UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

BRUNA SAMPAIO ROBERTO

ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

BIOTRANSFORMADOS POR TANASE IMOBILIZADA NA

INIBIÇÃO DE DIABETES E OBESIDADE: MODELOS IN VITRO

STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

POLYPHENOLS BY IMMOBILIZED TANNASE ON INHIBITION

OF DIABETES AND OBESITY: IN VITRO MODELS

CAMPINAS 2017

BRUNA SAMPAIO ROBERTO

ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

BIOTRANSFORMADOS POR TANASE IMOBILIZADA NA

INIBIÇÃO DE DIABETES E OBESIDADE: MODELOS IN VITRO

STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

POLYPHENOLS BY IMMOBILIZED TANNASE ON INHIBITION

OF DIABETES AND OBESITY: IN VITRO MODELS

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.

Thesis presented to the Faculty of Food Engineering of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Food Science.

Orientadora: Dra. GABRIELA ALVES MACEDO ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA BRUNA SAMPAIO ROBERTO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. GABRIELA ALVES MACEDO

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________ Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo

Orientadora

______________________________________________ Profa. Dra. Alessandra Gambero

FCM – USF Membro titular

______________________________________________ Profa. Dra. Joelise de Alencar Figueira Agelotti

IQ – UNIFAL Membro titular

______________________________________________ Profa. Dra. Solange Guidolin Canniatti Brazaca

USP - ESALQ Membro titular

______________________________________________ Profa. Dra. Vânia Battestin Wiendl

IFSP Membro titular

* A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.

Dedico este trabalho àquela que incansavelmente me ensina que a maior herança é o estudo e àquela que deixou um

grande legado sobre o amor de ensinar e a importância de estudar, minha mãe e minha vó (in memoriam).

A vocês dedico o meu melhor!

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus, pela minha vida cheia de sáude que me permitiu ter

determinação e persistência para ir atrás de todos meus sonhos. Obrigada por me amparar e

mostrar o caminho nas horas incertas. Com certeza, os trabalhos aos quais me dediquei foram

profícuos graças a Tua proteção.

À minha orientadora, Drª. Gabriela Alves Macedo, que nesses anos todos foi minha

referência científica. Obrigada por dividir comigo o teu conhecimento, que me fez dar tantos

passos e amadurecer como profissional. Obrigada pela sensibilidade, em vários momentos,

que me trouxe conforto ao saber que eu não estava sozinha. Obrigada pela confiança e sempre

acreditar no meu trabalho. Obrigada pela amizade, paciência, incentivo, pelos inúmeros

conselhos e pelo carinho transmitidos nesses anos.

À minha mãe, Beatriz, pelo amor sempre incondicional. És a grande responsável por

esta enorme experiência vivida. Este título só é meu por todo alicerce que tu construíste. Serei

eternamente grata pela dedicação diária, pela preocupação que mais de 1.000km implicam,

pelo exemplo de profissional, pela inspiração nos dias difíceis, pelo apoio nas diversas fases

dessa caminhada, por me ensinar a ser forte e a ter coragem a cada nova escolha. Obrigada

pelos princípios e valores a mim transmitidos, que nenhuma escola ensina e que sempre me

guiaram pelo bom caminho. Ao mesmo tempo, agradeço por sempre me transmitir o enorme

valor da escola, do professor e de um livro. Nunca cansarei de agradecer por fazer do meu

sonho o teu sonho, vivê-lo comigo, sem medir esforços, sendo pai e mãe por natureza, opção

e amor!

À minha querida avó Zilda Sampaio Roberto (in memorian) que mesmo sem sua

presença física se faz presente a cada pensamento, lembrança, sonhos e realizações. Seu

desejo de me ver crescendo com sucesso sempre esteve vivo em mim e me faz sempre mais

forte. Obrigada pelo amor puro e incentivador, pela atenção dedicada no início dos meus

estudos, obrigada por me abençoar e iluminar em todos os dias da minha vida.

Ao meu orientador do período sanduíche, Dr. Gordon McDougall, do The James

Hutton Institute, em Dundee, na Escócia, por ter me recebido de portas abertas, fazendo de

tudo para que eu tivesse uma adaptação fácil e rápida. Obrigada pelo tempo dedicado a me

orientar, pela preocupação com meu aprendizado e aproveitamento. Obrigada por oferecer

esta enorme possibilidade de crescimento acadêmico e pessoal. Não posso deixar de agradecer

pelo carinho e zelo, pois estava sempre preocupado com minha segurança e bem estar.

7

Ao meu namorado e agora noivo, André Luís, por todo o amor e compreensão dos

meus momentos de ausência decorrente da dedição na realização deste trabalho. Muito

obrigada por não me deixar desistir e me mostrar ser capaz de chegar onde desejo, sem dúvida

tu foste um incentivo fundamental. Obrigada por apoiar os meus sonhos e compartilhar as

minhas esperanças.

Ao Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos

da Universidade Estadual de Campinas pela oportunidade oferecida para a realização deste

trabalho.

A todos os amigos que fiz no Laboratório de Bioquímica de Alimentos e no

Laboratório de Bioprocessos, Ruann, Joelise, Amanda, Débora, Fernanda, Ricardo, Camilo,

Gilberto, Jéssica, Marcela, Liege, Léo, André, Dani, Débora, Erica, Fabiano, Fabíola, Paula,

Tauan, Vânia, Lívia e Amanda Ruviaro. Obrigada pelas risadas, conversas, dividirem

bancada, almoços, angústias, tristezas, alegrias, filmes, experiências e muito carinho. À Val e

Bia, que sempre estiveram dispostas em ajudar durante todos os meus experimentos. Ao

grande amigo José Valdo que me recebeu em Campinas e no laboratório com tanto carinho e

que fez o processo de adaptação ser mais fácil. Um agradecimento especial às minhas

queridas amigas e companheiras Isa, Lívia, Paulinha e Aninha, vocês foram essenciais! Vocês

foram a força, a alegria, o alívio, a risada alta, a mudança necessária em mim, a amizade que

pulsa... aquelas pessoas a quem eu nunca vou cansar de agradecer por esses anos de convívio

e por terem me feito uma pessoa melhor.

Aos amigos que fiz em Dundee, os quais tornaram minha estadia fora mais leve e

tranquila. Em especial à Silvia, Alex, Thales, Henrique, Laís, Fred, Mohit, Moacir, Mauro,

Raíssa e Mariana, pessoas incríveis que amenizaram a saudade de casa.

À minha “housemate” e amiga Laurence, que me acolheu de braços abertos em sua

casa. Obrigada por toda a ajuda com minha dificuldade com a língua “escocesa”, por cozinhar

tantas coisas gostosas, além dos passeios, dicas e toda a paciência com minhas diferenças

culturais.

Aos membros da banca examinadora pelas valiosas e detalhistas sugestões e

contribuições que tornaram minha tese melhor.

À CAPES pela bolsa de estudos durante 4 anos do doutorado no Brasil.

Ao CNPq (programa Ciência sem Fronteiras) que me oportunizou a experiência ímpar

de fazer o doutorado sanduíche, me concedendo uma bolsa de doutorado sanduíche e taxa de

bancada, que foram essenciais para a realização dos meus experimentos na Escócia.

8

Durante esta caminhada, buscando resposta para algumas de minhas inquietações e

para os problemas deste extenso trabalho, contei com a colaboração de muitas pessoas, as

quais tornaram esse sonho possível e o percurso mais agradável, em razão de sua torcida,

companhia, apoio, incentivo e oração. Enfim, meu agradecimento sincero à todos aqueles que

não foram mencionados aqui, mas que tiveram, de alguma forma, partipação nesse trabalho.

“A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem mesmo a delícia

da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você descobre que alguém

acredita e confia em você.”

(Ralph Waldo Emerson)

RESUMO

Chás branco, preto, verde e mate contém polifenóis que são compostos bioativos presentes em

abundância em nossa dieta e tem apresentado efeitos benéficos no sobrepeso, obesidade e

suas complicações, como diabetes mellitus tipo 2. Entretanto, muitos polifenóis não podem

ser absorvidos em sua forma nativa e seus efeitos estão associados à biodisponibilidade.

Enzimas glicosídicas adicionadas ao processamento podem hidrolisar os compostos fenólicos

dos alimentos, aumentando sua bioacessibilidade, biodisponibilidade, bioeficácia e,

consequentemente, incrementar sua atividade funcional. Assim, o objetivo deste estudo foi

avaliar a eficiência e estabilidade de um biorreator com a enzima tanase imobilizada em

alginato de sódio, definir parâmetros operacionais do processo, assim como, caracterizar os

extratos de chá branco, preto, verde e mate biotransformados, avaliar seus potenciais

antiobesidade in vitro e a bioacessibilidade dos polifenóis após processo de digestão in vitro.

As melhores condições operacionais do biorreator para a hidrólise enzimática foram:

utilização de tanase imobilizada em alginato de sódio na concentração de 5%, 300 rpm de

agitação, temperatura de 60ºC e concentração do imobilizado enzimático de 0,75%. Em

análise por HPLC-DAD e ESI-MS foi verificado que houve hidrólise dos polifenóis,

principalmente do ácido clorogênico, epigalocatequina galato (EGCG), galocatequina galato

(GCG), epicatequina galato (ECG) e rutina. A análise quantitativa foi realizada por HPLC-

DAD e o resultado mais significativo foi o aumento do ácido gálico 16 vezes no chá verde e

13 vezes no chá branco. Após a hidrólise do chá verde pela tanase imobilizada foi verificada a

diminuição de 75% do teor de EGCG e 95% do teor de ECG, e aumento de 70% do teor de

EGC e, cerca de 2,7 vezes o conteúdo de EC. Nos chás preto e branco biotransformados com

tanase imobilizada houve a hidrólise de 91% e 75% de ECG, respectivamente. No chá mate a

hidrólise de ácido clorogênico (54%) resultou no aumento do ácido cafeico em 4,3 vezes. A

modificação no perfil fenólico dos chás pela tanase imobilizada resultou no aumento da

atividade antioxidante, avaliados pelo método ORAC e DPPH. Os chás branco e verde

também apresentaram maior atividade oxidante através do método FRAP. Os compostos

fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas simuladas,

entretanto baixa estabilidade após as condições intestinais, demonstrando a importância do

consumo dos polifenóis já na porção aglicona ou em moléculas menores, facilitando a

absorção dos bioativos antes da degradação no trato gastrointestinal. Adicionalmente, a

biotransformação forneceu extratos de chás com maior potencial contra obesidade. O

conhecimento dessas relações é importante e permitiu a identificação de algum dos efeitos

10

relacionados ao consumo de chás, assim como comprovou que chás biotransformados são

alternativas com maior benefício que os chás originais, podendo ser utilizados como

adjuvantes no tratamento padrão de pessoas com sobrepeso, obesas e suas comorbidades

como o diabetes tipo 2.

Palavras-chave: Chás, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tanase, polifenóis, obesidade.

ABSTRACT

White, black, green and mate teas contain polyphenols which are bioactive compounds

present in abundance in our diet and have shown beneficial effects on overweight, obesity and

its complications, such as type 2 diabetes mellitus. However, many polyphenols can not be

absorbed in their native form and their effects are associated to bioavailability. Glycosidic

enzymes, added to the processing, can hydrolyse the phenolic compounds of food increasing

their bioaccessibility, bioavailability, bioefficacy and, as a consequence, increase their

functional activity. Therefore, the purpose of this study was to measure the efficiency and

stability of a bioreactor with the immobilized tannase enzyme in sodium alginate, to define

operational parameters of the process, as well as characterize biotransformed white, black,

green and mate tea extracts, to evaluate the antiobesity potential in vitro, and the

bioaccessibility of polyphenols after digestion process in vitro. The best bioreactor

operational conditions to enzymatic hydrolysis were: Tannase immobilized with alginate at a

5% concentration, 300 rpm stirring, temperature of 60 °C and enzymatic immobilized at a

0.75% concentration. The analyses from HPLC-DAD and HPLC/ESI-MS showed that there

was polyphenols hydrolysis, mainly chlorogenic acid, of catechins: epigallocatechin gallate

(EGCG), gallocatechin gallate (GCG), epicatechin gallate (ECG) and rutin. The quantitative

analysis was determined using HPLC-DAD and the most significant result was the increase of

gallic acid in 16 fold on green tea and 13 fold on white tea. After green tea hydrolysis by

immobilized tannase, a 75% decrease in EGCG content and 95% ECG content was observed,

with an increase of 70% in EGC content and 2.7 fold the EC content. In biotransformed black

and white teas by immobilized tannase there were hydrolysis of 91% and 75% of ECG,

respectively. In mate tea the hydrolysis of chlorogenic acid (54%) resulted in increased

caffeic acid by 4.3 fold. The modification in polyphenol profile of teas by immobilized

tannase resulted in increase of an antioxidant activity evaluated by both ORAC and DPPH

assays. The white and green teas also showed a higher antioxidant activity by FRAP assay.

The polyphenolic compounds of teas exhibited stability to the simulated gastric digestive

conditions, but low stability after intestinal conditions, evidencing the importance of phenolic

consumption in aglycone portion or in smaller molecules, facilitating the bioactives

absorption before gastrointestinal tract degradation. Additionally, the biotransformation

process provided teas extracts with higher potential against obesity. The knowledge of these

relations is important and allowed the identification of some of the effects related to the tea’s

consumption, as wells as proved that the biotransformed teas are an alternative with greater

12

benefits, as they can be used as adjuvants, without standard treatment of overweight, obese

people and their comorbidities like type 2 diabetes.

Keywords: Teas, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tannase, polyphenols, obesity

13

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato: bioacessibilidade e atividade antiobesidade. Tabela 2.1 Classificação dos flavonoides e fontes alimentares. ............................................... 36

Tabela 3.1 Atividades antiobesidade relacionadas aos polifenóis de Camellia sinensis (chá branco, chá verde e chá preto) e Ilex paraguariensis (erva mate e chá mate). ......................... 47

CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de taninos. Tabela 2.1 Variáveis e níveis utilizados. .................................................................................. 84

Tabela 2.2 Matriz do delineamento contendo valores decodificados e codificados (entre parênteses) das variáveis. ......................................................................................................... 85

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos para hidrólise de ácido tânico pela tanase livre e imobilizada, produzidas por Paecilomyces variotii. ...................................................................................... 89

Tabela 3.2 Parâmetros cinéticos obtidos para o processo de inativação da tanase. ................. 91Tabela 3.3 Avaliação da atividade específica e eficiência relativa após 6 ciclos de hidrólise com tanase imobilizada em 2 concentrações de alginato. ........................................................ 93Tabela 3.4 Estabilidade da atividade da enzima imobilizada durante o processo de armazenagem. ........................................................................................................................... 94Tabela 3.5 Delineamento composto central rotacional para estudo do efeito das variáveis temperatura, concentração de enzima, concentração de alginato e agitação na atividade enzimática utilizando tanase imobilizada em processo em batelada. ....................................... 95

Tabela 3.6 Coeficientes de regressão do DCCR para determinação da atividade enzimática após 30, 60 e 90 minutos de reação. ......................................................................................... 96

Tabela 3.7 Coeficientes de regressão do DCCR 24 para Eficiência Relativa de imobilização após 30, 60 e 90 minutos de reação. ......................................................................................... 97

Tabela 3.8 Eficiência Relativa (%) avaliada através da mensuração da proteína transferida para o meio reacional, em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático. .............................................................................................................................. 100 CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente gastrointestinal simulado.

Tabela 3.1 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá branco. ......................................................................................................................... 122

Tabela 3.2 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá verde. ........................................................................................................................... 123

Tabela 3.3 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá preto. ............................................................................................................................ 124

Tabela 3.4 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá mate. ............................................................................................................................ 126

14

Tabela 3.5 Efeito do tratamento da tanase imobilizada no teor dos principais polifenóis encontrados nos chás através da quantificação por HPLC/DAD............................................132Tabela 3.6 Atividade antioxidante………………………………………………..…………133

CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro.

Table 3.1 Total phenol content of tea extracts. ....................................................................... 170Table 3.2 Major changes in phenolic compounds after tannase treatment of teas. ................ 172

Tabela 3.3 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values for α-amylase activity. ..... 173Table 3.4 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on α-glucosidase activity. ................................................................................ 173Table 3.5 Lipase activity using ρNP substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition. ............................ 176Table 3.6 Lipase activity using olive oil as a substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.. ................. 178

15

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato: bioacessibilidade e atividade antiobesidade. Figura 2.1 Estrutura genérica dos flavonoides. ........................................................................ 34

Figura 2.2 Estrutura básica das diversas classes de flavonoides. ............................................. 35Figura 2.3 Estrutura de um trímero de proantocianidina.. ........................................................ 37

Figura 3.1 Planta Camellia sinensis. ........................................................................................ 39Figura 3.2 Planta Ilex paraguariensis. ...................................................................................... 43

Figure 4.1 Atividade esterásica e depsidase da tanase. ............................................................ 48Figura 4.2 Principais métodos de imobilização de enzimas. CLEA: cross-linked enzyme agregates. CLEC: cross-linked enzyme agregates.. .................................................................. 51Figura 4.3 Estrutura dos blocos homopoliméricos GG e MM e dos blocos heteropoliméricos GM, que constituem a molécula de alginato. ........................................................................... 53Figura 4.4 Formação da estrutura “eggbox” a partir da interação iônica dos blocos G com cátions de cálcio.. ...................................................................................................................... 55Figura 4.5 Modelo "egg-box" de gelificação do alginato e rearranjo das cadeias de alginato com cálcio.. ............................................................................................................................... 56Figura 4.6 Gráfico esquemático da formação de micropartículas de alginato de sódio via interação com íons cálcio.. ....................................................................................................... 57 CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de taninos.

Figura 2.1 Imobilização de tanase por encapsulação em alginato de sódio. ............................ 80Figura 2.2 Modelo esquemático do biorreator testado: Esquema de operação de um biorreator de mistura perfeita. A cesta contendo a enzima é representada pela estrutura fixada em b, Ci é a concentração de substrato, VR é o volume do biorreator e A é o sistema de agitação magnética. ................................................................................................................................. 83Figura 2.3 Ilustração do biorreator utilizado. ........................................................................... 83

Figura 3.1 Atividade enzimática da tanase imobilizada e livre. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). ........................................................ 86

Figura 3.2 Resultados da avaliação da porcentagem de atividade imobilizada e eficiência de imobilização. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste t (p<0,01). .... 87

Figura 3.3 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais para a tanase livre. .......................................................................................................................................... 89

Figura 3.4 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais da tanase imobilizada em duas concentrações: 3,6% e 5% ...................................................................... 90

Figura 3.5 Estabilidade operacional na reutilização da tanase imobilizada em alginato em ciclos sucessivos. Os valores representam a média ± desvio padrão. * = diferem estatisticamente pelo teste t (p<0,05). ...................................................................................... 92

16

Figura 3.6. Comportamento da atividade específica em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional. ................................................. 98Figura 3.7 Comportamento da hidrólise de ácido tânico em ácido gálico em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional. ....................................... 99 CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente gastrointestinal simulado.

Figura 3.1 Análise HPLC-MS do (A) chá branco (B) chá verde (C) chá preto. Os traços dos chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho.. .................... 120

Figura 3.2 Análise HPLC-MS do chá mate. Os traços dos chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho.. ........................................................................... 121

Figura 3.3 Áreas médias dos picos (HPLC/MS) a partir de três amostras. (A) Chá branco - CB= chá branco original, CBT= chá branco biotransformado. (B) Chá verde - CV= chá verde original, CVT= chá verde biotransformado. (C) Chá preto - CP= chá preto original, CPT= chá preto biotransformado, EC = epicatequina, CAT= catequina, EGC= epigalocatequina, GC= galocatequina, GQA= ácido 5-galoil quinico, CGA= ácido clorogênico, 3CGA= ácido 3-O-cafeoilquinico, 4CGA= ácido 4-O-cafeioilquinico, ECG = epicatequina galato, EGCG= epigalocatequina galato, DCQA= ácido dicafeoil quínico, PDBG= Prodelfinidina B 2-3'-O-galato. * = P <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t. ............................. 127

Figura 3.4 Média da área do picos (HPLC/MS) do ácido cafeico a partir de três amostras de chá mate. ** = significativamente diferentes através do teste t, p <0,01. .............................. 129

Figura 3.5 Média das áreas dos picos de cafeína e teobromina (HPLC/MS) a partir de três amostras. * = p <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t. ......................... 130

Figura 3.6 (A) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado (vermelho) após a digestão gástrica (B) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado (vermelho) após a digestão pancreática.. .................................................... 136Figura 3.7 (A) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado (vermelho) após digestão pancreática. ........................................................ 137

Figura 3.8 (A) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado (vermelho) após digestão pancreática. ........................................................ 139Figura 3.9 (A) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado (vermelho) após digestão pancreática. ........................................................ 141

Figura 3.10 Porcentagem de recuperação do ácido cafeico no chá mate biotransformado após digestão gástrica e pancreática após análise de HPLC-MS. ................................................... 143

CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro.

Figure 3.1 UV traces of tea extracts before and after tannase treatment. Samples were analysed at 1mg/mL and originals are in blue and tannase-treated in red. (A) Black tea (B) Green tea (C) White tea. (D) Mate tea. Traces are shown overlaid at 280 nm. ..................... 171

17

Figure 3.2 Effect of white tea (a) and green tea (b) extracts on lipase activity. The dose response for phenols content of extracts on lipase inhibition was assessed. Values are expressed as % control activity and were triplicates ± standard deviation. ........................... 177

Figure 3.3 Effect of tea extracts on 3T3-L1 cell viability. Two concentrations of tea extracts (250 and 500 µg of TPC/mL) were applied. Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. Values different from control group at *p< 0.05 are shown. ............... 179Figure 3.4 Effect of Black tea (A); Green tea (B); White tea (C) and Mate tea (D) on lipid accumulation in 3T3-L1 cells.. Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *p< 0,05 compared with control group. Same letters represent p>0.05; different letters represent p<0.05. ................. 181

18

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AE Atividade específica (U/mg de proteína)

AG Ácido gálico

APPH 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride

ARE Elemento de resposta antioxidante

BSA Albumina sérica bovina

BSA Albumina sérica bovina

CAT Catequina

CB Chá branco

CBT Chá branco biotransformado

CGA Ácido clorogênico

CP Chá preto

CPT Chá preto biotransformado

CV Chá verde

CVT Chá verde biotransformado

DCCR Delineamento Composto Central Rotacional

DCQA Ácido dicafeoil quínico

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium

DNA Ácido desoxirribonucleico

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

EC Epicatequina

ECG Epicatequina galato

EF Eficiência relativa

EGC Epigalocatequina

EGCG Epigalocatequina galato

FRAP Ferric reducing antioxidant power

GC Galocatequina

GCG Galocatequina galato

GQA Ácido 5-galoil quinico

HDL High density lipoprotein

HPLC High performance liquid chromatography

IC50 Concentração responsável por 50% da inibição

IL-6 Interleucina-6

19

LDL Low density lipoprotein

mRNA Ácido ribonucleico menssageiro

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NF-E2 Fator nuclear eritróide 2

ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity

PDBG Prodelfinidina B 2-3'-O-galato

PPO Polifenol oxidase endógena

SNC Sistema Nervoso Central

TNF-α Fatores de necrose tumoral alfa

UV Ultravioleta

20

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 24

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de

polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato: bioacessibilidade e atividade

antiobesidade ........................................................................................................................... 28

1. Introdução ....................................................................................................................... 31

2. Compostos fenólicos ....................................................................................................... 32

3. Chás ................................................................................................................................. 39

3.1 Chá Branco, Chá Preto e Chá Verde ..................................................................... 39

3.2 Chá Mate ................................................................................................................ 42

3.3 Chás e a obesidade ................................................................................................. 44

4. Tanase ............................................................................................................................. 47

4.1 Imobilização de enzimas ........................................................................................ 49

5. Conclusão ........................................................................................................................ 58

6. Referências ...................................................................................................................... 60

CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de

taninos ...................................................................................................................................... 73

1. Introdução ....................................................................................................................... 77

2. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 79

2.1 Materiais ................................................................................................................ 79

2.2 Produção e imobilização da tanase ........................................................................ 79

2.3 Determinação da atividade enzimática e eficiência de imobilização .................... 80

2.4 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 81

2.5 Estabilidade operacional e preservação da atividade durante armazenamento ..... 82

21

2.6 Estudo da hidrólise de ácido tânico em biorreator pela tanase imobilizada em

alginato por meio de planejamento de experimentos. .............................................................. 82

2.6.1Biorreator utilizado ........................................................................................... 82

2.6.2Delineamento composto central rotacional ....................................................... 84

2.6.3Planejamento univariado ................................................................................... 85

2.7 Análise Estatística .................................................................................................. 86

3. Resultados e Discussão ................................................................................................... 86

3.1 Atividade Enzimática e Eficiência de imobilização .............................................. 86

3.2 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 88

3.3 Estabilidade operacional e preservação durante armazenamento .......................... 92

3.4 Estudo da otimização da hidrólise de ácido tânico por delineamento composto

central rotacional ...................................................................................................................... 94

3.4.1Delineamento composto central rotacional ....................................................... 94

3.4.2Planejamento univariado ................................................................................... 98

4. Conclusão ...................................................................................................................... 100

5. Referências .................................................................................................................... 102

CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase

imobilizada e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente

gastrointestinal simulado ..................................................................................................... 106

1. Introdução ..................................................................................................................... 112

2. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 113

2.1 Materiais .............................................................................................................. 113

2.2 Chás e preparação dos extratos ............................................................................ 114

2.3 Imobilização da tanase e biotransformação enzimática ....................................... 114

2.4 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por HPLC-ESI/MS e quantificação

dos principais compostos fenólicos por HPLC-DAD ............................................................. 115

2.4.1Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por Cromatografia Líquida de

alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS) ................................ 115

22

2.4.2Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta

eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) ................................. 116

2.5 Atividade Antioxidante ........................................................................................ 117

2.5.1Capacidade de sequestrar o radical DPPH ...................................................... 117

2.5.2Teste de capacidade antioxidante do radical oxigênio – ORAC (Oxygen

Radical Antioxidant Activity) ................................................................................................ 117

2.5.3Poder redutor do íon ferro – FRAP ................................................................. 117

2.6 Digestão in vitro .................................................................................................. 118

2.7 Análise estatística ................................................................................................ 119

3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 119

3.1 Detecção, identificação e quantificação dos compostos extraídos de chás ......... 119

3.1.1Caracterização dos chás através da detecção e identificação por Cromatografia

Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS) .............. 119

3.1.2Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta

eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) ................................. 131

3.2 Atividade antioxidante ......................................................................................... 133

3.3 Estabilidade dos polifenóis após digestão in vitro ............................................... 135

4. Conclusão ...................................................................................................................... 143

5. Referências .................................................................................................................... 145

CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in

teas and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro ....................... 155

1. Introduction ................................................................................................................... 159

2. Materials and Methods .................................................................................................. 161

2.1 Materials and Chemicals ...................................................................................... 161

2.2 Immobilized tannase ............................................................................................ 162

2.3 Preparation of tea extracts ................................................................................... 163

2.4 Biotransformation ................................................................................................ 163

2.5 Total Phenols ....................................................................................................... 163

23

2.6 Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analysis ......................... 163

2.7 α - Amylase assay ................................................................................................ 165

2.8 α - Glucosidase assay ........................................................................................... 166

2.9 Lipase Assay (ρNP substrate) .............................................................................. 166

2.10 Lipase activity assay using olive oil as the substrate ........................................... 167

2.11 Cell culture and differentiation ............................................................................ 168

2.12 Oil Red O staining ............................................................................................... 168

2.13 Statistical analysis ................................................................................................ 169

3. Results and Discussion .................................................................................................. 169

3.1 Total Phenolic Content and Phenolic Profile ....................................................... 169

3.2 Effects on α-Amylase and α-Glucosidase inhibition ........................................... 172

3.3 Lipase inhibition effects ...................................................................................... 175

3.4 3T3-L1 Cell Culture and adipogenesis ................................................................ 179

4. Conclusions ................................................................................................................... 182

5. References ..................................................................................................................... 183

DISCUSSÃO GERAL .......................................................................................................... 190

CONCLUSÃO GERAL ....................................................................................................... 199

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 200

ANEXOS ................................................................................................................................ 207

24

INTRODUÇÃO GERAL

A obesidade é fator de risco para diversas doenças crônicas não transmissíveis como

diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, acidentes vasculares

cerebrais, hiperlipidemia, distúrbios músculo-esqueléticos e diversos tipos de câncer (OPAS,

2003; WHO, 2016). O excesso de massa corporal e a obesidade são reconhecidos como

problemas de saúde pública mundial e estão entre os cinco principais fatores de risco para as

causas de morte globais. Na literatura, existe um consenso de que a etiologia da obesidade é

bastante complexa, apresentando um caráter multifatorial. Dentre os diversos fatores, o

aumento da ingestão de alimentos altamente energéticos, ricos em gordura, associado ao

sedentarismo e à susceptibilidade genética seriam determinantes para o crescimento da

obesidade no mundo (FRANCISCHI et al. 2000; JEBB, 1997; OPAS, 2003; WHO, 2016).

Embora haja inúmeros fatores envolvidos, nota-se na literatura científica que os estudos sobre

obesidade são centrados nos fatores biológicos, relacionados ao estilo de vida, especialmente

no que diz respeito ao binômio: dieta e atividade física. Há crescente busca por alterações dos

fatores de risco contribuintes para a obesidade, seja utilizando fármacos, como também

através de mudanças comportamentais, como exercícios físicos frequentes e dieta. A inclusão

de alimentos com antioxidantes que desfavoreçam a ação de radicais livres ou quem atuem no

metabolismo de lipídeos e glicose para prevenir as complicações da obesidade sem, contudo,

apresentar efeitos adversos têm mostrado bons resultados (AUVICHAYAPAT et al., 2008;

HURSEL; VIECHTBAUER; WESTERTERP-PLANTENGA, 2009; HUANG et al., 2014;

BUCHHOLZ; MELZIG, 2016; CASTRO-ACOSTA et al., 2016; CHEN et al., 2016; PAN et

al., 2016; YANG et al., 2016). A partir disso, alterações da dieta impedindo o curso da

obesidade, ou seja, agindo na perda de peso ou na diminuição do ganho de peso é de suma

importância e interesse.

Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado os efeitos benéficos do chá e seus

compostos bioativos sobre a obesidade (HUANG et al., 2014; MIYOSHI et al., 2015;

BUCHHOLZ; MELZIG, 2016; PAN et al., 2016; YANG et al., 2016). Estudo realizado na

Holanda mostrou que a alta ingestão de flavonas, flavonois e catequinas foi inversamente

associado com o índice de massa corporal (IMC) em mulheres (HUGHES et al., 2008). Outro

estudo epidemiológico realizado com 6472 participantes descobriu que o consumo de chá

quente foi inversamente associado com a obesidade; consumidores de chá quente tinham

cintura inferior e IMC mais baixo do que os não consumidores (VERNARELLI; LAMBERT,

2013). A planta Camellia sinensis (C. sinensis) é usada como chá de diversas maneiras, de

25

acordo com os níveis de fermentação, sendo principalmente classificado como: branco e verde

(não fermentados), oolong (parcialmente fermentado) e preto (fermentado) (YANG; CHEN;

WU, 2014; HAYAT et al., 2015; SUZUKI et al., 2016). O poder antioxidante do chá é mais

elevado nos processos onde há pouca fermentação (CHENG, 2000). A planta Ilex

paraguariensis é usada como chá mate (torrado), chimarrão e tererê (infusão da erva verde em

água quente e fria, respectivamente) (MARTINS et al., 2009; MEINHART et al., 2010). Estes

chás são ricos em polifenóis cujos impactos na saúde ainda necessitam ser totalmente

esclarecidos, devido a inexistência de mecanismos de ação conclusivas e pouca pesquisa com

ensaios clínicos.

Polifenóis são compostos bioativos abundantes em nossa dieta e há evidências de seu

papel na prevenção de doenças degenerativas como câncer e doenças cardiovasculares. Os

efeitos dos polifenóis na saúde dependem da quantidade consumida e da sua bioacessibilidade

e biodisponilbilidade (SCALBERT et al., 2005). No entanto, a maioria dos polifenóis está

presente em alimentos sob a forma de ésteres, glicosídeos ou polímeros, não sendo absorvidos

na sua forma nativa. Estas substâncias precisam ser hidrolisadas pelas enzimas intestinais ou

pela microflora do cólon para serem absorvidas (MANACH; DONOVAN, 2004). Estas

enzimas podem ser obtidas de outras fontes como o próprio alimento ou serem adicionadas

durante o processamento (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). A hidrólise enzimática de

polifenóis resulta, além do aumento da absorção, no aumento da atividade antioxidante,

quando comparado com o composto original não biotransformado. Macedo et al. (2011)

estudaram extratos de chá verde e erva mate, substratos ricos em compostos fenólicos,

avaliando as propriedades antioxidantes potenciais antes e após a reação de biotransformação

enzimática catalisada por tanase de Paecilomyces variotii. Os autores verificaram que o poder

antioxidante dos substratos aumentou quando submetidos ao tratamento enzimático. Esses

resultados encontrados fornecem dados relevantes sobre o potencial da aplicação de tanase em

várias fontes de polifenóis a fim de aumentar o poder antioxidante de bebidas.

Apesar de todo potencial da aplicação de catalisadores biológicos, sua utilização

industrial pode ser limitada devido a diversos fatores, como: alto custo de produção, alta

solubilidade em água, menor estabilidade, baixa atividade a temperaturas elevadas e não ser

viável sua recuperação após a utilização, quando comparadas com catalisadores químicos.

Para minimizar esses problemas, técnicas de imobilização dessa enzima foram desenvolvidas

e monstraram bons resultados de eficiência e atividade enzimática, possibilitando o seu uso

em processos em batelada, oferecendo menor custo e facilitando a recuperação da enzima

com maior pureza do produto final (SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012).

26

Muitos trabalhos realizados com compostos fenólicos são centrados sobre sua

bioacessibilidade, biodisponibilidade, bioeficácia e estabilidade em diferentes matrizes. É

importante considerar que alguns polifenóis presentes em chás, que têm atividade biológica in

vitro e, in vivo, podem não ser biodisponiveis, ou serem rapidamente metabolizados e

excretados, tornando-se ineficazes. Além disso, apesar de estudos epidemiológicos indicarem

uma correlação entre a ingestão de alimentos ricos em compostos fenólicos e a redução do

risco de doenças crônicas, estudos intervencionais em seres humanos nem sempre tem

confirmado os efeitos benéficos desses compostos observados in vitro. É bem conhecido que

os flavonoides e ácidos fenólicos são altamente metabolizados após a ingestão e absorção

gastrointestinal, sendo geralmente transformados em metabólitos com diferente atividade

antioxidante da molécula precursora (MANACH et al., 2004). Ou seja, uma das razões para

tais discordâncias pode ser a falta de dados a respeito do processo que ocorre do momento da

sua ingestão até exercer seus efeitos biológicos.

Portanto, a elucidação do processo de digestão dos polifenóis constitui um passo

importante para uma abordagem completa sobre a atividade biológica dessas substâncias e

certamente, somente parte dos alimentos e compostos bioativos foi adequadamente estudada

desse ponto de vista. Juntamente com essa falta de dados há o uso crescente de novas

tecnologias que atendam a crescente necessidade de um melhor aproveitamento pelo corpo

dos compostos bioativos provenientes de fontes naturais, de forma que contribuam com a

melhoria da qualidade de vida.

A partir do exposto, o presente trabalho foi dividido em quatro capítulos. O Capítulo I

consiste em uma Revisão Bibliográfica que visou aliar o conhecimento da tanase e seu

potencial uso em chás, a imobilização de enzimas com foco na encapsulação em alginato de

sódio, chás como fonte de compostos fenólicos, sua bioacessibilidade, além das ações

antioxidantes e antiobesogênica.

No Capítulo II foram abordados aspectos de caracterização da tanase imobilizada em

alginato de sódio. Neste capítulo também teve o objetivo de realizar um estudo dos fatores

relevantes para a construção de um biorreator utilizando tanase imobilizada. Os parâmetros

avaliados incluíram a combinação mais adequada de imobilizado/substrato, a influência da

concentração de alginato, frequência de agitação e temperatura, sendo analisado também o

tempo de hidrólise na produção de ácido gálico.

Os Capítulos III e IV abordaram o estudo da utilização do biorreator em chás. O

objetivo foi primeiramente avaliar o perfil de fenólicos dos chás branco, preto, verde e mate,

antes e após a biotransformação, e posteriormente o impacto da hidrólise da tanase

27

imobilizada na atividade antioxidante dos chás, avaliada pelos ensaios de ORAC, FRAP e

DPPH. Através da digestão in vitro o objetivo foi identificar a estabilidade dos compostos

fenólicos dos chás. O impacto dos chás biotransformados na obesidade foi avaliado através da

inibição das enzimas gástricas in vitro e da adipogênese em células 3T3-L1.

28

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Efeito da biotransformação de polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato:

bioacessibilidade e atividade antiobesidade

29

RESUMO

Os polifenóis são encontrados amplamente em fontes vegetais, incluindo frutas, legumes e

cereais e em bebidas como chás e suco de frutas. Atuam na prevenção de doenças

degenerativas e cardiovasculares, no entanto, podem ter seu efeito diminuído devido à sua

complexação com outros compostos, sendo sua absorção diminuída em sua forma nativa.

Como estratégia tecnológica, enzimas adicionadas ao processamento podem hidrolisar estes

compostos desempenhando um papel essencial no aumento da biodisponibilidade e

bioeficácia destes compostos. A revisão bibliográfica aborda estratégias de imobilização de

enzimas que possam ser utilizadas na biotransformação por tanase para o aumento da

bioacessibilidade de polifenóis em chás, de forma que o precesso apresente viabilidade para

aplicação industrial.

Palavras-chave: polifenóis, tanase, imobilização, biotransformação, chás.

30

ABSTRACT

Polyphenols are found widely in plant sources, including fruits, vegetables and cereals and

inbeverages such as teas and fruit juice. They act in the prevention of degenerative and

cardiovascular diseases; however, they can have their effect diminished due to its

complexation with other compounds, being its absorption diminished in its native form. As a

technological strategy, enzymes added to the processing can hydrolyse these compounds by

playing an essential role in increasing the bioavailability and bioefficacy of these compounds.

The literature review approaches strategies for immobilization of enzymes that can be used in

biotransformation by tannase to increase the bioaccessibility of polyphenols in teas so that the

process presents viability for industrial application.

Keywords: polyphenols, tannase, immobilization, biotransformation, teas.

31

1. Introdução

O chá é uma das mais populares bebidas consumidas no mundo. Os inúmeros estudos

in vitro, em animais e em humanos evidenciam que seu abundante conteúdo de polifenóis

possui bioatividade para afetar a patogênese da obesidade e suas comorbidades. Os efeitos dos

polifenóis na saúde dependem da quantidade consumida e da sua bioacessibilidade e

biodisponibilidade (SCALBERT et al., 2005). Os polifenóis que não estão bioacessíveis na

sua forma nativa, em especial aqueles encontrados na forma de ésteres, glicosídeos e

polímeros, apresentam a necessidade de biotransformação no trato gastrointestinal

(SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). A hidrólise enzimática de polifenóis resulta, no

aumento da absorção e atividade antioxidante, quando comparado ao composto original não

biotransformado. A biodisponibilidade de um dado composto ou de seu metabólito depende

de fatores, como a complexidade da matriz, a estrutura química do composto de interesse e o

tempo de trânsito intestinal (HOLST; WILLIAMSON, 2008). Assim, os polifenóis mais

abundantes na dieta humana não são necessariamente os mais ativos, pois eles podem possuir

menor atividade intrínseca, serem pouco absorvidos no intestino, altamente metabolizados ou

ainda, rapidamente eliminados. Além disso, o teor de polifenóis das plantas pode diferir entre

as variedades de espécies e também com a maturação na época da colheita, fatores

ambientais, processamento e armazenamento (MANACH et al., 2004).

A enzima tanino acil hidrolase, conhecida como tanase (E.C. 3.1.1.20) é uma esterase

que tem capacidade de catalisar a reação de hidrólise das ligações ésteres presentes nos

taninos hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, assumindo inúmeras aplicações em alimentos,

medicamentos, bebidas e indústria química (BATTESTIN; MACEDO, 2007b). Macedo et

al. (2011) estudaram a atividade de tanase em extratos de chá verde e erva mate, substratos

ricos em compostos fenólicos, demonstrando maiores propriedades antioxidantes potenciais

do chá verde e extrato de erva-mate após a reação de biotransformação enzimática catalisada

por tanase de Paecilomyces variotii. Os resultados encontrados fornecem dados relevantes

sobre o potencial da aplicação de tanase em chás, fontes de polifenóis, para aumentar o poder

antioxidante de bebidas.

Apesar de todo potencial da aplicação de catalisadores biológicos, sua utilização

industrial pode ser limitada devido a diversos fatores, como: custo de produção, alta

solubilidade em água, menor estabilidade, baixa atividade a temperaturas elevadas e não ser

viável sua recuperação após a utilização, quando comparadas com catalisadores químicos

(CANILHA; CARVALHO; SILVA, 2006; SHELDON; PELT, 2013). Para minimizar esses

32

problemas, técnicas de imobilização podem reduzir os custos envolvidos na útil ização de

enzimas, permitindo também a reutilização do biocatalizador nas reações de aplicadas,

mostrando fundamental importância. Considerando a ampla variação nas quantidades de

antioxidantes fenólicos disponíveis por meio da alimentação, em combinação com a reduzida

biodisponibilidade, estratégias que permitam liberar os compostos fenólicos dos seus

conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional dos alimentos são

alternativas promissoras (GEORGETTI et al., 2009). Esta revisão aborda a utilização de

tanase imobilizada empregada com o objetivo de melhorar a bioacessibilidade e

biodisponibilidade dos compostos fenólicos em chás, bem como técnicas que permitem essa

avaliação. A revisão aborda também o potencial do uso da técnica em chás a fim de melhorar

seu potencial antioxidante e antiobesidade.

2. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são polifenóis presentes nos vegetais, na forma livre ou

ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas, e são metabólitos secundários cuja estrutura

química possui um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus

derivados funcionais como ésteres, metoxilas, glicosídeos e outros (KING; YOUNG, 1999;

LEE et al., 2005).

Atualmente são de amplo consenso os benefícios para saúde dos polifenóis. Estes são

antioxidantes naturais altamente eficazes, sugerindo-se que um aumento do consumo destes

em nossas dietas é benéfico na prevenção de danos oxidativos associados à várias doenças

humanas (GU et al., 2003). Há também afirmação de que os polifenóis podem atuar de forma

independente das suas atividades antioxidantes. Eles podem ter efeitos de drogas tal como a

modulação de sistemas de transdução de sinal, presumivelmente, através de interações com

receptores ou membranas e pela inibição direta das enzimas envolvidas na progressão da

doença (HANCOCK; MCDOUGALL; STEWART, 2007). Mais ainda, diversos trabalhos

apontam aos polifenóis capacidade de estimular a vasodilatação, melhorar a secreção de

insulina e inibir as atividades das enzimas fosfolipase A2, ciclooxigenase, lipoxigenase e

xantina oxidase que estão envolvidas em processos inflamatórios (MANACH et al., 2004;

HAN; SHEN; LOU, 2007; HEO et al., 2007; BOUAYED, 2010; BOUAYED; HOFFMANN;

BOHN, 2011; LEOPOLDINI; RUSSO; TOSCANO, 2011; PALAFOX-CARLOS; AYALA-

ZAVALA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2011). Diversos polifenóis, têm ainda sido destacados

devido à possibilidade de se ligarem a receptores celulares e transportadores de membranas e

33

assim influenciarem a expressão gênica, a sinalização e a adesão celular e modularem a

atividade de uma vasta gama de enzimas e receptores celulares (HEO et al., 2007;

BOUAYED; HOFFMANN; BOHN, 2011).

Os compostos fenólicos podem ser classificados em três grandes grupos (flavonoides,

ácidos fenólicos e taninos) e englobam desde moléculas simples até moléculas com alto grau

de polimerização (ANGELO; JORGE, 2007; SCHONS, 2009).

Os ácidos fenólicos são distribuídos por todo o reino vegetal. Muitas pesquisas têm

sido realizadas devido ao potencial papel destes compostos na proteção do organismo

humano. O consumo dos ácidos fenólicos tem sido indicado para proteger contra danos

oxidativos que ocorrem em muitas doenças, tais como a doença coronária cardíaca, acidente

vascular cerebral, obesidade, diabetes e câncer (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). Os

ácidos fenólicos são responsáveis por cerca de um terço do consumo total de polifenóis e

podem subdividir-se em derivados do ácido hidroxibenzóico e derivados do ácido

hidroxicinâmico.

Os ácidos hidroxibenzóicos tem uma estrutura de C6-C1 e são amplamente

encontradas em alimentos vegetais particularmente como glicosídeos (KROLL; RAWEL;

ROHN, 2003). Seus derivados incluem o ácido gálico (vinho e chás), elágico (morango, romã,

amora), salicílico (amendoim, trigo e pimenta), siríngico (açaí) e vanílico (baunilha). Os

ácidos gálico e elágico são importantes por serem precursores de taninos hidrolisáveis,

hidroxicinamatose estilbenos (SCHONS, 2009). Os ácidos hidroxicinâmico são comuns e

abundantes em muitas plantas e têm uma estrutura esquelética de C6-C3. Seus derivados

incluem o ácido cafeico (café, chá mate e mirtilo), ferúlico (farelo de milho e arroz), p-

cumárico (característico da uva e do vinho) e sinápico (feijão). Os ácidos fenólicos, além de

se apresentarem sob sua forma natural, podem também se ligar entre si ou com outros

compostos. A combinação mais importante destes ácidos ocorre com o éster de ácido caféico,

o qual, associado a um álcool-ácido cíclico, denominado ácido quínico, origina o ácido

clorogênico (chá mate, morangos, abacaxi, café, girassol e mirtilo). Raramente são

encontrados na forma livre, exceto em alimentos processados que sofreram congelamento,

esterilização, ou fermentação. Quando em outras formas, são derivados glicosilados ou ésteres

de ácido quínico, ácido chiquímico e ácido tartárico. (MANACH et al., 2004; HAN; SHEN;

LOU, 2007; LEOPOLDINI; RUSSO; TOSCANO, 2011). Os ácidos clorogênico e cafeico

mostraram ser antioxidantes e exercer efeito inibitório sobre a reação de N-nitrosação in vitro,

inibindo, deste modo, a formação de compostos N-nitrosos potencialmente mutagênicos e

carcinogênicos (HAN; SHEN; LOU, 2007). O ácido cafeico é geralmente o ácido fenólico

34

mais abundante nos frutos representando, na maior parte dos casos, entre 75 % a 100 % do

conteúdo total de ácidos hidroxicinâmicos. Os ácidos hidroxicinâmicos são encontrados em

todas as partes do fruto, embora as concentrações mais elevadas sejam encontradas nas partes

exteriores do fruto maduro (MANACH et al., 2004).

Todos os flavonoides tem em comum a estrutura C6-C3-C6, que consiste em dois

anéis aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos que formam um anel

heterocíclico, denominado anel C, possuindo hidroxilas e glicosídeos distribuídas ao redor

(Figura 2.1).

Figura 2.1 Estrutura genérica dos flavonoides.

Existem muitas classes de flavonoides que diferem no grau de oxidação do anel

fenólico. Para efeitos da presente revisão, a classificação do grupo de flavonoides se

concentra em flavonóis, flavonas, isoflavonas, flavanonas, flavanóis e antocianidinas (Figura

2.2). A Tabela 2.1 apresenta os principais grupos de flavonoides com seus componentes e

onde são encontrados em maior abundância nos alimentos.

A capacidade antioxidante dos flavonoides está diretamente associada ao aumento dos

grupos hidroxilas e diminuição das glicosilações. Essas moléculas estão associadas com o

comportamento ecológico de algumas plantas. A radiação UV nos vegetais é necessária à

fotossíntese, porém pode produzir espécies reativas de oxigênio (ERO). Os flavonoides agem

sequestrando esses radicais, resultando em efeito protetor para as células vegetais (WINKEL-

SHIRLEY, 2001).

35

Figura 2.2 Estrutura básica das diversas classes de flavonoides (MANACH et al., 2004).

Nos últimos anos tem crescido o número de pesquisas que sugerem que os flavonoides

protegem o DNA do dano induzido por radicais livres através do mecanismo scavenger. Esses

compostos podem reduzir a incidência de quebra da cadeia dupla, assim como o dano de base

residual através do rápido reparo químico. Suas propriedades permitem também atuar como

agentes quelantes de íons metálicos, responsáveis pela geração de (ERO) e consequentemente,

inibir o inicio da reação de lipoxigenação (ANDERSON et al., 2000; RIETVELD;

WISEMAN, 2003). Além disso, estudos têm demonstrado que os flavonoides podem inibir e

até induzir uma grande quantidade de enzimas que estão relacionadas em importantes

processos reguladores, como a divisão e proliferação celular, agregação plaquetária,

detoxificação, resposta inflamatória e resposta imune do organismo humano (WILLIAMS;

SPENCER; RICE-EVANS, 2004; JOHNSON; MAHER; HANNEKEN, 2009; DAI;

MUMPER, 2010; LEE et al., 2011).

36

Tabela 2.1 Classificação dos flavonoides e fontes alimentares. Subclasse Compostos Alimentos

Flavonol Quercetina, miricetina, kaempferol Chás, Cebola, vinho,

gengibre, maçã, uva, cereja,

couve.

Flavanonas Naringenina, hesperidina, eridictiol Frutas cítricas, ameixa

vermelha.

Flavona Apigenina, luteolina, tangeritina Camomila, aipo, salsa,

tomilho e tangerinas

Flavanols Catequinas, galocatequinas, epicatequina,

epigalocatequina, epicatequina galato,

epigalatocatequina galato, teaflavina,

teaflavina galato, teaflavina digalato,

tearubiginas

Chás (Camellia sinensis),

uva, vinho, maçã, cacau.

Antocianinas Cianidina, Delfidina, Peonidina,

Petunidina, Pelargonidina, Malvidina

Vinho tinto, frutos

vermelhos, azuis ou roxos.

Isoflavonas Genisteína, daidzeína, gliciteína Soja, grão de bico, amendoim

e outras leguminosas. Adaptado de Nijveldt et al. (2001) e Egert e Rimbach (2011)

Taninos são encontrados em muitos alimentos e bebidas e são os únicos compostos

fenólicos de elevado peso molecular com capacidade para complexar fortemente com os

carboidratos e proteínas. São divididos em dois grandes grupos: taninos hidrolisáveis e

taninos condensados ou proantocianidinas. Os taninos hidrolisáveis consistem em um núcleo

de carboidrato (na maioria das vezes a D-glicose) que é parcialmente ou totalmente

esterificado com grupos fenólicos, tais como o ácido gálico ou ácido elágico. Elagitaninos

podem ser hidrolisados em ácido elágico no corpo, um antioxidante muito eficaz. Elagitaninos

(ou o seu componente ácido elágico) parecem ter propriedades anti-cancerígenas in vitro

(ROSS; MCDOUGALL; STEWART, 2007) e propriedades antiobesidade por inibir a enzima

digestiva, lipase (MCDOUGALL; KULKARNI; STEWART, 2009). Já os polímeros

galotaninos são formados quando os monômeros de ácido gálico são esterificados de núcleos

de carboidratos. Estudos sugerem que o ácido gálico tem propriedades de proteção contra o

dano oxidativo em certas doenças neurológicas (PEREIRA et al., 2009).

37

Os taninos condensados ou proantocianidinas são os polímeros que são formados pela

condensação de flavonoides. Estes taninos não contêm resíduos de açúcar (Figura 2.3) e são

mais amplamente distribuídos do que os taninos hidrolisáveis. Possuem propriedades

antioxidantes fortes e têm sido reconhecidos por desempenharem um papel na manutenção da

elastina no tecido conjuntivo (KU; MUN, 2008). Estes compostos têm sido associados a

benefícios relacionados com diabetes, doenças cardiovasculares e níveis elevados de

colesterol (JIMÉNEZ et al., 2008). Estudo realizado por Steigerwalt et al. (2009) constatou

que pacientes que receberam Pycnogenol (um suplemento dietético rico em taninos

condensados) em fase precoce da retinopatia diabética, melhoraram a circulação sanguínea e

tiveram redução do edema, o que resultou em melhora da visão.

O

HO

OH

HO

OH

OH

O

HO

OH

HO

OH

OH

O

HO

OH

HO

OH

OH

Figura 2.3 Estrutura de um trímero de proantocianidina. Adaptado de Taylor et al. (2005).

Entretanto, a estrutura química dos compostos fenólicos pode afetar sua propriedade

biológica tais como a biodisponibilidade, bioacessibilidade, a atividade antioxidante e as

interações com receptores celulares específicos e enzimas (MACEDO et al., 2012). É

importante observar que a bioacesibilidade é definida como a quantidade de cada composto

ingerido que fica disponível para absorção no intestino após digestão. Por outro lado, a

biodisponibilidade inclui também na sua definição a bioatividade de um nutriente, está

inserida no contexto de ação fisiológica mais específica. Portanto, pode ser definida como a

fração de nutriente ou composto ingerido que é absorvido, atinge a circulação sistêmica, é

38

então distribuído aos tecidos, chegando ao tecido alvo e exercendo seu efeito sobre a saúde.

Em geral, a biodisponibilidade inclui digestão gastrointestinal, absorção, metabolismo,

distribuição de tecidos e bioatividade (PARADA; AGUILERA, 2007; FERNÁNDEZ-

GARCÍA; CARVAJAL-LÉRIDA; PÉREZ-GÁLVEZ, 2009; BOUAYED et al., 2012).

A maioria dos compostos fenólicos encontrados na natureza está associada com

açúcares, que compreende uma diversidade de conjugados, incluindo glicosídeos,

galactosídeos, rutinosídeos, arabinosídeos e xilosídeos, reduzindo a sua capacidade

antioxidante. Tais glicosídeos conjugados são, em sua maioria, não absorvidos no intestino

delgado, mas aqueles com porção de glicose podem ser sujeitos a desconjugação, catalisada

por uma hidrolase do epitélio intestinal, produzindo agliconas que são mais lipofílicas e, por

conseguinte, absorvida por difusão passiva (AURA, 2008; HOLST; WILLIAMSON, 2008).

No entanto, a maior parte dos compostos fenólicos não é eficientemente absorvida no

intestino delgado, e uma porção substancial passa para o cólon (GONZÁLEZ-BARRIO et al.,

2010). Uma vez no intestino grosso, estes componentes são sujeitos à degradação pela

microflora do cólon formando metabólitos incluindo fenólicos simples e ácidos aromáticos

(JENNER; RAFTER; HALLIWELL, 2005; AURA, 2008). Portanto, é razoável inferir que o

epitélio do cólon está em contato direto com os compostos fenólicos de origem e seus

produtos de degradação (JOHNSON, 2004).

Tanto a bioacessibilidade como a biodisponibilidade dos polifenóis dependem das

características dos compostos e da matriz alimentar em que estão inseridos e, ainda, de fatores

de variabilidade individual, como por exemplo, a acidez do estômago ou as concentrações e

atividades enzimáticas, o estado fisiológico, a dose de cada composto e a natureza dos outros

componentes da refeição. Em muitos casos, a biodisponibilidade e bioacessibilidade dos

polifenóis são regidas pelas propriedades físicas da fonte alimentar, que afetam a eficiência do

processo de digestão (PARADA; AGUILERA, 2007; BOUAYED et al., 2012). A baixíssima

biodisponibilidade de antocianinas pode ser atribuída, pelo menos parcialmente, à elevada

instabilidade destas moléculas nas condições alcalinas do intestino delgado. A partir de

estudos sobre a simulação da digestão gastrointestinal humana verificou-se que as

antocianinas, embora sejam estáveis nas condições ácidas do estômago, são menos estáveis ao

pH elevado do intestino delgado (MCDOUGALL et al., 2007; TAGLIAZUCCHI et al.,

2010). Essas mudanças estruturais podem afetar tanto a sua posterior absorção como a sua

bioatividade (BOUAYED et al., 2012). Além disso, mais efeitos indiretos da dieta em vários

parâmetros da fisiologia do intestino podem ter consequências sobre a absorção dos polifenóis

(pH, fermentações intestinais, excreção biliar, tempo de trânsito, etc.). As enzimas

39

transportadoras envolvidas na absorção e metabolismo dos polifenóis também podem ser

induzidas ou inibidas pela presença de alguns micronutrientes ou xenobióticos (MANACH et

al., 2004).

3. Chás

3.1 Chá Branco, Chá Preto e Chá Verde

Chás obtidos de Camellia sinensis é uma das bebidas mais antigas, foi descoberto

cerca de 2700 aC (HOFFMAN; MANNING, 2002; MAHMOOD; AKHTAR; ALI KHAN,

2010). Hoje está disponível para consumo em seis variedades principais (verde, preto, branco,

amarelo e vermelho), com base na técnica de oxidação e fermentação aplicada. Este chá tem

requisitos agro-climáticos específicos que só estão disponíveis nas regiões tropicais e

subtropicais (FAO, 2015).

A Camellia sinensis é consumida principalmente na forma de chá verde, preto e

branco. Esta planta é comumente cultivada em países com clima ameno e úmido, no entanto,

a planta de melhor qualidade é a proveniente da China. A planta Camellia sinensis é um

arbusto que pode atingir até 15 metros, com folhas simples, lanceoladas, coriáceas de 4 a 7

centímetros de comprimento, possui flores brancas, solitárias ou em grupos de duas ou três

nas axilas foliares (Figura 3.1). Os frutos são cápsulas deiscentes e oblongas possuindo uma

ou três sementes (LORENZI; MATOS, 2002).

Figura 3.1 Planta Camellia sinensis. (Fonte: http://www.lideragronomia.com.br)

40

O diferente processamento da Camellia sinensis leva aos diversos tipos de chás

produzidos a partir da planta e aos diferentes constituintes flavonoides dos mesmos. Para

produção do chá verde a planta é tratada termicamente (vapor), para inativar a polifenol

oxidase endógena (PPO), e então é laminada e seca. Em contrapartida, na produção do chá

preto, não há calor para a inativação de PPO, a planta sofre uma fermentação ou “fase de

oxidação” após a laminação. Esse processo permite a conversão em grande escala, catalisada

pela PPO, de compostos fenólicos simples para formas mais complexas, formando teaflavinas

e tearubiginas que tem coloração escura e típica do chá preto (HILAL; ENGELHARDT,

2007; MIZUKAMI; SAWAI; YAMAGUCHI, 2007; WANG; HO, 2009). Em contraste com o

chá verde e preto, o chá branco só é produzido a partir dos brotos jovens de folhas, cobertas

por pequenos filamentos prateados, colhidos apenas na primavera. O broto pode ser protegido

da luz solar durante seu crescimento para reduzir a formação de clorofila, dando às plantas

jovens uma aparência branca e conservando ainda mais as catequinas (ALCÁZAR et al.,

2007). Os brotos são cozidos no vapor e secos, este processo deve ser realizado logo após a

colheita para evitar a oxidação (RUSAK et al., 2008). Como resultado, os chás branco, verde

e preto diferem em suas propriedades sensoriais e têm composições químicas muito diferentes

(RIO et al., 2004; HILAL; ENGELHARDT, 2007; MIZUKAMI; SAWAI; YAMAGUCHI,

2007; WANG; HO, 2009).

Pesquisas realizadas com chás demonstram que a Camelia Sinesensis possui amplos

benefícios fisiológicos e farmacológicos. As principais classes de compostos fenólicos

encontrados nestes chás são os ácidos fenólicos e os flavonoides. Sendo os representantes dos

ácidos fenólicos, os ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos, e dos flavonoides, os

flavanóis (catequinas), flavonóis (quercetinas e kaempferol), proantocianidinas e flavonas

(RUSAK et al., 2008). Além dos compostos fenólicos, os chás podem apresentar

metilxantinas em sua composição. Por exemplo, C. sinensis é rica nos teores de cafeína,

teobromina e teofilina que apresentam em sua estrutura um esqueleto de purina, com

diferenciação entre o tipo e posição dos radicais na molécula (MARIA; MOREIRA, 2007;

RUSAK et al., 2008).

Estudos epidemiológicos relacionam o consumo de chás desta planta com resultados

favoráveis em relação a doenças cardiovasculares, inflamações, obesidade e diabetes tipo 2

(GONDOIN et al., 2010). Um número crescente de evidências pré-clínicas sugere que a

epigalocatequina galato (EGCG), a principal catequina encontrada nos chás, tem impacto

potencial em uma variedade de doenças humanas (SINGH; SHANKAR; SRIVASTAVA,

2011), ação antitumoral e antiangiogênica, possui funções antioxidantes (evitando danos

41

oxidativos em células saudáveis) e modulação da resposta de células tumorais à

quimioterapia. Estas propriedades quimiopreventivas, mediadas pela EGCG, induz a apoptose

e promove a interrupção do crescimento celular por meio da alteração da expressão de

proteínas reguladoras do ciclo celular e suprimindo fatores de transcrição oncogênicas

(SINGH; SHANKAR; SRIVASTAVA, 2011).

Aproximadamente 21% da produção total de chá é consumida como chá verde. O chá

verde possui sabor agradável, aroma floral e coloração verde clara com um tom verde oliva.

Contém grandes quantidades de catequinas (epigalocatequina, epigalocatequinagalato,

epicatequinagalato e epicatequina) como também contém cafeína, teanina e vitaminas

(TAKEO, 1992; NAGALAKSHMI, 2003; MACEDO et al., 2011). As catequinas são

reconhecidas por suas atividades antioxidantes, antimutagênica e anticarcinogênica, além dos

seus benefícios na obesidade e doenças cardiovasculares como já foi citado anteriormente.

Estudos com catequinas do chá verde relataram efeito hipocolesterolêmico e supressão da

absorção intestinal de colesterol (MURAMATSU; FUKUYO; HARA, 1986; IKEDA et al.,

1992). Além disso, a EGCG teve um efeito inibidor sobre a acetil-CoA carboxilase in vitro¸

enzima que é essencial para a biossíntese de ácidos graxos, e efeitos antiobesidade em doses

elevadas em ratos (WATANABE; KAWABATA; NIKI, 1998; KAO; HIIPAKKA; LIAO,

2000). A fim de confirmar os efeitos desta catequina (EGCG) do chá verde na inibição da

adipogênese e indução da apoptose em adipócitos, Lin; Della-Fera e Baile (2005) incubaram

pré-adipócitos e adipócitos maduros por diferentes tempos e em diferentes concentrações de

EGCG. Os resultados deste estudo mostraram que esta catequina inibiu a adipogênese e

causou apoptose em células adiposas maduras. Estudos em humanos também sugerem que o

chá verde pode contribuir para promover benefícios à saúde, tais como efeito hipoglicemiante,

controle do peso corporal ao reduzir o apetite e aumentar o catabolismo de gorduras (CHOO,

2003; KOO; NOH, 2007).

Em relação à composição do chá branco, as concentrações de EGCG e também de

metilxantinas (tais como cafeína) são maiores em comparação com o chá verde ou preto

(HILAL; ENGELHARDT, 2007). Dentre os estudos utilizando chá branco é interessante

relatar que este apresentou ação antimutagênica e antitumoral significativamente maior que o

chá verde (SANTANA-RIOS et al., 2001). Dashwood, Orner e Dashwood (2002) destacaram

que EGCG age na inibição da atividade do receptor catenina/TCF4 em células HEK293

devido à diminuição da expressão da catenina. Sugerindo a possibilidade de intervenção do

chá contra os estágios iniciais do câncer colorretal humano, envolvendo a via catenina/APC e

a alteração do gene alvo Wnt. O chá branco diminuiu a formação de tumores intestinais

42

também pela regulação negativa da β-catenina (DASHWOOD; ORNER; DASHWOOD,

2002; ORNER, 2003). Adicionalmente, abordando a ação antioxidante salienta-se que chá

branco gelado (comercial) apresentou boa capacidade antioxidante, com melhores valores em

relação à sucos de laranja e maçã e a outros chás gelados, como o chá verde e preto

(SEERAM et al., 2008).

Quando testado o poder do chá branco frente à adipogênese em culturas de adipócitos

e pré-adipócitos humanos, verificou-se que o chá branco foi capaz de diminuir a incorporação

de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, sem afetar a viabilidade da

célula (SÖHLE et al., 2009). Estes pesquisadores constataram que o chá branco diminuiu a

expressão mRNA de fatores relacionados à adipogênese e aumentou a atividade lipolítica dos

adipócitos.

Ao contrário do chá verde, cujos maiores compostos incluem catequinas EGCG, EGC,

ECG e EC, no chá preto, as catequinas monoméricas sofrem oxidação de polimerização,

levando a sua dimerização, para formar teaflavinas, tearubiginas e outros oligômeros.

Flavonóis (quercetina, kaempferol e miricetina) estão presentes na forma dos seus O-

glicosideos. Pelo menos 14 diferentes glicosídeos foram detectados no chá (SCHARBERT;

HOLZMANN; HOFMANN, 2004; JIANG et al., 2015). Há mono, di e tri glicosideos

presentes no chá preto, quando frequentemente a quercetina-3-ramnoglucosídeo está na

concentração mais elevada. Scharbert; Holzmann e Hofmann (2004) afirmam que os

flavonóis são responsáveis pela adstringência no chá preto e não teaflavina ou catequinas e

que o conteúdo destes compostos não é muito afetado pela fermentação da produção do chá.

3.2 Chá Mate

Ilex paraguariensis, conhecido popularmente como erva mate (Figura 3.2), é uma

planta sul-americana bastante cultivada no nordeste da Argentina, sul do Brasil e leste do

Paraguai (FILIP et al., 2001). Das folhas da erva-mate prepara-se uma bebida muito apreciada

pelo sabor amargo característico e propriedades estimulantes, conhecida por chimarrão ou

tererê (preparada com água quente ou fria, respectivamente), outra bebida que pode ser

preparada é o chá mate, obtido a partir do mate torrado. O chimarrão é uma bebida consumida

há centenas de anos pelos indígenas, antes mesmo da chegada dos europeus na América do

Sul. Alternativamente, seguindo o hábito de alguns apreciadores de erva-mate, o chá mate

surgiu no mercado brasileiro, em 1938, um produto suave e de aroma agradável obtido a partir

da “queima” da erva-mate verde. Foi introduzida, assim, uma opção revolucionária para o uso

43

de erva-mate enquanto chimarrão no Brasil. Desde então, o chá mate, como passou a ser

conhecido, foi incorporado à cultura nacional e desde então é a forma principalmente

consumida deste vegetal. Em outras regiões brasileiras, particularmente naquelas de clima

quente, é crescente o consumo de chá mate, na forma de bebida refrescante pronta para beber

(DIAS, 2006; MEINHART et al., 2010).

Figura 3.2 Planta Ilex paraguariensis. (Fonte: http://www.jardimdeflores.com.br/ e http://ervateiraseleme.com.br/a-erva-mate/)

As bebidas de erva-mate são reconhecidas por suas propriedades estimulantes, devido

à presença das xantinas, cafeína e teobromina (BASTOS et al., 2007; HECK; MEJIA, 2007).

Outros constituintes de importância da Ilex paraguariensis são as saponinas, que

demonstraram efeito hipocolesterolemiante (STEIN, 2005), alguns ácidos fenólicos (ácidos

clorogênico, caféico e gálico) e flavonoides como quercetina, rutina, luteolina e kaempferol

(BASTOS et al., 2005, 2006), entretanto existem estudos que afirmam que a rutina é perdida

após o processo de torrefação da erva-mate (BASTOS et al., 2007). Vale salientar também

que a erva mate possui aminoácidos, minerais (fósforo, ferro e cálcio), e vitaminas (C, B1, e

B2) (POMILIO; TRAJTEMBERG; VITALE, 2002; JACQUES et al., 2007; MIRANDA et

al., 2008). Diante de tantos compostos bioativos, o consumo das bebidas a partir da erva mate

44

podem ser benéficas à saúde, visto sua comprovada atividade antioxidante e outros efeitos

terapêuticos como: antiinflamatório, antiobesidade, anti-hipertensivo, colerético, eupéptico,

hepatoprotetor (BASTOS; TORRES, 2003; BRAVO; GOYA; LECUMBERRI, 2007;

GUGLIUCCI; BASTOS, 2009).

Vários estudos corroboram estes benefícios, como na avaliação do efeito protetor da

erva-mate contra danos oxidativos ao DNA, que indicaram intervenção significativa após 60

dias de consumo de chá mate, quando comparados aos níveis observados anteriormente à

ingestão da bebida. O mecanismo de ação proposto relaciona-se com elevados níveis dos

ácidos cafeico e clorogênico presentes na erva-mate (BASTOS et al., 2006). Silva et al.

(2009) mostraram que o consumo de mate por ratos pode diminuir os níveis de danos ao DNA

em leucócitos e a carcinogênese esofágica induzida por lesão térmica e dietilnitrosamina.

Carini et al. (1998) e Silva et al. (2008) demonstraram que os compostos fenólicos presentes

no extrato aquoso de Ilex paraguariensis atuam como antioxidantes não só, isoladamente,

mas também de forma sinérgica. Mosimann; Wilhelm-Filho e Silva (2006) verificaram que

coelhos hipercolesterolêmicos tratados com extrato aquoso de erva mate não tiveram alteração

nos níveis de lipídeos no soro, porém ocorreu redução das lesões ateroscleróticas e

diminuição da quantidade de colesterol, ambos na aorta. Estes autores sugeriram a existência

de outros mecanismos de atuação do extrato de Ilex paraguariensis como alteração da

agregação plaquetária, inibição da expressão de moléculas de adesão ou indução de produção

de óxido nítrico. Entretanto a suplementação com extrato de erva mate e dieta

hipercolesterolêmica em ratos diminuiu o ganho de peso dos animais, a concentração

plasmática de LDL e a gordura acumulada em tecidos viscerais.

Pode-se constatar que as informações sobre o chá mate são pequenas quando

comparada às das bebidas que utilizam erva mate verde e principalmente quando comparado

às informações dos chás verde ou preto. Sendo incipientes estes estudos e levando em

consideração que há estudos que comprovam que o chá mate tem um poder antioxidante tão

ou mais elevado do que os extratos de erva mate verde (BASTOS et al., 2007). São

promissoras as pesquisas que tenham como perspectivas a utilização do chá mate a fim de

comprovar essas teorias existentes e melhorar seu conteúdo bioativo, possibilitando a

elaboração de extratos coadjuvantes da manutenção da saúde humana.

3.3 Chás e a obesidade

45

A obesidade e o sobrepeso são definidos como acúmulo excessivo ou anormal de

gordura que apresenta um risco para a saúde. A obesidade é uma doença multifatorial que

envolve fatores genéticos, endócrinos e comportamentais. Dentre os comportamentais

destacam-se a ingestão excessiva de dietas ricas em gorduras e açúcares e o baixo nível de

atividade física (OPAS, 2003). O aumento da ingestão energética pode ser decorrente tanto da

elevação quantitativa do consumo de alimentos como de mudanças na dieta que se

caracterizam pela ingestão de alimentos com maior densidade energética, ou pela combinação

dos dois.

Os mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento da obesidade são

complexos e ainda contraditórios, no entanto já está bem estabelecido que esta condição está

associada a uma inflamação crônica na qual o tecido adiposo desempenha papel importante.

Consequentemente, sabe-se que este tecido não é apenas um fornecedor e armazenador de

energia, mas também um órgão dinâmico e endócrino exercendo importantes funções no

metabolismo e na regulação homeostásica (KERSHAW; FLIER, 2004; AILHAUD, 2006;

ŁAGOWSKA; JESZKA, 2011; MOTIE et al., 2014).

Os adipócitos produzem a maior parte das citocinas envolvidas no processo

inflamatório, tais como as adipocinas pró-inflamatórias interleucina 6 (IL-6), inibidor do

ativador de plasminogênio (PAI-1), angiotensina e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e

ainda, a citocina anti-inflamatória, adiponectina. A produção dessas moléculas

biologicamente ativas encontra-se em desregulação durante a obesidade, levando ao

estabelecimento de um perfil inflamatório, caracterizado pelo aumento do infiltrado de

macrófagos nesse tecido, aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias, e baixos níveis

de anti-inflamatórias (MONTAGUE et al., 1998; NTAMBI; KIM, 2000; ENGSTROM et al.,

2003).

O consumo energético excessivo leva a um aumento da síntese de triglicerídeos (TGs)

nos adipócitos e com isso ocorre uma expansão do tecido adiposo em tamanho (hipertrofia) e,

em algumas situações, em número (hiperplasia) dos adipócitos, gerando uma disfunção

nestes. A hipertrofia dos adipócitos maduros ocorre em resposta às suas ações metabólicas

típicas, que são a lipogênese e a lipólise. Já a hiperplasia do tecido adiposo, por sua vez,

depende da diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos maduros, processo denominado

adipogênese que caracteriza o ciclo de vida dos adipócitos (HAUSMAN et al., 2001;

DEFRONZO, 2004; AVRAM; AVRAM; JAMES, 2007; RAYALAM; DELLA-FERA;

BAILE, 2008; RODEHEFFER; BIRSOY; FRIEDMAN, 2008). O ciclo inclui proliferação de

pré-adipócitos, a diferenciação de células de gordura (adipogênese), atividade lipolítica, bem

46

como a apoptose de pré-adipócitos ou adipócitos maduros. A seqüência complexa de

diferenciação de pré-adipócitos é inicialmente desencadeada por transcrição ativada por fator

de vias de sinalização que desempenham um papel fundamental na cascata transcricional

(GREGOIRE, 2001). A cascata que leva à adipogênese inicia-se com a expressão de dois

fatores de transcrição adipogênicos fundamentais, os quais estimulam a cascata e, logo, a

diferenciação: o receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomas (PPARγ) e as

proteínas ligantes ao amplificador CCAAT (C/EBPs). Estes fatores são responsáveis por

promover uma cadeia de crescimento sucedida então por uma diferenciação terminal dos

adipocitos. Ainda que estes sejam os principais fatores de regulação da adipogênese, outros

fatores transcricionais influenciam no processo, como a proteína 1C ligadora do elemento

regulado por esteróis (SREBP-1c), além de proteínas secretadas por células amadurecidas

como parte da sua função endócrina (HAN et al., 2003).

O estado inflamatório da obesidade é acompanhado de um aumento do estresse

oxidativo (FURUKAWA et al., 2004). O processo inflamatório crônico juntamente com o

estresse oxidativo predispõe o organismo ao aumento de problemas cardiovasculares e a

diversas alterações metabólicas, como a síndrome metabólica, que inclui a dislipidemia

(elevação dos triglicerídes, HDL baixo, hiperlipidemia), hipertensão arterial sistêmica,

acúmulo excessivo de gordura visceral e a resistência insulínica. Fatores estes que aumentam

o risco para complicações na obesidade, como derrames, doença coronariana, apneia do sono,

aterosclerose, acúmulo ectópico de gordura, esteatose hepática e a diabetes mellitus tipo 2

(ENGSTROM et al., 2003; RASOULI; KERN, 2008; MOTIE et al., 2014).

Admitir o alto risco da obesidade e estando o aumento do estresse oxidativo

relacionado à obesidade e nas doenças resultantes dessa condição, a busca por intervenções

nutricionais com ação antioxidante e que promovam a diminuição da absorção de lipídeos, se

torna de grande interesse. Várias estratégias podem ser utilizadas visando à redução de peso

corporal, como a inclusão de chás de Camellia sinesis e Ilex paraguariensis. Compostos

fenólicos dos chás verde, branco, preto e mate, têm sido sugeridos como antiobesidade e

antidiabéticos (SOOD; BAKER; COLEMAN, 2008; ONAKPOYA et al., 2011; KANG et al.,

2012; KIM; HOON, 2014; XIE et al., 2014; ONAKPOYA; SULLIVAN; HENEGHAN,

2015; LI et al., 2016; YONEKURA et al., 2016; LUNCEFORD; GUGLIUCCI, 2005; KAO et

al., 2006; MIRANDA et al., 2008; ARÇARI et al., 2009; MARTINS et al., 2009; KANG et

al., 2012). Algumas pesquisas comprovaram estes efeitos biológicos positivos a partir dos

compostos fenólicos presentes em chás verde, branco, preto e mate (Tabela 3.1).

47

Tabela 3.1 Atividades antiobesidade relacionadas aos polifenóis de Camellia sinensis (chá branco, chá verde e chá preto) e Ilex paraguariensis (erva mate e chá mate). Amostra Atividade biológica Referência

Chá Branco Inibe adipogênese e estimula atividade lipolítica dos adipócitos Söhle et al. (2009)

Chá branco Redução do estresse oxidativo associada à obesidade e melhora

da hipertrigliceridemia.

Teixeira et al. (2012)

Chá Verde Menor ingestão energética, diminuição dos triglicerídeos hepático

e do colesterol e glicose plasmáticos e diminuição de enzimas

relacionadas ao metabolismo de lipídeos.

Murase et al. (2002)

Chá Verde Inibe adipogênese e induz a apoptose em pré adipócitos (3T3 L1) Lin; Della-Fera e Baile

(2005)

Chá Preto Reduziu o colesterol total e LDL colesterol, além de reduzir o

peso em humanos.

Fujita e Yamagami

(2008)

Chá Preto Prevenir a obesidade induzida por dieta por inibir a absorção de

lipídeos intestinal

Uchiyama et al. (2011)

Chá Preto Supressão da formação e acumulação de gordura agindo na

prevenção da obesidade.

Wu et al. (2016)

Erva Mate Reduziu lesão aterosclerótica Mosimann; Wilhelm-

Filho e da Silva (2006)

Erva Mate Redução significativa no peso corporal, glicemia, resistência à

insulina, concentração de colesterol e triacilglicerol.

Arçari et al. (2009)

Chá Mate Resultou na diminuição da peroxidação lipídica do plasma e no

aumento da expressão gênica de enzimas antioxidantes, indicando

que seu consumo regular melhora a defesa oxidativa por múltiplos

mecanismos.

Matsumoto et al. (2009)

4. Tanase

Tanino acil hidrolase (E.C.: 3.1.1.20), comumente referida como tanase, é uma enzima

descoberta acidentalmente em 1867 em uma experiência de formação de ácido gálico em uma

solução aquosa de taninos (AGUILAR et al., 2007). Esta enzima cliva ligações ésteres e

depsídicas, em taninos hidrolisáveis (AGUILAR; GUTIERRES-SANCHEZ, 2001),

produzindo glicose e ácido gálico (BELMARES et al., 2004), e também realiza a síntese de

ésteres de ácido gálico. O equilíbrio desta reação depende do solvente empregado no meio

reacional. Usando solventes polares (água, tampão), a enzima realiza a hidrólise, empregando

solventes orgânicos (hexano, benzeno) o equilíbrio reacional é no sentido da síntese.

48

A decomposição de taninos hidrolisáveis é mediada pela atividade esterásica sobre a

ligação éster entre o grupo anel aromático e o resíduo de glicose e pela atividade depsidásica

sobre a ligação éster entre os anéis aromáticos (Figura 4.1), sendo que foi identificado que a

tanase é responsável pelas duas atividades (HASLAM; STANGROOM, 1966). Estes autores

também relataram em seu trabalho que a proporção entre duas frações podia variar de acordo

com as condições de cultivo. Estudo utilizando colunas de afinidade fracionou duas isoformas

de tanase fúngica (BEVERINI; METCHE, 1990). Ambas apresentaram as duas atividades,

contudo a Tanase I possui maior característica esterásica, enquanto na Tanase II a atividade

depsídica é mais pronunciada.

Inicialmente, a Tanase rompe as ligações depsídicas da molécula de ácido tânico

liberando, 1,2,3,4,6-pentagaloilglicose e quatro moléculas de ácido gálico. Em seguida, os

demais resíduos galoil, ligados ao núcleo glicosídico, são seqüencialmente removidos até a

liberação da molécula de glicose e de outras cinco moléculas de ácido gálico (LEKHA;

LONSANE, 1997; PINTO et al., 2005).

Figure 4.1 Atividade esterásica e depsidase da tanase (PINTO et al., 2005).

Tanases são enzimas extracelulares produzidas por fungos, leveduras e bactérias, na

presença de ácido tânico (AGUILAR et al., 2007), e é uma glicoproteína formada por um

mistura de esterase e depsidade. O conteúdo de carboidratos pode variar de 25,4 a 66,2% do

peso total da enzima, e o papel exato desses elevados conteúdos de carboidratos não é

conhecido. Suspeita-se que seja a maneira de proteger o núcleo protéico da ação desnaturante

dos taninos hidrolisáveis e de direcionar o substrato ao centro ativo da enzima para

possibilitar a quebra desse em seus respectivos componentes, glicose e ácido gálico

(AGUILAR; GUTIERRES-SANCHEZ, 2001). A tanase apresenta pH de estabilidade na faixa

de 4,0 – 7,5, com pH ótimo de atividade a 6,5, temperatura de estabilidade entre 20ºC e 70ºC,

e atividade ótima a 70ºC. Sua atividade é inibida por íons metálicos Ba2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+ e

49

Ag2+, tiossulfato, carbonato, bissulfito de sódio, EDTA, 2- mercaptoetanol, ácido 4-

aminobenzóico, azida sódica, n-bromo succinato, cisteína, tween 80 e tween 20

(BATTESTIN; PINTO; MACEDO, 2007).

A enzima em questão tem sido caracterizada principalmente pelo estudo de suas

atividades em complexos fenólicos (BATTESTIN; PINTO; MACEDO, 2007). É usada

industrialmente na produção de ácido gálico, cujo éster é utilizado como agente conservante,

na indústria de ração animal, no tratamento de efluentes de curtumes, na produção de chás,

vinhos, processamento da cerveja e clarificação de sucos (LEKHA; LONSANE, 1997). Nosso

grupo de pesquisa desenvolveu estudos relacionados à quimio seletividade da tanase livre de

Paecilomyces variotii frente aos substratos epicatequinagalato, epigalocatequinagalato,

galotanino e elagitanino, como também, quanto ao efeito benéfico da hidrólise enzimática de

chá verde frente às melhorias do potencial nutracêutico do extrato.

Tanase de P. variotii tem sido purificada, caracterizada bioquimicamente, imobilizada

e, sua capacidade de reutilização estudada (BATTESTIN; MACEDO, 2007a; BATTESTIN;

PINTO; MACEDO, 2007; SCHONS, 2012). Uma vez que as enzimas são extraídas e

eventualmente purificadas, podem ser aplicadas várias estratégias de imobilização para

reutilizar em preparações enzimáticas. Agarose, quitosana, alginato e diferentes derivados de

silício podem ser utilizados para imobilização (BELMARES et al., 2004).

4.1 Imobilização de enzimas

Imobilização é um termo genérico empregado para descrever a retenção de uma

biomolécula em um sistema analítico (CARDOSO, 2009). Mais especificamente, a

imobilização enzimática mantém o biocatalisador fisicamente confinado ou localizado numa

certa região do espaço com retenção de sua atividade catalítica, podendo ser usado repetida e

continuamente (GROSOVÁ; ROSENBERG; REBROŠ, 2008). A ideia de utilização de

enzimas imobilizadas apareceu no século XX como uma alternativa interessante para superar

inconvenientes dos biorreatores clássicos (CHIBATA, 1978). O objetivo era garantir a

localização de catalisador biológico em uma área de espaço definido, a preservação da sua

atividade e reutilização.

Entre diversos benefícios possíveis, essa retenção permite a facilitada separação das

biomoléculas de interesse do meio reacional, solucionando uma das principais dificuldades

em usá-las de modo livre. Quando a enzima está em solução seu comportamento é igual ao de

qualquer soluto em que há uma dispersão na solução e os movimentos são livres, porém

50

quando imobilizadas estes movimentos são restritos (GIORNO; DRIOLI, 2000). O emprego

de enzima livre acarreta a inevitável presença do biocatalisador como parte integrante do meio

(se não houver uma etapa de separação da enzima) o que em muitos casos pode gerar

alteração de flavor e ainda a necessidade de uma nova batelada de biocatalisador

(SANGEETHA; RAMESH; PRAPULLA, 2005). Traços de enzima no produto final, em

alimentos ou medicamentos, podem ainda, ser um fator de risco, ao desencadear reações

alérgicas em seus usuários finais. Outro fator relevante para a utilização de enzimas

imobilizadas é que se estabelece um maior controle sobre o processo, pois se torna possível

parar a reação quando necessário alterando algum parâmetro de reação ou fechando-se a

vazão do biorreator.

Uma das razões para a grande expansão da tecnologia da imobilização está ligada ao

material de suporte, que pode agir sobre a estabilidade e a eficiência da enzima imobilizada. É

necessário que a enzima, quando imobilizada, mantenha máxima atividade catalítica, uma vez

que a ligação com o suporte pode ocasionar o comprometimento do sítio ativo por ligação

intra-sítio ou deformação deste, promovendo conformações não ativas. Através destes estudos

envolvendo imobilização, tem-se proporcionado melhor entendimento sobre as vantagens da

sua utilização, como exemplo o aumento da atividade da proteína, a capacidade destas de

aumentar a taxa de reação, controle e manipulação da seletividade, e reações multi-

enzimáticas, o que tem impulsionado ainda mais o desenvolvimento e aplicação de enzimas

imobilizadas em processos industriais (BRADY; JORDAAN, 2009).

Cada enzima é única em suas características e isto influencia na escolha do

procedimento de imobilização. Entretanto, a obtenção de um biocatalizador imobilizado com

estabilidade operacional é governado pela interação das propriedades da enzima e do material

usado como suporte para imobilização, assim como depende da estabilidade do suporte e do

tipo de amostra onde o substrato está contido, a qual pode conter diferentes ativadores e/ou

inibidores. Como não existe um método ideal ou procedimento geral para a imobilização do

componente biológico, a diversidade de métodos existentes permite a escolha de um que

promova uma melhor imobilização e menor perda da atividade enzimática (MATEO et al.,

2000).

Segundo Sheldon e Pelt (2013) os métodos para a imobilização são divididos em três

categorias: ligação a um suporte, encapsulamento e reticulação. Estas são combinações de

métodos químicos que envolvem a formação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os

resíduos terminais de uma enzima e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais

moléculas de enzima; métodos físicos que envolvem as forças físicas como adsorção,

51

interações eletrostáticas; métodos de encapsulação ou microencapsulação em matrizes

poliméricas (FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ; SANROMÁN; MOLDES, 2013). A Figura 4.2

apresenta esquematicamente a classificação dos métodos utilizados para imobilização das

enzimas.

Figura 4.2 Principais métodos de imobilização de enzimas. CLEA: cross-linked enzyme agregates. CLEC: cross-linked enzyme agregates. Adaptado de Nisha e Gobi (2012).

Assim como outras enzimas, a tanase na forma imobilizada, para aplicações

industriais, pode apresentar diversas vantagens, incluindo a melhoria da estabilidade da

enzima, o uso repetido da mesma, a facilidade de separação do produto e a possível operação

contínua em reatores de leito empacotado. Dentre os inúmeros métodos de imobilização o

encapsulamento em alginato tem se mostrado um método altamente adequado, pois este

polissacarídeo é um material biocompatível e biodegradável, sua encapsulação é uma técnica

simples, não tóxica e barata. O hidrogel das cápsulas de alginato tem sido proposto para

controlar a liberação de pequenas e macromoléculas, como enzimas (SUKSAMRAN et al.,

2009), além de ser uma técnica reprodutível que utiliza condições suaves durante o processo

52

de imobilização (HULST; TRAMPER, 1989; OGBONNA; AMANO; NAKAMURA, 1989) e

ter mostrado os melhores resultados dentre inúmeras técnicas de imobilização testadas

(SCHONS, 2012). Schons et al. (2011) imobilizaram tanase semipurificada produzida por

Paecilomyces variotii em cápsulas de alginato de sódio, utilizando o suporte para hidrólise de

ácido tânico. A eficiência da enzima imobilizada foi igual a da enzima livre em 3 rodadas de

utilização sucessiva para hidrólise de ácido tânico. Schons (2012) observou que as cápsulas

apresentaram maior estabilidade quanto ao pH, temperatura e inibidores, comparando com a

tanase livre.

Os alginatos comerciais podem ser extraídos de diversos tipos de algas, principalmente

de três espécies de algas marrons, Laminaria hyperborean, Ascophyllum nodosum e

Macrocystis pyrifera, nas quais o alginato compreende até 40% do seu peso seco. As algas da

espécie Macrocystis pyrifera são tidas como as principais produtoras desse polímero natural.

Além disso, o alginato pode ser produzido como um polímero exocelular por bactérias como

Azotobacter vinelandii e várias espécies de Pseudomonas através de fermentação em batelada

com frutose e glicose como fonte de carbono (SMIDSRØD; SKJÅK-BRAEK, 1990; CONTI

et al., 1994; REMMINGHORST; REHM, 2006). A obtenção do alginato envolve lavagem e

maceração das algas, seguido pela extração do alginato utilizando solução de carbonato de

sódio ou hidróxido de sódio. O extrato é filtrado e o alginato é isolado por precipitação

através da adição de cloreto de cálcio ou cloreto de sódio ao filtrado (HAUG et al., 1963;

RINAUDO, 2006). Os alginatos são talvez o componente mais estudado e utilizado para

encapsulação. Este composto é uma mistura complexa de dois tipos de ácidos, o ácido β-D-

manurônico e o ácido α-L-gulurônico. Os ácidos β-D-manurônico e α-L-gulurônico são

estereoquimicamente diferentes devido a uma diferença no C-5 (QIN, 2008).

O alginato é constituído por três tipos de blocos. Os blocos MM, contendo unidades de

ácido manurônico, com conformação linear e flexível; os blocos GG, com unidade de ácido

gulurônico, gerando um polímero denso e rígido, e os blocos GM, com unidades alternadas de

ácido gulurônico e manurônico formando estruturas de flexibilidade intermediária. Os

monômeros se dispõem de forma que seja estabelecida uma estrutura energeticamente

favorável. Para GG, é a conformação cadeia 1C4 ligada por ligação glicosídica α (1-4); para

M-M é a conformação em cadeia 4C1 por ligação glicosídica β (1-4). O grupo carboxílico é

responsável pela ligação glicosídica equatorial/equatorial no M-M, a ligação glicosídica

axial/axial em G-G e a ligação equatorial/axial em M-G (GACESA, 1988; NUSSINOVITCH,

1997). As geometrias de M, G e blocos alternados dependem de formas particulares de

monômeros e seu modo de ligação no polímero. A Figura 4.3 apresenta uma representação

53

esquemática da estrutura estereoquímica dos blocos GG, MM e GM. As propriedades físicas e

químicas do alginato dependem das proporções dos ácidos gulurônico e manurônico em sua

cadeia, as proporções relativas dos três tipos de blocos, a distribuição desses blocos, o

comprimento da cadeia e as configurações espaciais que os blocos M e G adotam, bem como

seus diferentes pesos moleculares. Esses fatores por sua vez dependem da espécie e da idade

da alga, do local e época do ano a partir da qual o alginato foi isolado (DRURY; DENNIS;

MOONEY, 2004; AVELLA et al., 2007) e todos estes fatores determinarão a flexibilidade da

cadeia, influenciando na solubilidade e na estabilidade do gel que será formado.

Figura 4.3 Estrutura dos blocos homopoliméricos GG e MM e dos blocos heteropoliméricos GM, que constituem a molécula de alginato (QIN, 2008).

O alginato é insolúvel em água à temperatura ambiente, não sendo simples o preparo

de sua solução para formação do gel. Ele deve ser disperso em água, sob alta taxa de

cisalhamento (agitação) ou com aquecimento (NUSSINOVITCH, 1997). Soluções aquosas de

alginato apresentam diminuição de viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento,

54

podendo ser classificadas como fluido não newtoniano. O alginato pode ser preparado em

uma larga variedade de massas moleculares, variando entre 50 a 100.000 kDa (AUGST;

KONG; MOONEY, 2006). A viscosidade da solução de alginato diminui com o aumento de

temperatura. Com relação ao pH, em pH abaixo de 5 os grupos -COO- começam a ser

protonados, diminuindo a repulsão eletrostática entre eles, o que permite a formação de pontes

de hidrogênio, aumento de viscosidade e, consequentemente, possibilita a formação de gel

(QIN, 2008).

O alginato forma géis em temperatura ambiente, estáveis ao calor, através de reação

com cátions divalentes. Para uso alimentício, o cálcio é o íon mais apropriado por não ser

tóxico. Smidsrød e Draget (1997) relataram que a alta seletividade de alginatos com íons

divalentes, como metais alcalinos terrosos (Mg<<Ca<Sr<Ba), indica que as interações entre

alginatos e esses íons não são puramente eletrostáticas, mas ocorre também através de

complexação nos blocos G. A gelificação ocorre através da ligação iônica de íons cálcio com

dois grupos carboxila presentes em resíduos adjacentes. A ligação química ocorre nos

resíduos de ácido poligulurônico, que devem estar presentes em certa proporção e devem

ocorrer em série. A formação de géis de alginato pela adição de íons cálcio envolve os blocos

GG também devido sua estrutura em zig-zag, que apresenta cavidade e que são importantes na

ligação de íons, formação e resistência mecânica do gel. Quando as cadeias de blocos G se

alinham lado a lado formando um “berço” em forma de diamante, o qual tem a dimensão ideal

para acomodar em seu interior um íon cálcio gerando uma estrutura dimérica. Portanto,

quanto maior for o conteúdo de blocos GG em sua cadeia, maior será a rigidez e resistência

deste gel (ØSTGAARD et al., 1993; SMIDSRØD; DRAGET, 1997; QIN, 2008; RINAUDO,

2008; VOS et al., 2014). Essa estrutura, em que os íons localizam-se nos interstícios entre as

cadeias de alginato, interagindo com o ânion carboxilato e com os grupos hidroxila, é

chamada de egg-box, apresentado na Figura 4.4, neste modelo os íons Ca+2 representam os

ovos, dispostos nos espaços que existem entre os blocos G emparelhados, que fazem o papel

da caixa. De acordo com este modelo podemos verificar a importância das unidades G na

gelificação do alginato. O alginato contendo uma maior fração de blocos GG possui uma

habilidade maior de formar géis mais resistentes, enquanto que o alginato rico em blocos MM

formarão géis mais frágeis (Figura 4.5) (GRANT et al., 1973; BRACCINI; PÉREZ, 2001).

55

Figura 4.4 Formação da estrutura “eggbox” a partir da interação iônica dos blocos G com cátions de cálcio. Adaptado de Braccini e Pérez (2001) e Avella et al. (2007).

Segundo Peniche et al. (2004), a reticulação do alginato com íons cálcio é estabelecida

pelas unidades gulurônicas, sendo que a força e a porosidade das partículas formadas

dependem da origem e da massa molar do polímero, da concentração do cloreto de cálcio e da

dispersão do alginato (PENICHE et al., 2004). Dependendo da quantidade de cálcio presente

no sistema, a associação inter cadeias pode ser temporária ou permanente, ou seja, níveis

reduzidos de cálcio induzem ao aumento da viscosidade e uma associação temporária, já em

níveis altos de cálcio resulta em precipitação, favorecendo uma associação permanente

(GEORGE; ABRAHAM, 2006).

Em valores de pH baixos, alginatos de alta massa molecular protonados podem formar

géis ácidos fracos. Nestes géis, a maior parte são cadeias homopoliméricas as quais formam

junções, mas a estabilidade depende do conteúdo de cadeias G. Géis com grande quantidade

de unidades G exibem alta porosidade, baixo encolhimento durante a formação do gel e menor

inchamento após secagem, no entanto, têm maior propensão em apresentar sinerese. Com o

aumento da quantidade de unidades M, os géis tornam-se mais macios, fracos, elásticos e

apresentam poros de menor tamanho (GACESA, 1992). Os blocos (MG)n formam cadeias

mais flexíveis e são mais solúveis em pH ácidos.

56

Figura 4.5 Modelo "egg-box" de gelificação do alginato e rearranjo das cadeias de alginato com cálcio. Adaptado de George e Abraham (2006) e Bressel (2007).

A rede de gel pode ser formada pelo método de reticulação interna, em que se adiciona

diretamente à solução de alginato um sal insolúvel de cálcio. Neste caso, após a formação de

partículas de alginato, por exemplo, por emulsão, adiciona-se uma solução ácida que

solubiliza o sal de cálcio, tornando os íons Ca2+ disponíveis para efetuar interação iônica e

consequentemente, reticular o alginato (PONCELET et al., 1999). Alternativamente, a

formação de gel de alginato pelo uso de íons Ca+2 pode ser realizada por procedimentos

simples e rápida como o gotejamento da solução polissacarídica diretamente em soluções

ricas neste cátion (Figura 4.6).

Ao utilizar esse processo de difusão simples na imobilização em alginato, uma

suspensão com a enzima é misturada a uma solução de alginato de sódio, suficiente para

formar um gel firme. Essa mistura é submetida à extrusão com auxílio de mangueiras e

bomba peristáltica, sendo gotejada em solução contendo sais de íons bivalentes como cloreto

de cálcio formando grânulos. Após gelificação a enzima é aprisionada dentro do gel. Durante

a permanência na solução salina, os íons cálcio são transportados para o centro da esfera e um

estado de equilíbrio é atingido variando de 15 min a 12 horas (HULST; TRAMPER, 1989). O

tempo depende das condições experimentais como temperatura, concentração do sal, diâmetro

da esfera, tipo e concentração de alginato, concentração da suspensão. O procedimento de

57

maturação do encapsulado, em solução de cloreto de cálcio, pode ocorrer um aumento que

pode chegar a 40% comparado ao tamanho original (KLEIN; STOCK; VORLOP, 1983a;

OGBONNA; AMANO; NAKAMURA, 1989).

Figura 4.6 Gráfico esquemático da formação de micropartículas de alginato de sódio via interação com íons cálcio. Adaptado de Juárez et al. (2014).

A formação deste gel, além da imobilização, é uma técnica muito utilizada como

agente espessante e estabilizante em alimentos, e também na produção de adesivos, tintas,

brinquedos e papéis. A gelificação do alginato permite a encapsulação de várias substâncias, e

quando modificado quimicamente, é utilizado na liberação controlada de proteínas que

promovem a regeneração do tecido mineralizado e como carregador de células transplantadas.

O alginato de sódio vem sendo estudado para usos como matriz para suporte de culturas

celulares específicas, encapsulação de drogas, imobilização de microorganismos e enzimas,

excipiente para medicamentos, material para impressão dental e curativo para ferimentos

(LEE et al., 2004; AUGST; KONG; MOONEY, 2006; AVELLA et al., 2007; QIN, 2008;

KO; SFEIR; KUMTA, 2010). Além disso, a técnica de imobilização tem elevado seu uso

quando associada a reatores, devido a alta eficiência que a técnica apresenta associado a

vantagens do uso de biorreatores (GABARDO, 2011).

As aplicações de enzimas em reações de transformação estão em crescimento em

diferentes segmentos industriais, sendo utilizadas no campo alimentício, farmacêutico e

ambiental, por exemplo. Os reatores utilizados para o cultivo de células imobilizadas podem

58

ser divididos em três categorias, de acordo com o padrão de fluxo: Reatores de mistura,

reatores de leito empacotado e reatores de leito fluidizado; que podem ainda serem

modificados para melhorar as características de transferência de massa e a capacidade de

controle das condições de cultivo ou para minimizar o estresse imposto ao suporte de

imobilização. A maior parte das reações é realizada em reatores de batelada clássicos, a

temperatura controlada. No final da reação a enzima (vegetal, animal ou de origem

microbiana) é inativada para recuperação dos produtos finais. A utilização desse tipo de reator

é relativamente simples em qualquer escala, os principais parâmetros que devem ser

controlados são temperatura e pH e a sua operação em modo contínuo é adequada em casos

de inibição pelo substrato. No entanto, este tipo de biorreator apresenta desvantagens, como a

tensão de cisalhamento imposta a matrizes sensíveis e quando se trata de produtos com

grandes quantidades de matéria prima bruta, como é frequentemente o caso na prática

industrial, acarretando em baixa produtividade, perda de atividade catalítica devido à

inativação, grande variabilidade da qualidade dos produtos, dentre outros (FUKUDA, 1994;

GROBOILLOT et al., 1994; RIOS et al., 2004; CARVALHO; CANILHA; SILVA, 2006).

Uma alternativa existente para a desvantagem desse método simples e prático é o

reator de cesto. O reator de cesto fornece uma boa mistura e é fácil de ser mantido sob

condições isotérmicas. Este tipo de reator tem a vantagem que o biocatalisador não sofre atrito

pelo agitador, sendo que o catalisador encontra-se contido em uma estrutura semipermeável,

em forma de uma cesta. Em alguns casos o biocatalisador é fixado em uma cesta estática

anular em torno do impulsor (GOTO; SAITO, 1984) ou em um cesto rotativo movido pelo

eixo (TESHIMA; OHASHI, 1977; GOTO; SAITO, 1984). O reator de cesto tem se mostrado

vantajoso, pois proporciona bons rendimentos, maiores produtividades, devido as

características do biocatalisador não ter contato direto com o agitador ajudando a evitar a

perda prematura da atividade catalítica, e por permitir sua reutilização, diminuindo assim o

custo de operação (ALVARADO-HUALLANCO; FILHO, 2012).

5. Conclusão

Os processos de hidrólise enzimática de chás e sua aplicação em reator mostraram ser

um atraente meio para promover a biotransformação de compostos fenólicos conjugados e

aumentar a concentração de compostos fenólicos livres nessas matrizes, sendo ainda capazes

de melhorar a absorção, capacidade antioxidante e efeito anti-adipogênico destes compostos.

Algumas ferramentas são utilizadas para tentar aumentar a estabilidade da enzima, a

59

utilização da imobilização enzimática possui vantagens, como maior estabilidade e

reutilização, abrindo porta para um aumento da eficiência de produção de produtos

potencialmente comerciais. A imobilização em alginato é uma opção atrativa ao setor

industrial devido à sua segurança toxicológica, eficiência de imobilização, facilidade de

aplicação e a viabilidade econômica. Neste sentido, ainda são necessárias pesquisas que

explorem novos substratos, enzimas e biorreatores que potencializem essas aplicações e que

avaliem o potencial de utilização para obtenção de produtos biotransformados como

antioxidantes naturais e como suplementos alimentares.

60

6. Referências

AGUILAR, C. N.; GUTIERRES-SANCHEZ, G. Review: sources, properties, applications and potential uses of tannin acyl hydrolase. Food Science and Technology International, v. 7, n. 5, p. 372–382, 2001. AGUILAR, C. N.; RODRÍGUEZ, R.; GUTIÉRREZ-SÁNCHEZ, G.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; PRADO-BARRAGAN, L. A.; RAMÍREZ-CORONEL, A.; CONTRERAS-ESQUIVEL, J. C. Microbial tannases: advances and perspectives. Applied microbiology and biotechnology, v. 76, n. 1, p. 47–59, 2007. AILHAUD, G. Adipose tissue as a secretory organ: from adipogenesis to the metabolic syndrome. Comptes Rendus Biologies, v. 329, n. 8, p. 570–577, 2006. ALCÁZAR, A.; BALLESTEROS, O.; JURADO, J. M.; PABLOS, F.; MARTÍN, M. J.; VILCHES, J. L.; NAVALÓN, A. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of agricultural and food chemistry, v. 55, n. 15, p. 5960–5, 2007. ALVARADO-HUALLANCO, M. B.; FILHO, F. M. Dynamic modeling , simulation and in silico optimization of fructooligosaccharides by immobilized fructosyltransferase in continuous basket reactor. Journal of Chemical science and technology, v. 1, p. 27–33, 2012. ANDERSON, R. F.; AMARASINGHE, C.; FISHER, L. J.; MAK, W. B.; PACKER, J. E. Reduction in free-radical-induced DNA strand breaks and base damage through fast chemical repair by flavonoids. Free Radical Research, v. 33, n. 1, p. 91–103, 2000.

ANGELO, P. M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos – uma breve revisão. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 1–9, 2007.

ARÇARI, D. P. et al. Antiobesity Effects of yerba maté Extract (Ilex paraguariensis) in High-fat Diet – induced Obese Mice. Obesity, v. 17, n. 12, p. 2127–2133, 2009.

AUGST, A. D.; KONG, H. J.; MOONEY, D. J. Alginate Hydrogels as Biomaterials. Macromolecular Bioscience, v. 6, n. 8, p. 623–633, 2006.

AURA, A.-M. Microbial metabolism of dietary phenolic compounds in the colon. Phytochemistry Reviews, v. 7, n. 3, p. 407–429, 2008.

AVELLA, M.; PACE, E. DI; IMMIRZI, B.; IMPALLOMENI, G.; MALINCONICO, M.; SANTAGATA, G. Addition of glycerol plasticizer to seaweeds derived alginates: Influence of microstructure on chemical–physical properties. Carbohydrate Polymers, v. 69, n. 3, p. 503–511, 2007.

AVRAM, M. M.; AVRAM, A. S.; JAMES, W. D. Subcutaneous fat in normal and diseased states. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 56, n. 3, p. 472–492, 2007.

BASTOS, D. H. M.; FORNARI, A. C.; QUEIROZ, Y. S. DE; SOARES, R. A. M.; TORRES, E. A. F. S. The chlorogenic acid and caffeine content of yerba mate (Ilex paraguariensis) beverages. Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 24, n. 1, p. 91–95, 2005. BASTOS, D. H. M.; ISHIMOTO, E. Y.; ORTIZ M. MARQUES, M.; FERNANDO FERRI, A.; TORRES, E. A. F. S. Essential oil and antioxidant activity of green mate and mate tea (Ilex paraguariensis) infusions. Journal of Food Composition and Analysis, v. 19, n. 6–7, p. 538–543, 2006.

61

BASTOS, D. H. M.; TORRES, E. A. F. S. Bebidas a base de erva-mate ( Ilex paraguariensis ) e saúde pública Maté ( Ilex paraguariensis ) beverages and public. Nutrire, v. 26, p. 77–89, 2003.

BASTOS, D. H.; SALDANHA, L. A.; CATHARINO, R. R.; SAWAYA, A.; CUNHA, I. B.; CARVALHO, P. O.; EBERLIN, M. N. Phenolic antioxidants identified by ESI-MS from yerba maté (Ilex paraguariensis) and green tea (Camelia sinensis) extracts. Molecules, v. 12, n. 3, p. 423–432, 2007.

BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Purification and biochemical characterization of tannase from a newly isolated strain of Paecilomyces variotii. Food Biotechnology, v. 21, n. 3, p. 207–216, 2007a. BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Tannase production by Paecilomyces variotii. Bioresource technology, v. 98, n. 9, p. 1832–1837, 2007b. BATTESTIN, V.; PINTO, G. A. S.; MACEDO, G. A. Biochemical characterization of tannases from Paecilomyces variotii and Aspergillus niger. Food Science and Biotechnology, v. 16, n. 243–248, 2007.

BELMARES, R.; CONTRERAS-ESQUIVEL, J. C.; RODRÍGUEZ-HERRERA, R.; CORONEL, A. R.; AGUILAR, C. N. Microbial production of tannase: an enzyme with potential use in food industry. LWT - Food Science and Technology, v. 37, n. 8, p. 857–864, 2004.

BEVERINI, M.; METCHE, M. Identification, purification and physicochemical properties of tannase of Aspergillus orizae. Sciences des Aliments (France), 1990.

BOUAYED, J. Polyphenols: a potential new strategy for the prevention and treatment of anxiety and depression. Current Nutrition & Food Science, v. 6, n. 1, p. 13–18, 2010.

BOUAYED, J.; DEUSSE, H.; HOFFMANN, L.; BOHN, T. Bioaccessible and dialysable polyphenols in selected apple varieties following in vitro digestion vs. their native patterns. Food Chemistry, v. 131, n. 4, p. 1466–1472, 2012. BOUAYED, J.; HOFFMANN, L.; BOHN, T. Total phenolics, flavonoids, anthocyanins and antioxidant activity following simulated gastro-intestinal digestion and dialysis of apple varieties: Bioaccessibility and potential uptake. Food Chemistry, v. 128, n. 1, p. 14–21, 2011. BRACCINI, I.; PÉREZ, S. Molecular basis of Ca2+ -induced gelation in alginates and pectins: the egg-box model revisited. Biomacromolecules, v. 2, n. 4, p. 1089–1096, 2001. BRADY, D.; JORDAAN, J. Advances in enzyme immobilisation. Biotechnology letters, v. 31, n. 11, p. 1639–50, 2009. BRAVO, L.; GOYA, L.; LECUMBERRI, E. LC/MS characterization of phenolic constituents of mate (Ilex paraguariensis, St. Hil.) and its antioxidant activity compared to commonly consumed beverages. Food Research International, v. 40, p. 393–405, 2007.

BRESSEL, T. A. B. Sistema gerador de microcápsulas de alginato. 2007. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007.

CANILHA, L.; CARVALHO, W.; SILVA, J. B. A. Biocatalizadores imobilizados: uso de células e enzimas imobilizadas em processos biotecnológicos. Revista Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, v. 9, n. 36, p. 48–57, 2006 CARDOSO, C. L. Imobilização de enzimas em suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca por substâncias bioativas. Química Nova, v. 32, n. 1, p. 175–187, 2009.

62

CARINI, M.; FACINO, R. M.; ALDINI, G.; CALLONI, M.; COLOMBO, L. Characterization of phenolic antioxidants from Maté (Ilex Paraguayensis) by liquid chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, v. 12, n. 22, p. 1813–1819, 1998. CARVALHO, W.; CANILHA, L.; SILVA, S. S. Uso de biocatalisadores imobilizados: uma alternativa para a condução de biprocessos. Revista Analytica, v. 23, n. 2, p. 60–70, 2006. CHIBATA, I. Industrial application of immobilized enzyme systems. Pure and Applied Chemistry, v. 50, n. 7, p. 667–675, 1978. CHOO, J. J. Green tea reduces body fat accretion caused by high-fat diet in rats through β-adrenoceptor activation of thermogenesis in brown adipose tissue. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 14, n. 11, p. 671–676, 2003.

CONTI, E.; FLAIBANI, A.; O’REGAN, M.; SUTHERLAND, I. W. Alginate from Pseudomonas fluorescens and P. putida: production and properties. Microbiology, v. 140, n. 5, p. 1125–1132, 1994. DAI, J.; MUMPER, R. J. Plant phenolics: Extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules, v. 15, n. 10, p. 7313–7352, 2010. DASHWOOD, W.-M.; ORNER, G. A.; DASHWOOD, R. H. Inhibition of β-catenin/Tcf activity by white tea, green tea, and epigallocatechin-3-gallate (EGCG): minor contribution of H2O2 at physiologically relevant EGCG concentrations. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 296, n. 3, p. 584–588, 2002. DEFRONZO, R. A. Dysfunctional fat cells, lipotoxicity and type 2 diabetes. International Journal of Clinical Practice, v. 58, n. October, p. 9–21, 2004. DIAS, K. Matte Leão. Mundo das Marcas, 2006. Disponível em: http://mundodasmarcas.blogspot.com.br/2006/07/mate. Acessado em 01/08/2016. DRURY, J. L.; DENNIS, R. G.; MOONEY, D. J. The tensile properties of alginate hydrogels. Biomaterials, v. 25, n. 16, p. 3187–3199, 2004. DULLOO, A. G.; SEYDOUX, J.; GIRARDIER, L.; CHANTRE, P.; VANDERMANDER, J. Green tea and thermogenesis: interactions between catechin-polyphenols, caffeine and sympathetic activity. International journal of obesity, v. 24, p. 252–258, 2000.

EGERT, S.; RIMBACH, G. Which sources of flavonoids : complex diets or dietary supplements ? Advances in Nutrition: An international Review Journal, v. 2, n. 10, p. 8–14, 2011. ENGSTROM, G.; HEDBLAD, B.; STAVENOW, L.; LIND, P.; JANZON, L.; LINDGARDE, F. Inflammation-sensitive plasma proteins are associated with future weight gain. Diabetes, v. 52, n. 8, p. 2097–2101, 2003.

FAO. World tea production and trade. Current and future development. Food and agriculture Organization of the United Nations, 2015.

FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ, M.; SANROMÁN, M. Á.; MOLDES, D. Recent developments and applications of immobilized laccase. Biotechnology Advances, v. 31, n. 8, p. 1808–1825, 2013. FERNÁNDEZ-GARCÍA, E.; CARVAJAL-LÉRIDA, I.; PÉREZ-GÁLVEZ, A. In vitro bioaccessibility assessment as a prediction tool of nutritional efficiency. Nutrition Research, v. 29, n. 11, p. 751–760, 2009.

63

FILIP, R.; LÓPEZ, P.; GIBERTI, G.; COUSSIO, J.; FERRARO, G. Phenolic compounds in seven South American Ilex species. Fitoterapia, v. 72, n. 7, p. 774–778, 2001. FUJITA, H.; YAMAGAMI, T. Antihypercholesterolemic effect of chinese black tea extract in human subjects with borderline hypercholesterolemia. Nutrition Research, v. 28, n. 7, p. 450–456, 2008.

FUKUDA, H. Immobilized microorganism bioreactors. In: ASENJO, J. A.; MERCHUK, J. C. (Eds.). Bioreactor System Design. New York: Marcel Dekke, Inc, p. 339–375, 1994.

FURUKAWA, S. et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. The journal of clinical investigation, v. 114, n. 12, p. 1752–1761, 2004.

GABARDO, S. Otimização da Bioconversão de lactose do soro de queijo em etanol em sistemas de biorreatores imobilizados. Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2011.

GACESA, P. Alginates. Carbohydrate Polymers, v. 8, n. 3, p. 161–182, 1988. GACESA, P. Enzymic degradation of alginates. International Journal of Biochemistry, v. 24, n. 4, p. 545–552, 1992. GEORGE, M.; ABRAHAM, T. E. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs: Alginate and chitosan — A review. Journal of Controlled Release, v. 114, n. 1, p. 1–14, 2006.

GEORGETTI, S. R.; VICENTINI, F. T. M. C.; YOKOYAMA, C. Y.; BORIN, M. F.; SPADARO, A C. C.; FONSECA, M. J. V. Enhanced in vitro and in vivo antioxidant activity and mobilization of free phenolic compounds of soybean flour fermented with different beta-glucosidase-producing fungi. Journal of applied microbiology, v. 106, n. 2, p. 459–66, 2009. GIORNO, L.; DRIOLI, E. Biocatalytic membrane reactors: applications and perspectives. Trends in Biotechnology, v. 18, n. 8, p. 339–349, 2000. GONDOIN, A.; GRUSSU, D.; STEWART, D.; MCDOUGALL, G. J. White and green tea polyphenols inhibit pancreatic lipase in vitro. Food Research International, v. 43, n. 5, p. 1537–1544, 2010.

GONZÁLEZ-BARRIO, R.; BORGES, G.; MULLEN, W.; CROZIER, A. Bioavailability of anthocyanins and ellagitannins following consumption of raspberries by healthy humans and subjects with an ileostomy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, n. 7, p. 3933–3939, 2010.

GOTO, S.; SAITO, T. Liquid-solid mass transfer in basket type three-phase reactors. Journal of Chemical Engineering of Japan, v. 17, n. 3, p. 324–327, 1984.

GRANT, G. T.; MORRIS, E. R.; REES, D. A.; SMITH, P. J. C.; THOM, D. Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: The egg-box model. FEBS Letters, v. 32, n. 1, p. 195–198, 1973. GREGOIRE, F. M. Adipocyte differentiation: from fibroblast to endocrine cell. Experimental biology and medicine, v. 226, n. 11, p. 997–1002, 2001. GROBOILLOT, A.; BOADI, D. K.; PONCELET, D.; NEUFELD, R. J. Immobilization of cells for application in the food industry. Critical reviews in biotechnology, v. 14, n. 2, p. 75–107, 1994.

64

GROSOVÁ, Z.; ROSENBERG, M.; REBROŠ, M. Perspectives and Applications of Immobilised β-Galactosidase in Food Industry – A Review. Czech Journal Food Science, v. 26, n. 1, p. 1–14, 2008.

GU, L.; KELM, M. A.; HAMMERSTONE, J. F.; BEECHER, G.; HOLDEN, J.; HAYTOWITZ, D.; PRIOR, R. L. Screening of foods containing proanthocyanidins and their structural characterization using LC-MS/MS and thiolytic degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, n. 25, p. 7513–7521, 2003.

GUGLIUCCI, A.; BASTOS, D. H. M. Chlorogenic acid protects paraoxonase 1 activity in high density lipoprotein from inactivation caused by physiological concentrations of hypochlorite. Fitoterapia, v. 80, n. 2, p. 138–142, 2009. HAN, J.; HAMILTON, J. A; KIRKLAND, J. L.; CORKEY, B. E.; GUO, W. Medium-chain oil reduces fat mass and down-regulates expression of adipogenic genes in rats. Obesity research, v. 11, n. 6, p. 734–744, 2003.

HAN, X.; SHEN, T.; LOU, H. Dietary polyphenols and their biological significance. International Journal of Molecular Sciences, v. 8, n. 9, p. 950–988, 2007.

HANCOCK, R. D.; MCDOUGALL, G. J.; STEWART, D. Berry fruit as ‘superfood’: Hope or hype? Biologist, v. 54, n. 2, p. 73–79, 2007.

HASLAM, E.; STANGROOM, J. E. The esterase and depsidase activities of tannase. Biochemical Journal, v. 99, p. 28–31, 1966.

HAUG, A.; LARSEN, B.; SAMUELSSON, B.; SJÖVALL, J.; MUNCH-PETERSEN, J. The solubility of alginate at low pH. Acta Chemica Scandinavica, v. 17, p. 1653–1662, 1963.

HAUSMAN, D. B.; DIGIROLAMO, M.; BARTNESS, T. J.; HAUSMAN, G. J.; MARTIN, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews, v. 2, n. 4, p. 239–254, Nov. 2001. HECK, C. I.; MEJIA, E. G. DE. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): a comprehensive review on chemistry, health implications, and technological considerations. Journal of Food Science, v. 72, n. 9, p. R138–R151, 2007.

HEO, H. J.; KIM, Y. J.; CHUNG, D.; KIM, D.-O. Antioxidant capacities of individual and combined phenolics in a model system. Food Chemistry, v. 104, n. 1, p. 87–92, 2007.

HILAL, Y.; ENGELHARDT, U. Characterisation of white tea – Comparison to green and black tea. Journal of Consumer Protection and Food Safety, v. 2, p. 414–421, 2007.

HOFFMAN, F.; MANNING, M. Herbal medicine and botanical medical fads. New York: The Haworth Press, 2002.

HOLST, B.; WILLIAMSON, G. Nutrients and phytochemicals: from bioavailability to bioefficacy beyond antioxidants. Current Opinion in Biotechnology, v. 19, n. 2, p. 73–82, 2008. HULST, A. C.; TRAMPER, J. Immobilized plant cells: A literature survey. Enzyme and Microbial Technology, v. 11, n. 9, p. 546–558, 1989. IKEDA, I.; IMASATO, Y.; SASAKI, E.; NAKAYAMA, M.; NAGAO, H.; TAKEO, T.; YAYABE, F.; SUGANO, M. Tea catechins decrease micellar solubility and intestinal absorption of cholesterol in rats. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, v. 1127, n. 2, p. 141–146, 1992.

65

JACQUES, R.; FREITAS, L. DOS S.; PEREZ, V.; DARIVA, C.; OLIVEIRA, A. P. DE; OLIVEIRA, J. V.; CAMARÃO, E. B. The use of ultrasound in the extraction of Ilex paraguariensis leaves: A comparison with maceration. Ultrasonics Sonochemistry, v. 14, n. 1, p. 6–12, 2007. JENNER, A. M.; RAFTER, J.; HALLIWELL, B. Human fecal water content of phenolics: the extent of colonic exposure to aromatic compounds. Free radical biology & medicine, v. 38, n. 6, p. 763–72, 2005.

JIANG, H.; ENGELHARDT, U. H.; THRÄNE, C.; MAIWALD, B.; STARK, J. Determination of flavonol glycosides in green tea, oolong tea and black tea by UHPLC compared to HPLC. Food Chemistry, v. 183, p. 30–35, 22015. JIMÉNEZ, J. P.; SERRANO, J.; TABERNERO, M.; ARRANZ, S.; DÍAZ-RUBIO, M. E.; GARCÍA-DIZ, L.; GOÑI, I.; SAURA-CALIXTO, F. Effects of grape antioxidant dietary fiber in cardiovascular disease risk factors. Nutrition, v. 24, n. 7–8, p. 646–653, 22008.

JOHNSON, I. T. New approaches to the role of diet in the prevention of cancers of the alimentary tract. Mutation research, v. 551, n. 1–2, p. 9–28, 22004.

JOHNSON, J.; MAHER, P.; HANNEKEN, A. The flavonoid, eriodictyol, induces long-term protection in ARPE-19 cells through its effects on Nrf2 activation and phase 2 gene expression. Investigative Opthalmology & Visual Science, v. 50, n. 5, p. 2398–2406, 2009. JUÁREZ, G. A. P.; SPASOJEVIC, M.; FAAS, M. M.; DE VOS, P. Immunological and technical considerations in application of alginate-based microencapsulation systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, v. 2, n. August, p. 1–15, 2014.

KANG, Y.-R. et al. Anti-obesity and anti-diabetic effects of Yerba Mate (Ilex paraguariensis) in C57BL/6J mice fed a high-fat diet. Laboratory animal research, v. 28, n. 1, p. 23–9, 2012.

KAO, Y.-H.; CHANG, H.-H.; LEE, M.-J.; CHEN, C.-L. Tea, obesity, and diabetes. Molecular Nutrition & Food Research, v. 50, n. 2, p. 188–210, 2006.

KAO, Y. H.; HIIPAKKA, R. A.; LIAO, S. Modulation of endocrine systems and food intake by green tea epigallocatechin gallate. Endocrinology, v. 141, n. 3, p. 980–7, 2000.

KERSHAW, E. E.; FLIER, J. S. Adipose Tissue as an Endocrine Organ. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 89, n. 6, p. 2548–2556, 2004.

KIM, N.; HOON, S. Evaluation of green pepper (Capsicum annuum L.) juice on the weight gain and changes in lipid profile in C57BL/6 mice fed a high-fat diet. Society of Chemical Industry, v. 95, p. 79–87, 2014. KING, A.; YOUNG, G. characteristics and occurrence of phenolic phytochemicals. Perspectives in Practice, v. 99, n. 2, p. 213–218, 1999. KLEIN, J.; STOCK, J.; VORLOP, K.-D. Pore size and properties of spherical Ca-alginate biocatalysts. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, v. 18, n. 2, p. 86–91, 1983.

KO, H.-F.; SFEIR, C.; KUMTA, P. N. Novel synthesis strategies for natural polymer and composite biomaterials as potential scaffolds for tissue engineering. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences, v. 368, n. 1917, p. 1981–97, 2010.

KOO, S. I.; NOH, S. K. Green tea as inhibitor of the intestinal absorption of lipids: potential mechanism for its lipid-lowering effect. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 18, n. 3, p. 179–183, 2007.

66

KROLL, J.; RAWEL, H. M.; ROHN, S. Reactions of plant phenolics with food proteins and enzymes under special consideration of covalent bonds. Food Science and Technology Research, v. 9, n. 3, p. 205–218, 2003.

KU, C. S.; MUN, S. P. Stabilization of extracellular matrix by Pinus radiata bark extracts with different molecular weight distribution against enzymatic degradation and radicals. Wood Science and Technology, v. 42, n. 5, p. 427–436, 2008. ŁAGOWSKA, K.; JESZKA, J. Adipose tissue as an endocrine organ. Medicina Sportiva, v. 15, n. 3, p. 140–146, 2011. LEE, K. G.; KWEON, H.; YEO, J. H.; WOO, S. O.; LEE, J. H.; PARK, Y. H. Structural and physical properties of silk fibroin/alginate blend sponges. Journal of Applied Polymer Science, v. 93, n. 5, p. 2174–2179, 2004.

LEE, K. S.; KIM, E. Y.; JEON, K.; CHO, S. G.; HAN, Y. J.; YANG, B. C.; LEE, S. S.; KO, M. S.; RIU, K. J.; LEE, H. T.; PARK, S. P. 3,4Dihydroxyflavone acts as an antioxidant and antiapoptotic agent to support bovine embryo development in vitro. Journal of Reproduction and Development, v. 57, n. 1, p. 127–134, 2011.

LEE, S.; UMANO, K.; SHIBAMOTO, T.; LEE, K. Identification of volatile components in basil (Ocimum Basilicum L.) and thyme leaves (Thymus Vulgaris L.) and their antioxidant properties. Food Chemistry, v. 91, p. 131–137, 2005. LEKHA, P. K.; LONSANE, B. K. Production and application of tannin acyl hydrolase: state of the art. In: Advances in Applied Microbiology. New York, USA: Academic press, v. 44p. 216–260, 1997..

LEOPOLDINI, M.; RUSSO, N.; TOSCANO, M. The molecular basis of working mechanism of natural polyphenolic antioxidants. Food Chemistry, v. 125, n. 2, p. 288–306, 2011.

LI, K. K.; WONG, H. L.; HU, T.; ZHANG, C.; HAN, X. Q.; YE, C. X.; LEUNG, P. C.; CHENG, B. H.; KO, C. H. Impacts of Camellia kucha and its main chemical components on the lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes. International Journal of Food Science & Technology, v. 51, n. 12, p. 2546–2555, 2016.

LIN, J.; DELLA-FERA, M. A.; BAILE, C. A. Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes. Obesity Research, v. 13, n. 6, p. 982–990, 2005. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. 2a ed. [s.l.] Plantarum, 2002. LUNCEFORD, N.; GUGLIUCCI, A. Ilex paraguariensis extracts inhibit AGE formation more efficiently than green tea. Fitoterapia, v. 76, n. 5, p. 419–427, 2005. MACEDO, J. A.; BATTESTIN, V.; RIBEIRO, M. L.; MACEDO, G. A. Increasing the antioxidant power of tea extracts by biotransformation of polyphenols. Food Chemistry, v. 126, n. 2, p. 491–497, 2011.

MAHMOOD, T.; AKHTAR, N.; ALI KHAN, B. The morphology, characteristics, and medicinal properties of Camellia sinensis tea. Journal of Medicinal Plants Research, v. 4, n. 19, p. 2028–2033, 2010. MANACH, C.; SCALBERT, A.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C.; JIME, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 79, n. 5, p. 727–747, 2004.

67

MARIA, C. A. B. DE; MOREIRA, R. F. A. Cafeína: Revisão sobre métodos de análise. Química Nova, v. 30, n. 1, p. 99–105, 2007. MATEO, C.; ABIAN, O.; FERNANDEZ–LAFUENTE, R.; GUISAN, J. M. Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment. Enzyme and Microbial Technology, v. 26, n. 7, p. 509–515, 2000. MATSUMOTO, R. L. T.; BASTOS, D. H. M.; MENDONÇA, S.; NUNES, V. S.; BARTCHEWSKY, W.; RIBEIRO, M. L.; OLIVEIRA CARVALHO, P. DE. Effects of maté tea (Ilex paraguariensis) ingestion on mrna expression of antioxidant enzymes, lipid peroxidation, and total antioxidant status in healthy young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 57, n. 5, p. 1775–1780, 2009.

MCDOUGALL, G. J.; FYFFE, S.; DOBSON, P.; STEWART, D. Anthocyanins from red cabbage--stability to simulated gastrointestinal digestion. Phytochemistry, v. 68, n. 9, p. 1285–1294, 2007. MCDOUGALL, G. J.; KULKARNI, N. N.; STEWART, D. Berry polyphenols inhibit pancreatic lipase activity in vitro. Food Chemistry, v. 115, n. 1, p. 193–199, 2009. MEINHART, A. D.; BIZZOTTO, C. S.; BALLUS, C. A.; POLONI RYBKA, A. C.; SOBRINHO, M. R.; CERRO-QUINTANA, R. S.; TEIXEIRA-FILHO, J.; GODOY, H. T. Methylxanthines and phenolics content extracted during the consumption of mate (Ilex paraguariensis St. Hil) beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, n. 4, p. 2188–2193, 2010.

MIRANDA, D. D. C.; ARCARI, D. P.; PEDRAZZOLI, J.; CARVALHO, P. D. O.; CERUTTI, S. M.; BASTOS, D. H. M.; RIBEIRO, M. L. Protective effects of mate tea (Ilex paraguariensis) on H2O2-induced DNA damage and DNA repair in mice. Mutagenesis, v. 23, n. 4, p. 261–265, 2008.

MIZUKAMI, Y.; SAWAI, Y.; YAMAGUCHI, Y. Simultaneous analysis of catechins, gallic acid, strictinin, and purine alkaloids in green tea by using catechol as an internal standard. Journal of agricultural and food chemistry, v. 55, n. 13, p. 4957–64, 2007. MONTAGUE, C. T.; PRINS, J. B.; SANDERS, L.; ZHANG, J.; SEWTER, C. P.; DIGBY, J.; BYRNE, C. D.; O’RAHILLY, S. Depot-related gene expression in human subcutaneous and omental adipocytes. Diabetes, v. 47, n. 9, p. 1384–1391, 1998.

MOSIMANN, A. L. P.; WILHELM-FILHO, D.; SILVA, E. L. DA. Aqueous extract of Ilex paraguariensis attenuates the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits. BioFactors, v. 26, n. 1, p. 59–70, 2006. MOTIE, M.; EVANGELISTA, L.; HORWICH, T.; LOMBARDO, D.; ZALDIVAR, F.; HAMILTON, M.; FONAROW, G. Association between inflammatory biomarkers and adiposity in obese patients with heart failure and metabolic syndrome. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 8, n. 1, p. 181–186, 2014. MURAMATSU, K.; FUKUYO, M.; HARA, Y. Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, v. 32, n. 6, p. 613–622, 1986.

MURASE, T.; NAGASAWA, A.; SUZUKI, J.; HASE, T.; TOKIMITSU, I. Beneficial effects of tea catechins on diet-induced obesity : stimulation of lipid catabolism in the liver. International journal of obesity, v. 26, p. 1459–1464, 2002.

68

NAGALAKSHMI, S. Tea: An Appraisal of Processing Methods and Products. In: CHAKRAVERTY, A.; MUJUMDAR, A. S.; RAGHAVAN, G. S. V; RAMASWAMY, H. S. (Eds.). Handbook of Postharvesting Technology: Cereals, Fruits, Vegetables, Tea, and Spices. New York: Marcel Dekker Inc., 2003. p. 741–778. NIJVELDT, R.; NOOD, E.; HOORN, D. E. C.; BOELENS, P. G.; NORREN, K.; LEEUWEN, P. A. M. Flavonoids : a review of probable mechanisms of action and potential applications. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 74, p. 418–425, 2001

NTAMBI, M. J.; KIM, Y.-C. Symposium: adipocyte function, differentiation and metabolism regulation of leptin production in humans. The Journal of Nutrition, v. 130, n. 12, p. 3127–3131, 2000. NUSSINOVITCH, A. Hydrocolloid Applications. Boston, MA, MA: Springer US, 1997.

OGBONNA, J. C.; AMANO, Y.; NAKAMURA, K. Elucidation of optimum conditions for immobilization of viable cells by using calcium alginate. Journal of Fermentation and Bioengineering, v. 67, n. 2, p. 92–96, 1989. ONAKPOYA, I. J.; SULLIVAN, J. O.; HENEGHAN, C. J. The effect of cactus pear (Opuntia ficus-indica) on body weight and cardiovascular risk factors: a systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. Nutrition, v. 31, n. 5, p. 640–646, 2015.

ONAKPOYA, I. J.; WIDER, B.; PITTLER, M. H.; ERNST, E. Food supplements for body weight reduction: A systematic review of systematic reviews. Obesity, v. 19, n. 2, p. 239–244, 2011. OPAS (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE). Doenças crônico-degenerativas e obesidade: Estratégia mundial sobre alimentação saudável, atividade física e saúde, 2003. ORNER, G. A. Suppression of tumorigenesis in the Apc min mouse: down-regulation of beta-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac. Carcinogenesis, v. 24, n. 2, p. 263–267, 2003.

ØSTGAARD, K.; KNUTSEN, S. H.; DYRSET, N.; AASEN, I. M. Production and characterization of guluronate lyase from Klebsiella pneumoniae for applications in seaweed biotechnology. Enzyme and Microbial Technology, v. 15, n. 9, p. 756–763, 1993. PALAFOX-CARLOS, H.; AYALA-ZAVALA, J. F.; GONZÁLEZ-AGUILAR, G. A. The role of dietary fiber in the bioaccessibility and bioavailability of fruit and vegetable antioxidants. Journal of Food Science, v. 76, n. 1, p. R6–R15, 2011.

PARADA, J.; AGUILERA, J. M. Food microstructure affects the bioavailability of several nutrients. Journal of Food Science, v. 72, n. 2, p. 21–32, 2007.

PENICHE, C.; HOWLAND, I.; CARRILLO, O.; ZALDÍVAR, C.; ARGÜELLES-MONAL, W. Formation and stability of shark liver oil loaded chitosan/calcium alginate capsules. Food Hydrocolloids, v. 18, n. 5, p. 865–871, 2004. PEREIRA, R. P. et al. Antioxidant effects of different extracts from Melissa officinalis, Matricaria recutita and Cymbopogon citratus. Neurochemical Research, v. 34, n. 5, p. 973–983, 2009.

PINTO, G. A. S.; COURI, S.; LEITE, S. G. F.; BRITO, E. S. DE. Tanase: Conceitos, Produção e Aplicação. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos de Curitiba. CEPPA, v. 23, n. 2, p. 435–462, 2005. POMILIO, A. B.; TRAJTEMBERG, S.; VITALE, A. A. High-performance capillary electrophoresis analysis of mate infusions prepared from stems and leaves of Ilex

69

paraguariensis using automated micellar electrokinetic capillary chromatography. Phytochemical Analysis, v. 13, n. 4, p. 235–241, 2002. PONCELET, D.; BABAK, V.; DULIEU, C.; PICOT, A. A physico-chemical approach to production of alginate beads by emulsification-internal ionotropic gelation. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 155, n. 2–3, p. 171–176, 1999.

QIN, Y. Alginate fibres: an overview of the production processes and applications in wound management. Polymer International, v. 57, n. 2, p. 171–180, 2008.

RASOULI, N.; KERN, P. A. Adipocytokines and the metabolic complications of obesity. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v. 93, n. 11 SUPPL. 1, p. 64–73, 2008.

RAYALAM, S.; DELLA-FERA, M. A.; BAILE, C. A. Phytochemicals and regulation of the adipocyte life cycle. Journal of Nutritional Biochemistry, v. 19, n. 11, p. 717–726, 2008.

REMMINGHORST, U.; REHM, B. H. A. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters, v. 28, n. 21, p. 1701–1712, 2006.

RIETVELD, A.; WISEMAN, S. Antioxidant effects of tea: evidence from human clinical trials. The Journal of Nutrition, v. 133, n. 10, p. 3244–3246, 2003.

RINAUDO, M. Characterization and properties of some polysaccharides used as biomaterials. Macromolecular Symposia, v. 245–246, n. 1, p. 549–557, 2006.

RINAUDO, M. Main properties and current applications of some polysaccharides as biomaterials. Polymer international, v. 57, n. April, p. 171–180, 2008.

RIO, D. DEL; STEWART, A. J.; MULLEN, W.; BURNS, J.; LEAN, M. E. J.; BRIGHENTI, F.; CROZIER, A. HPLC-MSn analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 10, p. 2807–15, 19 2004.

RIOS, G. M.; BELLEVILLE, M. P.; PAOLUCCI, D.; SANCHEZ, J. Progress in enzymatic membrane reactors – A review. Journal of Membrane Science, v. 242, n. 1–2, p. 189–196, 2004. RODEHEFFER, M. S.; BIRSOY, K.; FRIEDMAN, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell, v. 135, n. 2, p. 240–249, 2008. ROSS, H. A.; MCDOUGALL, G. J.; STEWART, D. Antiproliferative activity is predominantly associated with ellagitannins in raspberry extracts. Phytochemistry, v. 68, n. 2, p. 218–228, 2007.

RUSAK, G.; KOMES, D.; LIKIĆ, S.; HORŽIĆ, D.; KOVAČ, M. Phenolic content and antioxidative capacity of green and white tea extracts depending on extraction conditions and the solvent used. Food Chemistry, v. 110, n. 4, p. 852–858, 2008. SABU, M. C.; SMITHA, K.; RAMADASAN, K. Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reducing oxidative stress in experimental diabetes. Journal of Ethnopharmacology, v. 83, n. 1–2, p. 109–116, 2002.

SANGEETHA, P. T.; RAMESH, M. N.; PRAPULLA, S. G. Fructooligosaccharide production using fructosyl transferase obtained from recycling culture of Aspergillus oryzae CFR 202. Process Biochemistry, v. 40, n. 3–4, p. 1085–1088, 2005. SANTANA-RIOS, G.; ORNER, G. A.; AMANTANA, A.; PROVOST, C.; WU, S.-Y.; DASHWOOD, R. H. Potent antimutagenic activity of white tea in comparison with green tea

70

in the Salmonella assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, v. 495, n. 1–2, p. 61–74, 2001. SCALBERT, A.; MANACH, C.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C.; JIMÉNEZ, L. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 45, n. 4, p. 287–306, 2005.

SCALBERT, A.; WILLIAMSON, G. Dietary Intake and Bioavailability of Polyphenols. The Journal of Nutrition, v. 130, n. 8, p. 2073–2085, 2000.

SCHARBERT, S.; HOLZMANN, N.; HOFMANN, T. Identification of the astringent taste compounds in black tea infusions by combining instrumental analysis and human bioresponse. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 11, p. 3498–3508, 2004.

SCHONS, P. F. Detanificação e desfitinização de grãos de sorgo (Sorghum bicolor) por tanase e fitase e estudo biológico. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas.Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas, 2009. SCHONS, P. F. Imobilização da tanase de Paecilomyces variotii e ação em reações de hidrólise e síntese. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos. Campinas, SP, 2012.

SCHONS, P. F.; LOPES, F. C. R.; BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Immobilization of Paecilomyces variotii tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of Microencapsulation, v. 28, n. 3, p. 211–9, 2011. SEERAM, N. P.; AVIRAM, M.; ZHANG, Y.; HENNING, S. M.; FENG, L.; DREHER, M.; HEBER, D. Comparison of antioxidant potency of commonly consumed polyphenol-rich beverages in the United States. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, n. 4, p. 1415–1422, 2008. SHELDON, R. A.; PELT, S. VAN. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how. Chemical Society Reviews, v. 42, n. 15, p. 6223–6235, 2013. SILVA, E. L. DA; NEIVA, T. J. C.; SHIRAI, M.; TERAO, J.; ABDALLA, D. S. P. Acute ingestion of yerba mate infusion (Ilex paraguariensis) inhibits plasma and lipoprotein oxidation. Food Research International, v. 41, n. 10, p. 973–979, 2008.

SILVA, J. F. DA; BIDINOTTO, L. T.; FURTADO, K. S.; SALVADORI, D. M. F.; RIVELLI, D. P.; BARROS, S. B. DE M.; RODRIGUES, M. A. M.; BARBISAN, L. F. Mate attenuates DNA damage and carcinogenesis induced by diethylnitrosamine and thermal injury in rat esophagus. Food and Chemical Toxicology, v. 47, n. 7, p. 1521–1529, 2009.

SINGH, B. N.; SHANKAR, S.; SRIVASTAVA, R. K. Green tea catechin, epigallocatechin-3-gallate (EGCG): mechanisms, perspectives and clinical applications. Biochemical pharmacology, v. 82, n. 12, p. 1807–21, 2011. SMIDSRØD, O.; DRAGET, K. I. Alginate Gelation Technologies. In: DICKINSON, E.; BERGENSTAHL, B. (Eds.). Food colloids: proteins, lipids and polysaccharides. Elsevier, 1997. p. 279–293.

SMIDSRØD, O.; SKJÅK-BRAEK, G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology, v. 8, n. 4, p. 71–78, 1990.

SÖHLE, J.; KNOTT, A.; HOLTZMANN, U.; SIEGNER, R.; GRÖNNIGER, E.; SCHEPKY, A.; GALLINAT, S.; WENCK, H.; STÄB, F.; WINNEFELD, M. White tea extract induces

71

lipolytic activity and inhibits adipogenesis in human subcutaneous (pre)-adipocytes. Nutrition & metabolism, v. 6, p. 20, 2009. SOOD, N.; BAKER, W. L.; COLEMAN, C. I. Effect of glucomannan on plasma lipid and glucose concentrations, body weight, and blood pressure: Systematic review and meta-amalysis. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 88, n. 1, p. 1167–1175, 2008.

STEIGERWALT, R.; BELCARO, G.; CESARONE, M. R.; RENZO, A. DI; GROSSI, M. G.; RICCI, A.; DUGALL, M.; CACCHIO, M.; SCHÖNLAU, F. Pycnogenol® improves microcirculation, retinal edema, and visual acuity in early diabetic retinopathy. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, v. 25, n. 6, p. 537–540, 2009.

STEIN, F. L. P. Vascular responses to extractable fractions of Ilex paraguariensis in rats fed standard and high-cholesterol diets. Biological Research For Nursing, v. 7, n. 2, p. 146–156, 2005. SUKSAMRAN, T.; OPANASOPIT, P.; ROJANARATA, T.; NGAWHIRUNPAT, T.; RUKTANONCHAI, U.; SUPAPHOL, P. Biodegradable alginate microparticles developed by electrohydrodynamic spraying techniques for oral delivery of protein. Journal of microencapsulation, v. 26, n. 7, p. 563–70, 2009. TAGLIAZUCCHI, D.; VERZELLONI, E.; BERTOLINI, D.; CONTE, A. In vitro bio-accessibility and antioxidant activity of grape polyphenols. Food Chemistry, v. 120, n. 2, p. 599–606, 2010.

TAKEO, T. Green and semi-fermented teas. In: WILSON, K. C. CLIFFORD, M. N. Teas: Cultivation to consumption. Springer Netherlands, Dordrecht, 1992. p. 413-457.

TEIXEIRA, L. G. et al. White tea (Camellia sinensis) extract reduces oxidative stress and triacylglycerols in obese mice. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 32, n. 4, p. 733–741, 2012. TESHIMA, H.; OHASHI, Y. Particle to liquid mass transfer in a rotating catalyst basket reactor. Journal of Chemical Engineering of Japan, v. 10, n. 1, p. 70–72, 1977. UCHIYAMA, S.; TANIGUCHI, Y.; SAKA, A.; YOSHIDA, A.; YAJIMA, H. Prevention of diet-induced obesity by dietary black tea polyphenols extract in vitro and in vivo. Nutrition, v. 27, n. 3, p. 287–292, 2011.

VOS, P. DE; LAZARJANI, H. A.; PONCELET, D.; FAAS, M. M. Polymers in cell encapsulation from an enveloped cell perspective. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 67–68, p. 15–34, 2014. WANG, Y.; HO, C.-T. Polyphenolic chemistry of tea and coffee: a century of progress. Journal of agricultural and food chemistry, v. 57, n. 18, p. 8109–14, 2009. WATANABE, J.; KAWABATA, J.; NIKI, R. Isolation and identification of acetyl-CoA carboxylase inhibitors from green tea (Camellia sinensis). Bioscience, biotechnology, and biochemistry, v. 62, n. 3, p. 532–4, 1998.

WILLIAMS, R. J.; SPENCER, J. P. E.; RICE-EVANS, C. Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Radical Biology and Medicine, v. 36, n. 7, p. 838–849, 2004.

WINKEL-SHIRLEY, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology, v. 126, n. February 2015, p. 485–493, 2001. WU, T.; GUO, Y.; LIU, R.; WANG, K.; ZHANG, M. Black tea polyphenols and polysaccharides improve body composition, increase fecal fatty acid, and regulate fat

72

metabolism in high-fat diet-induced obese rats. Food & Function, v. 7, n. 5, p. 2469–2478, 2016. XIE, G.; HE, R.; FENG, X.; YAN, T.; LAN, F.; WU, M. The hypoglycemic effects of Camellia assamica var . kucha extract. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 74, n. 2, p. 405–407, 2014.

YONEKURA, L.; MARTINS, C. A.; SAMPAIO, G. R.; MONTEIRO, M. P.; CÉSAR, L. A. M.; MIOTO, B. M.; MORI, C. S.; MENDES, T. M. N.; RIBEIRO, M. L.; ARÇARI, D. P.; TORRES, A. F. DA S. Bioavailability of catechins from guaraná (Paullinia cupana) and its effect on antioxidant enzymes and other oxidative stress markers in healthy human subjects. Food & function, v. 7, p. 2970–2978, 2016.

73

CAPÍTULO II

Imobilização de tanase e caracterização cinética da enzima imobilizada na hidrólise de

taninos

(Artigo a ser submetido à revista Bioresource Tecnology)

74

Imobilização de tanase e caracterização cinética da enzima imobilizada na hidrólise de

taninos

Tannase immobilization and kinetic characterization of immobilized enzyme in tannins

hydrolysis

Bruna Sampaio Roberto1*; Isabela Mateus Martins1; Ruann Janser Soares de Castro1; Gabriela

Alves Macedo2

1 Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil. 2 Food and Nutrition Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil

* Corresponding author: sampaior.bruna@gmail.com

75

RESUMO

As tanino acil hidrolases, conhecidas como tanases (E.C: 3.1.1.20) são esterases que

hidrolisam ligações éster e ligações depsídicas em substratos como ácido tânico, epicatequina

galato, epigalocatequina galato em meio aquoso, tendo vasta aplicação na indústria de

alimentos. O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante. A aplicação

da tanase pode ser potencializada se for imobilizada, por proporcionar a reutilização das

enzimas, facilitar a separação dos produtos e aumentar a estabilidade em solventes orgânicos,

diminuindo custos e facilitando o uso em reatores. Com o intuito de aumentar a escala

produtiva do processo de biotransformação enzimática do ácido tânico e de polifenóis, este

trabalho teve como objetivo definir as características cinéticas da enzima microencapsulada

em alginato. Além disso, avaliar a sua utilização em biorreator de forma a minimizar uma

possível “lixiviação” das enzimas imobilizadas, aumentando a estabilidade operacional da

mesma, e selecionar as condições mais adequadas para a utilização do biorreator com

matrizes alimentares. Os resultados indicaram que a tanase imobilizada em alginato 5% reteve

86% da sua atividade específica original após 5 ciclos de reutilização, enquanto que a tanase

imobilizada em alginato 3,6% reteve 83%. O planejamento experimental utilizando DCCR

demonstrou os fatores relevantes para utilização do imobilizado em biorreator, e assim o

subsequente estudo univariado permitiu a obtenção das condições mais adequadas para o

processo: tanase imobilizada com alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação,

temperatura de 60ºC e concentração das enzimas microencapsuladas de 0,75%. Os resultados

demonstraram promissor uso industrial destes microencapsulados, podendo ser utilizado em

sistemas alimentares.

Palavras-chave: tanase imobilizada, microencapsulação, biorreator, alginato de sódio.

76

ABSTRACT

The tannin acyl hydrolases, known as tannases (E.C: 3.1.1.20), are esterases that hydrolyse

ester bonds and depsides bonds in substrates such as tannic acid, epicatechin gallate,

epigallocatechin gallate inan aqueous medium, having wide application in the food industry.

The development of immobilization techniques has been important. The tannase application

can be potentiated if immobilized, providing there use of the enzymes, facilitating the

products separation and increasing the stability in organic solvents, reducing costs and

making it easier to use in reactors. In order to increase the productive scale of the enzymatic

biotransformation process of tannic acid and polyphenols, this work aimed to define the

kinetic characteristics of the enzyme microencapsulated in alginate. In addition, evaluate its

use in a bioreactor inorder to minimize a possible "leaching" of the immobilized enzymes,

increasing the operational stabilityof the same, and select the most suitable conditions for the

use of bioreactor with food matrices. The results indicated that 5% alginate immobilized

tannase retained 86% of its original specific activity after 5cycles of reuse, while alginate

immobilized tannase 3.6% retained 83%. The experimental design using DCCR demonstrated

the relevant factors for the use of the immobilized in a bioreactor and the subsequent

univariate study allowed to obtain the most suitable conditions for the process: tannase

immobilized with alginate in the concentration of 5%, 300 rpm of stirring, temperature of

60°C and microencapsulated enzymes concentration of 0.75%. The results showed a

promising industrial use of these microencapsulated and can be used in food systems.

Keywords: immobilized tannase, microencapsulation, bioreactor, sodium alginate.

77

1. Introdução

Tanase (tanino acil hidrolase, EC 3.1.1.20) é uma enzima induzível, que catalisa a

hidrólise de ligações éster e dipeptidase em galotaninos, elagitaninos, taninos complexos e

hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, favorecendo a liberação de glicose e ácido gálico

(RAMÍREZ et al., 2008; RODRÍGUEZ et al., 2009). A literatura traz relatos das suas

consideráveis aplicações para clarificação em vinho, cerveja, sucos de fruta e refrigerantes, na

elaboração de chá instantâneo, assim como síntese de ésteres de ácido gálico usados como

antioxidantes na indústria de alimentos (LEKHA; LONSANE, 1997; AGUILAR;

GUTIERRES-SANCHEZ, 2001; AGUILAR et al., 2007; ARIAN; ANWAR; ARTIKA,

2007). Além disso, tanase é também amplamente utilizada para o tratamento de efluentes

industriais e estudos da última década abordam a aplicação de tanase de Paecilomyces variotii

em chás, analisando a capacidade da enzima em hidrolisar EGCG em epicatequina e ácido

gálico e a atividade antioxidante dos compostos formados (KAR; BANERJEE, 2000;

BATTESTIN; MACEDO; DE FREITAS, 2008).

Os fatores limitantes apresentados pelas enzimas livres são a baixa resistência a

temperaturas elevadas; solubilidade em água, dificultando a separação e reutilização;

incompatibilidade do uso em solventes orgânicos devido ao poder desnaturante de vários

destes; e estarem presentes em baixas concentrações. A fim de ultrapassar ou até mesmo

eliminar alguns, faz com que as enzimas imobilizadas tornem-se bastante atrativas e estimula

o estudo de desenvolvimento de novos métodos analíticos para imobilizar a enzima em uma

matriz adequada (ABDEL-NABY et al., 1999; CHANG et al., 2006; MAHENDRAN;

RAMAN; KIM, 2006; HOTA; DUTTA; BANERJEE, 2007; SHARMA; AGARWAL;

SAXENA, 2008; SRIVASTAVA; KAR, 2010; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al.,

2014). Enzimas imobilizadas são mais fáceis de manipular e separar do produto, minimizando

assim ou eliminando a contaminação do produto pela enzima, como também possibilita alta

densidade celular por unidade de volume do biorreator, levando ao aumento da produtividade,

à diminuição do tempo de reação e à redução dos riscos de contaminação (PRADELLA,

2001; ZHANG; FRANCO, 2002). Através da imobilização é possível obter maior

estabilidade da enzima e menor interferência de compostos indesejáveis (MATEO et al.,

2007; SHELDON, 2007; CAMPANELLA et al., 2008). No entanto, a ideia de reutilização da

enzima implicitamente significa que a estabilidade da preparação de enzima final deve ser

suficientemente elevada para permitir a reutilização. Além disso, tendo em conta que o intuito

do uso final será como catalisador industrial, o processo de imobilização do componente

78

biológico também é uma etapa crucial na construção de um biorreator, pois a escolha da

técnica de imobilização, bem como, do suporte a ser utilizado é de extrema importância para o

bom desempenho deste instrumento, sendo que os processos de imobilização ideais devem

limitar a utilização de reagentes tóxicos ou altamente instáveis e processos muito complexos

(MAHENDRAN; RAMAN; KIM, 2006; MATEO et al., 2007; SHARMA; AGARWAL;

SAXENA, 2008; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al., 2014). Assim, embora existam

centenas de protocolos de imobilização, como os já mencionados neste trabalho, a concepção

de protocolos que permitam melhorar as propriedades da enzima e possam ser utilizados em

maior escala ainda é pouco alcançado e é uma meta que chama atenção .

Adicionalmente, o uso de enzimas relativamente dispendiosas como a tanase requer a

sua recuperação e reutilização para fazer um processo economicamente viável e ampliar a sua

utilização. A utilização de uma enzima imobilizada permite simplificar grandemente a

concepção do biorreator e o controle da reação (CHEETHAM, 1993; KATCHALSKI-

KATZIR, 1993; BICKERSTAFF, 1997). A simples filtração da enzima do meio reacional

possibilita a utilização em qualquer tipo de reator. Assim, a imobilização é geralmente um

requisito para a utilização de uma enzima como um biocatalisador industrial, e é a solução

mais simples para o problema da solubilidade destes interessantes biocatalisadores.

Não foram encontrados dados na literatura sobre as características cinéticas da tanase

de Paecilomyces variotii imobilizada em alginato de cálcio, embora Flores-Maltos et al.

(2011) tenham relatado fatores cinéticos da tanase imobilizada obtida de Apergillus niger. As

propriedades das enzimas imobilizadas são influenciadas tanto pelas propriedades da enzima

como pelo material do suporte, logo, a interação entre esses dois componentes proporciona

um derivado imobilizado com propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas

específicas (TISCHER; KASCHE, 1999; ZANIN; MORAES, 2014). Estes fatores

influenciam no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de

transferência de massa e de reação intrínseca e, portanto, afetam o comportamento da enzima

imobilizada (VILLENEUVE et al., 2000; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO, 2004).

Baseado nos resultados interessantes e promissores do extenso trabalho realizado pelo

grupo de pesquisa, o qual otimizou a imobilização da tanase obtida de Paecilomyces variotii

(SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012), o objetivo deste estudo foi reproduzir o processo

otimizado por SCHONS (2012) a fim de caracterizar a cinética de hidrólise da tanase

microencapsulada em alginato, bem como obter um processo em biorreator em maior escala

que possibilitasse uma boa hidrólise de matizes alimentares e que possa ser futuramente

utilizada em processos industriais.

79

2. Materiais e Métodos

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioquímica de Alimentos

(Departamento de Ciência de Alimentos) e Laboratório de Bioprocessos (Departamento de

Alimentos e Nutrição), localizados na Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP,

Campinas - SP.

2.1 Materiais

Para a microencapsulação de tanase em alginato foi utilizado alginato de sódio (sal

sódico do ácido algínico, viscosidade >25cps) obtido da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA),

assim como o Cloreto de Cálcio utilizado para reticulação do alginato de sódio, ácido tânico,

rodanina e ácido gálico. Também foram utilizados hidróxido de sódio (Merck KGaA,

Darmstadt, Germany), sulfato de amônio (Ecibra, São Paulo, Brasil). Coomassie Brilhante G-

250 obtido da Vetec (Química Fina Ltda, Brasil). A água utilizada em todo o trabalho foi

destilada e deionizada em sistema MilliQ da Millipore e os demais reagentes utilizados foram

de grau analítico.

2.2 Produção e imobilização da tanase

A tannase de Paecilomyces variotii foi produzida de acordo com procedimento

previamente publicado por Battestin e Macedo (2007). O meio de fermentação para produção

da enzima continha 20 g de farelo de trigo, 20 mL de água destilada e 10% de ácido tânico (p

/ p). Neste meio foi adicionado a suspensão de esporos (2,5 mL) do Paecilomyces variotii

contendo 1,6 X 107 esporos/mL. Após fermentação, extração e filtração, a tanase foi

parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônio (80% de saturação) e

dialisada, eliminando algumas impurezas. O extrato de tanase semipurificado foi congelado à

-18°C para posteriormente ser liofilizado e imobilizado.

A imobilização da tanase utilizando alginato de sódio foi feita seguindo técnica já

otimizada com algumas modificações (SCHONS, 2012) na utilização do alginato de sódio

com viscosidade >25cps e inclusão de maiores concentrações de alginato. Logo, nessa fase do

processo foi utilizado 15 mL de alginato de sódio, homogeinizados por 1 hora a 200rpm,

foram misturados com 54 mg de extrato semi-purificado de tanase de P. variotii (3,6mg de

80

tanase/mL de alginato) em temperatura ambiente. Em seguida a suspensão foi gotejada, a uma

altura de 10 cm, em 90 mL de solução de cloreto de cálcio (CaCl2, 0,1M), com o auxílio de

uma bomba peristáltica. Após o gotejamento as cápsulas permaneceram em repouso, sob-

refrigeração (7ºC), na solução de CaCl2 durante 6h obtendo-se pérolas de alginato de cálcio de

aproximadamente 20mm de diâmetro. As pérolas foram peneiradas e lavadas sucessivamente

com 200 mL de água destilada a 10 ºC para remoção do excesso de íons cálcio e da enzima

não ligada. Na Figura 2.1 está ilustrado as enzimas imobilizadas obtidas. Amostras controle

foram obtidas pelo gotejamento da solução de alginato, sem a adição de enzima, no cloreto de

cálcio. As características cinéticas da enzima imobilizada foram determinadas utilizando

condições determinadas por Schons (2012) e a enzima imobilizada em pequenos volumes de

reação.

Figura 2.1 Imobilização de tanase por encapsulação em alginato de sódio.

2.3 Determinação da atividade enzimática e eficiência de imobilização

Foi avaliada através do método definido por Sharma; Bhat; Dawra (2000) com

algumas modificações: utilização do ácido tânico em tampão acetato como substrato em

substituição ao metil galato em tampão citrato; e utilização da temperatura ótima, 60ºC para

enzima imobilizada e 40ºC para enzima livre (SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012). O

método tem como princípio avaliar a capacidade da enzima em produzir ácido gálico a partir

da hidrólise de ácido tânico. O ensaio é colorimétrico mensurando a formação de um

81

complexo entre a rodanina e o ácido gálico formado na reação de hidrólise enzimática pela

enzima imobilizada com absorção máxima a 520 nm. A concentração de ácido gálico foi

definida através de uma curva de calibração de ácido gálico em tampão fosfato 0,02M pH 5,5.

A partir da concentração de produto no meio reacional a atividade enzimática foi expressa

como U, considerando-se 1U como a quantidade de enzima que libera um µmol de ácido

gálico/min/mL do meio reacional de ácido tânico. A atividade específica foi expressa através

do número de unidade de enzimas por miligrama de proteína (U/mg de proteína).

A porcentagem de atividade enzimática (%AE) da tanase imobilizada foi expressa em

relação à atividade específica da tanase livre como mostrado na equação 1.

𝑨𝑬 (%) =𝒂𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒏𝒂𝒔𝒆 𝒊𝒎𝒐𝒃𝒊𝒍𝒊𝒛𝒂𝒅𝒂

𝒂𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒏𝒂𝒔𝒆 𝒍𝒊𝒗𝒓𝒆 𝑿 𝟏𝟎𝟎

(Equação 1)

A determinação da porcentagem da eficiência de imobilização de tanase de

Paecilomyces variotii foi realizada mensurando a concentração de proteína na solução de

cloreto de cálcio após o tempo de cura (BRADFORD, 1976). Retirou-se alíquota de 100µL da

solução contendo a enzima que não foi imobilizada e adicionou-se 2,5mL do reagente de

Bradford. Agitou-se e mediu-se a absorbância após 5 minutos em espectrofotômetro a 595nm.

A porcentagem da eficiência de imobilização foi determinada pela equação 2.

𝑬𝑰 % = 𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 𝒆𝒏𝒄𝒂𝒑𝒔𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 𝒆𝒎𝒑𝒓𝒆𝒈𝒂𝒅𝒂 ×𝟏𝟎𝟎

(Equação 2)

2.4 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd

Para calcular as constantes cinéticas, os dados foram representados graficamente a

partir da determinação da taxa de reação com concentrações de substrato variando de 0,1 à

1g/L e ensaiados sob condições padronizadas (pH 5,5, 40ºC para a enzima livre, e pH 5,5,

60°C para a enzima imobilizada (SCHONS et al., 2011)) e assim com esses dados foi obtida a

equação de Michaelis-Menten. Os cálculos de Km e Vmáx da enzima imobilizada foram

realizados utilizando o método de transformação linear de Lineweaver e Burk (1934). As

82

constantes de inativação térmica (kd) foram determinadas plotando um gráfico ln A (atividade

enzimática) versus tempo sendo que os coeficientes angulares de cada curva foram as

constantes de inativação (kd). A meia-vida aparente (t½) das partículas de tanase imobilizada,

definido como o tempo em que a atividade residual chega a 50% do seu valor inicial, foi

estimada conforme a equação 3:

𝐭½ =𝐥𝐧(𝟎,𝟓)−𝑲𝒅

(Equação 3)

2.5 Estabilidade operacional e preservação da atividade durante armazenamento

O estudo da estabilidade operacional através da tanase imobilizada foi realizado pela

hidrólise do ácido tânico em regime de bateladas consecutivas fazendo o reuso das partículas

de tanase imobilizada. O poder catalítico da tanase imobilizada foi determinado pela hidrólise

do ácido tânico conforme descrito no item 2.3 após cada batelada de duração de 30 minutos.

Nesse processo também foi verificado possível fuga da enzima para o meio. A tanase

imobilizada foi removida do meio por filtração, lavada e reutilizada na reação de hidrólise do

ácido tânico, este procedimento foi feito todos os dias até o sexto reuso, baseado nos

resultados de Shons (2012).

Em paralelo foi avaliado a estabilidade da enzima imobilizada frente ao tempo de

armazenamento. A preservação da atividade foi medida armazenando a enzima à temperaturas

de refrigeração, embalando-as em placas de petri cobertas por filme plástico e então,

analisando suas atividade a cada 15 dias por 90 dias, pois .

2.6 Estudo da hidrólise de ácido tânico em biorreator pela tanase imobilizada em

alginato por meio de planejamento de experimentos.

2.6.1 Biorreator utilizado

Biorreator de vidro, operando em batelada, no modo mistura, foi utilizado para avaliar

as condições da hidrólise de ácido tânico e resistência física média das esferas de alginato. Foi

constituído por um béquer e o sistema de agitação mostrado na Figura 2.2 (apenas

esquemático). Este sistema foi projetado para minimizar a fragmentação das partículas

83

imobilizadas, sendo então encamisados e a manutenção da temperatura por uma chapa de

aquecimento (Figura 2.3).

Figura 2.2 Modelo esquemático do biorreator testado: Esquema de operação de um biorreator de mistura perfeita. A cesta contendo a enzima é representada pela estrutura fixada em b, Ci é a concentração de substrato, VR é o volume do biorreator e A é o sistema de agitação magnética.

Figura 2.3 Ilustração do biorreator utilizado.

84

2.6.2 Delineamento composto central rotacional

Após os estudos realizados com a tanase imobilizada em alginato de sódio para

caracterização da cinética enzimática, os parâmetros de hidrólise do ácido tânico em

biorreator de mistura foram avaliados utilizando um delineamento composto central

rotacional (DCCR). O DCCR foi composto por 16 pontos fatoriais (p.f.), 8 pontos axiais (p.a.)

e 4 pontos centrais (p.c.) totalizando 28 ensaios (24 p.f. + 8 p.a. + 4 p.c. = 28). As quatro

variáveis independentes em estudo foram: concentração de alginato, temperatura,

concentração enzimática (expressa em porcentagem de imobilizado em relação ao volume de

substrato), e frequência de agitação (expressa em rpm) no tempo de 30, 60 e 90 minutos. As

variáveis dependentes (respostas) foram atividade enzimática da tanase e eficiência da

imobilização (calculada utilizando a equação 2). As variáveis e os níveis em estudo estão

descritos na Tabela 2.1. e a matriz do delineamento experimental contendo todos os ensaios e

os valores reais utilizados está apresentada na Tabela 2.2.

Tabela 2.1 Variáveis e níveis utilizados.

Variáveis Níveis

-α* -1 0 +1 +α*

Alginato (%) 2,9 3,6 4,3 5 5,7

Temperatura (ºC) 30 40 50 60 70

Enzima (%) 0,05 0,5 1 1,5 2

Agitação (rpm) 300 400 500 600 700

*α = 1,41

Após avaliar os efeitos das variáveis independentes, a hidrólise do ácido tânico pela

tanase imobilizada em alginato de cálcio foi estudada através da combinação dos efeitos

significativos utilizando ensaios univariados, quando as condições selecionadas foram:

concentração de alginato de 5%; agitação de 300rpm; temperatura de 60ºC e tempo de reação

de 60 minutos.

85

Tabela 2.2 Matriz do delineamento contendo valores decodificados e codificados (entre parênteses) das variáveis. Ensaios Alginato (%) Temperatura (ºC) Enzima (%) Agitação (rpm)

1 3,6 (-1) 40 (-1) 0,5 (-1) 400(-1) 2 3,6 (-1) 40 (-1) 0,5 (-1) 600 (+1) 3 3,6 (-1) 40 (-1) 1,5 (+1) 400 (-1) 4 3,6 (-1) 40 (-1) 1,5 (+1) 600 (+1) 5 3,6 (-1) 60 (+1) 0,5 (-1) 400 (-1) 6 3,6 (-1) 60 (+1) 0,5 (-1) 600 (+1) 7 3,6 (-1) 60 (+1) 1,5 (+1) 400 (-1) 8 3,6 (-1) 60 (+1) 1,5 (+1) 600 (+1) 9 5 (+1) 40 (-1) 0,5 (-1) 400 (-1)

10 5 (+1) 40 (-1) 0,5 (-1) 600 (+1) 1 5 (+1) 40 (-1) 1,5 (+1) 400 (-1)

12 5 (+1) 40 (-1) 1,5 (+1) 600 (+1) 13 5 (+1) 60 (+1) 0,5 (-1) 400 (-1) 14 5 (+1) 60 (+1) 0,5 (-1) 600 (+1) 15 5 (+1) 60 (+1) 1,5 (+1) 400 (-1) 16 5 (+1) 60 (+1) 1,5 (+1) 600 (+1) 17 2,9 (-α) 50 (0) 1 (0) 500 (0) 18 5,7 (+α) 50 (0) 1 (0) 500 (0) 19 4,3 (0) 30 (-α) 1 (0) 500 (0) 20 4,3 (0) 70 (+α) 1 (0) 500 (0) 21 4,3 (0) 50 (0) 0,05 (-α) 500 (0) 22 4,3 (0) 50 (0) 2 (+α) 500 (0) 23 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 300 (-α) 24 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 700 (+α) 25 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0) 26 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0) 27 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0) 28 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0)

2.6.3 Planejamento univariado

Os novos ensaios foram conduzidos em triplicata a partir de cinco concentrações de

enzima, sendo que os níveis das variáveis anteriormente analisadas foram fixados. Foi

utilizada a concentração de alginato de sódio de 5%, temperatura de 60ºC e agitação de

300rpm. A variação da concentração da enzima imobilizada no meio reacional foi o fator

estudado. Foram utilizadas as concentrações de 0,1%; 0,25%; 0,5%; 0,75% e 1%. Em todos

os ciclos de hidrólise a reação foi paralisada em banho de gelo a fim de garantir que possíveis

resíduos que fossem transferidos para o meio não superestimassem os resultados.

86

2.7 Análise Estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada através de software STATISTICA,

utilizando-se Experimental Design.

3. Resultados e Discussão

3.1 Atividade Enzimática e Eficiência de imobilização

Durante testes preliminares de imobilização foi verificado que reações ultrapassando 3

horas de reação provocavam a ruptura das cápsulas de alginato. A fim de elevar a vida útil,

minimizando a fragmentação das partículas imobilizadas, a imobilização da enzima em

alginato de sódio 5%foi incluída no estudo.

As partículas de alginato produzidas através da encapsulação foram caracterizadas em

termos da eficiência da imobilização (%EI), que avalia o potencial da técnica em manter a

enzima imobilizada; atividade enzimática e % da atividade enzimática (%AE) que reproduz a

atividade da enzima livre que foi mantida no sistema (Figura 3.1 e Figura 3.2). Os resultados

mostram que houve a imobilização da enzima com melhor %EI e valores muito próximos ao

%AE encontrados por Schons (2012).

Figura 3.1 Atividade enzimática da tanase imobilizada e livre. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

3,6%alginato 5%alginato enzimalivre

Atividad

een

zimática(U)

a

bc

87

Para a determinação da atividade foi utilizado o princípio estabelecido por Sharma et

al. (2000) que avalia a quantidade de produto formado e Schons (2012) estabeleceu a

atividade enzimática através da mensuração quantitativa do substrato após a reação

(MONDAL et al., 2001). Ainda que tenha sido utilizado princípios de métodos diferentes para

a avaliação da atividade enzimática percebeu-se que o método otimizado por Schons (2012)

pode ser reproduzido.

Figura 3.2 Resultados da avaliação da porcentagem de atividade imobilizada e eficiência de imobilização. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste t (p<0,01).

A imobilização por encapsulação através de gelificação iônica em alginato de sódio

forma uma membrana porosa em torno da enzima que é capaz de controlar o tamanho das

moléculas que entram e saem das células. Em outras palavras, a preservação da enzima no

encapsulado e a %AE estão altamente relacionadas com as características do agente de

encapsulação. As proteínas por apresentarem alta massa molecular ficam mantidas no interior

da cápsula, já substratos desta enzima, bem como os produtos desta hidrólise podem passar

livremente pelos poros da membrana, ou seja, as massas moleculares do substrato enzimático

e do produto formado estão diretamente relacionadas à limitação difusional e ao impedimento

esteárico do sítio ativo da enzima. Ainda que a maior concentração de alginato de sódio tenha

apresentado maior aprisionamento da enzima, isso não foi convertido em %AE,

possívelmente devido à limitação difusional do substrato pela cápsula. Os alginatos são

heteropolímeros lineares de ácidos carboxílicos compostos de subunidades monoméricas de

β-D-ácido manurônico (M) e α-L-ácido gulurônico (G) interligados por ligações 1,4-

glicosídicas. Estes monômeros podem ser organizados em cadeias consecutivas de resíduos G

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

%AtividadeImobilizada %EficiênciadeImobilização

3,6%alginato

5%alginato

3,6%alginato(Schons,2012)aa

b

a

88

(G)n, de resíduos M (M)n, ou alternando resíduos M e G (MG)n. Diferenças na relação M/G

impactam na configuração molecular e consequentemente na funcionalidade, viscosidade,

capacidade e força de geleificação (KLEIN; STOCK; VORLOP, 1983; ERTESVÅG;

VALLA, 1998; CHAN; LEE; HENG, 2002) o que pode ter impactado na %EI deste estudo,

uma vez que o alginato utilizado possui maior viscosidade (>25cps) que o utilizado por

Schons (2012) (25cps).

Alginatos contendo maiores concentrações de resíduos GG formam géis mais rígidos e

resistentes. Os resíduos M também formam ligações intermoleculares, apesar de mais fracos,

mais macios e mais elásticos. Ou seja, quanto maior o conteúdo de blocos G, maior é o

potencial de formação de gel e maior é sua força (LIU et al., 2004). Sabe-se que os íons cálcio

têm mais afinidade por resíduos G (SHILPA; AGRAWAL; RAY, 2003) formando uma rede

polimérica mais rígida, logo essa interação pode ter influenciado nos diferentes imobilizados.

As configurações espaciais que os blocos M e G adotam, juntamente com a proporção,

distribuição e comprimento destes blocos, determinam as propriedades físicas e químicas do

alginato (SMIDSRØD, 1974). Outro fator que deve ser avaliado é a homogeneização do

alginato em água, quando há melhor homogeneização facilita as interações eletrostáticas entre

o polímero de alginato e a enzima a ser encapsulada e entre o alginato e os íons cálcio.

Foi observado (dados não apresentados) que há baixa dispersão em água se o alginato

for adicionado muito rapidamente, formando grumos sem hidratação completa e que

consequentemente prejudicam a interação dos resíduos de alginato com os íos cálcio. Além

disso, estudos anteriores demonstraram que a capacidade de retenção de proteínas em

matrizes de alginato era maior com o aumento da concentração do polímero

(VANDENBERG et al., 2001).

3.2 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd

A caracterização desses parâmetros é importante para avaliar o potencial

biotecnológico do catalizador. O estudo das propriedades cinéticas pode ser utilizado para

direcionar a aplicação destas enzimas em processos industriais, dando suporte para manter o

nível desejado de atividade. Km e Vmáx foram calculados a partir dos gráficos de

Lineweaver-Burk (Figura 3.3 e Figura 3.4) e estão apresentados na Tabela 3.1.

89

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos para hidrólise de ácido tânico pela tanase livre e imobilizada, produzidas por Paecilomyces variotii. Enzima Km (µmol) Vmáx (U.mg-1)

Ezima livre 0,6 3,17

Imobilizada - alginato 3,6% 1,02 0,78

Imobilizada - alginato 5% 3,23 1,15

O valor de Km de uma enzima fornece uma indicação da força de ligação entre a

enzima ao seu substrato, assim, um Km baixo indica uma maior afinidade para o substrato

(MOTTA, 2006). O Vmáx pode ser definido como a produção máxima com a quantidade total

de enzima participando da reação. Esta medição é teórica e tem um valor aproximado de um

determinado momento, uma vez que exigiria que todas as moléculas de enzima estivessem

ligadas firmemente aos seus substratos (LINEWEAVER; BURK, 1934; BERG;

TYMOCZKO; STRYER, 2002; MOTTA, 2006).

Figura 3.3 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais para a tanase livre.

Nos dois casos de enzima imobilizada, os valores de Km foram maiores do que o valor

de Km da enzima livre, para 3,6% alginato foi 1,7 vezes superior e 5% alginato foi 5,4 vezes.

Este aumento de Km implica a utilização de maior concentração de substrato para atingir a

y=0.1903x+0.3158R²=0.97124

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

1/v

1/[S]

90

mesma taxa de reação obtida com as enzimas livres. O incremento em Km pode ser devido os

efeitos de transferência de massa, onde a resistência influencia o transporte de substrato a

partir de uma solução para o sítio catalítico e também a difusão dos produtos da reação de

volta para a solução. Por outro lado, a fixação da enzima na matriz de imobilização pode levar

a uma diminuição na flexibilidade da molécula de enzima como também pode levar à

mudanças conformacionais na sua estrutura terciária que resultam na dificuldade de acesso do

substrato ao seu sitio ativo, que são normalmente refletida na diminuição da atividade

catalítica (CAO, 2005), fator que também pode explicar o valor da Vmax da enzima

imobilizada mostrar-se inferior à livre. Resultados semelhantes no Vmáx e Km para enzimas

imobilizadas foram reportados por Bayramoğlu et al. (2008); El-tanash; Sherief e Nour (2011)

e Flores-maltos et al. (2011). No entanto analisando a diferença entre as diferentes tanases

imobilizadas, percebe-se que embora 5% alginato tenha sido negativo para a resistência do

substrato a matriz, possivelmente por sua estrutura mais rígida, este não afetou tão

intensamente a conformação da enzima apresentando melhores valores de Vmáx que a reação

que utilizou 3,6% de alginato.

Figura 3.4 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais da tanase imobilizada em duas concentrações: 3,6% e 5%

O tempo de meia vida e a constante de inativação da tanase admitindo duas

temperaturas, 40ºC temperatura ótima da tanase livre e 60ºC temperatura ótima da tanase

y=1.3072x+1.2845R²=0.95183

y=2.8249x+0.872R²=0.95166

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

1/v

1/[S]

alginato3,6%

alginato5%

91

imobilizada, estão demonstrados na Tabela 3.2. Pode-se notar que a atividade enzimática

manteve-se mais estável na menor temperatura, 40ºC.

Tabela 3.2 Parâmetros cinéticos obtidos para o processo de inativação da tanase. Temperatura Enzima livre Enzima imobilizada –

alginato 3,6%

Enzima imobilizada -

alginato 5%

Kd (h-1) t ½ (h) Kd (h-1) t ½ (h) Kd (h-1) t ½ (h)

40ºC 0,91 0,76 0,4 1,75 0,39 1,78

60ºC 1,35 0,51 0,57 1,21 0,5 1,48

O tempo de meia-vida (t½) de uma enzima, em determinada temperatura, é o tempo

que leva para a atividade desta enzima reduzir à metade de sua atividade original / inicial.

Valores mais elevados destes parâmetros são importantes e desejáveis para aplicações

industriais, pois indica a resistência da enzima à inativação térmica. O processo de

imobilização aumentou os valores de tempo de meia vida para as temperaturas estudadas,

demonstrando que o processo aumenta a estabilidade térmica relativa a enzima livre. A

enzima imobilizada com alginato 5% apresentou ligeiramente maior resistência térmica

quando em comparação com a enzima imobilizada em alginato 3,6%. É importante destacar

que essa diferença foi mais perceptível quando avaliado à temperatura ótima para a atividade

de tanase imobilizada em alginato (60°C), apresentando valor de t ½ estimado em 1,21h e

1,48h, respectivamente. Observou-se que a constante de desnaturação (Kd) aumentou com o

aumento da temperatura para todas as tanases. Através dos dados apresentados observou-se

que o valor para essa constante é inversamente proporcional a estabilidade da enzima, ou seja,

quanto menor o valor de Kd maior é a estabilidade da enzima. Seguindo esta afirmação,

enquanto os valores de Kd foram de 0,91 h-1 a 40 ° C e 1,35 h-1 a 60 ° C para a enzima livre,

para as enzimas imobilizadas variaram entre 0,39 h-1 e 0,4 h-1 a 40 ° C e 0,5 h-1 e 0,57 a 60 ° C,

para a concentração de 5% e 3,6%, respectivamente. EL-Tanash et al. (2011) estudaram a

cinética de desnaturação térmica de uma tanase de Aspergillus aculeatus imobilizada em

gelatina com reticulante glutaraldeído e obtiveram tempo de meia-vida de 312,3; 47,4 e 27,5

min a 60, 70 e 80 ° C, respectivamente.

Todas as afirmações apresentadas quanto a cinética demonstram que as propriedades

das enzimas imobilizadas são influenciadas tanto pelas propriedades intrínsecas da enzima

como pelo agente de encapsulação. Se, por um lado, o suporte pode aumentar o tempo de

meia-vida da enzima imobilizada, por outro, uma escolha imprudente pode afetar

92

adversamente não só o tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema (YAHYA;

ANDERSON; MOO-YOUNG, 1998; TISCHER, 1999). Isso demonstra a importância do

conhecimento da técnica de imobilização e das características do imobilizado para melhorar o

seu uso como catalizador de reações.

3.3 Estabilidade operacional e preservação durante armazenamento

A estabilidade operacional da tanase imobilizada é o fator que afeta a liberação de

ácido gálico na bioconversão de taninos em processos sequencias afetando diretamente suas

possíveis aplicações industriais em alimentos, bebidas e sucos. A estabilidade operacional da

tanase imobilizada foi avaliada em processos descontínuos repetidos. Depois de cada

batelada, a tanase imobilizada foi lavada e reutilizada em condições ótimas para a reação. A

porcentagem de atividade residual foi determinada para 6 bateladas sequênciais. Conforme

Shons (2012) o procedimento otimizado permite a reutilização da tanase imobilizada em

alginato de sódio por até 5 ciclos, mantendo 60% de sua atividade catalítica. Já os resultados

da Figura 3.5 indicam que neste trabalho a tanase imobilizada em alginato 5% reteve 86% da

sua atividade específica original após 5 ciclos, enquanto que tanase imobilizada em alginato

3,6% reteve 83%, confirmando promissor uso industrial destes imobilizados.

Figura 3.5 Estabilidade operacional na reutilização da tanase imobilizada em alginato em ciclos sucessivos. Os valores representam a média ± desvio padrão. * = diferem estatisticamente pelo teste t (p<0,05).

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

Atividaderesid

ual(%)

Ciclosdereutilização

Alginato5%

Alginato3,6%

** *

93

Resultados semelhantes foram encontrados com tanase de Aspergilus niger em

microencapsulados de alginato de sódio que foram usados repetidamente durante 7 ciclos com

77% eficiência (SRIVASTAVA; KAR, 2010). Na Tabela 3.3 podemos observar os resultados

de atividade específica e a eficiência relativa do imobilizado, que mediu a capacidade da

cápsula em manter a enzima imobilizada após os ciclos sucessivos de hidrólise, medida

através da mensuração da proteína residual no meio de reação.

Tabela 3.3 Avaliação da atividade específica e eficiência relativa após 6 ciclos de hidrólise com tanase imobilizada em 2 concentrações de alginato.

Concentração de alginato

Alginato 3,6% Alginato 5%

Eficiência

inicial (%) 56,38 70,65

Atividade específica

(U/g proteína)

Eficiência

relativa (%)

Atividade específica

(U/g proteína)

Eficiência

relativa (%)

1 0,49 98,55 0,57 98,81

2 0,49 98,55 0,59 96,42

3 0,46 94,1 0,56 95,2

4 0,42 84,00 0,52 89,7

5 0,41 65,00 0,51 68,3

6 0,38 52,00 0,48 57,3

A partir desse parâmetro podemos observar que o método mesmo após 6 bateladas não

teve perda acima de 50%. Supõe-se que essa perda de proteína para o meio seja devido à

desestabilização do imobilizado que ocorre ao passo que a solução pode conter substâncias

sequestradoras de cátions como fosfatos, que sequestram o íon Ca+2 desestabilizando a

configuração do gel de alginato (KING, 1983). O último parâmetro de caracterização

analisado, mas não menos importante, é o tempo de vida útil e durabilidade frente às

condições de armazenamento que devem ser considerados quando se quer desenvolver um

imobilizado enzimático. Normalmente as enzimas imobilizadas mantêm sua atividade em

condições de estocagem quando não são expostas a condições adversas de pH e temperatura

(GÓMEZ et al., 2006). As enzimas foram estocadas em placas de petri, embaladas em filme

plástico de pvc e armazenadas a 5ºC. A determinação da atividade da tanase imobilizada

durante o processo do armazenamento pode ser observado na Tabela 3.4.

94

Foi verificado que após 60 dias de estocagem a atividade hidrolítica da tanase

imobilizada manteve-se estável, apresentando valores de atividade relativa (comparado à

atividade inicial) superior à 84%. Quando comparada a tanase imobilizada estudada por

Srivastava e Kar (2010), que reteve 71,7% da atividade enzimática após 60 dias, pode-se

observar que o procedimento de imobilização desta enzima teve melhor resistência ao

armazenamento, mantendo por mais tempo a atividade hidrolítica da enzima.

Tabela 3.4 Estabilidade da atividade da enzima imobilizada durante o processo de armazenagem. Dias Alginato 3,6% Alginato 5%

Ativ. Específica Ativ. Relativa Ativ. Específica Ativ. Relativa

0 0,49 100 % 0,57 100%

15 0,5 100% 0,55 96%

30 0,46 93% 0,54 95%

60 0,42 85% 0,5 88%

90 0,29 60% 0,36 63%

3.4 Estudo da otimização da hidrólise de ácido tânico por delineamento composto

central rotacional

3.4.1 Delineamento composto central rotacional

Para a avaliação do comportamento do complexo enzimático em um biorreator, vários

parâmetros físicos e químicos, relacionados entre si ou não, podem influenciar na resposta

enzimática. Ainda que a resposta de maior relevância seja a atividade enzimática, uma vez

que somente manter imobilizada a enzima sem que ela retenha atividade catalítica não é

interessante industrialmente, a eficiência relativa (ER) (%) foi também avaliada. No intuito de

verificar as condições mais adequadas para manutenção da atividade enzimática sem

prejudicar a ER do imobilizado, o delineamento composto central rotacional avaliou os efeitos

de 4 variáveis do processo de hidrólise do ácido tânico pela enzima tanase imobilizada em

alginato: concentração de alginato (%), concentração de enzima na reação (%), agitação (rpm)

e temperatura (ºC). Os valores de atividade enzimática e eficiência relativa da imobilização,

foram determinados nos tempos de 30, 60 e 90 minutos, encontram-se na Tabela 3.5 com os

valores decodificados das variáveis independentes.

95

Tabela 3.5 Delineamento composto central rotacional para estudo do efeito das variáveis temperatura, concentração de enzima, concentração de alginato e agitação na atividade enzimática utilizando tanase imobilizada em processo em batelada. Nº de

ensaios

Alginato

(%)

Temp

(ºC)

Enzima

(%)

Agitação

(rpm)

AE ER AE ER AE ER

30 minutos 60 minutos 90 minutos

1 3,6 40 0,5 400 0,37 98,0 1,35 97,7 0,68 96,9

2 3,6 40 0,5 600 0,38 97,7 1,49 97,4 0,69 97,1

3 3,6 40 1,5 400 0,14 97,6 0,52 97,2 0,26 96,9

4 3,6 40 1,5 600 0,18 97,2 0,66 96,5 0,38 96,3

5 3,6 60 0,5 400 0,47 98,1 2,04 97,4 1,16 97,2

6 3,6 60 0,5 600 0,50 98,5 2,18 97,7 1,19 96,9

7 3,6 60 1,5 400 0,30 97,7 1,01 97,2 0,54 96,9

8 3,6 60 1,5 600 0,32 97,1 1,21 96,5 0,65 95,7

9 5 40 0,5 400 0,47 98,9 2,11 98,4 1,18 97,8

10 5 40 0,5 600 0,51 98,5 2,32 98,0 1,21 97,8

11 5 40 1,5 400 0,21 98,3 0,63 97,8 0,28 97,3

12 5 40 1,5 600 0,20 97,9 0,69 97,5 0,39 96,9

13 5 60 0,5 400 0,53 98,8 2,85 98,2 1,32 97,7

14 5 60 0,5 600 0,57 98,5 3,05 98,0 1,47 97,3

15 5 60 1,5 400 0,27 98,2 1,06 97,6 0,54 97,3

16 5 60 1,5 600 0,32 97,7 1,41 97,2 0,68 96,8

17 2,9 50 1 500 0,54 54,4 2,52 54,2 1,38 51,1

18 5,7 50 1 500 0,25 99,5 1,05 99,1 0,53 98,8

19 4,3 30 1 500 0,16 98,2 0,66 97,5 0,37 97,1

20 4,3 70 1 500 0,41 97,7 2,26 97,3 1,25 96,6

21 4,3 50 0,05 500 0,36 98,4 1,34 98,0 0,71 97,1

22 4,3 50 2 500 0,26 97,8 1,04 97,2 0,54 96,8

23 4,3 50 1 300 0,25 98,1 0,92 97,5 0,41 96,8

24 4,3 50 1 700 0,36 97,9 1,15 97,5 0,54 96,8

25 4,3 50 1 500 0,25 97,9 0,87 97,6 0,62 97,0

26 4,3 50 1 500 0,38 98,1 1,24 97,5 0,64 97,1

27 4,3 50 1 500 0,49 98,0 1,62 97,7 0,68 97,0

28 4,3 50 1 500 0,27 98,0 0,81 97,6 0,50 97,0

AE (U/mg de proteína); Eficiência Relativa (% proteína mantida)

As análises estatísticas comprovaram que para a atividade enzimática apenas os

termos lineares de concentração de enzima e temperatura foram estatisticamente significativos

96

(p-valor < 0,05) (Tabela 3.6). A avaliação destes parâmetros mostrou que, dentro dos

intervalos avaliados, é possível o uso de qualquer concentração de alginato e agitação sem

comprometer negativamente a relação atividade enzimática/produto.

Além disso, pelos coeficientes não significativos das interações entre as variáveis

(p menor que o nível de significância α = 0,05) pode-se estimar que de forma geral o efeito

dos parâmetros operacionais e suas interações na atividade enzimática não são dependentes

para a resposta da atividade enzimática no biorreator dentro da faixa estudada. Logo, para

obter informações mais concisas das reações enzimáticas em biorreator, foram analisados os

resultados deste planejamento e fixados parâmetros para dar sequência ao estudo utilizando

ensaios univariados avaliando a concentração de enzima na reação.

Tabela 3.6 Coeficientes de regressão do DCCR para determinação da atividade enzimática após 30, 60 e 90 minutos de reação. Coficientes Erro Padrão T(14) P Tempo de reação 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’

Média 0,349 1,133 0,61 0,06 0,284 0,140 6,27 3,987 4,356 0,008 0,001 0,001

Alginato (L) -0,007 0,030 -0,008 0,023 0,116 0,057 -0,31 0,255 -0,131 0,771 0,802 0,898

Alginato (Q) 0,017 0,191 0,098 0,023 0,116 0,057 0,746 1,643 1,720 0,510 0,124 0,109

Temp(L) 0,054 0,343* 0,177* 0,023 0,116* 0,057 2,398 2,955* 3,090 0,096 0,011* 0,009*

Temp (Q) -0,009 0,110 0,062 0,023 0,116 0,057 -0,401 0,948 1,086 0,715 0,360 0,297

Enzima(L) -0,086* -0,45* -0,23* 0,023* 0,116* 0,057* -3,8* -3,88* -4,023 0,032* 0,002* 0,001*

Enzima (Q) -0,004 0,041 0,016 0,023 0,116 0,057 -0,18 0,357 0,277 0,867 0,727 0,786

Agitação (L) 0,018 0,080 0,04 0,023 0,116 0,057 0,809 0,688 0,7 0,478 0,503 0,496

Agitação (Q) -0,005 0,003 -0,022 0,023 0,116 0,057 -0,239 0,027 -0,379 0,827 0,978 0,711

AlgXTemp -0,014 0,013 -0,036 0,028 0,142 0,070 -0,522 0,093 -0,518 0,638 0,928 0,613

AlgXEnzima -0,019 -0,180 -0,088 0,028 0,142 0,070 -0,674 -1,265 -1,250 0,549 0,228 0,233

AlgXAgit 0,0002 0,013 0,01 0,028 0,142 0,070 0,009 0,094 0,143 0,993 0,927 0,889

TempXConc 0,009 -0,042 -0,018 0,028 0,142 0,070 0,330 -0,293 -0,250 0,763 0,774 0,806

TempXAgit 0,004 0,021 0,010 0,028 0,142 0,070 0,14 0,149 0,143 0,899 0,884 0,889

ConcXAgit -0,002 0,005 0,016 0,028 0,142 0,070 -0,066 0,033 0,232 0,952 0,974 0,820

*valores significativos a um intervalo de confiança de 95%.

Os valores destacados são significativos a um intervalo de confiança de 95%,

constatando que, quase em sua totalidade, os parâmetros estudados não foram significativos.

A partir das variáveis significativas, efetuou-se análise de variância (ANOVA) obtendo como

R2 o valor de 0,41 (30 minutos), 0,56 (60 minutos) e 0,46 (90 minutos), indicando assim que,

respectivamente, apenas 41%, 56% e 46% da variabilidade na resposta podem ser explicadas

pelo modelo. Este valor é considerado insatisfatório para obtenção de um modelo válido e útil

para fins preditivos.

97

Foi mensurado o teor de proteína nos meios de reação para verificação do

comportamento de fuga (Eficiência Relativa) e os dados estão apresentados na Tabela 3.7

apenas a concentração de alginato foi significativa nessa resposta.

Tabela 3.7 Coeficientes de regressão do DCCR 24 para Eficiência Relativa de imobilização após 30, 60 e 90 minutos de reação. Coficientes Erro Padrão T(14) P

Tempo de reação

30’ 60’ 90 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’

Média 98,02 97,58 97,01 3,91 3,88 4,14 25,1 25,15 23,45 0,00 0,00 0,00

Alginato (L)* 3,95 3,95 4,19 1,59 1,58 1,69 2,48 2,49 2,48 0,03 0,03 0,03

Alginato (Q)* -4,38 -4,36 -4,58 1,59 1,58 1,69 -2,75 -2,75 -2,71 0,02 0,02 0,02

Temp(L) -0,02 -0,06 -0,10 1,59 1,58 1,69 -0,01 -0,04 -0,06 0,99 0,97 0,96

Temp (Q) 0,86 0,82 0,91 1,59 1,58 1,69 0,54 0,52 0,54 0,60 0,61 0,60

Enzima(L) -0,28 -0,29 -0,23 1,59 1,58 1,69 -0,17 -0,18 -0,14 0,87 0,86 0,89

Enzima (Q) 0,90 0,88 0,92 1,59 1,58 1,69 0,56 0,55 0,55 0,58 0,59 0,59

Agitação (L) -0,12 -0,11 -0,13 1,59 1,58 1,69 -0,08 -0,07 -0,08 0,94 0,94 0,94

Agitação (Q) 0,89 0,85 0,89 1,59 1,58 1,69 0,56 0,54 0,53 0,59 0,60 0,61

AlgXTemp -0,08 -0,04 -0,02 1,95 1,94 2,07 -0,04 -0,02 -0,01 0,97 0,98 0,99

AlgXEnzima 0,01 0,01 0,00 1,95 1,94 2,07 0,01 0,01 0,00 1,00 0,99 1,00

AlgXAgit -0,03 0,01 0,04 1,95 1,94 2,07 -0,02 0,00 0,02 0,99 1,00 0,99

TempXConc -0,05 -0,02 -0,01 1,95 1,94 2,07 -0,03 -0,01 -0,01 0,98 0,99 1,00

TempXAgit 0,03 0,04 -0,09 1,95 1,94 2,07 0,02 0,02 -0,05 0,99 0,99 0,96

ConcXAgit -0,08 -0,10 -0,13 1,95 1,94 2,07 -0,04 -0,05 -0,07 0,97 0,96 0,95

*valores significativos a um intervalo de confiança de 95%.

Apesar dos resultados obtidos não proporcionarem a geração de um modelo

matemático, a fixação dos parâmetros foi possível analisando a tendência dos resultados e

fatores como custos, facilidade na execução do processo e preservação máxima das

características do imobilizado. Podemos observar que nos intervalos superiores de

temperatura foram detectados os maiores valores de atividade enzimática, como no ensaio 20,

13 e 14. Já em relação à concentração de enzima, podemos observar que menores

concentrações de enzima em maiores temperaturas, como no ensaio 13 e 14 resultaram em

valores maiores de atividade enzimática, como por exemplo, o ensaio 1 e 2. No entanto, o

estudo já abordado sobre as condições mais adequadas para a imobilização de tanase

(SCHONS, 2012) demonstrou que este imobilizado apresenta maior estabilidade a 60°C, logo,

para o estudo univariado a temperatura foi fixada nesta faixa.

O alginato não teve efeito significativo sobre a atividade da enzima imobilizada. A

partir de estudos anteriores do grupo com a imobilização da tanase (SCHONS, 2012), quando

foram estudadas concentrações de alginato de até 3,6%, foi constatado que a maior

concentração era a de melhor resposta nos parâmetros testados. Observando estes dois fatos, o

98

valor de concentração de alginato foi fixado em 5% devido ser tecnicamente mais resistente,

com boa viscosidade para a imobilização da tanase e ter apresentado boa resposta quanto à

eficiência em todo delineamento experimental.

A atividade enzimática não teve influência significativa da agitação, então foi fixada

na menor agitação, 300 rpm, diminuindo o risco de danos físicos ao imobilizado e podendo

aumentar a vida útil do mesmo. Notou-se também que em 90 minutos já houve grande queda

da atividade enzimática, então foi optado por utilizar 60 minutos de reação de hidrólise no

biorreator.

3.4.2 Planejamento univariado

A partir do estudo DCCR com quatro parâmetros experimentais independentes e

críticos para a observação da hidrólise em biorreator, possibilitou que algumas condições

fossem fixadas e apenas a concentração de enzima imobilizada no biorreator fosse estudada

utilizando um estudo univariado, almejando-se encontrar sinais mais intensos e condições

mais favoráveis para as determinações das melhores condições para serem admitidas em um

biorreator.

Os resultados da atividade enzimática no estudo univariado podem ser visualizados na

Figura 3.6.

Figura 3.6. Comportamento da atividade específica em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 10 20 30 40 50 60 70

Atividad

eespe

cífica

(U/m

gproteína

)

Tempo(minutos)

0,1%

0,25%

0,5%

0,75%

1%

99

De acordo com o conjunto de resultados obtidos, o efeito negativo da concentração de

imobilizado enzimático visualizado anteriormente em relação à atividade enzimática se

manteve até a concentração de 0,75%, já concentrações menores apresentaram, também,

menor atividade enzimática, ou seja, concentrações menores de 0,75% no biorreator implica

em menor concentração do complexo enzima/substrato, diminuindo a conversão enzimática.

Como podemos visualizar na Figura 3.7, a maior conversão de ácido tânico em ácido

gálico ocorreu na concentração de 0,75% em que foi obtido 152µmol de ácido gálico em 300

mL de meio reacional (0,50 µmol/mL) e atividade específica de 4,35 (U/mg de proteína). Nos

demais ensaios a conversão em ácido gálico variou entre 23 à 91 µmol e a atividade específica

variou entre 1,98 à 3,91, exceto no ciclo de hidrólise utilizando 1% de imobilizado

enzimático, em que foi obtido 149µmol de ácido gálico, resultados de ácido gálico bem

próximos utilizando concentração menor de enzima, ou seja, menor custo, com melhor

atividade enzimática.

Figura 3.7 Comportamento da hidrólise de ácido tânico em ácido gálico em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional.

Outro fator que foi avaliado e que também mensura a qualidade do sistema enzima

imobilizada/biorreator é a eficiência relativa (Tabela 3.8). Esse parâmetro avalia qual a

porcentagem de enzima é perdida para o meio reacional e qual percentual é mantida nas

cápsulas de alginato.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60 70

µmol

de

ácid

o gá

lico

Tempo (minutos)

0,1%

0,25%

0,5%

0,75%

1%

100

Tabela 3.8 Eficiência Relativa (%) avaliada através da mensuração da proteína transferida para o meio reacional, em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático.

Concentração de alginato Eficiência Relativa (%)

0,1% 99,90 ± 0,259a

0,25% 99,88 ± 0,097a

0,5% 99,66 ± 0,083a

0,75% 99,80 ± 0,77a

1% 99,70 ± 0,057a

Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras iguais em uma mesma coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p≤0.05).

Foram obtidos promissores resultados, demonstrando que o sistema foi capaz de

manter a enzima imobilizada em cápsulas de alginato, portanto a eficiência não é um

parâmetro limitante na escolha da concentração enzimática. A partir desses dados foi admitido

que a melhor concentração a ser utilizado no biorreator é de 0,75%.

4. Conclusão

Os resultados obtidos neste trabalho indicam o potencial da utilização da tanase

imobilizada em biorreator de batelada como processo viável para obtenção de hidrolisados

fenólicos.

A tanase imobilizada em alginato apresenta propriedades catalíticas interessantes e

diferentes da enzima livre. Estas diferenças podem estar relacionadas com o coeficiente de

difusão de massa através das células imobilizadas e alterações conformacionais da proteína,

bem como a interação do substrato com a matriz polimérica. Foi possível estimar parâmetros

cinéticos da enzima imobilizada de regressão linear com altos coeficientes de correlação. A

enzima imobilidada em alginato 5% apresentou melhores propriedades cinéticas: Km=

3,23µmol, Vmáx = 1,15 U.mg-1. A partir dos dados obtidos de Kd (0,5h-1) e t½ (1,48h) pode-

se constatar que a imobilização da tanase em alginato 5% permitiu boa estabilidade quanto à

temperatura de 60ºC. Outras propriedades obtidas das cápsulas de enzima como a

possibilidade de recuperação e utilização em bateladas consecutivas comprovam que a tanase

imobilizada de Paecilomyces variotii é um biocatalisador interessante, com potencial

aplicação em processos industriais.

101

O desenvolvimento do modelo de biorreator foi capaz de produzir, em maior escala,

ácido gálico a partir da hidrólise de ácido tânico, podendo ser utilizado em matrizes

alimentares sem que necessite a permanência da enzima no produto final. O DCCR

apresentou baixa correlação, com R2 de 0,41 (30 minutos), 0,56 (60 minutos) e 0,46 (90

minutos), porém foi importante no auxilio da melhor estratégia para dar sequência à

construção do biorreator com o estudo univariado. Os estudos do biorreator com tanase

imobilizada permitiram selecionar as condições mais adequadas para a hidrólise utilizando

ácido tânico como substrato: alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação,

temperatura de 60ºC e concentração do imobilizado enzimático de 0,75%. O trabalho permitiu

encontrar um processo em biorreator para hidrólise utilizando tanase imobilizada com alta

produtividade e eficiência.

102

5. Referências

ABDEL-NABY, M. A.; SHERIF, A. A.; EL-TANASH, A. B.; MANKARIOS, A. . Immobilization of Aspergillus oryzae tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of Applied Microbiology, v. 87, p. 108–114, 1999. AGUILAR, C. N.; GUTIERRES-SANCHEZ, G. Review: sources, properties, applications and potential uses of tannin acyl hydrolase. Food Science and Technology International, v. 7, n. 5, p. 372–382, 2001.

AGUILAR, C. N.; RODRÍGUEZ, R.; GUTIÉRREZ-SÁNCHEZ, G.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; PRADO-BARRAGAN, L. A.; RAMÍREZ-CORONEL, A.; CONTRERAS-ESQUIVEL, J. C. Microbial tannases: advances and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 76, n. 1, p. 47–59, 2007.

ARIAN, Y.; ANWAR, S.; ARTIKA, I. M. The production of tannin acyl hydrolase from aspergillus niger. Microbiology Indonesia, v. 1, n. 2, p. 94–97, 2007.

BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Tannase production by Paecilomyces variotii. Bioresource technology, v. 98, n. 9, p. 1832–1837, 2007.

BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A.; DE FREITAS, V. A. P. Hydrolysis of epigallocatechin gallate using a tannase from Paecilomyces Variotii. Food Chemistry, v. 108, n. 1, p. 228–233, 2008. BAYRAMOĞLU, G.; KIRALP, S.; YILMAZ, M.; TOPPARE, L.; ARICA, M. Y. Covalent immobilization of chloroperoxidase onto magnetic beads: catalytic properties and stability. Biochemical Engineering Journal, v. 38, n. 2, p. 180–188, 2008.

BERG, J. M.; TYMOCZKO, J.; STRYER, L. The Michaelis-Menten model accounts for the kinetic properties of many enzymes. In: FREEMAN, W. H. (Ed.). Biochemistry. [s.l: s.n.], 2002. BICKERSTAFF, G. F. Immobilization of enzymes and cells: some practical considerations. In: BICKERSTAFF, G. F. (Ed.). Methods in Biotecnology: Immobilization of Enzymes and Cells. [s.l.] Humana Press, 1997. 1p. 1–11. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1–2, p. 248–254, 1976.

CAMPANELLA, L.; NUCCILLI, A.; TOMASSETTI, M.; VECCHIO, S. Biosensor analysis for the kinetic study of polyphenols deterioration during the forced thermal oxidation of extra-virgin olive oil. Talanta, v. 74, n. 5, p. 1287–1298, 2008. CAO, L. Carrier-bound immobilized enzymes. Weinheim, FRG: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005. CHAN, L. W.; LEE, H. Y.; HENG, P. W. S. Production of alginate microspheres by internal gelation using an emulsification method. International Journal of Pharmaceutics, v. 242, n. 1–2, p. 259–262, 2002.

CHANG, F. S.; CHEN, P. C.; CHEN, R. L. C.; LU, F. M.; CHENG, T. J. Real-time assay of immobilized tannase with a stopped-flow conductometric device. Bioelectrochemistry, v. 69, n. 1, p. 113–116, 2006. CHEETHAM, P. S. J. The use of biotransformations for the production of flavours and fragrances. Trends in Biotechnology, v. 11, n. 11, p. 478–488, 1993.

103

DALLA-VECCHIA, R.; NASCIMENTO, G. Aplicações sintéticas de lipases imobilizadas em polímeros. Química Nova, v. 27, n. 4, p. 623–630, 2004. EL-TANASH, A. B.; SHERIEF, A. A.; NOUR, A. Catalytic properties of immobilized tannase produced from Aspergillus aculeatus compared with the free enzyme. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 28, n. 3, p. 381–391, 2011.

ERTESVÅG, H.; VALLA, S. Biosynthesis and applications of alginates. Polymer Degradation and Stability, v. 59, n. 1–3, p. 85–91, 1998.

FLORES-MALTOS, A.; RODRÍGUEZ-DURÁN, L. V; RENOVATO, J.; CONTRERAS, J. C.; RODRÍGUEZ, R.; AGUILAR, C. N. Catalytical properties of free and immobilized Aspergillus niger tannase. Enzyme research, v. 2011, p. 1–6, 2011. GÓMEZ, L.; RAMÍREZ, H. L.; VILLALONGA, M. L.; HERNÁNDEZ, J.; VILLALONGA, R. Immobilization of chitosan-modified invertase on alginate-coated chitin support via polyelectrolyte complex formation. Enzyme and Microbial Technology, v. 38, n. 1–2, p. 22–27, 2006. HOTA, S. K.; DUTTA, J. R.; BANERJEE, R. Immobilization of tannase from Rhizopus oryzae and its efficiency to produce gallic acid from tannin rich agro-residues. Indian Journal of Biotechnology, v. 6, n. 2, p. 200–204, 2007.

KAR, B.; BANERJEE, R. Biosynthesis of tannin acyl hydrolase from tannin-rich forest residue under different fermentation conditions. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 25, n. 1, p. 29–38, 2000. KATCHALSKI-KATZIR, E. Immobilized enzymes--learning from past successes and failures. Trends in Biotechnology, v. 11, n. 11, p. 471–478, 1993. KING, A. H. Brown seaweed extracts (alginates). In: GLICKSMAN, M. (Ed.). Food Hydrocolloids. [s.l: s.n.], 1983. p. 115–188. KLEIN, J.; STOCK, J.; VORLOP, K.-D. Pore size and properties of spherical Ca-alginate biocatalysts. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, v. 18, n. 2, p. 86–91, 1983.

LEKHA, P. K.; LONSANE, B. K. Production and application of tannin acyl hydrolase: state of the art. In: Advances in Applied Microbiology. New York, USA: Academic press, 1997. 44p. 216–260. LINEWEAVER, H.; BURK, D. The determination of enzyme dissociation constants. Journal of the American Chemical Society, v. 56, n. 3, p. 658–666, 1934. LIU, X.; XUE, W.; LIU, Q.; YU, W.; FU, Y.; XIONG, X.; MA, X.; YUAN, Q. Swelling behaviour of alginate–chitosan microcapsules prepared by external gelation or internal gelation technology. Carbohydrate Polymers, v. 56, n. 4, p. 459–464, 2004.

MAHENDRAN, B.; RAMAN, N.; KIM, D.-J. Purification and characterization of tannase from paecilomyces variotii: hydrolysis of tannic acid using immobilized tannase. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 70, n. 4, p. 444–50, 2006. MATEO, C.; PALOMO, J. M.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; GUISAN, J. M.; FERNANDEZ-LAFUENTE, R. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology, v. 40, n. 6, p. 1451–1463, 2007. MONDAL, K. C.; BANERJEE, D.; JANA, M.; PATI, B. R. Colorimetric assay method for determination of the tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) activity. Analytical Biochemistry,

104

v. 295, n. 2, p. 168–71, 15 Aug. 2001.

MOTTA, V. T. Enzimas. In: Bioquímica básica. Autolab análises clínicas. [s.l: s.n.]p. 101. PRADELLA, J. G. da C. Reatores com células imobilizadas. In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Ed.). Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. 2. ed. São Paulo: Editora Edagard Blücher Ltda, 2001. p. 355–372.

RAMÍREZ, L.; ARRIZON, J.; SANDOVAL, G.; CARDADOR, A.; BELLO-MENDOZA, R.; LAPPE, P.; MATEOS-DÍAZ, J. C. A new microplate screening method for the simultaneous activity quantification of feruloyl esterases, tannases, and chlorogenate esterases. Applied Biochemistry and Biotecnology, v. 151, n. 2, p. 711–723, 2008.

RODRÍGUEZ, H.; CURIEL, J. A.; LANDETE, J. M.; RIVAS, B. de las; FELIPE, F. L. de; GÓMEZ-CORDOVÉS, C.; MANCHEÑO, J. M.; MUÑOZ, R. Food phenolics and lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, v. 132, n. 2–3, p. 79–90, 2009. SCHONS, P. F. Imobilização da tanase de Paecilomyces variotii e ação em reações de hidrólise e síntese. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos. Campinas, SP, 2012.

SCHONS, P. F.; LOPES, F. C. R.; BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Immobilization of Paecilomyces variotii tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of Microencapsulation, v. 28, n. 3, p. 211–9, 2011. SHARMA, S.; AGARWAL, L.; SAXENA, R. K. Purification, immobilization and characterization of tannase from Penicillium variable. Bioresource technology, v. 99, n. 7, p. 2544–2551, 2008.

SHARMA, S.; BHAT, T. K.; DAWRA, R. K. A Spectrophotometric method for assay of tannase using rhodanine. Analytical Biochemistry, v. 279, n. 1, p. 85–9, 2000.

SHELDON, R. A. Enzyme immobilization: the quest for optimum performance. Advanced Synthesis & Catalysis, v. 349, n. 8–9, p. 1289–1307, 2007.

SHILPA, A.; AGRAWAL, S. S.; RAY, A. R. Controlled delivery of drugs from alginate matrix. Journal of Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews, v. 43, n. 2, p. 187–221, 2003. SMIDSRØD, O. Molecular basis for some physical properties of alginates in the gel state. Faraday Discussions of the Chemical Society., v. 57, p. 263–274, 1974. SRIVASTAVA, A.; KAR, R. Application of immobilized tannase from Aspergillus niger for the removal of tannin from myrobalan juice. Indian Journal of Microbiology, v. 50, n. Suppl 1, p. 46–51, 2010.

TISCHER, W. Immobilized enzymes: crystals or carriers? Trends in Biotechnology, v. 17, n. 8, p. 326–335, 1999.

VANDENBERG, G. W.; DROLET, C.; SCOTT, S. L.; NOUE, J. Factors affecting protein release from alginate-chitosan coacervate microcapsules during production and gastric/intestinal simulation. Journal of Controlled Release, v. 77, p. 297–307, 2001. VILLENEUVE, P.; MUDERHWA, J. M.; GRAILLE, J.; HAAS, M. J. Customizing lipases for biocatalysis: A survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of Molecular Catalysis - B Enzymatic, 2000.

YAHYA, A. R. .; ANDERSON, W. A.; MOO-YOUNG, M. Ester synthesis in lipase-catalyzed reactions. Enzyme and Microbial Technology, v. 23, n. 7–8, p. 438–450, 1998.

105

YAO, J.; CHEN, Q.; ZHONG, G.; CAO, W.; YU, A.; LIU, Y. Immobilization and characterization of tannase from a metagenomic library and its use for removal of tannins from green tea infusion. Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 24, n. 1, p. 80–86, 2014. ZANIN, G. M.; MORAES, F. F. de. Enzimas imobilizadas. In: SAID, S.; PIETRO, R. C. L. R. (Ed.). Enzimas como Agentes Biotecnológicos. 2a ed. Ribeirão Pedro: Legis Summa, 2014. p. 41–84.

ZHANG, W.; FRANCO, C. M. M. Characterizing the heterogeneity of an immobilized cell

gel matrix. Engineering in Life Sciences, v. 2, n. 12, p. 409–414, 2002.

106

CAPÍTULO III

Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil

fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente gastrointestinal simulado

(Artigo a ser submetido à revista Food Chemistry)

107

Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil

fenólico, atividade antioxidante e estabilidade na digestão gastrointestinal simulada

Phenolics hydrolysis of various types of tea by immobilized tannase and phenolic profile,

antioxidant activity and stability under simulated gastrointestinal digestion effect

Bruna Sampaio Roberto1*; Gordon J. McDougall3; J. William Allwood3; Derek Stewart3;

Livia Dias de Queirós; Isabela Mateus Martins1; Gabriela Alves Macedo2

1Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil. 2 Food and Nutrition Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil 3 Environmental and Biochemical Sciences Group, Enhancing Crop Productivity and Utilisation Theme, The James Hutton Institute, Dundee, United Kingdom.

* Corresponding author: sampaior.bruna@gmail.com

108

RESUMO

Os polifenóis, ou compostos fenólicos, amplamente encontrados em chás, estão relacionados

à prevenção de câncer e doenças crônicas. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente

como glicosídeos ou outros conjugados, minimizando a biodisponibilidade e os efeitos

benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados

no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos

polifenóis ou de suas fontes vegetais, fora do trato gastrointestinal também pode liberar estes

compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais

antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil fenólico e atividade antioxidante in

vitro bem como elucidar a recuperação de compostos fenólicos após a simulação da digestão

in vitro de chás biotransformados por tanase imobilizada. O estudo da eficiência da enzima

imobilizada em hidrolisar polifenóis em chás branco, preto, verde e mate foi avaliado por

HPLC-ESI-MS e a quantificação dos principais polifenóis foi realizada por HPLC-DAD. As

alterações na atividade antioxidante dos chás biotransformados foram avaliadas pelos

métodos in vitro ORAC, DPPH e FRAP e a estabilidade dos polifenóis foi avaliada a partir de

métodos padronizados da simulação de digestão in vitro. Os resultados demonstraram que a

enzima imobilizada é capaz de hidrolisar principalmente ácido clorogênico, as catequinas

EGCG, GCG e ECG e a rutina. A quantificação permitiu visualizar que o aumento mais

significativo foi de ácido gálico, 16 vezes no chá verde e 13 vezes no chá branco. No chá

verde também se observou a diminuição em 75% do teor de EGCG, com consequente

aumento de EGC (70%) e 95% de hidrolise de ECG com o conteúdo de EC aumentando mais

que 2 vezes. Já no chá preto e chá branco houve a hidrólise de 91% e 75% da ECG,

respectivamente. O chá mate apresentou relevante hidrólise de ácido clorogênico (54%)

resultando no aumento do ácido cafeico (4,3 vezes). Essa modificação no perfil fenólico dos

chás pela tanase imobilizada resultou também no aumento da atividade antioxidante avaliados

pelo método ORAC e DPPH e nos chás branco e verde também através do método (FRAP).

Os compostos fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas

simuladas embora tenha apresentado pobre estabilidade após a simulação das condições

intestinais, demonstrando a importância do consumo dos fenólicos já na porção aglicona ou

em moléculas menores. Os resultados indicaram que a tanase mesmo imobilizada foi eficaz

para transformar o perfil fenólico dos chás e aumentar o poder antioxidante mostrando ser

possivelmente utilizada para modificar o perfil de bioativos e até mesmo aumentar a extração

109

comercial dos polifenóis de matrizes complexas. Além disso, os resultados sugerem que é

mais desejável seguir o modelo de hidrólise com tanase imobilizada para fornecer fontes de

bioativos com potencial de bioacessibilidade melhorado.

Palavras chave: polifenóis, chás, biotransformação, tanase imobilizada, bioacessibilidade.

110

ABSTRACT

Polyphenols, or phenolic compounds, widely found in teas, are related to the prevention of

cancer and chronic diseases. However, polyphenols often occur as glycosides or other

conjugates, minimizing thebioavailability and beneficial effects of these compounds on

health, requiring the biotransformation of these conjugates in the gastrointestinal tract. As a

technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant

sources outside the gastrointestinal tract can alsorelease these compounds from their

conjugates and consequently improve the functional activity of such antioxidants. The

objective of this work was to evaluate the phenolic profile and antioxidant activity in vitro as

well as to elucidate the recovery of phenolic compounds after the biotransformed

teas byimmobilized tannase in vitro digestion simulation. The study of the enzyme

immobilized efficiency in hydrolyzing polyphenols in white, black, green and mate teas was

evaluated by HPLC-ESI-MS and the quantification of the main polyphenols was performed

by HPLC-DAD. The changes in the antioxidant activity of the biotransformed teas were

evaluated by the in vitro methods ORAC, DPPH and FRAP and the stability of the

polyphenols was evaluated using standard in vitro digestion simulation methods. The results

demonstrated that the immobilized enzyme is capable of hydrolyzing mainly chlorogenic

acid, the catechins EGCG, GCG and ECG and the routine. The quantification showed that the

most significant increase was gallic acid, 16 times in green tea and 13 times in white tea.

Green tea also showed a 75% decrease in EGCG content, with a consequent increase in EGC

(70%) and 95% ECG hydrolysis with EC content increasing more than 2-fold. In black tea

and white tea, there was hydrolysis of 91% and 75% of ECG, respectively. Mate tea showed a

significant chlorogenic acid hydrolysis (54%) resulting in an increase in caffeic acid (4.3

times). This teas’ phenolic profile modification by the immobilized tannase also resulted in

antioxidant activity’s increase evaluated by the ORAC and DPPH method and in the white

and green teas also through the FRAP method. The teas’ phenolic compounds exhibited

stability to the simulated gastric digestive conditions, although they presented poor stability

after the intestinal conditions’ simulation, demonstrating the importance of the phenolic

consumption in the aglycone portion or in smaller molecules. The results indicated that the

same immobilized tannase was effective to transform the teas’ phenolic profiled to increase

the antioxidant power, showing that it is possibly used to modify the profile of bioactive and

to even increase the commercial extraction of polyphenols from complex matrices. In

111

addition, the results suggest that it is more desirable to follow the hydrolysis model with

immobilized tannase to provide bioactive sources with improved bioavailability potential.

Keyword: polyphenols, teas, biotransformation, immobilized tannase, accessibility.

112

1. Introdução

Os fitoquímicos têm sido extensivamente estudados devido sua importância como

compostos bioativos e seus efeitos positivos na saúde, seja por mecanismos complementares

ou sinérgicos, podem estar relacionados com suas propriedades em nível do trato

gastrointestinal, atividade antiviral, antibacteriana, anti-inflamatória, antialérgica,

antimutagência/anticarcinogênica, anticolesterolêmica e atividade antioxidante (CHENG;

LIN; LIN, 2002). Muitos desses estudos químicos foram realizados em chás de Camellia

sinensis, por conterem vários antioxidantes, incluindo os polifenóis catequina, monômeros de

flavonoides e compostos análogos como epigalocatequina galato, epigalocatequina,

epicatequina galato e epicatequina, teaflavina e grupos poliméricos tearubiginas (VARILEK

et al., 2001; RAHMAN; BISWAS; KIRKHAM, 2006). Estudos biológicos têm indicado que

EGCG, um dos principais componentes fenólicos do chá, é o mais benéfico para a saúde

humana, embora muitos dos outros componentes fenólicos também tenham demonstrado

benefícios à saúde (MURASE et al., 2002; RAMÍREZ et al., 2008). Erva Mate (Ilex

paraguariensis), espécie de planta nativa da região subtropical da América do Sul, é um

importante alimento vegetal rico em compostos antioxidantes, que podem agir como

adjuvantes na prevenção e evolução de alguns tipos de câncer. Várias propriedades

farmacológicas desta planta foram atribuídas à presença de compostos fenólicos,

principalmente o ácido clorogênico. A literatura está bem documentada sobre seus efeitos

antioxidantes (BRAVO; GOYA; LECUMBERRI, 2007; MARTINS et al., 2009;

MATSUMOTO et al., 2009; BOAVENTURA et al., 2012, 2013a, 2013b; CRISTINA et al.,

2015), antiobesidade (ARÇARI et al., 2009, 2011, 2013; GOSMANN et al., 2012) e suas

propriedades quimiopreventivos (RAMIREZ-MARES; CHANDRA; MEJIA, 2004; MEJIA et

al., 2005; MIRANDA et al., 2008). No entanto, fatores limitantes dos efeitos biológicos são a

má absorção, transporte transcelular pobres e metabolismo rápido, seguida de excreção

(MANACH; DONOVAN, 2004).

Tanase (acilo hidrolase tanino, E.C 3.1.1.20) é uma importante hidrolase que tem

muitas aplicações potenciais, entre as quais uma é facilitar a biotransformação de catequinas

de chá, podendo aumentar sua atividade antioxidante. Ao hidrolisar a ligação '' éster '', assim

como ligações '' depsidase '' de fenólicos em chás podem liberar agliconas e compostos

fenólicos simples, flavonoides (quercetina, miricetina) e ácidos fenólicos, que são capazes de

serem diretamente absorvidos através da mucosa do intestino delgado (BRAVO, 1998;

113

MANACH; DONOVAN, 2004). Apesar dessa importante aplicação da tanase, a sua

utilização em larga escala é limitada devido aos altos custos de produção e conhecimentos

insuficientes da enzima. A imobilização de enzimas é um método utilizado para superar as

limitações do emprego de enzimas livres e várias tentativas têm sido feitas para imobilizar

tanase em uma matriz adequada (BOADI; NEUFELD, 2001; HOTA; DUTTA; BANERJEE,

2007; EL-TANASH; SHERIEF; NOUR, 2011; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al.,

2014). Considerando que a tanase pode fornecer bioativos mais biodisponíveis, é interessante

saber a estabilidade destas moléculas no trato gastrointestinal uma vez que os polifenóis da

dieta tem que estar disponíveis após a digestão para então serem absorvidos. A atividade

antioxidante dos compostos bioativos e a sua estabilidade dependem de muitos fatores, tais

como a matriz do alimento, pH, temperatura, presença de inibidores ou potencializadores de

absorção, a presença de enzimas, metabolismo individual, e outros fatores relacionados

(TAGLIAZUCCHI et al., 2010). Por conseguinte, a capacidade de liberar os fitoquímicos da

matriz alimentar e sua resistência à digestão podem ser o primeiro passo para determinar a

absorção destes compostos. No entanto, há poucas informações disponíveis sobre a

biodisponibilidade e a permeabilidade intestinal de compostos fenólicos dos chás de Camellia

sinensis e Illex paraguariensis. O objetivo deste trabalho foi verificar se a hidrólise dos

polifenóis de diferentes chás pode aumentar a atividade antioxidante e a bioacessibilidade

destes fenólicos através da simulação da digestão in vitro.

2. Materiais e Métodos

2.1 Materiais

Todos os reagentes utilizados foram grau analítico ou de grau HPLC. A água utilizada

foi água ultrapurificada grau HPLC, obtida do sistema de purificação de água Milli-Q

(Millipore Merck, Darmstadt, Alemanha). O cloreto de cálcio, acetona, metanol, cloreto

férrico hexa-hidratado, fosfato de sódio, alginato (sal de sódio do ácido algínico), a pepsina,

pancreatina, sais biliares, carbonato de sódio, ácido fórmico, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH), 2,2'- azobis (2-amidinopropano) (AAPH), 4,6-tripryridyl-s-triazina (TPTZ) foram

adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA); fosfato de sódio monobásico e dibásico,

cloreto de cálcio obtidos da LabSynth (Diadema, Brasil); fluoresceína e acetato de sódio da

Ecibra (São Paulo, Brasil); 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) da

114

Acros Organics (Geel, Bélgica); Acetonitrila e ácido fórmico para análise HPLC-MS foram

comprados da Optima ™ (Fisher Scientific Ltd., Loughborough, Leicestershire, Reino Unido)

e os padrões de polifenóis foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) com

exceção do ácido clorogênico e epigalocatequina galato utilizados da Extrasynthèse S.A.

(Genay, França).

2.2 Chás e preparação dos extratos

Chá preto (CP), chá verde (CV), chá branco (CB), chá mate (CM): da marca Leão®

foram adquiridos no mercado local (Campinas, SP, Brasil).

Em béqueres foram pesados 30g de cada amostra de chá e em seguida foram

adicionados 450 mL de tampão fosfato 20 mM, pH 5,5. A extração de compostos de chá

preto, verde, mate e branco foi realizada num banho de água a 100 ° C durante 30 min. Para

obter extratos antes e após biotransformação, as extrações foram realizadas em duplicata.

Depois dos extratos serem filtrados em papel filtro, os extratos originais foram liofilizados e o

extrato seco resultante foi chamado de extrato de chá original e utilizado em análises futuras,

a respectiva duplicada foi utilizada na biotransformação dos polifenóis. Este modelo permite

comparar os dados da atividade antioxidante de chás biotransformadas usando enzima livre

(MACEDO et al., 2011).

2.3 Imobilização da tanase e biotransformação enzimática

A imobilização utilizando tanase de Paecilomyces variotii obtido de acordo com

procedimento publicado anteriormente (BATTESTIN; MACEDO, 2007). A encapsulação foi

realizada utilizando o método modificado descrito por Schons et al. (2011). Uma solução de

alginato de sódio a 5% foi preparada utilizando um agitador orbital (200 rpm durante 1 hora),

em seguida, 54 mg de tanase foi misturado em 15 mL de alginato de sódio 5% (3,6 mg de

tanase/mL). A suspensão foi adicionada gota a gota com auxílio de uma seringa a uma

distância de 12 cm da solução contendo 90 mL de cloreto de cálcio (0,1 M). As cápsulas

obtidas foram estabilizadas por armazenamento na solução de cloreto de cálcio durante a noite

a 7ºC, em seguida, separados por peneira, lavou-se com 200 mL de água destilada a 10°C e

então foram mantidas em placas de Petri cobertas com filme plástico e sob-refrigeração.

115

Para o tratamento enzimático dos extratos de chá (300 mL de extrato em tampão

fosfato 20 mM, pH 5,5) foram biotransformados com 0,75% de tanase imobilizada a 60 ° C

durante 2h, com agitação magnética a 300 rpm. No final da reação, a enzima imobilizada foi

recolhida por filtração e os extratos de chá biotransformados foram liofilizados e usados em

análises futuras.

2.4 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por HPLC-ESI/MS e

quantificação dos principais compostos fenólicos por HPLC-DAD

As amostras controle e biotransformadas dos chás antes e após digestão tiveram sua

composição avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um espectrômetro

de massas (HPLC-MS). A quantificação dos principais fenólicos presentes nos chás foi

realizada com base em curvas de calibração do padrão analítico avaliados por cromatografia

de alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD).

2.4.1 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por Cromatografia

Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS)

Os extratos foram transferidos para frascos analíticos equipados com filtro PTFE de

0,45µM e com tampas de silicone com septos previamente cortados (Thomson Ltd.

Oceanside, Califórnia, EUA). As amostras foram armazenadas no injetor automático a 6°C e

analisadas em ambos os modos negativos e positivos de ionização por eletrospray (ESI). As

análises por HPLC foram realizadas com um sistema de HPLC da Thermo 600 Accela

acoplado à um detector de PDA Accela (Thermo Fisher-Ltd. Hemel Hempstead U.K.). O

HPLC foi operado a uma velocidade de fluxo de 300 µL / min, a coluna (C18 Synergi Hydro-

RP 80A, 150x2.0mm, 4µm de dimensão de partícula; Phenomenex Ltd., Macclesfield, Reino

Unido) foi mantida a temperatura de 30ºC. O solvente A, água deionizada (ELGA-PureLab

option-Q, Elga Ltd., High Wycombe, Reino Unido), e solvente B, acetonitrila de grau HPLC

foram acidificados com ácido fórmico 0,1% grau de espectrometria de massa. O gradiente

utilizado foi o seguinte: 98% de A (0-2 min), 98-95% de A (2-5 min), 95-55% de A (5-25

min), 55% de A - 100% de B (25-26 min), mantido 100 % B (26-29 min), 100% B - 98% A

(26-30 min), manteve-se 98% A (30-35 min). O eluente da coluna foi monitorado pelo

detector Accela PDA onde espectros foram coletados no comprimento de onda de 200 à

116

600nm e então transferidos para o sistema de espectrometria de massa Thermo LTQ-Orbitrap

XL operado pelo software Xcalibur (Thermo-Fisher Ltd. Reino Unido). Os espectros de

massa foram coletados principalmente em modo para verificação completa (m/z 80-2000)

com resolução de massa de 30000 (FWHM definido para m/z 400), posteriormente a

verificação secundária foi aplicada para obter os dados de MS2, que corresponde ao espectro

de fragmentação com base em um único íon mais intenso, definido na verificação completa

preliminar, ambas verificações geraram perfis com dados espectrais. A presença de compostos

fenólicos foi confirmada com base na comparação dos dados de m/z e MS2 com os valores na

literatura e em relação aos padrões (DUNN et al., 2008; BROWN et al., 2009).

2.4.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de

alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD)

As análises individuais dos principais fenólicos foram realizadas utilizando um HPLC

DionexUltiMate 3000 (Alemanha), equipado comamostrador automático (WPS-3000(T)SL

Analytical), bomba quaternária (LPG-3400SD) e uma coluna C18 Atlantis® (Waters, 5 µm,

4.6 x 150 mm) acoplada a um detector UV/VIS (DAD-3000). A eluição em gradiente teve,

como fase móvel solvente A, água/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) e solvente B, metanol/ácido

fórmico (99,9:0,1, v/v). O gradiente linear obedeceu a condição de concentração de solvente

A de 95 % (0-5 min), 95-85% (5-20 min), 85-60% (20-50 min), 60-30% (45-65 min), 30-20%

(65-72 min), 20-95% (72-75), 95-100% (110-120 min). A velocidade de fluxo foi ajustada

para 0,5 mL / min. A identificação de compostos individuais foi realizada comparando o

tempo de retenção e espectro. Os compostos foram quantificados utilizando os picos a 280

nm, sendo os teores calculados utilizando curvas construídas com os padrões autenticados. Os

compostos dos extratos de chás (1g) foram diluídos em metanol 80%, extraídos por 40ºC em

ultrassom e então filtrados em filtros Millipore 0,45µm e injetados (20 µL) diretamente no

sistema cromatográfico. ara os padrões fenólicos, 1mg das amostras foram diretamente

dissolvidos em 800µL de metanol e 200 µL de água ultrapura e então filtrados em filtros

Millipore 0,45µm.

Os polifenóis analisados foram: Chá branco, preto e verde – ácido gálico,

epigalatocatequina galato, epigalocatequina, catequina, epicatequina galato, epicatequina,

quercetina e rutina. Chá mate – ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafeico, quercetina e

rutina.

117

2.5 Atividade Antioxidante

2.5.1 Capacidade de sequestrar o radical DPPH

A atividade antioxidante potencial do extrato de chá foi avaliado com base na

atividade captadora do estável radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), de acordo com

Brand-Williams et al. (1995) e Macedo et al. (2011). O ensaio foi conduzido em triplicata, e a

atividade antioxidante foi calculada usando a equação de regressão linear determinada

representando graficamente a atividade antioxidante de soluções de concentrações conhecidas

de Trolox. A redução do radical DPPH é monitorada pela redução da absorbância no

comprimento de onda específico, quando em contato com uma substância que pode doar

hidrogênio. A atividade antioxidante foi expressa como µmol de Trolox equivalente/mg de

extrato de chá.

2.5.2 Teste de capacidade antioxidante do radical oxigênio – ORAC (Oxygen

Radical Antioxidant Activity)

Os ensaios ORAC realizados utilizaram fluoresceína (FL) como indicador

fluorescente, tal como descrito por Macedo et al. (2011). O teste ORAC automatizado foi

realizado num leitor de microplacas NOVOSTAR (BMG LABTECH, Alemanha) com filtros

de fluorescência para um comprimento de onda de excitação de 485nm e um comprimento de

onda de emissão de 520 nm. As medições foram feitas em uma placa COSTAR 96. A reação

foi realizada a 37 ° C e iniciada por decomposição térmica de AAPH e consequente produção

de radicais livres em tampão de fosfato 75 mM (pH 7,4), devido à sensibilidade de FL ao pH.

As medições foram realizadas em triplicata. Valores de ORAC foram definidos como a

diferença entre a área sob a curva de decaimento FL e o branco (AUC líquida). Equações de

regressão entre AUC líquida e concentração antioxidante foram calculados para todas as

amostras. Valores de ORAC-FL foram expressos como µmol equivalente Trolox/g de extrato

de chá (CAO; SOFIC; PRIOR, 1996).

2.5.3 Poder redutor do íon ferro – FRAP

118

O ensaio FRAP foi realizado de acordo com o procedimento do (BENZIE; STRAIN,

1996). O ensaio foi realizado em triplicata e as absorbâncias medidas a 593 nm a 37 ° C,

sendo monitorado em uma cinética de 4 min. Os resultados estão expressos como µmol de

Trolox equivalente/g de extrato de chá.

2.6 Digestão in vitro

Este procedimento in vitro é similar a digestão no trato digestivo superior e foi

adaptado a partir do método descrito por (MCDOUGALL et al., 2005). O método consiste em

dois passos sequenciais: pepsina/HCl iniciam a digestão, durante 2 h a 37 ° C para simular as

condições gástricas, seguido por uma digestão com sais biliares e pancreatina durante 2 h a 37

° C para simular as condições do intestino delgado.

Os extratos de chá foram diluídos com água destilada até o volume de 20 mL, para

obter uma concentração de 2 mg / mL. As amostras tiveram o pH de 1,7 ajustado com HCl 1

M, e assim 100µL de pepsina (315U/ml) foi adicionado, para em seguida, serem incubadas a

37 ° C em banho-maria durante 2 h, com agitação a 100 rpm. Depois de 2 horas, alíquotas de

2 mL foram removidos e congelados, representando amostras pós digestão gástrica (IVG). O

restante foi colocado em béquer de 250 mL, e foi adicionado 4,5mL da mistura de pancreatina

(4 mg/mL) e sais biliares (25 mg/mL). Tubo de diálise de celulose (massa molecular de 12

kDa) contendo NaHCO3 suficiente para neutralizar a acidez titulável da amostra foi

adicionado em cada amostra, e o bequer foi selado com parafilme. A quantidade de NaHCO3

0,1M necessária para a neutralização de 18 mL do conteúdo pós digestão gástrica mais 4,5

mL de sais biliares/pancreatina foi definida como a acidez titulável. Após 2 h de incubação a

37 ° C, as amostras foram removidas da incubação. O filme foi removido, retirado o tubo de

diálise e despejado seu conteúdo no béquer. O pH de todas as soluções foi diminuido para

cerca de 1-2 utilizando HCl 1M.

As amostras, após digestão in vitro (IVD) foram submetidas ao procedimento de

extração em fase sólida (SPE) utilizado para concentrar as frações ricas em fenóis.

Resumidamente, as unidades de SPE (Strata C18-E, unidades GIGA, capacidade de 10 g)

foram sensibilizadas utilizando 80% de acetonitrila/20% de água ultrapura contendo 0,1% de

ácido fórmico, e depois equilibrada em ácido fórmico 0,1% em água ultrapura. Cada amostra

foi aplicada ao sistema e o material não ligado foi descartado. As unidades de SPE foram

lavadas 2 vezes com ácido fórmico 0,1%. Os extratos ligados, ricos em polifenóis, eluiram-se

119

com acetonitrila. Após a medição do teor de fenóis, os extratos foram evaporadas até à secura

em Speed Vac. As amostras foram congeladas para análise posterior em HPLC.

2.7 Análise estatística

Todas as medições foram realizadas em triplicata. Os resultados são apresentados

como médias ± desvio padrão. O efeito significativo do tratamento enzimático em chás foram

avaliados utilizando oneway ANOVA, seguido de um teste Post hoc que melhor avaliou cada

dado coletado. As análises estatísticas foram realizadas utilizando software STATISTICA

versão 8.0 (StatSoft. Inc. (2007), Tulsa, OK, EUA).

3. Resultados e Discussão

3.1 Detecção, identificação e quantificação dos compostos extraídos de chás

3.1.1 Caracterização dos chás através da detecção e identificação por

Cromatografia Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas -

(HPLC/ESI-MS)

Os resultados obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a

biotransformação em chás branco, verde e preto estão ilustrados na Figura 3.1. E o resultado

cromatográfico do perfil fenólico resultante da biotransformação da tanase em chá mate está

na Figura 3.2.

120

Figura 3.1 Análise HPLC-MS do (A) chá branco (B) chá verde (C) chá preto. Os traços dos chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho. Os traços estão sobrepostos para identificar as diferenças no conteúdo fenólico.

013_wt_01 24/04/2015 03:04:50

RT: 0,07 - 24,40

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100uA

UNL:1,08E6Channel A UV 008_Wo_01NL:1,09E6Channel A UV 013_wt_01

017_gt_02 24/04/2015 05:27:36

RT: 0,00 - 24,40

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1,08E6Channel A UV 018_go_02NL:1,08E6Channel A UV 017_gt_02

023_bt_02 24/04/2015 09:01:46

RT: 0,00 - 24,50

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 NL:1,08E6Channel A UV 022_Bo_02NL:1,08E6Channel A UV 023_bt_02

17

3430

A FSD = 1.08E6

1

2

4

35 8 9

12+14

17

21-23

24

27

28

30

3234

35-4041

42

46-53

55-63

6566

FSD = 1.08E6B

1

32

4

5

8 9 14

17

21-23

24

27

28

32

35-40 41

42

43-53

55-63

65 66

2

95

4

10-14

16

20

23

24

26

27

28

3237-38

4145

51

54-63

6466

FSD = 1.08E6C

121

Figura 3.2 Análise HPLC-MS do chá mate. Os traços dos chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho. Os traços estão sobrepostos para identificar as diferenças no conteúdo fenólico.

O uso de espectrometria de massa, juntamente com a cromatografia líquida de alto

desempenho permitiu caracterização detalhada das alterações observadas através da

identificação dos compostos descritos nas tabelas 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 baseadas nos dados de

fragmentação MS, juntamente com caracterizações em estudos anteriormente publicados e no

nível dos traços. Nesta tabela estão listados os picos identificados, os tempos de retenção

(TR), moléculas desprotonada/protonada ([M-H] - / [M + H] +), e o maior íon fragmentado

(NI/PI). Na figura 3.3 podemos analisar a comparação da área dos picos dos compostos com

maior expressividade.

Para fins biológicos, os mais importantes flavonoides dos chás obtidos de Camellia

sinensis são as catequinas e os seus produtos de fermentação, as teaflavinas. Elas têm sido

objeto de muitos estudos analíticos com cromatografia para otimizar a sua separação,

identificação e quantificação. Catequinas são os principais componentes fenólicos de chás,

especialmente o chá verde e branco, e (-)- epigalocatequina galato e (-)- epicatequina galato

são os mais proeminentes, como mostrado por Lin et al. (2008) e suportado neste estudo. (-)-

Epicatequinas e (-)-epigalocatequinas são os principais compostos fenólicos e catequina,

galocatequina, catequina galato, galocatequina galato estão presentes em concentrações

relativamente baixas.

RT: 0.11 - 22.32

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 NL:5.10E5Channel A UV 010_Mate_01NL:5.10E5Channel A UV 015_mate_t_01

FSD = 1.08E6

122

Tabela 3.1 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá branco.

Pico nº Identificação do composto TR M/Z (M-H) MS2 Alteração

1 Ácido quínico 1.49 191 traços é

2 Ácido chiquímico 1.97 173 155 é

3 Galoil glicose 3.5 331 169, 271, 211 ê

4 Ácido gálico 4.5 169 125 é

5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 é

8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é

9 Teobromina 9.1 +181 traços ó

11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 ó

12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 é

14 Dímero de galocatequina 10 609 traços é

17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 ó

20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê

21 Catequina 11.7 289 245 é

22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê

23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 é

24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ó

27 EC 13.2 289 245, 205 é

28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê

30 GCG 14.2 457 331, 305, 169 ê

32 Apigenina arabinosídeo glicosídeo 14.3 563 443, 473, 353 ê

34 Miricetina 3-O ramnosilglicosídeo 14.6 625 316, 271, 607 é

35 Miricetina 3-O- galactosídeo 14.7 479 316 é

37 Quercetina galactosil rutinosídeo 15 771 609, 301 ê

39 Quercetina glucosil rutinosídeo 15.2 771 301, 609 ê

40 Quercetina diramnosilglicosídeo 15.5 755 609, 301, 463 é

41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê

42 Quercetina-3-O-rutinosídeo (Rutina) 15.7 609 301, 271 ê

46 Kaempferol 3-O-glicosilrutinosídeo 16.2 755 593, 285 é

48 Kaempferol 3-O- ramnosilgalactosídeo 16.8 593 285; 447 é

49 Kaempferol 3-O-galactosídeo 16.9 447 284 é

51 Kaempferol 3-O-glicosídeo 17.3 447 285 ê

53 Miricetina 18.3 317 traços é

123

55 Quercetina hexose ramnose coumaroil pentose

hexose

19.3 1049 903, 887, 745, 301 ê

56 Ácido dicafeoilquínico 19.38 516 443, 353 ó

57 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 19.38 1033 887, 301 é

58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 é

59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil

hexosil hexoside

19.6 901 755, 828, 285 é

60 Quercetina ramnose coumaroil pentose hexose 19.7 887 741, 301 é

62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ê

63 Kaempferol tri glicosídeo acilado 20.6 871 725, 585, 431, 285 é

65 Quercetina 21 301 traços é

66 Kaempferol 23.6 285 traços é

Os dados se referem aos resultados de LC-MS. A última coluna mostra se há aumento do composto conforme estimado pela área do pico PDA (teste t, p<0,05). Os símbolos representam: éaumento; ê diminuição; ó nenhuma mudança; e + modo positivo.

Tabela 3.2 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá verde.

Pico nº Identificação do composto TR M/Z (M-H) MS2 Alteração

1 Ácido quínico 1.49 191 traços é

2 Ácido chiquímico 1.97 173 155 é

3 Galoil glicose 3.5 331 169, 271, 211 ó

4 Ácido gálico 4.5 169 125 é

5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 ó

8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é

9 Teobromina 9.1 +181 traços ó

11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 ó

12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 é

14 Dímero de galocatequina 10 609 traços é

17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 é

20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê

21 Catequina 11.7 289 245 é

22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê

23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 é

24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ó

27 EC 13.2 289 245, 205 é

28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê

124

30 GCG 14.2 457 331, 305, 169 ê

32 Apigenina arabinosídeo glicosídeo 14.3 563 443, 473, 353 ê

34 Miricetina 3-O ramnosilglicosídeo 14.6 625 316, 271, 607 é

35 Miricetina 3-O- galactosídeo 14.7 479 316 é

37 Quercetina galactosil rutinosídeo 15 771 609, 301 ê

39 Quercetina glucosil rutinosídeo 15.2 771 301, 609 ê

40 Quercetina diramnosilglicosídeo 15.5 755 609, 301, 463 é

41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê

42 Quercetina-3-O-rutinosídeo (Rutina) 15.7 609 301, 271 ê

43 Catequina galato 16.1 441 289, 169, 331 ê

44 Quercetina 3-O-galactosídeo 16.1 463 301 ê

46 Kaempferol 3-O-glicosilrutinosídeo 16.2 755 593, 285 ê

48 Kaempferol 3-O- ramnosilgalactosídeo 16.8 593 285; 447 ó

49 Kaempferol 3-O-galactosídeo 16.9 447 284 ê

51 Kaempferol 3-O-glicosídeo 17.3 447 285 ê

53 Miricetina 18.3 317 traços é

55 Quercetina hexose ramnose coumaroil

pentose hexose

19.3 1049 903, 887, 745, 301 é

56 Ácido dicafeoilquínico 19.38 516 443, 353 ó

57 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 19.38 1033 887, 301 é

58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 é

59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil

hexosil hexoside

19.6 901 755, 828, 285 ó

60 Quercetina ramnose coumaroil pentose

hexose

19.7 887 741, 301 é

62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ó

63 Kaempferol tri glicosídeo acilado 20.6 871 725, 585, 431, 285 ó

65 Quercetina 21 301 traços é

66 Kaempferol 23.6 285 traços é

Os dados se referem aos resultados de LC-MS. A última coluna mostra se há aumento do composto conforme estimado pela área do pico PDA (teste t, p<0,05). Os símbolos representam: éaumento; ê diminuição; ó nenhuma mudança; e + modo positivo.

Tabela 3.3 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá preto.

Pico nº Identificação do composto TR M/Z (M-H) MS2 Alteração

2 Ácido chiquímico 1.97 173 155 é

4 Ácido gálico 4.5 169 125 é

125

5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 ê

8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é

9 Teobromina 9.1 +181 traços ê

10 Hidroxiteaflavina 9.1 581 563, 545, 395, 257 ê

11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 ó

12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 ê

13 Metil éster de ácido gálico 10 183 168, 139, 124 é

14 Dímero de galocatequina 10 609 traços é

16 Teasinensina 10.8 761 591, 609, 623 ê

17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 é

20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 é

21 Catequina 11.7 289 245 é

22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê

23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 ê

24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ê

26 Teasinensina A ou D 12.7 913 743, 573 ê

27 EC 13.2 289 245, 205 é

28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê

32 Apigenina arabinosídeo glicosídeo 14.3 563 443, 473, 353 ê

37 Quercetina galactosil rutinosídeo 15 771 609, 301 ê

38 Vitexina – 4’-O-glicosídeo 15.1 593 413, 293 é

41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê

45 Quercetina 3-O-glicosídeo 16.2 463 301 ê

51 Kaempferol 3-O-glicosídeo 17.3 447 285 ê

54 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 18.9 1063 917, 301 ê

56 Ácido dicafeoilquínico 19.38 516 443, 353 ó

57 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 19.38 1033 887, 301 é

58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 ê

59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil

hexosil hexoside

19.6 901 755, 828, 285 ê

61 Teaflavina 19.9 563 545, 379, 241 ê

62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ê

64 Teaflavina – 3,3 – digalato 20.8 867 715, 697, 527, 389 ê

66 Kaempferol 23.6 285 traços ê

Os dados se referem aos resultados de LC-MS. A última coluna mostra se há aumento do composto conforme estimado pela área do pico PDA (teste t, p<0,05). Os símbolos representam: éaumento; ê diminuição; ó nenhuma mudança; e + modo positivo.

126

Tabela 3.4 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato de chá mate.

Pico nº Identificação do composto TR M/Z (M-H) MS2 Alteração

2 Ácido chiquímico 1.97 173 155 é

4 Ácido gálico 4.5 169 125 ó

6 Ácido coumaroilchiquímico 7.4 319 341, 174, 371 é

7 Ácido cis-4-O-cafeoilquínico 8.4 353 174, 179, 191 é

9 Teobromina 9.1 +181 traços ê

11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 é

12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 ê

15 Ácido cafeoilquínico 10.4 353 179, 174, 191 é

18 Ácido cis-5-o-cafeoilquínico 11.4 353 707, 191, 135, 126 é

19 Ácido cis-3-o-cafeoilquínico 11.6 353 191, 179, 174, 135 é

23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 ê

24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ê

25 Ácido cafeico 12.7 179 135 é

29 Ácido Feruloilquínico 14 367 174, 112, 191 ê

31 Ácido cafeoilchiquímico 14.3 335 174, 191, 112, 179 ê

33 Ácido cafeoil chiquímico 14.5 335 174, 161, 191,112 ê

36 Ácido Feruloilquínico 15 367 163, 191 é

47 Ácido dicafeoilquínico 16.6 515 353, 191, 179 ê

50 Ácido dicafeoilquínico 17.1 515 353, 174, 191 ê

52 Ácido dicafeoilquínico 17.8 515 353, 174, 187, 112 ê

Os dados se referem aos resultados de LC-MS. A última coluna mostra se há aumento do composto conforme estimado pela área do pico PDA (teste t, p<0,05). Os símbolos representam: éaumento; ê diminuição; ó nenhuma mudança; e + modo positivo.

A análise de HPLC / ESI-MS mostrou a presença de um pico significativo de EGCG

nas amostras originais. O espectro de massa revelou íons [M-H]- com m/z 457 e 169 e MS2

331 consistente com a estrutura de EGCG comparada com íons produzidos por padrão.

Entretanto, nos chás biotransformados por tanase, foi detectado o aumento da sua forma de

aglicona. O espectro de massa revelou um íon de massa consistente com a estrutura de EGC

(PM: 306 g/mol) detectado pelo íon de m/z 305, e ainda detectando o íon fragmentado que

corresponde à perda de CO2 (m/z 261) e C6H6O3, (m/z 179) devido à cisão do anel

heterocíclico (GU et al., 2003; ZHAO et al., 2011). Este resultado é consistente com os

127

resultados apresentados por Macedo et al. (2011), estudo que mostra que a tanase pode

hidrolisar a epigalocatequina galato em epigalocatequina e ácido gálico.

Figura 3.3 Áreas médias dos picos (HPLC/MS) a partir de três amostras. (A) Chá branco - CB= chá branco original, CBT= chá branco biotransformado. (B) Chá verde - CV= chá verde original, CVT= chá verde biotransformado. (C) Chá preto - CP= chá preto original, CPT= chá preto biotransformado, EC = epicatequina, CAT= catequina, EGC= epigalocatequina, GC= galocatequina, GQA= ácido 5-galoil quinico, CGA= ácido clorogênico, 3CGA= ácido 3-O-cafeoilquinico, 4CGA= ácido 4-O-cafeioilquinico, ECG = epicatequina galato, EGCG= epigalocatequina galato, DCQA= ácido dicafeoil quínico, PDBG= Prodelfinidina B 2-3'-O-galato. * = P <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t.

0.0E+005.0E+071.0E+081.5E+082.0E+082.5E+083.0E+083.5E+084.0E+084.5E+085.0E+08

Área(m

UA.s)

CBCBT

**

**

**

**

**

*

**

**

**

** **

A

0.0E+005.0E+071.0E+081.5E+082.0E+082.5E+083.0E+083.5E+084.0E+084.5E+085.0E+08

Área(m

UA.s) CVCVT

**

*

**

*

***

**

**

**

**

B*

0.0E+00

5.0E+07

1.0E+08

1.5E+08

2.0E+08

2.5E+08

3.0E+08

3.5E+08

4.0E+08

Área(m

UA.s)

CPCPT

**

**

** ****

****

**

***

C

128

O ECG foi identificado com base na comparação do espectro de absorção, tempo de

retenção, e maior íon de fragmentação ([M - H]- com m/z 441 e os fragmentos de MS2 com

m/z 331, 289 e 169) e notavelmente os extratos originais apresentaram os níveis mais

elevados enquanto que naqueles biotransformados pela tanase o pico diminuiu

significativamente. Esse comportamento pode ser analisado pela representação gráfica da

média da área dos picos dos principais compostos detectados acompanhados da análise

estatística. Além disso, o pico 27, identificado como (-)-EC (fragmentação MS-MS [M - H]-

com m/z 289 e o principal fragmento MS2 de m/z 245 e 205) e o pico 3, ácido gálico (m/z

169), apresentaram níveis mais elevados em chás preto, verde e branco biotransformados.

Outras mudanças ocorreram nos extratos de chá devido ao tratamento enzimático, chá

branco e verde biotransformados mostraram níveis mais elevados de GC (pico 8),

acompanhado pela diminuição GCG (pico 30) bem como a hidrólise de rutina (quercetina-

rutinoside- pico de 37) e aumento da sua forma aglicona, quercetina (pico 65) foi observado.

O aumento do pico da miricetina (picos 53 - CVT e CBT) e kaempferol (pico 66 -

CPT, CVT e CBT) após o tratamento com tanase imobilizada sugere que houve a hidrólise

dos derivados de miricetina e kaempferol, de forma análoga a estrictinina diminuiu (pico 22-

CVT e CBT) sugerindo que pode ter ocorrido a quebra do tanino em ácido elágico (não

detectado). Os resultados são consistentes com Battestin et al. (2008), He et al. (2006),

Macedo et al. (2011), Ni et al. (201) e Ferreira et al. (2013) e indicam que a tanase

imobilizada a partir de P. variotii também é capaz de hidrolisar as ligações éster de substratos

naturais.

Análise por HPLC/MS do extrato de chá mate revelou a presença de vários derivados

de ácido hidroxicinâmico sendo a principal alteração pelo tratamento da tanase o aumento de

ácido cafeico (Figura 3.4) e alguns isômeros de ácido cafeoilquínico seguido da diminuição

de ácido clorogênico e isômeros e ácido dicafeoilquínico.

129

Figura 3.4 Média da área do picos (HPLC/MS) do ácido cafeico a partir de três amostras de chá mate. ** = significativamente diferentes através do teste t, p <0,01.

Resultados semelhantes foram detectados com tratamento de tanase livre (MACEDO

et al., 2011). A identificação do ácido clorogênico (pico 23) foi confirmada por análise de íon

majoritário MS-MS, que revelou a presença do íon negativo [MH]- com m/z = 353. A

fragmentação MS2 com m/z 191 e 179 foram consistentes com ácido quínico e ácido cafeico,

bem como a fragmentação com m/z 173 indica a saída de uma molécula de água do ácido

quínico. Em contraste aos achados deste estudo e de Bastos et al. (2007), Filip et al. (2001)

descreveu a presença de quercetina, kaempferol e miricetina em extratos de chá mate.

Além da caracterização extensa dos chás, esta análise cromatográfica confirmou com

sucesso o aumento na presença de compostos, tais como EC, AG, EGC, ácido cafeico para os

quais estudos tem relatado ter maior biodisponibilidade (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN,

2001; MANACH; DONOVAN, 2004; MACEDO et al., 2011). A cromatografia ainda

detectou a diminuição da cafeína após a transformação pela tanase (Figura 3.5). Em 2005 e

2006, pesquisadores descobriram que a cafeína aumenta a secreção de cortisol. Além disso,

indivíduos mais velhos ou com maior percentagem de gordura corporal apresentaram maior

nível de excreção de cortisol quando a cafeína foi adicionada à sua dieta (LOVALLO et al.,

2005, 2006). Alguns estudos sugerem ainda que a cafeína é capaz de aumentar a resistência à

insulina (KEIJZERS et al., 2002). Fato importante uma vez que o risco de diabetes está

diretamente relacionado ao grau de resistência a insulina e a biotransformação, por sua vez,

foi capaz de diminuir esse composto.

0.0E+00

1.0E+07

2.0E+07

3.0E+07

4.0E+07

5.0E+07

6.0E+07

Ácidocafeico

Área(m

UA.s)

ChámateOriginal

Biotransformado

130

Figura 3.5 Média das áreas dos picos de cafeína e teobromina (HPLC/MS) a partir de três amostras. * = p <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t.

Foi identificado também o incremento no conteúdo de teobromina após a

biotransformação do chá branco. Não está claro o mecanismo que acarretou no aumento, nem

a razão deste comportamento ter ocorrido apenas no chá branco. Horžić et al. (2009)

confirmaram que naturalmente o chá branco possui maior teor de teobromina que o chá verde

por ser encontrada em folhas mais jovens. Os autores demonstraram também que diferentes

procedimentos de extração podem refletir no teor de liberação da matriz, ou seja, o tratamento

enzimático pode ter agido na extração do conteúdo de teobromina existente nas folhas do chá

branco. Especula-se que durante o processo de biotransformação pode ter ocorrido quebra de

ligações hidrofóbicas do complexo metilxantina-taninos liberando moléculas de

0

500000000

1E+09

1.5E+09

2E+09

2.5E+09

3E+09

3.5E+09

Cháverde Chábranco Chápreto Chámate

Área(m

UA.s)

Cafeína Original

Biotransformado

*

**

**

0.0E+002.0E+074.0E+076.0E+078.0E+071.0E+081.2E+081.4E+081.6E+081.8E+08

Cháverde Chábranco CháPreto Chámate

Área(m

UA.s)

Teobromina Original

Biotransformado

**

**

**

131

teobromina/cafeína (ALONSO, 2004) e/ou a quebra do grupo metil na posição 1 da cafeína

possibilitando a predominância de teobromina.

A teobromina é uma metilxantina primária encontrada principalmente no Theobroma

cacao. Como uma metilxantina, é bloqueadora de receptores de adenosina, inibindo a

fosfodiesterase capaz de hidrolisar o AMPc em AMP e seus efeitos celulares são centrados

neste aumento do AMPc intracelular (MARTÍNEZ-PINILLA; OÑATIBIA-ASTIBIA;

FRANCO, 2015). A fisiologia do cérebro é dependente de variações na concentração de

adenosina nos neurônios. Sugimoto et al. (2014) afirmaram ser um composto bioativo eficaz

na prevenção de glioblastoma. No entanto as evidências mostram que as metilxantinas,

cafeína e teobromina, tem ações psicoativas qualitativamente diferentes. Pesquisadores

concluíram que a cafeína tem efeitos mediados pelo SNC no estado de alerta, enquanto que a

teobromina atua principalmente em alterações periféricas como diminuição da pressão arterial

(MITCHELL et al., 2011; BAGGOTT et al., 2013). Embora seja um composto que os

pesquisadores tenham dado menor atenção, podemos encontrar grandes achados também em

relação ao suporte a obesidade. Em 2015, os dados de Jang et al. (2015) sugeriram que a

teobromina inibe a diferenciação de adipócitos durante os estádios iniciais da adipogênese em

pré-adipócitos 3T3-L1 e Neufingerl et al. (2013) concluiu que a teobromina é capaz de

aumentar o HDL sérico.

3.1.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de

alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD)

As mudanças nas concentrações dos principais fenólicos antes e após a

biotransformação de todos os chás pode ser vista na Tabela 3.5. As visíveis mudanças na

quantificação de alguns compostos reafirmam a eficiência da tanase imobilizada na hidrólise

de chás uma vez que obtivemos resultados de hidrólise próximos aos estudos de Lu; Chen,

(2008), Macedo et al., (2011) e Raghuwanshi; Misra; Saxena, (2013) que utilizaram tanase

livre em chás.

Dentre os vários resultados interessantes, como o aumento de deglicosilados e

diminuição da cafeína, o aumento mais significativo é claramente o aumento de ácido gálico,

quando houve aumento de 16 vezes para o chá verde e 13 vezes no chá branco. O chá preto

apresentou aumento menos significativo, o que pode ser explicado já pelo seu menor teor de

moléculas que pudessem hidrolisar resultando na liberação da molécula de ácido gálico, como

132

EGCG e ECG. Conforme Zeng et al. (2016) o chá verde possui altos teores de EGCG devido

ao seu processo de obtenção ser brando, evitando degradação de suas catequinas. Podemos

confirmar estes achados, pois a tanase foi capaz de diminuir em 75% o teor de EGCG e

aumentando em 70% seu produto de hidrólise EGC. Além disso, ocorreram 95% de hidrólise

da ECG, acarretando em aumento de aproximadamente 2,7 vezes o conteúdo de EC, o que

demonstra alta afinidade da enzima por este substrato. Estes achados foram corroborados com

a hidrólise de 91% e 75% da EGC no chá preto e chá branco, respectivamente.

Tabela 3.5 Efeito do tratamento da tanase imobilizada no teor dos principais polifenóis encontrados nos chás através da quantificação por HPLC/DAD.

Composto Tratamento Chá verde Chá branco Chá Preto Chá mate

mg/g

Ácido Gálico Original 3,26 ± 0,24b 4,81 ± 0,59b 11,95 ± 1,33b nd

Biotransformado 54,18 ± 5,30a 65,26 ± 2,85a 25,44 ± 1,22a 0,8 ± 0,03

EGC Original 13,58 ± 1,52b 10,64 ± 1,68b 2,81 ± 0,30b nd

Biotransformado 23,23 ± 2,08a 16,44 ± 0,49a 6,42 ± 0,12a nd

Catequina Original 0,73 ± 0,04b 0,67 ± 0,038b 0,20 ± 0,03b nd

Biotransformado 1,66 ± 0,12a 1,24 ± 0,07a 0,58 ± 0,02a nd

EGCG Original 126,51 ± 2,00a 115,8 ± 1,22a 16,27 ± 1,51b nd

Biotransformado 31,12 ± 1,84b 35,8 ± 7,59b 3,90 ± 0,43a nd

EC Original 18,59 ± 0,52b 20,78 ± 0,74b 6,45 ± 0,29b nd

Biotransformado 50,69 ± 2,79a 50,07 ± 1,55a 12,76 ± 0,61a nd

ECG Original 36,64 ± 1,77a 33,38 ± 3,30a 11,71 ± 1,68a nd

Biotransformado 1,92 ± 0,96b 8,35 ± 0,28b 1,02 ± 0,01b nd

Rutina Original 0,85 ± 0,015a 0,75 ± 0,026a Nd 4,12 ± 0,25a

Biotransformado 0,24 ± 0,016b 0,13 ± 0,024b Nd 0,30 ± 0,02b

Quercetina Original 0,03 ± 0,007a 0,054 ± 0,01b Nd nd

Biotransformado 0,28 ± 0,045b 0,81 ± 0,21a Nd 1,04 ± 0,17a

Ácido Cafeico Original nd nd Nd 1,07 ± 0,03b

Biotransformado nd nd Nd 4,65 ± 0,01a

Ácido Clorogênico

Original nd nd Nd 24,48 ± 0,48a

Biotransformado nd nd Nd 13,26 ± 0,08b

Os resultados são apresentados como a média (n = 3) ± DP. Médias com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes em relação ao tratamento analisados através do teste One-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey (p<0,01). Nd = não detectado.

O significativo aumento do ácido cafeico foi confirmado pela quantificação a partir de

curva padrão realizada com padrão. O ácido cafeico é conhecido pelas atividades

antioxidantes, imunomoduladora, anti-proliferativas, indutoras da apoptose e anti-

133

inflamatórias (PARK et al., 2004; GAMARO et al., 2011; ZHANG et al., 2014; VINI;

SREEJA, 2015). Bezerra et al. (2012) publicaram um artigo que demonstrou o potencial do

ácido cafeico como agente terapêutico na obesidade ao restaurar parcialmente o metabolismo

normal de ratos obesos tratatos com ácido cafeico.

Além disso, ainda que em baixas concentrações, o aumento de quercetina e ácido

gálico podem contribuir para o aumento da bioatividade do chá mate. Quercetina tem

apresentado recentes avanços na elucidação de seus efeitos. Porras et al. (2017) mostraram em

seus resultados a adequação da quercetina com uma abordagem terapêutica para doença

hepática gordurosa não alcoólica associada a obesidade através de mecanismos que incluem

resposta anti-inflamatória, antioxidante e prebiótica integrativa.

3.2 Atividade antioxidante

Análise de ORAC, FRAP e DPPH dos extratos de chás originais e biotransformados

por tanase imobilizada são mostrados na Tabela 3.6.

Tabela 3.6 Atividade antioxidante Tratamento P-valor**

Chás Original Biotransformado

Efeito do

tratamento Todos chás

DPPH

Preto* 1080.3 ± 159.2d 1639,5 ± 84.6c 0,005

< 0,0001 Verde* 2391.0 ± 216.7b 3021,3 ± 240.8a 0,028

Branco* 1749.7 ± 221.0c 3429,4 ± 61.0a 0,0002

Mate* 481.8 ± 3.9e 1614,4 ± 27.4c <0,0001

ORAC

Preto* 1863.7 ± 181.8c 2739.5 ± 434.3a,b 0,021

<0.0001 Verde* 2673.4 ± 159.7a,b 3525.6 ± 320.5a 0,014

Branco* 2304.3 ± 76.6c 3248.0 ± 536.6a,b 0,0039

Mate* 2438.78 ± 388.14b,c 3466.9 ± 205.3a 0,0025

FRAP

Preto 2618.8 ± 115.6d,e 3708.1 ± 861.4c,d -

0,0018

0,0009 <0.0001

Verde* 2871.6 ± 645.4d,e 5614.7 ± 70.5b

Branco* 4614.1 ± 501.6b,c 7198.2 ± 67.7a

Mate 2397.0 ± 181.1e 2722,2 ± 395.2d,e -

*Diferença significativa estatisticamente entre chás biotransformados e originais (p≤0,05) a, b, c, d, e valores (média ± dp) de cada analito com letras diferentes diferem significativamente (p≤0,05) ** Análise utilizando ANOVA, seguido pelo teste Tukey (p≤0.05).

134

O fator decisivo para explicar esses resultados da atividade antioxidante pode ser a

composição fenólica de cada extrato e não simplesmente o conteúdo fenólico total (BASTOS

et al., 2007). Ainda que a catequina com maior atividade antioxidante ainda é assunto

controverso, (BATTESTIN; MACEDO; DE FREITAS, 2008; MACEDO et al., 2012)

comprovaram que os fenólicos deglicosilados apresentam maior atividade antioxidante, então

é relevante observar as relações estabelecidas entre estrutura e potencial de redução. O

tratamento da tanase em todos os extratos gerou uma complexa mistura de estruturas

diferentes com ação antioxidante significativamente superior, avaliando as três técnicas

utilizadas (≤0.05). À medida que a atividade antioxidante é influenciada por ácidos fenólicos

e flavonoides monoméricos, e que alterações nos arranjos dos grupos hidroxilas e

substituições por glicosilação acabam diminuindo a atividade antioxidante (RICE-EVANS;

MILLER; PAGANGA, 1997), espera-se que os fenóis com pequenas moléculas e agliconas

aumente a atividade antioxidante. Nesse sentido nossos resultados concordam com estudos

prévios de Macedo et al. (2011), Macedo et al. (2012), Ni et al. (2015) quando a tanase ajudou

a aumentar a atividade antioxidante, indicando que a tanase imobilizada tem aplicações

práticas no processamento de chás.

O primeiro ensaio de avaliação antioxidante mensurou o poder da amostra em

sequestrar o radical DPPH e chá verde e branco, mostraram maior atividade antioxidante,

aumentando 1,26 e 1,95 vezes após o tratamento enzimático, respectivamente. Os resultados

estão de acordo com estudo de (HONG et al., 2013), mostrando que o tratamento enzimático

aumenta a atividade antioxidante, e supõe-se estar relacionado com o aumento de AG, cafeína

e catequinas, porém neste estudo não foi possível elucidar o(s) mecanismo(s) pelo qual o trata

mento com enzimas aumenta a atividade de DPPH.

Não há diferença significativa de atividade antioxidante incidindo sobre a eliminação

do radical peroxil (ORAC) entre os tipos de chás biotransformados, embora o aumento

mediado pelo tratamento com enzima nos seus valores tenha sido foi relevante, com o

aumento médio de 1,39 vezes. Dávalos et al. (2004) mostraram que a quercetina e catequina

foram os valores mais altos de ORAC, 10,5 e 14,9 Trolox equivalente/mol de composto puro,

respectivamente, o ácido cafeico foi mais ativo do que o ácido ferúlico e a sua esterificação

com o ácido quínico (ácido clorogênico) apresentou atividade reduzida. Essas moléculas

antioxidantes podem explicar diretamente nossos resultados ORAC significativos em chás

biotransformados. Neste estudo, a quelação de íons ferrosos por chás com ou sem tratamento

de tanase foi examinada por FRAP. Amostras de chá branco biotransformadas apresentaram

135

os maiores valores de FRAP, mostrando melhor capacidade de catalisara transferência de

elétrons, levando a inibição da peroxidação lipídica. Embora chás de Camellia sinensis

biotransformados enzimáticamente tenham apresentado magnitude de atividade, podemos ver

a grande melhoria do chá mate após a biotransformação, 3,35 vezes para DPPH, 1,42 vezes

para ORAC e 1,13 para FRAP. Embora a relação estrutura-atividade seja mais complexa e,

vários fatores devem ser analisados, os resultados desses ensaios apoiam o princípio de que as

estruturas com mais grupos hidroxila exercem maior atividade antioxidante, uma vez que a

hidrólise pela enzima reestabelece a molécula com mais uma OH livre, como por exemplo, os

ésteres de catequina galato que refletem na liberação do antioxidante catequina mais o ácido

gálico (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).

3.3 Estabilidade dos polifenóis após digestão in vitro

Uma vez que estudos in vitro avaliando a biodisponibilidade cada vez mais têm

ganhado importância devido aos custos e implicações éticas que envolvem estudos in vivo

(SOLER et al., 2010), optou-se por realizar ensaios in vitro para avaliar a disponibilidade dos

compostos fenólicos e a sua estabilidade através do processo digestivo. As figuras 3.6, 3.7,

3.8, 3.9 mostram os picos cromatográficos dos polifenóis após a digestão gástrica e duodenal

de todos os chás avaliados nesse estudo, mostrando a estabilidade destes compostos. A

bioacessibilidade representa a razão de fenóis disponíveis após a digestão. O método de

digestão in vitro não pode imitar o transporte ativo que ocorre no estômago (PASSAMONTI

et al., 2003) ou o transporte dos flavonoides por meio de interação com o transportador de

sódio dependente de glicose (SGLT1) no intestino delgado (GEE et al., 1998). No entanto, a

estabilidade sob condição gastrointestinal é crucial para potencial bioacessibilidade, o que irá

definir quais os polifenóis estão acessíveis para mecanismos de transporte eficiente. A

estabilidade dos polifenóis dos extratos de chás originais e biotransformados foi avaliada

utilizando um modelo de sistema que imita o processo digestivo humano. Os extratos

utilizados nesse modelo tiveram os compostos já identificados anteriormente confirmados em

relação a sua estabilidade através da confirmação dos seus picos identificados por dados

característicos de MS/MS.

Os cromatogramas obtidos das amostras pós-digestão puderam demonstrar que as

etapas do processamento do chá podem, potencialmente, influenciar a bioacessibilidade de

polifenóis bioativos. Através dos gráficos obtidos por cromatografia pode ser verificado que

136

os picos de ácido gálico, ácido cafeico, prodelfinidina B 2-3'-O-galato (PDBG), EGC e EC

são capazes de resistir à digestão gástrica e se não forem absorvidos até o momento em que

atingem o intestino, podem ser facilmente absorvidas pelos enterócitos. Observamos também

que estrictinina teve picos mais altos em amostras biotransformadas após a digestão,

comportamento que não havia sido observado antes da digestão in vitro. Fato relevante uma

vez que Gondoin et al. (2010) atribuiu a essa molécula o poder inibidor da lipase pancreática.

Figura 3.6 (A) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado (vermelho) após a digestão gástrica (B) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado (vermelho) após a digestão pancreática. Os traços de chá branco são sobrepostos para identificar diferenças no conteúdo fenólico.

gastric_white_t_neg_01 15-Jun-15 23:03:59

RT: 0.00 - 24.44

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.30E6Channel A UV Gastric_White_neg_01NL:1.08E6Channel A UV gastric_white_t_neg_01

pancreatic_white_t_neg_02 16-Jun-15 15:07:22

RT: 0.00 - 24.44

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.30E6Channel A UV pancreatic_white_neg_01NL:1.08E6Channel A UV pancreatic_white_t_neg_02

Strictinin

FSD = 1.08E6

Ácido gálico

EC

Ácido gálico

Strictinin

A

Galocatequina

Teobromina

Ácido 5-galoilquinico

Teobromina

EGC

EGC

FSD = 1.08E6

EC

Estrictinina

Estrictinina

B

137

Os resultados mostram que a degradação dos polifenóis através da digestão

gastrointestinal in vitro ocorreu principalmente durante a fase da simulação dos processos

bioquímicos no intestino duodenal assim como os resultados obtidos por Green et al. (2007).

É importante ressaltar que os principais compostos incrementados através da

biotransformação apresentaram boa recuperação nas amostras de chá verde e chá branco,

como podemos observar na Figura 3.6 e 3.7 mostrando o efeito positivo da biotransformação

em aumentar a bioacessibilidade dos polifenóis.

Figura 3.7 (A) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado (vermelho) após digestão pancreática.

gastric_green_t_neg_01 15-Jun-15 21:16:57

RT: 0.07 - 22.87

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6Channel A UV gastric_green_neg_01NL:1.08E6Channel A UV gastric_green_t_neg_01

pancreatic_green_t_neg_02 16-Jun-15 13:20:17

RT: 0.00 - 22.52

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.82E6Channel A UV pancreatic_green_neg_01NL:1.88E6Channel A UV pancreatic_green_t_neg_02

Ácidogálico

EGC

ÁcidogálicoEGC

A FSD = 1.08E6

FSD = 1.08E6B

EC

EC

gastric_green_t_neg_01 15-Jun-15 21:16:57

RT: 0.07 - 22.87

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6Channel A UV gastric_green_neg_01NL:1.08E6Channel A UV gastric_green_t_neg_01

138

A estabilidade do ácido gálico nos três chás de Camellia sinensis, está de acordo com

os trabalhos sobre a biodisponibilidade do ácido gálico em seres humanos, que documentam

que este composto é extremamente bem absorvido, em comparação com outros polifenóis e é

um potente antioxidante capaz de eliminar esses radicais livres (MANACH et al., 2005;

TUNG et al., 2009; BADHANI; SHARMA; KAKKAR, 2015). Vários estudos demonstram

os grandes potenciais desse ácido fenólico, tanto in vitro como in vivo. Suas atividades

anticancerígenas são evidenciadas através de medidas pró-oxidantes de compostos galato. As

espécies reativas de oxigênio geradas por galatos têm sido relacionadas com a morte celular

apóptica e necrótica. Pesquisadores alegam que os galatos induzem apoptose seletivamente

em células tumorais de crescimento rápido, deixando as células saudáveis intactas. A

citotoxicidade seletiva é plausível uma vez que células normais apresentam capacidade em

resistir à apoptose induzida por ácido gálico pela liberação de inibidores que não são

produzidos por células cancerosas (ISUZUGAWA; OGIHARA; INOUE, 2001; FARIED et

al., 2007; CHIA et al., 2010; SOURANI et al., 2015).

Dentre outras importantes ações benéficas, como atividades anti-inflamatórias

(BENSAAD et al., 2017), cardioprotetoras (EL-HUSSAINY et al., 2016), hepatoprotetoras

(LATIEF et al., 2016; MONEIM et al., 2016), Chao et al. (2014) demonstraram que o ácido

gálico é capaz de melhorar a esteatose não alcoólica induzida por dieta rica em gordura. O

estudo mostrou que os alvos desse ativo são relacionados a distúrbios metabólicos como

metabolismo lipídico, glicólise, cetogênese, metabolismo da colina e da microbiota intestinal,

muitos destes que estão relacionados a obesidade. Doan et al. (2015) demonstraram o poder

nutrigenômico do ácido gálico. Foi relatado que o ácido gálico regula o peso corporal de ratos

obesos através da ativação da AMPK, enzima responsável por vias relacionadas a produção

de ATP e oxidação da gordura para ser consumida, como também de outros genes

relacionados com o gasto energético no tecido adiposo marrom.

As catequinas EC e EGC, que também foram incrementadas após a biotransformação

com tanase imobilizada, oscilaram entre 88% e 98,56% de recuperação após digestão ácida

para a EGC de chá branco biotransformado e EC do chá verde biotransformado,

respectivamente. O papel da biotransformação reside no fato de que estes compostos são

absorvidos na primeira porção do intestino, precisando chegar após a digestão ácida, intactos

no intestino, para então serem absorvidos (SPENCER et al., 2001; SPENCER, 2003). Já

compostos que precisam ser metabolizados pela flora intestinal, como EGCG, precisam

chegar ao cólon onde são metabolizados e absorvidos (KALE et al., 2010). Nossos resultados

139

mostraram baixa identificação de moléculas como EGCG e ECG após a simulação da

digestão que ocorre no intestino, uma vez que estes compostos precisam ser metabolizados

pela flora intestinal os estudos relatam baixa absorção desses compostos e comprava a

necessidade da biotransformação prévia destes compostos. O chá preto não apresentou dados

relevantes de recuperação desses compostos uma vez que já apresentavam baixas

concentrações antes da simulação da digestão.

Figura 3.8 (A) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado (vermelho) após digestão pancreática.

Análises de HPLC com detector de espectrometria de massa (HPLC-MS) mostrou que

tanto EGC como EGCG foram as catequinas mais suscetíveis à degradação na digestão

pancreática. A instabilidade de catequinas ao pH quase neutro, bem como a sensibilidade das

gastric_black_t_neg_01 15-Jun-15 20:41:16

RT: 0.10 - 24.66

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6Channel A UV Gastric_Black_neg_01NL:1.08E6Channel A UV gastric_black_t_neg_01

pancreatic_black_t_neg_01 16-Jun-15 02:02:22

RT: 0.10 - 24.66

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6nm=200.0-600.0 PDA pancreatic_black_neg_01NL:1.08E6Channel A UV pancreatic_black_t_neg_01

FSD = 1.08E6

FSD = 1.08E6

140

catequinas às condições intestinais do duodeno já foram previamente relatadas (ZHU et al.,

1997; RECORD; LANE, 2001; SU et al., 2003). O pH elevado (6,0-8,0), o oxigênio residual

dissolvido, e provável presença de espécies reativas de oxigênio advindas da digestão normal

podem facilitar várias reações, incluindo a epimerização e auto-oxidação no lúmen intestinal

(ZHU et al., 1997; SU et al., 2003). Acredita-se que reações de auto-oxidação continuam

devido à vulnerabilidade dos grupos hidroxila adjacentes (radical pirogalol) no anel B da EGC

e EGCG (ZHU et al., 1997; ARTS et al., 2002) levando a desprotonação e subsequente

formação de radicais livres semiquinona no anel B (GUO et al., 1996; MIZOOKU et al.,

2003; LAMBERT; SANG; YANG, 2007). Condições de pH elevados propagam ainda mais

reações de auto-oxidação, estabilizando espécies de catequina semiquinona e permitindo que

estes intermediários reajam ainda mais, formando vários produtos finais que, potencialmente,

incluem irreversíveis produtos de dimerização homo e hetero (YOSHINO et al., 1999;

MOCHIZUKI et al., 2002). De acordo com observações de Green et al. (2007), que

realizaram estudo sobre a estabilidade das catequinas EC e ECG, esses compostos são menos

sensíveis à digestão simulada. Estudos sugeriram que próximo ao pH neutro a capacidade de

doar elétron dos grupos pirogalol para EGCG e EGC é significativamente maior do que para

os grupos catecol em EC e ECG, resultando em aumento da taxa de oxidação (MOCHIZUKI

et al., 2002), em outras palavras esta diferença na estrutura do anel B pode, portanto, ser útil

na previsão da sensibilidade intestinal de catequinas e que pode ser melhor percebida através

da recuperação destas moléculas nas amostras biotransformadas de chás após a simulação in

vitro.

Neste momento, é digno mencionar que embora uma enorme quantidade de compostos

fenólicos tenha sido perdida ao longo de todo processo de digestão, é provável que alguns

compostos se degradaram em formas mais simples ou sintetizados para criar novos produtos,

enquanto outros podem ter sofrido transformações estruturais, eventualmente não sendo

detectadas pelos métodos utilizados ou que estivessem abaixo do limite de detecção da

metodologia.

As análises da estabilidade dos polifenóis obtidos do chá mate podem ser observadas

no gráfico da Figura 3.9. Uma vez que a biotransformação foi sugerida a partir do fato que a

absorção dos ácidos clorogênicos no trato gastrointestinal proximal é inferior a dos ácidos

hidroxinâmicos livres por não possuirmos esterases capazes de hidrolisar os ácidos

esterificados, reduzindo significativamente a eficiência da absorção dos ácidos clorogênicos

141

no lúmen gástrico e no intestino delgado (MANAH, 2004; PLUMB, 1999; RECHNER,

2001), a estabilidade do produto dessa reação deve ser estável até seu sítio de absorção.

Neste trabalho foi observado que o ácido cafeico aumentado pela biotransformação foi

passível de recuperação, sendo o ácido fenólico majoritário na amostra obtida após a

simulação da digestão gástrica em comparação com a recuperação do composto após a

digestão na primeira porção do intestino (Figura 3.10). Em indivíduos com ileostomia, foi

demonstrado que 33% de um total de 2,8mmol de ácidos clorogênicos (isômeros 3,4 e 5-

CQA) foram absorvidos no estômago e intestino delgado, enquanto a absorção de ácido

cafeico, administrado na mesma dose, foi de 95% (OLTHOF et al., 2003). Resultados

semelhantes foram encontrados em experimentos com animais (AZUMA et al., 2000;

GONTHIER et al., 2003).

Figura 3.9 (A) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado (vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado (vermelho) após digestão pancreática.

gastric_mate_t_neg_01 15-Jun-15 23:39:40

RT: 0.41 - 19.96

2 4 6 8 10 12 14 16 18Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6Channel A UV Gastric_Mate_neg_01NL:5.08E5Channel A UV gastric_mate_t_neg_01

pancreatic_mate_t_neg_01 16-Jun-15 05:00:45

RT: 0.04 - 19.92

2 4 6 8 10 12 14 16 18Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

uAU

NL:1.08E6Channel A UV pancreatic_mate_neg_01NL:8.08E5Channel A UV pancreatic_mate_t_neg_01

Ácidocafeico

FSD = 1.08E6

FSD = 1.08E6

142

Dessa forma foi demonstrado que a biotransformação do ácido clorogênico pode ter

efeitos positivos na biodisponibilidade de compostos bioativos uma vez que viabilizou a

disponibilidade de ácido cafeico após a digestão gástrica, o que não ocorreu com a amostra

original de chá mate original. O ácido clorogênico por sua vez não foi identificado nas duas

amostras, sugerindo que houve degradação em moléculas não identificadas. O ácido cafeico

foi previamente estudado por inúmeros grupos de pesquisa. Dentre os inúmeros efeitos

farmacológicos comprovados, através das propriedades antioxidantes, (STOJKOVIĆ et al.,

2013; GENARO-MATTOS et al., 2015) anti-inflamatórias, (ZHANG et al., 2014;

CHOUDHARY et al., 2016), antibacteriana (LUÍS et al., 2014; LIMA et al., 2016) e

anticarcinogênica (KANG et al., 2008; HONG et al., 2015; ROSENDAHL et al., 2015)

podemos ilustrar a importância desse composto para a saúde através do estudo que

comprovou que o ácido cafeico é capaz de suprimir a atividade de lipogênese e ativar a

enzima AMPK, relacionada com a β-oxidação dos ácidos graxos, indicando o potencial

significativo como agente preventivo na obesidade por supressão de enzimas lipogênicas e

acumulação de lipídeos (LIAO et al., 2013).

Após a digestão in vitro, apesar de a concentração de ácido clorogênico ter diminuído

em ambas as amostras de chá mate, continuou a apresentar considerável pico. O ácido

clorogênico pode apresentar pouca hidrólise no estômago, devido à estabilidade desta

substância em pH 2, o grau de acidez do conteúdo gástrico. Nardini et al. (2002) encontraram

apenas o ácido cafeico no plasma após a ingestão de café. Paralelamente, os resultados deste

estudo mostraram que além do ácido cafeico apresentar boa resistência ao ácido gástrico, seu

pico no cromatograma apresentou maior intensidade nas amostras submetidas à ação da

tanase (Figura 3.10).

Boaventura et al. (2015) avaliaram a estabilidade de polifenóis de erva mate e

comprovaram que apesar da diminuição do conteúdo de fitoquímicos, amostra de erva-mate

após digestão promoveram considerável atividade antioxidante celular, inibiram a

proliferação de células cancerosas do fígado humano (HepG2), comparável à amostras sem

digestão de alimentos de origem vegetal, como cranberry e framboesa e não foram observadas

alterações na citotoxicidade, sugerindo que o processo de digestão gastrointestinal não afeta o

potencial citotóxico do extrato de erva-mate. Também corroborando com os resultados deste

estudo Siracusa et al. (2011) observaram diminuição de aproximadamente 82% do teor de

ácido 5-cafeoilquínico em amostras de L. Crithmum após a simulação da digestão in vitro.

Estes autores também descobriram que o ácido 3,5-dicafeoilquínico foi completamente

143

degradado logo após a digestão gástrica in vitro. De acordo com Friedman et al. (2006),

ácidos clorogênicos não são estáveis em pH aumentado, o qual é encontrado na digestão

intestinal. É interessante notar que a biodisponibilidade varia muito de um polifenol para

outro, de modo que os polifenóis mais abundantes não são necessariamente aqueles que

conseguem maiores concentrações de metabólitos ativos no tecido-alvo (MANACH et al.,

2005).

Figura 3.10 Porcentagem de recuperação do ácido cafeico no chá mate biotransformado após digestão gástrica e pancreática após análise de HPLC-MS.

4. Conclusão

Nosso estudo demonstrou por meio da identificação do perfil de polifenóis em cada

extrato de chá, que a tanase imobilizada é capaz de hidrolisar os substratos contidos em chás.

A capacidade antioxidante de extratos de chá originais e de chás que seguiram com

tratamento por tanase imobilizada, foi mensurada por ORAC, FRAP e ensaios de DPPH, o

que, em todas as análises, confirmaram que o tratamento dos extratos biotransformados por

tanase aumentou a sua potência antioxidante. Estes resultados demonstram a capacidade de

tanase para catalisar a hidrólise de vários substratos diferentes dos extratos de chá e confirma

que essa reação resulta em polifenóis com nível de capacidade antioxidante mais elevado. Os

compostos fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas

simuladas, mas estabilidade pobre após as condições intestinais. Ainda que os polifenóis

foram sensíveis às condições digestivas, as moléculas que atingem o intestino podem ser

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Ácidocafeico

Recupe

ração(%

)

Ácidocafeico

Controle

digestãogástrica

digestãopancreática

144

absorvidas pela mucosa antes e/ou depois de serem hidrolisadas pelas condições do intestino e

assim ainda proporcionar considerável efeito benéfico. Portanto, enquanto estes resultados in

vitro não forem totalmente reproduzidos para as condições in vivo, estes dados fornecem

evidência de que o tratamento da tanase tem impacto positivo sobre a bioacessibilidade dos

polifenóis do chá.

145

5. Referências

ALONSO, J. Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos. In: IMPRESO, A. (Ed.). [s.l: s.n.]p. 10021–1026.

ARÇARI, D. P.; BARTCHEWSKY, W.; SANTOS, T. W.; OLIVEIRA, K. A.; FUNCK, A.; PEDRAZZOLI, J.; SOUZA, M. F. F. De; SAAD, M. J.; BASTOS, D. H. M.; GAMBERO, A.; CARVALHO, P. D. O.; RIBEIRO, M. L. Antiobesity effects of yerba maté extract (Ilex paraguariensis) in high-fat diet – induced obese mice. Obesity, v. 17, n. 12, p. 2127–2133, 2009. ARÇARI, D. P.; BARTCHEWSKY, W.; SANTOS, T. W.; OLIVEIRA, K. A.; OLIVEIRA, C. C.; GOTARDO, É. M.; PEDRAZZOLI, J.; GAMBERO, A.; FERRAZ, L. F. C.; CARVALHO, P. de O.; RIBEIRO, M. L. Anti-inflammatory effects of yerba maté extract (Ilex paraguariensis) ameliorate insulin resistance in mice with high fat diet-induced obesity. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 335, n. 2, p. 110–115, 2011.

ARÇARI, D. P.; SANTOS, J. C.; GAMBERO, A.; RIBEIRO, M. L. The in vitro and in vivo effects of yerba mate (Ilex paraguariensis) extract on adipogenesis. Food Chemistry, v. 141, n. 2, p. 809–15, 2013. ARTS, M. J. T. J.; HAENEN, G. R. M. M.; WILMS, L. C.; BEETSTRA, S. A. J. N.; HEIJNEN, C. G. M.; VOSS, H.-P.; BAST, A. Interactions between flavonoids and proteins: effect on the total antioxidant capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n. 5, p. 1184–1187, 2002. AZUMA, K.; IPPOUSHI, K.; NAKAYAMA, M.; ITO, H.; HIGASHIO, H.; TERAO, J. absorption of chlorogenic acid and caffeic acid in rats after oral. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 48, n. 11, p. 5496–5500, 2000.

BADHANI, B.; SHARMA, N.; KAKKAR, R. Gallic acid: a versatile antioxidant with promising therapeutic and industrial applications. RSC Advances, v. 5, n. 35, p. 27540–27557, 2015. BAGGOTT, M. J.; CHILDS, E.; HART, A. B.; DE BRUIN, E.; PALMER, A. A.; WILKINSON, J. E.; WIT, H. Psychopharmacology of theobromine in healthy volunteers. Psychopharmacology, v. 228, n. 1, p. 109–118, 2013. BASTOS, D. H.; SALDANHA, L. A.; CATHARINO, R. R.; SAWAYA, A.; CUNHA, I. B.; CARVALHO, P. O.; EBERLIN, M. N. Phenolic antioxidants identified by esi-ms from yerba maté (Ilex paraguariensis) and green tea (Camellia sinensis) extracts. Molecules, v. 12, n. 3, p. 423–432, 2007. BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Tannase production by Paecilomyces variotii. Bioresource technology, v. 98, n. 9, p. 1832–1837, 2007. BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A.; DE FREITAS, V. A. P. Hydrolysis of epigallocatechin gallate using a tannase from Paecilomyces variotii. Food Chemistry, v. 108, n. 1, p. 228–233, 2008.

BENSAAD, L. A.; KIM, K. H.; QUAH, C. C.; KIM, W. R.; SHAHIMI, M. Anti-inflammatory potential of ellagic acid, gallic acid and punicalagin A&B isolated from Punica granatum. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 17, n. 1, p. 47, 2017. BENZIE, I. F. F.; STRAIN, J. J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ‘antioxidant power’: the FRAP assay. Analytical Biochimistry, v. 239, n. 1, p. 70–76, 1996. BEZERRA, R. M. N.; VEIGA, L. F.; CAETANO, A. C.; ROSALEN, P. L.; AMARAL, M. E.

146

C.; PALANCH, A. C.; DE ALENCAR, S. M. Caffeic acid phenethyl ester reduces the activation of the nuclear factor κb pathway by high-fat diet-induced obesity in mice. Metabolism: Clinical and Experimental, v. 61, n. 11, p. 1606–1614, 2012.

BOADI, D. .; NEUFELD, R. . Encapsulation of tannase for the hydrolysis of tea tannins. Enzyme and Microbial Technology, v. 28, p. 590–595, 2001.

BOAVENTURA, B. C. B.; AMBONI, R. D. de M. C.; DA SILVA, E. L.; PRUDENCIO, E. S.; DI PIETRO, P. F.; MALTA, L. G.; POLINATI, R. M.; LIU, R. H. Effect of in vitro digestion of yerba mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil.) Extract on the cellular antioxidant activity, antiproliferative activity and cytotoxicity toward hepg2 cells. Food Research International, v. 77, p. 257–263, 2015. BOAVENTURA, B. C. B.; MURAKAMI, A. N. N.; PRUDÊNCIO, E. S.; MARASCHIN, M.; MURAKAMI, F. S.; AMANTE, E. R.; AMBONI, R. D. de M. C. Enhancement of bioactive compounds content and antioxidant activity of aqueous extract of mate (Ilex paraguariensis a. St. Hil.) through freeze concentration technology. Food Research International, v. 53, n. 2, p. 686–692, 2013b.

BOAVENTURA, B. C. B.; PIETRO, P. F.; KLEIN, G. A.; STEFANUTO, A.; DE MORAIS, E. C.; DE ANDRADE, F.; WAZLAWIK, E.; DA SILVA, E. L. Antioxidant potential of mate tea (Ilex paraguariensis) in type 2 diabetic mellitus and pre-diabetic individuals. Journal of Functional Foods, v. 5, n. 3, p. 1057–1064, 2013a.

BOAVENTURA, B. C. B.; PIETRO, P. F.; STEFANUTO, A.; KLEIN, G. A.; DE MORAIS, E. C.; DE ANDRADE, F.; WAZLAWIK, E.; DA SILVA, E. L. Association of mate tea (Ilex paraguariensis) intake and dietary intervention and effects on oxidative stress biomarkers of dyslipidemic subjects. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.), v. 28, n. 6, p. 657–64, 2012. BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT - Food Science and Technology, v. 28, n. 1, p. 25–30, 1995.

BRAVO, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutrition Reviews, v. 56, n. 11, p. 317–333, 1998.

BRAVO, L.; GOYA, L.; LECUMBERRI, E. LC / MS characterization of phenolic constituents of mate (Ilex paraguariensis , st. Hil.) and its antioxidant activity compared to commonly consumed beverages. Food Research International, v. 40, p. 393–405, 2007. BROWN, M.; DUNN, W. B.; DOBSON, P.; PATEL, Y.; WINDER, C. L.; FRANCIS-MCINTYRE, S.; BEGLEY, P.; CARROLL, K.; BROADHURST, D.; TSENG, A.; SWAINSTON, N.; SPASIC, I.; GOODACRE, R.; KELL, D. B. Mass spectrometry tools and metabolite-specific databases for molecular identification in metabolomics. Analyst, v. 134, p. 1322–1332, 2009.

CAO, G.; SOFIC, E.; PRIOR, R. L. Antioxidant capacity of tea and common vegetables. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, n. 11, p. 3426–3431, 1996.

CHAO, J.; HUO, T.-I.; CHENG, H.-Y.; TSAI, J.-C.; LIAO, J.-W.; LEE, M.-S.; QIN, X.-M.; HSIEH, M.-T.; PAO, L.-H.; PENG, W.-H. Gallic acid ameliorated impaired glucose and lipid homeostasis in high fat diet-induced NAFLD mice. PLoS ONE, v. 9, n. 6, p. e96969, 2014. CHENG, H.; LIN, C.; LIN, T. Antiviral properties of prodelphinidin b-2 3 ′ - o -gallate from green tea leaf. v. 13, n. 4, p. 223–229, 2002.

147

CHIA, Y. C.; RAJBANSHI, R.; CALHOUN, C.; CHIU, R. H. Anti-neoplastic effects of gallic acid, a major component of toona sinensis leaf extract, on oral squamous carcinoma cells. Molecules, v. 15, n. 11, p. 8377–8389, 2010.

CHOUDHARY, S.; MOURYA, A.; AHUJA, S.; SAH, S. P.; KUMAR, A. Plausible anti-inflammatory mechanism of resveratrol and caffeic acid against chronic stress-induced insulin resistance in mice. Inflammopharmacology, v. 24, n. 6, p. 347–361, 2016. CRISTINA, B.; BOAVENTURA, B.; LUIZ, E.; HAI, R.; FARIA, P.; PIETRO, D.; MINUZZI, A.; SCHWINDEN, E.; DIAS, R.; CASTANHO, D. M. Effect of yerba mate (Ilex paraguariensis a. St. Hil.) infusion obtained by freeze concentration technology on antioxidant status of healthy individuals. LWT - Food Science and Technology v. 62, p. 948–954, 2015.

DÁVALOS, A.; GÓMEZ-CORDOVÉS, C.; BARTOLOMÉ, B. Extending applicability of the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-fluorescein) assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 1, p. 48–54, 2004. DOAN, K. V.; KO, C. M.; KINYUA, A. W.; YANG, D. J.; CHOI, Y.-H.; OH, I. Y.; NGUYEN, N. M.; KO, A.; CHOI, J. W.; JEONG, Y.; JUNG, M. H.; CHO, W. G.; XU, S.; PARK, K. S.; PARK, W. J.; CHOI, S. Y.; KIM, H. S.; MOH, S. H.; KIM, K. W. gallic acid regulates body weight and glucose homeostasis through AMPK activation. Endocrinology, v. 156, n. 1, p. 157–168, 2015.

DUNN, W. B.; BROADHURST, D.; BROWN, M.; BAKER, P. N.; REDMAN, C. W. G.; KENNY, L. C.; KELL, D. B. Metabolic profiling of serum using ultra performance liquid chromatography and the LTQ-Orbitrap mass spectrometry system. Journal of Chromatography, v. 871, n. 2, p. 288–298, 2008.

EL-HUSSAINY, E.-H. M. A.; HUSSEIN, A. M.; ABDEL-AZIZ, A.; EL-MEHASSEB, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, v. 94, n. 8, p. 868–878, 2016. EL-TANASH, A. B.; SHERIEF, A. A.; NOUR, A. Catalytic properties of immobilized tannase produced from Aspergillus aculeatus compared with the free enzyme. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 28, n. 3, p. 381–391, 2011.

FARIED, A.; KURNIA, D.; FARIED, L. S.; USMAN, N.; MIYAZAKI, T.; KATO, H.; KUWANO, H. Anticancer effects of gallic acid isolated from indonesian herbal medicine, Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl, on human cancer cell lines. International Journal of Oncology, v. 30, p. 605–613, 2007.

FERREIRA, L. R.; MACEDO, J. A.; RIBEIRO, M. L.; MACEDO, G. A. Improving the chemopreventive potential of orange juice by enzymatic biotransformation. Food Research International, v. 51, n. 2, p. 526–535, 2013. FILIP, R.; LÓPEZ, P.; GIBERTI, G.; COUSSIO, J.; FERRARO, G. Phenolic compounds in seven south american Ilex species. Fitoterapia, v. 72, n. 7, p. 774–778, 2001. FLORES-MALTOS, A.; RODRÍGUEZ-DURÁN, L. V; RENOVATO, J.; CONTRERAS, J. C.; RODRÍGUEZ, R.; AGUILAR, C. N. Catalytical properties of free and immobilized Aspergillus niger tannase. Enzyme Research, v. 2011, p. 1–6, 2011.

FRIEDMAN, M.; KIM, S.-Y.; LEE, S.-J.; HAN, G.-P.; HAN, J.-S.; LEE, K.-R.; KOZUKUE, N. Distribution of catechins, theaflavins, caffeine, and theobromine in 77 teas consumed in

148

the United States. Journal of Food Science, v. 70, n. 9, p. 550–559, 2006.

GAMARO, G. D.; SUYENAGA, E.; BORSOI, M.; LERMEN, J.; PEREIRA, P.; ARDENGHI, P. Effect of rosmarinic and caffeic acids on inflammatory and nociception process in rats. ISRN Pharmacology, v. 2011, p. 1–6, 2011. GEE, J. M.; DUPONT, M. S.; RHODES, M. J. .; JOHNSON, I. T. Quercetin glucosides interact with the intestinal glucose transport pathway. Free Radical Biology and Medicine, v. 25, n. 1, p. 19–25, 1998.

GENARO-MATTOS, T. C.; MAURÍCIO, Â. Q.; RETTORI, D.; ALONSO, A.; HERMES-LIMA, M. Antioxidant activity of caffeic acid against iron-induced free radical generation— A chemical approach. PLOS ONE, v. 10, n. 6, p. e0129963, 2015. GONDOIN, A.; GRUSSU, D.; STEWART, D.; MCDOUGALL, G. J. White and Green Tea Polyphenols Inhibit Pancreatic Lipase in vitro. Food Research International, v. 43, n. 5, p. 1537–1544, 2010.

GONTHIER, M.; VERNY, M.; BESSON, C.; RE, C.; SCALBERT, A. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. Nutrient Metabolism, n. February, p. 1853–1859, 2003. GOSMANN, G.; BARLETTE, A. G.; DHAMER, T.; ARÇARI, D. P.; SANTOS, J. C.; DE CAMARGO, E. R.; ACEDO, S.; GAMBERO, A.; GNOATTO, S. C. B.; RIBEIRO, M. L. Phenolic compounds from maté (Ilex paraguariensis) inhibit adipogenesis in 3t3-l1 preadipocytes. Plant Foods for Human Nutrition, v. 67, n. 2, p. 156–161, 2012. GREEN, R. J.; MURPHY, A. S.; SCHULZ, B.; WATKINS, B. a.; FERRUZZI, M. G. Common tea formulations modulate in vitro digestive recovery of green tea catechins. Molecular Nutrition and Food Research, v. 51, n. 9, p. 1152–1162, 2007.

GU, L.; KELM, M. A.; HAMMERSTONE, J. F.; BEECHER, G.; HOLDEN, J.; HAYTOWITZ, D.; PRIOR, R. L. Screening of foods containing proanthocyanidins and their structural characterization using LC-MS/MS and thiolytic degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, n. 25, p. 7513–7521, 2003.

GUO, Q.; ZHAO, B.; LI, M.; SHEN, S.; XIN, W. Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, v. 1304, n. 3, p. 210–222, 1996. HE, Q.; LV, Y.; YAO, K. Effects of tea polyphenols on the activities of amylase, pepsin, trypsin and lipase. Food Chemistry, v. 101, n. 3, p. 1178–1182, 2006. HONG, Y.-H.; JUNG, E. Y.; PARK, Y.; SHIN, K.-S.; KIM, T. Y.; YU, K.-W.; CHANG, U. J.; SUH, H. J. Enzymatic improvement in the polyphenol extractability and antioxidant activity of green tea extracts. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 77, n. 1, p. 22–9, 2013. HONG, Y.-J.; YANG, S.-Y.; NAM, M.-H.; KOO, Y.-C.; LEE, K.-W. caffeic acid inhibits the uptake of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo- [4,5-b]pyridine (PhIP) by inducing the efflux transporters expression in caco-2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 38, n. 2, p. 201–207, 2015. HORŽIĆ, D.; KOMES, D.; BELŠČAK, A.; GANIĆ, K. K.; IVEKOVIĆ, D.; KARLOVIĆ, D. The composition of polyphenols and methylxanthines in teas and herbal infusions. Food Chemistry, v. 115, n. 2, p. 441–448, 2009.

HOTA, S. K.; DUTTA, J. R.; BANERJEE, R. Immobilization of tannase from Rhizopus

149

oryzae and its efficiency to produce gallic acid from tannin rich agro-residues. Indian Journal of Biotechnology, v. 6, n. 2, p. 200–204, 2007. ISUZUGAWA, K.; OGIHARA, Y.; INOUE, M. Different generation of inhibitors against gallic acid-induced apoptosis produces different sensitivity to gallic acid. Biological & pharmaceutical bulletin, v. 24, n. 3, p. 249–53, 2001.

JANG, Y. J.; KOO, H. J.; SOHN, E.-H.; KANG, S. C.; RHEE, D.-K.; PYO, S. Theobromine inhibits differentiation of 3T3-L1 cells during the early stage of adipogenesis via AMPK and MAPK signaling pathways. Food & Function., v. 6, n. 7, p. 2365–2374, 2015. KALE, A.; GAWANDE, S.; KOTWAL, S.; NETKE, S.; ROOMI, W.; IVANOV, V.; NIEDZWIECKI, A.; RATH, M. Studies on the effects of oral administration of nutrient mixture, quercetin and red onions on the bioavailability of epigallocatechin gallate from green tea extract. Phytotherapy Research, v. 24, n. S1, p. S48–S55, 2010. KANG, N. J.; LEE, K. W.; SHIN, B. J.; JUNG, S. K.; HWANG, M. K.; BODE, A. M.; HEO, Y.-S.; LEE, H. J.; DONG, Z. Caffeic acid, a phenolic phytochemical in coffee, directly inhibits fyn kinase activity and UVB-induced COX-2 expression. Carcinogenesis, v. 30, n. 2, p. 321–330, 2008. KEIJZERS, G. B.; DE GALAN, B. E.; TACK, C. J.; SMITS, P. Caffeine can decrease insulin sensitivity in humans. Diabetes Care, v. 25, n. 2, p. 364–369, 2002. LAMBERT, J. D.; SANG, S.; YANG, C. S. Possible controversy over dietary polyphenols: benefits vs risks. Chemical Research in Toxicology, v. 20, n. 4, p. 583–5, 2007. LATIEF, U.; HUSAIN, H.; MUKHERJEE, D.; AHMAD, R. Hepatoprotective efficacy of gallic acid during nitrosodiethylamine-induced liver inflammation in wistar rats. The Journal of Basic & Applied Zoology, v. 76, p. 31–41, 2016.

LIAO, C.; OU, T.; WU, C.; WANG, C. Prevention of diet-induced hyperlipidemia and obesity by caffeic acid in C57BL/6 mice through regulation of hepatic lipogenesis gene expression. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 61, n. 46, p. 11082–11088, 2013.

LIMA, V. N.; OLIVEIRA-TINTINO, C. D. M.; SANTOS, E. S.; MORAIS, L. P.; TINTINO, S. R.; FREITAS, T. S.; GERALDO, Y. S.; PEREIRA, R. L. S.; CRUZ, R. P.; MENEZES, I. R. A.; COUTINHO, H. D. M. Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: gallic acid, caffeic acid and pyrogallol. Microbial Pathogenesis, v. 99, p. 56–61, 2016. LIN, L.-Z.; CHEN, P.; HARNLY, J. M. New phenolic components and chromatographic profiles of green and fermented teas. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, n. 17, p. 8130–40, 2008.

LOVALLO, W. R.; FARAG, N. H.; VINCENT, A. S.; THOMAS, T. L.; WILSON, M. F. Cortisol responses to mental stress, exercise, and meals following caffeine intake in men and women. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 83, n. 3, p. 441–447, 2006. LOVALLO, W. R.; WHITSETT, T. L.; AL’ABSI, M.; SUNG, B. H.; VINCENT, A. S.; WILSON, M. F. Caffeine stimulation of cortisol secretion across the waking hours in relation to caffeine intake levels. Psychosomatic Medicine, v. 67, n. 5, p. 734–739, 2005.

LU, M.-J.; CHEN, C. Enzymatic modification by tannase increases the antioxidant activity of green tea. Food Research International, v. 41, n. 2, p. 130–137, 2008.

LUÍS, Â.; SILVA, F.; SOUSA, S.; DUARTE, A. P.; DOMINGUES, F. Antistaphylococcal

150

and biofilm inhibitory activities of gallic, caffeic, and chlorogenic acids. Biofouling, v. 30, n. 1, p. 69–79, 2014. MACEDO, J. A.; BATTESTIN, V.; RIBEIRO, M. L.; MACEDO, G. A. Increasing the antioxidant power of tea extracts by biotransformation of polyphenols. Food Chemistry, v. 126, n. 2, p. 491–497, 2011.

MACEDO, J. A; FERREIRA, L. R.; CAMARA, L. E.; SANTOS, J. C.; GAMBERO, A; MACEDO, G. A; RIBEIRO, M. L. Chemopreventive potential of the tannase-mediated biotransformation of green tea. Food Chemistry, v. 133, n. 2, p. 358–65, 2012. MANACH, C.; DONOVAN, J. L. Pharmacokinetics and metabolism of dietary flavonoids in humans. Free Radicals Research, v. 38, n. 8, p. 771–785, 2004. MANACH, C.; WILLIAMSON, G.; MORAND, C.; SCALBERT, A.; RÉMÉSY, C. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I . Review of 97 bioavailability studies. American Society for Clinical Nutrition, v. 81, n. suppl, p. 230–242, 2005.

MARTÍNEZ-PINILLA, E.; OÑATIBIA-ASTIBIA, A.; FRANCO, R. the relevance of theobromine for the beneficial effects of cocoa consumption. Frontiers in Pharmacology, v. 6, n. February, p. 1–5, 2015. MARTINS, F.; SUZAN, A. J.; CERUTTI, S. M.; ARÇARI, D. P.; RIBEIRO, M. L.; BASTOS, D. H. M.; CARVALHO, P. D. O. Consumption of mate tea (Ilex paraguariensis) decreases the oxidation of unsaturated fatty acids in mouse liver. The British Journal of Nutrition, v. 101, n. 4, p. 527–532, 2009. MATSUMOTO, R. L. T.; BASTOS, D. H. M.; MENDONÇA, S.; NUNES, V. S.; BARTCHEWSKY, W.; RIBEIRO, M. L.; DE OLIVEIRA CARVALHO, P. Effects of maté tea ( Ilex paraguariensis ) ingestion on mRNA expression of antioxidant enzymes, lipid peroxidation, and total antioxidant status in healthy young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 57, n. 5, p. 1775–1780, 2009.

MCDOUGALL, G. J.; DOBSON, P.; SMITH, P.; BLAKE, A.; STEWART, D. Assessing potential bioavailability of raspberry anthocyanins using an in vitro digestion system. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n. 15, p. 5896–5904, 2005. MEJIA, E. G.; SONG, Y. S.; RAMIREZ-MARES, M. V.; KOBAYASHI, H. Effect of yerba mate (Ilex paraguariensis) tea on topoisomerase inhibition and oral carcinoma cell proliferation. Journal of agricultural and food chemistry, v. 53, n. 6, p. 1966–1973, 2005.

MIRANDA, D. D. C.; ARCARI, D. P.; PEDRAZZOLI, J.; CARVALHO, P. D. O.; CERUTTI, S. M.; BASTOS, D. H. M.; RIBEIRO, M. L. Protective effects of mate tea (Ilex paraguariensis) on H2O2-induced DNA damage and DNA repair in mice. Mutagenesis, v. 23, n. 4, p. 261–265, 2008.

MITCHELL, E. S.; SLETTENAAR, M.; VD MEER, N.; TRANSLER, C.; JANS, L.; QUADT, F.; BERRY, M. Differential contributions of theobromine and caffeine on mood, psychomotor performance and blood pressure. Physiology and Behavior, v. 104, n. 5, p. 816–822, 2011.

MIZOOKU, Y.; YOSHIKAWA, M.; TSUNEYOSHI, T.; ARAKAWA, R. Analysis of oxidized epigallocatechin gallate by liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry : RCM, v. 17, n. 16, p. 1915–8, 2003. MOCHIZUKI, M.; YAMAZAKI, S. I.; KANO, K.; IKEDA, T. Kinetic analysis and mechanistic aspects of autoxidation of catechins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -

151

General Subjects, v. 1569, n. 1–3, p. 35–44, 2002.

MONEIM, A. A.; ABD EL-TWAB, S. M.; ASHOUR, M. B.; YOUSEF, A. I. Hepato-renal protective effects of gallic acid and p-coumaric acid in nicotinamide/streptozotocin-induced diabetic rats. International Journal of Bioassays, v. 5, n. 6, p. 4641, 2016. MURASE, T.; NAGASAWA, A.; SUZUKI, J.; HASE, T.; TOKIMITSU, I. Beneficial effects of tea catechins on diet-induced obesity: stimulation of lipid catabolism in the liver. International journal of obesity, v. 26, p. 1459–1464, 2002.

NARDINI, M.; CIRILLO, E.; NATELLA, F.; SCACCINI, C. Absorption of phenolic acids in humans after coffee consumption. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n. 20, p. 5735–5741, 2002. NEUFINGERL, N.; ZEBREGS, Y. E. M. P.; SCHURING, E. A. H.; TRAUTWEIN, E. A. Effect of cocoa and theobromine consumption on serum hdl-cholesterol concentrations: a randomized controlled trial. American Journal of Clinical Nutrition, v. 97, n. 6, p. 1201–1209, 2013. NI, H.; CHEN, F.; JIANG, Z. D.; CAI, M. Y.; YANG, Y. F.; XIAO, A. F.; CAI, H. N. Biotransformation of tea catechins using Aspergillus niger tannase prepared by solid state fermentation on tea byproduct. LWT - Food Science and Technology, v. 60, n. 2, p. 1206–1213, 2015. OLTHOF, M. R.; HOLLMAN, P. C. H.; BUIJSMAN, M. N. C. P.; AMELSVOORT, J. M. M.; KATAN, M. B. Chlorogenic acid , quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are extensively metabolized in humans. Human Nutrition and Metabolism, v. 133, p. 1806–1814, 2003. OLTHOF, M. R.; HOLLMAN, P. C. H.; KATAN, M. B. Human Nutrition and Metabolism Chlorogenic Acid and Caffeic Acid Are Absorbed in Humans 1. The Journal of Nutrition, v. 131, n. 1, p. 66–71, 2001.

PARK, J. H.; LEE, J. K.; KIM, H. S.; CHUNG, S. T.; EOM, J. H.; KIM, K. A.; CHUNG, S. J.; PAIK, S. Y.; OH, H. Y. Immunomodulatory effect of caffeic acid phenethyl ester in Balb/c mice. International Immunopharmacology, v. 4, n. 3, p. 429–436, 2004. PASSAMONTI, S.; VRHOVSEK, U.; VANZO, A.; MATTIVI, F. the stomach as a site for anthocyanins absorption from food. FEBS Letters, v. 544, n. 1–3, p. 210–213, 2003. PLUMB, G. W., GARCIA-CONESA, M. T., KROON, P. A., RHODES, M., RIDLEY, S. AND WILLIAMSON, G. Metabolism of chlorogenic acid by human plasma, liver, intestine and gut microflora. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 79, p. 390–392, 1999. PORRAS, D.; NISTAL, E.; MARTÍNEZ-FLÓREZ, S.; PISONERO-VAQUERO, S.; OLCOZ, J. L.; JOVER, R.; GONZÁLEZ-GALLEGO, J.; GARCÍA-MEDIAVILLA, M. V.; SÁNCHEZ-CAMPOS, S. Protective effect of quercetin on high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in mice is mediated by modulating intestinal microbiota imbalance and related gut-liver axis activation. Free Radical Biology and Medicine, v. 102, n. November 2016, p. 188–202, 2017 RAGHUWANSHI, S.; MISRA, S.; SAXENA, R. K. Enzymatic treatment of black tea (CTC and Kangra orthodox) using Penicillium charlesii tannase to improve the quality of tea. Journal of Food Processing and Preservation, v. 37, p. 855–863, 2013.

RAHMAN, I.; BISWAS, S. K.; KIRKHAM, P. A. Regulation of inflammation and redox

152

signaling by dietary polyphenols. Biochemical pharmacology, v. 72, n. 11, p. 1439–52, 2006. RAMIREZ-MARES, M. V.; CHANDRA, S.; DE MEJIA, E. G. In vitro chemopreventive activity of Camellia sinensis, Ilex paraguariensis and Ardisia compressa tea extracts and selected polyphenols. Mutation research, v. 554, n. 1–2, p. 53–65, 2004.

RAMÍREZ, L.; ARRIZON, J.; SANDOVAL, G.; CARDADOR, A.; BELLO-MENDOZA, R.; LAPPE, P.; MATEOS-DÍAZ, J. C. A new microplate screening method for the simultaneous activity quantification of feruloyl esterases, tannases, and chlorogenate esterases. Applied Biochemistry and Biotecnology, v. 151, n. 2, p. 711–723, 2008.

RECHNER, A.R.; SPENCER, J.P.E.; KUHNLE, G., HAHN, U.; RICE-EVANS C.A. Novel biomarkers of the metabolism of caffeic acid derivatives in vivo. Free Radical Biology and Medicine, v. 30, n. 11, p. 1213–1222, 2011. RECORD, I. R.; LANE, J. M. Simulated intestinal digestion of green and black teas. Food Chemistry, v. 73, n. 4, p. 481–486, 2001. RICE-EVANS, C. A.; MILLER, N. J.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine, v. 20, n. 7, p. 933–956, 1996.

RICE-EVANS, C.; MILLER, N.; PAGANGA, G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in Plant Science, v. 2, n. 4, p. 152–159, 1997.

ROSENDAHL, A. H.; PERKS, C. M.; ZENG, L.; MARKKULA, A.; SIMONSSON, M.; ROSE, C.; INGVAR, C.; HOLLY, J. M. P.; JERNSTROM, H. Caffeine and caffeic acid inhibit growth and modify estrogen receptor and insulin-like growth factor i receptor levels in human breast cancer. Clinical Cancer Research, v. 21, n. 8, p. 1877–1887, 2015.

SCHONS, P. F.; LOPES, F. C. R.; BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Immobilization of Paecilomyces variotii tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of microencapsulation, v. 28, n. 3, p. 211–9, 2011. SIRACUSA, L.; KULISIC-BILUSIC, T.; POLITEO, O.; KRAUSE, I.; DEJANOVIC, B.; RUBERTO, G. Phenolic composition and antioxidant activity of aqueous infusions from Capparis spinosa L. and Crithmum maritimum L. before and after submission to a two-step in vitro digestion model. Journal of agricultural and food chemistry, v. 59, n. 23, p. 12453–9, 2011.

SOLER, A.; ROMERO, M. P.; MACIÀ, A.; SAHA, S.; FURNISS, C. S. M. M.; KROON, P. a.; MOTILVA, M. J. Digestion stability and evaluation of the metabolism and transport of olive oil phenols in the human small-intestinal epithelial caco-2/tc7 cell line. Food Chemistry, v. 119, n. 2, p. 703–714, 2010.

SOURANI, Z.; POURGHEYSARI, B.; RAFIEIAN-KOPAEI, M.; SHIRZAD, H.; SHIRZAD, M. The effect of gallic acid on jurkat cell line. Journal of HerbMed Pharmacology, v. 4, n. 4, p. 129–132, 2015. SPENCER, J. P. E. Metabolism of tea flavonoids in the gastrointestinal tract. Proceedings of the third international scientific symposium on tea and human health: role of flavonoids in the diet, american society for nutritional sciences. The Journal of Nutrition, n. 27, p. 3255–3261, 2003. SPENCER, J. P. E.; SCHROETER, H.; RECHNER, A. R.; RICE-EVANS, C. Bioavailability of flavan-3-ols and procyanidins: gastrointestinal tract influences and their relevance to

153

bioactive forms in vivo. Antioxidants and redox signaling, v. 3, n. 6, p. 1023–1039, 2001.

STOJKOVIĆ, D.; PETROVIĆ, J.; SOKOVIĆ, M.; GLAMOČLIJA, J.; KUKIĆ-MARKOVIĆ, J.; PETROVIĆ, S. In situ antioxidant and antimicrobial activities of naturally occurring caffeic acid, p -coumaric acid and rutin, using food systems. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 93, n. 13, p. 3205–3208, 2013.

SU, Y. L.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y.; LUN SU, Y.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y.; SU, Y. L.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y. Stability of tea theaflavins and catechins. Food Chemistry, v. 83, n. 2, p. 189–195, 2003. SUGIMOTO, N.; MIWA, S.; HITOMI, Y.; NAKAMURA, H.; TSUCHIYA, H.; YACHIE, A. Theobromine, the primary methylxanthine found in theobroma cacao, prevents malignant glioblastoma proliferation by negatively regulating phosphodiesterase-4, extracellular signal-regulated kinase, akt/mammalian target of rapamycin kinase, and nuclear fact. Nutrition and Cancer-an International Journal, v. 66, n. 3, p. 419–423, 2014.

TAGLIAZUCCHI, D.; VERZELLONI, E.; BERTOLINI, D.; CONTE, A. In vitro bio-accessibility and antioxidant activity of grape polyphenols. Food Chemistry, v. 120, n. 2, p. 599–606, 2010. TUNG, Y.-T.; WU, J.-H.; HUANG, C.-C.; PENG, H.-C.; CHEN, Y.-L.; YANG, S.-C.; CHANG, S.-T. Protective effect of Acacia confusa bark extract and its active compound gallic acid against carbon tetrachloride-induced chronic liver injury in rats. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, v. 47, n. 6, p. 1385–92, 2009.

VARILEK, G. W.; YANG, F.; LEE, E. Y.; WILLEM, J. S.; ZHONG, J.; OZ, H. S.; WESTBERRY, K. F.; MCCLAIN, C. J. Green tea polyphenol extract attenuates inflammation in interleukin-2 – deficient mice, a model of autoimmunity 1. Nutrional Immunology, v. 131, n. 7, p. 2034–2039, 2001.

VINI, R.; SREEJA, S. Punica granatum and its therapeutic implications on breast carcinogenesis: A review. BioFactors, v. 41, n. 2, p. 78–89, 2015.

YAO, J.; CHEN, Q.; ZHONG, G.; CAO, W.; YU, A.; LIU, Y. Immobilization and characterization of tannase from a metagenomic library and its use for removal of tannins from green tea infusion. Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 24, n. 1, p. 80–86, 2014.

YOSHINO, K.; SUZUKI, M.; SASAKI, K.; MIYASE, T.; SANO, M. Formation of antioxidants from (-)-epigallocatechin gallate in mild alkaline fluids, such as authentic intestinal juice and mouse plasma. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 10, n. 4, p. 223–229, 1999.

ZENG, Y.; CHEN, H.; NI, T.; RUAN, R.; NIE, C.; LIU, X.; FENG, L.; ZHANG, F.; LU, J.; LI, J.; LI, Y.; TAO, W.; GREGORY, S. G.; GOTTSCHALK, W.; LUTZ, M. W.; LAND, K. C.; YASHIN, A.; TAN, Q.; YANG, Z.; BOLUND, L.; MING, Q.; YANG, H.; MIN, J.; WILLCOX, D. C.; WILLCOX, B. J.; GU, J.; HAUSER, E.; TIAN, X.-L.; VAUPEL, J. W. Interaction between the FOXO1A-209 genotype and tea drinking is significantly associated with reduced mortality at advanced ages. Rejuvenation Research, v. 19, n. 3, p. 195–203, 2016. ZHANG, M.; ZHOU, J.; WANG, L.; LI, B.; GUO, J.; GUAN, X.; HAN, Q.; ZHANG, H. Caffeic acid reduces cutaneous tumor necrosis factor alpha (TNF-Α), IL-6 and IL-1β levels and ameliorates skin edema in acute and chronic model of cutaneous inflammation in mice.

154

Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 37, n. 3, p. 347–354, 2014.

ZHAO, Y.; CHEN, P.; LIN, L.; HARNLY, J. M.; YU, L.; LI, Z. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry, v. 126, n. 3, p. 1269–1277, 2011. ZHU, Q. Y.; ZHANG, A.; TSANG, D.; HUANG, Y.; CHEN, Z. Stability of green tea

catechins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, n. 12, p. 4624–4628, 1997.

155

CAPÍTULO IV

Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their

potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro (Publicado na revista: Food and Function)

O artigo foi publicado em 01 de agosto de 2016

Food Funct. 2016, v.7, n. 9, 3920-3932

http://dx.doi.org/10.1039/C6FO00373G

156

Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their

potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro

Bruna Sampaio Roberto1*; Gabriela Alves Macedo2; Juliana Alves Macedo2; Isabela Mateus

Martins1; Vânia Mayumi Nakajima2; J. William Allwood3; Derek Stewart3; Gordon J.

McDougall3

1 Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil. 2 Food and Nutrition Department, College of Food Engineering, Campinas State University, Campinas, SP, Brazil 3 Environmental and Biochemical Sciences Group, Enhancing Crop Productivity and Utilisation Theme, The James Hutton Institute, Dundee, United Kingdom.

* Corresponding author: sampaior.bruna@gmail.com

157

ABSTRACT

The aim of this work was to assess the effect of immobilised-tannase treatment on

black, green, white and mate tea components and on their bioactivities relevant to obesity.

Tannase treatment caused predictable changes in polyphenol composition with substantial

reductions in galloylated catechins in green, white and black tea. Mate tea, which is rich in

chlorogenic acids, was much less affected by tannase treatment although some degradation of

caffeoyl quinic acid derivatives was noted. The original tea samples were effective in

inhibiting digestive enzymes in vitro. They inhibited amylase activity, some with IC50 values

~ 70 µg/mL, but were much less effective against µ-glucosidase. They also inhibited lipase

activity in vitro and they caused dose-dependent reductions in lipid accumulation in cultured

adipocytes.

The bio-transformed tea samples generally matched the effectiveness of the original

samples but in some cases they were markedly improved. In particular, tannase treatment

reduced the IC50 for amylase inhibition for green tea and white tea by 15- and 6-fold

respectively. In addition, the bio-transformed samples were more effective than the original

samples in preventing lipid accumulation in adipocytes.

These in vitro studies indicate that bio-transformed tea polyphenols could assist in the

management of obesity through improvement in energy uptake and lipid metabolism and

indicate that biotechnological modification of natural food molecules can improve the benefits

of a common beverage such as tea.

KEYWORDS

Polyphenols; anti-obesity; Camellia sinensis; Ilex paraguariensis ; tannase

158

ABBREVIATIONS

BT- black tea EC- epicatechin ECG- epicatechin gallate EGC- epigallocatechin EGCG - epigallocatechin gallate GAE- gallic acid equivalents GC- gallocatechin GT- green tea IC50 - concentration giving 50% inhibition MT- mate tea WT- white tea

159

1. Introduction

Obesity is a condition in which an abnormally large amount of fat is stored in the

adipose tissue, resulting in an increase in body weight and is one of the major global Public

Health problems. 1,2 Obesity has been associated with comorbid metabolic and chronic

diseases, such as type 2 diabetes, heart diseases, hypertension, stroke and several forms of

cancer, and has added tremendous burden to health care systems. 3 Thus, finding effective

therapies for obesity has received substantial attention and there has been a focus on

examining the massive natural variation inherent in phytochemicals for potential anti-obesity

effects.

During the last twenty years, the potential bioactivities of tea and tea polyphenols

have been intensively investigated. The action of tea polyphenols in preventing obesity may

be through stimulating hepatic lipid metabolism, 4 stimulating thermogenesis, 5 synergism

with caffeine and theanine, 6 inhibiting gastric and pancreatic digestive enzymes 7 and finally

suppressing fatty acid synthase. 8 Several studies have demonstrated the efficacy, the

importance and the potential use of inhibition of amylase, 9 glucosidases 10 and lipases 11,12 in

the treatment of obesity and associated comorbidities and reinforce the need to search for new

sources of these inhibitors. On the other hand, adipose tissue hyperplasia is a result of

increased adipogenesis, which includes preadipocyte proliferation and adipocyte

differentiation. Thus, potential therapeutic agents that have the ability to reduce or inhibit

adipogenesis or increase cell death by apoptosis could have a profound impact as a strategy

for treating and preventing obesity and related metabolic disorders. 13

Tea is the second most widely-consumed beverage worldwide (after water) and is

rich in polyphenolic compounds. Camellia sinensis (L.) Kuntze (Theaceae) is the species of

plant used extensively in infusions, which are made from their dried fresh (white and green

teas), enzymatically oxidized (oolong and black teas) or microorganism fermented (pu-erh

160

tea) leaves. 14,15 Currently, the products from primary and secondary metabolism of C.

sinensis are the focus of several chemical investigations. Green tea and white tea contains

several tea polyphenols, including epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC),

epicatechin gallate (ECG), and epicatechin (EC). 16 These flavonoids have been proven to

have antioxidant, anti-mutagenic, and anti-carcinogenic properties, and they can also prevent

cardiovascular diseases. 17 The oxidative process to produce black-tea leads to a

rearrangement of a series of compounds, as well as lead to compound decomposition. Thus,

black-tea contains the oxidation/condensation products of catechins, such as theaflavins and

polymeric thearubigins. 18,19 It is well established that these changes in the chemical

composition of different teas may be reflected in their biological properties.

Mate tea (Ilex paraguariensis ) is a plant originally from the subtropical region of

South America and is present in the South of Brazil, the North of Argentina, Paraguay and

Uruguay. Mate beverages are rich in polyphenolic compounds (mainly caffeoyl derivatives

e.g. dicaffeoylquinic and chlorogenic acids) but also saponins and purine alkaloids 20 and

several studies have identified mate tea as an excellent candidate in the struggle against

obesity. 21–25

The functional effect of the phenolic compounds depends not only on the amount

ingested, but on its bioavailability. 26 Furthermore, tea phenolics, particularly those with a

galloyl moiety or their polymers and esters, are not readily absorbed in humans. 27 However,

enzymes can be used in processing to alter the phenolic profile and thereby enhance

effectiveness and potential bioavailability. Macedo et al.28 evaluated the potential antioxidant

properties of green and mate tea extract before and after enzymatic biotransformation

catalysed by the tannase from Paecilomyces variotii. The antioxidant power of the extracts

increased after enzymatic treatment. Tannases have mostly been characterised by their

activity on complex polyphenolics, and are able to hydrolyse ‘‘ester’’ bonds (e.g. galloyl ester

161

of an alcohol moiety), as well as ‘‘depside’’ bonds (galloyl ester of gallic acid) of substrates

such as tannic acid, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, and chlorogenic acid. 29

Despite all of the potential application of biological catalysts, their industrial use can be

limited by several factors, such as production cost, potential allergenicity, high water

solubility, lower stability, low activity at high temperatures, and unfeasibility of recycling of

activity compared with chemical catalysts. To minimize these problems an alternative

approach is the use of immobilized enzymes. Reports regarding immobilized tannases from

Paecilomyces variotii are scarce, but its immobilized form offers several advantages,

including improvement of enzyme stability, reusability of the enzyme, ease of product

separation, and a possible continuous operation in bioreactors.

Based on published evidence of anti-obesity effect of those teas 4,12,13,21–25,30 and

obtained results by our group that biotransformation by tannase increases the bioactivity of

those beverages 28, the present study aims to evaluate the effect of immobilized tannase

biotransformation on the polyphenol composition of teas and the effect of biotransformed

extracts on obesity and diabetes through the inhibition of digestive enzymes and lipid

accumulation in 3T3-L1 differentiated into adipocytes.

2. Materials and Methods

2.1 Materials and Chemicals

Standard Black tea (BT), Green tea (GT), White tea (WT), Mate tea (MT), all from

the Leão® brand, were purchased in the local market (Campinas, SP, Brazil). Calcium

chloride, sodium phosphate, sodium alginate (alginic acid sodium salt), Folin–Ciocalteu,

lipase from Porcine pancreas Type II, p-nitrophenyl laurate, deoxycholate sodium salt, p-

nitrophenyl α-p-glucopyranoside, rat-intestinal acetone powder, potato starch, Porcine

pancreatic α-amylase, p-hydroxybenzoic acid hydrazide (PAHBAH), 1-methyl-3-

162

isobutylxanthine (IBMX), Dexamethasone, Oil Red O, methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium

bromide (MTT), sodium dodecyl sulphate (SDS) and insulin were purchased from Sigma–

Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitrile and formic acid for LC-MS analysis were

purchase from Optima™ (Fisher Scientific Ltd., Loughborough, Leicestershire, UK). The

standards chlorogenic acid and epigallocatechin gallate were from Extrasynthèse S.A. (Genay,

France). Tris (hydroxymethyl)-methylamine and HEPES were purchased from BDH,

Laboratory Supplies (Poole, Dorset, UK). Triton X-100 was purchased from Amersham

Pharmacia Biotech (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). Dulbecco’s modified medium

(DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Phosphate-Buffered Saline (PBS), penicillin-

streptomycin were purchased from Gibco® (Invitrogen Life Technologies, Alameda, CA,

USA).

2.2 Immobilized tannase

The tannase (tannin acyl hydrolase) from Paecilomyces variotii was obtained

according to a previously published procedure. 31 Immobilization was carried out using the

modified encapsulation method described by Schons et al. 32 A 5% sodium alginate solution

was prepared using an orbital shaker (200 rpm for 1 hour) then 54 mg tannase was mixed in

15 ml of 5% sodium alginate (3.6 mg of tannase/mL). The suspension was added dropwise

with a syringe into a beaker containing 90 mL of solution of calcium chloride (0.1M). The

obtained capsules were stabilised by storage in the calcium chloride solution overnight at 7ºC,

then separated by sieving, washed with 200 ml of distilled water at 10 °C and retained in Petri

dishes.

163

2.3 Preparation of tea extracts

30g of each sample of tea and 450 mL of 20 mM phosphate buffer, pH5.5 were

combined in 600 ml Becker flasks. The extraction of compounds from black, green, mate and

white tea was performed in a water bath at 100o C for 30 min. To obtain extracts before and

after biotransformation, the extractions were performed in duplicate. After being filtered on

filter paper, the original extracts were freeze-dried and the resulting powder was called

original tea extract and used in future analyses. This model allows comparison of enzymatic

biotransformation data already published using the free enzyme. 28

2.4 Biotransformation

The tea extracts (300 mL of infusion in 20 mM phosphate buffer, pH 5.5) were

biotransformed with 2.25 g immobilized tannase at 60°C for 2h with magnetic stirring at 300

rpm. At the end of the reaction, the immobilized enzyme was collected by filtration and the

biotransformed tea extracts were freeze-dried and used in future analyses.

2.5 Total Phenols

Dry extracts were dissolved in ethanol 5% at 1mg/mL and the phenol content was

measured using a modified Folin–Ciocalteu method 33 and quantified as gallic acid

equivalents (GAE).

2.6 Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analysis

The extracts were transferred to Single Step 0.45 µm PTFE filter analytical vials

fitted with pre-slit silicon septa caps (Thomson Ltd. Oceanside, California U.S., P/N 35540-

500). The samples were stored in the auto sampler at 6 °C and analysed in both negative and

positive electrospray ionisation (ESI) modes. HPLC separations were performed with a

164

Thermo Accela 600 HPLC system coupled with an Accela PDA detector (Thermo-Fisher Ltd.

Hemel Hempstead U.K). The HPLC was operated at a flow rate of 300 µL/min, the column

(Synergi C18 Hydro-RP 80 Ä, 150x2.0mm, 4 µm particle size; Phenomenex Ltd.

Macclesfield U.K., P/N 00F-4375-B0) was maintained at a temperature of 30 oC. The solvent

A, 18.2 MΩ.cm deionised water (ELGA-PureLab option-Q, Elga Ltd., High Wycombe U.K.),

and solvent B, HPLC grade acetonitrile were acidified with 0.1% [v/v] mass spectrometry

grade formic acid. The gradient programme was as follows: hold 98% A 0-2 min, 98-95% A

2-5 min, 95-55% A 5-25 min, 55% A - 100% B 25-26 min, hold 100% B 26-29 min, 100% B

– 98% A 26-30 min, hold 98% A 30-35 min. The HPLC column eluent was first monitored by

the Accela PDA detector where spectra were collected in wavelength/absorbance mode from

200-600 nm before then being transfered to the Thermo LTQ-Orbitrap XL mass spectrometry

system operated under Xcalibur software (Thermo-Fisher Ltd. U.K.). Mass spectra were

primarilly colected in full scan mode (m/z 80-2000) at a mass resolution of 30,000 (FWHM

defined at m/z 400) applying the FT detector, a data-dependent secondary scan event was

applied to collect MS2 CID fragmentation spectra (NCE 45, activation time 30 ms, 0.25

Activation Q) within the LTQ based upon the single most intense ion as defined within the

preliminary full MS scan, the full scan event generated 'profile' mode spectral data, whereas

the LTQ MS2 scan events generated ‘centroid’ mode data. The presence of phenolic

compounds was confirmed based on the comparison of HPLC retention time and accurate

mass full scan m/z and nominal mass MS2 data with literature values and against

standards34,35. The LC-MS raw data profiles were first converted into an MZML centroid

format within the Proteowizard MSConvert software package. Each MZML based three-

dimensional data matrix (intensity × m/z × time – one per sample) was converted (or

deconvolved) into a vector of peak responses, where a peak response is defined as the sum of

intensities over a window of specified mass and time range (e.g. m/z = 102.1 ± 0.01 and

165

time = 130 ± 10 s). In this experiment the deconvolution was performed using the freely

available XCMS software (http://masspec.scripps.edu/xcms/xcms.php). The XC-MS

deconvolution yields an MS Excel based XY matrix. The peak area values for the compounds

of interest within each sample analysed in triplicate were assessed for significant differences

between pre- and post-tannase treatments of each respective tea variety by applying a

Students two-tailed T-test.

2.7 α - Amylase assay

This assay was conducted as described previously with slight modifications. 36

Briefly, stock starch solution was prepared by suspending 1.25 (w/v) soluble potato starch in

synthetic saliva buffer and gelatinizing the mixture for 15 min at 90 °C. Porcine pancreatic α-

amylase was dissolved in synthetic saliva buffer at 380 mg/L. The control assay contained

800 µL of synthetic saliva buffer and 100 µL of α-amylase, 100 µL of UPW, and the reaction

was started by addition of 500 µL of starch solution. The assays with tea extracts contained

the required amounts of extracts within the 100 µL volume. To estimate IC50 values (the

amount of phenols that gave 50% inhibition of amylase), assays were carried out with a range

of sample contents. A 5% (w/v) stock solution of p-hydroxybenzoic acid hydrazide

(PAHBAH) in 0.5M HCl was diluted 1:4 with 0.5 M NaOH to give the working PAHBAH

reagent. Triplicate samples (40 µL) of assays were taken at fixed times (0, 5, 10, 15 and 20

min) and added to 1.2 mL of PAHBAH reagent in a 1.5 mL tube. After heating for 10 min at

90 °C, the absorbance at 410 nm was measured. Controls lacking enzyme were used as

blanks. An assay time of 5 min was used as the rate of production of reducing termini was

linear up to this point. Percentage of control amylase activity was calculated as the difference

between the control and the + extract reactions divided by the control reaction.

166

2.8 α - Glucosidase assay

The α-glucosidase assay was adapted from the method by Whitson et al. 37 and used

to measure inhibition of α-glucosidase by tea extracts. The buffer for this assay was 100 mM

HEPES (pH 6.8) and the substrate was 2 mM ρ-nitrophenyl α-ρ-glucopyranoside. A total of

3g of rat-intestinal acetone powder was suspended in 9mL of 0.9% saline, and the suspension

was vortexed. It was then centrifuged (16,000 rpm for 5 min) and the supernatant used.

Inhibitors were added in a fixed total volume to obtain the concentration ranges required for

individual experiments. Controls lacking inhibitors were run and defined the control activity

in each experiment. Each treatment was accompanied by a treatment blank containing all

components apart from the enzyme to account for the possible absorbance of the tea

extracts/inhibitors. This assay was time and substrate sensitive therefore all components were

added in a specific order: buffer, enzyme, inhibitor then substrate. The substrate was added

last to start the reaction. The assay was linear over for 2 h at 37 oC. Then samples were

centrifuged at 16,000 rpm for 5 min and the absorbance at 410 nm read in a UV

spectrophotometer. All samples were carried out in triplicate and values were presented as %

control activity ± standard deviation.

2.9 Lipase Assay (ρNP substrate)

This assay was as reported previously. 11 Lipase from porcine pancreas Type II was

dissolved in ultra-pure water at 10 mg/ml; then the supernatant was used after centrifugation

at 16,000 rpm for 5 min. The assay buffer was 100 mM Tris buffer (pH 8.2) and p-nitrophenyl

laurate (ρNP laurate) was used as the substrate. The substrate stock was 0.08% w/v ρNP

laurate dissolved in 5 mM sodium acetate (pH 5.0) containing 1% Triton X-100 and was

heated in boiling water for 1 min to aid dissolution, mixed well, then cooled to room

temperature.

167

The control assay contained 400 µL assay buffer, 450 µl substrate solution and 150µL

lipase. Tea extracts were dissolved in ultra-pure water in concentrations of 20 µg/mL to 100

µg/mL and added in 50 µL total volume. The buffer, enzyme and sample extracts were added

and then substrate was added to start the reaction. The samples were incubated at 37°C for 2h.

Then samples were centrifuged at 16,000 rpm for 2.5 min and read at 400 nm in a UV

spectrophotometer. All samples were assayed in triplicate and an inhibitor blank was prepared

for each sample. The results are expressed as % control activity.

2.10 Lipase activity assay using olive oil as the substrate

The olive oil assay system used was an adapted version by Wilcox et al. 38 of the

method of Vogel & Zieve. 39 The turbidimetric method measures the reduction in turbidity

that occurs following the breakdown of TAGs to free fatty acids by lipase. The olive oil was

passed through aluminium oxide (80 × 15 mm deep in a glass chromatography column –

checked) to remove free fatty acids. 10.0 g of the olive oil free from fatty acids was made up

to 100 mL with acetone giving a 10 % solution. This is turn was diluted 1 in 10 with acetone

to achieve a 1% olive oil stock solution. The stock solution was stored at 4°C and was used

over the entire series of experiments. For use in the assay, an olive oil substrate solution was

prepared by adding 4 mL of 1 % stock olive oil solution to a heated solution (70°C) of 100

mL 0.05 M Tris buffer at pH 8.3 containing 0.35% sodium deoxycholate. This solution was

maintained at 70°C and homogenised for 10 min. Once the froth had settled and the solution

had returned to room temperature, the substrate solution could be used in the assay for up to

6h. The enzyme solution contained 1.29 mg/ml lipase and 18 µg/ml colipase in deionised

water. Orlistat was added (0.4 µg/mL) to the enzyme solution as an inhibition control. Tea

extracts were added to the freshly prepared substrate solution containing the olive oil to give

50, 75, 100, 150, 200 and 250 µg GAE/mL. The samples were incubated at 37°C for 15 min.

168

After the incubation, the substrate solution was added to the solution containing the enzyme

solution or deionised water. The assay was maintained at 37°C and read every 5 min at 405

nm over 35 min.

2.11 Cell culture and differentiation

This assay was conducted as described previously with slight modifications by Moon

et al. 40 For the in vitro study, we used the cell line 3T3-L1, this cell line represents a well-

established model system to study fat metabolism. The 3T3-L1 cell line (preadipocytes) was

cultured to confluence in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 10 mL/L

penicillin/streptomycin at 37 °C and 5% CO2. Forty-eight hours after achieving confluence

(day 0), the cells were incubated in differentiation medium (DMEM supplemented with 10%

fetal bovine serum, 1 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin and 0.5 µM IBMX). After 72 h

(day 4), the cells were then cultured in maturation medium DMEM supplemented with 10%

fetal bovine serum and 10 µg/mL insulin) for 10 days.

For the MTT and Oil Red O assays the cells were incubated with Black, White,

Green and Mate tea before and after biotransformation at the following concentrations: 100,

200, 400 or 500 µg GAE/mL during the differentiation period (from day 3). The group not

treated with tea was used as control. Cell toxicity was estimated by using the tetrazolium salt

reduction test (MTT assay) on 3T3-L1 cells. 40

2.12 Oil Red O staining

The cells were incubated with the compounds during the diferenciation period (from

day 3). After 10 days of differentiation, the cells were washed with 10% formaldehyde in

PBS, fixed in 10% paraformaldehyde in PBS for 1h. After this time, the cells were washed

twice with 60% isopropyl alcohol following incubated for 1h with Oil Red O solution. After

169

multiple water washes, the Oil Red O was dissolved in 100% isopropyl alcohol, and the

optical density was measured on a microplate spectrophotometer at 540 nm. The data are

presented as mean ± SD from triplicate. 40

2.13 Statistical analysis

All data were expressed as mean ± SD in triplicate using STATISTICA software

version 8.0 (StatSoft. Inc. (2007), Tulsa, OK, USA). Analysis of variance (ANOVA) was

carried out followed by Tukey’s test. The significance level of p< 0.05 was employed.

3. Results and Discussion

3.1 Total Phenolic Content and Phenolic Profile

The tannase treatment increased total phenol content of teas from between 1.2 (WT)

to 1.8 fold (MT) (Table 3.1). Tannase catalyses the hydrolysis of the ester and depside bonds

in hydrolysable tannins or gallic acid esters (such as EGCG or ECG) releasing glucose,

epicatechin and gallic acid respectively. 41 It is possible that products released by tannase

react more intensely with Folin reagent and so have apparently increased the total phenolic

content of the samples. Alternatively, the tannase treatment may also have removed non-

phenolic material and thereby concentrated phenolic material. However, the recovery of dry

weight was not significantly lower after tannase treatment.

The composition of teas before and after tannase treatment were analysed by LC-MS

(Fig. 3.1; Table 3.2). The black, white, green and mate teas gave characteristic phenolic

compositions entirely consistent with previous reports. 12,16,19,42–45

GT and WT had a similar composition (Fig. 3.1) and tannase treatment caused

similar effects notably with higher amounts of gallic acid (peak 1) and epicatechin (peak 14)

and lower amounts of ECGC (peak 15) and ECG (peak 16; Table 3.2). BT also showed

170

increased levels of gallic acid and lower amounts of EGCG but the effects were less apparent

because BT has lower levels of these galloylated catechins. On the other hand, tannase

treatment of mate tea caused fewer changes but there were characteristic reductions in

chlorogenic acid isomers (e.g. peak 11), dicaffeoyl quinic acids (peaks 17-19) and the

appearance of caffeic acid (peak 13).

Table 3.1 Total phenol content of tea extracts. Phenols Black Tea Green Tea White Tea Mate tea

(µg GAE/mL)

Original 992.2 ± 6.8b 863.3 ± 28.2b 1112.0 ± 21.2b 820.3 ± 68.4b

Biotransformed

1647.1 ± 154.6a

1472.7 ± 139.7a

1365.9 ± 38.3a

1511.7 ± 45.0a

Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. Same letters represent p>0.05 in column; different letters represent p<0.05 in column.

Overall, the main components that increased in WT after tannase treatment were

gallic acid, gallocatechin, catechin and epicatechin. There were also less dramatic increases in

2 of the 3 chlorogenic acids and in theobromine. In GT, gallic acid, gallocatechin, catechin

and epicatechin notably increased with less dramatic increases in 2 of the 3 chlorogenic acids.

In BT, only gallic acid, epigallocatechin, catechin and epicatechin were increased. In Mate

tea, the mainly increased component was caffeic acid. In BT and MT, there were notable

decreases in caffeine and theobromine content.

Both EGCG and ECG were effectively depleted by tannase treatment of tea extracts.

This agrees with previous work who found that tannase completely hydrolysed EGCG in tea

to epigallocatechin (EGC) and gallic acid and increased the antioxidant activity. 28,46,47 Using

standards, Ni et al. 46 also proved that GCG was hydrolysed to GC and gallic acid and ECG

to EC and gallic acid. Overall, the reaction processes were consistent with previous findings

that tannase cleaves ester bonds in EGCG, ECG and chlorogenic acids.29

171

Figure 3.1 UV traces of tea extracts before and after tannase treatment. Samples were analysed at 1mg/mL and originals are in blue and tannase-treated in red. (A) Black tea (B) Green tea (C) White tea. (D) Mate tea. Traces are shown overlaid at 280 nm.

Figure 1. UV traces of tea extracts before and after tannase treatment. Samples were analysed at 1mg/mL and originals are in blue and tannase-treated in red. (A) Black tea (B) Green tea (C) White tea. (D) Mate tea. Traces are shown overlaid at 280 nm.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 18 19 20 21 22Time (min)

0102030405060708090

100FSD = 1.30E6

1

2 4

8

11

12

14 15 16

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 18 19 20 21 22Time (min)

0102030405060708090

100FSD = 1.10E6

B 1

2 3 4

79-11

12

14

15

16

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22Time (min)

0102030405060708090

100FSD = 1.10E6

C

16

15

14

12

9-1173 42

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22Time (min)

0102030405060708090

100FSD = 5.10E5

D

17 18 1913

1211

65

A

172

Table 3.2 Major changes in phenolic compounds after tannase treatment of teas. Peak Putative identity TR m/z/

(M-H)- MS2 BT GT WT MT

1 Gallic acid 4.5 169 125 é é é ó 2 5-galloylquinic acid 6.1 343 191,169 ê ó ó x 3 Gallocatechin 8.9 305 261, 279, 179, é é é x 4 Theobromine 9.1 ⊕181 ínfimo ê ó ó ê 5 4-O-caffeoylquinic acid 9.1 353 174, 191, 112 ó ó ó é 6 3-O-caffeoylquinic acid 9.9 353 191 ê é é ê 7 EGC 11.2 305 287, 261 é ó ó x 8 Prodelphinidin B 2-3’O-gallate 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê ê ê x 9 Catechin 11.7 289 245 é é é x 10 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê ê ê X 11 Chlorogenic acid 12.0 353 191, 179, 173 ê é é ê 12 Caffeine 12.5 ⊕195 138, 109 ê ó ó ê 13 Caffeic acid 12.7 179 135 x x x é 14 EC 13.2 289 245, 205 é é é X 15 EGCG 13.5 457 169, 331 ê ê ê X 16 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê ê ê X 17 Dicaffeoyl quinic acid 1 16.6 515 353, 191, 179 x x x ê 18 Dicaffeoyl quinic acid 2 17.1 515 353, 191, 179 x x x ê 19 Dicaffeoyl quinic acid 3 17.8 515 353, 191, 179 x x x ê The peak annotations refer to Figure 1. The symbols represent: é increased; ê decreased; ó no change; x not identified, ⊕ = positive mode.

3.2 Effects on α-Amylase and α-Glucosidase inhibition

For comparison, the results of the α-amylase inhibition assays were expressed in IC50

values (concentration giving 50% inhibition) based on the phenolic concentration of extracts

(Table 3.3).

All tea extracts inhibited α-amylase to some extent and were ranked as BT > MT >

GT > WT for original extracts and GT > WT > BT > MT for biotransformed extracts.

Therefore, the original extracts of BT and MT were better than tannase-treated extracts but,

on the other hand, tannase-treated extracts of WT and GT were substantially better than

original extracts. In fact, tannase treatment potentiated inhibition by GT and WT by 15 and 6

fold respectively but only slightly reduced the effectiveness of BT (x1.3) and MT (x1.5).

173

Tabela 3.3 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values for α-amylase activity. IC50 Black Tea Green Tea White Tea Mate tea

TPC (µg GAE/mL)

Original 65.5 ± 2.7Bc 178.4 ± 5.9Ab 209.7 ± 4.2Aa 70.0 ± 0.9Bc

Biotransformed 89.5 ± 0.9Ab 11.3 ± 0.3Bd 36.6 ± 3.2Bc 105.2 ± 1.6Aa

Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.

The IC50 values of the tea extracts against α-glucosidase activities are presented in

Table 3.4. None of the tea samples were particularly strong inhibitors and the original GT was

the most active sample with an IC50 at 512 µg/mL, compared to 675 µg/mL for the tannase-

treated GT sample. IC50 values could not be obtained for BT and MT as they did not reach 50

% inhibition at the concentrations used. The α-glucosidase inhibitory effect was ranked as GT

> WT > BT > MT for original extracts and as WT > GT > MT > BT for enzyme treated

extracts. The IC50 of the original WT and enzyme treated WT extracts were 662.0 and 604.7

µg/mL, respectively. Tannase treatment did not improve the effectiveness of BT (500 mg/mL

BT achieved 64% activity) but Mate was slightly more effective (i.e. 500 µg/mL achieved 84

% activity). Overall the tea extracts were much less effective against glucosidase than

amylase with IC50 values for α-amylase ~50 fold lower in some cases.

Table 3.4 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on α-glucosidase activity.

IC50 Black Tea Green Tea White Tea Mate tea TPC (µg GAE/mL)

Original 500 (65% ± 0.8)*

511.9 ± 2.8Bb 662.0 ± 47.2Aa 500 (94% ± 1.2)*

Biotransformed 500

(64% ± 0.9)* 674.7 ± 60.9Aa 604.7 ± 42.8Aa 500

(84% ± 2.0)* Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *% Activity obtained at the highest concentration tested. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.

174

The particular enhancement of amylase inhibition of WT (X6) and GT (X15) by

tannase treatment suggests that the reduction in galloylated components (such as EGCG and

ECG) and corresponding increases in gallic acid and free catechins may be important for

inhibition. Although to a much lesser extent, tannase treatment also increased the levels of

flavonol aglycones such as quercetin, kaempferol and myricetin in WT and GT through

hydrolysis of various glycosylated flavonols (shown in the previous chapter). Although these

differences were much less apparent than the changes in ECGC and EGC, approx ten-fold

lower by UV absorbance, they may still be relevant. Flavonols and their aglycones have been

found to inhibit a-amylase in vitro, with IC50 values at micromolar levels (equivalent to ~

6µg/mL for quercetin). Modelling suggested that these components act by binding at the

active site 48 and that glycosylated flavonols were considerably less effective than their

aglycones. Therefore, relatively small increases in flavonol aglycones in biotransformed green

and white tea samples may partly account for their enhanced effectiveness in amylase

inhibition. However, some inhibition may also occur through non-specific inhibition by

interaction of phenolic hydroxyl groups with enzymes through hydrogen bonds and/or

hydrophobic bonds. 49

The teas were not very effective inhibitors of glucosidase and overall, tannase

treatment did not improve inhibition. Flavonols have been found to have high glucosidase

inhibitory activity 50 but although their levels increased after tannanse treatment, they formed

a small proportion of the total content.

Amylases and glucosidases are the main enzymes responsible for the processing of

dietary starch and producing monosaccharides for absorption by enterocytes. α-Amylase

hydrolyses α-1,4-glycosidic bonds and splits amylose and amylopectin into smaller

oligosaccharides and disaccharides, like maltose. The α-glucosidases hydrolyse disaccharides

to monosaccharides. Previous reports suggest that the inhibition of these enzymes can be an

175

important concept for management of type 2 diabetes since inhibition of the two hydrolytic

enzymes could retard the influx of glucose from the intestinal tract and modulate increases in

postprandial blood glucose. 51 α-Glucosidase inhibitors, such as acarbose, have been shown to

be effective in suppressing postprandial hyperglycemia by limiting glucose absorption and the

resulting insulin response and this drug is one of the most widely used α-glucosidase

inhibitors to treat patients with type 2 diabetes and also to reduce vascular complications such

as retinopathy and neuropathy. 52 However, synthetic α-glucosidase inhibitors such as

acarbose are often associated with gastrointestinal side effects including abdominal pain,

flatulence, and diarrhoea due to bacterial fermentation of undigested carbohydrate in the

colon. Kwon et al. 53 suggest that intestinal α-glucosidase and α-amylase inhibitors from

natural sources such as plant-based foods could be as effective as synthetic drugs with lesser

undesirable side effects. However, high amylase inhibition and low glucosidase inhibition

shown by the tea samples might also show these negative side effects in vivo due to survival

of starch oligomers into the colon. Biotransformation of the teas with tannase is unlikely to

have improved these side effects as it enhanced amylase inhibition in most cases and did not

increase glucosidase inhibition.

3.3 Lipase inhibition effects

All tea samples showed inhibition of lipase and using ρNP as substrate they were

ranked as MT ≥ GT ≥ WT > BT for original extracts and WT > BT = GT = MT for tannase-

treated extracts (Table 3.5). WT and GT did not show inhibition of lipase activity when tested

at 25µg/mL (Figure 3.2) but gave slight but significant activation for some teas (Figure 3.2,

GT). In previous work, Gondoin et al. 12 reported IC50 values of 35 and 22 µg/mL for their

WT and GT preparations but reported no inhibition by BT at 200 µg GAE/mL. However, in

this study, BT showed effective inhibition (IC50 ~ 75 µg/mL).

176

Table 3.5 Lipase activity using ρNP substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.

IC50 Black Tea Green Tea White tea Mate tea TPC (µg/mL)

Original 75.0 ± 6.1Aa 51.2 ± 2.4Bbc 59.4 ± 4.3Ab 43.4 ± 3.7Bc

Biotransformed 68.9 ± 0.7Aa 69.9 ± 1.7Aa 55.8 ± 1.5Ab 70.0 ± 3.5Aa Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.

Overall the effects of tannase treatment were slight (e.g. changes in IC50 values of 1.6

– 1.0 fold). In Gondoin et al., 12 WT was more effective than GT, but only bio-transformed

samples showed this trend when the effectiveness of GT was reduced from IC50 values of ~51

to 70. The extracts in this study were less effective but these differences probably arose

because the WT and GT were obtained from different sources and had different compositions.

Notably, although tannase-treatment did not greatly alter the IC50 value for WT

(Figure 3.2), there was a trend to greater inhibition than the original WT with higher amounts

of extract. With GT, tannase treatment reduced the IC50 value (50 – 70 µg/mL) and this lower

effectiveness was apparent at higher concentrations.

Gondoin et al. 12 suggested that catechins, EGCG and estrictinina contents were

important for the inhibition of lipase. GT and WT had higher contents of these compounds

than black tea which supports this theory. Indeed, EGC, EGCG and gallic acid have been

identified as competitive inhibitors of pancreatic lipase in vitro with effectiveness, EGCG >

EGC > gallic acid. 54,55 However the reduction of EGCG and ECG in biotransformed white

tea did not alter the IC50 values as the higher content of catechin, epicatechin and gallic acid

may compensate for the loss of galloylated catechins. The mate tea extract showed high levels

of caffeoyl quinic acid derivatives and caffeic acid. Rohn et al. 56 reported that chlorogenic

acid inhibited amylase, trypsin and lysozyme through covalent bond formation but recent

work has suggested that chlorogenic acid may bind at the active site of pancreatic lipase as a

177

competitive inhibitor. 57 This may partly explain the effectiveness of mate tea in lipase

inhibition (IC50 = 43 µg/mL) and the lower inhibition by biotransformed mate tea extract

(IC50 = 70 µg/mL), which has reduced chlorogenic acid content. However, in these mixtures,

non-specific interactions of phenolics with lipase (protein-binding) may play a part in

inhibition.

Figure 3.2 Effect of white tea (a) and green tea (b) extracts on lipase activity. The dose response for phenols content of extracts on lipase inhibition was assessed. Values are expressed as % control activity and were triplicates ± standard deviation.

Lipase activity was also measured by changes in turbidity of olive oil due to the

breakdown of triacylglycerol to free fatty acids and monoacylglycerols. Orlistat, a lipase

inhibitor used as a positive control, strongly inhibited lipase activity with an IC50 of 0.4

µg/mL (data not shown). The extent of inhibition using the olive oil substrate were lower than

that shown with the synthetic substrate (ρNP-laurate) with GT, MT and BT approaching 60 %

activity at 200-250 µg/mL with no significant increases up to ~ 500 µg/mL (Table 3.6). Only

WT gave an IC50 value (~ 110 µg/mL) but this was which was 2 fold higher than the IC50

value noted for the ρNP laurate assay. The apparent order of effectiveness was WT > GT, MT

& BT, which was different from the order with ρNP-laurate. Overall, tannase-treatment

178

improved inhibitory performance in BT, GT and MT but slightly reduced the effectiveness of

WT but still gave an order of WT ≥ GT ≥ MT > BT. The tannase-treated teas also began to

plateau in effectiveness at higher concentrations so inhibition at 350 µg/mL was often only

35-45% (results not shown).

Table 3.6 Lipase activity using olive oil as a substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.

IC50 Black Tea Green Tea White Tea Mate tea TPC (µg/mL)

Original 250 (60.3% ± 2.6)*

200 (61.8 ± 6.1)*

112.0 ± 2.8B 200 (63.7 ± 5.0)*

Biotransformed 243.0 ± 9.6a 146.5 ± 12.5b 125.9 ± 4.7Ab 189.0 ± 10.6b

Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *Activity(%) from the best inhibition. Different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.

The ρNP-laurate is a synthetic substrate whereas olive oil is a natural mixture of

different triacylglycerols with varying acyl chain length, of differing affinity for lipase. 38

Lipase has to act on triglyceride substrates twice for there to be a detectable change, as

diacylglycerol is not solubilised and does not therefore reduce turbidity. This could explain

the lower levels of inhibition seen using olive oil compared to the synthetic substrate which

only requires one cleavage event. Also, pancreatic lipase has two domains, the N-terminal

catalytic domain (AA residues 1-336) and a C terminal domain (residues 337-449) which

binds to colipase which allows formation of the substrate-lipase complex, anchors the lipase

on the oil surface and stabilizes it in the active conformation. 58 The oil assay, but not the pNP

assay, requires added colipase and therefore tea components could also influence activity by

affecting colipase-lipase stability.

The observed inhibitory effect of teas on lipase activity agrees with He, et al. 59

where the effect on pancreatic lipase was less severe than with amylase. Pancreatic lipase is

essential for digestion of dietary fats in the intestinal lumen. It removes the fatty acids in

positions 1 and 3 of triglycerides releasing 2-monoacylglycerol and fatty acids. 60 Inhibition

179

of lipase is one of the most studied mechanisms for determining the potential efficacy of

natural products as anti-obesity agents. Limiting lipid digestion reduces fatty acid absorption,

lowers caloric utilization and may influence weight loss. 60 Tetrahydrolipstatin (Orlistat) is

currently approved for the treatment of obesity and, taken with a suitable diet, this drug has

been proven to promote weight loss and reduce weight recovery in obese patients over a

period of 2 years. 61 However use of Orlistat has been associated with adverse and

discomforting side effects and there has been a drive to discover natural alternatives which

has highlighted different classes of compounds such as saponins, polyphenols and terpenes

from plants. 62

3.4 3T3-L1 Cell Culture and adipogenesis

Most original and tannase-treated tea extracts were not cytotoxic to 3T3-L1 cells

(Figure 3.3) but certain samples (BT, BT-treated and MT) gave up to 20% non-viable cells.

However, this level has been suggested to be non-cytotoxic in previous studies 63.

Figure 3.3 Effect of tea extracts on 3T3-L1 cell viability. Two concentrations of tea extracts (250 and 500 µg of TPC/mL) were applied. Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. Values different from control group at *p< 0.05 are shown.

98.9107.1 87.3

96.7 *88,7 *

87,7100.7

106.2

97.3 102.5106.9

112.8

*80,0

*82,8 *

88,798.0

0

20

40

60

80

100

120

140

WhiteTea Biotransf.WhiteTea

GreenTea Biotransf.GreenTea

BlackTea Biotransf.BlackTea

Matetea Biotransf.MateTea

Cellviab

ility%

250µg/mL 500µg/mL

180

The effects of tea samples on adipogenesis were assessed by prevention of lipid

accumulation in 3T3-L1 cells as measured by Oil Red O staining. Previous studies have

shown that polyphenols as well as various natural extracts induce apoptosis, decrease lipid

accumulation and stimulate lipolysis in pre-adipocytes and adipocytes. 40,64,65 All original tea

samples significantly inhibited adipogenesis compared to controls in a dose-dependent

manner (Figure 3.4). The order of effectiveness was WT >MT >GT> BT. In all cases, the

tannase-treated tea samples were more effective than the original samples, albeit in BT this

only became significant at 400-500 µg/mL. However, the order of effectiveness did not

change. Biotransformed WT was the most effective treatment reducing lipid content to ~40%

control at 500 µg/mL. However, tannase-treated MT was more effective at lower

concentrations e.g. at 100 µg/mL tannase-treated MT gave ~65 % control lipid levels.

In BT, although tannase treatment enhanced gallic acid, epicatechin, catechin and

gallocatechin, prodelphinidin B2-3’-O-gallate levels were reduced. Prodelphinidin B2 is a

dimer of gallocatechin units 66 and prodelphinidin B2-3’-O-gallate is capable of forming

complexes with proteins and polysaccharides, and may interact with enzymes and

transcription factors involved in adipogenesis. 67 Kuo et al. 68 showed that prodelphinidin B-2

3’-O-gallate inhibited the proliferation of A549 cells and had no detectable toxic effects on

normal WI-38 cells.

Biotransformed WT inhibited adipogenesis at all concentrations tested. Increasing

doses reduced lipid accumulation over the control, reaching levels of 42% at a concentration

of 500 µg GAE/mL. This was significantly different from the original extract which reached

53% at this dose. However, Söhle et al. 30 noted that a related WT extract reduced lipid

accumulation up to 70%. The improvement of both GT and WT by biotransformation

suggests that reducing EGCG levels and increasing gallic acid and catechins may aid in

181

restricting adipogenesis. 13,69 It is also possible that catechins act in synergy with the surviving

caffeine to have a greater effect on adipogenesis as suggested by Dulloo et al.69

The effectiveness of the tannase-treated Mate tea may be explained by increased

relative amounts of the caffeoyl quinic acid isomers and caffeic acid.

Figure 3.4 Effect of Black tea (A); Green tea (B); White tea (C) and Mate tea (D) on lipid accumulation in 3T3-L1 cells.. Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *p< 0,05 compared with control group. Same letters represent p>0.05; different letters represent p<0.05.

0

50

100

150

Control 100 µg 200 µg 400 µg 500 µg

% L

ipid

con

tent

Original Biotransformed Control *a*a *a*a *a*b *a*b

A

0

50

100

150

Control 100µg 200µg 400µg 500µg

%Lipidcon

tent

Original Biotransformed Control*a*b *a*b *a*b *a*bC

0

50

100

150

Control 100 µg 200 µg 400 µg 500 µg

% L

ipid

con

tent

Original Biotransformed Control D

*a*b *a*b *a*b *a*b

0

50

100

150

Control 100 µg 200 µg 400 µg 500 µg

%L

ipid

con

tent

Original Biotransformed Control *a*b *a*b *a*b *a*bB

182

4. Conclusions

The tannase-mediated biotransformation of tea extracts caused predictable changes in

polyphenolic composition (increased gallic acid, caffeic acid, flavonol aglycones) and the

transformed extracts retained or improved their ability to inhibit the crucial starch hydrolysing

enzymes, α-glucosidase and amylase. However, the biotransformed teas inhibited α-amylase

most effectively, showing the greatest potential in use as an effective complementary therapy

for post prandial hyperglycemia linked to type 2 diabetes. Although biotransformed samples

had different behaviors, in general, the biotransformation was beneficial in lipase inhibition.

Furthermore, our data demonstrated that biotransformed tea extracts were more effective in

inhibiting adipogenesis than the originals. The results suggest that biotransformed teas are,

therefore, a suitable source to modulate the adipocyte life cycle and to induce hypolipidemic

action due to high inhibitory action of lipase and have therefore the potential to influence

body weight and obesity.

Scarce information is available with respect to enhanced functional properties of tea

extracts after tannase treatment; therefore, it appears reasonable to suggest that our findings

may be useful for the extension of existing applications of tannase in relation to tea

improvement.

183

5. References

1. J. O. Hill, H. R. Wyatt, G. W. Reed and J. C. Peters, Obesity and the Environment : Where

Do We Go from Here ? Science (80-. )., 2003, 299, 853–855.

2. WHO, WHO Press. World Health Statistics 2006. Organ. Geneva, Switz., 2006, 1–80.

3. A. G. Tsai, D. Williamson and H. Glick, NIH Public Access, Assoc. Study Obes., 2011,

12, 50–61.

4. T. Murase, A. Nagasawa, J. Suzuki, T. Hase and I. Tokimitsu, Beneficial effects of tea

catechins on diet-induced obesity : stimulation of lipid catabolism in the liver, International

Journal of Obesety, 2002, 1459–1464.

5. A. G. Dulloo, J. Seydoux, L. Girardier, P. Chantre and J. Vandermander, Green tea and

thermogenesis: interactions between catechin-polyphenols, caffeine and sympathetic activity,

Int. J. Obes. a, 2000, 24, 252–258

6. G. Zheng, K. Sayama and T. Okubo, Anti-obesity effects of three major components of

green tea , catechins , caffeine and theanine in mice , in vivo, 2004, 62, 55–62.

7. L. Han, T. Takaku, J. Li, Y. Kimura and H. Okuda, Anti-obesity action of oolong tea , Int.

J. Obes, 1999, 23, 98–105.

8. C.-W. Yeh, W.-J. Chen, C.-T. Chiang, S.-Y. Lin-Shiau and J.-K. Lin, uppression of fatty

acid synthase in MCF-7 breast cancer cells by tea and tea polyphenols: a possible mechanism

for their hypolipidemic effects, Pharmacogenomics J., 2003, 3, 267–276.

9. D. Grussu, D. Stewart and G. J. McDougall, Berry polyphenols inhibit α-amylase in vitro:

Identifying active components in rowanberry and raspberry J. Agric. Food Chem., 2011, 59,

2324–2331.

10. A. S. Boath, D. Stewart and G. J. McDougall, Berry components inhibit  α-glucosidase

in vitro: Synergies between acarbose and polyphenols from black currant and rowanberry.

Food Chem., 2012, 135, 929–936.

11. G. J. Mcdougall, N. N. Kulkarni and D. Stewart, Berry polyphenols inhibit pancreatic

lipase activity in vitro, Food Chem., 2009, 115, 193–199.

12. A. Gondoin, D. Grussu, D. Stewart and G. J. McDougall, White and green tea

polyphenols inhibit pancreatic lipase in vitro, Food Res. Int., 2010, 43, 1537–1544.

13. J. Lin, M. A. Della-Fera and C. A. Baile, Green tea polyphenol epigallocatechin

gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes, Obes. Res., 2005,

13, 982–990.

184

14. H. Y. Jiang, T. Shii, Y. Matsuo, T. Tanaka, Z. H. Jiang and I. Kouno, A new catechin

oxidation product and polymeric polyphenols of post-fermented tea, Food Chem., 2011, 129,

830–836.

15. A. B. Sharangi, Medicinal and therapeutic potentialities of tea (Camellia sinensis L.) –

A review, Food Res. Int., 2009, 42, 529–535.

16. Y. Zhao, P. Chen, L. Lin, J. M. Harnly, L. Yu and Z. Li, Tentative identification,

quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using

UPLC/DAD/MS, Food Chem., 2011, 126, 1269–1277.

17. X. Cao and Y. Ito, Preparation and Purification of Epigallocatechin by High-Speed

Countercurrent Chromatography (HSCCC), J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 2004, 27,

145–152.

18. U. H. Engelhardt, in Coprehensive natural products II, Development & Modification

of Bioactivity, Chemistry and biology., eds. L. Mender and H.-W. (Ben) Liu, 1st edn., 2010,

pp. 999–1032.

19. L.-Z. Lin, P. Chen and J. M. Harnly, New phenolic components and chromatographic

profiles of green and fermented teas, J. Agric. Food Chem., 2008, 56, 8130–40.

20. F. Martins, A. J. Suzan, S. M. Cerutti, D. P. Arçari, M. L. Ribeiro, D. H. M. Bastos

and P. D. O. Carvalho, Consumption of mate tea (Ilex paraguariensis) decreases the oxidation

of unsaturated fatty acids in mouse liver, Br. J. Nutr., 2009, 101, 527–532.

21. J. Pang, Y. Choi and T. Park, Ilex paraguariensis extract ameliorates obesity induced

by high-fat diet: Potential role of AMPK in the visceral adipose tissue, Arch Biochem

Biophys, 2008, 476, 178–185.

22. D. P. Arçari, W. Bartchewsky, T. W. Santos, K. A. Oliveira, A. Funck, J. Pedrazzoli,

M. F. F. De Souza, M. J. Saad, D. H. M. Bastos, A. Gambero, P. D. O. Carvalho and M. L.

Ribeiro, Antiobesity Effects of yerba maté Extract (Ilex paraguariensis) in High-fat Diet –

induced Obese Mice, Obesity, 2009, 17, 2127–2133.

23. D. P. Arçari, W. Bartchewsky, T. W. dos Santos, K. A. Oliveira, C. C. De Oliveira, É.

M. Gotardo, J. Pedrazzoli, A. Gambero, L. F. C. Ferraz, P. de O. Carvalho and M. L. Ribeiro,

Anti-inflammatory effects of yerba maté extract (Ilex paraguariensis) ameliorate insulin

resistance in mice with high fat diet-induced obesity, Mol. Cell. Endocrinol., 2011, 335, 110–

115.

185

24. D. P. Arçari, J. C. Santos, A. Gambero and M. L. Ribeiro, The in vitro and in vivo

effects of yerba mate (Ilex paraguariensis) extract on adipogenesis, Food Chem., 2013, 141,

809–15.

25. G. D. Pimentel, F. S. Lira, J. C. Rosa, A. V. Caris, F. Pinheiro, E. B. Ribeiro, C. M.

Oller do Nascimento and L. M. Oyama, Yerba mate extract (Ilex paraguariensis) attenuates

both central and peripheral inflammatory effects of diet-induced obesity in rats.Nutr.

Biochem., 2013, 24, 809–818.

26. B. Holst and G. Williamson, Nutrients and phytochemicals: from bioavailability to

bioefficacy beyond antioxidants, Curr. Opin. Biotechnol., 2008, 19, 73–82.

27. K. Nakagawa, S. Okuda and T. Miyazawa, Dose-dependent incorporation of tea

catechins, (-)-epigallocatechin-3-gallate and (-)-epigallocatechin, into human plasma, Biosci.

Biotechnol. Biochem., 1997, 61, 1981–1985.

28. J. A. Macedo, V. Battestin, M. L. Ribeiro and G. A. Macedo, Increasing the

antioxidant power of tea extracts by biotransformation of polyphenols, Food Chem., 2011,

126, 491–497.

29. M. T. García-Conesa, P. Østergaard, S. Kauppinen and G. Williamson, Carbohydr. ,

Hydrolysis of diethyl diferulates by a tannase from Aspergillus oryzae. Polym., 2001, 44,

319–324.

30. J. Söhle, A. Knott, U. Holtzmann, R. Siegner, E. Grönniger, A. Schepky, S. Gallinat,

H. Wenck, F. Stäb and M. Winnefeld, White Tea extract induces lipolytic activity and inhibits

adipogenesis in human subcutaneous (pre)-adipocytes, Nutr. Metab. (Lond), 2009, 6, 20.

31. V. Battestin and G. A. Macedo, Tannase production by Paecilomyces variotii.

Bioresour Technol, Nutr Metab (Lond), Bioresour. Technol., 2007, 98, 1832–7.

32. P. F. Schons, F. C. R. Lopes, V. Battestin and G. A. Macedo, Immobilization of

Paecilomyces variotii tannase and properties of the immobilized enzyme, J. Microencapsul.,

2011, 28, 211–219.

33. N. Deighton, R. Brennan, C. Finn and H. V Davies, Antioxidant properties of

domesticated and wild Rubus species. J. Sci. Food Agric., 2000, 80, 1307–1313.

34. W. B. Dunn, D. Broadhurst, M. Brown, P. N. Baker, C. W. G. Redman, L. C. Kenny

and D. B. Kell, Metabolic profiling of serum using Ultra Performance Liquid

Chromatography and the LTQ-Orbitrap mass spectrometry system, J. Chromatogr., 2008,

871, 288–298.

186

35. M. Brown, W. B. Dunn, P. Dobson, Y. Patel, C. L. Winder, S. Francis-McIntyre, P.

Begley, K. Carroll, D. Broadhurst, A. Tseng, N. Swainston, I. Spasic, R. Goodacre and D. B.

Kell, Mass Spectrometry Tools and Metabolite-Specific Databases for Molecular

Identification in Metabolomics, Analyst, 2009, 134, 1322–1332.

36. N. Pantidos, A. Boath, V. Lund, S. Conner and G. J. McDougall, Phenolic-rich

extracts from the edible seaweed , ascophyllum nodosum , inhibit α -amylase and α -

glucosidase : Potential anti-hyperglycemic effects. J. Funct. Foods, 2014, 10, 201–209.

37. J. Whitson, G. J. McDougall, H. A. Ross, V. a Lund, C. a Hamilton, A. F. Dominiczak

and D. Stewart, Bioactive Berry Components : Potential Modulators of Health Benefits,

Funct. Plant Sci. Biotechnol., 2010, 4, 34–39.

38. M. D. Wilcox, I. A. Brownlee, J. C. Richardson, P. W. Dettmar and J. P. Pearson, The

modulation of pancreatic lipase activity by alginates. Food Chem., 2014, 146, 479–484.

39. W. C. Vogel and L. Zieve, A rapid and sensitive turbidimetric method for serum lipase

based upon differences between the lipases of normal and pancreatitis serum, Clin. Chem.,

1963, 9, 168–181.

40. H. Moon, C. Chung, H. Lee, T. Kim, Y. Choi, C. Chung, G. U. Lee, T. Kim and Y.

Choi, Inhibitory Effect of ( % ) -Epigallocatechin-3- Gallate on Lipid Accumulation of 3T3-

L1 Cells, Obesity, 2007, 15.

41. P. K. Lekha and B. K. Lonsane, Production and application of tannin acyl hydrolase:

state of the art. In: Advances in Applied Microbiology, Advances in Applied Microbiology,

1997, pp. 44, 216–260.

42. L. Bravo, L. Goya and E. Lecumberri, LC / MS characterization of phenolic

constituents of mate (Ilex paraguariensis , St . Hil .) and its antioxidant activity compared to

commonly consumed beverages, Food Res, 2007, 40, 393–405.

43. D. H. M. Bastos, L. A. Saldanha, R. R. Catharino, C. Alexandra, H. F. Sawaya, I. B. S.

Cunha, P. O. Carvalho and M. N. Eberlin, Phenolic Antioxidants Identified by ESI-MS from

Yerba Maté, Molecules, 2007, 423–432.

44. M. A. Rostagno, N. Manchón, M. D. Arrigo, E. Guillamón, A. Villares and A. García-

lafuente, Analytica Chimica Acta Fast and simultaneous determination of phenolic

compounds and caffeine in teas , mate , instant coffee , soft drink and energetic drink by high-

performance liquid chromatography using a fused-core column., Anal. Chim. Acta, 2011,

685, 204–211.

187

45. Y. Hilal and U. Engelhardt, Characterisation of white tea – Comparison to green and

black tea, J. Consum. Prot. Food Saf., 2007, 2, 414–421.

46. H. Ni, F. Chen, Z. D. Jiang, M. Y. Cai, Y. F. Yang, A. F. Xiao and H. N. Cai,

Biotransformation of tea catechins using Aspergillus niger tannase prepared by solid state

fermentation on tea byproduct, LWT - Food Sci. Technol., 2015, 60, 1206–1213.

47. V. Battestin, G. A. Macedo and V. A. P. De Freitas, Hydrolysis of epigallocatechin

gallate using a tannase from Paecilomyces variotii, Food Chem., 2008, 108, 228–233.

48. E. Lo Piparo and S. A. Nestlé, Flavonoids for controlling starch digestion : Structural

requirements for inhibiting human Flavonoids for Controlling Starch Digestion : Structural

Requirements for Inhibiting Human r -Amylase, J. Med. Chem., 2008, 51, 3555–3561.

49. S. S. Deshpande, M. Cheryan, D. K. Salunkhe and B. S. Luh, Tannin analysis of food

products, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 1986, 24, 401–449.

50. C. L. T. Chang, Y. Lin, A. P. Bartolome, Y. Chen, S. Chiu and W. Yang, Herbal

Therapies for Type 2 Diabetes Mellitus : Chemistry , Biology , and Potential Application of

Selected Plants and Compounds, Evidence-Based Complement. Altern. Med., 2013, 2013.

51. E. Apostolidis and C. M. Lee, In vitro potential of Ascophyllum nodosum phenolic

antioxidant mediated alpha-glucosidase and alpha-amylase, J. Food Sci., 2010, 75, 97–102.

52. K. Tadera, Y. Minami, K. Takamatsu and T. Matsuoka, Inhibition of alpha-

glucosidase and alpha-amylase by flavonoids, J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo)., 2006, 52,

149–153.

53. Y. I. Kwon, D. A. Vattem and K. Shetty, Evaluation of clonal herbs of Lamiaceae

species for management of diabetes and hypertension, Asia Pac. J. Clin. Nutr., 2006, 15,

107–118.

54. Y. T. Zhu, X. Y. Ren, L. Yuan, Y. M. Liu, J. Liang and X. Liao, Fast identification of

lipase inhibitors in oolong tea by using lipase functionalised Fe3O4 magnetic nanoparticles

coupled with UPLC-MS/MS, Food Chem., 2015, 173, 521–526.

55. A. T. M. A. Rahim, Y. Takahashi and K. Yamaki, Mode of pancreatic lipase inhibition

activity in vitro by some flavonoids and non-flavonoid polyphenols, Food Res. Int., 2015, 75,

289–294.

56. S. Rohn, H. Rawel and J. Kroll, Inhibitory effects of plant phenols on the activity of

selected enzymes, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 3566–3571.

188

57. B. Hu, F. Cui, F. Yin, X. Zeng, Y. Sun and Y. Li, Caffeoylquinic acids competitively

inhibit pancreatic lipase through binding to the catalytic triad, Int. J. Biol. Macromol., 2015,

80, 529–535.

58. H. van Tilbeurgh, L. Sarda, R. Verger and C. Cambillau, Structure of the pancreatic

lipase-procolipase complex, Nature, 1992, 352, 159–162.

59. Q. He, Y. Lv and K. Yao, Effects of tea polyphenols on the activities of α-amylase,

pepsin, trypsin and lipase, Food Chem., 2006, 101, 1178–1182.

60. M. Mukherjee, Human digestive and metabolic lipases - A brief review, J. Mol. Catal.

B Enzym., 2003, 22, 369–376.

61. L. Sjöström, A. Rissanen, T. Andersen, M. Boldrin, A. Golay, H. P. Koppeschaar

and M. Krempf, Randomised placebo-controlled trial of orlistat for weight loss and

prevention of weight regain in obese patients. European Multicentre Orlistat Study Group.,

Lancet, 1998, 352, 167–172.

62. N. A. Lunagariya, N. K. Patel, S. C. Jagtap and K. K. Bhutani, Inhibitors of pancreatic

lipase: State of the art and clinical perspectives, EXCLI J., 2014, 13, 897–921.

63. C. M. O. Simões, M. Amoros and L. Girre, Mechanism of antiviral activity of

triterpenoid saponins, Phyther. Res., 1999, 13, 323–328.

64. S. Rayalam, M. A. Della-Fera and C. A. Baile, Phytochemicals and regulation of the

adipocyte life cycle, J. Nutr. Biochem., 2008, 19, 717–726.

65. T. F. Furuyashiki, H. N. Agayasu, Y. A. Oki, H. B. Essho, T. H. Ashimoto, K. K.

Anazawa and H. A. Shida, Tea Catechin Suppresses Adipocyte Differentiation Accompanied

by Down-regulation of PPAR 2 and C / EBP in 3T3-L1 Cells, Biomarkers, 2004, 68, 2353–

2359.

66. B. Severine and H. Hoste, Monomers of condensed tannins affect the larval

exsheathment of parasitic nematodes of ruminants, J. Agric. Food Chem., 2006, 54, 7481–

7487.

67. T. Okuda, Systematics and health effects of chemically distinct tannins in medicinal

plants, Phytochemistry, 2005, 66, 2012–2031.

68. P. L. Kuo, Y. L. Hsu, T. C. Lin and C. C. Lin, The antiproliferative activity of

prodelphinidin B-2 3' -O-gallate from green tea leaf is through cell cycle arrest and Fas-

mediated apoptotic pathway in A549 cells, Food Chem. Toxicol., 2005, 43, 315–323.

189

69. A. G. Dulloo, C. Duret, D. Rohrer, L. Girardier, N. Mensi, M. Fathi, P. Chantre and J.

Vandermander, Efficacy of a green tea extract rich in catechin polyphenols and caffeine in

increasing 24-h energy expenditure and fat oxidation, Am. J. Clin. Nutr, 1999, 1040–1045.

190

DISCUSSÃO GERAL

Estudos centrados em tecnologias que facilitem processos para obtenção de alimentos

com maior poder nutracêutico e no aumento da biodisponilibidade de compostos bioativos

tem aumentado consideravelmentemente. Estratégias nutricionais que proporcionem

prevenção e adjuvantes no tratamento de doenças crônicas são cada vez mais necessárias e

procuradas pela população. Logo, torna de suma importância que a comunidade científica

elucide cada vez mais o poder dos alimentos e formas que potencializem seus benefícios.

Nesse sentido, esse estudo proporcionou a encapsulação da enzima tanase com adequada

eficiência de imobilização (%EI) e boa porcentagem de atividade enzimática (%AE). A

estabilidade operacional da tanase imobilizada foi avaliada em processos descontínuos

repetidos. Depois de cada batelada, a tanase imobilizada foi lavada e reutilizada em condições

ótimas para a reação. A porcentagem de atividade residual foi determinada para 6 bateladas

sequenciais, indicando que a tanase imobilizada em alginato 5% reteve 86% da sua atividade

específica original após 5 ciclos, enquanto que tanase imobilizada em alginato 3,6% reteve

83%. Este é um resultado que demonstra promissor uso industrial destes imobilizados.

Através desse estudo foi possível o desenvolvimento de um modelo de biorreator

capaz de produzir, em maior escala, ácido gálico a partir da hidrólise de ácido tânico, podendo

ser utilizado em matrizes alimentares sem que necessite a permanência da enzima no produto

final. O planejamento adotado foi do tipo DCCR e as respostas foram obtidas através das

análises de atividade enzimática e eficiência de imobilização. A avaliação estatística do

planejamento mostrou até dois parâmetros significativos, porém, a análise de variância

mostrou que os resultados foram considerados insatisfatórios para geração de um modelo

preditivo (R2 < 0,5). Entretanto, os resultados individuais dos ensaios indicaram a tendência

dos parâmetros analisados e permitiram fixar os valores da concentração de alginato,

temperatura e agitação no ensaio subsequente do biorreator. O estudo univariado permitiu

atingir as condições mais adequadas para a hidrólise utilizando ácido tânico como substrato

(alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação, temperatura de 60ºC e concentração

do imobilizado enzimático de 0,75%). O trabalho mostrou as condições para a construção de

um biorreator com tanase imobilizada de forma a obter alta produtividade e alta eficiência.

Após esses resultados foi utilizado o biorreator para a biotransformação de 4 chás,

sendo eles: chá verde, branco, preto e mate. O tratamento com tanase imobilizada aumentou o

teor de polifenóis totais de 1,2 a 1,8 vezes. O tratamento enzimático permitiu a hidrólise das

191

ligações éster ou depsídicas dos taninos hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, como por

exemplo, EGCG e ECG (LEKHA; LONSANE, 1997). Esse aumento pode ser explicado por

uma maior reação dos produtos da reação enzimática com o reagente utilizado na técnica para

determinação de fenólicos (Follin Cecaulteau) e também é importante destacar que a enzima é

capaz de remover o material não fenólico contido nas amostras de chás e assim liberar os

compostos fenólicos ligados a fibras e outros complexos (CHAMORRO et al., 2012).

A análise por cromatografia líquida permitiu além da detecção de inúmeros

compostos, a quantificação dos principais polifenóis presentes nos chás. A catequina EGCG

foi confirmada por comparação da massa dos íons do pico padrão. O pico deste composto

apresentou maior área nas amostras originais, entretanto, em chás biotransformados por

tanase, foi detectado o aumento da sua forma de aglicona. Outra catequina detectada através

de seu espectro de massa revelou um íon de massa consistente com a estrutura de EGC (PM:

306 g/mol) detectado pelo íon de m/z 305, e ainda detectando o íon fragmentado que

corresponde à perda de CO2 (m/z 261) e C6H6O3, (m/z 179), resultado da cisão do anel

heterocíclico (GU et al., 2003; ZHAO et al., 2011). Este resultado é consistente com os

resultados apresentados por Macedo et al. (2011), estudo que comprovou que a tanase pode

hidrolisar a epigalocatequina galato em epigalocatequina e ácido gálico.

O ECG foi identificado com base na comparação do espectro de absorção, tempo de

retenção, e maior íon de fragmentação e notavelmente os extratos originais apresentaram os

níveis mais elevados, enquanto que naqueles que sofreram modificação de seu perfil fenólico

pela tanase o pico diminuiu significativamente. Os picos identificados como (-)-EC e ácido

gálico apresentaram níveis mais elevados em chás preto, verde e branco biotransformados.

Outras mudanças ocorreram nos extratos de chá devido ao tratamento enzimático: CVT e

CBT mostraram níveis mais elevados de GC, catequina e ácido clorogênico, acompanhado

pela diminuição de GCG, bem como a hidrólise da rutina e aumento da sua forma aglicona, a

quercetina, foi observado. No chá preto a tanase imobilizada resultou no aumento de ácido

gálico, epigalocatequina, catequina e epicatequina. O aumento do pico da miricetina e

kaempferol após o tratamento com tanase imobilizada, ainda que tenha sido muito discreto,

sugere que houve a hidrólise dos derivados de miricetina e kaempferol. Os resultados são

consistentes com Battestin et al. (2008), He et al. (2006), Macedo et al. (2011), Ni et al.

(2015) e Ferreira et al. (2013) e indicam que a tanase a partir de P. variotii na forma

imobilizada também é capaz de hidrolisar as ligações éster de substratos naturais.

192

A análise por HPLC/MS do extrato de chá mate revelou a presença de vários

derivados de ácido hidroxicinâmico, sendo a principal alteração pelo tratamento da tanase o

aumento de ácido cafeico, seguido da diminuição de ácido clorogênico e ácido

dicafeoilquínico. Resultados semelhantes foram detectados com tratamento de tanase livre

(MACEDO et al., 2011). A identificação do ácido clorogênico foi confirmada por análise do

íon majoritário, que revelou a presença do íon negativo [MH]- com m/z = 353. A

fragmentação MS2 com m/z 191 e 179 foram consistentes com ácido quínico e ácido cafeico,

bem como a fragmentação com m/z 173 indica a saída de uma molécula de água do ácido

quínico. Em contraste aos achados deste estudo e de Bastos et al. (2007), Filip et al. (2001)

descreveu a presença de quercetina, kaempferol e miricetina em extratos de chá mate.

Além da caracterização extensa dos chás, 66 compostos foram identificados através da

análise cromatográfica. As mudanças nas concentrações dos principais fenólicos antes e após

a biotransformação também foram mensuradas, confirmando o aumento de compostos para os

quais estudos têm relatado ter maior biodisponibilidade (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN,

2001; MANACH; DONOVAN, 2004; MACEDO et al., 2011). Dentre os vários resultados

interessantes, como o aumento de deglicosilados e diminuição da cafeína, o aumento mais

significativo foi claramente o aumento de ácido gálico, quando houve aumento de 16 vezes

para o chá verde e 13 vezes no chá branco. O chá preto apresentou aumento menos

significativo, o que pode ser explicado por já apresentar menor teor de moléculas que

pudessem hidrolisar e liberar moléculas de ácido gálico, como a EGCG e ECG. No chá verde

foi demonstrado que a tanase foi capaz de diminuir em 75% o teor de EGCG, aumentando em

70% seu produto de hidrólise EGC, além disso, ocorreram 95% de hidrólise da ECG,

acarretando num aumento de aproximadamente 2,7 vezes o conteúdo de EC, comprovando

alta afinidade da enzima por este substrato. Estes achados foram corroborados com a hidrólise

de 91% e 75% da ECG no chá preto e chá branco, respectivamente. Estas constatações

reafirmam a eficiência da tanase imobilizada na hidrólise de chás, uma vez que obtivemos

resultados de hidrólise próximos a estudos que utilizaram tanase livre em chás (LU; CHEN,

2008; RAGHUWANSHI; MISRA; SAXENA, 2012).

O tratamento da tanase em todos os extratos gerou uma complexa mistura de

estruturas diferentes, com ação antioxidante significativamente superior (métodos DPPH,

ORAC e FRAP (≤0.05)). O fator decisivo para explicar esses resultados da atividade

antioxidante pode ser a composição fenólica de cada extrato e não simplesmente o conteúdo

fenólico total (BASTOS et al., 2007). A catequina com maior atividade antioxidante ainda é

193

assunto controverso, então é relevante considerar as relações estabelecidas entre estrutura,

potencial de redução e as interações do conjunto dos compostos. À medida que a atividade

antioxidante é influenciada por ácidos fenólicos e flavonoides monoméricos, e que alterações

nos seus arranjos dos grupos hidroxilas e substituições por glicosilação acabam diminuindo a

atividade antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1997), espera-se que os fenóis

com moléculas menores e as agliconas aumentem a atividade antioxidante. Nesse sentido os

resultados deste estudo concordam com os estudos de Macedo et al. (2011), Macedo et al.

(2012) e Ni et al. (2015) quando a tanase ajudou a aumentar a atividade antioxidante,

corroborando a tese de que a tanase imobilizada tem aplicações práticas no processamento de

chás. Embora chás de Camellia sinensis biotransformados enzimaticamente tenham

apresentado melhora na atividade antioxidante, observou-se grande melhoria do chá mate

após a biotransformação, 3,35 vezes para DPPH, 1,42 vezes para ORAC e 1,13 para FRAP.

Ainda que a relação estrutura-atividade seja mais complexa e, vários fatores devem ser

analisados, os resultados desses ensaios apoiam o princípio de que as estruturas com mais

grupos hidroxila exercem maior atividade antioxidante, uma vez que a hidrólise pela enzima

reestabelece a molécula com mais uma OH livre, como por exemplo, os ésteres de catequina

galato, que ao serem hidrolisados resultam na liberação dos antioxidantes catequina e ácido

gálico (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).

Ao realizar o estudo in vitro para avaliar a disponibilidade dos compostos fenólicos e a

sua estabilidade através do processo digestivo em um modelo de sistema que simula o

processo digestivo humano, os cromatogramas das amostras pós-digestão puderam

demonstrar que as etapas do processamento do chá podem, potencialmente, influenciar a

bioacessibilidade de polifenóis bioativos. Embora a proporção de polifenóis recuperados após

digestão in vitro foi mais elevada nas amostras originais do que nas de chás biotransformados,

através dos gráficos obtidos por cromatografia pode ser analisado que os picos de ácido

gálico, ácido cafeico, PDGB, EGC e EC são capazes de resistir à digestão gástrica e se não

forem absorvidas até este momento, atingem o intestino, onde por serem moléculas simples

podem ser facilmente absorvidas pelos enterócitos. Em acordo com o princípio proposto por

Green et al. (2007) de que processos tecnológicos melhoram a recuperação dos compostos

fenólicos, ainda que o estudo não tenha substancialmente aumentado a recuperação dos

polifenóis, a biotransformação trouxe uma abordagem que permite a disponibilidade de

moléculas que são mais facilmente absorvidas e tem potencial de serem biodisponíveis e

bioacessíveis, ou seja, a melhora foi qualitativa e não quantitativa. É importante ressaltar que

194

os principais compostos incrementados através da biotransformação apresentaram boa

recuperação nas amostras de chá verde e chá branco, como por exemplo, o ácido gálico. A

estabilidade do ácido gálico nos três chás de Camellia sinensis, está de acordo com os

trabalhos sobre a biodisponibilidade do ácido gálico em seres humanos, que documentam que

este composto é extremamente bem absorvido, em comparação a outros polifenóis, fato

importante uma vez que é um potente antioxidante e possui uma ampla variedade de estudos

comprovando sua eficácia na prevenção e como adjuvante no tratamento da obesidade

(MANACH et al., 2005; TUNG et al., 2009; CHAO et al., 2014; BADHANI; SHARMA;

KAKKAR, 2015; DOAN et al., 2015).

Análises em cromatografia líquida com detector de espectrometria de massa (HPLC-

MS) mostraram que tanto EGC como EGCG foram as catequinas mais suscetíveis à

degradação na digestão pancreática. A instabilidade de catequinas ao pH quase neutro, bem

como a sensibilidade das catequinas às condições intestinais do duodeno já foram

previamente relatadas (ZHU et al., 1997; RECORD; LANE, 2001; SU et al., 2003). O pH

elevado (6,0-8,0), o oxigênio residual dissolvido, e provável presença de espécies reativas de

oxigênio advindas da digestão normal podem facilitar várias reações, incluindo a

epimerização e auto-oxidação no lúmen intestinal (ZHU et al., 1997; SU et al., 2003).

Acredita-se que reações de auto-oxidação continuam devido à vulnerabilidade dos grupos

hidroxila adjacentes (radical pirogalol) no anel B da EGC e EGCG (ZHU et al., 1997; ARTS

et al., 2002) levando a desprotonação, subsequente formação de radicais livres semiquinona

no anel B (GUO et al., 1996; MIZOOKU et al., 2003; LAMBERT; SANG; YANG, 2007) e

permitindo que intermediários reajam ainda mais, formando vários produtos finais que,

potencialmente, incluem irreversíveis produtos de dimerização homo e hetero (YOSHINO et

al., 1999; MOCHIZUKI et al., 2002). De acordo com observações de Green et al. (2007), que

realizaram estudo sobre a estabilidade das catequinas EC e ECG, esses compostos são menos

sensíveis à digestão simulada. Estudos sugeriram que próximo ao pH neutro a capacidade de

doar elétron dos grupos pirogalol para EGCG e EGC é significativamente maior do que para

os grupos catecol em EC e ECG resultando em aumento da taxa de oxidação (MOCHIZUKI

et al., 2002), em outras palavras estas diferenças na estrutura do anel B podem, portanto, ser

útil na previsão da sensibilidade intestinal de catequinas e que pode ser melhor percebida

através da recuperação destas moléculas nas amostras biotransformadas de chás após a

simulação in vitro.

195

O ácido cafeico aumentado pela biotransformação foi passível de recuperação, sendo o

ácido fenólico o composto majoritário na amostra de chá mate obtida após a simulação da

digestão gástrica em comparação com a recuperação deste composto após a digestão na

primeira porção do intestino. Em indivíduos com ileostomia, foi demonstrado que 33% de um

total de 2,8 mmol de ácidos clorogênicos (isômeros 3,4 e 5-CQA) foram absorvidos no

estômago e intestino delgado, enquanto a absorção de ácido cafeico, administrado na mesma

dose, foi de 95% (OLTHOF et al., 2003). Resultados semelhantes foram encontrados em

experimentos com animais (AZUMA et al., 2000; GONTHIER et al., 2003). Dessa forma

salienta-se como a biotransformação do ácido clorogênico pode ter efeitos positivos na

biodisponibilidade de compostos bioativos realmente potentes, uma vez que viabilizou a

disponibilidade de ácido cafeico após a digestão gástrica, o que não ocorreu com a amostra de

chá mate original. O ácido clorogênico por sua vez não foi identificado nas duas amostras,

sugerindo que houve degradação em moléculas não identificadas. Dentre os inúmeros efeitos

farmacológicos comprovados do ácido cafeico, propriedades antioxidantes (STOJKOVIĆ et

al., 2013; GENARO-MATTOS et al., 2015), anti-inflamatórias (ZHANG et al., 2014;

CHOUDHARY et al., 2016), antibacteriana (LUÍS et al., 2014; LIMA et al., 2016) e

anticarcinogênica, (KANG et al., 2008; HONG et al., 2015; ROSENDAHL et al., 2015)

podemos ilustrar a importância desse composto para a saúde com os resultados do estudo em

que o ácido cafeico suprimiu a atividade de lipogênese e ativou a enzima AMPK. A enzima

AMPK está relacionada com a β-oxidação dos ácidos graxos, indicando o potencial

significativo do ácido cafeico como agente antiobesidade por supressão de enzimas

lipogênicas e acumulação de lipídeos (LIAO et al., 2013).

Nesse estudo também foi avaliado o poder dos chás originais e após biotrasformação

enzimática na inibição de enzimas gástricas. Todos os extratos apresentaram algum poder

inibitório da enzima α-amilase e foram ranqueados como CP > CM > CV > CB entre as

amostras originais e CVT > CBT > CPT > CMT entre as amostras que sofreram a ação da

tanase, mostrando que a tanase trouxe especialmente significativos benefícios para os chás

verde e branco, aumentando a inibição em 15 e 6 vezes, respectivamente.

Particularmente o aumento da inibição da amilase através do tratamento enzimático

sugere que a redução de componentes ligados ao grupamento galoil e consequente aumento

do ácido gálico e catequinas livres podem ter importante papel na inibição. Adicionalmente, a

tanase foi capaz de hidrolisar vários flavonols glicosilados, aumentando as formas agliconas

de quercetina, miricetina e kaempferol, que já tem sua maior ação sobre a inibição de enzimas

196

documentada (PIPARO; NESTLÉ, 2008). Portanto, os aumentos relativamentes pequenos de

flavonols agliconas em amostras de chá verde e branco biotransformadas pode explicar

parcialmente a sua eficácia aumentada na inibição da amilase. Amilase e glicosidases são as

principais enzimas responsáveis pela digestão do amido, produzindo monossacarídeos para a

absorção pelos enterócitos. Estudos sugerem que a inibição dessas enzimas podem ser uma

importante maneira de apoiar a manutenção de diabetes tipo 2, retardando assim a absorção de

glicose pelo trato gastrointestinal e modulando o aumento da glicose sérica pós-prandial

(APOSTOLIDIS; LEE, 2010).

Ao testar a inibição da enzima α-glucosidase não houve amostras com grande

atividade inibitória, no entanto amostras de CV apresentaram maior inibição, com IC50=

512 µg/mL, comparado a 675 µg/mL das amostras após tratamento com tanase. Já o IC50 das

amostras originais e biotransformadas de chá branco foram 662,0 e 604,7 µg/mL,

respectivamente. Não foi obtido IC50 das amostras de chá preto e mate, pois não atingiram

50% da inibição. O tratamento com tanase imobilizada não foi capaz de aumentar o poder do

chá preto, ensaio com 500 µg/mL de CP apresentou 65% e com CPT 64% da atividade de α-

glicosidase, enquanto o chá mate após sofrer a hidrólise da tanase foi capaz de diminuir a

atividade de 94% para 84% com 500 µg/mL.

Todas as amostras de chás apresentaram inibição da lipase usando ρNP-laurato como

substrato. Enquanto que para as amostras originais o chá com maior ação inibitória sobre a

enzima foi o chá mate e os menores foram chá preto e branco, após o tratamento com tanase o

comportamento foi o inverso. Gondoin et al. (2010) sugeriram que as catequinas, EGCG e

estrictinina são importantes nesse mecanismo de ação. Chá verde e chá branco apresentaram

maior conteúdo desses compostos que o Chá preto, suportanto essa teoria.

De fato, EGCG, EGC, e ácido gálico têm sido identificados como inibidores

competitivos da lipase pancreática in vitro (RAHIM; TAKAHASHI; YAMAKI, 2015; ZHU

et al., 2015), entretanto, a redução de EGCG e ECG no chá branco biotransformado não

prejudicou valores de IC50. O maior teor de catequina, epicatequina e ácido gálico pode

compensar a perda de catequinas com a molécula de galato. O extrato de chá mate apresentou

altos níveis de derivados de ácido cafeoilquínico e ácido cafeico. Rohn, Rawel e Kroll (2002)

relataram que o ácido clorogênico inibiu a amilase, tripsina e lisozima através da formação de

ligações covalentes, mas trabalhos recentes sugeriram que o ácido clorogênico pode se ligar

ao local ativo da lipase pancreática como um inibidor competitivo. Isto pode explicar em parte

a eficácia do CM na inibição da lipase (IC50 = 43 µg / mL) e a menor inibição pelo CMT

197

(IC50 = 70 µg / mL), que tem reduzido teor de ácido clorogênico. Contudo, nestas misturas,

interações não específicas de fenólicos com lipase (ligação a proteínas) podem desempenhar

um papel na inibição.

Quando a atividade da lipase foi avaliada utilizando como substrato o azeite e como

controle positivo o orlistat, medicamento comumente utilizado para diminuir a absorção de

lipídeos, percebeu-se que a extensão da inibição foi menor que a mostrada com o substrato

sintético (ρNP-laurato) com CV, CM e CP. O ρNP-laurato é um substrato sintético, enquanto

que o azeite é um substrato natural, resultado de uma mistura de diferentes triacilgliceróis

com comprimento de cadeia acila variáveis, que terão afinidade diferente pela enzima

(ROGALSKA; RANSAC; VERGER, 1990; JEMEL et al., 2009). A enzima teria também de

atuar sobre o substrato duas vezes para que houvesse alteração detectável na densidade óptica,

uma vez que a atividade da lipase foi medida por alterações na turbidez da solução de azeite

devido à degradação do triacilglicerol em ácidos graxos livres e monoacilglicerol. Nessa ação

de hidrólise primeiramente forma-se o diacilglicerol, que não foi tão solubilizado e, portanto,

não reduziu tão fortemente a densidade óptica. Outro fator que deve ser avaliado é que a

cadeia polipeptídica da lipase pancreática é dividida em duas unidades, o domínio terminal N

compreende os resíduos de aminoácidos 1-336 e o domínio terminal C com os resíduos 337-

449 (TILBEURGH et al., 1992). O terminal N é o domínio catalítico e o terminal C liga-se à

colipase, um cofactor necessário para a atividade da enzima. A colipase liga-se à lipase,

tornando-se um intermediário que permite a formação do complexo substrato-lipase e

contribui para ancorar a lipase na superfície e estabilizá-la na conformação ativa

(BROCKMAN, 2000). No ensaio utilizando o substrato natural utilizou-se colipase, uma vez

que os compostos de chás também podem interagir com colipase e ao desestabilizar a

conformação enzimática o efeito inibidor pode ser aumentado ou caso contrário, se esta

interação não ocorrer a enzima pode tornar-se mais estável. Por outras palavras, a interação

inibidor-complexo enzimático é diferente da interação inibidor-lipase utilizadas nos ensaios.

A maioria dos extratos de chás originais e biotransformados mostrou não ser

citotóxicos para células 3T3-L1. Ainda que alguns (CP, CPT e CM) tenham apresentado até

20% de células não viáveis, este valor não é preocupante e tem sido sugerido como não

citotóxicos em estudos anteriores (SIMÕES; AMOROS; GIRRE, 1999). Os efeitos das

amostras de chá sobre a adipogênese foram avaliados pela prevenção da acumulação de

lípideos em células 3T3-L1, tal como medido pela coloração com Oil Red O. Estudos

anteriores mostraram que os polifenóis, assim como vários extratos naturais, induzem a

198

apoptose, diminuem a acumulação de lipídeos e estimulam a lipólise em pré-adipócitos e

adipócitos. Todas as amostras originais de chá inibiram significativamente a adipogênese em

comparação com os controles de uma forma dependente da dose. Em todos os casos, as

amostras de chá tratadas com tanase foram mais eficazes do que as amostras originais, mesmo

que em pequenas proporções. O CBT foi o tratamento mais eficaz reduzindo o teor de

lipídeos para ~ 40% em relação ao controle na concentração de 500 µg / mL. Contudo, CMT

foi a amostra mais eficaz quando avaliado em concentrações mais baixas.

Em CP, embora o tratamento com tanase tenha aumentado o ácido gálico,

epicatequina, catequina e galocatequina, os níveis de PDBG foram reduzidos. A

prodelfinidina B2 é um dímero de unidades de galocatequina (SEVERINE; HOSTE, 2006) e a

PDBG é capaz de formar complexos com proteínas e polissacarídeos, podendo ainda interagir

com enzimas e fatores de transcrição envolvidos na adipogênese, explicando resultados tão

aproximados entre CP e CPT (OKUDA, 2005). Nos chás branco e verde a melhoria pela

biotransformação sugere que a redução dos níveis de EGCG e o aumento do ácido gálico e

das catequinas agliconas podem ajudar a restringir a adipogênese (DULLOO et al., 1999;

LIN; DELLA-FERA; BAILE, 2005). Também é possível que as catequinas agliconas ajam

em sinergia com a cafeína remasnescente para ter maior efeito sobre a adipogênese

(DULLOO et al., 1999).

A eficácia do CMT pode ser explicada por quantidades relativamente aumentadas de

isômeros de ácido cafeoilquínico e ácido cafeico. Juman et al. (2011) detectaram que o

tratamento de ácido cafeico em células 3T3-L1 diminuiu a deposição de triglicerídeos

semelhante ao resveratrol, que é conhecido por ter efeito inibitório na diferenciação de

adipócitos, da supressão da produção e secreção de adipocitocinas a partir de adipócitos

maduros. Esses resultados mostram que além da biotransformação permitir a presença de

moléculas mais bioacessíveis e biodisponíveis, os extratos ainda mantém sua atividade na

diferenciação de adipócitos, podendo ser utilizado como tratamento adjuvante na obesidade.

199

CONCLUSÃO GERAL

Primeiramente este trabalho possibilitou a comprovação do potencial da utilização da

tanase imobilizada em biorreator de batelada como processo viável para obtenção de

hidrolisados fenólicos com maior valor biológico.

Através da identificação do perfil de polifenóis em cada extrato de chá, pode-se

identificar que a tanase imobilizada é capaz de hidrolisar os substratos contidos em chás,

apresentando principalmente ácido gálico, EGC, EC, ácido cafeico e agliconas de flavonol

aumentados. A análise da capacidade antioxidante permitiu observar que o tratamento com a

tanase aumentou a sua potência antioxidante, mostrando que essa reação resulta em polifenóis

com nível de capacidade antioxidante mais elevado. Os polifenóis dos chás exibiram melhor

estabilidade às condições digestivas gástricas simuladas, ou seja, a biotransformação dos

polifenóis em moléculas menores pode possibilitar que os bioativos sejam absorvidos antes da

degradação no trato gastrointestinal.

Os chás biotransformados inibiram a α-amilase de forma mais eficaz, mostrando o

maior potencial como uma terapia complementar eficaz para hiperglicemia pós-prandial

ligada ao diabetes tipo 2. Embora as amostras biotransformadas tivessem comportamentos

diferentes, em geral, a biotransformação foi benéfica na inibição da lipase. Além disso, os

nossos dados demonstraram que os extratos de chá biotransformados eram mais eficazes na

inibição da adipogênese do que os originais. Esses resultados sugerem que os chás

biotransformados são uma fonte alimentar adequada para modular o ciclo de vida dos

adipócitos e para induzir ação hipolipidêmica podendo influenciar no peso corporal e na

obesidade. Portanto, parece razoável sugerir que este estudo é útil para a extensão de

aplicações existentes de tanase imobilizada em relação à melhoria de chás vizando seu

potencial uso como adjuvantes em tratamentos de obesidade e diabetes mellitus tipo 2.

200

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

APOSTOLIDIS, E.; LEE, C. M. In vitro potential of Ascophyllum nodosum phenolic antioxidant mediated alpha-glucosidase and alpha-amylase. Journal of Food Science, v. 75, n. 3, p. 97–102, 2010. ARTS, M. J. T. J.; HAENEN, G. R. M. M.; WILMS, L. C.; BEETSTRA, S. A. J. N.; HEIJNEN, C. G. M.; VOSS, H.-P.; BAST, A. Interactions between flavonoids and proteins: effect on the total antioxidant capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n. 5, p. 1184–1187, 2002. AUVICHAYAPAT, P.; PRAPOCHANUNG, M.; TUNKAMNERDTHAI, O.; SRIPANIDKULCHAI, B.; AUVICHAYAPAT, N.; THINKHAMROP, B.; KUNHASURA, S.; WONGPRATOOM, S.; SINAWAT, S.; HONGPRAPAS, P. Effectiveness of green tea on weight reduction in obese thais: A randomized, controlled trial. Physiology and Behavior, v. 93, n. 3, p. 486–491, 2008.

AZUMA, K.; IPPOUSHI, K.; NAKAYAMA, M.; ITO, H.; HIGASHIO, H.; TERAO, J. Absorption of chlorogenic acid and caffeic acid in rats after oral. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 48, n. 11, p. 5496–5500, 2000. BADHANI, B.; SHARMA, N.; KAKKAR, R. Gallic acid: a versatile antioxidant with promising therapeutic and industrial applications. RSC Advances, v. 5, n. 35, p. 27540–27557, 2015.

BASTOS, D. H.; SALDANHA, L. A.; CATHARINO, R. R.; SAWAYA, A.; CUNHA, I. B.; CARVALHO, P. O.; EBERLIN, M. N. Phenolic antioxidants identified by esi-ms from yerba maté (Ilex paraguariensis) and green tea (Camellia sinensis) extracts. Molecules, v. 12, n. 3, p. 423–432, 2007.

BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A.; DE FREITAS, V. A. P. Hydrolysis of epigallocatechin gallate using a tannase from Paecilomyces variotii. Food Chemistry, v. 108, n. 1, p. 228–233, 2008. BROCKMAN, H. L. Kinetic behavior of the pancreatic lipase-colipase-lipid system. Biochemie, v. 82, 2000.

BUCHHOLZ, T.; MELZIG, M. F. Medicinal plants traditionally used for treatment of obesity and diabetes mellitus - screening for pancreatic lipase and α-amylase inhibition. Phytotherapy research : PTR, v. 30, n. 2, p. 260–6, 2016. CASTRO-ACOSTA, M. L.; LENIHAN-GEELS, G. N.; CORPE, C. P.; HALL, W. L. Berries and anthocyanins: promising functional food ingredients with postprandial glycaemia-lowering effects. Proceedings of the Nutrition Society, v. 75, n. 3, p. 342–355, 2016.

CHAMORRO, S.; VIVEROS, A.; ALVAREZ, I.; VEGA, E.; BRENES, A. Changes in polyphenol and polysaccharide content of grape seed extract and grape pomace after enzymatic treatment. Food Chemistry, v. 133, n. 2, p. 308–314, 2012. CHAO, J.; HUO, T.-I.; CHENG, H.-Y.; TSAI, J.-C.; LIAO, J.-W.; LEE, M.-S.; QIN, X.-M.; HSIEH, M.-T.; PAO, L.-H.; PENG, W.-H. Gallic acid ameliorated impaired glucose and lipid homeostasis in high fat diet-induced NAFLD mice. PLoS ONE, v. 9, n. 6, p. e96969, 2014.

CHEN, I.-J.; LIU, C.-Y.; CHIU, J.-P.; HSU, C.-H. Therapeutic effect of high-dose green tea extract on weight reduction: A randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Clinical Nutrition, v. 35, n. 3, p. 592–599, 2016.

201

CHENG, T. O. Tea Is Good for the Heart. Archives of Internal Medicine, v. 160, n. 15, p. 2397–2397, 2000. CHOUDHARY, S.; MOURYA, A.; AHUJA, S.; SAH, S. P.; KUMAR, A. Plausible anti-inflammatory mechanism of resveratrol and caffeic acid against chronic stress-induced insulin resistance in mice. Inflammopharmacology, v. 24, n. 6, p. 347–361, 2016.

DOAN, K. V.; KO, C. M.; KINYUA, A. W.; YANG, D. J.; CHOI, Y.-H.; OH, I. Y.; NGUYEN, N. M.; KO, A.; CHOI, J. W.; JEONG, Y.; JUNG, M. H.; CHO, W. G.; XU, S.; PARK, K. S.; PARK, W. J.; CHOI, S. Y.; KIM, H. S.; MOH, S. H.; KIM, K. W. gallic acid regulates body weight and glucose homeostasis through AMPK activation. Endocrinology, v. 156, n. 1, p. 157–168, 2015 DULLOO, A. G.; DURET, C.; ROHRER, D.; GIRARDIER, L.; MENSI, N.; FATHI, M.; CHANTRE, P.; VANDERMANDER, J. Efficacy of a green tea extract rich in catechin polyphenols and caffeine in increasing 24-h energy expenditure and fat oxidation. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 70, p. 1040–1045, 1999. FERREIRA, L. R.; MACEDO, J. A.; RIBEIRO, M. L.; MACEDO, G. A. Improving the chemopreventive potential of orange juice by enzymatic biotransformation. Food Research International, v. 51, n. 2, p. 526–535, 2013.

FILIP, R.; LÓPEZ, P.; GIBERTI, G.; COUSSIO, J.; FERRARO, G. Phenolic compounds in seven South American Ilex species. Fitoterapia, v. 72, n. 7, p. 774–778, 2001.

FRANCISCHI, R. P. P.; PEREIRA, L. O.; FREITAS, C. S.; KLOPFER, M.; SANTOS, R. C.; VIEIRA, P.; LANCHA, A. H. Jr. Obesidade: atualização sobre sua etiologia, morbidade e tratamento. Revista de Nutrição, v. 13, n. 1, p. 17–28, 2000. GENARO-MATTOS, T. C.; MAURÍCIO, Â. Q.; RETTORI, D.; ALONSO, A.; HERMES-LIMA, M. Antioxidant activity of caffeic acid against iron-induced free radical generation — A chemical approach. PLoS ONE, v. 10, n. 6, p. e0129963, 2015.

GONDOIN, A.; GRUSSU, D.; STEWART, D.; MCDOUGALL, G. J. White and green tea polyphenols inhibit pancreatic lipase in vitro. Food Research International, v. 43, n. 5, p. 1537–1544, 2010. GONTHIER, M.; VERNY, M.; BESSON, C.; RE, C.; SCALBERT, A. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. Nutrient Metabolism, p. 1853–1859, 2003.

GREEN, R. J.; MURPHY, A. S.; SCHULZ, B.; WATKINS, B. A.; FERRUZZI, M. G. Common tea formulations modulate in vitro digestive recovery of green tea catechins. Molecular Nutrition and Food Research, v. 51, n. 9, p. 1152–1162, 2007. GU, L.; KELM, M. A.; HAMMERSTONE, J. F.; et al. Screening of foods containing proanthocyanidins and their structural characterization using LC-MS/MS and thiolytic degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, n. 25, p. 7513–7521, 2003. GUO, Q.; ZHAO, B.; LI, M.; SHEN, S.; XIN, W. Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, v. 1304, n. 3, p. 210–222, 1996.

HAYAT, K.; IQBAL, H.; MALIK, U.; BILAL, U.; MUSHTAQ, S. Tea and its consumption: Benefits and risks. Critical reviews in food science and nutrition, v. 55, n. 7, p. 939–54, 2015.

202

HE, Q.; LV, Y.; YAO, K. Effects of tea polyphenols on the activities of amylase, pepsin, trypsin and lipase. Food Chemistry, v. 101, n. 3, p. 1178–1182, 2006. HONG, Y.-J.; YANG, S.-Y.; NAM, M.-H.; KOO, Y.-C.; LEE, K.-W. caffeic acid inhibits the uptake of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo- [4,5-b]pyridine (PhIP) by inducing the efflux transporters expression in caco-2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 38, n. 2, p. 201–207, 2015. HUANG, J.; WANG, Y.; XIE, Z.; ZHOU, Y.; ZHANG, Y.; WAN, X. The anti-obesity effects of green tea in human intervention and basic molecular studies. European journal of clinical nutrition, v. 68, n. 10, p. 1075–87, 2014.

HUGHES, L. A. E.; ARTS, I. C. W.; AMBERGEN, T.; et al. Higher dietary flavone , flavonol , and catechin intakes are associated with less of an increase in BMI over time in women: A longitudinal analysis from the Netherlands Cohort Study. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 88, p. 1341–1352, 2008.

HURSEL, R.; VIECHTBAUER, W.; WESTERTERP-PLANTENGA, M. S. The effects of green tea on weight loss and weight maintenance: A meta-analysis. International Journal of Obesity, v. 33, n. 9, p. 956–961, 2009. JEBB, S. A. A etiology of obesity. British Medical Bulletin, v. 3, n. 2, p. 264–285, 1997.

JEMEL, I.; FENDRI, A.; GARGOURI, Y.; BEZZINE, S. Kinetic properties of dromedary pancreatic lipase: A comparative study on emulsified and monomolecular substrate. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 70, p. 238–242, 2009. JUMAN, S. J.; YASUI, N.; OKUDA, H.; UEDA, A.; NEGISH, H.; MIKI, T.; IKEDA, K.. caffeic acid phenethyl ester suppresses the production of adipocytokines , leptin , tumor necrosis factor -alpha and resistin , during differentiation to adipocytes in 3T3-L1 Cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 34, n. 4, p. 490–494, 2011. KANG, N. J.; LEE, K. W.; SHIN, B. J.; et al. Caffeic acid, a phenolic phytochemical in coffee, directly inhibits Fyn kinase activity and UVB-induced COX-2 expression. Carcinogenesis, v. 30, n. 2, p. 321–330, 2008.

LAMBERT, J. D.; SANG, S.; YANG, C. S. Possible controversy over dietary polyphenols: benefits vs risks. Chemical Research in Toxicology, v. 20, n. 4, p. 583–5, 2007.

LEKHA, P. K.; LONSANE, B. K. Production and application of tannin acyl hydrolase: state of the art. Advances in Applied Microbiology. v. 44, p.216–260, 1997.

LIAO, C.; OU, T.; WU, C.; WANG, C. Prevention of diet-induced hyperlipidemia and obesity by caffeic acid in C57BL/6 mice through regulation of hepatic lipogenesis gene expression. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 61, n. 46, p. 11082–11088, 2013.

LIMA, V. N.; OLIVEIRA-TINTINO, C. D. M.; SANTOS, E. S.; MORAIS, L. P.; TINTINO, S. R.; FREITAS, T. S.; GERALDO, Y. S.; PEREIRA, R. L. S.; CRUZ, R. P.; MENEZES, I. R. A.; COUTINHO, H. D. M. Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: gallic acid, caffeic acid and pyrogallol. Microbial Pathogenesis, v. 99, p. 56–61, 2016. LIN, J.; DELLA-FERA, M. A.; BAILE, C. A. Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes. Obesity Research, v. 13, n. 6, p. 982–990, 2005.

203

LU, M.-J.; CHEN, C. Enzymatic modification by tannase increases the antioxidant activity of green tea. Food Research International, v. 41, n. 2, p. 130–137, 2008. LUÍS, Â.; SILVA, F.; SOUSA, S.; DUARTE, A. P.; DOMINGUES, F. Antistaphylococcal and biofilm inhibitory activities of gallic, caffeic, and chlorogenic acids. Biofouling, v. 30, n. 1, p. 69–79, 2014.

MACEDO, J. A.; BATTESTIN, V.; RIBEIRO, M. L.; MACEDO, G. A. Increasing the antioxidant power of tea extracts by biotransformation of polyphenols. Food Chemistry, v. 126, n. 2, p. 491–497, 2011. MACEDO, J. A; FERREIRA, L. R.; CAMARA, L. E.; SANTOS, J. C.; GAMBERO, A; MACEDO, G. A; RIBEIRO, M. L. Chemopreventive potential of the tannase-mediated biotransformation of green tea. Food Chemistry, v. 133, n. 2, p. 358–65, 2012.

MANACH, C.; DONOVAN, J. L. Pharmacokinetics and metabolism of dietary flavonoids in humans. Free Radicals Research, v. 38, n. 8, p. 771–785, 2004.

MANACH, C.; SCALBERT, A.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C.; JIME, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 79, n. 5, p. 727–747, 2004. MANACH, C.; WILLIAMSON, G.; MORAND, C.; SCALBERT, A.; RÉMÉSY, C. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. II. Review of 93 intervention studies. American Society for Clinical Nutrition, v. 81, p. 243S–255S, 2005.

MARTINS, F.; SUZAN, A. J.; CERUTTI, S. M.; et al. Consumption of mate tea (Ilex paraguariensis) decreases the oxidation of unsaturated fatty acids in mouse liver. The British Journal of Nutrition, v. 101, n. 4, p. 527–532, 2009. MEINHART, A. D.; BIZZOTTO, C. S.; BALLUS, C. A.; POLONI RYBKA, A. C.; SOBRINHO, M. R.; CERRO-QUINTANA, R. S.; TEIXEIRA-FILHO, J.; GODOY, H. T. Methylxanthines and phenolics content extracted during the consumption of mate (Ilex paraguariensis St. Hil) beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, n. 4, p. 2188–2193, 2010.

MIYOSHI, N.; PERVIN, M.; SUZUKI, T.; UNNO, K.; ISEMURA, M.; NAKAMURA,Y. Green tea catechins for well-being and therapy: prospects and opportunities. Botanics: Targets and Therapy, v. 5, p. 85–96, 2015. MIZOOKU, Y.; YOSHIKAWA, M.; TSUNEYOSHI, T.; ARAKAWA, R. Analysis of oxidized epigallocatechin gallate by liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry : RCM, v. 17, n. 16, p. 1915–8, 2003.

MOCHIZUKI, M.; YAMAZAKI, S. I.; KANO, K.; IKEDA, T. Kinetic analysis and mechanistic aspects of autoxidation of catechins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v. 1569, n. 1–3, p. 35–44, 2002. NI, H.; CHEN, F.; JIANG, Z. D.; et al. Biotransformation of tea catechins using Aspergillus niger tannase prepared by solid state fermentation on tea byproduct. LWT - Food Science and Technology, v. 60, n. 2, p. 1206–1213, 2015.

OKUDA, T. Systematics and health effects of chemically distinct tannins in medicinal plants. Phytochemistry, v. 66, n. 17 SPEC. ISS., p. 2012–2031, 2005.

OLTHOF, M. R.; HOLLMAN, P. C. H.; BUIJSMAN, M. N. C. P.; AMELSVOORT, J. M. M. VAN; KATAN, M. B. Chlorogenic acid , quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are

204

extensively metabolized in humans. Human Nutrition and Metabolism, v. 133, p. 1806–1814, 2003. OLTHOF, M. R.; HOLLMAN, P. C. H.; KATAN, M. B. Human nutrition and metabolism chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans. The Journal of Nutrition, v. 131, n. 1, p. 66–71, 2001.

OPAS (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE). Doenças crônico-degenerativas e obesidade: Estratégia mundial sobre alimentação saudável , atividade física e saúde. 2003.

PAN, M.-H.; TUNG, Y.-C.; YANG, G.; LI, S.; HO, C.-T. Molecular mechanisms of the anti-obesity effect of bioactive compounds in tea and coffee. Food & Function, v. 7, n. 11, p 4481-4491, 2016. PIPARO, E. LO; NESTLÉ, S. A. Flavonoids for controlling starch digestion : Structural requirements for inhibiting human α-amylase. Journal of Medicinal Chemistry, v. 51, n. 12, p. 3555–3561, 2008.

RAGHUWANSHI, S.; MISRA, S.; SAXENA, R. K. Enzymatic treatment of black tea (CTC and Kangra orthodox ) using Penicillium charlesii tannase to improve the quality of tea. Journal of Food Processing and Preservation, v. 37, p. 855–863, 2013. RAHIM, A. T. M. A.; TAKAHASHI, Y.; YAMAKI, K. Mode of pancreatic lipase inhibition activity in vitro by some flavonoids and non-flavonoid polyphenols. Food Research International, v. 75, p. 289–294, 2015.

RECORD, I. R.; LANE, J. M. Simulated intestinal digestion of green and black teas. Food Chemistry, v. 73, n. 4, p. 481–486, 2001.

RICE-EVANS, C. A.; MILLER, N. J.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine, v. 20, n. 7, p. 933–956, 1996. RICE-EVANS, C.; MILLER, N.; PAGANGA, G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in Plant Science, v. 2, n. 4, p. 152–159, 1997. ROGALSKA, E.; RANSAC, S.; VERGER, R. Stereoselectivity of lipases. II. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by gastric and pancreatic lipases. The journal of biological chemistry, v. 265, n. 33, p. 20271–20276, 1990.

ROHN, S.; RAWEL, H.; KROLL, J. Inhibitory effects of plant phenols on the activity of selected enzymes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n. 12, p. 3566–3571, 2002. ROSENDAHL, A. H.; PERKS, C. M.; ZENG, L.; MARKKULA, A.; SIMONSSON, M.; ROSE, C.; INGVAR, C.; HOLLY, J. M. P.; JERNSTROM, H. Caffeine and caffeic acid inhibit growth and modify estrogen receptor and insulin-like growth factor i receptor levels in human breast cancer. Clinical Cancer Research, v. 21, n. 8, p. 1877–1887, 2015. SCALBERT, A.; MANACH, C.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C.; JIMÉNEZ, L. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 45, n. 4, p. 287–306, 2005.

SCALBERT, A.; WILLIAMSON, G. Dietary Intake and Bioavailability of Polyphenols. The Journal of Nutrition, v. 130, n. 8, p. 2073–2085, 2000.

205

SCHONS, P. F. Imobilização da tanase de Paecilomyces variotii e ação em reações de hidrólise e síntese. 2012. 117f. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, 2012.

SCHONS, P. F.; LOPES, F. C. R.; BATTESTIN, V.; MACEDO, G. A. Immobilization of Paecilomyces variotii tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of microencapsulation, v. 28, n. 3, p. 211–9, 2011. SEVERINE, B.; HOSTE, H. Monomers of condensed tannins affect the larval exsheathment of parasitic nematodes of ruminants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 54, n. 20, p. 7481–7487, 2006.

SIMÕES, C. M. O.; AMOROS, M.; GIRRE, L. Mechanism of antiviral activity of triterpenoid saponins. Phytotherapy research, v. 13, n. 4, p. 323–328, 1999.

STOJKOVIĆ, D.; PETROVIĆ, J.; SOKOVIĆ, M.; GLAMOČLIJA, J.; KUKIĆ-MARKOVIĆ, J.; PETROVIĆ, S. In situ antioxidant and antimicrobial activities of naturally occurring caffeic acid, p -coumaric acid and rutin, using food systems. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 93, n. 13, p. 3205–3208, 2013.

SU, Y. L.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y.; LUN SU, Y.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y.; SU, Y. L.; LEUNG, L. K.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y. Stability of tea theaflavins and catechins. Food Chemistry, v. 83, n. 2, p. 189–195, 2003. SUZUKI, T.; MIYOSHI, N.; HAYAKAWA, S.; Imai, S.; Isemura, M.; Nakamura, Y. Health Benefits of Tea Consumption. In: WILSON, T.; TEMPLE, N. J. (Eds.) Beverage Impacts on Health and Nutrition, 2016. Cham: Springer International Publishing, p.49–68.

TILBEURGH, H. VAN; SARDA, L.; VERGER, R.; CAMBILLAU, C. Structure of the pancreatic lipase-procolipase complex. Nature, v. 352, p. 159–162, 1992.

TUNG, Y.-T.; WU, J.-H.; HUANG, C.-C.; PENG, H.-C.; CHEN, Y.-L.; YANG, S.-C.; CHANG, S.-T. Protective effect of Acacia confusa bark extract and its active compound gallic acid against carbon tetrachloride-induced chronic liver injury in rats. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, v. 47, n. 6, p. 1385–92, 2009. VERNARELLI, J. A.; LAMBERT, J. D. Tea consumption is inversely associated with weight status and other markers for metabolic syndrome in US adults. European Journal of Nutrition, v. 52, n. 3, p. 1039–48, 2013.

WHO, World Health Organization. Obesity and overweight, 2016. YANG, C. S.; CHEN, G.; WU, Q. Recent scientific studies of a traditional chinese medicine, tea, on prevention of chronic diseases. Journal of Traditional and Complementary medicine, v. 4, n. 1, p. 17–23, 2014.

YANG, C. S.; ZHANG, J.; ZHANG, L.; HUANG, J.; WANG, Y. Mechanisms of body weight reduction and metabolic syndrome alleviation by tea. Molecular nutrition & food research, v. 60, n. 1, p. 160–74, 2016. YOSHINO, K.; SUZUKI, M.; SASAKI, K.; MIYASE, T.; SANO, M. Formation of antioxidants from (−)-epigallocatechin gallate in mild alkaline fluids, such as authentic intestinal juice and mouse plasma. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 10, n. 4, p. 223–229, 1999. ZHANG, M.; ZHOU, J.; WANG, L.; LI, B.; GUO, J.; GUAN, X.; HAN, Q.; ZHANG, H. Caffeic acid reduces cutaneous tumor necrosis factor alpha (TNF-Α), IL-6 and IL-1β levels

206

and ameliorates skin edema in acute and chronic model of cutaneous inflammation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 37, n. 3, p. 347–354, 2014. ZHAO, Y.; CHEN, P.; LIN, L.; HARNLY, J. M.; YU, L.; LI, Z. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry, v. 126, n. 3, p. 1269–1277, 2011.

ZHU, Q. Y.; ZHANG, A.; TSANG, D.; HUANG, Y.; CHEN, Z. Stability of green tea catechins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, n. 12, p. 4624–4628, 1997.

ZHU, Y. T.; REN, X. Y.; YUAN, L.; LIU, M. Y.; LIANG, J.; LIAO, X. Fast identification of lipase inhibitors in oolong tea by using lipase functionalised Fe3O4 magnetic nanoparticles coupled with UPLC-MS/MS. Food Chemistry, v. 173, p. 521–526, 2015.

207

ANEXOS

ANEXOS

208

1. Comprovante da autorização da utilização de artigos já publicados

209

210

211

*