCTCACCTG

105520 _3'UTR_Fw_SacI AAGAGCTCACTTCTGTGACTGTATACGCAT

105520 _3'UTR_Rv_NotI AAGCGGCCGCGGGTCTGATTGGGATACGTGCG

60565 _5'UTR_Fw_NcoI AACCATGGTCTTGAGCTTGTCCCTTGTT

60565 _5'UTR_Rv_NsiI AAATGCATGTCCATCTTAATCAAGACAATATGCC

60565 _3'UTR_Fw_EcoRI AAGAATTCACGGTCTGTACATATTGGATG

60565 _3'UTR_Rv_NotI AAGCGGCCGCCGGATGCGTTCCCAGAGCTC

70803_5'UTR_Fw_ClaI AAATCGATGTCAGCTTTGGTCAGACACA

70803_5'UTR_Rv_NcoI AACCATGGCGTCTAGAGCTGGACCGGGTCGA

70803_3'UTR_Fw_SacI AAGAGCTCGGAGTTGGTTTCCTAGAGTTGCA

70803_3'UTR_Rv_BspEI AATCCGGAAGAGATGCAGCTAGAACATGCG

123978_5'UTR_Fw_ClaI AAATCGATAACAACCAGATCGTTTCCTG

123978_5'UTR_Rv_AflII AACTTAAGGGTGATGAAGTAGGTTTGCT

123978_3'UTR_Fw_EcoRI AAGAATTCGCTCGGTCATTTTTCGAGTATC

123978_3'UTR_Rv_NotI AAGCGGCCGCCCCTTCGATTCTATGTTGGCCC

pyr4_T.reesei_Fw CGGTTGATTGTTGCCGTCCGTTTC

pyr4_T.reesei_Rv CGTCCCGTCTCCAACAGAGCACC

pyrG_A.fumigatus_5'Rv AATGGGGTAGACAGGCAGAAC

pyrG_A.fumigatus_3'Fw ACATTGTGCCTGTCATTAAACG

pJET1.2_Fw CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC

pJET1.2_Rv AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG

123967_5UTR_ext_Fw TCCCGTCTGACATTGATACAAGACC

Confirmação da

transformação

123967_3'UTR_ext_Rv TTGGGCTCGTCAATGTACAGCATGT

104227 _5'UTR_ext_Fw CCTATTCTCCTTTACTCAGGCG

104227 _3'UTR_ext_Rv GCACAGAACATCAGTAGCGAAG

105520 _5'UTR_ext_Fw ACGATGGAGCTGAAAGGATGGA

105520 _3'UTR_ext_Rv ACGTCCTTGCTTTACGGCATCTG

60565 _5'UTR_ext_Fw AGCCTTGGAAGTCAATGGAGA

60565 _3'UTR_ext_Rv CATGAAAGACGATGGCTGCTC

70803_5'UTR_ext_Fw CATCATAGTCGGGCCTTGGT

70803_3'UTR_ext_Rv AGAGAAACGTCGTCCAGCACAAT

123978_5'UTR_ext_Fw AGAGAGACGCCATCATCGCTTC

123978_3'UTR_ext_Rv CCAAGAATGGTGTCTTCCCGC

pyrG_interno_5’Rv AATGGGGTAGACAGGCAGAAC

pyrG_interno_3’Fw ACATTGTGCCTGTCATTAAACG

pyr4_interno_5’Rv GATAATACCTACCCAGTCAGACC

pyr4_interno_3’Fw GCAGCGTAACATCTTCAGAGC

111

3.2.2.1 Cassete da hidrofobina – construção in vivo por recombinação

homóloga

Para amplificar as regiões flanqueadoras 5’ e 3’ do gene da hidrofobina, e do

marcador pyr4 de T. reesei, foram utilizados os seguintes oligos: 123967_pRS426_Fw +

123967_pyr4_Rv, 123967_pyr4_Fw + 123967_pRS426_Rv, e pyr4_T.reesei_Fw +

pyr4_T.reesei_Rv, respectivamente (Tabela 5). Após eletroforese em gel de agarose, os

produtos da PCR foram purificados com o kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification

(GE HealthCare Life Sciences, EUA), e transformados com o plasmídeo pRS426 linearizado na

levedura SC9721, como descrito por GITZ e colaboradores (1992). Brevemente, as leveduras

crescidas overnight em meio YPD líquido foram transferidas para 200 mL de novo meio YPD

para crescimento até a fase exponencial. Alcançada a DO (densidade óptica) de 0,4, as

células foram centrifugadas, lavadas com água estéril, depois ressuspensas em 1 mL de

solução 1x TE/LiAc (100 µL 10x Tris-HCl/EDTA, 100 µL 10x acetato de lítio e 800 µL água).

Para a recombinação homóloga, 100 µL desta suspensão de células foram misturados a

aproximadamente 300 ng de cada um dos fragmentos purificados (regiões flanqueadoras 5’

e 3’, e gene pyr4) e 150 ng do plasmídeo pRS426 previamente linearizado com as enzimas de

restrição BamHI (G▼GATCC) e EcoRI (G▼AATTC) (Promega) (proporção em massa de DNA 2:1

(inserto:vetor)). 100 µg de DNA de esperma de salmão (Sigma-Aldrich, EUA) desnaturado a

100 °C por 10 minutos (min) e 600 µL de 40 % PEG/1x LiAc (50 % PEG 3.350, 10x acetato de

lítio) também foram adicionados à reação. Após a adição de 70 µL de DMSO 100 %, as

células foram aquecidas a 42 °C por 15 min e transferidas imediatamente para o gelo por 2

min para choque térmico.

As células foram centrifugadas, lavadas com água estéril e plaqueadas em meio

sólido YNB ura- suplementado com os aminoácidos histidina, leucina, triptofano e lisina.

Algumas colônias foram inoculadas e crescidas em meio YNB ura- líquido também

suplementado, para extração do DNA total com o kit DNAeasy Plant Mini (Qiagen). O

protocolo inicial foi modificado com a adição de pérolas de vidro tratadas com ácido nítrico

para promover a lise mecânica da parede celular das leveduras. Em seguida, foi realizada a

transformação do DNA total por eletroporação na cepa E. coli DH5α, e os transformantes

foram crescidos em meio LB sólido com ampicilina.

Colônias isoladas de bactérias foram crescidas em meio LB líquido contendo

ampicilina e os plasmídeos com os cassetes foram purificados utilizando o kit de extração

112

QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Após confirmação da correta montagem do plasmídeo, o

mesmo foi então utilizado como template para amplificação do cassete de deleção por PCR,

utilizando TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase (Clontech) e os oligos 123967_pRS426_Fw e

123967_pRS426_Rv (Tabela 5). A seguinte ciclagem foi utilizada: 30 ciclos de 98 °C por 10

segundos (desnaturação do DNA), 55 °C por 30 segundos (anelamento dos oligos) e 72 °C por

6 min (extensão). Os cassetes amplificados foram separados por tamanho por eletroforese

em gel de agarose 0,8%, tiveram suas bandas purificadas e sequenciadas para confirmação

de sua montagem. A Figura 9 ilustra a montagem do cassete da hidrofobina por

recombinação homóloga in vivo.

Figura 9. Construção do cassete de deleção do gene da hidrofobina. No primeiro passo, as regiões flanqueadoras (amarelo) do gene alvo são amplificadas com oligos contendo tags para o plasmídeo pRS426 (preto) e o gene marcador pyr4 de T. reesei (verde). O gene pyr4 é amplificado e os três fragmentos são transformados na levedura SC9721 junto com o plasmídeo pRS426 linearizado contendo o gene de resistência à ampicilina (Ampᴿ) e o gene ura3 (biossíntese de ácidos nucleicos). O cassete de deleção é então montado pela levedura por recombinação homóloga das tags com os DNAs do plasmídeo, regiões flanqueadoras 5’ e 3’, e o gene pyr4. O esquema foi modificado do trabalho de GOUVÊA (2009). O tamanho dos fragmentos, tags e do plasmídeo não estão em escala proporcional.

113

3.2.2.2 Demais cassetes – construção por clivagem e ligação in vitro

Para amplificar as regiões flanqueadoras 5’ e 3’ do gene 104227, foram utilizados

os oligos com tag para enzimas de restrição 104227 _5'UTR_Fw_ClaI +

104227_5'UTR_Rv_NsiI e 104227 _3'UTR_Fw_SacI + 104227 _3'UTR_Rv_NotI (Tabela 5),

respectivamente. O mesmo foi realizado para os demais genes com os respectivos oligos

(Tabela 5). A enzima Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs Inc., USA) foi

utilizada com a seguinte ciclagem: 30 ciclos de 98 °C por 10 segundos, 60 °C por 30 segundos

e 72 °C por 1 min. Os produtos amplificados foram purificados de gel de agarose após

eletroforese e clonados no vetor pJET1.2 (2.974 pb) digerido com EcoRV (GAT▼ATC),

utilizando os kits GeneJET Gel Extraction e CloneJET PCR Cloning (Thermo Fisher Scientific,

EUA), respectivamente, seguindo as recomendações dos fabricantes. Os vetores das colônias

recombinantes foram extraídos utilizando o kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher

Scientific, EUA) e sequenciados (Microsynth, Áustria) para verificar a sequência correta dos

insertos. Cada inserção foi então excisada para subsequente clonagem no vector pJET-pyrG

pela digestão com as endonucleases de restrição adequadas (Tabela 5) (todas as enzimas

foram adquiridas da New England Biolabs Inc., EUA).

Apenas após confirmar a ligação da sequência flanqueadora 5’ no vetor pJET-

pyrG por PCR de colônia e digestão, a outra sequência flanqueadora 3’ foi clonada no vetor.

A construção dos cassetes de deleção foi confirmada por amplificação da região do vetor

pJET-pyrG contendo as três sequências: extremidade 5’ (1 kb), marcador pyrG (1,5 kb) e

extremidade 3’ (1 kb) do gene alvo. Para aumentar a quantidade do vetor construído com o

cassete de deleção, colônias recombinantes foram inoculadas em frascos de 250 mL

contendo 50 mL de meio LB líquido com ampicilina a 37 °C overnight sob agitação de 200

rpm. Os vetores foram extraídos utilizando o kit XChange Plasmid Midi (VWR International,

USA), e quantificados no NanoDrop ™ One/One (Thermo Fisher Scientific, EUA). A seguir, é

mostrado um esquema simplificado com os passos da construção dos cassetes utilizando o

vetor pJET-pyrG (Figura 10).

114

Figura 10. Principais passos da clonagem por clivagem e ligação do vetor pJET-pyrG para construção dos cassetes de deleção. Sequências flanqueadoras de aproximadamente 1 kb das extremidades 5’ e 3’ dos genes alvo foram amplificadas utilizando oligos com sítios de restrição (Tabela 5). Os produtos de PCR foram clonados no vetor pJET-pyrG digerido com as enzimas de restrição correspondentes. Os sítios das enzimas de restrição e os oligos são indicados. AmpR: gene de resistência à ampicilina; pyrG_Afu: orotidina-5'-fosfato decarboxilase de A. fumigatus.

115

3.2.3 Transformação de T. reesei

A transformação de protoplastos mediada por PEG foi realizada de acordo com

DERNTL e colaboradores (2015a), e modificado de GRUBER e colaboradores (1990).

Brevemente, os esporos da cepa auxotrófica T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4 foram

ressuspensos em uma solução contendo 8 g/L NaCl e 0,5 mL/L Tween 80, e inoculados em

discos de celofane dispostos na parte de cima de 4-5 placas de Petri (90 x 15 mm), contendo

extrato de malte suplementado com uridina. Os esporos foram incubados a 30 °C overnight

para crescimento do micélio. Os micélios foram raspados dos discos de celofane com auxílio

de uma pinça estéril e digeridos em uma solução enzimática contendo 40 mg de β-glucanase

from Trichoderma longibrachiatum (Sigma Aldrich, EUA) e 75 mg de driselase® from

Basidiomycetes sp. (Sigma Aldrich, EUA) dissolvidos em 10 mL de tampão P (pH 5,6) (79,2 g/L

(NH4)2SO4, 5,7 g/L KH2PO4, 1,42 g/L K2HPO4) por 4-5 h sob agitação de 60 rpm a 30 °C. Os

protoplastos foram filtrados em lã de vidro, centrifugados a 3.000 g por 10 min à 20 °C e o

pellet lavado com 10 mL de tampão P. Após nova centrifugação, o pellet foi ressuspenso em

1-2 mL de tampão STC (218 g/L sorbitol, 1,45 g/L CaCl2.2H2O, 10 mL/L 1 M Tris.HCl, pH 7,4) e

uma alíquota de 150 μL foi incubada com 15-20 μg do vetor pJET-pyrG previamente

linearizado com NotI-HF e contendo o cassete de deleção. No caso da hidrofobina, 10-15 μg

do cassete amplificado por PCR e purificado de gel de agarose foram utilizados na reação.

Após 30 min no gelo, 1 mL de solução de PEG (249,4 g/L PEG 6.000, 7,5 g/L CaCl2.2H2O, 10

mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5)) foi adicionado para carrear o DNA para o interior dos protoplastos.

A cada volume de transformação foram adicionados 40 mL de meio MA aquecido (55 °C)

suplementado com 1,2 M sorbitol, 10 g/L D-glicose, 15 g/L ágar e sem uridina. O volume de

10 mL (top medium) foi despejado em quatro placas de Petri contendo 10 mL do mesmo

meio já solidificado (bottom medium), e as placas foram incubadas a 30 °C por 3-5 dias até

visualização das colônias transformantes. Sorbitol foi utilizado como estabilizador osmótico

para os protoplastos pela ótima taxa de regeneração (> 90 %) em T. reesei (R. L. MACH; S.

ZEILINGER, 2002).

Plugs de ágar contendo os transformantes foram recortados e transferidos para

novo meio MA sem sorbitol e suplementado com 10 g/L D-glicose para formação de esporos.

Para seleção de homokaryons, os esporos foram estriados e crescidos em meio MA

suplementado com 10 g/L D-glicose e 1 mL/L IGEPAL CA-630 ou 1 mL/L Triton X-100, como

fonte de carbono e agentes restritores de colônia, respectivamente, a 30 °C por 3 dias.

116

Transformantes isolados de esporo único foram crescidos em meio líquido MEX a 30 °C por

3-4 dias para formação de micélio. Para confirmação das deleções gênicas, o DNA genômico

foi isolado com pérolas de vidro utilizando o agitador FastPrep®-24 Classic (5.0 m/s, 30

segundos) (MP Biomedicals, EUA) seguido de um protocolo baseado em fenol-clorofórmio. O

RNA foi degradado utilizando RNase A (Thermo Fisher Scientific, EUA), e o DNA foi

precipitado com isopropanol, lavado com etanol 70 % (v/v) e ressuspenso em água destilada.

O DNA genômico foi utilizado como template nas reações de PCR utilizando OneTaq® Quick-

Load® DNA Polymerase (New England Biolabs Inc., EUA).

A Figura 11 exemplifica a recombinação homóloga do cassete de deleção no

locus gênico de interesse, e mostra também a mudança dos sítios de enzimas de restrição e

a região de anelamento da sonda utilizada na técnica de southern blotting (ver adiante).

Figura 11. Exemplo de recombinação homóloga e deleção gênica. Primeiramente, a cepa selvagem (T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4) foi transformada com o vetor pJET-pyrG linearizado, que possui as regiões flanqueadoras 5’ e 3’ do gene alvo. A ORF (Open Reading Frame) foi substituída então pelo marcador pyrG via recombinação homóloga, dando origem a uma cepa mutante prototrófica. As setas indicam os oligos utilizados nas combinações de PCR para confirmação da deleção. A barra verde na região flanqueadora 5’ representa a sonda utilizada para southern blotting (ver adiante). Como exemplo, são mostrados sítios de restrição para a enzima NcoI. Linha sólida e pontilhada representam o DNA genômico e do vetor, respectivamente.

3.2.4 Confirmação das deleções gênicas por PCR

Após a transformação dos protoplastos com os cassetes purificados (para

hidrofobina) ou com os vetores linearizados (demais genes), as colônias supostamente

transformadas tiveram seu DNA genômico isolado e utilizado como template nas reações de

PCR para confirmação da integração do cassete no locus gênico correto. Cada reação foi

117

composta de: 1,0 μL de DNA genômico diluído (100-200 ng), 5,0 μL de 5X OneTaq® Standard

Reaction Buffer, 0,5 μL de dNTPs (10 mM), 0,5 μL de oligos forward e reverse (10 pmol/μL),

0,125 μL de OneTaq® DNA Polymerase (5 U/μL) (New England Biolabs Inc., EUA) e 17,4 μL de

água estéril para completar o volume final de 25 μL. As amostras foram amplificadas em

termociclador com a seguinte ciclagem: 98 °C por 30 segundos; 30 ciclos de 94 °C por 30

segundos, 60 °C por 1 min e 68 °C por 2-7 min, e uma extensão final de 68 °C por 5 min. Em

seguida, os produtos amplificados foram marcados com o fluoróforo GelRed™ (Biotium,

EUA) diluído 500x em água destilada, e aplicados em gel de agarose 0,8-1,0 % (m/v) imerso

em tampão TAE 1x (Tris-Acetato-EDTA). As bandas de DNA foram visualizadas após

exposição à luz UV.

No total, três combinações diferentes de oligos foram utilizadas para confirmar a

integração correta dos três fragmentos – regiões flanqueadoras 5’ e 3’, e o gene repórter

pyr4 (para hidrofobina) ou pyrG (para os demais genes) - que compõem o cassete. Na

primeira e segunda combinação, um oligo anela externamente ao cassete em uma das

extremidades 5’ ou 3’, enquanto que o outro anela internamente ao gene marcador. Na

terceira combinação, ambos os oligos anelam em regiões externas ao cassete (Figura 11). Os

oligos utilizados e os tamanhos esperados das bandas de DNA amplificadas por PCR são

mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Combinações de oligos utilizados nas reações de PCR para confirmar as deleções gênicas em T. reesei.

Combinação de oligos

Oligo forward Oligo reverse

Tamanho esperado do produto da PCR (kb)

Selvagem Mutante

Gene da hidrofobina

#1 123967_5UTR_ext_Fw pyr4_interno_5’Rv - 2,0

#2 pyr4_interno_3’Fw 123967_3'UTR_ext_Rv - 2,25

#3 123967_5UTR_ext_Fw 123967_3'UTR_ext_Rv 3,7 6,0

Demais genes

#1 5'UTR_ext_Fw pyrG_interno_5’Rv - 2,0

#2 pyrG_interno_3’Fw 3'UTR_ext_Rv - 2,0

#3 5'UTR_ext_Fw 3'UTR_ext_Rv 3,4-5,7* 4,5

* 104227: 3,4 kb; 105520: 5,4; 60565: 5,2; 70803: 5,7; 123978: 5,1.

3.2.5 Southern blotting

A técnica do southern blotting foi realizada para complementar as reações de

PCR na confirmação da deleção gênica, e também para analisar a presença de núcleos

118

heterokaryons e necessidade de outra rodada de seleção dos transformantes. O princípio

desta técnica consiste em marcar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos por sondas

radioativas ou “frias”. Após a transformação de T. reesei e recombinação homóloga dos

cassetes de deleção, os DNAs genômicos das cepas mutantes são alterados no locus do gene

deletado, de modo a mudar o padrão de clivagem em relação à cepa selvagem. Isso resulta

na formação de fragmentos que são marcados por sondas e visualizados na forma de bandas

de diferentes tamanhos (Figura 11).

Neste trabalho, foram utilizadas sondas “frias” preparadas com o kit Amersham

Gene Images AlkPhos Direct Labelling and Detection System (GE Healthcare, EUA), seguindo

as recomendações do fabricante. Em resumo, 80-100 µg de DNA genômico da cepa

selvagem e dos supostos mutantes foram digeridos com a enzima de restrição apropriada

(100 U) a 37 °C por 2 h, e separados por eletroforese (70 V, 120 min) em gel de agarose 0,8

% (m/v). Como controle, o produto de PCR (50-100 ng) utilizado como sonda também foi

separado em gel de agarose algumas vezes junto com as demais amostras. Após fotografar o

gel, o DNA (carga negativa) foi transferido overnight por capilaridade para uma membrana

de nylon carregada positivamente (Hybond®-N+ hybridization membrane, Sigma-Aldrich,

EUA) em contato com uma solução 10X de citrato de sódio (8,8 g/L de citrato de trissódio e

17,5 g/L de NaCl, pH 7,0). A membrana foi incubada a 80 °C por 2 h em um forno de

hibridização para fixação do DNA, e em seguida equilibrada por 10 min com um reagente de

hibridização (0,25 mL/cm²) previamente aquecido a 55 °C. A sonda de DNA (400 ng)

amplificada da região flanqueadora 5’ de cada gene e conjugada previamente com fosfatase

alcalina foi então adicionada à garrafa contendo o tampão de hibridização e membrana, e

incubada overnight a 55 °C. O tampão contendo a sonda foi removido e a membrana lavada

duas vezes com tampão contendo reagente de bloqueio a 55 °C, e outras duas vezes com

solução contendo 1 M de Tris base e 2 M de NaCl. O substrato fluorescente ECF da fosfatase

alcalina (~25 μL/cm2) foi adicionado à membrana e o excesso removido. Após 40 min de

incubação à temperatura ambiente e protegida da luz, a membrana foi revelada no

fotodocumentador ImageQuant® LAS 500 (GE Healthcare, EUA). Em casos em que a

fluorescência estivesse baixa, aumentou-se o tempo de incubação para até 5 h.

119

3.2.6 Teste de crescimento por massa seca

A cepa selvagem (T. reesei QM6a Δtmus53 Δpyr4) e os mutantes de T. reesei

tiveram seu crescimento avaliado em diferentes fontes de carbono. Foram utilizadas de 2-3

placas esporuladas após 8-10 dias, contendo meio sólido PDA suplementado com uridina. Os

esporos foram ressuspensos em água e diluídos 100X para contagem na câmara de

Neubauer. 2 x 106 esporos foram inoculados em erlenmeyers de 250 mL, contendo 30 mL de

MA com 20 g/L de glicose, xilose, Na-CMC (celulose solúvel) ou 5 g/L de bagaço explodido a

vapor (BEX). Os inóculos foram incubados a 29 °C sob agitação de 200 rpm, na presença de

luz artificial. Os cultivos em glicose e xilose foram incubados por 96 h, e 192 h para CMC e

BEX. Esta diferença de tempo se deve ao fato do crescimento do fungo ser menor nestas

duas últimas fontes de carbono, havendo a necessidade de se incubar por um tempo maior

para ganho de massa fúngica. Após o tempo de incubação, os micélios foram separados do

meio por filtração à vácuo com filtros de celulose. O sobrenante foi coletado, aliquotado e

guardado a -20 °C para quantificação de proteína total e atividade enzimática. A massa seca

foi obtida e pesada após secar os micélios a 60 °C por 3 dias em uma estufa microbiológica.

As amostras em BEX foram desconsideradas da análise de crescimento por massa seca em

razão da dificuldade de se separar o micélio do bagaço. Para essas amostras, somente a

quantificação de proteína total e os ensaios de atividade enzimáticos foram realizados. Todo

experimento foi realizado em triplicata biológica.

3.2.7 Quantificação de proteína total

A quantificação de proteína total do sobrenadante foi aferida por fluorescência

com o kit Qubit Protein Assay (faixa de detecção: 0,25-5 µg) (Thermo Fisher Scientific, EUA),

no leitor Qubit 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, EUA). Sucintamente, uma solução de

trabalho foi preparada diluindo o fluoróforo concentrado em tampão, na proporção 1:200.

Esta solução foi utilizada para diluir três amostras-padrão (0, 200 e 400 ng/μL) e as amostras

dos sobrenadantes, em um volume final de 200 μL por reação. Foram utilizados 10 e 20 μL,

respectivamente, para construir a curva padrão e quantificar as proteínas totais.

3.2.8 Atividade enzimática

A atividade enzimática dos sobrenadantes da cepa selvagem e dos mutantes de

T. reesei foi avaliada através do método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) pela liberação de

120

açúcares redutores, e também pela hidrólise dos substratos sintéticos derivados de pNP (ρ-

nitrophenol). Para as atividades enzimáticas aferidas pelo método DNS, 50 μL de substrato e

20 μL do sobrenadante de fungo foram diluídos em tampão acetato de sódio 100 mM (pH

4,8) para completar um volume final de 100 μL. Dependendo da absorbância lida, a amostra

era diluída 10X no mesmo tampão para repetição da análise. A reação foi incubada a 50 °C

em um termociclador por 30 min para CMC (concentração estoque de 10 g/L), e 10 min para

xylan from beechwood (concentração estoque de 5 g/L) (Sigma-Aldrich, EUA). 100 μL de DNS

foram adicionados para paralisar a reação. A absorbância foi aferida a 540 nm em um leitor

de placas (Tecan Infinite M200 PRO, Suíça), e diluições seriadas de glicose e xilose foram

utilizadas para construção da curva padrão das atividades de celulase e xilanase,

respectivamente. Cada unidade (IU) de atividade enzimática foi definida como a quantidade

de enzima necessária para liberar 1 μmol de açúcar redutor por min.

Para as atividades específicas de CBH e BGL foram utilizados os substratos

sintéticos pNPC (4-nitrophenyl β-D-cellobioside) e pNPG (4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside)

(Sigma Aldrich, EUA), respectivamente. A atividade foi aferida diluindo-se 30 μL do

sobrenadante de T. reesei em 20 μL de tampão citrato de sódio 100 mM (pH 4,8) e 50 μL do

respectivo substrato pNP (10 mM). A reação foi incubada a 50 °C por 10 min para pNPC e

pNPG. A reação foi paralisada pela adição de 100 μL de carbonato de sódio 1 M. A

absorbância foi aferida a 410 nm no mesmo leitor de placas, e diluições seriadas de pNP

foram utilizadas para construção da curva padrão. Cada unidade (IU) de atividade enzimática

foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de pNP por min.

Como controle (branco) de ambas metodologias para atividade enzimática, os

substratos foram incubados apenas com tampão nas mesmas condições de temperatura e

tempo, e foram adicionados os mesmos volumes de sobrenadante contendo as enzimas

após a paralisação das reações com DNS ou carbonato de sódio. O valor da absorbância

detectado foi descontado do controle, e a atividade foi calculada com base na equação de

regressão da curva padrão de glicose e xilose para DNS, ou pNP.

3.2.10 Expressão gênica por RT-qPCR

Uma alíquota de 100 mg separada anteriormente para cada amostra foi

ressuspensa em 1 mL do reagente peqGOLD TriFast (PEQLAB Biotechnologie, Alemanha) e

homogeneizada no agitador FastPrep®-24 Classic (5,0 m/s, 30 segundos) (MP Biomedicals,

121

EUA). O RNA total foi isolado seguindo as recomendações do fabricante, e a concentração

quantificada por NanoDrop™ One/One (Thermo Fisher Scientific, EUA). 10 μg de RNA foram

tratados com o kit TURBO DNA-free (Thermo Fisher Scientific, EUA) para digestão do DNA

genômico residual, e em seguida o cDNA foi sintetizado utilizando a enzima SuperScript™ II

Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, USA), a partir de 500 ng de RNA tratado.

Antes e depois do tratamento com DNase, as amostras de RNA tiveram sua integridade

verificada com o kit Agilent RNA 6000 Nano, no instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer

System (ambos da Agilent Technologies, EUA).

Em seguida, oligos específicos para a região codante de cada gene alvo foram

desenhados para amplificar uma região de 80-200 pb (Tabela 7), utilizando o Primer Express

Software v3.0.1 (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os produtos amplificados com estes oligos

com Taq DNA Polymerase I (Thermo Fisher Scientific, EUA) foram separados por gel de

agarose 2 % (90 V, 120 min) e purificados com o kit PureLink Quick Gel Extraction (Thermo

Fisher Scientific, EUA). Os produtos purificados para cada gene foram diluídos na base 10

(10-1 a 10-8) e utilizados na construção da curva padrão. As reações de qPCR foram realizadas

utilizando-se 1,0 μL do cDNA diluído 10X ou 1,0 μL da diluição seriada, 5,0 μL do mix SYBR®

Green PCR Master (Thermo Fisher Scientific, EUA), 2 pmol dos oligos forward e reverse

(Tabela 7), e água estéril para completar o volume final de 10,0 μL. Todas as reações foram

realizadas no ViiA 7 Real Time PCR system (Thermo Fisher Scientific, EUA), utilizando a

seguinte ciclagem: ativação por 10 min a 95 °C seguida de 40 ciclos de desnaturação (15

segundos a 95 °C), anelamento e extensão (1 min a 60 °C). A quantificação da expressão

gênica foi feita relacionando a quantidade de produto inicial de cada gene com o valor de Ct

(cycle threshold) de cada reação de amplificação. A normalização foi realizada dividindo-se a

média da quantidade de transcrito de cada gene (obtidas nas réplicas) pela média das

quantidades dos transcritos dos genes normalizadores (act e sar1). Somente oligos com

eficiência de amplificação ≥ 85 %, coeficiente de correlação (R²) ≥ 0.98 e curva melting

específica com único pico foram considerados na análise. A aquisição dos dados e análise da

curva melting foram realizadas no software ViiA™ 7 (Thermo Fisher Scientific, EUA).

122

Tabela 7. Relação dos oligonucleotídeos utilizados nas análises de qPCR.

Oligonucleotídeo Sequência (5' -> 3')

act_Fw CGTGACATCAAGGAGAAGCTCT act_Rv CTCTCAAGACCCAGGACAGAAG sar1_Fw TGGATCGTCAACTGGTTCTACGA sar1_Rv GCATGTGTAGCAACGTGGTCTTT cbh1_Fw ACCACCAAGAAATTGACCGT cbh1_Rv CGCCCTTGTCTGAGAAAGAG 105520_Fw TCTCCGGTCAGAAGTTTGCC 105520_Rv AGGAGGGCGTTTGATCAGTG

123978_Fw TCAGACGCTTGATGATTTGCATCGC 123978_Rv AAGTCACGGTTCCAGTGGTC hfb_Fw CAACCCGCTGTGCTGTGA

hfb_Rv ACAGACGCTGCCAAAGGACTT

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.3.1 Transformação de T. reesei

A construção do cassete de deleção da hidrofobina por recombinação homóloga

na levedura SC9721 e a montagem dos demais cassetes in vitro foram confirmadas por PCR,

utilizando-se os oligos que anelam nas extremidades das regiões flanqueadoras 5’ e 3’

(Tabela 5, Figura 12). Após a amplificação, os produtos da PCR foram verificados em gel de

agarose. Os cassetes da hidrofobina e demais genes apresentaram bandas com os tamanhos

esperados de 5,5 (2 kb das duas regiões flanqueadoras + 3,5 kb do marcador pyr4) e 3,5 kb

(2 kb das duas regiões flanqueadoras + 1,5 kb do marcador pyrG), respectivamente.

Figura 12. Confirmação por PCR da construção dos cassetes de deleção. A presença das bandas com os tamanhos esperados indica que as regiões flanqueadoras 5’ e 3’ estão adjacentes aos marcadores pyr, e que as construções foram bem sucedidas. É mostrada a amplificação do cassete da hidrofobina de cinco colônias diferentes (#1-5). CT-: controle negativo da reação sem template de DNA.

Os cassetes amplificados e purificados da hidrofobina, e os vetores linearizados

com os cassetes dos demais genes foram utilizados para transformar os protoplastos de T.

reesei. Para cada gene, foram obtidas entre 80 e 160 colônias (Figura 13A). Cada colônia foi

123

isolada e transferida para o mesmo meio seletivo anterior, mas sem sorbitol, para regenerar

a parede celular e formar esporos. Apenas as colônias que cresceram mais rápido e tiveram

um crescimento mais regular caracterizado pela mesma densidade de hifa ao redor do plug

foram consideradas para a próxima rodada de seleção (Figura 13B). Apesar das demais

colônias terem conseguido crescer em meio sem uridina, elas foram consideradas mutantes

falso-positivos e excluídas das análises posteriores. Provavelmente elas tiveram uma

integração parcial do cassete e expressão do marcador pyr, permitindo seu crescimento no

meio, mesmo na ausência de uridina.

Figura 13. Seleção dos transformantes de T. reesei. A) Colônias crescidas após 5 dias, em meio MA suplementado com sorbitol sem uridina. B) Plugs de ágar transferidos para meio MA sem sorbitol e uridina para formação de esporos. É visível a diferença de crescimento entre as colônias transferidas para a mesma placa. Colônias de falso-positivos (C) e mutantes putativos (D) crescendo em meio contendo IGEPAL para seleção de homokaryon. Asteriscos vermelhos indicam mutantes putativos escolhidos para análises posteriores.

Após essa “inspeção visual”, um número menor de colônias foi transferido para

meio seletivo contendo IGEPAL ou Triton X-100. O uso destes restritores de crescimento de

colônia assegura a seleção de um único esporo homokaryon, eliminando o background de

heterokaryons de outras células. Novamente mais algumas colônias falso-positivas foram

eliminadas neste passo (Figura 13C), e apenas 2-5 colônias para cada gene foram

consideradas positivas (Figura 13D) e crescidas em meio MEX líquido contendo uridina para

extração do DNA genômico. Os DNAs genômicos dos mutantes putativos foram então

124

utilizados como template em reações de PCR, utilizando três combinações diferentes de

oligos para confirmar a deleção gênica (Figura 14).

Figura 14. Confirmação das deleções gênicas por PCR, utilizando três combinações de oligos. Os oligos utilizados anelaram na região interna e externa dos cassetes, de modo a comprovar a sua total integração no locus gênico correto. A confirmação foi verificada pelo padrão de bandas esperado para cada gene, como mostrado na Tabela 6. Alguns mutantes falso-positivos (seta amarela) foram encontrados e eliminados das análises posteriores.

125

Como já mostrado anteriormente (Tabela 6), os oligos anelaram em regiões

encontradas no interior do cassete e também fora dele. O DNA genômico da cepa parental

QM6a foi utilizado como controle negativo das transformações, e seu padrão de bandas

comprovou a correta integração do cassete no locus gênico desejado ou a presença de

mutantes falso-positivos (Figura 14).

Do total de seis genes escolhidos, apenas os genes 70803 e 104227 não tiveram

sua deleção confirmada por PCR. Apesar de algumas colônias terem sido isoladas e

apresentarem pelo menos uma das bandas esperadas, elas tiveram uma integração parcial

ou ectópica do cassete no locus gênico. Além destes dois genes, outros mutantes falso-

positivos também apareceram na transformação de outros genes. Na Figura 14, a

transformação do gene 123978, por exemplo, resultou no aparecimento de pelo menos três

mutantes falso-positivos (setas amarelas). Ainda que a região interna ao cassete na

extremidade 3’ tenha sido amplificada, não houve amplificação dos produtos esperados nas

outras duas combinações de oligos. Assim, apenas os genes 123967, 60565, 123978 e

105520 tiveram seus mutantes selecionados para a próxima etapa de confirmação por

southern blotting.

A etapa do southern blotting foi realizada em paralelo às amplificações por PCR

para confirmar a deleção gênica e também a presença de mutantes homokaryons, portando

apenas núcleos transformados com os cassetes de deleção. No total, foram identificados

três mutantes verdadeiros para 123967, 123978, 105520 e cinco para o 60565 (Figura 15). A

correta integração dos cassetes gera um novo padrão de clivagem no locus gênico e,

consequentemente, altera os tamanhos dos fragmentos marcados pelas sondas. Isso

permite que seja possível diferenciar um mutante verdadeiro de um falso-positivo. Após a

etapa de confirmação por PCR, apenas um falso-positivo (seta amarela, Figura 15) foi

identificado para o gene 123978, mostrando que o southern blotting é uma técnica

importante para fazer uma dupla checagem dos mutantes.

126

Figura 15. Esquema da integração do cassete de deleção no locus gênico da cepa parental QM6a e membrana revelada do southern blotting. No esquema, são mostrados os loci gênicos do gene a ser deletado antes e após a transformação por recombinação homóloga. As regiões flanqueadoras 5’ e 3’ foram utilizadas na construção dos cassetes juntamente com o marcador pyr4 (para a hidrofobina) ou pyrG (para os demais genes). As linhas pretas contínuas e pontilhadas representam o DNA genômico da cepa QM6a e os cassetes de deleção, respectivamente. A barra laranja embaixo da região flanqueadora 5’ indica a região utilizada como sonda no southern blotting. A seta amarela na membrana do gene 123978 indica um mutante falso-positivo com integração parcial do cassete.

127

3.3.2 Caracterização fenotípica de T. reesei

A fim de verificar a influência da deleção dos genes sobre a produção de

celulases e sacarificação do bagaço em T. reesei, ou outra característica fenotípica relevante

como alteração de crescimento, os mutantes tiveram seus fenótipos avaliados quanto ao

crescimento por massa seca em diferentes fontes de carbono, secreção de proteína total e

atividade enzimática. Dessa forma, um mutante confirmado por PCR e southern blotting de

cada gene foi comparado com os demais mutantes e com a cepa parental QM6a não

transformada.

Para avaliação de diferença de crescimento, as cepas foram crescidas em duas

fontes de carbono consideradas indutoras da produção de celulases (xilose e CMC) e

também em glicose, como fonte repressora. Os inóculos foram realizados em meio líquido a

partir da mesma quantidade de esporos. Em glicose não houve diferença significativa de

crescimento entre todas as cepas avaliadas, mas na condição xilose e CMC, as cepas com os

genes 105520, 60565 e 123978 deletados apresentaram um crescimento duas vezes maior

do que o controle (Figura 16A). Em relação às diferentes fontes de carbono analisadas, todas

as cepas cresceram mais em glicose e xilose do que em CMC, mesmo com o dobro de tempo

entre estas condições (96 h contra 192 h) (Figura 16A). Este crescimento já era esperado,

uma vez que glicose e xilose são açúcares prontamente assimiláveis e não requerem a

síntese de enzimas hidrolíticas para serem consumidos pela célula. De modo inverso, o CMC

requer a ação de pelo menos três enzimas para sua conversão em glicose: CBHs, EGLs e

BGLs.

128

Figura 16. Avaliação de crescimento por massa seca (A) e quantificação de proteína total secretada no meio extracelular (B). Os inóculos foram realizados a partir da mesma concentração de esporos para todas as cepas, e a quantificação de proteína total foi obtida dos extratos brutos. O teste estatístico one-way ANOVA seguido do teste de múltiplas comparações de Dunnett foi aplicado, utilizando a cepa parental QM6a como referência.*pvalue < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001; **** < 0,0001.

Em seguida, foi realizada a quantificação de proteínas totais secretadas no meio

nestas mesmas condições de crescimento e também em BEX (Figura 16B). Novamente em

glicose não houve diferença significativa na quantidade de proteínas secretadas entre as

cepas. Em xilose, a deleção dos genes 105520, 60565 e 123978 levou a um aumento de

aproximadamente duas vezes em relação ao controle. Em CMC e BEX, as cepas Δ123978 e

Δ105520 tiveram uma redução de 50 % na quantidade de proteínas secretadas,

respectivamente em relação ao controle (Figura 16B). É interessante notar ainda que os

níveis de proteínas secretadas em glicose foram comparáveis e até maiores do que nas

demais condições de crescimento (Figura 16B). Isso pode ser parcialmente explicado pelo

fato de T. reesei ativar um metabolismo basal que induz a expressão e secreção de algumas

enzimas, como quitinases (ILMÉN et al., 1997; MACKENZIE; JEENES; ARCHER, 2004).

Contudo, vale lembrar que essa indução é inferior àquela causada pelas moléculas indutoras

soforose e celulose, por exemplo. Proteases também são produzidas e secretadas por fungos

em glicose, e podem contribuir para essa dose de proteínas extracelulares (SOUZA et al.,

2015).

As atividades enzimáticas de CMCase e xilanase foram medidas e normalizadas

pela quantidade total de proteínas de cada amostra para avaliar a influência das deleções

sobre o sistema celulolítico de T. reesei. O substrato Na-CMC é utilizado comumente nos

ensaios de celulase para avaliar a produção e atividade de endoglucanases, enquanto que o

xilano é utilizado para verificar a atividade de xilanase total. Para CMCase, houve diferença

129

significativa de atividade entre as cepas em CMC e BEX (Figura 17A). Em CMC, foi verificado

um aumento significativo de atividade para as cepas Δ60565 e Δ123978. A cepa Δ60565

também apresentou maior atividade em BEX comparado com o controle (Figura 17A). De

forma contrária, a cepa Δ105520 mostrou uma diminuição significativa da atividade em BEX.

Como era esperado, praticamente não houve atividade em glicose em todas as cepas (Figura

17A). A glicose é um açúcar ativador da resposta da RCC e inibe a transcrição de genes de

várias celulases.

Figura 17. Atividades de CMCase (A) e xilanase (B) normalizadas por proteína total das cepas controle e mutantes de T. reesei, crescidas em diferentes fontes de carbono. Como já esperado, a condição glicose não induziu a produção de celulases e hemicelulases. As demais fontes de carbono tiveram efeito positivo sobre a produção e atividade destas enzimas. O teste estatístico one-way ANOVA seguido do teste de múltiplas comparações de Dunnett foi aplicado, utilizando a cepa parental QM6a como referência.*pvalue < 0,05; ** < 0,01.

Para as atividades de xilanase, houve diferença significativa entre as cepas em

xilose, CMC e BEX (Figura 17B). Em xilose e CMC, a deleção dos genes 105520 e 123978

ocasionou o mesmo perfil de atividade em relação ao controle, e reduziu a formação de

xilanase em ambas as fontes de carbono. Em BEX, somente a cepa Δ105520 apresentou

diminuição considerável da atividade xilanolítica. Em ordem decrescente, BEX, CMC e xilose

foram os maiores indutores da produção de xilanases, enquanto que as cepas crescidas em

glicose não apresentaram atividade. É interessante observar também que as cepas em BEX

apresentaram as maiores atividades (> 150 IU/mg) em relação às demais condições (Figura

17B), comprovando os resultados encontrados na literatura de que o bagaço de cana é um

bom substrato lignocelulósico para produção de enzimas hidrolíticas on site (SOUZA; BON;

SILVAB, 2018).

130

O bagaço é o resíduo lignocelulósico de maior interesse neste trabalho, haja vista

sua relevância na produção de etanol 2G e outros produtos de valor agregado. Por essa

razão, as atividades com os substratos sintéticos foram quantificadas apenas para as cepas

crescidas em BEX. Como resultado, a cepa Δ105520 mostrou uma redução significativa de 35

% para as atividades utilizando os substratos pNPC (Figura 18A) e pNPG (Figura 18B),

específicos para CBH e BGL, respectivamente. As atividades de pNPCase e pNPGase das

demais cepas deletadas não foram significativamente diferentes do controle. Levando-se em

consideração que a deleção desse gene também diminuiu significativamente a quantidade

de proteínas extracelulares (Figura 16B) e a atividade de CMCase em BEX (Figura 17A),

pode-se hipotetizar que o gene 105520 codifica um fator de transcrição envolvido na

indução da expressão de genes voltados à degradação da biomassa. Por essa linha de

raciocínio, pode-se sugerir que sua superexpressão levaria a um efeito contrário sobre esse

fenótipo, aumentando as atividades celulolíticas de T. reesei e contribuindo para uma maior

desconstrução de biomassa de cana. Entretanto, esta suposição não foi confirmada neste

trabalho.

Figura 18. Atividades enzimáticas de pNPCase (B) e pNPGase (B) quantificadas para as cepas QM6a e mutantes de T. reesei crescidos em BEX após 192 h. O teste estatístico one-way ANOVA seguido do teste de múltiplas comparações de Dunnett foi aplicado, utilizando a cepa parental QM6a como referência.****pvalue < 0,0001.

3.3.3 Expressão gênica dos genes alvos em glicose e soforose

A expressão gênica dos genes alvos também foi avaliada em três cepas

diferentes de T. reesei (QM6a, Δxyr1 e Δcre1) crescidas em duas fontes de carbono: glicose e

soforose. No total, três dos quatro genes (hfb, 105520 e 123978) tiveram sua expressão

131

gênica analisada. Não foi possível avaliar a expressão somente do gene 60565 até a

conclusão deste trabalho. A avaliação da expressão nestas cepas permite inferir se os genes

em questão são regulados pelos principais fatores de transcrição que coordenam o sistema

celulótico de T. reesei, e se esta regulação é dependente da fonte de carbono na qual o

fungo está crescendo. Como já esperado, o gene da celobiohidrolase 1 (cbh1) foi mais

expresso em soforose nas cepas QM6a e Δcre1, com uma expressão quatro vezes maior em

Δcre1 comparada com a parental (Figura 19). Isso pode ser explicado pelo fato de cbh1 estar

sob controle transcricional de CRE1, que na sua ausência aumenta a expressão de várias

celulases e de outros genes. A expressão de cbh1 é ainda dependente da expressão do

regulador XYR1. Na ausência de XYR1, cbh1 não é expresso, mesmo na presença de um forte

indutor como a soforose (Figura 19). Pelas razões apontadas, cbh1 foi escolhido como um

dos genes de referência para avaliar as mesmas regulações para os demais genes.

Figura 19. Expressão normalizada dos genes alvos de deleção em diferentes cepas de T. reesei crescidas em glicose e soforose. As cepas QM6a, Δxyr1 e Δcre1 foram utilizadas para avaliar a influência dos reguladores XYR1 e CRE1 sobre a expressão dos genes alvos. O gene cbh1 já é bem estudado na literatura por ser ativado e reprimido por esses reguladores, respectivamente, e foi utilizado como um controle dessa regulação para os demais genes analisados. A expressão foi normalizada utilizando-se os genes de referência sar1 e act. Teste t-student foi aplicado para avaliar diferenças significativas entre a expressão em soforose e glicose. *pvalue < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001; **** < 0,0001.

132

O gene hfb teve sua expressão induzida significativamente por soforose na cepa

QM6a, quase dobrando os valores de expressão (Figura 19). Curiosamente, o açúcar

soforose não foi capaz de induzir a maior expressão de hfb em relação à glicose na ausência

de xyr1. Isso demonstra o papel importante deste regulador transcricional na expressão de

hfb. Ainda que a diferença não foi significativa, soforose também aumentou a expressão de

hfb na cepa Δcre1, sugerindo uma possível regulação por este repressor catabólico. De

forma intrigante, a soforose conseguiu promover um aumento significativo na expressão do

gene 105520 apenas na cepa deletada para o gene cre1 (Figura 19). Portanto, o gene 105520

- que inclusive codifica um fator de transcrição hipotético – é modulado transcricionalmente

por CRE1 e está sujeito à repressão catabólica. Os resultados anteriores indicam ainda uma

relação deste fator de transcrição hipotético com a regulação da expressão de celulases, que

são induzidas na presença de soforose.

O gene 123978 que codifica uma álcool desidrogenase da família CAZy AA3

apresentou uma expressão bastante curiosa. Em todas as cepas de T. reesei, sua expressão

foi aumentada de forma significativa e expressiva na presença de soforose (Figura 19).

Comparando-se esta diferença de expressão entre as cepas, nota-se que a expressão deste

gene foi aumentada em mais de duas e seis vezes na presença de soforose, nas cepas Δcre1

e Δxyr1 em relação à QM6a, respectivamente. Este resultado é interessante porque sugere

que ambos os reguladores CRE1 e XYR1 exercem uma regulação negativa sobre o gene

123978. Estes fatores de transcrição possuem ação antagônica sobre um grande número de

genes de funções diversas, e, portanto, outros mecanismos moleculares desconhecidos

podem estar atuando na modulação da expressão do gene 123978.

3.4 CONCLUSÃO

A construção de mutantes knockout de T. reesei e sua caracterização fenotípica

levou à identificação de um gene alvo possivelmente envolvido com a ativação transcricional

de enzimas de degradação de bagaço de cana. A deleção do FT 105520 teve um efeito

negativo sobre as atividades enzimáticas de celulase em BEX, mais notavelmente para

celobiohidrolases e endoglucanases. A análise de expressão gênica mostrou ainda que este

gene está sob repressão catabólica por carbono na presença do indutor soforose. Os dados

sugerem, portanto, que o gene FT 105520 tem um papel na regulação gênica modulada em

BEX. Estudos mais aprofundados são necessários para entender a importância e relevância

133

deste FT na desconstrução de ligncelulose, e a construção de uma cepa superexpressando

esse gene poderia ser um dos caminhos a ser seguido, com o objetivo final de aprimorar

coquetéis enzimáticos voltados à produção de etanol 2G a partir de biomassa de cana.

134

CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE Trichoderma reesei E Aspergillus niger CRESCIDOS EM DIFERENTES FONTES DE CARBONO

4.1 INTRODUÇÃO

A metabolômica identifica e quantifica os mebólitos produzidos por um sistema

biológico, seja este uma célula ou um organismo multicelular. Através desta tecnologia é

possível tirar uma “foto” da grande diversidade química de moléculas existentes em uma

amostra, e assim compreender a dinâmica do metabolismo celular alterada em resposta a

perturbações naturais ou externas (SCHUHMACHER et al., 2013). A metabolômica, por si só,

é uma ferramenta imprescindível para revelar o perfil de metabólitos envolvidos em uma

determinada resposta celular, mas pode ser integrada a outras “ômicas” como uma

estratégia para se aumentar a produção do produto desejado, de forma energéticamente

favorável para a célula e viável economicamente (ELLIS; GOODACRE, 2012).

Atualmente, as técnicas de cromatografia gasosa (GC) e líquida (LC) acopalhadas

a espectrometria de massa (MS), e a técnica de espectrometria por ressonância magnética

nuclear (RMN) são as mais utilizadas, e englobam as mais diversas aplicações, desde o

diagnóstico de doenças humanas, nutrição e saúde alimentar até microbiologia e

biotecnologia (SCHUHMACHER et al., 2013; SUBBARAJ et al., 2019). Em relação à utilização

de resíduos lignocelulósicos para obtenção de biocombustíveis e outros produtos de valor

agregado, a metabolômica também é uma peça chave na medida em que fornece pistas de

como os sistemas biológicos reagem quando são modificados geneticamente para alguma

aplicação biotecnológica. Como exemplo, o perfil metabólico de fungos filamentosos -

conhecidos por produzirem quantidades significativas de enzimas – pode ser explorado para

direcionar o engenheiramento metabólico destas fábricas celulares para produzirem mais

celulases ou outras enzimas de interesse industrial (MASHEGO et al., 2007; CASTILLO et al.,

2016).

Na contramão da grande quantidade de artigos publicados com as enzimas de T.

reesei, são escassos os trabalhos que avaliaram o metabolismo deste fungo em diferentes

fontes de carbono, e os primeiros trabalhos datam da primeira década do ano 2000. Em

2002, CHAMBERGO e colaboradores analisaram pela primeira vez a preferência energética

de T. reesei pela respiração celular ao invés da fermentação, na presença de altas

concentrações de glicose. Utilizando ESTs (expressed sequence tag) e microarray, os autores

135

verificaram um aumento da expressão de genes do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA,

também chamado de ciclo de Krebs) e da cadeia respiratória da mitocôndria, quando T.

reesei foi crescido em glicose (CHAMBERGO et al., 2002).

Mais tarde, DRUZHININA e colaboradores (2006) avaliaram o crescimento do

micélio e a produção de celulases de T. reesei e alguns dos seus mutantes, em 95 fontes de

carbono diferentes, incluindo açúcares (glicose, glicerol, galactose, xilose e celobiose), ácidos

orgânicos (ácido -aminobutírico, glucurônico e galacturônico) e aminoácidos. O estudo teve

como objetivo principal investigar o metabolismo global de carbono das cepas de T. reesei e

testar o método desenvolvido.

Em 2009, JOUHTEN e colaboradores (2009) investigaram o perfil metabólico de

T. reesei com isótopo de carbono 13 incorporado nas fontes de carbono e detectado por

RMN. Neste trabalho, os autores utilizaram glicose e sorbitol marcados, e observaram o

fluxo metabólico especialmente nas vias de biossíntese de aminoácidos. O açúcar soforose e

a cepa mutante com o gene cre1 deletado – que induz a produção de enzimas, e medeia a

repressão por carbono, respectivamente – foram também avaliados nos experimentos para

verificar possíveis alterações do fluxo metabólico ao longo das vias. Como resultado, os

autores não notaram diferenças significativas no fluxo metabólico das cepas QM6a e Δcre1,

e nem na presença de soforose. A deleção de cre1, portanto, não medeia alterações

metabólicas dependentes da fonte de carbono no metabolismo central de T. reesei. E a

soforose não induz mudanças significativas no requerimento de aminoácidos para proteínas,

ou na razão das atividades anabólicas e oxidativas do ciclo TCA (JOUHTEN et al., 2009).

Mais recentemente, a rede metabólica de T. reesei foi construída, validada e

disponilizada para simulações de produção de enzimas em diferentes condições (CASTILLO

et al., 2016). O modelo metabólico foi construído primeiramente em 2014, quando o mesmo

grupo de pesquisa desenvolvou um método computacional de reconstrução de redes

metabólicas baseado no genoma (PITKÄNEN et al., 2014). Em outra publicação, este modelo

foi validado utilizando como input um conjunto de dados de T. reesei crescido em celobiose

(PAKULA et al., 2016). Neste trabalho, uma extensa quantidade de variáveis foi avaliada,

como formação de biomassa, consumo de açúcar, produção de metabólitos, atividade

enzimática, quantificação de aminoácidos livres e análise do transcriptoma. Mais tarde, o

modelo foi refinado, incluindo uma equação de biomassa e reações envolvendo entrada e

saída de metabólitos (CASTILLO et al., 2016).

136

Aspergillus niger é outro fungo industrial de grande interesse biotecnológico que

serve de plataforma biológica para produção de ácido cítrico, enzimas de degradação de

biomassa vegetal e outras enzimas utilizadas nas indústrias de alimentos e química (BORIN

et al., 2017). De modo semelhante a T. reesei, A. niger também é pouco estudado em

relação a seu perfil metabólico quando crescido em diferentes fontes de carbono. Um dos

trabalhos pioneiros foi conduzido por RUIJTER e VISSER (1996) que quantificaram os

metabólitos intermediários da via glicolítica de A. niger crescido em glicose após 48 h. Neste

trabalho, a quantificação foi realizada através de um analisador automático e o objetivo

principal era testar o método de extração empregado, e não o metabolismo intracelular de

fato. Mais tarde, os metabólitos secundários produzidos por A. niger e outras espécies foram

analisados por LC, e utilizados para identificação taxonômica de uma nova espécie de

Aspergillus sp. (DE VRIES et al., 2005).

MEIJER e colaboradores (2007) examinaram o metabolismo de xilose por GC-MS

em A. niger com a finalidade de aumentar a produção de succinato, um dos dez blocos

químicos de maior valor agregado que podem ser obtidos a partir de biomassa vegetal

(WERPY; PETERSEN, 2004). Os autores observaram diversas mudanças nas concentrações

dos metabólitos intra e extracelulares, e relacionaram este resultado à limitação de O2

disponível nas condições de fermentação (MEIJER et al., 2007). Com foco ainda na síntese de

succinato e também malato, o mesmo grupo utilizou em outro trabalho a estratégia de

superexpressar o gene que codifica uma isocitrato liase, e avaliar o fluxo metabólico por

carbono marcado em A. niger. Foi possível observar desvios de vias metabólicas que levaram

ao aumento de outros ácidos orgânicos, como fumarato e malato (MEIJER et al., 2009).

Outros poucos trabalhos também exploraram o perfil metabólico de A. niger para síntese de

açúcares prebióticos (DRIOUCH; MELZER; WITTMANN, 2012), validação de metologia de

extração e análise de metabólitos por LC-MS (ZHENG et al., 2019), e ainda o perfil

metabólico resultante da degradação dos resíduos de viniculturas por A. niger e outros

fungos (KARPE et al., 2015, 2017).

Dada a importância da metabolômica para a maior compreensão do

metabolismo celular e a ausência de trabalhos na área, foi proposto neste trabalho avaliar

por RMN o perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em glicose, lactose, CMC e BEX.

Como já visto anteriormente por trabalhos do nosso grupo de pesquisa (BORIN et al., 2015,

2017, 2018), ambos os fungos utilizam estratégias diferentes de degradação de biomassa

137

vegetal de cana e assimilação de carbono, e é muito provável que isso também reflita ou

seja reflexo dos seus metabolismos celulares. Como esperado, foi possível notar padrões e

diferenças interessantes em relação à utilização destas fontes de carbono pelos dois fungos

industriais. Os resultados encontrados abrem novas perspectivas de engenheiramento

metabólico para a produção dirigida de enzimas lignolíticas de interesse industrial.

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Microrganismos e condições de cultivo

Os fungos Trichoderma reesei RUT-C30 (ATCC 56765) e Aspergillus niger N402

(ATCC 64974) foram gentilmente cedidos pelos pesquisadores Dr°. Bernhard Seiboth (VTT,

Finlândia) e Dr°. David Archer (Universidade de Nottingham, Inglaterra), respectivamente.

Inicialmente, os esporos de T. reesei e A. niger foram estriados em placas de petri meio PDA

sólido (39 g/L, potato dextrose agar), e incubados por 10 e 3 dias a 29 °C e 28 °C,

respectivamente, para propagação e formação de esporos. Os mesmos foram recolhidos das

placas com ajuda de alça de Drigalski estéril, adicionando-se uma solução composta de 8 g/L

NaCl e 0,5 mL/L Tween 80. A solução de esporos foi diluída 100 vezes para contagem na

câmara de Neubauer e uma concentração final de 1 x 107 foi utilizada nos inóculos.

Os esporos foram inoculados em erlemeyers de 250 mL contendo 30 mL de meio

líquido MA (MANDELS; ANDREOTTI, 1978) (pH 5,5) composto de 20 mL/L de solução de

oligoelementos 50X (0,25 g/L FeSO4·7H2O, 0,085 g/L MnSO4·H2O, 0,07 g/L ZnSO4·7H2O, 0,1

g/L CaCl2·2H2O), 250 mL/L de solução mineral 2X (5,6 g/L (NH4)2SO4, 8,0 g/L KH2PO4, 1,2 g/L

MgSO4·7H2O, 1,6 g/L CaCl2·2H2O), 500 mL/L de tampão citrato-fosfato (0,1 M Na2HPO4, pH

5,0 ajustado com ácido cítrico 0,2 M), 1 mL/L de uréia 5 M e uma concentração pré-

determinada da fonte de carbono (10 g/L glicose, 10 g/L lactose monohidratada, 10 g/L Na-

CMC, ou 5 g/L BEX). Os esporos foram incubados a 200 rpm por 48 horas a 29 °C e 28 °C para

T. reesei e A. niger, respectivamente. Os cultivos de T. reesei foram expostos à luz artificial

para induzir a expressão e produção de celulases (SCHMOLL, 2018b).

Os micélios foram então separados do meio por filtração à vácuo com papel

filtro, lavados com água estéril e macerados imediatamente em nitrogênio líquido. Alíquotas

de 100 mg foram pesadas em uma balança analítica e armazenadas a -80 °C para posterior

extração dos metabólitos intracelulares. No caso das amostras de fungo crescido em BEX,

alíquotas de 120 mg - contendo tanto micélio quanto BEX residual - foram separadas pois

138

esta quantidade foi a mais apropriada para identificação dos metabólitos nos testes

realizados previamente. Vale salientar que nesta condição de cultivo, não é possível fazer a

separação entre o micélio e o bagaço.

A fim de desconsiderar os metabólitos presentes nas amostras controle sem

fungo, alíquotas de 100 μL dos meios líquidos contendo glicose, CMC e lactose, e alíquotas

de 120 mg de BEX foram também armazenadas a -80 °C para posterior extração dos

metabólitos. Os sobrenadantes foram mantidos a -20 °C para quantificação de proteína total

e dosagem de atividade enzimática de (hemi)celulases. Todos os meios foram autoclavados a

121°C por 20 min para esterilização antes dos fungos serem inoculados ou transferidos. O

experimento foi realizado em quadruplicata biológica.

4.2.2 Extração dos metabólitos

Para extração dos metabólitos intracelulares, 600 μL de uma solução de metanol

(Sigma-Aldrich, EUA) e clorofórmio (J.T.Baker, Thermo Fisher Scientific, EUA) (2:1, v/v) foram

adicionados às amostras geladas. As amostras foram homogeneizadas em vortex por 10

segundos, sonicadas por 5 min em um banho ultrasônico (Branson) e mantidas no gelo por

15 min. Em seguida, foram adicionados 300 μL de clorofórmio e 300 μL de água milli-Q

gelada para formação de uma solução trifásica. As amostras foram homogeneizadas em

vortex por 10 segundos e centrifugadas a 14.000 rpm por 20 min com a centrífuga

refrigerada a 4 °C. Nesta etapa, as amostras foram fracionadas em três porções: a superior

foi composta pelos metabólitos polares de interesse, a intermediária por lipídios e debris

celular, e a inferior pelo clorofórmio. Da fração superior, 300 μL foram cuidadadosamente

transferidos para novo microtubo. Em seguida, o volume foi liofilizado em um concentrador

refrigerado (Refrigerated CentriVap Centrifugal Concentrator, Labconco, EUA) a 4 °C por, no

mínimo, 48 horas para total remoção de metanol residual. As amostras foram ressuspensas

em 540 μL de água deuterada (Sigma-Aldrich, EUA) e 60 μL de tampão fosfato de sódio (1 M

Na2HPO4/NaH2PO4 em D2O e 0,5 mM trimetilsililpropionato (TMSP), pH 7,4). Após ter sido

homogeneizado em vortex e centrifugado brevemente, todo volume das amostras foi

transferido para tubos transparentes cilíndricos de RMN. O TMSP foi utilizado como controle

interno do experimento.

139

4.2.3 Processamento e análise dos dados

Os espectros 1H RMN das amostras foram adquiridos utilizando o espectrômetro

Varian-Agilent Inova (Agilent Technologies Inc.™, Santa Clara, EUA), instalado no Laboratório

Nacional de Biociências do CNPEM. Este espectrômetro de RMN é equipado com sonda

criogênica de tripla ressonância e opera na frequência de 1H de 500 MHz e temperatura

constante de 25 °C. Um total de 256 varreduras foram coletadas com 32.000 pontos, tempo

de aquisição de 4 segundos em uma janela de largura espectral de 16 ppm. Um tempo de

espera de 1,5 segundos foi adicionado entre as varreduras, durante o qual um campo

contínuo de radiofrequência de pré-saturação de água foi aplicado. As correções da fase

espectral, da linha base, bem como a identificação e quantificação dos metabólitos

presentes nas amostras, foram realizadas utilizando-se o software Chenomx NMR Suite®

(Chenomx Inc.™, Edmonton, Canadá) e o banco de dados Chenomx Reference Compounds (>

500 metabólitos).

A normalização das concentrações e análises estatísticas foram realizadas

através da ferramenta online MetaboAnalyst (CHONG et al., 2019). Primeiramente, uma

planilha “.csv” contendo os valores brutos das concentrações em μM e os valores de massa

em mg (linha adicionada “weight”) foi utilizada como input dos dados. O valor de 0,05 foi

atribuído aos metabólitos não identificados em todas as amostras (missing values), para fins

de comparação e análise estatística. Em seguida, a normalização foi realizada divindo-se os

valores das concentrações pela massa de cada amostra biológica (opção “Normalization by

reference feature”). O valor normalizado foi multiplicado por 103 e convertido em log2. Para

a clusterização hierárquica das réplicas, foram utilizados a distância euclidiana e o algoritmo

de clusterização de Ward. A análise de correlação de Pearson (0 a 1) foi utilizada para

calcular quão correlatas e reprodutíveis estavam as réplicas biológicas. Para a análise de

padrão de correlação dos metabólitos, somente foram considerados aqueles com p-value ≤

0,05 e p-value ajustado (FDR) ≤ 0,1. Os testes estatísticos ANOVA (unicaudal, FDR ≤ 0,1) e t-

student (fold change ≥ 2, FDR ≤ 0,1) foram utilizados para verificar diferenças significativas

entre as amostras e entre os dois fungos para a mesma condição, respectivamente.

4.2.4 Quantificação de proteína total

A quantificação de proteína total do sobrenadante - que é composto por

celulases e hemicelulases, e outras proteínas secretadas pelo fungo - foi aferida por

140

fluorescência com o kit Qubit Protein Assay (faixa de detecção: 0,25-5 µg) (Thermo Fisher

Scientific, EUA), no leitor Qubit 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, EUA). Sucintamente,

uma solução de trabalho foi preparada diluindo o fluoróforo concentrado em tampão, na

proporção 1:200. Esta solução foi utilizada para diluir três amostras-padrão (0, 200 e 400

ng/μL) e as amostras dos sobredantes, em um volume final de 200 μL por reação. Foram

utilizados 10 e 20 μL, respectivamente, para construir a curva padrão e quantificar as

proteínas totais.

4.2.5 Atividade enzimática

Para as atividades enzimáticas aferidas pelo método DNS, 50 μL de substrato e

20 μL do sobrenadante de cada fungo foram diluídos em tampão acetato de sódio 100 mM

(pH 4,8) para completar um volume final de 100 μL. Dependendo da absorbância lida, a

amostra era diluída 10X no mesmo tampão para repetição da análise. A reação foi incubada

a 50 °C em um termociclador por 30 min para CMC (concentração estoque de 10 g/L), e 10

min para xylan from beechwood (concentração estoque de 5 g/L) (Sigma-Aldrich, EUA). 100

μL de DNS foram adicionados para paralisar a reação. A absorbância foi detectada a 540 nm

em um leitor de placas (Tecan Infinite M200 PRO, Suíça), e diluições seriadas de glicose e

xilose foram utilizadas para construção da curva padrão das atividades de celulase e

xilanase, respectivamente. Cada unidade (IU) de atividade enzimática foi definida como a

quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de açúcar redutor por min.

Para as atividades específicas de CBH e BGL foram utilizados os substratos

sintéticos pNPC (4-nitrophenyl β-D-cellobioside) e pNPG (4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside)

(Sigma Aldrich, EUA), respectivamente. A atividade foi aferida diluindo-se 30 μL do

sobrenadante de T. reesei em 20 μL de tampão citrato de sódio 100 mM (pH 4,8) e 50 μL do

respectivo substrato pNP (10 mM). A reação foi incubada a 50 °C por 10 min para ambos os

substratos, e foi paralisada pela adição de 100 μL de carbonato de sódio 1 M. A absorbância

foi detectada a 410 nm no mesmo leitor de placas, e diluições seriadas de pNP foram

utilizadas para construção da curva padrão. Cada unidade (IU) de atividade enzimática foi

definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de pNP por min.

Como controle (branco), os substratos foram incubados apenas com tampão nas

mesmas condições de temperatura e tempo, e foram adicionados os mesmos volumes de

sobrenadante contendo as enzimas após a paralisação das reações com DNS ou carbonato

141

de sódio. O valor da absorbância detectado foi descontado do controle, e a atividade foi

calculada com base na equação de regressão da curva padrão de glicose e xilose para DNS

ou pNP.

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1 Comparação do perfil metabólico global de T. reesei e A. niger

A identificação dos espectros de RMN permitiu a identificação de, no total, 75

metabólitos, incluindo açúcares, aminoácidos, intermediários de vias metabólicas, ácidos

orgânicos, nucleotídeos e cofatores (Anexo I). Os perfis dos metabólitos identificados foram

primeiro comparados por análise de componente principal (PCA) seguida de clusterização

hierárquica. A PCA é uma análise multivariada de grande relevância para a condensação de

um grande número de variáveis existentes em um conjunto de dados, e fornece uma visão

geral das relações entre estas variáveis e as amostras (BRO; SMILDE, 2014). A combinação da

PCA com a clusterização permitiu avaliar a reprodutibilidade das réplicas biológicas, verificar

padrões de similaridade entre as condições amostradas e identificar quais os principais

metabólitos que mais influenciaram na variação dos dados (Figura 20). Dessa forma, duas

réplicas outliers (T. reesei_glicose_#2 e A. niger_lactose_#1) foram identificadas e

desconsideradas das análises posteriores.

As amostras de BEX também foram desconsideradas nas análises quantitativas,

uma vez que elas não puderam ser normalizadas por massa como as demais amostras.

Durante o crescimento em BEX, as hifas de T. reesei e A. niger permeiam a estrutura

lignocelulósica de modo a formar um emaranhado praticamente inseparável de micélio e

fibras. Por essa razão, é muito difícil isolar a biomassa dos fungos para avaliar o crescimento

por massa seca e fazer a extração dos metabólitos unicamente do micélio. Apesar da massa

ser padronizada para as extrações, não se sabe em qual proporção é encontrado o micélio

dos fungos e o BEX residual utilizado como fonte de carbono. Portanto, o perfil de

metabólitos encontrado para ambos os fungos em BEX será discutido separadamente e

apenas qualitativamente.

142

Figura 20. Análise comparativa do perfil metabólico encontrado nas amostras de T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc, G), CMC e lactose (Lac, L). A) PCA de dois componentes mostrando o agrupamento entre as condições amostradas por similaridade de perfil metabólico. Quanto maior a distância entre as amostras, maior a diferença dos perfis de metabólitos. Os círculos pontilhados e as elipses de diferentes cores indicam os três grandes grupos formados e as regiões com mais de 95 % de confiabilidade, respectivamente. B) Dendograma da clusterização hierárquica das amostras.

143

A análise de dois componentes revelou claramente a existência de três grandes

grupos de amostras que foram separadas principalmente pela fonte de carbono (Figura

20A). Em outras palavras, as diferenças dos perfis entre os fungos crescidos nas mesmas

condições de crescimento foram menores do que as causadas pelas fontes de carbono. O

primeiro componente (PC1) foi responsável por mais da metade (55,7 %) de toda variação

biológica encontrada, e segregou as amostras dos fungos crescidos em lactose das demais

condições de crescimento. As amostras de CMC e glicose estiveram mais próximas entre si

no PC1. O segundo componente (PC2) respondeu por 22,9 % dessa variação, e separou as

amostras de modo a formar os três grupos de substratos bem definidos (Figura 20A). Os dois

componentes juntos responderam por 78,6 % da variação do conjunto de dados, e por essa

razão não foram adicionados outros componentes na análise de PCA.

O dendrograma das amostras clusterizadas corroborou as diferenças apontadas

pela análise de PCA. As amostras biológicas foram consistentes para as mesmas condições

de crescimento, e as amostras de lactose foram as mais distingas em relação às demais

fontes de carbono (Figura 20B). É curioso notar que as maiores diferenças foram observadas

entre as fontes de carbono, e não entre os fungos. T. reesei e A. niger pertencem às classes

Sordariomycetes e Eurotiomycetes, respectivamente, e evoluíram de forma independente ao

longo do tempo (SCHOCH et al., 2009; BEIMFORDE et al., 2014). Portanto, acreditava-se que

ambos os fungos pudessem divergir em relação ao perfil metabólico avaliado nas condições

deste estudo. No entanto, apesar dos caminhos evolutivos serem diferentes, T. reesei e A.

niger apresentaram vários metabólitos em comum, sugerindo a adoção de estratégias

parecidas para crescerem e se adaptarem às fontes de carbono avaliadas.

O perfil dos metabólitos encontrados por heatmap mostrou que apenas um

pequeno número foi observado nas amostras controle (meio de cultivo sem fungo) (Anexo

II). Dentre eles, destacam-se: glicose, maltose e frutose (controle glicose); glucarato,

galactose e lactose (controle lactose); e N-acetilglicosamina (controle CMC) (Anexo II).

Praticamente todos estes metabólitos fazem parte da composição dos meios de cultivo nos

quais foram crescidos os fungos T. reesei e A. niger, e, portanto, sua identificação na análise

dos perfis metabólicos já era esperada.

A seguir, foram investigados os metabólitos que mais contribuíram para as

diferenças observadas nas análises anteriores. Especificamente para o PC1, os metabólitos

com valores maiores de score foram lactose, glucitol (sorbitol), galactitol, 2-fosfoglicerato e

144

galactose; e os menores, serina, frutose, prolina e glucarato (Figura 21, Anexo III). O grupo

de metabólitos com valores maiores respondeu por boa parte da segregação das amostras

de lactose à direita, enquanto que o grupo dos valores menores, pelas demais amostras à

esquerda (Figura 21). Lactose, glucitol, galactitol e galactose são metabólitos do

metabolismo da lactose, e, portanto, é evidente sua maior contribuição para a variação das

amostras nesta fonte de carbono. Por outro lado, os metabólitos com menores valores de

score foram encontrados quase que exclusivamente em CMC e glicose, como observado

pelos gráficos da frutose e serina ao lado do PCA (Figura 21, Anexo III).

Figura 21. Distribuição dos scores dos principais metabólitos responsáveis pelas diferenças encontradas entre T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac). Os metabólitos destacados em laranja e vermelho, e verde e azul apresentaram os maiores e menores valores de score para o primeiro e segundo componente, respectivamente. A fim de exemplificar, é mostrada a abundância normalizada pela massa de apenas alguns dos metabólitos com maiores e menores valores de score ao lado do gráfico do PCA.

145

Em relação ao PC2, homoserina, 2-fosfoglicerato e glutationa foram os

metabólitos com maiores valores de score, enquanto que celobiose, glicolato e galactarato,

os menores (Figura 21, Anexo III). Estes metabólitos apresentaram perfis de concentrações

bastante diferentes: os de maior valor de score foram encontrados quase que

exclusivamente em glicose e lactose, ao passo que os de menor foram encontrados em

maior abundância em CMC (Figura 21, Anexo I).

Analisando globalmente a concentração dos metabólitos em ambos os fungos

(Figura 22), é possível verificar similaridades nos perfis com alguns metabólicos se

destacando dos demais pela maior abundância nas condições amostradas. Notavelmente,

manitol, trealose, GABA (4-aminobutirato), glicerol-3-fosfocolina e os aminoácidos

glutamina, alanina e glutamato foram os metabólitos mais abundantes em ambos os fungos

crescidos em glicose, CMC e lactose (Figura 22, Anexo I). Manitol e trealose são produzidos

normalmente nas células de fungos como forma de reservas de carboidrato e energia. São

de extrema relevância para o desenvolvimento de fungos e atuam como moléculas

protetoras contra diversos tipos de estresse (MEENA et al., 2015). Como mostrado adiante,

manitol e trehalose também foram os metabólitos mais abundantes em T. reesei e A. niger

crescidos em BEX. GABA é um aminoácido não proteico formado a partir da descarboxilação

de glutamato e com papel central na via GABA shunt que desvia o fluxo de carbono do ciclo

TCA para formar semialdeído succínico e succinato. Esta via é energeticamente menos

eficiente que o ciclo TCA e não gera um ganho de ATP ou NADH para a célula, tendo assim

um papel ainda não totalmente compreendido no metabolismo de fungos (MEAD et al.,

2013). Além da via GABA shunt, GABA atua sobre a germinação dos conidiósporos e pode

servir como fonte de nitrogênio para fungos (KUMAR; PUNEKAR, 1997). É ainda produzido

em resposta a vários estresses e em condições limitadas de disponibilidade de fonte de

carbono (BÖNNIGHAUSEN et al., 2015a; SHELP; BOWN; ZAREI, 2017). Glicerol-3-fosfocolina

está envolvido no metabolismo de fosfolipídeos que compõem as membranas celulares,

enquanto que glutamina, alanina e glutamato participam ou são moléculas precursoras de

várias vias bioquímicas, como metabolismo de histidina, glutationa, nitrogênio e purina

(database KEGG). A presença destes metabólitos em grandes concentrações nas quatro

fontes de carbonos sugere um core de metabólitos imprescindível para o crescimento de T.

reesei e A. niger (Figura 22, Anexo I).

146

Figura 22. Heatmap dos metabólitos identificados em T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac). Os valores das concentrações dos metabólitos foram normalizados pela opção “autoscale samples” e são apresentados em log2. Metabólitos mais e menos abundantes são mostrados em vermelho e azul, respectivamente. Glicerol foi outro metabólito muito abundante em glicose, CMC e lactose (Figura

22, Anexo I). Este metabólito faz parte da composição básica dos fosfolipídeos de

membrana, conectando uma molécula de fosfato a duas cadeias de ácido graxo. Possui

função de reserva de energia e atua também como protetor contra estresses (KLEIN et al.,

2017; RIES et al., 2018b). Outro metabólito em comum para ambos os fungos foi o 2-

fosfoglicerato, um dos intermediários finais da via glicolítica. 2-fosfoglicerato estava em

147

maiores concentrações principalmente em glicose e lactose, que são fontes de carbono mais

fáceis de serem assimiladas e convertidas em energia em relação à CMC. Assim é esperado

que a via glicolítica esteja mais ativa em substratos menos complexos em termos de

estrutura e composição química. Apesar de a lactose estar presente no meio de cultivo

(Anexo II) e poder influenciar o conteúdo dos metabolomas de T. reesei e A. niger – ainda

que os micélios de ambos fungos tenham sido lavados antes de serem macerados – foi

observada uma alta concentração desse açúcar em ambos os fungos, alcançando valores de

log2 igual a 13 (Anexo I). Essa concentração já era esperada uma vez que, ao contrário do

que se pensava que T. reesei apenas clivava lactose extracelularmente (SEIBOTH et al.,

2007), dois grupos de pesquisa identificaram e caracterizaram uma lactose permease (Crt1,

jgi|3405) capaz de transportar lactose para dentro da célula, e com papel essencial sobre a

indução de celulases em T. reesei crescido neste açúcar (IVANOVA et al., 2013; ZHANG et al.,

2013). No mesmo ano, pelo menos mais duas permeases de lactose foram descobertas em

T. reesei (jgi|77517 e 79202) (PORCIUNCULA et al., 2013). Dessa forma, nossos dados

sugerem que a lactose foi de fato internalizada por T. reesei, ao invés de ser primeiro clivada

em glicose e galactose para depois serem assimiladas.

Curiosamente, não houve diferença significativa (teste t-student, FDR < 0,05)

entre os níveis de lactose encontrados no metaboloma de T. reesei e A. niger (Figura 22,

Anexo I). Já é bem reportado na literatura que lactose e galactose não são as fontes de

carbono preferenciais de A. niger, como observado pelas menores taxas de crescimento em

relação a T. reesei e A. nidulans (STEINBERG, 1939; FEKETE et al., 2012). Em A. niger, o

transporte de galactose não ocorre nos conidiósporos, mas sim no micélio, sendo, portanto,

dependente do estágio de crescimento do fungo (FEKETE et al., 2012). Ainda que A. niger

cresça mais vagarosamente que T. reesei em lactose (dados não mostrados) e não tenha

ainda nenhum transportador de lactose descrito, o açúcar deve estar sendo assimilado por

transportadores ainda não identificados e caracterizados, caso contrário não seria possível

quantificar lactose no metaboloma intracelular do fungo (Figura 22). Recentemente, PENG e

colaboradores (2018) realizaram uma análise in silico para investigar novos transportadores

de açúcar em A. niger, e identificaram um transportador (An07g01310) sendo induzido por

lactose. Este transportador poderia então fazer o uptake de lactose para o meio intracelular

dos conidiósporos de A. niger. Alguns transportadores de lactose também já foram

caracterizados em A. nidulans, como LacpA e LacpB (KULCSÁR et al., 2016). A busca pelos

148

ortólogos dos seus genes em A. niger apontou lac12 (An12g09270) como sendo o candidato

mais provável para ambos os transportadores (AspGD, (ARNAUD et al., 2012). Apesar do

trabalho publicado por nosso grupo (BORIN et al., 2017) e por SOUSA e colaboradores (2011)

terem mostrado a hiper-expressão de lac12 em A. niger crescido em bagaço explodido de

cana, seu papel de transportador permanece elusivo.

Galactose e galactitol foram mais abundantes significativamente (teste t-student,

FDR < 0,05) em T. reesei do que A. niger, quando crescidos em lactose (Figura 22, Anexo IV).

Uma das razões para estas diferenças significativas é que, apesar de ambos os fungos terem

as principais vias de catabolismo de galactose, que convertem galactose a galactose-1-

fosfato (via de Leloir) ou a galactitol (via oxidoredutiva) (SEIBOTH et al., 2007; MOJZITA et

al., 2012), T. reesei possui uma taxa de crescimento maior em galactose (FEKETE et al.,

2012). Essa habilidade metabólica pode favorecer então o catabolismo de lactose na geração

de energia e, consequentemente, promover o maior crescimento de T. reesei. A. niger de

fato mostrou um menor crescimento em massa seca quando crescido em lactose em relação

a T. reesei (dado não mostrado).

Finalmente, o dissacarídeo celobiose formado a partir da hidrólise das cadeias de

celulose foi encontrado nas amostras de T. reesei e A. niger crescidos em CMC (Figura 22,

Anexo I). A presença deste metabólito já era esperada no metaboloma destes dois fungos,

uma vez que suas celulases, especialmente celobiohidrolases, liberam celobiose que será

transportada e clivada em duas moléculas de glicose para entrar na via glicolítica.

4.3.2 T. reesei versus A. niger

A seguir, o perfil geral de metabólitos foi avaliado individualmente para cada

fungo e então comparado entre eles para identificar as similaridades na quantidade e

variedade de metabólitos (Figura 23). Em T. reesei, a lactose continuou sendo a fonte de

carbono que ocasionou uma maior diferença de perfil metabólico entre as amostras, como

observado pelo padrão de ramificação da clusterização hierárquica (Figura 23A, Figura 20B).

O mesmo resultado foi também verificado nas análises de dendrograma, PCA e correlação

de Pearson (dados não mostrados), utilizando somente os dados de T. reesei como input. Em

A. niger, por outro lado, as amostras de lactose foram agrupadas com as de glicose, e as de

CMC foram agrupadas separadamente (Figura 23B). Dados de PCA e dendrograma

149

analisados exclusivamente para A. niger também corroboraram esse resultado (dados não

mostrados).

Figura 23. Heatmap dos 40 metabólitos com maior diferença significativa somente entre as amostras de T. reesei (Tr) (A) ou A. niger (An) (B) crescidos em glicose (Gluc, G), CMC e lactose (Lac, L). Teste ANOVA (FDR ≤ 0,5) foi aplicado para avaliar os metabólitos com maior diferença estatística. Os valores das concentrações dos metabólitos foram normalizados e são apresentados em log2.

Vários metabólitos foram compartilhados por ambos os microrganismos em mais

de uma fonte de carbono, e um número menor foi encontrado exclusivamente em um dos

dois fungos. Um exemplo é o perfil de metabólitos observados em lactose, onde T. reesei

apresentou a maior quantidade de metabólitos em relação à A. niger (Figura 23). Dentre os

40 metabólitos com maior diferença estatisticamente significativa (ANOVA, FDR < 0,05)

entre as amostras de ambos os fungos, 16 e 8 metabólitos foram encontrados quase que

exclusivamente em lactose para T. reesei e A. niger, respectivamente (Figura 23). Além disso,

todos os oito metabólitos (galactitol, glucitol, dimetilamina, lactose, sarcosina, UDP-

150

galactose, anserina e 3-hidroxi-isovalerato) encontrados em A. niger foram também

identificados em T. reesei.

Além dos intermediários do catabolismo da lactose, outros metabólitos também

foram encontrados em maior abundância em ambos os fungos crescidos em lactose, como,

por exemplo, a sarcosina e dimetilamina (catabolismo de colina e metabolismo de glicina),

anserina (metabolismo de β-alanina e histidina) e 3-hidroxi-isovalerato (catabolismo de

leucina) (Figura 23). É interessante notar que estes metabólitos são intermediários de vias

bioquímicas de degradação de aminoácidos, e mais curioso ainda que estes perfis foram

observados em uma fonte de carbono que é utilizada industrialmente para produção de

enzimas. As atividades enzimáticas para celulase e xilanase em lactose mostradas à frente,

contudo, não parecem ter sido influenciadas por essa resposta dos fungos em utilizar vias de

catabolismo de aminoácido. Uma das explicações seria que os fungos adotam esta estratégia

metabólica para produzir outros metabólitos importantes para seu crescimento em lactose e

adaptação a diferentes tipos de estresse abiótico.

Exclusivamente em CMC, é interessante notar que glicolato e celobiose foram os

únicos metabólitos encontrados em ambos os fungos (Figura 23). Glicolato é um dos

precursores de glioxilato, o principal metabólito da via alternativa do ciclo TCA, conhecida

como glyoxylate shunt. Esta via compartilha cinco das oito enzimas do ciclo TCA, e é utilizada

para realimentar o ciclo TCA e produzir glicose através da gliconeogênese, em condições de

escassez de glicose (carbon starvation) (RIES et al., 2018a; CHEW et al., 2019). Nesta via, o

glioxilato e acetil-CoA que possuem apenas dois carbonos são utilizados pela malato sintase

para formar malato, um dos intermediários do ciclo TCA com quatro carbonos. Em seguida,

malato é convertido em oxaloacetato, que é essencial para a via de gliconeogênese. Dessa

forma, há um desvio de dois passos de descarboxilação do ciclo TCA – de isocitrato (C6) para

α-cetoglutarato (C6), e deste para succinil-CoA (C5) – para favorecer o anabolismo de

glicose, por exemplo (CHEW; CHEE; THAN, 2019). Além disso, acredita-se que o glyoxylate

shunt permita que a célula seja mais tolerante ao estresse oxidativo (AHN et al., 2016), o

qual pode ser causado por privação de glicose, por exemplo (SHIMIZU et al., 2005).

O substrato CMC não é uma fonte de carbono prontamente assimilável e requer

a ação de celulases para a liberação de glicose e celobiose. Celobiose mostrou concentrações

maiores que a glicose tanto em T. reesei quanto A. niger (Figura 23, Anexo I). Dessa forma, a

glicose por ser o açúcar de estrutura mais simples deve estar sendo preferencialmente

151

consumido enquanto que a celobiose ainda é hidrolisada para ser aproveitada. Em resposta,

os fungos poderiam desviar o fluxo de carbono do ciclo TCA para o glyoxalate shunt,

favorecendo a gliconeogênese na formação de glicose.

Em relação à utilização de glicose, nota-se que a grande maioria dos metabólitos

identificados e com diferença estatisticamente significativa foi compartilhada com outras

fontes de carbono nos dois fungos (Figura 23). Na comparação entre glicose e CMC, mio-

inositol, frutose, glucarato, prolina e serina foram compartilhados por T. reesei e A. niger;

entre glicose e lactose, 2-fosfoglicerato e glutationa (Figura 23); e entre glicose, CMC e

lactose, vários aminoácidos (glutamato, glutamina, alanina, leucina, tirosina, arginina,

histidina, valina), succinato e malato também foram observados em ambos os fungos (Figura

22). Estes metabólitos estão relacionados com diversas vias metabólicas, incluindo

biossíntese de aminoácidos, glicólise, ciclo TCA/glyoxylate shunt, metabolismo de

glicerofosfolipídeos e biossíntese de parede celular. A presença desse grande número de

metabólitos compartilhados demonstra semelhanças na utilização das mesmas fontes de

carbono pelos dois fungos, apesar de haver algumas diferenças que serão pontuadas

adiante.

4.3.3 Perfil metabólico por fonte de carbono

As fontes de carbono contribuíram para a maior variação entre as amostras, e

por essa razão, elas foram analisadas separadamente entre T. reesei e A. niger. Estas

comparações permitiram identificar diferenças significativas nas concentrações de

metabólitos entre os dois fungos, e assim verificar quais vias podem ter sido requeridas para

metabolização de cada fonte de carbono. A análise comparativa dos perfis metabólicos

forneceu pistas de como ambos os fungos podem estar utilizando esses substratos não

somente para crescerem, mas também para, por exemplo, produzirem enzimas de interesse

industrial, como celulases e hemicelulases.

Glicose

No total, foram identificados 50 e 53 metabólitos em T. reesei e A. niger

crescidos em glicose, respectivamente, em pelo menos uma réplica de T. reesei ou A. niger.

Destes, os que apresentaram maior diferença foram: glutamina, lisina, asparagina e

glutationa para T. reesei, e ornitina, glicerol, 2-fosfoglicerato e manitol para A. niger (Figura

152

24A). Não por acaso, a análise de correlação apontou também os mesmos metabólitos como

sendo os mais correlatos (correlação > 80 %) para ambos os fungos, ou seja, aqueles que

foram identificados quase que exclusivamente em uma única condição (Figura 24B).

Contudo, apenas quatro metabólitos tiveram diferença estatisticamente significativa entre

ambos os fungos: glutamina em T. reesei, e ornitina, glicerol e 2-fosfoglicerato em A. niger

(Figura 24C-D, Anexo IV).

Figura 24. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em glicose por 48 h. A) Heatmap com os 12 metabólitos com maior diferença significativa segundo o teste estatístico t-student. B) Lista dos metabólitos mais correlacionados entre si em T. reesei (rosa) e A. niger (azul). C) Gráfico de Volcano dos metabólitos identificados com valores de foldchange (FC) > 2 e com diferença significativa pelo test t-student (FDR ≤ 0,1; -log10(p) ≥ 1,0). Metabólitos com valores de log2(FC) > 1 e < -1 foram estatisticamente mais abundantes em T. reesei e A. niger, respectivamente. D) Exemplos de metabólitos com maior diferença significativa entre as condições amostradas. Os valores apresentados foram normalizados apenas pela massa e convertidos em log2.

153

Glutamina é um aminoácido necessário à biossíntese de proteínas, mas também

é utilizado por fungos filamentosos como fonte preferencial de nitrogênio e molécula

sinalizadora da via target of rapamycin (TOR) (RIES et al., 2018a). A via TOR é a principal

responsável pelo sensoramento de nitrogênio e coordena a transdução de sinal downstream

desencadeada por esse macronutriente. Em T. reesei, inclusive, um dos genes alvos desta via

- ortólogo de sch9 em S. cerevisiae - está relacionado ao crescimento vegetativo, resposta ao

estresse e indução de celulases (LV et al., 2015a). A glutamina ainda pode ser convertida

reversivelmente em glutamato, o qual é precursor da molécula GABA (ácido γ-

aminobutírico) envolvida na resposta contra estresses bióticos e abióticos (BÖNNIGHAUSEN

et al., 2015b; SHELP; BOWN; ZAREI, 2017). Portanto, o maior acúmulo deste aminoácido em

T. reesei crescido em glicose (Figura 24D) pode estar associado ao crescimento vegetativo do

fungo. Como será visto adiante, a glutamina também foi um dos metabólitos mais

correlacionados com o crescimento de T. reesei em CMC e lactose (Figuras 25 e 26, Anexo

IV), podendo ser requerida para modular a resposta aos estresses gerados por essas fontes

de carbono. Por fim, glutamina parece ter grande importância para o metabolismo central

de T. reesei.

Em relação aos metabólitos encontrados com maior diferença em A. niger, é

interessante notar que glicerol foi 27 vezes mais abundante neste fungo do que em T. reesei

crescido em glicose (Figura 24D, Anexo IV). Como já mencionado, glicerol é um dos

principais constituintes das cadeias de fosfolipídeos e triacilglicerol que compõem as

membranas celulares e as reservas de lipídeo, e também tem papel de agente protetor

contra estresse osmótico e de temperatura (KLEIN et al., 2017; RIES et al., 2018b).

Curiosamente, este metabólito foi encontrado significativamente em maior concentração

em todas as condições de crescimento de A. niger em comparação com T. reesei (Figuras 25-

27, Anexo IV). Assim, A. niger parece sintetizar mais glicerol que T. reesei como uma

estratégia de crescimento e anabolismo energético. Além disso, glicerol é o metabólito

predominante em fungos filamentosos sob estresse osmótico (WYATT et al., 2015), e deve

ser mais requerido por A. niger para proteger seu metabolismo celular contra os estresses

enfrentados nas fontes de carbono avaliadas.

Além do glicerol, os metabólitos ornitina e 2-fosfoglicerato também foram

identificados com diferença significativa em A. niger em relação a T. reesei crescido em

glicose (Figura 24C-D, Anexo IV). A ornitina faz parte do ciclo da uréia e é formada a partir

154

da reação de degradação do aminoácido arginina que libera um mol de uréia. A ornitina

também participa do metabolismo das poliaminas, dando origem aos metabólitos

putrescina, espermidina e espermina, que estão envolvidos na modulação de diversos

processos intracelulares, como crescimento celular, morfogênese, transdução de sinal e

resposta ao estresse oxidativo (ROCHA; WILSON, 2019). O fato destes três metabólitos não

terem sido identificados nos dados de metabolômica sugere que a ornitina deve estar sendo

consumida dentro do ciclo da uréia para formar intermediários de outras vias, como o

fumarato e a arginina. A presença do metabólito arginina em A. niger crescido em glicose,

CMC e lactose corrobora com esta hipótese (Figura 22, Anexo I).

O metabólito 2-fosfoglicerato é formado como um dos intermediários da via

glicolítica e foi encontrado com diferença significativa em A. niger crescido em glicose

(Figura 24D, Anexo IV). A. niger assimila glicose como fonte de carbono para produção de

energia, seja obtendo-o do próprio meio de cultivo ou pela degradação da lignocelulose do

BEX. É de se esperar, portanto, que a via glicolítica esteja ativa e acumule alguns de seus

metabólitos intermediários. Ademais, A. niger mostrou maior crescimento em glicose (dado

não mostrado) e maiores atividades de celulase e xilanase em BEX, como mostrado adiante,

o que vai de acordo com a diferença significativa observada para 2-fosfoglicerato.

CMC

Nesta fonte de carbono, foram observados 19 e 12 metabólitos mais

correlacionados com o crescimento de T. reesei e A. niger, respectivamente (Figura 25A-B).

Para T. reesei, foram notadas diferenças significativas para metabólitos do metabolismo de

fosfoglicerolipídeos (colina, O-acetilcolina, O-fosfocolina, glicerol-3-fosfocolina), glicólise

(lactato), metabolismo de ascorbato (galactarato e glucarato), ciclo TCA e glyoxylate shunt

(malato, fumarato e glicolato), além de glicose e os dissacarídeos celobiose e trealose

(Figura 25C-D, Anexo IV).

155

Figura 25. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em CMC por 48 h. A) Heatmap com os 20 metabólitos com maior diferença significativa segundo o teste estatístico t-student. B) Lista dos metabólitos mais correlacionados entre si em T. reesei (rosa) e A. niger (azul). C) Gráfico de Volcano dos metabólitos identificados com valores de foldchange (FC) > 2 e com diferença significativa pelo test t-student (FDR ≤ 0,1; -log10(p) ≥ 1,0). Metabólitos com valores de log2(FC) > 1 e < -1 foram estatisticamente mais abundantes em T. reesei e A. niger, respectivamente. D) Exemplos de metabólitos com maior diferença significativa entre as condições amostradas. Os valores apresentados foram normalizados e convertidos em log2.

Os metabólitos identificados como sendo pertencentes do metabolismo dos

fosfoglicerolipídeos sugerem que T. reesei está direcionando seu metabolismo para a

formação e/ou remodelamento da sua membrana e parede celulares, as quais são

constituídas por fosfolipídeos, quitina, β-glicanos e outros elementos (GOW; LATGE;

MUNRO, 2017). Apesar de não haver diferença significativa pelo test t-student entre as

concentrações dos dois fungos, o metabólito UDP-N-acetil-glucosamina foi um dos mais

correlacionados com o crescimento de T. reesei em CMC, e provavelmente está presente no

156

interior das células pois é precursor da quitina (GOW; LATGE; MUNRO, 2017). De modo

especial, as concentrações dos metabólitos O-acetilcolina e O-fosfocolina foram 377 e 117

vezes maiores em T. reesei do que A. niger crescido em CMC, respectivamente (Figura 25D,

Anexo IV). De acordo com o banco de dados KEGG (KANEHISA et al., 2019), no metabolismo

dos fosfoglicerolipídeos, O-acetilcolina pode ser desacetilada e dar origem à colina, que

quando fosforilada forma O-fosfocolina, um dos precursores da fosfatidilcolina. Este

metabólito, por sua vez, compreende 68 e 51 % dos fosfolipídeos da parede de T. reesei e A.

niger, respectivamente (GRYZ et al., 2019). Assim, apesar de A. niger ter crescido mais em

CMC (dados não mostrados), parece que T. reesei requer a maior participação destes

metabólitos quando exposto a essa fonte de carbono. Interessante observar ainda que

colina foi o único metabólito do metabolismo de fosfoglicerolipídeos a ser mais abundante

significativamente em T. reesei crescido também em lactose e BEX (Figura 26, Anexo IV).

Isso sugere uma importância especial deste metabólito no metabolismo de T. reesei.

De forma bastante curiosa, lactato atingiu níveis mais expressivos em T. reesei

crescido em CMC (Figura 25), e também em lactose (Figura 26). Este metabólito foi

encontrado em A. niger crescido nas mesmas condições, mas em menor concentração

(Anexo I e IV). A conversão de piruvato em lactato é catalisada pela enzima lactato

desidrogenase, em uma reação normalmente realizada por bactérias láticas de forma

anaeróbica, ou ainda aerobicamente pelos fungos filamentosos do gênero Rhizopus sp.

(JUTURU; WU, 2016; KOMESU et al., 2017). Esta reação oxida o cofator NADH a NAD+, que

pode então ser utilizado na conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bifosfoglicerato na

via glicolítica. Apesar de T. reesei e A. niger não serem considerados produtores naturais de

lactato e realizarem respiração aeróbica, é possível identificar genes putativos codificando

lactato desidrogenase no genoma de ambos os fungos. Segundo a anotação funcional mais

recente da cepa T. reesei QM6a, existem pelos menos cinco genes que supostamente

codificam essa enzima (jgi|67718, 55161, 56470, 122010 e 59887) (DRUZHININA et al.,

2016). Em T. atroviride LU132, inclusive, um gene dessa enzima foi identificado como sendo

hiper-expresso nos conídios deste fungo crescidos em meio PDA (MENDOZA-MENDOZA et

al., 2015). A. niger possui pelo menos dois genes ainda não caracterizados para essa enzima

(An01g09780 e An04g08220) (ANDERSEN; NIELSEN; NIELSEN, 2008; CERQUEIRA et al., 2014),

e lactato também foi observado no metaboloma de A. nidulans crescido em glicose e CMC

(RIES et al., 2018b). Contudo, apesar de haver a predição desses genes, faz-se necessária a

157

sua caracterização para avaliar a função e relação com a formação de lactato. De todo modo,

é intrigante notar o acúmulo de lactato em T. reesei e A. niger, e também em outros fungos

filamentosos, como A. nidulans (RIES et al., 2018b).

Como já mencionado, glicose e celobiose são produtos da degradação das

cadeias de celulose do CMC, que é realizada por meio de celulases secretadas por ambos os

fungos no meio extracelular. T. reesei acumulou significativamente mais celobiose e glicose

do que A. niger em CMC (Figura 25, Anexo IV). No entanto, essa mesma diferença não foi

observada nas atividades de celulase aferidas com o sobrenadante do meio CMC.

Trealose foi outro metabólito encontrado com diferença significativa em T. reesei

crescido em CMC (Figura 25) e também em lactose (Figura 26, Anexo IV). Trata-se de um

dissacarídeo formado por duas moléculas de glicose conectadas entre si por uma ligação do

tipo α-1,1. É encontrado em bactérias, insetos, plantas e fungos, desempenhando o papel de

reserva de carboidrato e protetor contra estresses abióticos. Trealose é um açúcar

importante para o desenvolvimento de fungos e pode ser utilizado durante a glicólise,

esporulação ou germinação dos conídios. Também ajuda a célula a suportar estresses

causados pela limitação de nutrientes no meio, previne a agregação de proteínas

desnaturadas e participa da homeostasia da parede celular (AL-BADER et al., 2010;

THAMMAHONG et al., 2019). Pelas razões apresentadas, é evidente que este metabólito é

de grande importância para o crescimento de ambos os fungos, uma vez que, apesar de ter

sido encontrado com diferença significativa em T. reesei, trealose foi um dos metabólitos

identificados em maior abundância para T. reesei e A. niger em todas as fontes de carbono

(Anexo I).

Em A. niger, os principais metabólitos com diferença significativa participam do

metabolismo de pirimidina (uridina), degradação de corpos cetônicos (3-hidroxibutirato e 2-

hidroxi-isobutirato), ciclo da uréia (ornitina), metabolismo de aminoácidos (arginina, alanina,

treonina, glicina) e do metabolismo de resposta a estresses (glicerol e GABA) (Figura 25,

Anexo IV). A maior concentração de uridina, um dos cinco nucleotídeos essenciais que

compõem os ácidos nucleicos, pode estar atrelada à promoção da síntese das

macromoléculas de RNA requeridas para a transcrição gênica. Genes associados ao

crescimento do fungo e outros cujos produtos são enzimas estar sendo mais transcritos

nesta condição em A. niger, como observado pelas maiores atividades de xilanase e

158

pNPGase mostradas adiante, e pelo maior crescimento por massa seca (dados não

mostrados).

3-hidroxibutirato e 2-hidroxi-isobutirato foram os metabólitos com menor

concentração em relação aos demais (Anexo I), mas foram 79 e 9 vezes mais abundantes em

A. niger do que em T. reesei, respectivamente (Figura 25D, Anexo IV). Estes metabólitos

podem ser produzidos a partir de acetil-CoA através de várias reações intermediárias, e

especialmente 2-hidroxi-isobutirato vem ganhando atenção por parte de indústrias

farmacêuticas e químicas que visam utilizá-lo como molécula precursora de vários produtos

de alto valor agregado, como plásticos biodegradáveis de poli-hidroxibutirato (ROHWERDER;

MÜLLER, 2010; RABERG et al., 2018)

Foi evidente a presença significativa dos aminoácidos glicina, arginina, treonina e

alanina no metaboloma de A. niger crescido em CMC (Figura 25, Anexo IV). O metabolismo

de aminoácidos é uma rede complexa e repleta de vias bioquímicas interconectadas que

levam à formação de intermediários de outros metabolismos celulares. Alanina, por

exemplo, pode dar origem ou ser formada a partir de piruvato, através de uma

aminotransferase. A arginina, quando clivada pela arginase, é convertida em ornitina com a

liberação de uréia. A ornitina serve como precursor da biossíntese de poliaminas, e a

treonina, da biossíntese de glicina. Estes são apenas alguns exemplos de várias conversões

que podem ocorrer no interior celular, e revelam as várias possibilidades de “caminhos”

diferentes que os metabólitos podem percorrer. Por outro lado, a presença destes

aminoácidos de forma mais significativa em A. niger denota uma grande relevância do

metabolismo de aminoácidos para o crescimento do fungo nesta fonte de carbono.

Glicerol e GABA também foram encontrados de forma mais significativa em A.

niger (Figura 25, Anexo IV). Como já citado anteriormente, glicerol pode estar relacionado

com a estratégia de A. niger em sintetizar mais esta molécula como reserva de energia.

GABA, por outro lado, é formado em resposta ao estresse e deve auxiliar o fungo em superar

a carência de uma fonte de carbono mais acessível que o CMC.

Lactose

O açúcar lactose foi um dos principais responsáveis pelas diferenças de perfil

metabólico entre T. reesei e A. niger. Como mencionado anteriormente, lactose é um açúcar

de metabolismo lento para ambos os fungos, mas afeta mais severamente o crescimento de

159

A. niger, prejudicando a germinação dos conidiósporos e a formação de micélio (HORR,

1936; KARAFFA et al., 2006). Essa diferença de metabolismo refletiu diretamente sobre a

maior quantidade de metabólitos sendo mais correlacionados (Figura 26A-B) e com maior

abundância significativa (Figura 26C-D) em T. reesei. Dos 16 metabólitos mais correlatos, 14

foram estatisticamente mais abundantes em T. reesei. Dentre os principais, encontram-se

treonato, sacaropina, galactonato e galactose (Figura 26, Anexo IV). Em relação ao

metaboloma de A. niger, os metabólitos glicerol-3-fosfocolina, O-acetilcolina, 3-

hidroxibutirato, betaína, arginina e alantoína tiveram mais de 90 % de correlação, e

apresentaram a maior diferença significativa comparado com T. reesei em termos de

concentração (Figura 26, Anexo IV).

160

Figura 26. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em lactose por 48 h. A) Heatmap com os 20 metabólitos com maior diferença significativa segundo o teste estatístico t-student. B) Lista dos metabólitos mais correlacionados entre si em T. reesei (rosa) e A. niger (azul). C) Gráfico de Volcano dos metabólitos identificados com valores de foldchange (FC) > 2 e com diferença significativa pelo test t-student (FDR ≤ 0,1; -log10(p) ≥ 1,0). Metabólitos com valores de log2(FC) > 1 e < -1 foram estatisticamente mais abundantes em T. reesei e A. niger, respectivamente. D) Exemplos de metabólitos com maior diferença significativa entre as condições amostradas. Os valores apresentados foram normalizados e convertidos em log2.

O metabólito treonato pode ser formado a partir da oxidação do ácido

dehidroascórbico gerado pela degradação de ácido ascórbico em contato com espécies

reativas de oxigênio (ROS) (DEWHIRST; FRY, 2018). Treonato apresentou uma concentração

1.200 vezes maior em T. reesei comparado com A. niger (Anexo IV). Esta alta concentração

pode ser um indicativo de que as células de T. reesei utilizam ácido ascórbico e seu

metabolismo para contornar os possíveis efeitos danosos do estresse oxidativo provocado,

161

por exemplo, pela galactose liberada da lactose. O acúmulo de galactose é reportado como

sendo tóxico mesmo em baixas concentrações para fungos filamentosos (HORR, 1936;

KARAFFA et al., 2006). Sabe-se ainda que a combinação de altos níveis de galactitol e

galactose 1-fosfato inibe a atividade da enzima fosfoglicomutase, que converte glicose 1-

fosfato em glicose 6-fosfato. Consequentemente, a formação da glicose 6-fosfato e seu

consumo pela via glicolítica é interrompida (DE JONGH et al., 2008), fazendo com que a

célula utilize a via oxidativa de catabolismo de galactose. Acredita-se que esta seja uma das

razões para a existência de duas vias de catabolismo de galactose (Leloir e oxidativa) (HORR,

1936; KARAFFA et al., 2006).

Sacaropina foi o segundo metabólito mais correlato e com maior diferença

significativa em T. reesei, em relação a A. niger (Figura 26, Anexo IV). Em fungos, sacaropina

é utilizada como molécula precursora da síntese de lisina e 2-oxoglutarato pela sacaropina

desidrogenase (DE MELLO SERRANO et al., 2012). Assim, a presença de sacaropina em

lactose pode estar envolvida na síntese proteica e também na alimentação do ciclo TCA.

Comparando-se o metaboloma de A. niger com T. reesei em lactose, nota-se que

o metabolismo do primeiro favoreceu o acúmulo de fosfoglicerolipídeos (glicerol-3-

fosfocolina e O-acetilcolina), betaína, glicerol e GABA (Figura 26, Anexo IV). Os

fosfoglicerolipídeos juntamente com o glicerol estão associados à formação de membranas

celulares e ao metabolismo primário de crescimento do fungo. Betaína é o metabólito

resultante da degradação de colina, e dentre suas funções mais importantes, estão:

proteção contra estresses, fonte de carbono e nitrogênio, e intermediário do metabolismo

de aminoácidos (metionina, glicina, serina) e de energia (piruvato) (ZOU et al., 2016). Por

fim, a presença significativa de GABA em A. niger crescido em lactose (Anexo IV) sugere

haver uma sinergia com betaína e outros osmólitos (trehalose, por exemplo) para driblar

diferentes tipos de estresse enfrentados pelas células. A fim de facilitar o maior

entendimento dos metabólitos encontrados no metaboloma de T. reesei e A. niger crescidos

em glicose, CMC e lactose, é apresentado um esquema simplificado com as principais vias

bioquímicas discutidas acima. Os metabólitos com diferença estatística entre os dois fungos

também são destacados (Figura 27).

162

Figura 27. Esquema simplificado das principais vias metabólicas utilizadas por T. reesei e A. niger quando crescidos em glicose, CMC e lactose. As fontes de carbono presentes nos meios de cultivo podem ser transportadas diretamente para o interior celular (glicose e lactose) ou precisam ser hidrolisadas antes no meio extracelular (CMC). Para simplificar, algumas reações envolvendo metabólitos intermediários que não foram identificados na metabolômica não são mostrados. Metabólitos com diferença significativa (teste t-student, FDR < 0,05) para a mesma fonte de carbono entre os dois fungos são destacados (*). G1P: glicose 1-fosfato; G6P: glicose 6-fosfato; F6P: frutose 6-fosfato; F1,6P: frutose 1,6-bifosfato; GA3P: gliceraldeído 3-fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona fosfato; 3PG e 2PG: 3- e 2-fosfoglicerato; gal1P: galactose 1-fosfato; UDP-G: glicose uridina difosfato; UDP-gal: galactose uridina difosfato; TCA: ácido tricarboxílico; 2-OG: 2-oxoglutarato; OAA: oxaloacetato; glicerol-3FC: glicerol 3-fosfoglicerato; ATP: adenosina trifosfato; ala: alanina; ser: serina; tre: treonina; gli: glicina; leu: leucina; ile: isoleucina; lis: lisina; fen: fenilalanina; tir: tirosina; asp: aspartato; asn: arparagina; arg: arginina; pro: prolina; his: histidina; glu: glutamato; GABA: 4-aminobutirato.

163

BEX

No total, 31 e 35 metabólitos foram identificados no metaboloma de T. reesei e

A. niger, respectivamente (Anexo I). Essa menor quantidade e varidade de metabólitos em

BEX se deve, principalmente, pela presença de bagaço junto com micélio nas amostras

coletadas, e por ensaios prévios, acreditamos que o peso do mesmo é bem maior que o do

fungo em si. Como nas demais fontes de carbono, manitol, glutamina, trealose, alanina e

glutamato foram os mais abundantes em ambos os fungos (Figura 28A). Esse grupo de

metabólitos foi discutido anteriormente e parece ser de fundamental importância para o

crescimento de T. reesei e A. niger nas condições avaliadas neste estudo. Curiosamente, isso

vale também para BEX, que é a fonte de carbono mais complexa em termos de estrutura

(regiões cristalinas e amorfas) e composição química (cadeias de celulose e hemicelulose

entremeadas por lignina) em relação à glicose, CMC e lactose.

Figura 28. Análise do perfil metabólico de T. reesei e A. niger crescidos em BEX por 48 h. A) Heatmap com a comparação da concentração dos metabólitos encontrados em ambos os fungos crescidos em BEX. Os valores apresentados foram normalizados e convertidos em log2. B) Lista dos metabólitos mais correlacionados entre si em T. reesei (rosa) e A. niger (azul).

Ainda que não tenha sido verificado qual fungo cresceu mais ou menos em BEX,

é possível observar diferenças acentuadas na abundância de alguns metabólitos entre os

dois fungos (Figura 28). Colina, O-acetilcolina, lactato e GABA tiveram mais de 70 % de

correlação (FDR < 0,05) com o metaboloma de T. reesei (Figura 28B), e como já discutido

164

anteriormente, estão associados supostamente às vias de biossíntese de fosfoglicerolipídeos

(colina e O-acetilcolina), regeneração do cofator NADH (lactato) e resposta a estresses e

GABA shunt (GABA). Em particular para lactato, dos cinco genes preditos em codificar

piruvato desidrogenase em T. reesei QM6a, dois ortólogos em RUT-C30 (jgi|73249 e

jgi|139907, ortólogos de jgi|56470 e jgi|122010 em QM6a, respectivamente) tiveram

valores de RPKM maiores que 1300 em pelo menos um tempo amostrado (6, 12 ou 24 h) em

BEX, no estudo conduzido por BORIN e colaboradores (BORIN et al., 2017). De forma

semelhante, o gene An01g09780 de A. niger chegou a alcançar valores de RPKM maiores

que 1800 em BEX no ponto 6 h (BORIN et al., 2017). Contudo, o acúmulo de lactato como

estratégia energética para alimentar os cofatores da via glicolítica permanece a ser melhor

estudado.

Os metabólitos 2-fosfoglicerato, glicerol, 3-hidroxibutirato, betaína, ornitina e

leucina foram mais correlacionados (> 70 %, FDR < 0,05) com A. niger (Figura 28B). Estes

metabólitos fazem parte da glicólise (2-fosfoglicerato), biossíntese de membranas (glicerol),

resposta a estresses (betaína e glicerol), degradação de corpos cetônicos (3-hidroxibutirato),

ciclo da uréia (ornitina) e metabolismo de aminoácidos (leucina e betaína). É interessante

notar a maior correlação de 2-fosfoglicerato para o metaboloma de A. niger (Figura 28B). O

metabólito 2-fosfoglicerato é o nono metabólito da via da glicólise e, além da condição BEX,

foi encontrado também em A. niger crescido em lactose e glicose. Em T. reesei, o metabólito

só foi encontrado em lactose e glicose. A presença de 2-fosfoglicerato em BEX unicamente

em A. niger sugere que talvez este fungo consiga degradar e assimilar mais rápido os

açúcares liberados da degradação de biomassa vegetal de cana e convertê-los em

intermediários da via glicolítica para produção de energia. Como apresentado adiante

(Figura 29), as atividades enzimáticas de celulase e xilanase aferidas em BEX foram de fato

maiores em A. niger do que T. reesei, no tempo avaliado para este estudo (48 h).

4.3.4 Atividade enzimática

No presente trabalho, foram utilizados substratos de interesse industrial para a

produção de compostos de alto valor agregado, como enzimas e etanol 2G. A fim de

correlacionar o metabolismo dos fungos T. reesei e A. niger com a indução conhecida de

enzimas hidrolíticas pelas fontes de carbono utilizadas, foram realizados ensaios de

atividade enzimática para celulase e xilanase (Figura 29). Em glicose, as atividades

165

enzimáticas para CMC (Figura 29A), xilano (Figura 29B) e pNPG (Figura 29C) foram

significativamente baixas em ambos os fungos. Glicose é considerado açúcar repressor da

transcrição e formação de enzimas hidrolíticas, ativando a repressão catabólica mediada por

CRE1 (ANTONIÊTO et al., 2016). Por isso, não era esperada a detecção de altas atividades

nesta condição. As atividades baixas são, provavelmente, resultado do metabolismo basal

dos fungos, que produz e secreta algumas enzimas no meio extracelular (Figura 29).

Figura 29. Atividades enzimáticas aferidas para os sobrenadantes de T. reesei e A. niger crescidos em glicose, CMC, lactose e BEX. As atividades de CMCase (A), xilanase (B) e pNPG (C) foram normalizadas pela quantidade de proteína total dosada. A diferença estatística entre ambos os fungos para a mesma condição foi determinada pelo teste t-student não pareado bicaudal.*pvalue < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001; **** < 0,0001.

Em CMC, A. niger apresentou atividades significativamente maiores de xilanase e

pNPGase em relação a T. reesei (Figura 29B-C). Em ambos os fungos, as atividades em CMC

foram maiores em relação à condição glicose pois a celulose é indutor da formação de

(hemi)celulases (Figura 29A). Em A. niger crescido em BEX, todas as atividades enzimáticas

foram estatisticamente maiores do que em T. reesei. Nesta condição, as atividades de

CMCase (Figura 29A), xilanase (Figura 29B) e pNPGase (Figura 29C) foram 2, 2,5 e 18 vezes

maiores em A. niger, respectivamente, e confirma o papel relevante de bagaço para ser

166

utilizado como indutor de enzimas industriais. A diferença notável de atividade para pNPG se

deve ao fato de que este substrato é específico para β-glicosidases, as quais são mais

produzidas e secretadas por A. niger do que T. reesei. Os coquetéis comerciais à base de

celulases de T. reesei são inclusive suplementados com essa classe de enzimas, muitas vezes

provenientes de A. niger, como a β-glicosidase Novozyme 188 (Novozymes, Dinamarca)

(CHAMPREDA et al., 2019).

O açúcar lactose é considerado um dos principais indutores de enzimas em

escala comercial para T. reesei (LI et al., 2017), e também tem efeito positivo sobre a

formação de celulases e hemicelulases em A. niger (MRUDULA; MURUGAMMAL, 2011;

AMORE; GIACOBBE; FARACO, 2013). Assim, como esperado, foi observada uma expressiva

atividade de CMCase para ambos os fungos crescidos em lactose (Figura 29A). Por outro

lado, lactose não induziu fortemente a atividade de xilanase para T. reesei e A. niger (Figura

29B), como observado pelos valores de atividade um pouco acima dos quantificados em

glicose. Para pNPG, a atividade enzimática de β-glicosidase foi estatisticamente maior para

T. reesei em relação a A. niger, e esta diferença, provavelmente, se deve ao maior

crescimento do primeiro em lactose (dados não mostrados).

4.4 CONCLUSÃO

Os fungos industriais T. reesei e A. niger mostraram estratégias parecidas de

assimilação das fontes de carbono, mostrando a presença expressiva de um mesmo

conjunto de metabólitos em todas as condições de crescimento. Estes metabólitos são

carboidratos de reserva (manitol e trealose), metabólitos de estresse (GABA), componentes

do metabolismo de fosfoglicerolipídeos e síntese de membranas celulares (glicerol 3-

fosfocolina e glicerol), e do metabolismo de aminoácidos (glutamato, glutamina e alanina). A

presença destes metabólitos em todas as condições analisadas sugere, portanto, um papel

de extrema importância para o crescimento de ambos os fungos em fontes de carbono

simples e complexas.

Diferenças pontuais foram observadas entre os metabolomas de T. reesei e A.

niger, e indicam os mecanismos particulares adotados por cada fungo para sobreviver e

enfrentar estresses presentes nas condições de crescimento. T. reesei, por exemplo,

acumulou mais intermediários do catabolismo de lactose nesta fonte de carbono, e em CMC

parece adotar o glyoxylate shunt como alternativa ao ciclo TCA para geração de energia em

167

uma possível situação de privação de carbono (starvation). A. niger, por outro lado,

concentra mais glicerol e GABA em suas células para serem utilizados supostamente como

metabólitos de reserva e de estresse, respectivamente. Em BEX, A. niger mostrou maiores

atividades para celulase e hemicelulase, o que pode ter contribuído para maior ativação da

via glicolítica, como sugerido pelo acúmulo de 2-fosfoglicerato. Trabalhos futuros com o

objetivo de aumentar a produção de enzimas, ou utilizar T. reesei e A. niger como fábricas

celulares, devem levar em consideração os mecanismos adotados por ambos os fungos para

crescerem e se adaptarem a esses substratos de interesse industrial, como o bagaço da

cana.

168

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

O presente trabalho abrangeu a construção de uma rede de co-expressão gênica,

construção e caracterização de cepas deletadas em T. reesei, e ainda o estudo do

metaboloma intracelular de dois fungos produtores de enzimas crescidos em fontes de

carbono de interesse industrial. Como conclusões principais, pode-se citar:

A análise de rede de co-expressão gênica revelou dezenas de genes anotados

como FTs, CAZymes, transportadores de açúcar e proteínas hipotéticas, sendo

co-expressos com genes já conhecidos e relacionados com degradação de

biomassa. Diversos parecem ser regulados transcricionalmente por XYR1, e

alguns hubs foram co-expressos com este ativador, sugerindo uma possível

relação com a desconstrução da parede do bagaço de cana.

Foram construídas cepas deletadas de T. reesei para dois FTs, uma CAZyme e

uma hidrofobina. A caracterização fenotípica apontou o gene 105520 como um

possível ativador transcricional de celulases em BEX, em especial para

celobiohidrolases e endoglucanases. Na presença de soforose, este gene sofre

também repressão catabólica por carbono mediada por CRE1.

Em relação ao metaboloma dos fungos industriais T. reesei e A. niger, ambos

valeram-se de um mesmo conjunto de metabólitos para crescerem e se

adaptarem a todas as condições de crescimento avaliadas. Dentre eles, foram

identificados carboidratos de reserva (manitol e trealose), metabólitos de

estresse (GABA), componentes do metabolismo de fosfoglicerolipídeos e síntese

de membranas celulares (glicerol 3-fosfocolina e glicerol), e do metabolismo de

aminoácidos (glutamato, glutamina e alanina).

Diferenças no metaboloma de ambos os fungos também foram observadas. T.

reesei, por exemplo, assimilou de forma mais eficiente o açúcar lactose quando

crescido nesta fonte de carbono, e também parece ativar a via alternativa do TCA

(glyoxalate shunt) em CMC como estratégia para produzir energia pela

gliconeogênese.

A. niger mostrou níveis mais altos de glicerol e GABA em CMC e lactose, o que

sugere a preferência deste fungo em sintetizar estes metabólitos como reserva

de energia e molécula sinalizadora de estresses, respectivamente.

169

Em BEX, A. niger mostrou maiores atividades para celulase e hemicelulase,

contribuindo para maior ativação da via glicolítica, como sugerido pelo acúmulo

de 2-fosfoglicerato no seu perfil metabólico.

Finalmente, o presente estudo contribuiu para a identificação de novos genes

alvos possivelmente envolvidos na degradação de biomassa da cana. Estes genes devem ser

melhor investigados para que se possa comprovar sua real influência sobre a sacarificação

do bagaço, de forma a tentar otimizar os coquetéis enzimáticos e minimizar seu custo para a

produção de etanol 2G.

170

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203

ANEXO I Tabela 1. Relação dos 75 metabólitos identificados e suas concentrações em T. reesei crescido em glicose, CMC, lactose e BEX, após 48 h. Os valores das concentrações foram normalizados pela massa coletada e convertidos em log2. Metabólitos com concentrações maiores são mostrados em verde mais escuro. Avg: média; std: desvio padrão.

T. reesei

Glucose CMC Lactose BEX

Metabolite Avg Std Avg Std Avg Std Avg Std

2-Hydroxyisobutyrate -1.092 0.033 -0.789 0.449 3.746 0.193 -1.243 0.065

2-Oxoglutarate -1.092 0.033 6.995 0.125 6.779 0.308 -1.243 0.065

2-Phosphoglycerate 9.233 0.477 -0.789 0.449 14.757 0.256 -1.243 0.065

3-Hydroxybutyrate -1.092 0.033 -0.789 0.449 5.651 0.295 -1.243 0.065

3-Hydroxyisovalerate -1.092 0.033 -0.789 0.449 6.070 0.294 -1.243 0.065

4-Aminobutyrate 11.703 0.254 9.816 0.335 10.217 0.757 8.851 0.992

ADP 7.212 0.462 7.924 0.421 8.393 0.197 4.108 3.624

AMP 5.356 0.847 6.211 0.477 7.189 0.303 3.288 3.444

Acetate -1.092 0.033 4.529 3.132 9.319 0.509 4.457 0.391

Alanine 11.887 0.111 11.179 0.244 13.595 0.186 9.361 0.992

Allantoin -1.092 0.033 -0.789 0.449 7.608 0.411 -1.243 0.065

Anserine -1.092 0.033 -0.789 0.449 6.386 0.906 -1.243 0.065

Arginine 9.419 0.638 9.051 0.165 7.744 0.512 -1.243 0.065

Asparagine 10.188 0.675 7.625 5.189 9.043 0.248 7.100 1.114

Aspartate 8.539 0.863 10.330 0.338 8.505 0.281 7.181 0.711

Betaine 5.932 1.076 7.030 0.419 5.136 0.139 4.716 0.968

Cellobiose -1.092 0.033 11.858 0.366 -0.876 0.294 2.736 4.641

Choline 7.748 0.703 9.127 0.436 8.794 0.368 6.282 1.024

Dimethylamine -1.092 0.033 -0.789 0.449 2.937 1.092 -1.243 0.065

Fructose 7.450 0.987 10.243 0.645 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Fumarate 6.377 0.707 9.664 0.346 7.882 0.328 5.586 1.411

Galactarate -1.092 0.033 9.317 0.221 7.633 0.589 -1.243 0.065

Galactitol -1.092 0.033 -0.789 0.449 13.994 0.214 -1.243 0.065

Galactonate -1.092 0.033 -0.789 0.449 9.364 0.633 2.396 4.248

Galactose -1.092 0.033 -0.789 0.449 11.708 0.098 -1.243 0.065

Glucarate 7.162 0.955 9.529 0.606 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Glucitol -1.092 0.033 -0.789 0.449 13.035 0.580 -1.243 0.065

Glucose 7.872 0.484 10.580 0.387 9.284 0.245 6.662 1.183

Glucuronate -1.092 0.033 -0.789 0.449 10.472 0.701 -0.597 1.284

Glutamate 10.765 0.840 12.283 0.159 12.144 0.171 9.723 0.900

Glutamine 12.795 0.679 13.460 0.301 12.537 0.205 10.702 1.129

Glutathione 8.019 0.220 -0.789 0.449 8.111 0.179 -1.243 0.065

Glycerol 7.543 0.665 8.641 0.622 11.187 0.795 -1.243 0.065

Glycine 8.645 0.238 5.866 3.366 10.390 0.610 5.899 1.301

Glycolate -1.092 0.033 11.332 0.194 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Histidine 8.226 0.950 7.475 0.103 6.941 0.222 -1.243 0.065

204

(Continuação – metabólitos T. reesei)

Homoserine 9.033 0.555 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Isobutyrate 0.907 1.986 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Isoleucine 6.895 0.311 6.150 0.710 6.855 0.303 1.479 3.192

Lactate 10.101 0.570 9.848 0.300 9.956 0.321 8.052 1.042

Lactose -1.092 0.033 -0.789 0.449 13.267 0.430 -1.243 0.065

Leucine 7.354 0.434 7.639 0.448 7.467 0.300 0.049 2.647

Levulinate 3.031 3.610 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Lysine 9.588 0.380 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Malate 10.145 0.645 12.435 0.395 10.025 0.473 -1.243 0.065

Maltose -1.092 0.033 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Mannitol 14.568 0.031 15.045 0.472 14.676 0.262 12.141 1.094

Mannose -1.092 0.033 -0.789 0.449 4.104 5.906 -1.243 0.065

N-Acetylcysteine 2.562 3.138 -0.789 0.449 5.848 0.973 -1.243 0.065

N-Acetylglucosamine 3.385 0.352 6.649 1.189 5.846 0.877 5.058 0.981

N6-Acetyllysine 2.831 3.445 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

NAD+ 6.878 0.434 6.816 0.630 7.400 0.396 1.859 3.637

O-Acetylcholine 6.125 0.673 7.492 0.296 4.241 0.281 3.145 1.006

O-Phosphocholine -1.092 0.033 4.632 3.195 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Ornithine 7.006 0.184 5.839 0.617 7.594 0.770 0.278 3.106

Phenylalanine 6.373 0.276 4.110 3.493 6.402 0.598 -1.243 0.065

Proline 7.990 0.503 8.612 0.601 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Pyruvate 5.981 0.658 3.808 1.401 6.544 0.309 4.876 2.146

Saccharopine -1.092 0.033 -0.789 0.449 9.501 0.320 -1.243 0.065

Sarcosine -1.092 0.033 -0.789 0.449 3.249 0.835 -1.243 0.065

Serine 10.124 0.382 10.327 0.839 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Succinate 9.334 0.744 9.227 0.220 10.291 0.155 6.371 1.098

Threonate 7.979 0.157 9.190 0.767 11.519 0.395 -1.243 0.065

Threonine 9.159 0.801 6.853 1.307 8.400 0.181 5.182 0.951

Trehalose 12.503 0.402 13.193 0.378 12.477 0.403 10.843 1.414

Tyrosine 6.352 0.089 5.424 0.791 6.186 0.468 -1.243 0.065

UDP-N-Acetylglucosamine 8.902 0.288 8.855 0.218 8.693 0.090 6.181 1.218

UDP-galactose -1.092 0.033 -0.789 0.449 7.712 0.321 -1.243 0.065

UDP-glucose 7.451 0.228 7.612 0.331 8.669 0.089 5.692 0.776

Uracil 6.522 0.299 4.456 3.137 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Uridine -1.092 0.033 -0.789 0.449 -0.876 0.294 -1.243 0.065

Valine 8.036 0.153 7.718 0.312 8.384 0.150 5.421 0.767

cis-Aconitate -1.092 0.033 6.326 0.480 5.980 0.200 -1.243 0.065

myo-Inositol 8.245 0.585 8.034 0.475 -0.876 0.294 2.456 4.324

sn-Glycero-3-phosphocholine 10.646 0.486 11.219 0.286 8.838 0.052 7.677 1.057

205

Tabela 2. Relação dos 75 metabólitos identificados e suas concentrações em A. niger crescido em glicose, CMC, lactose e BEX, após 48 h. Os valores das concentrações foram normalizados pela massa coletada e convertidos em log2. Metabólitos com concentrações maiores são mostrados em laranja mais escuro. Avg: média; std: desvio padrão.

A. niger

Glucose CMC Lactose BEX

Metabolite Avg Std Avg Std Avg Std Avg Std

2-Hydroxyisobutyrate -1.038 0.126 2.466 0.237 1.333 1.565 -1.276 0.009

2-Oxoglutarate -1.038 0.126 7.366 0.203 6.972 0.879 -1.276 0.009

2-Phosphoglycerate 10.631 0.270 -1.041 0.030 11.421 0.787 10.550 0.211

3-Hydroxybutyrate -1.038 0.126 5.536 0.348 7.720 0.227 6.481 0.396

3-Hydroxyisovalerate -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.892 0.829 -1.276 0.009

4-Aminobutyrate 11.439 1.175 11.561 0.164 11.570 0.221 7.499 0.465

ADP 6.096 0.626 7.168 0.585 7.345 0.841 4.764 0.454

AMP 6.563 1.224 7.582 0.547 7.574 0.470 5.599 0.214

Acetate 0.386 2.874 -1.041 0.030 6.073 0.928 4.552 0.482

Alanine 11.806 0.475 12.587 0.049 11.998 0.280 9.691 0.179

Allantoin 1.553 5.058 -1.041 0.030 9.027 0.321 -1.276 0.009

Anserine -1.038 0.126 -1.041 0.030 7.753 1.377 -1.276 0.009

Arginine 10.610 0.469 11.210 0.218 9.569 0.271 -1.276 0.009

Asparagine 8.645 0.499 9.283 0.623 9.004 0.102 5.942 0.619

Aspartate 8.875 0.407 9.391 0.633 9.291 0.226 7.630 0.246

Betaine 6.350 0.204 5.324 0.345 6.773 0.337 6.837 0.326

Cellobiose -1.038 0.126 10.004 0.190 0.226 0.482 6.166 0.348

Choline 5.283 2.215 6.284 0.259 6.696 0.188 3.480 0.293

Dimethylamine -1.038 0.126 -1.041 0.030 3.477 0.794 -1.276 0.009

Fructose 8.605 0.661 9.277 0.382 0.226 0.482 -1.276 0.009

Fumarate 7.399 1.114 7.528 0.177 7.284 0.263 4.538 0.335

Galactarate -1.038 0.126 7.507 0.040 4.806 4.359 -1.276 0.009

Galactitol -1.038 0.126 -1.041 0.030 6.238 4.775 -1.276 0.009

Galactonate -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.226 0.482 4.613 3.967

Galactose -1.038 0.126 -1.041 0.030 2.797 4.084 -1.276 0.009

Glucarate 7.132 0.564 7.559 0.160 0.226 0.482 -1.276 0.009

Glucitol -1.038 0.126 -1.041 0.030 8.850 7.023 -1.276 0.009

Glucose 7.797 0.892 8.744 0.452 8.522 0.429 6.553 0.808

Glucuronate -1.038 0.126 -1.041 0.030 2.783 4.060 -1.276 0.009

Glutamate 10.521 0.641 12.296 0.059 11.894 0.009 10.221 0.142

Glutamine 10.686 0.289 12.598 0.147 11.420 0.775 9.705 0.169

Glutathione 6.738 0.672 -1.041 0.030 7.475 0.569 -1.276 0.009

Glycerol 12.194 0.899 10.654 0.748 12.788 0.165 10.345 0.329

Glycine 8.938 0.365 9.825 0.077 4.930 4.146 5.422 1.706

Glycolate -1.038 0.126 9.395 0.212 0.226 0.482 -1.276 0.009

Histidine 8.374 0.781 8.342 0.071 7.796 0.382 -1.276 0.009

Homoserine 9.760 0.814 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

206

(Continuação – metabólitos A. niger)

Isobutyrate 3.656 0.618 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Isoleucine 5.971 1.064 6.595 0.178 6.521 0.275 4.243 0.484

Lactate 8.005 1.240 7.006 0.140 7.376 0.486 5.510 0.662

Lactose -1.038 0.126 -1.041 0.030 13.078 0.972 -1.276 0.009

Leucine 7.215 0.931 7.361 0.453 6.870 0.460 4.123 0.465

Levulinate 5.458 0.357 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Lysine 0.883 3.866 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Malate 10.737 0.940 10.728 0.398 10.470 0.797 -1.276 0.009

Maltose -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Mannitol 15.148 0.269 15.217 0.132 14.996 0.234 13.470 0.278

Mannose -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

N-Acetylcysteine 4.911 0.099 -1.041 0.030 5.605 0.700 -1.276 0.009

N-Acetylglucosamine 4.460 2.024 5.360 0.824 3.779 2.642 5.323 0.857

N6-Acetyllysine 7.676 0.330 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

NAD+ 7.324 0.824 7.473 0.357 7.716 0.165 4.875 0.163

O-Acetylcholine 3.084 2.732 -1.041 0.030 6.964 0.141 0.368 1.138

O-Phosphocholine -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Ornithine 9.324 0.304 8.636 0.149 8.143 0.349 6.430 0.151

Phenylalanine 4.545 3.783 5.771 0.141 2.356 3.655 -1.276 0.009

Proline 7.307 0.908 8.064 0.230 0.226 0.482 -1.276 0.009

Pyruvate 5.828 0.615 4.700 0.744 4.352 3.127 4.440 0.422

Saccharopine -1.038 0.126 -1.041 0.030 0.226 0.482 -1.276 0.009

Sarcosine -1.038 0.126 -1.041 0.030 4.535 0.498 -1.276 0.009

Serine 3.586 5.308 10.259 0.196 0.226 0.482 -1.276 0.009

Succinate 9.156 0.980 8.843 0.307 8.838 0.760 5.696 0.407

Threonate 4.955 4.023 8.383 0.168 0.226 0.482 -1.276 0.009

Threonine 8.846 0.392 8.700 0.035 8.670 0.034 5.982 0.598

Trehalose 11.732 1.071 12.210 0.164 11.157 0.095 9.670 0.302

Tyrosine 6.307 1.060 6.257 0.102 3.975 3.316 -1.276 0.009

UDP-N-Acetylglucosamine 8.434 0.217 8.542 0.098 8.338 0.051 5.719 0.873

UDP-galactose -1.038 0.126 -1.041 0.030 7.937 0.711 -1.276 0.009

UDP-glucose 6.835 0.944 7.680 0.377 7.246 0.747 5.619 0.751

Uracil 5.556 1.280 5.645 0.135 0.226 0.482 -1.276 0.009

Uridine 3.024 4.805 6.708 0.164 0.226 0.482 -1.276 0.009

Valine 7.838 0.738 7.863 0.065 7.550 0.143 5.474 0.336

cis-Aconitate -1.038 0.126 5.897 0.650 6.595 0.197 0.223 2.993

myo-Inositol 6.813 1.562 7.808 0.470 0.226 0.482 -1.276 0.009

sn-Glycero-3-phosphocholine 9.798 0.712 9.580 0.627 10.178 0.125 8.199 0.220

207

ANEXO II

Figura 1. Heatmap do perfil metabólico de T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC, lactose (Lac) e BEX, e das amostras controle (CT). Por motivo de espaço, são mostradas apenas as médias das concentrações das amostras. A chave em preto indica as réplicas das condições controle (meio de cultura sem fungo). O perfil metabólico da condição BEX é apresentado apenas para dar uma visão geral da abundância e diversidade dos metabólitos encontrados.

208

ANEXO III Tabela 1. Metabólitos identificados em T. reesei e A. niger com os 10 maiores (em vermelho) e menores (em azul) valores de score para a análise de PCA de dois componentes. PC1 e PC2 foram responsáveis pela maior separação das amostras de lactose das demais amostras, respectivamente.

Metabolites PC1 Metabolites PC2

Lactose 0.31708 Homoserine 0.34444

Glucitol 0.29155 2-Phosphoglycerate 0.29807

Galactitol 0.28566 Glutathione 0.23353

2-Phosphoglycerate 0.24272 N6-Acetyllysine 0.21931

Galactose 0.22462 Lysine 0.18109

Glucuronate 0.20545 Levulinate 0.18036

UDP-galactose 0.19427 N-Acetylcysteine 0.13313

Allantoin 0.19186 Isobutyrate 0.11541

Anserine 0.17262 Uracil 0.053009

Saccharopine 0.16899 Pyruvate 0.046093

Uridine -0.06571 Serine -0.09228

Homoserine -0.07201 O-Phosphocholine -0.09425

Uracil -0.13499 Acetate -0.10539

Glycolate -0.15487 Threonate -0.10668

Cellobiose -0.16325 3-Hydroxybutyrate -0.11757

myo-Inositol -0.18705 cis-Aconitate -0.23773

Glucarate -0.19277 2-Oxoglutarate -0.27096

Proline -0.19297 Galactarate -0.31531

Fructose -0.21696 Glycolate -0.33481

Serine -0.2175 Cellobiose -0.35135

209

ANEXO IV Metabólitos com diferença estatisticamente significativa em T. reesei crescido em glicose, CMC, lactose e BEX, em relação às mesmas condições de crescimento de A. niger. O teste t-student foi aplicado e somente os metabólitos com foldchange (FC) > 2 (T. reesei) ou FC < 2 (A. niger), e false-discovery rate (FDR) ≤ 0,1 foram mantidos.

Glicose

Metabolites FC log2(FC) FDR

Glutamine 4.54 2.18 3.93E-02

2-Phosphoglycerate 0.39 -1.37 5.29E-02

Ornithine 0.20 -2.33 4.36E-03

Glycerol 0.04 -4.76 1.71E-02

CMC

Metabolites FC log2(FC) FDR

O-Acetylcholine 376.67 8.56 9.75E-08

O-Phosphocholine 116.94 6.87 2.41E-02

Acetate 107.14 6.74 2.41E-02

Choline 7.32 2.87 1.42E-04

Lactate 7.26 2.86 3.26E-05

Fumarate 4.46 2.16 1.46E-04

Glucarate 4.14 2.05 2.31E-03

Glycolate 3.83 1.94 6.71E-05

Cellobiose 3.67 1.88 3.90E-04

Glucose 3.54 1.82 2.40E-03

Galactarate 3.54 1.82 3.54E-05

Betaine 3.30 1.72 2.31E-03

Malate 3.26 1.71 2.45E-03

sn-Glycero-3-phosphocholine 2.97 1.57 7.42E-03

Fructose 2.04 1.03 7.01E-02

Trehalose 2.02 1.01 7.42E-03

AMP 0.38 -1.38 2.00E-02

Alanine 0.38 -1.39 1.42E-04

Threonine 0.35 -1.52 5.58E-02

4-Aminobutyrate 0.30 -1.72 3.37E-04

Glycerol 0.24 -2.05 1.38E-02

Arginine 0.22 -2.16 3.54E-05

Glycine 0.16 -2.66 9.24E-02

Ornithine 0.15 -2.70 4.10E-04

2-Hydroxyisobutyrate 0.11 -3.22 7.95E-05

3-Hydroxybutyrate 0.01 -6.30 9.22E-06

Uridine 0.01 -7.45 1.80E-06

210

Lactose

Metabolites FC log2(FC) FDR

Threonate 1245.40 10.28 3.46E-05

Saccharopine 303.78 8.25 3.46E-05

Galactonate 292.64 8.19 1.02E-04

Galactose 53.88 5.75 1.44E-02

Galactitol 46.84 5.55 3.34E-02

Glucuronate 25.97 4.70 2.76E-02

3-Hydroxyisovalerate 22.72 4.51 1.02E-04

Glycine 13.18 3.72 6.36E-02

2-Phosphoglycerate 9.21 3.20 2.22E-03

Acetate 8.64 3.11 7.20E-03

Lactate 5.87 2.55 1.94E-03

Choline 4.36 2.12 1.75E-03

Alanine 3.01 1.59 1.75E-03

2-Hydroxyisobutyrate 2.86 1.51 3.76E-02

Trehalose 2.56 1.36 9.87E-03

Succinate 2.50 1.32 2.98E-02

UDP-glucose 2.48 1.31 2.92E-02

Glutamine 2.00 1.00 6.72E-02

4-Aminobutyrate 0.43 -1.22 6.35E-02

sn-Glycero-3-phosphocholine 0.39 -1.34 1.02E-04

Allantoin 0.38 -1.40 1.44E-02

Glycerol 0.36 -1.47 4.25E-02

Betaine 0.32 -1.66 1.75E-03

Arginine 0.29 -1.77 9.80E-03

3-Hydroxybutyrate 0.24 -2.06 1.41E-03

O-Acetylcholine 0.15 -2.71 2.23E-04

BEX

Metabolites FC log2(FC) FDR

Choline 8.04 3.01 1.71E-02

Lactate 6.27 2.65 2.80E-02

O-Acetylcholine 6.22 2.64 2.80E-02

Betaine 0.26 -1.94 2.80E-02

Leucine 0.26 -1.96 9.28E-02

Ornithine 0.10 -3.39 2.80E-02

3-Hydroxybutyrate 0.01 -6.76 5.64E-07

Glycerol 0.00 -10.62 1.92E-08

2-Phosphoglycerate 0.00 -10.81 2.74E-09

211

ANEXO V

212

213

ANEXO VI

214

ANEXO VII

215

ANEXO VIII

216

ANEXO IX

217

ANEXO X

218

ANEXO XI

219

ANEXO XII