UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

ELLIDA DE AGUIAR SILVESTRE

DIVERSIDADE GENÉTICA E TAXA DE CRUZAMENTO DE Myroxylon peruiferum,

UMA ESPÉCIE COM POTENCIAL FITOTERÁPICO, VISANDO O

ENRIQUECIMENTO GENÉTICO EM ÁREA EM PROCESSO DE RESTAURAÇÃO

FLORESTAL

GENETIC DIVERSITY AND MATING SYSTEM OF Myroxylon peruiferum, A

SPECIES WITH PHYTOTERAPIC POTENTIAL, AIMING THE GENETIC

ENRICHMENT IN THE AREA IN FOREST RESTORATION PROCESS.

Campinas

2016

ELLIDA DE AGUIAR SILVESTRE

DIVERSIDADE GENÉTICA E TAXA DE CRUZAMENTO DE Myroxylon peruiferum,

UMA ESPÉCIE COM POTENCIAL FITOTERÁPICO, VISANDO O

ENRIQUECIMENTO GENÉTICO EM ÁREA EM PROCESSO DE RESTAURAÇÃO

FLORESTAL

GENETIC DIVERSITY AND MATING SYSTEM OF Myroxylon peruiferum, A

SPECIES WITH PHYTOTERAPIC POTENTIAL, AIMING THE GENETIC

ENRICHMENT IN THE AREA IN FOREST RESTORATION PROCESS.

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da

Universidade Estadual de Campinas como parte

dos requisitos exigidos para obtenção do título de

Doutora em Genética e Biologia Molecular, na

Área de Genética Vegetal e Melhoramento

Thesis presented to the Institute of Biology of

the University of Campinas in partial

fulfillment of the requirements for the degree

of Doctor in Genetics and Molecular Biology,

in the area of Plant Genetics and Breeding

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA ELLIDA DE AGUIAR SILVESTRE, E

ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA

IMACULADA ZUCCHI

Orientadora: DRA. MARIA IMACULADA ZUCCHI

Co-orientador: DR. PEDRO HENRIQUE SANTIN BRANCALION

Campinas

2016

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/06431-0; CNPq,141583/2012-6; FAPESP, 2011/50296-8

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de BiologiaMara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Silvestre, Ellida de Aguiar, 1987- Si39d SilDiversidade genética e taxa de cruzamento de Myroxylon peruiferum, uma

espécie com potencial fitoterápico, visando o enriquecimento genético em áreaem processo de restauração florestal / Ellida de Aguiar Silvestre. – Campinas,SP : [s.n.], 2016.

SilOrientador: Maria Imaculada Zucchi. SilCoorientador: Pedro Henrique Santin Brancalion. SilTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Biologia.

Sil1. Genética da conservação. 2. Microssatélites (Genética). 3. Polimorfismo

de nucleotídeo único. I. Zucchi, Maria Imaculada. II. Brancalion, PedroHenrique Santin. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia.IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Diversidade genética e taxa de cruzamento de Myroxylonperuiferum, uma espécie com potencial fitoterápico, visando o enriquecimento genético emárea em processo de restauração florestalPalavras-chave em inglês:Conservation geneticsMicrosatellites (Genetics)Polymorphism single nucleotideÁrea de concentração: Genética Vegetal e MelhoramentoTitulação: Doutora em Genética e Biologia MolecularBanca examinadora:Pedro Henrique Santin Brancalion [Coorientador]Prianda Rios LabordaAndré Olmos SimõesRicardo Ribeiro RodriguesEvandro Marsola de MoaraesData de defesa: 12-08-2016Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Campinas, 12 de agosto de 2016

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Pedro Henrique Santin Brancalion (Presidente)

Dra. Prianda Rios Laborda

Prof. Dr. André Olmos Simões

Prof. Dr. Ricardo Ribeiro Rodrigues

Prof. Dr. Evandro Marsola de Moraes

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra

no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedico à minha mãe Vanêce de Aguiar Silvestre,

ao meu namorado Leandro Longato Neto.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me fortalecer nas horas difíceis e sempre me guiar na minha jornada;

A Universidade Estadual de Campinas, por subsidiar esta etapa da minha vida profissional e

em especial ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, em nome de

todos os funcionários e todo corpo docente;

Ao CNPq, pela concessão de um ano de bolsa de estudos;

À FAPESP, pela concessão de três anos de bolsa de estudos;

A Dra. Maria Imaculada Zucchi, minha orientadora, pela paciência e compreensão e acima de

tudo por ser uma boa amiga;

Ao Dr. Pedro Henrique Santin Brancalion, meu co-orientador, pela a ajuda constante;

Ao Dr. José Baldin Pinheiro, por abrir as portas do seu laboratório me ajudando a desenvolver

este projeto;

Ao Instituto Florestal pela permissão das coletas na EE Caetetus, e à Fundação José Pedro de

Oliveira, pela permissão de coleta na ARIE Mata Santa Genebra;

Aos colegas do Grupo de Genética e Genômica da Conservação, pela companhia e auxílio no

laboratório e nas coletas, Alessandro Alves Pereira, Marcos Vinícius Bohrer Monteiro

Siqueira, Camila Menezes Trindade Macrini, Kaiser Dias Schwarcz, Miklos Maximiliano

Bajay, Vitor Antonio Côrrea Pavinato, Fabiano Lucas Araújo, Gustavo Maruyama Mori e

Fátima Donizete Pelissari Saturno;

A Mariana Novello, pelas jornadas de coleta e muitas risadas;

Ao João Paulo Gomes Viana, pelas ajuda nas análises e pelas discussões científicas e sobre

GoT;

A Carolina Grando, pela ajuda nas coletas e pelas longas conversas e troca de experiência;

A Patricia Sanae Sujii, pelas consultorias técnicas e pessoais e pela arte gráfica deste trabalho;

Ao Evandro Vagner Tambarussi, pela ajuda nas análises do sistema reprodutivo e pelo

incentivo e preocupação;

Aos meus inesquecíveis amigos Katharinne Ingrid Moraes de Carvalho, Bruno Soares

Moreira, Jamile Queiroz de Sousa, Samira da Silva Maciel, Flavia Danniele Frota Machado,

Camilla Micaely, Ocimara Oliveira, Betriny Nascimento, Hendrie Nunes entre outros, por

mesmo de longe me apoiarem e me ajudarem na parte prática como também com conselhos;

Aos amigos de Piracicaba, são tantos que não cabem nestas linhas, por serem uma verdadeira

família;

Ao meu namorado Leandro Longato Neto, pela paciência em todos os momentos e por me

proporcionar segurança e carinho;

A Isabella Longato Simon, sobrinha querida, que me alegra em todos os momentos;

Aos meus sogros e cunhados, pela torcida constante e apoio;

A minha mãe e irmão, por acreditar inabalavelmente em mim e no meu potencial;

Aos meus familiares, em especial meu pai, pelo apoio;

A todos que tornaram possível a realização deste projeto.

RESUMO

Atualmente, a restauração ecológica surge como uma atividade promissora e efetiva para

recuperar a biodiversidade e os serviços ecossistêmicos onde eles foram perdidos e/ou

reduzidos. A mata Atlântica é o bioma brasileiro onde os impactos oriundos dessas

perturbações são mais acentuados. A diversidade genética torna-se importante para projetos

de restauração, pois a sua variação pode afetar as taxas de endogamia e comprometer a

perpetuação das espécies nativas reintroduzidas e, consequentemente, o sucesso da

restauração, ao longo do tempo. Assim, os objetivos deste trabalho foram descrever o sistema

reprodutivo de Myroxylon peruiferum L.f., avaliar a diversidade e estrutura genética da

espécie em viveiros comerciais do estado de São Paulo e em populações naturais e restauradas

na Mata Atlântica, com o auxílio de marcadores microssatélites e SNPs. Para o estudo do

sistema reprodutivo foram coletadas sementes de uma área de remanescente natural de Mata

Atlântica totalizando 200 sementes (20 sementes de cada árvore matriz). Para o estudo de

diversidade genética em mudas de M. peruiferum, foram coletadas amostras em quatro

viveiros comerciais. Para a comparação entre áreas naturais e restauradas, foram amostrados

indivíduos em quatro populações contrastantes de Mata Atlântica (duas naturais e duas

restauradas). Os resultados mostram que a população de M. peruiferum apresenta sistema

reprodutivo misto e evidências de endogamia biparental. Faz-se necessária a coleta de

sementes de pelo menos 47 árvores matrizes para fins de conservação e restauração florestal,

para que se tenha uma amostra de sementes com tamanho efetivo que evite a depressão por

endogamia. A diversidade genética das mudas de M. peruiferum foi baixa, indicando a

necessidade de aperfeiçoar os sistemas de coleta de sementes e à compra de mudas de vários

viveiros da mesma região para uso em um mesmo projeto de restauração. Os resultados das

estimativas dos parâmetros populacionais sugerem que não existe diferença significativa em

relação à diversidade genética e endogamia entre as populações naturais e restauradas

indicando níveis similares de diversidade genética e que os projetos de restauração foram

eficientes. Os resultados encontrados neste trabalho podem auxiliar pesquisadores e gestores

em futuros projetos de conservação da espécie e uso na restauração ecológica.

Palavras-chave: Cabreúva; genética da conservação; genômica populacional; microssatélite;

restauração ativa; SNP

ABSTRACT

Currently, ecological restoration is emerging as a promising and effective activity to recover

biodiversity and ecosystem services where they have been lost and/or reduced. The Atlantic

Forest is the Brazilian biome where the impacts from these disturbances are more

pronounced. Genetic diversity is important for studies of restoration, because its variation

may affect the rates of inbreeding and compromise the perpetuation of the reintroduced native

species and, therefore, the success of restoring in the long term. The objectives of this project

were to describe the mating system of the Myroxylon peruiferum L.f.; to evaluate the genetic

diversity and structuring of the species in commercial nurseries in the state of São Paulo and

nature and restored populations in the Brazilian Atlantic Forest with microsatellite and SNPs

markers. To study the mating system, seeds were collected from a natural remnants area of

Brazilian Atlantic Forest, totaling 200 seedlings (20 seeds of each mother-tree). To study the

genetic diversity in M. peruiferum seedlings, samples were collected in four commercial

nurseries. To compare remnant and restored areas, individuals were sampled in four

contrasting populations of the species (two natural areas and two restored areas). The results

showed that the population of M. peruiferum presents a mixed-mating system and evidence

the biparental inbreeding. We propose that at least 47 seed-trees are needed for seed collection

efforts associated with conservation and forest restoration outcomes, which will provide a

sample of seeds with an effective size that will enable the avoidance of an inbreeding

depression. The genetic diversity of M. peruiferum seedlings was low, indicating the need to

improve seed collection systems and buying seedlings of various nurseries in the same region

for use in the same restoration project. The results of the population parameters estimates

suggest that there is no significant difference of genetic diversity and endogamy among

remnant and restored populations indicating similar levels of genetic diversity and the success

of restoration projects. The findings of this study can assist researchers and managers in future

conservation projects of the species and use in the ecological restoration.

Keywords: Cabreúva; conservation genetic; population genomic; microsatellite; active

restoration; SNPs

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição geográfica de Myroxylon peruiferum no território brasileiro. Fonte:

Sartori, A.L.B. Myroxylon in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de

Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB29797>.........22

Figura 2: a) Exemplar da espécie de estudo M. peruiferum (acervo próprio); b) Folhas

compostas pinadas (acervo próprio); c) Troco reto e liso (acervo próprio); d) Inflorescência

(rubens-plantasdobrasil.blogspot.com.br); e e) Frutos tipo sâmara

(http://www.clickmudas.com.br)..............................................................................................23

Capítulo 1 Sistema reprodutivo e diversidade genética de Myroxylon peruiferum L.f.

(Fabaceae), uma espécie arbórea da Mata Atlântica utilizada na restauração florestal

Figura 1.1: Mapa das áreas de estudo para o sistema reprodutivo e diversidade genética de M.

peruiferum. ...............................................................................................................................29

Figura 1.2: Produção de mudas de M. peruiferum. a) Mudas separadas por matriz; b) Plântulas

emergidas a partir de semeadura direta; e c) Mudas em tubetes contendo mistura de terra e

vermiculita................................................................................................................................30

Figura 1.3: Estruturação populacional para M. peruiferum em quatro viveiros comerciais do

estado de São Paulo. a) Representação gráfica dos valores de

grupos mais provável de acordo com Evanno et al. (2005) pelas análises do programa

STRUCTURE v.2.3.3 (Pritchard, et al. 2000; Falush et al. 2003); b) Teste de atribuição

realizado pela análise bayesiana das populações de M. peruiferum estudadas em cinco

agrupamentos. Os indivíduos amostrados nas populações estão representados pelas barras

verticais coloridas. A mesma cor em diferentes populações indica que pertencem ao mesmo

grupo. Cores diferentes na mesma barra indicam a porcentagem do genoma compartilhado

com cada grupo.........................................................................................................................37

Capítulo 2 Diversidade genética de Myroxylon peruiferum L.f. (Fabaceae) em áreas de

remanescente natural e restauração florestal

Figura 2.1: Mapa das quatro áreas de estudo de Mata Atlântica no estado de São Paulo, Brasil.

REF área de referencia, FRAG área fragmentada, REST 1 área em processo de

restauração 1 com 56 anos e REST 2 área em processo de restauração 2 com 26 anos........47

Figura 2.2: Representação gráfica para a classificação dos locos SNPs (azul) em relação à

distribuição empírica do FST para as quatro áreas de estudo, sendo os locos presentes na região

vermelha candidate positive selection (candidatos à seleção direcional ou positiva), os locos

na região amarela candidate balancing selection (candidatos à seleção balanceadora) e os

locos presentes na região cinza candidate neutral (candidatos a neutros). ..............................50

Figura 2.3: Estruturação populacional para M. peruiferum em quatro populações de Mata

Atlântica. a) Representação gráfica dos valores de

provável de acordo com Evanno et al. (2005) pelas análises do programa STRUCTURE

v.2.3.3 (Pritchard, et al. 2000; Falush et al. 2003); b) Teste de atribuição realizado pela análise

bayesiana das populações de M. peruiferum estudadas em quatro agrupamentos; c) Teste de

atribuição realizado pela análise bayesiana das populações de M. peruiferum estudadas em

dois agrupamentos. Os indivíduos amostrados nas populações estão representados pelas

barras verticais coloridas. A mesma cor em diferentes populações indica que pertencem ao

mesmo grupo. Cores diferentes na mesma barra indicam a porcentagem do genoma

compartilhado com cada grupo.................................................................................................55

Figura 2.4: Gráfico de dispersão dos indivíduos (pontos) ao longo dos dois primeiros

componentes principais da DAPC, com a formação de grupos (elipses) para as quatro áreas

estudadas. a) DAPC para SNPs neutros com retenção de 54% da variação; b) DAPC para

SNPs outliers com retenção de 80,9% da variação...................................................................56

LISTA DE TABELAS



Tabela 1.1: Estimativas dos parâmetros do sistema reprodutivo para M. peruiferum na Estação

Ecológica dos Caetetus (REF)..................................................................................................33

Tabela 1.2: Estimativas dos parâmetros do sistema reprodutivo dentro de progênie (N =

número de sementes dentro de progênie, = índice de fixação das matrizes, = índice de

fixação das progênies, = taxa de cruzamento multiloco, m st t = taxa de cruzamento

biparental, = correlação de paternidade, = número efetivo de doador de pólen, =

coeficiente de coancestria dentro de progênie, = tamanho efetivo de variância dentro de

progênie)...................................................................................................................................34

Tabela 1.3: Estimativas de diversidade genética para M. peruiferum em quatro viveiros

comerciais no estado de São Paulo ( = número de indivíduos amostrados, AR = riqueza

alélica, HO = heterozigosidade observada, HE = heterozigosidade esperada no equilíbrio de

Hardy-Weinberg e FIS = índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança (IC)...........36

Tabela 1.4: Resultado da estruturação do FST de Weir e Cockerham (1984) par a par para os

quatro viveiros comerciais no estado de São Paulo utilizando marcadores microssatélite.......36



Tabela 2.1: Estimativas de diversidade genética para as populações de M. peruiferum

utilizando marcadores microssatélites ( = número de indivíduos amostrados, AR = riqueza


Hardy-Weinberg e FIS = índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança

(IC)............................................................................................................................................52


utilizando marcadores SNP neutros e outliers seleção direcional ( = número de indivíduos

amostrados, A = número de diferentes alelos, P = número de alelos privados, AR = riqueza


Hardy-Weinberg e FIS= índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança (IC)............53

Tabela 2.3: Resultado da estruturação par a par nas populações de M. peruiferum pelo

estimador FST utilizando marcadores microssatélites e SNPs neutros .....................................54

SUMÁRIO

RESUMO...................................................................................................................................8

ABSTRACT...............................................................................................................................9

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................10

LISTA DE TABELAS..............................................................................................................12

INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................................................17

OBJETIVOS.............................................................................................................................24


(Fabaceae), uma espécie arbórea da Mata Atlântica utilizada na restauração

florestal.....................................................................................................................................25

Resumo......................................................................................................................................25

1.1. Introdução...........................................................................................................................26

1.2. Material e Método..............................................................................................................28

Local de coleta..........................................................................................................................28

Produção de mudas...................................................................................................................30

Extração de DNA e genotipagem SSRs....................................................................................30

Análises estatísticas...................................................................................................................31

Sistema reprodutivo..................................................................................................................31

Diversidade e estrutura genética...............................................................................................32

1.3. Resultados..........................................................................................................................33

Sistema reprodutivo..................................................................................................................33


1.4. Discussão............................................................................................................................38


remanescente natural e restauração florestal ......................................................................42

Resumo......................................................................................................................................42

2.1. Introdução..........................................................................................................................43

2.2. Material e Método..............................................................................................................45

Áreas de estudo.........................................................................................................................45

Amostragem..............................................................................................................................47

Extração de DNA e genotipagem SSRs....................................................................................47

Construção de biblioteca genômica para a obtenção de SNPs..................................................48

Processamento de análise dos marcadores SNPs......................................................................48

Análises estatísticas...................................................................................................................49

Locos candidatos à seleção.......................................................................................................49


2.3. Resultados..........................................................................................................................49

Obtenção dos Locos SNPs........................................................................................................49

Diversidade e índice de fixação................................................................................................50

Estrutura genética......................................................................................................................51

2.4. Discussão...........................................................................................................................57

Considerações para restauração florestal..................................................................................59

CONCLUSÕES GERAIS.........................................................................................................61

REFERÊNCIAS........................................................................................................................62

ANEXOS..................................................................................................................................84

17

INTRODUÇÃO GERAL Esta dissertação faz parte do Projeto Biota-Fapesp (2011/50296-8) intitulado

Biologia da conservação de espécies nativas da Mata Atlântica com potencial fitoterápico:

Uma abordagem genética sobre restaurações florestais

gerar informações importantes para o conservacionismo de espécies nativas da Mata Atlântica

com potencial fitoterápico (Casearea sylvestris, Centrolobium tomentosum, Piptadenia

gonoacantha e Myroxylon peruiferum). Este projeto se propôs realizar um estudo

aprofundado sobre as condições de diversidade e estruturação genética em áreas de

restauração florestal, comparando essas condições com as encontradas

em remanescentes naturais da mata Atlântica.

A Mata Atlântica é um complexo vegetacional que se estende desde o Rio Grande

do Norte até o Rio Grande do Sul por toda costa brasileira com diferentes condições

topográficas e climáticas. Abrange planícies e montanhas costeiras com altos índices de

precipitação, bem como planaltos com longos períodos de seca (METZGER, 2009). Possui

várias fitofisionomias, por exemplo, Floresta Ombrófila Densa, Floresta Ombrófila Aberta,

Mata de Araucárias, Floresta Estacional Semidecidual, Floresta Estacional Decidual, campos

de altitude, manguezais e restinga (SOS MATA ATLÂNTICA/INPE, 2015). A Mata

Atlântica detém grande parte da biodiversidade com, por exemplo, 15.001 espécies de

Angiospermas sendo 7.432 endêmicas (THE BRAZIL FLORA GROUP, 2015) e encontra-se

bastante fragmentada sendo considerado um dos 25 hotspots para a conservação da

biodiversidade do mundo (MYERS et al., 2000). Originalmente, cobria aproximadamente

17% do território brasileiro (130.973.638 ha), hoje restam apenas 15% da área original

(19.676.120 ha) (SOS MATA ATLÂNTICA/INPE, 2015).

A degradação da Mata Atlântica iniciou-se por volta de 500 anos atrás (DEAN,

1995) com a exploração econômica de diferentes produtos, como o Pau-Brasil (Caesalpinia

echinata), a introdução da cana de açúcar entre outras culturas, e expansão da pecuária

(METZGER, 2009). Como consequência do longo histórico de degradação, a Mata Atlântica

encontra-se altamente fragmentada, sendo esses fragmentos pequenos e isolados circundados

por matriz urbana e agrícola (RIBEIRO et al., 2009). Myers et al. (2000) sugerem que muitas

espécies se tornaram extintas. Grande parte desses fragmentos são parques, reservas, estações

ecológicas ou estão localizados dentro de propriedades privadas (TABARELLI et al., 2005).

Além da grande biodiversidade que a Mata Atlântica abriga, cerca de 110 milhões de

brasileiros dependem dela para o fornecimento de comida, água, regulação climática

18

(RODRIGUES et al., 2009b; JOLY et al., 2014), assim torna-se necessária sua conservação in

situ e recuperação. De acordo com a Lei n° 9.985 de 2000, conservação in situ é a

conservação de ecossistemas e habitats naturais e a manutenção e recuperação de populações

viáveis de espécies em seus meios naturais e, no caso de espécies domesticadas ou cultivadas,

nos meios onde tenham desenvolvido suas propriedades características; e recuperação é a

restituição de um ecossistema ou de uma população silvestre degradada a uma condição não

degradada, que pode ser diferente de sua condição original. Muitas ações estão sendo

realizadas para a conservação da Mata Atlântica através da manutenção das áreas

remanescentes e a restauração florestal de áreas degradadas, para reestabelecer as principais

ligações de conectividade entre os fragmentos (RIBEIRO et al., 2009).

Com as crescentes pressões sobre os ecossistemas mundiais, a restauração vem

como uma ferramenta para mitigar as mudanças climáticas e evitar a perda da biodiversidade

enquanto fornece outros benefícios para a humanidade e para os sistemas naturais

(ALEXANDER et al., 2011b). O interesse na restauração florestal tem aumentado

rapidamente nas últimas décadas (ARONSON e ALEXANDER, 2013) e metas ambiciosas de

restauração têm sido estabelecidas em âmbito internacional e nacional. No Brasil, devido ao

cumprimento da nova lei de proteção e recuperação da vegetação nativa (Lei nº 12.651 de

2012), estima-se que 21 milhões de hectares de ecossistemas degradados na maioria dos

casos ecossistemas florestais sejam restaurados nos próximos 20 anos (SOARES-FILHO et

al., 2014).

A restauração possui três metas principais: 1) o rápido estabelecimento das

plantas; 2) persistência das plantas ao longo do tempo; e 3) a resiliência dos ecossistemas

(KETTENRING et al., 2014) com a recuperação da biodiversidade e dos serviços

ecossistêmicos que foram perdidos e/ou reduzidos (MIJANGOS et al., 2015). No Brasil, a

primeira ação de restauração ocorreu no inicio do século XIX devido a uma crise no

suprimento de água na cidade do Rio de Janeiro (CORLETT, 1999), desde então, vários

projetos de restauração foram conduzidos na Mata Atlântica. Ao longo dos anos, os objetivos

dos projetos de restauração mudaram e novas técnicas foram desenvolvidas (RODRIGUES et

al., 2009b). Segundo Rodrigues et al. (2009b), a evolução da restauração na Mata Atlântica

pode ser dividida em fases. Fase 1, corresponde aos primeiros projetos de restauração que

tinham como objetivo apenas a proteção da água e do solo. Esses projetos não levavam em

consideração os processos ecológicos e não tinham um critério de seleção de espécies

estabelecido. Fase 2, a partir dessa fase começou o uso de espécies nativas brasileiras e de

aspectos ecológicos da sucessão florestal. Fase 3, nessa fase ocorreu a introdução de uma

19

maior diversidade funcional principalmente no que se refere a longevidade e grupo ecológico

das espécies. Tinham como objetivo não só proteger os serviços ecossistêmicos, mas também

a conservação da biodiversidade. Fase 4, teve como principal foco reestabelecer os processos

ecológicos básicos da floresta visando recuperar a resiliência. Fase 5, esta fase compreende o

atual esforço em incorporar a diversidade genética nos projetos de restauração, pois ela é a

chave para a evolução e manutenção de qualquer sistema florestal (LESICA e ALLENDORF,

1999).

As técnicas de restauração mais utilizadas na literatura são o plantio de mudas e

semeadura direta (RUIZ-JAEN e AIDE, 2005). O uso de espécies nativas na restauração é

importante, pois são capazes de se adaptar a condições bióticas e abióticas locais favorecendo

a biodiversidade local e as funções ecossistêmicas em comparação com espécies exóticas

(TANG et al., 2007). No entanto, pouco se sabe sobre a variação genética entre e dentro de

espécies de árvores nativas, sua história de vida e a consequências de suas interações com os

outros e com seu ambiente (THOMAS et al., 2014). O estudo de espécies nativas pode

permitir o conhecimento de sua história de vida e entender seu comportamento com o meio

em que está inserida, possibilitando a inferência de estratégias para a conservação ao longo

prazo, tornando-se importante para projetos de conservação e restauração.

O uso de parâmetros genéticos para o estudo de espécies arbóreas da Mata

Atlântica tem se tornado frequente e vêm auxiliando projetos de conservação, melhoramento e

restauração. O estudo do sistema reprodutivo, por exemplo, é importante, pois pode afetar os

níveis de endogamia, a estrutura de famílias e o tamanho efetivo populacional local com

consequências na adaptação local (GERBER et al., 2014) sendo bastante relevante para fins

de conservação e restauração. O tamanho efetivo populacional segundo Wright (1931) é o

número de indivíduos reprodutivos em uma população ideal que teria os mesmos valores de

frequências alélicas e endogamia que a população sob questão. Esse parâmetro tem grande

implicação na capacidade de uma população em manter as características genéticas ao longo

de muitas gerações, sendo imprescindível para à análise de sua viabilidade a médio e longo

prazo (KAGEYAMA e GANDARA, 2003). Por exemplo, alguns estudos com espécies

tropicais têm observado valores de tamanho efetivo de variância para progênies menores do

que esperado para populações panmíticas ( Copaifera langsdorffii

em uma área fragmentada, o tamanho efetivo variou entre progênies de 1,40 a 2,97

(MANOEL et al., 2012a). Para Handroanthus heptaphyllus, em duas populações

fragmentadas, foi observado tamanho efetivo de 2,98 e 3,07, respectivamente (MORI et al.,

20

2015). Para espécies arbóreas tropicais, a estimativa do tamanho efetivo, por exemplo, tem

implicações no número de árvores matrizes para a coleta de sementes para programas de

conservação ex situ e recuperação ambiental (SEBBENN, 2002; 2006).

O número de árvores matrizes para a coleta de sementes é de grande importância

para projetos de conservação e restauração, pois para essas atividades as sementes devem ser

coletadas de um número de árvores matrizes que mantenham níveis suficientes de

variabilidade genética e o mínimo de endogamia (SEBBENN et al., 2003). Baixa diversidade

genética no material plantado pode levar a um excesso de homozigoto na próxima geração e

consequentemente levar a depressão por endogamia (WHITE et al., 2007). Uma ampla base

genética por si só não garante a sobrevivência das plantas até a fase reprodutiva, contudo,

aumenta a chance de parte do material se estabelecer (SEBBENN, 2002). Os efeitos negativos

da homogeneidade genética, às vezes, não são imediatamente evidentes, mas acumulam-se ao

longo do tempo, significando que os problemas resultantes são difíceis de prever (ROGERS e

MONTALVO, 2004).

Com a atual questão das mudanças climáticas, a perda da diversidade genética

pode afetar a habilidade das espécies em se adaptar a essas condições (BARRETT e

SCHLUTER, 2008), especialmente em populações que sofreram redução no tamanho efetivo

populacional (ELLSTRAND e ELAM, 1993; LEIMU et al., 2006). Populações pequenas e

isoladas que tiveram redução na diversidade genética como consequência da deriva genética

tendem a se tornar endogâmicas (REED e FRANKHAM, 2003) com consequências negativas

para a preservação dessas populações (FRANKHAM, 1995a; b). O conhecimento sobre a

estrutura da variação genética é fundamental para o entendimento da genética populacional de

espécies florestais e outras plantas (EPPERSON, 1992). Assim, a quantidade de variação

genética e sua distribuição espacial são elementos chave para a viabilidade e sobrevivência

das espécies arbóreas e para o estabelecimento de estratégias de conservação e restauração

(ESCUDERO et al., 2003).

O uso dos marcadores moleculares é essencial para o estudo populacional, pois

são a principal ferramenta para avaliar a variabilidade genética dentro e entre populações

(TELLES et al., 2003), permitindo um melhor entendimento dos processos microevolutivos,

gerando informações sobre a diferenciação populacional no espaço e no tempo que pode ser

de grande valor para a conservação (NEWTON et al., 1999; CRANDALL et al., 2000;

HEDRICK, 2001; MANEL et al., 2003). Marcador molecular de acordo com Ferreira e

Grattapaglia (1998) pode ser qualquer fenótipo proveniente de um gene expresso ou de um

segmento de DNA não expresso, transmitidas pelas leis comuns de herança de uma geração

21

para a outra. Dentre os marcadores moleculares, os mais utilizados para o estudo populacional

são os marcadores microssatélites, pois eles possuem característica genética que permitem a

construção de mapas genéticos, o estudo do fluxo gênico, análise de paternidade entre outros

(CHASE et al., 1996; KALIA et al., 2011). Atualmente, tem-se intensificado o interesse no

uso dos marcadores SNPs (Single nucleotide polymorphisms) para estudos populacionais

devido à quantidade de marcas geradas e a ampla cobertura genômica permitindo responder

algumas questões não resolvidas pelos marcadores microssatélite como, por exemplo,

processos de adaptação local (OUBORG et al., 2010).

Os SSRs (Simple sequence repeats) ou microssatélites são sequências de DNA de

um a seis pares de bases repetidas em tandem (TÓTH et al., 2000). São úteis para avaliar

parâmetros populacionais, devido algumas vantagens como, são codominantes; possuem alta

transferibilidade; alto grau de polimorfismo; extensa cobertura genômica; demanda baixa

qualidade e quantidade de DNA e poder ser automatizada (TÓTH et al., 2000; SEMAGN et

al., 2006; KALIA et al., 2011). Os SNPs (Single nucleotide polymorphisms) são variações na

sequência de DNA que afeta apenas uma base na sequência do genoma. São obtidos através

de técnicas de sequenciamento de nova geração e têm se tornado os marcadores moleculares

mais populares no estudo genético de plantas (LIU et al., 2015). Dentre suas vantagens estão:

abundantes nos genomas de plantas (RAFALSKI, 2002); baixa taxa de novas mutações

(BRUMFIELD et al., 2003); e genotipagem de elevado rendimento e automatização

(CHAGNÉ et al., 2007).

O estudo genético de espécies arbóreas tropicais permite um melhor entendimento

sobre a história de vida e dinâmica populacional dessas espécies, podendo auxiliar em

programas de conservação e restauração florestal, sendo o conhecimento sobre o sistema

reprodutivo e sobre a estrutura e diversidade genética, essenciais para estes fins. Assim

estudar a espécie arbórea Myroxylon peruiferum é um passo importante para sua conservação.

A espécie de estudo, Myroxylon peruiferum L.f., pertence à família Fabaceae e é

conhecida popularmente como bálsamo ou Cabreúva. É uma espécie clímax utilizada na

restauração florestal. A espécie não é endêmica do Brasil, sendo encontrada também na

Argentina, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana, México e Peru. No Brasil, a espécie ocorre

nas regiões Nordeste, Sudeste, Centro-Oeste e Sul (Figura 1) tanto no Cerrado como na Mata

Atlântica (MARTINS et al., 2016). Segundo Lorenzi (1992) e Figliolia et al. (2006) a espécie

é encontrada no interior da mata primária densa e em formações secundárias, principalmente

na Floresta Estacional Semidecidual. Nogueira (1977) afirma que a espécie é frequente em

beira de rios e suporta inundações anuais.

22

Figura 1: Distribuição geográfica de Myroxylon peruiferum no território brasileiro. Fonte:

Sartori, A.L.B. Myroxylon in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio

de Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB29797>.

Myroxylon peruiferum (Figura 2a) é uma árvore decídua, heliófita, com folhas

compostas pinadas (Figura 2b) com 10-14 folíolos com glândulas translúcidas em forma de

traços (MARCON, 2013) de 10-12 cm de comprimento (MARTINS et al., 2016). Atingem de

10 a 15 metros de altura, possui o tronco reto (Figura 2c), inermes, rugoso, castanho escuro

com diâmetro de 60 cm a 80 cm (LORENZI, 1992; MARTINS et al., 2016). As

inflorescências (Figura 2d) são racemosas, terminais e axilares e as flores são brancas ou

amareladas com cálice campanulado (MARTINS et al., 2016). São polinizadas por abelhas,

borboletas, mariposas e aves (YAMAMOTO, 2001; YAMAMOTO et al., 2007; NISHIDA et

al., 2014). Os frutos (Figura 2e) são do tipo sâmara de cor marrom, medindo de 5,5 a 9,5

centímetros (MARTINS et al., 2016). São dispersos pelo vento e podem ser diretamente

semeados (AGUIAR e BARCIELA, 1986). As sementes medem de 1 a 1,3 centímetros de

comprimento e são consideradas ortodoxas (CARVALHO et al., 2006; MARTINS et al.,

23

2016). A floração ocorre nos meses de julho a setembro e a frutificação ocorre nos meses de

outubro a dezembro (FIGLIOLIA et al., 2006). Devido ao seu crescimento lento em plantios

puros, recomenda-se que sejam plantadas juntamente com espécies pioneiras e secundárias de

rápido crescimento para que tutorem seu crescimento, caso o objetivo seja a produção de

madeira (SEBBENN et al., 1998).

Figura 2: a) Exemplar da espécie de estudo M. peruiferum (acervo próprio); b) Folhas

compostas pinadas (acervo próprio); c) Tronco reto e liso (acervo próprio); d) Inflorescência

(rubens-plantasdobrasil.blogspot.com.br); e e) Frutos tipo sâmara

(http://www.clickmudas.com.br).

A espécie M. peruiferum além de ser utilizada na recuperação de áreas

degradadas, possui alguns outros usos como na construção civil, perfumaria e fitoterapia. A

espécie possui atividade fitoterápica contra alguns microrganismos (OHSAKI et al., 1999;

GONÇALVES et al., 2005; CARVALHO et al., 2008). A Organização Mundial de Saúde

(OMS) reconhece que grande parte da população em países em desenvolvimento utiliza

desses recursos fitoterápicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). A grande utilização de

espécies com potencial fitoterápico gera uma intensa procura aos recursos naturais, o que tem

causado sérios danos à diversidade genética de algumas espécies (SOUZA, 2015). Por causa

24

do seu uso fitoterápico e de sua madeira apresentar elevada densidade e resistência ao

apodrecimento, à espécie sofreu exploração comprometendo a diversidade genética e a

vulnerabilidade da espécie (MAMEDE et al., 2007). Por exemplo, Toniato et al. (1998)

observaram para a espécie densidade absoluta igual a 5 indivíduos/ha - em um fragmento de

mata de brejo. Silva e Soares (2002) encontraram densidade absoluta igual a 4 indivíduos/ha

em um fragmento de Floresta Estacional Semidecidual. Silva (2008) estudando a composição

florística e fitossociologia em um talhão de espécies

Navarro de And - SP observou uma redução no número de

indivíduos de M. peruiferum entre os anos de 1957 e 2007 de 54 indivíduos para 13

indivíduos.

OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo descrever o sistema reprodutivo de

Myroxylon peruiferum L. f. e avaliar a diversidade e estrutura genética da espécie em viveiros

comerciais do estado de São Paulo e em fragmentos de floresta nativa e plantios de

restauração com o auxílio de marcadores moleculares a fim de compreender a dinâmica

populacional da espécie e suas implicações para o manejo e conservação da Mata Atlântica. Os

objetivos específicos foram:

1) Sistema reprodutivo: descrever ao sistema reprodutivo de M. peruiferum em

um fragmento remanescente de Mata Atlântica através das estimativas da taxa de cruzamento

e parâmetros afins, além de determinar o número de árvores matrizes para coleta de sementes

para projetos de conservação e restauração florestal;

2) Diversidade e estrutura genética em viveiros: avaliar a diversidade e estrutura

genética de mudas de M. peruiferum em viveiros comerciais no estado de São Paulo com o

uso de marcadores SSRs, a fim de entender os níveis de diversidade genética nas mudas que

podem ser utilizadas em projetos de restauração;

3) Diversidade e estrutura genética em fragmentos florestais: avaliar a diversidade

e estrutura genética em áreas restauradas em comparação com áreas nativas de Mata Atlântica

utilizando marcadores SSRs e SNPs com a finalidade de avaliar o potencial dos projetos de

restauração estudados; além de identificar locos SNPs que podem estar sob influência de

seleção.

25



Resumo

Projetos internacionais e nacionais visam à recuperação ambiental de ecossistemas tropicais a

fim de mitigar os problemas ambientais atuais. No entanto, é dada pouca atenção para a

variação genética dentro e entre as espécies arbóreas nativas e do material que é incorporado

nos projetos de restauração. Os objetivos deste trabalho foram descrever o sistema

reprodutivo e avaliar a diversidade e estrutura genética de Myroxylon peruiferum L. f. com o

auxílio de marcadores microssatélites. Para a estimativa da taxa de cruzamento, foram

analisadas 200 plântulas, produzidas a partir de sementes coletadas de 10 matrizes localizadas

em um remanescente natural de Mata Atlântica. Para a estimativa da diversidade e estrutura

genética, foram coletadas 148 mudas provenientes de quatro viveiros comercias do estado de

São Paulo. As progênies de M. peruiferum apresentaram taxa de cruzamento misto (0,740) e

evidências de endogamia biparental. O número de matrizes para a coleta de sementes para

projetos de conservação e restauração foi de pelo menos 47, considerando um tamanho

efetivo de referência de 100. As estimativas de diversidade genética foram baixas, por

exemplo, riqueza alélica variou de 2,73 a 3,01 e o índice de fixação foi alto para todos os

viveiros estudados (0,1488), provavelmente devido ao número reduzido e isolamento das

árvores matrizes que deram origem as mudas estudadas. Os resultados mostram a necessidade

de um planejamento mais adequado na coleta de sementes para produção de mudas em

projetos de conservação ex situ e restauração, a fim de garantir maior diversidade genética nas

novas populações permitindo sua manutenção ao logo do tempo.

Palavras-chave: endogamia biparental; microssatélites; restauração ativa; taxa de cruzamento

26

1.1 Introdução

Em um panorama global, o extenso uso da terra e as mudanças na sua cobertura

causada pelo homem têm levado a esforços de conservação focados na recuperação natural e

ativa dos ecossistemas degradados visando restaurar a biodiversidade e os serviços

ecossistêmicos (ARONSON et al., 2007; CHAZDON, 2008; REY BENAYAS et al., 2008).

Por exemplo, esforços internacionais e nacionais têm estabelecido metas para a recuperação

ambiental como, a restauração de 15% dos ecossistemas degradados (CBD, 2010), ou 150

milhões de hectares (WRI, 2012) até 2020 e o Pacto pela Restauração da Mata Atlântica que

visa à restauração de 15 milhões de hectares deste bioma até 2050 (MELO et al., 2013).

Devido ao histórico de degradação de alguns ecossistemas naturais e a recuperação natural

demorar décadas, projetos de restauração ativa têm se tornado comum para reintroduzir um

grande conjunto de espécies nativas típicas das florestas tropicais (CHAZDON, 2008; HOLL

e AIDE, 2011; RODRIGUES et al., 2011). O uso de espécies nativas na restauração florestal

contribui para conservação das espécies utilizadas e de sua diversidade genética, são melhores

adaptadas às condições locais e podem ser preferenciais para o uso pelas comunidades locais

(TANG et al., 2007; CHAZDON, 2008). Diante das imprevisíveis condições futuras, os

projetos de restauração estão incorporando o uso de material vegetal geneticamente

diversificado para garantir a persistência da restauração ao longo do tempo (HARRIS et al.,

2006; RODRIGUES et al., 2009a).

A diversidade genética permite que populações naturais sejam capazes de

sobreviver à variação climática, a doenças, a competição e condições do solo. Desta forma, ao

utilizar-se materiais geneticamente diversos, as populações restauradas poderão ter o potencial

de populações naturais (BASEY et al., 2015). O papel da diversidade genética não se limita

apenas a dinâmica populacional, mas também as funções do ecossistema. Por exemplo, em

alguns ecossistemas, populações geneticamente diversas são mais produtivas, aumentam a

retenção de nutrientes e suportam as mais diversas e abundantes comunidades animais

(JOHNSON e AGRAWA, 2005; CRAWFORD e RUDGERS, 2012a; b; REYNOLDS et al.,

2012). Conhecer o a diversidade genética das mudas que serão utilizadas nos projetos de

restauração torna-se importante, pois populações restauradas que possuem diversidade

genética alta serão mais capazes de se adaptar e persistir nas imprevisíveis mudanças futuras

que aquelas menos diversas geneticamente (JUMP et al., 2009). A estrutura da diversidade

genética e seu padrão espacial dentro das populações também são componentes importantes

dos processos evolutivos de populações naturais de plantas (EPPERSON, 1990).

27

O sistema reprodutivo tem papel importante na composição genética das

populações, pois ele determina o modo de transmissão dos genes de uma geração para outra,

influenciando na distribuição e conteúdo da variação genética dentro e entre populações

(BROWN, 1990; OOSTERMEIJER et al., 2003). Com base na taxa de cruzamento, as

espécies podem ser autógamas, aquelas que apresentam até 5% de cruzamentos, alógamas,

aquelas que apresentam mais de 95% de cruzamentos, ou mistas, que apresentam uma taxa

intermediária entre autógamas e alógamas. Em geral, acredita-se que espécies arbóreas

tropicais possuem um sistema reprodutivo misto com predominância de cruzamentos

(MURAWSKI e HAMRICK, 1992). O sistema reprodutivo em espécies arbóreas pode ser

medido como a proporção de sementes que são provenientes da autofecundação e de

cruzamentos (MURAWSKI e HAMRICK, 1991) e geralmente tem sido caracterizado pelos

modelos de cruzamentos mistos (RITLAND e JAIN, 1981) e cruzamentos correlacionados

(RITLAND, 1989). As estimativas dos parâmetros do sistema de reprodução como, taxa de

cruzamento e correlação de paternidade, são utilizadas para estimar a coancestria e o tamanho

efetivo dentro de progênies, sendo estes dois últimos parâmetros fundamentais para

determinar o número de árvores matrizes para a coleta de sementes para conservação genética

e recuperação ambiental (SEBBENN, 2002; MORI et al., 2013). A coleta de sementes requer

amostras representativas da variabilidade genética, a fim de evitar endogamia nas futuras

gerações e conservar o potencial evolutivo das espécies, pois sementes provenientes de uma

ou poucas árvores matrizes pode levar à fundação de populações sujeitas aos efeitos da deriva

genética, como alterações nas frequências alélicas, perda e fixação de alelos, redução na

heterozigosidade e aumento nos níveis de endogamia (SEBBENN, 2002). Uma das formas de

avaliar o sistema reprodutivo é utilizar marcadores genéticos, dentre eles se destacam os

marcadores moleculares microssatélites que quantificam o processo de transmissão de genes

entre plantas e gerações, permitindo uma ampla cobertura genômica para a espécie (CLEGG,

1980; OLIVEIRA et al., 2002).

Em ecossistemas fragmentados, como é o caso da Mata Atlântica brasileira, o

conhecimento sobre a taxa de cruzamento das espécies alvo dos projetos conservacionistas é

essencial para o planejamento de estratégias para mitigar a perda da diversidade genética e

para fomentar o restabelecimento de populações viáveis em projetos de restauração ecológica.

Problemas de erosão genética podem ser agravados nesse contexto quando se trata de espécies

historicamente superexploradas para a produção de madeira, como é o caso da espécie de

estudo, reduzindo a densidade da espécie em remanescentes naturais e favorecendo a perda de

diversidade genética por processos como a deriva genética e isolamento geográfico.

28

Myroxylon peruiferum L.f (Fabaceae), popularmente conhecida como balsámo ou

Cabreúva, é uma espécie clímax com ampla distribuição na Mata Atlântica. É polinizada por

abelhas e aves (YAMAMOTO, 2001; YAMAMOTO et al., 2007) e possui síndrome de

dispersão pelo vento. Os frutos são do tipo sâmara de cor castanho-amarelada, medindo até 13

cm e com 1 ou 2 sementes aromáticas (MAINIERI, 1970). O número de sementes por peso é

de 1.700/Kg (MORI et al., 2012). Possui madeira altamente resistente sendo bastante usada na

construção civil, também é usada na perfumaria e armazenamento de cachaça (LORENZI,

1992; FIGLIOLIA et al., 2006; CATÃO et al., 2011). A espécie também possui potencial

fitoterápico frente à microrganismos (OHSAKI et al., 1999; GONÇALVES et al., 2005;

CARVALHO et al., 2008).

Assim, os objetivos do trabalho foram estimar a taxa de cruzamento de M.

peruiferum em uma área considerada como referência para programas de restauração e avaliar

a diversidade genética de mudas da espécie em quatro viveiros comerciais no estado de São

Paulo com o auxílio de marcadores microssatélites, a fim de responder as seguintes perguntas:

a) Qual a taxa de cruzamento da espécie em um remanescente natural de Mata Atlântica que é

uma área de referência em projetos de restauração? b) Quantas matrizes são necessárias para

coleta de sementes a fim de assegurar variabilidade genética para uso em projetos de

conservação ex situ e restauração? c) Qual o nível de diversidade genética das mudas

utilizadas em projetos de restauração?

1.2 Material e Métodos

Local de coleta

A coleta de sementes para o estudo do sistema reprodutivo de M. peruiferum foi

realizada na Estação Ecológica dos Caetetus - REF (Figura 1.1) localizada entre os

municípios de Gália e Alvilândia no Centro-Oeste do estado de São Paulo. Possui uma área

contínua de 2.170 ha, é um dos últimos remanescentes conservados de Floresta Estacional

Semidecidual no planalto Ocidental do estado de São Paulo (IBGE, 1992), sendo considerada

uma área referência para projetos de restauração florestal. Durigan et al. (2000) encontrou

densidade absoluta de indivíduos adultos de Myroxylon peruifeum neste remanescente de dois

individuo por hectare.

A coleta de amostras foliares de mudas de M. peruiferum para o estudo de

diversidade genética se deu em quatro viveiros comerciais do estado de São Paulo (Figura

1.1), sendo 37 amostras por viveiro. O primeiro viveiro (V1), está localizado no município de

Penápolis e foi fundado em 1986. O segundo viveiro (V2), está localizado no município de

Capão Bonito e foi estabelecido em 1998. Está inserido dentro da Floresta Nacional de Capão

29

Bonito, uma unidade de conservação de uso sustentável sob administração do IBAMA/MMA.

O terceiro viveiro (V3), está localizado no município de Socorro, faz parte da Associação

Ambientalista Copaíba e foi fundado em 1999. O quarto viveiro (V4), está localizado no

município de Ibaté e foi fundado em 1993. Segundo informações dos viveiros, as mudas

analisadas foram provenientes de poucas árvores matrizes e principalmente coletadas em

fragmentos de floresta.

Figura 1.1: a) Mapa das áreas de estudo para o sistema reprodutivo e diversidade genética de

M. peruiferum.

30

Produção de mudas

As sementes de M. peruiferum foram coletadas de 10 árvores matrizes e

identificadas por matriz em sacos separados no local de coleta. Posteriormente foram levadas

para casa de sombra e foram germinadas diretamente em areia, separadas por matriz (Figura

1.2a). Após a germinação inicial (Figura 1.2b), as plântulas foram transferidas

individualmente para tubetes grandes, contendo mistura de terra e vermiculita, e foram

mantidas em casa de sombra por aproximadamente uma semana (Figura 1.2c). Após este

período, os tubetes contendo as plântulas foram transferidos ao sol pleno. Foi produzido um

total de 200 plântulas, sendo 20 plântulas para cada árvore matriz.

Figura 1.2: Produção de mudas de M. peruiferum. a) Mudas separadas por matriz; b) Plântulas

emergidas a partir de semeadura direta; e c) Mudas em tubetes contendo mistura de terra e

vermiculita.

Extração de DNA e genotipagem SSRs

O DNA foi extraído de folhas segundo Doyle e Doyle (1990) com algumas

modificações (2% CTAB, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% PVP-40 (p/v), 1,42

M NaCl e 3% -mercaptoetanol (v/v)). Os genótipos de cada indivíduo foram identificados

utilizando oito marcadores microssatélites (SCHWARCZ et al., 2014). A genotipgem foi

31

realizada usando o sequenciador 4300 DNA Analyzer (Li-Cor, Lincoln, EUA) e o tamanho

dos fragmentos amplificados foram determinados usando 50-350bp IRDyeR700 e 800 ladder

(Li-Cor) e o programa SAGA (Li-Cor).

Análises estatísticas

Sistema reprodutivo

As análises do sistema reprodutivo de M. peruiferum foram realizadas usando o

modelo de cruzamento misto (RITLAND e JAIN, 1981) e de cruzamentos correlacionados

(RITLAND, 1989), implementado no programa MLTR (RITLAND, 2002). Foi utilizado o

algoritmo Expectation-Maximization (EM) para obtenção de estimativas de máxima

verossimilhança dos parâmetros. Foram estimados os seguintes parâmetros: taxa de

cruzamento multiloco ( ), taxa de cruzamento uniloco ( ), taxa de cruzamento entre

indivíduos aparentados ( ) e a correlação de paternidade multiloco ( ). As

pressuposições do modelo misto são: 1) o conjunto de pólen é homogêneo para os

cruzamentos com todos os genótipos maternos; 2) segregação independente e 3) os locos não

são afetados pela seleção ou mutação entre o evento reprodutivo e a análise (RITLAND e

JAIN, 1981). Com a estimativa desses parâmetros pôde-se estimar o número efetivo de

doador de pólen ( ), o coeficiente de coancestria médio dentro de progênies

, onde é o coeficiente de endogamia parental

(RITLAND, 1989) e é a taxa de autofecundação, e a frequência de pares de irmãos

de autofecundação ( ), meios-irmãos ( ),

irmãos-completo ( ) e irmãos de autofecundação e cruzamento

( ) (RITLAND, 1989; SEBBENN, 2006).

O índice de fixação para as matrizes e progênies foi estimado através dos

programas SPAGEDI 1.3 (HARDY e VEKEMANS, 2002), utilizando o coeficiente de

parentesco (estimador J. Nason) com base em Loiselle et al. (1995) e FSTAT (GOUDET,

1995), respectivamente. O tamanho efetivo dentro de progênie foi estimado segundo

Cockerham (1969) como: , onde é o tamanho da amostra e é o

coeficiente de endogamia dentro de progênie, estimado pelo índice de fixação. O tamanho

efetivo de variância de acordo com Sebbenn et al. (2003) mede, em termos de deriva genética,

32

a representatividade genética de uma amostra de estruturas de progênies retirada de uma

população ancestral ideal. O número de matrizes necessárias para a coleta de sementes para

fins de conservação ou restauração considerando um tamanho efetivo populacional de

referência, ou que se pretende reter na amostra de sementes, igual a 100 foi estimado como

(SEBBENN, 2006). Essa estimativa obedece a três pressupostos: 1)

matrizes não correlacionadas; 2) cada matriz tem um conjunto diferente de doadores de pólen;

e 3) as matrizes não cruzam entre si. Considerando progênies de polinização aberta, o

tamanho efetivo populacional de referência, o qual se espera reter na população, igual a 100

seria recomendado para conservação em curto prazo (cinco gerações) de populações naturais

que, por exemplo, apresentam sobreposição de gerações (FRANKHAM et al., 2014). Esse

tamanho efetivo populacional permite a perda de até 10% do fitness da população

(FRANKHAM et al., 2014). A estimativa do número de árvores matrizes para coleta de

sementes é relevante para estratégias de conservação e restauração, pois provavelmente

garante a variabilidade genética necessária para a persistência da população no curto e médio

prazo.

Diversidade e estrutura genética

As análises de diversidade genética para as mudas de M. peruiferum foram

realizadas no programa R (R CORE TEAM, 2015), utilizando os pacotes diveRsity

(KEENAN et al., 2013) e PopGenKit (PAQUETTE, 2012), considerando cada viveiro como

uma população. Os parâmetros estimados foram: riqueza alélica (AR), heterozigosidades

observada (HO) e esperada (HE) e o índice de fixação (FIS). Intervalos de confiança foram

obtidos por 1000 reamostragens boostraps.

A estrutura genética populacional foi avaliada com o programa STRUCTURE v.

2.3.3 (PRITCHARD et al., 2000; FALUSH et al., 2003). Foram realizadas dez simulações

independentes feitas para cada valor de número de agrupamento K (1 a 10). Em cada

simulação, foram feitas 1.000.000 MCMC (Markov chain Monte Carlo) com um descarte

inicial (burn-in) de 500.000, o modelo escolhido foi admixture com frequências alélicas

correlacionadas. As simulações foram então feitas para o K mais provável em relação aos

propostos utilizando valores de EVANNO et al., 2005).

33

1.3 Resultados

Sistema reprodutivo

Os valores da taxa de cruzamento multiloco ( ) e taxa de cruzamento uniloco

( ) estão representados na tabela 1.1. A taxa de autofecundação foi 0,260. A taxa de

cruzamento entre indivíduos aparentados ( ) indicou endogamia biparental e a provável

existência de estrutura genética intra-populacional. A taxa de cruzamento multiloco dentro de

progênie variou de 0,543 a 0,945 e foi observado endogamia biparental em seis progênies

(Tabela 1.2).

Tabela 1.1: Estimativas dos parâmetros do sistema reprodutivo para M. peruiferum na Estação

Ecológica dos Caetetus (REF).

Parâmetros Valores (95%IC)

Número de árvores matrizes/número de sementes 10/200

Taxa de cruzamento multiloco ( ) 0,740 (0,646-0,807)

Taxa de cruzamento uniloco ( ) 0,622 (0,549-0,678)

Cruzamento entre parentes ( ) 0,118 (0,060-0,174)

Correlação de paternidade ( ) 0,233 (0,106-0,335)

Número efetivo de doador de pólen ( ) 4,3 (3,0-9,4)

Frequência de pares de irmãos de autofecundação ( ) 0,07 (0,04-0,13)

Frequência de pares de meios-irmãos ( ) 0,42 (0,32-0,53)

Frequência de pares de irmãos-completos ( ) 0,13 (0,05-0,19)

Frequência de pares de irmãos de autofecundação e de cruzamento

( )

0,38 (0,31-0,46)

Coeficiente de coancestria médio ( ) 0,217 (0,194-0,239)

Tamanho efetivo de variância ( ) 2,12 (1,94-2,33)

Número de árvores matrizes ( ) 47 (43-51)

35

A correlação de paternidade multiloco ( ) e o número efetivo de doadores de

pólen (1/ ) (Tabela 1.1) indicaram que poucos pais contribuíram na doação de pólen na

geração analisada. A correlação de paternidade dentro de progênies variou de 0,089 a 0,450,

enquanto que o número de doadores de pólen variou de 2,2 a 11,2 (Tabela 1.2). As progênies

foram compostas principalmente por meios-irmãos (42%), seguido por irmãos de

autofecundação (38%) e de irmãos-completos (13%).

O índice de fixação para as matrizes variou de -0,498 a 0,188 com quatro matrizes

mostrando algum nível de endogamia ( > 0). O índice de fixação dentro de progênies

variou de -0,212 a 0,014, com apenas uma progênie mostrando evidência de endogamia ( >

0). O coeficiente de coancestria dentro de progênies variou de 0,158 a 0,274 (Tabela 1.2). O

tamanho efetivo de variância variou de 1,75 a 2,86 dentro de progênies (Tabela 1.2). Baseado

no tamanho efetivo de variância, pelo menos 47 matrizes são necessárias para a coleta de

sementes para fins de conservação e restauração considerando-se um tamanho efetivo

populacional de 100 (Tabela 1.1).


A riqueza alélica (AR) variou de 2,73 a 3,01 e a heterozigosidade observada (HO)

variou de 0,346 a 0,443, no entanto, não houve diferença significativa para estas estimativas

entre os viveiros estudados (Tabela 1.3). A heterozigosidade esperada (HE) variou de 0,432 a

0,514 e foi significativamente maior no V4 em relação ao V3. O índice de fixação (FIS) variou

de -0,0256 a 0,3382 e foi significativamente maior no V4 em relação ao V2 e V3 (Tabela 1.3)

e foi significativamente diferente de zero. O índice de fixação (FIS) considerando todos os

viveiros foi 0,1488. A diferenciação genética (FST) entre as populações foi alta (0,2731). O

FST par a par entre os viveiros para M. peruiferum mostrou que existe uma estruturação alta

entre os pares de viveiros e que os viveiros 1 e 2 foram os mais diferenciados entre si (Tabela

1.4).

Em relação à estruturação populacional, de acordo com estatística ad hoc proposta

por Evanno et al. (2005), o valor mais provável de K foi 5 (Figura 1.3a), separando os quatro

viveiros em cinco diferentes agrupamentos, no qual o V4 é estruturado em dois agrupamentos

(Figura 1.3b).

36

Tabela 1.3: Estimativas de diversidade genética para M. peruiferum em quatro viveiros

comerciais no estado de São Paulo ( = número de indivíduos amostrados, AR = riqueza

alélica, HO = heterozigosidade observada, HE = heterozigosidade esperada no Equilíbrio de

Hardy-Weinberg e FIS = índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança (IC).

Viveiros N AR (95% IC) HO (95% IC) HE (95% IC) FIS (95% IC)

V1 37 2,73

(2,12-3,00)

0,397

(0,325-0,465)

0,467

(0,431-0,492)

0,1516

(-0,009-0,2898)

V2 37 2,91

(2,25-3,25)

0,443

(0,392-0,497)

0,432

(0,383-0,474)

-0,0256

(-0,1494-0,0917)

V3 37 3,01

(2,62-3,25)

0,419

(0,365-0,471)

0,435

(0,393-0,460)

0,0410

(-0,0804-0,1596)

V4 37 2,92

(2,62-3,00)

0,346

(0,278-0,399)

0,514

(0,473-0,527)

0,3382

(0,2370-0,4423)

Tabela 1.4: Resultado da estruturação do FST de Weir e Cockerham (1984) par a par para os

quatro viveiros comerciais no estado de São Paulo utilizando marcadores microssatélite.

V2 V3 V4

V1 0,3438* 0,2126* 0,2105*

V2 0,3298* 0,3301*

V3 0,1692*

*Significativo a 5%

37

Figura 1.3: Estruturação populacional para M. peruiferum em quatro viveiros comerciais do

estado de São Paulo. a) Representação gráfica dos valores de

grupos mais provável de acordo com Evanno et al. (2005) pelas análises do programa

STRUCTURE v.2.3.3 (Pritchard, et al. 2000; Falush et al. 2003); b) Teste de atribuição

realizado pela análise bayesiana das populações de M. peruiferum estudadas em cinco

agrupamentos. Os indivíduos amostrados nas populações estão representados pelas barras

verticais coloridas. A mesma cor em diferentes populações indica que pertencem ao mesmo

grupo. Cores diferentes na mesma barra indicam a porcentagem do genoma compartilhado

com cada grupo.

38

1.4 Discussão

A taxa de cruzamento multiloco para M. peruiferum na Estação Ecológica de

Caetetus indicou que a espécie apresenta sistema reprodutivo misto com predominância de

alogamia e provavelmente fraco ou nenhum mecanismo de autoincompatibilidade. Espécies

que apresentam sistema reprodutivo misto podem possuir elevado nível de adaptabilidade às

condições ambientais em novas áreas, proporcionado pela autofecundação em conjunto com a

recombinação de alelos que confere um alto potencial evolutivo para a espécie (SCARIOT et

al., 1991). A taxa de cruzamento pode variar entre populações, entre indivíduos e entre

eventos reprodutivos da mesma planta (SEBBENN, 2006; FERES et al., 2012). Estas taxas

podem variar tanto populacionalmente quanto temporalmente devido a diferenças na presença

de polinizadores. Desta forma, torna-se importante a análise de mais de uma área para uma

maior acurácia do sistema reprodutivo da espécie.

A taxa de cruzamento entre indivíduos aparentados indicou evidências de

cruzamento biparental. Ao nível de progênie também foi encontrado cruzamento biparental,

sugerindo a existência de estrutura genética espacial (SGS, do inglês, Spatial Genetic

Structure). Schwarcz et al. (in prep) também encontrou estrutura genética espacial para a

população de M. peruiferum na Estação Ecológica dos Caetetus. A estrutura genética espacial

promove o cruzamento entre parentes e consequentemente a endogamia biparental (GAINO et

al., 2010; FORTI et al., 2014). A dispersão biológica da espécie pode influenciar a estrutura

genética espacial (JORDANO et al., 2007; HOBAN et al., 2014). De acordo com Dick et al.

(2008) a dispersão de semente tem maior impacto na estruturação espacial em espécies

tropicais. M. peruiferum tem um fruto médio do tipo sâmara que é disperso pelo vento, o qual

pode explicar a estrutura genética espacial intra-populacional observada, já que frutos maiores

(tipo sâmara) são dispersos por distâncias menores (GREENE e JOHNSON, 1993). Esses

resultados corroboram com outros estudos que atribuem a existência de SGS à baixa dispersão

espacial de sementes (GAINO et al., 2010; HE et al., 2012; MORI et al., 2013). Apenas a

progênie M9, teve um índice de fixação diferente de zero, sugerido que a endogamia

encontrada é em grande parte atribuída ao cruzamento biparental.

A correlação de paternidade indicou poucos cruzamentos correlacionados, o qual

é suportado pela maior parte das progênies serem formadas por meios-irmãos (42%). Outros

estudos envolvendo espécies tropicais encontraram valores similares para a correlação de

paternidade (RIBEIRO e LOVATO, 2004; MOREIRA et al., 2011; RAMOS et al., 2011). A

pequena quantidade de cruzamentos correlacionados que encontramos para M. peruiferum na

área de estudo, pode ser associada à baixa densidade populacional da espécie (DURIGAN et

39

al., 2000), porque espécies com baixa densidade populacional tem menor diversificação de

pólen (MURAWSKI e HAMRICK, 1991; CASCANTE, et al. 2002). O coeficiente de

coancestria para cada descendência foi maior do que esperado para famílias de meios-irmãos

( = 0,125) sugerindo uma mistura de parentesco. Esse resultado reflete a biologia e história

da espécie, que apresenta sistema misto de reprodução, baixa densidade populacional devido à

fragmentação e exploração e evidências de SGS corroborado pela forma e síndrome de

dispersão do fruto. Gusson et al. (2006) e Manoel et al. (2012b) encontraram valores similares

de coancestria para espécies arbóreas da Mata Atlântica. O coeficiente de coancestria é um

parâmetro importante para programas de melhoramento e conservação, pois é uma medida de

identidade por descendência e pode ser influenciado pela seleção (GUSSON et al., 2006;

KARHUNEN e OVASKAINEN, 2012). O tamanho efetivo de variância foi menor do que

esperado para populações panmíticas ( 4), o qual tem importantes implicações para a

coleta de sementes para fins de melhoramento, conservação e restauração (SEBBENN, 2006).

Especificamente, pelo menos 47 matrizes não relacionadas seriam necessárias para promover

uma amostra de sementes com um tamanho efetivo populacional de 100 que, em curto prazo,

tolera 10% da perda de fitness pela população (FRANKHAM et al., 2014). Esse valor está de

acordo com a BLM Seeds of Success Program (USDI BUREAU OF LAND

MANAGEMENT, 2012) que recomenda amostragem de 30 indivíduos se a espécie for

totalmente alógama, 59 indivíduos se a espécies realiza autofecundação e 50 indivíduos se o

sistema reprodutivo da espécie ou a taxa de autofecundação não são conhecidos. Bessega et

al. (2000) estimou para a espécie mista Prosopis alba, número de matrizes para coleta de

sementes igual a 41.

Os parâmetros de diversidade genética encontrados nos viveiros foram baixos

(Tabela 1.3), que pode ser atribuído à biologia da espécie e/ou à baixa densidade populacional

causada pela fragmentação e pelo histórico de exploração que a espécie tem sofrido ao longo

do tempo. A fragmentação pode reduzir a diversidade genética neutra e adaptativa das

populações (JOHANSSON et al., 2007) e estudos têm sugerido que a redução da densidade de

indivíduos adultos pode levar a alterações nos padrões de diversidade genética como a perda

de alelos (ANDRÉ et al., 2008; LACERDA et al., 2008). A maior heterozigosidade esperada

encontrada no V4 em relação ao V3 ocorreu provavelmente porque o V4 é formado por dois

conjuntos gênicos, como observado pela estruturação genética que provavelmente é devido ao

local de coleta das sementes ou matrizes coletadas. O maior valor do índice de fixação foi

encontrado para o V4 sendo o único que não diferiu significativamente de zero. A maior

40

endogamia encontrada no V4 provavelmente ocorre devido ao efeito de Wahlund (desvio do

equilíbrio de Hardy-Weinberg causado por subestrutura populacional), já que foram

observados dois conjuntos gênicos para este viveiro. O índice de fixação considerando todos

os viveiros foi alto. O excesso de homozigotos observado pode ser devido ao isolamento pela

distância que é observado em M. peruiferum. Espécies que sofreram redução populacional

devido à exploração madeireira como à espécie de estudo, exibem número reduzido de

indivíduos reprodutivos afetando o sistema reprodutivo da espécie e os níveis de endogamia

(MILLAR et al., 2013; ARRUDA et al., 2015). O isolamento devido à fragmentação pode

influenciar as interações planta-polinizador resultando em consequências negativas no sistema

reprodutivo e no fluxo gênico, podendo aumentar os níveis de endogamia (LOWE et al.,

2005; AGUILAR et al., 2006; GIRÃO et al., 2007; KETTLE et al., 2007; AGUILAR et al.,

2008; LOBO et al., 2013). Com base nos valores de FST, a diferenciação genética entre

viveiros foi alta, indicando que não há mistura entre as mudas dos viveiros, o que era

esperado já que cada viveiro coleta sementes de M. peruiferum de regiões diferentes.

A estruturação genética entre os viveiros indicou a formação de cinco grupos

distintos, refletindo o isolamento geográfico entre os viveiros e corroborando com os valores

de FST. O V4 apresentou dois agrupamentos, provavelmente devido à quantidade de matrizes

que coletaram representando dois conjuntos gênicos. O V2 foi o que apresentou maior

diferenciação, possivelmente por causa da coleta de sementes: esse viveiro compra sementes

de uma cooperativa de coletores de sementes de árvores nativas e possivelmente não tem a

informação de quantas árvores foram coletadas sementes e dos locais de coleta.

Geralmente viveiros comerciais coletam sementes de 12 a 13 matrizes o que é

recomendado por Kageyama e Gandara (2003) para espécies alógamas em populações

grandes. Por apresentar sistema reprodutivo misto, M. peruiferum requer um maior número de

matrizes para coleta de sementes, para ter um tamanho efetivo populacional que garanta a

viabilidade das populações a curo e médio prazo (ao menos 47 matrizes). Sebbenn (2002),

também recomenda um número maior de árvores matrizes. Para garantir um mínimo de

variabilidade genética, é necessário coletar sementes em um número adequado de árvores

matrizes dependendo do tamanho da área que será restaurada e do sistema reprodutivo da

espécie, por exemplo, para populações com indício de endogamia em restaurações menores

que 100 ha, a coleta de pelo menos 30 árvores matrizes (SEBBENN, 2002). A coleta de maior

número de matrizes poderia garantir uma maior diversidade genética nas mudas dos viveiros

comerciais, já que os níveis de diversidade foram baixos. No entanto, como M. peruiferum

apresenta um histórico de exploração madeireira, a densidade populacional foi reduzida, então

41

os viveiros coletam sementes das árvores que encontram nas matas ou em áreas urbanas.

Macedo (1993) comenta a dificuldade em se coletar sementes de espécies nativas, sendo

comumente obtidas de poucas árvores e em áreas urbanas, levando a problemas genéticos, que

podem afetar o sucesso da futura plantação. A coleta de espécies nativas com baixa densidade

populacional é bastante onerosa e não há retribuição financeira do mercado para mudas com

maior diversidade genética.

Cada viveiro representa um grupo genético distinto, provavelmente devido aos

diferentes locais de coleta de sementes, sendo a troca de sementes entre os viveiros uma boa

alternativa para incrementar a diversidade genética das mudas que poderão ser utilizadas em

projetos de restauração. A troca mútua de sementes entre viveiros pode aumentar a

diversidade genética nos seus estoques de mudas (BRANCALION et al., 2012). Compor uma

população inicial com alta diversidade genética pode evitar o efeito fundador, possibilitando a

viabilidade da restauração ao longo prazo, pois a população fundadora poderia ter um

tamanho efetivo populacional adequando para representar a variabilidade genética da

população ao longo do tempo. Contudo, é importante ressaltar neste ponto que devido à

diferenciação genética alta entre os viveiros pode ocorrer depressão por exogamia, que resulta

na perda do fitness em virtude da dissimilaridade genética (EDMANDS, 2007). Desta forma,

deve-se ter o cuidado com a origem das sementes que serão trocadas.

Recomendações específicas na coleta de sementes de espécies arbóreas ameaçadas

da Mata Atlântica são importantes para apoiar programas de restauração em larga-escala

como o Pacto pela Restauração da Mata Atlântica, uma coalizão com mais de 250 instituições

trabalhando para a restauração de 15 milhões de hectares deste bioma até 2050 (MELO et al.,

2013). Desta forma, podendo haver uma melhor integração da genética da conservação com

os programas de restauração, com o intuito de aproveitar os crescentes investimentos globais

na restauração de ecossistemas (MENZ et al., 2013) para suportar o restabelecimento de

populações com potencial genético para sua conservação a longo prazo.

42



Resumo

Devido à fragmentação da paisagem, populações naturais têm declinado e tornando-se

pequenas e isoladas. Como consequência, tais populações experimentam uma redução da

diversidade genética que é importante para a conservação e manutenção das populações ao

longo do tempo. A restauração florestal apresenta-se como medida para mitigar os efeitos da

fragmentação e vem recebendo bastante interesse nos últimos anos. No entanto, informações

sobre a diversidade genética são escassas nos projetos de restauração, assim o objetivo central

do trabalho é comparar os níveis de diversidade genética em projetos de restauração com

áreas naturais. Foram amostrados indivíduos jovens e adultos de M. peruiferum em quatro

populações contrastantes da Mata Atlântica (duas naturais e duas restauradas). Para a

comparação da diversidade genética foram utilizados marcadores microssatélites e SNPs. Os

valores dos parâmetros de diversidade genética para ambos os marcadores foram menores, por

exemplo, em relação à riqueza alélica os microssatélites variaram de 2,26 a 3,90 e os SNPs de

1,22 a 1,72, do que esperado para espécies arbóreas tropicais e não houve diferença

significativa entre as áreas naturais e restauradas indicando que os níveis de diversidade

genética nas áreas restauradas são similares aos encontrados nas áreas naturais. Foram

identificados locos candidatos à seleção (locos outliers). A análise dos locos outliers mostrou

estruturação genética distinta entre as áreas podendo indicar áreas com conjuntos gênicos

únicos e interessantes para conservação. Os resultados observados neste trabalho poderão

contribuir em programas de restauração e conservação, auxiliando pesquisadores e gestores

sobre o sucesso dos protocolos de restauração e condução de futuros projetos de restauração e

conservação.

Palavras-chave: endogamia; genética da conservação; locos outliers; microssatélite; SNPs

43

2.1 Introdução

Nos últimos 50 anos, o desmatamento levou a mudanças substanciais na

composição, estrutura e funcionamento das florestas tropicais (GHAZOUL e MCLEISH,

2001; PUTZ et al., 2001) devido ao aumento das fronteiras agrícolas e urbanização. A

considerável perda de habitat e fragmentação das florestas tropicais representa grande ameaça

para a conservação de populações naturais de espécies nativas (SAUNDERS et al., 1991;

FAHRIG, 2003). A fragmentação causa consequências genéticas negativas para as populações

remanescentes (AGUILAR et al., 2008), pois pode diminuir a diversidade genética neutra e

adaptativa das populações devido ao decréscimo do tamanho efetivo populacional e da

conectividade inter-populacional (JOHANSSON et al., 2007). Estes processos por

consequência podem levar a deriva genética, endogamia, baixo potencial evolutivo,

culminando em um alto risco de extinção (SACCHERI et al., 1998; REED e FRANKHAM,

2003). Uma alternativa para a redução dos efeitos negativos da fragmentação seria a

manutenção da conectividade das populações por meio de corredores ecológicos

(SAUNDERS et al., 1991). A conservação dos fragmentos remanescentes e a conectividade

de habitats através da restauração florestal representam uma forte estratégia para mitigar a

perda da biodiversidade (POSSINGHAM et al., 2015). Assim, conhecer o sucesso da

restauração é importante para o planejamento de futuras políticas públicas, para o manejo

dessas áreas e para a conservação da biodiversidade. São crescentes os esforços para a

restauração florestal em todo mundo como parte de estratégias para os problemas ambientais

atuais como, mudança climática e desertificação (THOMAS et al., 2014). No Brasil, não é

diferente, com o Pacto pela Restauração da Mata Atlântica, que visa à restauração de 15

milhões de hectares até 2050 (MELO et al., 2013).

A restauração em larga escala é importante em biomas nos quais as funções

ecossistêmicas foram comprometidas e grande parte na biodiversidade nativa está em risco de

extinção (MEA, 2005). Este é o caso da Mata Atlântica brasileira, considerada

de biodiversidade global (MYERS et al., 2000), que se encontra altamente fragmentada com

apenas 15% restantes da sua cobertura original (SOS MATA ATLÂNTICA/INPE, 2015). A

restauração tem como objetivo o restabelecimento dos processos ecológicos em conjunto com

a prestação de serviços ecossistêmicos vitais (ALEXANDER et al., 2011a). De acordo com o

SER (2004) a restauração ecológica usa o conhecimento do funcionamento, composição e

estrutura de ecossistema pré-existente para propiciar a recuperação de um ecossistema que foi

degradado, danificado ou destruído. A restauração tem que ser guiada por uma visão geral dos

sistemas políticos e socioeconômicos, buscando uma ligação e cooperação entre a

44

recuperação dos ecossistemas nativos, proteção e manutenção da biodiversidade nativa, uso

sustentável dos recursos e entrega de bens e serviços ecossistêmicos para a sociedade

(ARONSON et al., 2007; WRIGHT et al., 2009). Contudo, deve-se considerar o papel da

genética para a resiliência das áreas em processo de restauração florestal. Segundo Mijangos

et al. (2015), a genética pode fornecer informações essenciais para o processo de tomada de

decisão e monitoramento de projetos de restauração. Um parâmetro importante e que

atualmente vem sendo considerado nos projetos de restauração é a diversidade genética

(RODRIGUES et al., 2009b).

A diversidade genética está relacionada com o fitness das populações (REED e

FRANKHAM, 2003), e também pode afetar o funcionamento e resiliência dos ecossistemas

(MADRITCH e HUNTER, 2002; KETTENRING et al., 2014). A diversidade genética de

espécies arbóreas é uma componente chave no funcionamento dos ecossistemas florestais

(RATNAM et al., 2014), pois pode afetar a diversidade de espécies em comunidades

associadas (VELLEND e GEBER, 2005; WHITHAM et al., 2006). É através da variação

genética que os organismos podem responder às possíveis mudanças ambientais, garantindo

sua sobrevivência através da sua capacidade de adaptação e reprodução ao longo do tempo

(KOSKELA e AMARAL, 2002; NAMKOONG et al., 2002; BARRETT e SCHLUTER,

2008; WAN et al., 2014). Ao se utilizar nas restaurações florestais indivíduos ou propágulos

geneticamente diversos, as populações restauradas poderão ter o potencial de populações

naturais (BASEY et al., 2015). No entanto, a seleção dessas fontes de propágulos para a

implantação em projetos de restauração se baseia apenas na localização e disponibilidade do

material de origem não levando em consideração os níveis e distribuição da variação genética

das populações fontes potenciais (RAMP et al., 2006).

Comparar a variabilidade genética das populações introduzidas nos plantios de

restauração com populações de referência é uma estratégia interessante para assegurar que as

populações restauradas estão mantendo níveis de diversidade genética similares aos presentes

em populações de referência (RAMP et al., 2006). O uso de ferramentas moleculares é

essencial para a determinação de parâmetros genéticos. Os marcadores moleculares

microssatélites, por exemplo, são bastante utilizados nas análises de genética de populações,

como estrutura populacional, endogamia, parentesco (GUICHOUX et al., 2011). Além destes

marcadores, os SNPs (Single nucleotide polymorphisms) que são amplamente dispersos por

todo genoma mesmo em espécies não modelo (WANG et al., 1998 ), vêm

se tornando os marcadores moleculares genéticos mais populares no estudo de plantas (LIU et

al., 2015). Devido à rapidez com que eles podem ser genotipados em um grande número de

45

amostras, estão sendo preferíveis em relação aos microssatélites que são mais trabalhosos

(GUICHOUX et al., 2011). Esses marcadores também podem responder algumas questões

não resolvidas pelos marcadores microssatélite como, por exemplo, questões sobre adaptação

local (OUBORG et al., 2010). As informações geradas neste trabalho serão úteis para planos

de manejo e futuras políticas públicas para restauração florestal e conservação de Myroxylon

peruiferum.

Myroxylon peruiferum L.f (Fabaceae), popularmente conhecida como balsámo ou

Cabreúva, é uma espécie clímax com ampla distribuição na Mata Atlântica. É polinizada por

abelhas e aves (YAMAMOTO, 2001; YAMAMOTO et al., 2007) e possui síndrome de

dispersão pelo vento. Possui madeira altamente resistente que é usada na construção civil e é

utilizada na perfumaria e armazenamento de cachaça (LORENZI, 1992; FIGLIOLIA et al.,

2006; CATÃO et al., 2011). A espécie também possui potencial fitoterápico frente à

microrganismos (OHSAKI et al., 1999; GONÇALVES et al., 2005; CARVALHO et al.,

2008). O presente trabalho teve como objetivo estimar parâmetros de diversidade, estrutura

genética e endogamia para M. peruiferum em quatro áreas contrastantes (duas áreas de

remanescente florestal e duas áreas em processo de restauração) utilizando dois tipos de

marcadores moleculares (microssatélites e SNPs). Foram abordadas as seguintes questões: a)

A diversidade genética é menor nas áreas em processo de restauração que nos remanescentes

naturais estudados? b) Como as populações estão estruturadas? c) Existem locos

potencialmente relacionados à seleção nas populações? d) Existe correlação entre os

parâmetros genéticos estudados com os diferentes tipos de marcadores?

2.2 Material e Métodos

Áreas de estudo

As coletas foram realizadas em duas áreas de remanescente natural de Mata

Atlântica e duas áreas em processo de restauração (Figura 2.1).

Área de Relevante Interesse Ecológico Mata Santa Genebra (A.R.I.E. Santa

Genebra), localizada no município de Campinas, São Paulo, com 251,77 ha é considerada a

segunda maior floresta urbana do Brasil. A altitude média é de 670 m e a temperatura média

anual de 21,6 ºC (FJPO - Fundação José Pedro de Oliveira, 2010). Possui um entorno

diversificado, com cultivos agrícolas, bairros residenciais e duas rodovias de fluxo intenso

que tangenciam a mata (SP 332 e SP 138-146). A Mata de Santa Genebra é considerada uma

Floresta Estacional Semidecidual, e devido ao seu isolamento e histórico de perturbações

antrópicas, como incêndios, ela representa um exemplo de floresta natural degradada.

46

Estação Ecológica dos Caetetus (E.E. Caetetus), Floresta Estacional

Semidecidual com área de 2.176,10 ha, é uma Unidade de Conservação administrada pelo

Instituto Florestal, órgão da Secretaria de Meio Ambiente do Estado de São Paulo. Está

localizada entre os municípios de Gália e Alvinlândia, Região Centro-Oeste do Estado de São

Paulo. A temperatura média anual gira em torno de 22ºC, altitude média de 530 m e apresenta

pluviosidade média anual em torno de 1.480 mm (DURIGAN et al., 2000). É um dos últimos

remanescentes significativos de Floresta Estacional Semidecidual no planalto ocidental do

Estado de São Paulo (IBGE, 1992), possuindo melhor estado de conservação, representando

assim o melhor referencial possível de uma área não antropizada. Em sua área pode-se

encontrar várias espécies ameaçadas de extinção, como por exemplo, a peroba-rosa

(Aspidosperma polyneuron) e o mico-leão-preto (Leonthopithecus chrysopygus), entre outras.

Área de Cosmópolis, área em processo de restauração florestal, localizada no

município de Cosmópolis, São Paulo, nas dependências da Usina Ester (22º 39' Sul e 47º 12'

Oeste). É um trecho de mata ciliar, situado na Bacia Hidrográfica do Rio Jaguari. O processo

de restauração teve início em 1955 a 1960 (NOGUEIRA, 1977), a partir de um projeto de

reflorestamento para substituir um pasto ralo à margem direita do rio Jaguari. Possui 25 ha,

onde foram plantadas 71 espécies arbóreas (50 nativas e 21 exóticas) sem critérios

sucessionais. As mudas utilizadas nessa restauração foram provenientes do parque da Escola

ESALQ), que por sua vez também é uma

restauração florestal. Atualmente, a composição vegetativa da área alcança 30 metros de

altura e apresenta um sub-bosque denso, onde ocorre regeneração natural.

Área de Iracemápolis, área em processo de restauração florestal, localizada no

município de Iracemápolis, São Paulo, às margens do Ribeirão Cachoeirinha. Essa área foi

restaurada a partir de 1988 a 1990 (RODRIGUES et al., 1992) com o intuito de recuperar o

entorno do reservatório municipal de Iracemápolis. Possui área de aproximadamente 50 ha e

seu entorno é ocupado por plantação agrícola. As mudas utilizadas na restauração vieram de

dois viveiros de mudas (Cesp-Paraibuna e da Unicamp). A área possui alta diversidade de

espécies (140 espécies na maioria nativa, mas com algumas exóticas) e atualmente, possui

dossel com cerca de 20 m de altura e sub-bosque pouco denso.

A fim de facilitar a discussão dos resultados serão atribuídas abreviaturas para

cada área. A.R.I.E. Santa Genebra (fragmentada - FRAG), Estação Ecológica dos Caetetus

(referencial - REF), Cosmópolis (restauração 1 REST 1) e Iracemápolis (restauração 2

REST 2).

47

Figura 2.1: Mapa das quatro áreas de estudo de Mata Atlântica no estado de São Paulo, Brasil.

REF área de referencia, FRAG área fragmentada, REST 1 área em processo de

restauração 1 com 56 anos e REST 2 área em processo de restauração 2 com 26 anos.

Amostragem

Foram obtidas amostras foliares e de câmbio de indivíduos jovens (plântulas) e

adultos de M. peruiferum em cada área de estudo. Para as análises com

marcadores SSRs, foram utilizados 66 indivíduos em REF, 34 indivíduos em FRAG, 50

indivíduos em REST1 e 45 indivíduos em REST1. Para as análises com marcadores SNPs foi

considerado seis indivíduos em REF, FRAG e REST2 e cinco indivíduos em REST1. Todos

os indivíduos foram georreferenciados.

Extração de DNA e genotipagem SSRs

O DNA foi extraído de folha e câmbio segundo Doyle e Doyle (1990) com

algumas modificações (2% CTAB, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% PVP-40

(p/v), 1,42 M NaCl e 3% -mercaptoetanol (v/v)). Os genótipos de cada indivíduo foram

identificados utilizando oito marcadores microssatélites (SCHWARCZ et al., 2014). A

genotipagem foi realizada usando o sequenciador 4300 DNA Analyzer (Li-Cor, Lincoln,

EUA) e o tamanho dos fragmentos amplificados foram determinados usando 50-350bp

IRDyeR700 e 800 ladder (Li-Cor) e o programa SAGA (Li-Cor).

48

Construção de biblioteca genômica para a obtenção de SNPs

A biblioteca genômica para a obtenção dos marcadores SNPs foi construída

utilizando o protocolo de ddRAD (double-digest RADseq) de Peterson et al. (2012). Foram

utilizadas inicialmente duas enzimas de restrição (EcoRI e Mse1) para redução da

complexidade do genoma. As pontas coesivas foram ligadas a adaptadores específicos para

cada indivíduo (barcodes) e a outros específicos da plataforma Illumina. Em seguida, foram

realizadas duas etapas de PCR de enriquecimento, e os produtos de reação foram separados

em gel de agarose 2,5% (p/v), para a seleção de fragmentos entre 300 a 400 pb. Os

fragmentos foram removidos do gel por eletroeluição. A biblioteca foi validada com auxílio

do equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA,

USA) e por meio de real-time PCR (qPCR). O sequenciamento das amostras foi realizado na

plataforma Illumina Genome Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

Processamento e análise dos marcadores SNPs

As sequências de DNA provenientes do sequenciamento foram analisadas na

plataforma Stacks (CATCHEN et al., 2011), que contém uma série de programas para a

obtenção dos SNPs contidos nessas sequências (SNP calling). A primeira etapa para obtenção

do conjunto de dados de SNPs foi descartar sequências de adaptadores e sequências de baixa

qualidade ou com barcodes truncados, e a separação das sequências correspondentes a cada

um dos indivíduos, com base em seus respectivos barcodes, com o auxílio do programa

process_radtags.

Nas etapas seguintes foi construído um catálogo de marcadores SNPs a partir do

conjunto de sequências. O programa ustacks foi utilizado para a formação de pilhas de

sequências (stacks), seguido da remoção das pilhas de sequências repetitivas e da

identificação dos SNPs. O programa cstacks realizou a construção do catálogo de locos

consenso com base nos 23 indivíduos utilizados no sequenciamento. O programa sstacks foi

posteriormente utilizado para identificar as pilhas formadas pelo ustacks dentro do catálogo

consenso. Por fim, correções na identificação dos genótipos foram realizadas pelo programa

rxstacks.

Subsequentemente, filtragens no conjunto de dados inicial foram realizadas

visando obter SNPs de qualidade e informativos para estimar a diversidade genética e

estruturação populacional. Foi considerado como loco SNP o marcador que atendeu os

seguintes critérios: frequência alélica mínima igual ou superior a 5%, profundidade de

sequenciamento igual a cinco, presença do loco nas quatro populações, ausência de dados

perdidos no conjunto de dados final.

49

Análises estatísticas

Locos candidatos à seleção

Foi realizada pela identificação dos locos que geraram valores de FST outlier, a

partir da distribuição empírica de FST por meio de reamostragens, no programa LOSITAN

(ANTÃO et al., 2008). Os locos outliers foram considerados candidatos à seleção direcional

quando apresentaram p valor maior que 0,995 após correção FDR (False Discovery Rates), e

candidatos à seleção balanceadora quando apresentaram p valor menor que 0,005.


As análises de diversidade genética tanto para locos microssatélites como para

locos SNPs foram realizadas no programa R (R CORE TEAM, 2015), utilizando os pacotes

diveRsity (KEENAN et al., 2013) e PopGenKit (PAQUETTE, 2012), considerando cada

localidade como uma população. Os parâmetros estimados foram: riqueza alélica (AR),

heterozigosidades observada (HO) e esperada (HE), o índice de fixação (FIS), as estatísticas F

descritas por Weir e Cockerham (1984) e o FST par a par. Intervalos de confiança foram

obtidos por 1000 reamostragens boostraps.

Para os microssatélites, a estrutura genética populacional foi investigada com o

programa STRUCTURE v. 2.3.3 (PRITCHARD et al., 2000; FALUSH et al., 2003). Foram

realizadas dez simulações independentes feitas para cada valor de número de agrupamento K

(1 a 10). Em cada simulação, foram feitas 1.000.000 MCMC (Markov chain Monte Carlo)

com um descarte inicial (burn-in) de 500.000, o modelo escolhido foi admixture com

frequências alélicas correlacionadas. As simulações foram então feitas para o K mais provável

em relação aos propostos utilizando valores de EVANNO et al., 2005). A estrutura

genética populacional para os SNPs foi obtida pela análise exploratória multivariada DAPC

(Discriminant Analysis of Principal Components), com o auxílio do pacote adegenet

(JOMBART, 2008; JOMBART et al., 2010; JOMBART e AHMED, 2011).

2.3 Resultados

Obtenção de locos SNPs

O sequenciamento na plataforma Illumina resultou em 31.732.502 sequências

correspondentes a RAD-tags de boa qualidade, sendo que todos os indivíduos tiveram número

suficiente de sequências (média de 1.379.674 ± 206.491,892 E.P.M.) para serem considerados

nas análises posteriores. Após o tratamento das sequências, foram obtidos 8.408 SNPs

bialélicos, dos quais 6.994 foram marcadores candidatos a neutros, 1.013 foram marcadores

candidatos à seleção balanceadora e 401 foram marcadores candidatos à seleção direcional

(Figura 2.2).

50

Figura 2.2: Representação gráfica para a classificação dos locos SNPs (azul) em relação à

distribuição empírica do FST para as quatro áreas de estudo, sendo os locos presentes na região

vermelha candidate positive selection (candidatos à seleção direcional ou positiva), os locos

na região amarela candidate balancing selection (candidatos à seleção balanceadora) e os

locos presentes na região cinza candidate neutral (candidatos a neutros).

Diversidade genética e índice de fixação

Para os marcadores microssatélite, a riqueza alélica (AR) foi maior nos jovens que

nos adultos para todas as populações (Tabela 2.1). Não houve diferença significativa quando

comparamos apenas os adultos. No entanto, entre jovens, a riqueza alélica foi

significativamente maior na população REF que na FRAG. Os adultos da população REF

apresentaram maior heterozigosidade esperada que os da população REST 1. Os SNPs

candidatos a neutros demonstraram que a população de FRAG apresentou maior número de

alelos em relação às demais populações. O maior número de alelos privados foi encontrado na

população de REST 2. Não houve diferença significativa entre as populações quanto à riqueza

alélica (AR) e heterozigosidade esperada (HE) (Tabela 2.2). Já os SNPs outliers demonstraram

que a população de REF 2 apresentou maior número de alelos e de alelos privados em relação

às demais populações. Foi encontrado diferença significativa para a riqueza alélica (AR) entre

51

as populações de FRAG e REST 2. A população de FRAG apresentou menor

heterozigosidade esperada (HE) em relação às demais populações (Tabela 2.2). O índice de

fixação considerando todas as populações com a análise dos microssatélites foi de 0,1420.

Considerando os dois marcadores, não houve diferença significativa entre as populações em

relação ao índice de fixação.

Estrutura genética

A diferenciação genética (FST) entre as populações usando microssatélites foi

moderada (0,0864), indicando que a maior parte da variação é encontrada dentro das

populações. Com os SNPs, o FST entre as populações foi 0,1515, indicando uma diferenciação

genética moderada. Os valores de FST entre pares de populações de M. peruiferum com os

marcadores microssatélites mostraram que existe uma estruturação moderada e que as

populações de FRAG e REST 1 foram as menos diferenciadas entre si (Tabela 2.3). O FST

entre os pares de população com SNPs neutros, também indicou uma menor diferenciação

entre as populações de FRAG e REST 1 (Tabela 2.4).

Na análise da estruturação populacional com microssatélites, de acordo com estatística

ad hoc proposta por Evanno et al. (2005), o valor mais provável de K foi 4 (Figura 2.3a),

separando as quatro populações em quatro diferentes agrupamentos (Figura 2.3b). O segundo

valor mais provável para o K foi dois (Figura 2.3a), sendo a maioria dos indivíduos das

populações das áreas de restauração reunidos em um agrupamento e as populações de REF e

FRAG em outro agrupamento (Figura 2.3c). Em ambos os cenários se observou uma mistura

substancial entre as populações. Em relação à estruturação genômica das populações, com os

SNPs neutros, foram observados três grupos genéticos, sendo REF o grupo mais divergente

em comparação aos demais, seguido do grupo de REST 2. O grupo formado por FRAG e

REST 1 indica que estes estão próximos geneticamente (Figura 2.4a). Com os SNPs outliers

foi observado quatro grupos genéticos distintos, sendo REF o grupo mais divergente em

comparação aos demais (Figura 2.4b).

52


utilizando marcadores microssatélites ( = número de indivíduos amostrados, AR = riqueza


Hardy-Weinberg e FIS = índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança (IC).

Populações (95%IC) (95%IC) (95%IC) (95%IC)

REF

Adultos 15 2,94

(2,37-3,37)

0,592

(0,513-0,675)

0,570

(0,494-0,584)

-0,0337

(-0,1766-0,0924)

Jovens 51 3,90

(3,37-4,37)

0,432

(0,369-0,498)

0,488

(0,453-0,514)

0,1167

(0,0161-0,2195)

FRAG

Adultos 13 2,70

(2,25-3,12)

0,453

(0,380-0,531)

0,505

(0,420-0,535)

0,1352

(-0,0478-0,2944)

Jovens 21 3,10

(2,87-3,25)

0,389

(0,323-0,452)

0,546

(0,494-0,561)

0,2384

(0,0917-0,3691)

REST 1

Adultos 6 2,26

(1,87-2,50)

0,425

(0,297-0,567)

0,446

(0,310-0,464)

0,0384

(-0,3027-0,2839)

Jovens 44 3,55

(3,12-3,87)

0,397

(0,337-0,463)

0,495

(0,453-0,523)

0,1945

(0,1036-0,2835)

REST 2

Adultos 19 2,45

(2,00-3,00)

0,504

(0,459-0,553)

0,501

(0,435-0,545)

-0,0461

(-0,227-0,1094)

Jovens 26 3,40

(3,00-3,62)

0,562

(0,477-0,637)

0,547

(0,494-0,569)

0,0147

(-0,1202-0,1453)

53


utilizando marcadores SNP neutros e outliers seleção direcional ( = número de indivíduos

amostrados, A = número de diferentes alelos, P = número de alelos privados, AR = riqueza


Hardy-Weinberg e FIS= índice de fixação). Com 95% de intervalo de confiança (IC).

Populações n A P AR

(95% IC)

HO

(95% IC)

HE

(95% IC)

FIS

(95% IC)

REF 6

SNPs neutros 11929 203 1,61

(1,46-1,67)

0,229

(0,179-0,270)

0,249

(0,182-0,249)

0,082

(-0,139-0,259)

SNPs outliers 531 58 1,28

(1,20-1,31)

0,105

(0,079-0,130)

0,114

(0,088-0,114)

0,126

(0,097-0,254)

FRAG 6


(1,55-1,81)

0,297

(0,285-0,308)

0,288

(0,232-0,282)

-0,028

(-0,188-0,043)


(1,14-1,26)

0,075

(0,066-0,087)

0,079

(0,059-0,082)

0,104

(0,062-0,235)

REST 1 5


(1,47-1,71)

0,269

(0,217-0,308)

0,256

(0,188-0,256)

-0,052

(-0,283-0,079)


(1,26-1,35)

0,151

(0,107-0,202)

0,147

(0,101-0,147)

0,058

(0,009-0,162)

REST 2 6


(1,35-1,67)

0,253

(0,202-0,303)

0,242

(0,163-0,255)

-0,042

(-0,247-0,110)


(1,29-1,45)

0,173

(0,122-0,231)

0,193

(0,130-0,197)

0,159

(0,130-0,250)

54

Tabela 2.3: Resultado da estruturação par a par nas populações de M. peruiferum pelo

estimador FST utilizando marcadores microssatélites e SNPs neutros.

Marcadores Microssatélites

REST 2 REF FRAG

REST 1 0,0741* 0,0757* 0,0540*

REST 2 0,1006* 0,0764*

REF 0,0636*

Marcadores SNPs neutros

REST 2 REF FRAG

REST 1 0,1879* 0,1651* 0,0606*

REST 2 0,2358* 0,1342*

REF 0,1278*

*Significativo a 5%

55

Figura 2.3: Estruturação populacional para M. peruiferum em quatro populações de Mata

Atlântica com o uso de marcadores microssatélites. a) Representação gráfica dos valores de

acordo com Evanno et al. (2005) pelas

análises do programa STRUCTURE v.2.3.3 (Pritchard, et al. 2000; Falush et al. 2003); b)

Teste de atribuição realizado pela análise bayesiana das populações de M. peruiferum

estudadas em quatro agrupamentos; c) Teste de atribuição realizado pela análise bayesiana

das populações de M. peruiferum estudadas em dois agrupamentos. Os indivíduos amostrados

nas populações estão representados pelas barras verticais coloridas. A mesma cor em

diferentes populações indica que pertencem ao mesmo grupo. Cores diferentes na mesma

barra indicam a porcentagem do genoma compartilhado com cada grupo.

56

Figura 2.4: Gráfico de dispersão dos indivíduos (pontos) ao longo dos dois primeiros

componentes principais da DAPC, com a formação de grupos (elipses) para as quatro áreas

estudadas com o uso de marcadores SNPs. a) DAPC para SNPs neutros com retenção de 54%

da variação; b) DAPC para SNPs outliers com retenção de 80,9% da variação.

57

2.4 Discussão As estimativas de diversidade genética em todas as populações foram menores do

que é esperado para espécies arbóreas tropicais, pois estudos com espécies arbóreas da Mata

Atlântica mostram altos níveis de diversidade genética. Por exemplo, Carvalho et al. (2010)

estudando Copaifera langsdorffii em áreas fragmentadas, observaram heterozigosidade

esperada média de 0,879 para indivíduos adultos e 0,900 para jovens. Cruz Neto et al. (2014)

observaram heterozigosidade esperada média de 0,655 para uma área plantada e de 0,865 para

uma área natural para Inga vera. Carvalho et al. (2015) observaram para Euterpe edulis

heterozigosidade esperada variando de 0,716 a 0,864 e riqueza alélica variando de 6,2 a 9,2. A

baixa diversidade genética encontrada nas populações de M. peruiferum neste estudo,

provavelmente ocorreu devido à baixa densidade populacional e ao sistema reprodutivo da

espécie. Alguns estudos mostram que espécies com sistema reprodutivo misto tem baixa

diversidade genética (SUN et al., 1998; MOREIRA et al., 2011; BRESSAN et al., 2013;

TAMBARUSSI et al., 2015). M. peruiferum é bastante utilizada em projetos de restauração

florestal, para fins de conservação, e o conhecimento sobre sua diversidade torna-se

importante para planos de reintrodução da espécie em novas áreas. Os menores valores de

diversidade genética obtidos com os marcadores SNPs em comparação aos microssatélites é

devido à natureza bialélica dos marcadores SNPs, que apresentam menor variação intra loco

quando comparados aos microssatélites.

Considerando os marcadores microssatélites, foi encontrada entre os indivíduos

jovens, maior riqueza alélica na população REF em comparação a população FRAG e entre os

indivíduos adultos, uma alta heterozigosidade esperada na população REF em relação à

população REST 1. Esses resultados são esperados e consistentes com outros estudos que

mostram que populações em grandes áreas possuem maior diversidade genética em

comparação àquelas em pequenas áreas (FERNÁNDEZ-M e SORK, 2007; DIXO et al., 2009;

ROSAS et al., 2011; TAMBARUSSI et al., 2015). Populações pequenas têm baixa

diversidade genética, pois são mais suscetíveis a perda de alelos ao acaso devido a deriva

genética do que grandes populações (DITTBRENNER et al., 2005; ILVES et al., 2015). Os

SNPs outliers mostraram menor diversidade genética na população FRAG em relação às

demais. Farah (2009) encontrou para essa área, redução no número de indivíduos de M.

peruiferum entre 1983 e 2004. Essa redução provavelmente ocorreu devido ao histórico de

fragmentação e antropização que a área vem sofrendo ao longo dos anos. Vranckx et al.

(2011) realizaram um estudo de meta-análise com espécies lenhosas e os resultados

mostraram que a nível de população a diversidade genética é negativamente afetada pela

58

fragmentação. Johansson et al. (2007), observaram que os impactos da deriva genética em

relação a seleção natural são maiores em paisagens fragmentadas, onde as populações são

pequenas e apresentam redução na diversidade genética neutra e adaptativa, prejudicando o

futuro potencial adaptativo da população.

A diferenciação genética com os marcadores microssatélites foi moderada entre

todas as populações sugerindo uma mistura substancial entre as populações, provavelmente

devido aos atributos ecológicos e a história de vida da espécie (DUMINIL et al., 2007). Com

os marcadores SNPs a diferenciação genética foi alta. Tem sido sugerido que o FST é

dependente das frequências alélicas, sendo encontrados valores maiores para os SNPs que são

bialélicos em relação aos microssatélites que são multialélicos (JAKOBSSON et al., 2013).

O índice de fixação para todas as populações utilizando os marcadores

microssatélites foi alto, esse excesso de homozigotos provavelmente é devido ao sistema

reprodutivo da espécie e a baixa densidade populacional de indivíduos reprodutivos ou

polinizadores. Populações exploradas como ocorreu com M. peruiferum devido à exploração

madeireira, apresentam baixa densidade de indivíduos reprodutivos que pode afetar seu

sistema reprodutivo e aumentar os níveis de endogamia (MILLAR et al., 2013; ARRUDA et

al., 2015). Outra causa potencial da elevada homozigosidade nas populações estudadas é a

fragmentação que pode influenciar negativamente as interações planta-polinizador resultando

no aumento de cruzamentos entre indivíduos aparentados e autofecundação (AGUILAR et al.,

2006; GIRÃO et al., 2007; KETTLE et al., 2007; LOBO et al., 2013).

A estruturação genética para as quatro populações de M. peruiferum mostrou

resultados diferentes quando utilizamos marcadores diferentes devido à natureza de cada

marcador e provavelmente ao tamanho amostral para cada marcador. Os microssatélites

demonstraram que as populações estão divididas em quatro agrupamentos com mistura

substancial, sendo as populações de REF e FRAG mais próximas entre si e as populações das

áreas restauradas mais próximas entre si. Com a análise dos SNPs, foi observado que a

população mais distante foi a REF e as populações de FRAG e REST 1 formaram um

agrupamento provavelmente devido as mudas plantadas na área REST 1 que foram

provenientes do parque da ESALQ/USP que por sua vez é uma área restaurada com mudas

provenientes da região de Campinas-SP onde se encontra a área FRAG, explicando assim a

formação desse agrupamento. Esse resultado foi corroborado pelo FST entre os pares de

populações usando microssatélites e SNPs. Com os SNPs outliers as populações formaram

quatro grupos distintos, podendo indicar áreas interessantes para conservação da espécie, já

59

que provavelmente cada população apresentou um conjunto gênico único, sendo fontes de

variabilidade genética.

Além das análises de diversidade e estruturação genética, os marcadores SNPs

também podem detectar sinais de seleção utilizando o FST outlier (LUIKART et al., 2003).

Foram observados tanto marcadores candidatos à seleção balanceadora quanto candidatos à

seleção direcional. A seleção balanceadora está relacionada a diferentes regimes de seleção

responsáveis pela manutenção do polimorfismo genético dentro de populações, como por

exemplo, a vantagem do heterozigoto, no qual muitos genes são polimórficos e estas variantes

são mantidas na população; a seleção dependente de frequência, na qual genótipos raros tem

vantagem adaptativa; e a heterogeneidade espacial e temporal do habitat, no qual diferentes

genótipos têm vantagens em diferentes ambientes; dentre outros (HEDRICK, 2007; DELPH e

KELLY, 2014). Já a seleção direcional causa importantes variações genéticas adaptativas, que

levam a um contínuo aumento da frequência e para a fixação ou perto da fixação de um alelo,

reduzindo a variabilidade na região genômica próximo a locos sobre seleção (HEDRICK,

2007). Esses locos são úteis para estudos posteriores que objetivam a identificação da

homologia destes locos SNPs a genes ou sequências de outras espécies com funções

conhecidas descritas em banco de dados de sequências que possam indicar associações com

regiões provavelmente relacionadas à adaptação local das populações.

Considerações para restauração florestal

Os resultados obtidos neste trabalho não indicaram diferenças significativas entre

as áreas naturais e as áreas restauradas. Outros trabalhos com espécies arbóreas da Mata

Atlântica (Piptadenia gonoacantha,, Casearia sylvestris e Centrolobium tomentosum) nas

mesmas áreas de estudo, também mostraram que as populações em áreas restauradas tiveram

valores de diversidade genética comparáveis as populações em áreas naturais em diferentes

estágios de conservação (ZUCCHI et al. in prep). Os projetos de restauração das áreas REST

1 e REST 2 foram capazes de recompor a diversidade genética da espécie aos níveis

encontrados nas áreas naturais, provavelmente pela formação de corredores auxiliando o fluxo

gênico ou pela alta diversidade genética das plantas fundadoras. Outros estudos demonstraram

a capacidade das restaurações em restabelecer a diversidade genética (SMULDERS et al.,

2008; RITCHIE e KRAUSS, 2012).

Informações sobre o impacto da restauração florestal para restabelecer a

diversidade genética para grande parte das espécies da Mata Atlântica são escassas

(RODRIGUES et al., 2009b) e com o crescente interesse na recuperação de ecossistemas

degradados (ARONSON e ALEXANDER, 2013), os resultados obtidos nesse trabalho podem

60

auxiliar na tomada de decisão para futuras políticas públicas na restauração de áreas

degradadas. Os resultados de quantidade e estrutura da variação genética na população

referência ou fonte e na população restaurada fornecem aos pesquisadores e gestores

informações importantes sobre o sucesso dos protocolos de restauração, além de prover

embasamento para futuras pesquisas e gestão (RAMP et al., 2006). A genômica populacional

também pode ser uma ótima ferramenta para reconhecer áreas prioritárias para conservação

visto que através dos SNPs outliers pode-se ter uma visão mais acurada sobre populações com

conjuntos gênicos diferentes que podem ser fonte de variabilidade, desta maneira, relevantes

para a sobrevivência da espécie ao longo do tempo.

61

CONCLUSÕES GERAIS

A espécie M. peruiferum apresenta sistema reprodutivo misto com cruzamentos

preferenciais e evidências de endogamia biparental. No entanto, o sistema reprodutivo

pode variar de população para população e temporalmente, ou seja, em anos

diferentes. Para uma medida mais acurada da estimativa do sistema reprodutivo da

espécie M. peruiferum, seria interessante a avaliação desta estimativa em diferentes

populações.

Com base na coancestria e tamanho efetivo, pode-se estimar o número de árvores

matrizes para a coleta de sementes para projetos de conservação e restauração

florestal. É indicada a coleta de pelo menos 47 árvores matrizes quando consideramos

um tamanho efetivo populacional de 100 que tolera a perda de até 10% do fitness.

A diversidade genética das mudas de M. peruiferum nos viveiros amostrados foi baixa,

evidenciando a importância da troca de sementes entre viveiros comerciais a fim de

incrementar a diversidade genética da população inicial na área restaurada. No

entanto, deve-se considerar a região de coleta das sementes que serão permutadas para

evitar a depressão por exogamia.

As estimativas de diversidade genética foram baixas para a espécie M. peruiferum nas

populações analisadas, necessitando-se a conservação da espécie através da

manutenção dos fragmentos remanescentes e a recuperação de áreas degradadas.

Não houve diferenças significativas nos parâmetros de diversidade genética e índice

de fixação entre áreas de remanescente natural e áreas restauradas, evidenciando a

eficácia das restaurações estudadas em restabelecer a diversidade genética nas áreas.

No entanto, não se conhece o tamanho efetivo populacional de cada área, assim

entender esse parâmetro pode auxiliar programas de restauração e conservação a

compreender se a espécie de estudo se manterá a médio e longo prazo.

62

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84

ANEXOS

1. Artigo publicado

Sujii PS, Silvestre E de A, Grando C, Viana JPG, Siqueira MVBM, Salazar VLP, Zucchi MI. DNA e Meio ambiente, um vídeo que ilustra como a genética pode ajudar na conservação da biodiversidade. Genética na Escola.

87

2. Artigo submetido Zucchi MI, Sujii PS, Mori GM, et al. Restoring genetic diversity in a threatened ecosystem.

Restoring genetic diversity in a threatened ecosystem Maria Imaculada Zucchi1, Patricia Sanae Sujii2, Gustavo Maruyama Mori1, João Paulo Gomes Viana2, Carolina Grando2, Ellida de Aguiar Silvestre2, Kaiser Dias Schwarcz2, Camila Menezes Macrini1, Miklos Maxiliano Bajay3, Fabiano Lucas Araújo4, Marcos Vinícius Bohrer Monteiro Siqueira1, Alessandro Alves Pereira3, Anete Pereira de Souza5, José Baldin Pinheiro3, Ricardo Ribeiro Rodrigues6, Pedro H. S. Brancalion7 1 Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Polo Regional de Desenvolvimento Tecnológico do Centro Sul. Rodovia SP 127, km 30, 13400-970. Piracicaba, SP - Brasil 2 Department of Genetics, Evolution and Bioagents, Institute of Biology, State University of Campinas. Av. Cândido Rondon 400, Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-875, Campinas, SP, Brazil 3 Department of Genetics, “Luiz de Queiroz” College of Agriculture, University of São Paulo, Av. Pádua Dias, 11, Piracicaba, SP, 13400-970, Brazil 4 Agronomic Institute of Campinas, Av. Barão de Itapura, 1481, 13020-902, Campinas, SP, Brazil 5 Department of Plant Biology, Institute of Biology, State University of Campinas. Av. Cândido Rondon 400, Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-875, Campinas, SP, Brazil 6 Department of Biological Sciences, “Luiz de Queiroz” College of Agriculture, University of São Paulo, Av. Pádua Dias, 11, Piracicaba, SP, 13400-970, Brazil 7 Department of Forest Sciences, “Luiz de Queiroz” College of Agriculture, University of São Paulo, Av. Pádua Dias, 11, Piracicaba, SP, 13400-970, Brazil Running title: genetic diversity in restoration Abstract

New international commitments foster large-scale restoration projects. The long-term

ecological success of these emergent projects will rely on the genetic diversity of reintroduced

or colonizing species, which is a limiting factor in highly-fragmented landscapes. Despite the

paramount role of genetic diversity for species persistence, the effectiveness of genetic

diversity recovery in restoration programs is poorly known. By assessing the genetic diversity

of four model tree species in restored and conserved sites in the Atlantic Forest of Brazil, we

found that restoration areas show similar levels of neutral genetic diversity and inbreeding to

those observed in natural forest remnants. Based on these findings, we advocate the use of

high levels of genetic diversity in restoration in order to support biodiversity conservation in

human-modified landscapes. We demonstrate how ecological restoration can be a powerful

tool for not only supporting the conservation of ecosystems and species, as well documented

in the literature, but also genetic diversity – the basic constituent of biodiversity.

88

Introduction

Recent international commitments have paved the way for the implementation of large-scale

ecological restoration programs in the upcoming decades (Latawiec et al. 2015). The success

of such programs will rely on the increase of ecological integrity and long term sustainability

of restoration (Suding et al. 2015). One of the key aspects underlying ecological integrity and

sustainability is genetic diversity, which influences the chances of reintroduced or naturally

colonizing populations persisting in restored sites without further human assistance (Mijangos

et al. 2015). However, the role of genetic diversity in restoration processes represents a

knowledge gap for the effective implementation of restoration programs.

Threatened ecosystems, where severe habitat loss and fragmentation increase the risk

of extinction after habitat change, require special attention to genetic issues (Kuussaari et al.

2009). Following drastic reductions in population size and gene flow, some species may go

extinct due to increased genetic load, i.e. accumulation of deleterious recessive alleles;

reduced fecundity, and hindered adaptability as a result of genetic drift and inbreeding

(Young et al. 1996, Aguilar et al. 2008). Consequently, protecting existing fragments,

increasing habitat cover, and reconnecting habitat patches through restoration interventions

represent a major strategy for mitigating loss of biodiversity (Possingham et al. 2015).

Threatened ecosystems are also dominated by second-growth remnants. In the case of

tropical forests, over 70% of their global cover is constituted by naturally regenerated

fragments (FAO 2010). Tree populations in second-growth tropical forests can initially have

low levels of genetic diversity reflecting a strong founder effect, and shift towards

geneticallyrich populations in the mid- and long-term due to gene flow at the landscape level

(Sezen et al. 2005, 2007). This gene flow between remaining and restored patches may be

compromised in threatened ecosystems due to reduced habitat cover and severe

fragmentation. This scenario enhances the need for restoration projects aimed at planting

populations with higher levels of genetic diversity, in order to ensure some level of

autonomous viability among the restored populations, until gene flow is restored.

Consequently, the implementation of restoration projects that use an initial pool of

individuals representing high levels of genetic diversity can help achieve both ecological

sustainability for restored patches and provide a source of alleles and genes for remaining

populations. In spite of its strategic importance for conserving biodiversity in threatened

ecosystems, ecological restoration has been mostly recognized and supported by society

because of its role for improving ecosystem services (Palmer & Filoso 2009). For instance,

86% of restoration projects implemented in Colombia focused in watershed services (Murcia

89

et al. 2015), a trend also observed in other restoration projects in Latin America (Brancalion et

al. 2014). Fostered by society awareness, restoration policies have been focused in

reestablishing ecosystem functions in degraded areas with importance for soil and water

protection. Overall, 60% of studies included in a review about restoration success were

implemented to comply with environmental laws with clear links with ecosystem services

provisioning, like the Clean Water Act in USA (Ruiz-Jaen & Aide 2005).

Payments for ecosystem services (PES) schemes reinforced this trend. A review about

PES in the Brazilian Atlantic Forest indicated that only 5 out of 79 projects focused on

biodiversity conservation, while carbon stocking and watershed protection were the main

targets (Guedes & Seehusen 2011). While a growing body of empirical and scientific

evidence has supported the role of restoration for recovery of ecosystem services, the same

cannot be said about its ability to reestablish similar composition levels to reference

ecosystems (Rey Benayas et al. 2009; Bullock et al. 2011; Suganuma & Durigan 2014). When

genetic diversity is considered, the knowledge gap is even bigger, which limits science-policy

interface for the inclusion of genetic concerns as part of the strategic plan for the

implementation of global restoration commitments in the coming decades.

In the Brazilian Atlantic Forest, one of the top five global biodiversity hotspots, the

predominance of landscapes with less than 10% habitat cover illustrates the need to upscale

restoration programs to safeguard biodiversity (Banks-Leite et al. 2014). Restoration projects

aimed at high levels of species diversity have been implemented in the last two decades in this

biome (Rodrigues et al. 2011), but with little attention to the genetic diversity of reintroduced

species. The same is true for the restoration of other species-rich ecosystems worldwide, in

which restoration practitioners are still struggling to address taxonomic and functional

diversity, with concerns over genetic diversity remaining a relatively minor issue.

We assessed the genetic diversity of four tree species in old restoration plantations and

conserved forest remnants. We tested the following hypotheses for four functionally different

species to evaluate the potential for restoration projects to provide sources of alleles among

fragments through gene flow: (i) there is substantial genetic differentiation among study

populations due to the approach adopted by early restoration projects and the geographic

distance between natural areas; (ii) restored populations have lower genetic diversity and

higher inbreeding levels than populations from natural forest remnants.

Methods

Study sites

90

We studied four areas within the Brazilian Atlantic Forest, in the state of São Paulo: two areas

undergoing restoration and two natural remnants (Figure 1). All fragments selected for this

study lie in the seasonal semideciduous forest domain, within the Atlantic forest complex,

with Cwa Köppen climate classification.

Figure 1. Description of studied sites and species in the Atlantic Forest region of São Paulo

state, Brazil.

91

Both restoration sites were established in riparian buffers previously occupied by

sugarcane plantations in the Iracemápolis (Rest.1) and Cosmópolis (Rest.2) municipalities.

The restoration approach for these areas has been based on establishing high species-diversity

(see details in Garcia et al. 2014), and the landscape matrix in which they occur is dominated

by sugarcane plantations, which has very low native forest cover remaining (5.6% for

Iracemápolis and 10.5% for Cosmópolis municipalities).

The natural remnants were selected to represent a large conserved ecosystem and a

fragmented, disturbed forest patch, in order to contrast the genetic status of populations in

conserved areas with those in remnants subject to strong fragmentation, which predominately

comprise the Atlantic Forest region (Ribeiro et al. 2009). Caetetus Ecological Station (Cons.)

served as the reference ecosystem, as it is a well-preserved and large forest patch (2170 ha),

surrounded byagricultural areas and pastures (Durigan et al. 2000). The Municipal reserve of

Santa Genebra Forest (Frag.) represented the disturbed forest and is the largest urban,

semideciduous, seasonal forest fragment in São Paulo State (252 ha). In contrast to the Cons.,

Frag. has been compromised by human-mediated disturbances (Farah et al. 2014).

Study species

We studied the tree species Casearia sylvestris (Salicaceae), Centrolobium

tomentosum (Fabaceae), Myroxylum peruiferum (Fabaceae) and Piptadenia gonoachanta

(Fabaceae), which represent different ecological, pollination, and seed dispersal groups

(Figure 1). They were also selected because there were a sufficient number of adult

individuals in each site for genetic diversity analysis and spontaneously regenerating

seedlings in the understory of plantations for further studies on gene flow. These species were

initially planted in Rest.1 using nursery grown seedlings produced in the same farm where the

plantation was implemented, and in Rest.2 using seedlings produced in the forest nurseries of

the Botanical Institute of São Paulo and of the Department of Water and Electric Energy of

São Paulo State. Unfortunately, there is no information regarding the number of populations

and mother trees from which the seeds used to produce the seedlings were collected.

However, such pioneer restoration projects were known to focus in taxonomic plant diversity,

without concerns about genetic diversity (Rodrigues et al. 2009).

Sampling

We sampled a total of 468 adult individuals across the four species in all sites (with an

average of 31.2 individuals, min = 14, max = 50, for each species and sampling locality).

Whenever it was possible, we sampled adult trees present in the original planting lines of

92

restoration sites in order to better include planted individuals in our samples. We collected

leaves or a disc of vascular cambium from each tree for DNA extraction.

Molecular markers and genotyping

We quantified the genetic diversity of the four selected species using previously

developed microsatellite markers. Seven loci were genotyped for C. tomentosum (Sujii et al.

2015), eight for M. peruiferum (Schwarcz et al. 2014), eight for P. gonoachanta (Grando et al.

2015) and eight for C. sylvestris (Cavallari et al. 2008). Genetic markers were enriched using

the Polymerase Chain Reaction (PCR) following the amplification conditions described in the

aforementioned studies. We genotyped amplified fragments on a Li-Cor 4300 DNA Analyzer

(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, USA) using the 50-350bp IRDye700 and 800 (Li-Cor)

ladder and identified alleles with the Saga v. 3.3 software (Li-Cor).

Genetic analyses

We examined genetic population structure using the multilocus clustering method

implemented in STRUCTURE 2.3.3 (Pricthard et al. 2000) under an admixture model with

correlated allele frequencies. We performed 50 independent Markov Chain Monte Carlo runs

for the number of clusters (K) ranging from one to 10 with 1×106 iterations following a burn-

in period of 5×105 iterations. The uppermost hierarchical level of genetic structure was

identified using K inferred with the ad hoc K statistic (Evanno et al. 2005), which best

explained the genetic data. We also quantified population subdivision by estimating FST

(proportion of the genetic variance between subpopulations relative to the total genetic

variance) using the R package diversity (Keenan et al. 2013). Confidence intervals were

obtained with 1,000 bootstrap replicates. We used expected (HE) and observed

heterozygosities (HO) and allelic richness (Ar) to estimate the genetic diversity of each

species in each sampling locality. We also estimated inbreeding coefficients (FIS) for the

populations within each sampling locality using the diveRsity (Keenan et al. 2013) and

PopGenKit (Paquette 2012) R (R Core Team 2015) packages. Confidence intervals were

obtained with 10,000 bootstrap replicates.

Results

The multilocus clustering analysis indicated that populations from natural remnant

forests were genetically differentiated as expected due to the large distance between them

(Figure 2). Populations from restoration areas were comprised of up to three distinct genetic

clusters, some of which were similar to natural remnant populations. Although we observed

genetic structure among populations within species, the exact pattern of differentiation was

not the same for all species. Each sample site for P. gonoacantha represented a genetically

93

unique population, with almost no admixture. Conversely, for C. tomentosum, we detected

only two distinct genetic groups, with one being present in all populations and the other in

one remnant and one restoration area. Populations of M. peruiferum and C. sylverstris were

composed of either two or three genetic groups, with substantial admixture.

Figure 2. Genetic structure of all species and populations determined by the multilocus

clustering method of STRUCTURE. Each column corresponds to a single individual and each

colour represents a particular genetic assignment.

Overall, allelic richness was slightly lower or did not differ between restoration areas

and natural remnants. Earlier successional species (C. sylvestris and P. gonochanta) showed

the largest reduction in allelic richness between restored and natural populations compared to

94

other species (Figure 3). In contrast, across all species the general pattern of estimated

expected heterozygosity under Hardy-Weinberg Equilibrium and inbreeding coefficients for

populations from restoration areas was not different from natural remnant populations (Figure

3).

Figure 3. Estimates of genetic diversity (Ar - allelic richness; and HE - expected

heterozygosity under Hardy-Weinberg Equilibrium) and of inbreeding coefficients (FIS) for

each species. Blue: populations from natural remnants; Red: populations from restoration

areas.

Discussion

Overall, we observed that populations in restoration sites had comparable levels of

genetic diversity to those in natural forest remnants and were not exposed to higher levels of

inbreeding depression. This pattern was consistent across all species, despite particularities

detected for eachtaxa. Such favourable results indicate that it is fairly possible to reestablish

high levels of genetic diversity when restoring degraded areas using seedling plantation and

direct seeding – the most commonly used restoration techniques described in the literature

(Ruiz-Jaen & Aide 2005), and that it may support the persistence of reintroduced populations

in the plant community by reducing the chances of genetic load even in the context of highly

fragmented landscapes.

The persistence in restoration sites of reintroduced tree species with ecological

importance for maintaining forest structure – like those included in this work – is one of the

95

aspects to be considered to meet the call made by ecologists to policy makers to consider long

term restoration sustainability as a planning principle (Suding et al. 2015). The healthy

regeneration of such species in the plant community can help preventing biomass collapse

even in the context of dispersal limitation, a common ecological barrier preventing the

recolonization of large-seeded, latesuccessional tree species in tropical forest restoration

projects (Reid et al. 2015). Ultimately, safeguarding the persistence of canopy tree species in

restoration sites can help maintaining some of the functions they mediate, like carbon

stocking and soil protection, with direct implications for ecosystem services. Establishing

populations with high levels of genetic variation can also be a strategy to face global climate

change.

Genetic variation in regions of the genome responsible for adaptation is required for

populations to evolve in response to environmental changes (Allendorf et al. 2013). Although

high genetic diversity in neutral regions of the genome does not guarantee adaptive potential,

there is a significant correlation between neutral levels of genetic diversity and population

fitness (Reed & Frankham 2003). Therefore, similar levels of genetic diversity in restored and

natural remnant forests indicate that the fitness of restored populations may be robust to

inbreeding. It is noteworthy that for this analysis we examined only adult individuals, which

in the restoration areas represent the initially-planted saplings and are not the result of

reproduction after restoration. These results are evidence that the seedlings used in restoration

plantations were not more inbred than the ones from well preserved natural remnants.

Although the long term maintenance of high levels of genetic diversity is uncertain, given the

evident limitations imposed by severe fragmentation, it was clear that restoration was not

depauperated in genetic diversity compared to reference sites, and this is a good beginning.

However, the higher reduction in allelic richness in early successional species sampled

in restoration sites suggests that some species may be more susceptible to bottleneck effects

and lose alleles at a faster rate than overall heterozygosity, which indicates that the challenge

of restoring genetic diversity can vary among species. The observed differences in genetic

structuring across species may be due to idiosyncratic ecological and historical species

characteristics such as demography, life history, evolutionary history and genomic

architecture (Duminil et al. 2007), as well as different seed sources used for each species.

Both allelic richness and genetic structuring can be manipulated in restoration projects due to

two main strategies, namely the establishment of restoration projects in portions of landscape

where gene flow is favoured and the selection of populations and mother trees to collect

seeds. This first strategy can be operationalized through the selection of restoration sites based

96

on landscape connectivity, using prioritization maps already available for the Atlantic Forest

(Tambosi et al. 2014). The second can be achieved through a welldesigned seed collection

program to increase genetic diversity of seed lots, which can include selecting populations

and mother trees and mixing seed lots obtaining from different sources to maximize genetic

diversity (Brancalion et al. 2012). Therefore, managing genetic diversity is not only important

but also viable in Atlantic Forest restoration and, potentially, elsewhere.

Establishing populations with high genetic diversity in restoration sites can be useful

for supporting the persistence of restored populations, as well as for conserving populations in

forest fragments, since these early restoration areas may be suitable nodes of forest

connectivity in the landscape matrix and be a source of new alleles for previously isolated

populations. Populations from restoration fragments can facilitate gene flow by acting as

stepping-stones for genetic material bound for surrounding forest fragments, which in turn

mitigates genetic drift in small restoration patches and in previously isolated tree populations

(Figure 4). Since some restoration areas may be gene sources in fragmented landscapes, they

could be used as key landscape components to support conservation genetics of species

threatened by fragmentation. This reinforces the importance of maintaining and creating

habitat patches for increasing landscape connectivity and consequent gene flow among

remaining and reintroduced populations (Possingham et al. 2015), adding value to recent

frameworks that propose prioritization of restoration sites to increase landscape connectivity

(Rappaport et al. 2015). Such restoration patches could also serve as germplasm conservation

sites to safeguard genetic diversity of vulnerable species, which might be particularly relevant

in drastically transformed environments (Breed et al. 2012) such as the Atlantic Forest.

98

Figure 4. Expected effects of restoring small forest fragments with high genetic diversity.

Conservation genetics research should go beyond describing the ongoing trend of

fragmentation-driven genetic impoverishment, and explore the new avenues offered by the

emergent field of restoration genetics. Ecological restoration can be a powerful tool for not

only supporting the conservation of ecosystems and species, as is well documented in the

scientific literature, but also genes – the basic constituents of biodiversity.

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