NORMA MEXICANA NMX-AA-167-SCFI-2017 ANÁLISIS DE AGUA ...

SINEC – 20170406122558167 ICS: 13.060.45

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NORMA MEXICANA

NMX-AA-167-SCFI-2017

ANÁLISIS DE AGUA - ENUMERACIÓN DE ORGANISMOS

PATÓGENOS: ENTEROCOCOS FECALES EN AGUAS

NATURALES, RESIDUALES, RESIDUALES TRATADAS,

SALINAS Y COSTERAS – MÉTODO DE PRUEBA.

ENUMERATION OF PATHOGENIC ORGANISMS: FECAL

ENTEROCOCCI IN NATURAL WATERS, WASTEWATERS,

TREATED WASTEWATERS, SALINE AND COASTAL - TEST

METHODS

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P R E F A C I O

En la elaboración de la presente norma mexicana participaron las siguientes empresas e

instituciones:

- ANÁLISIS DE AGUA, S.A. DE C.V. - ARVA, LABORATORIO DE ANÁLISIS INDUSTRIALES, S.A. DE C.V.

- ATLATEC, S.A. DE C.V.

- CENTRO NACIONAL DE METROLOGIA

- CESAR CLEMENTE ALVARADO GARCIA

- COMISIÓN DEL AGUA DEL ESTADO DE MÉXICO

- COMISIÓN NACIONAL DEL AGUA - CONTROL QUÍMICO NOVAMANN INTERNACIONAL, S.A. DE C.V.

- ECCACIV, S. A. DE C. V.

- ENTIDAD MEXICANA DE ACREDITACIÓN, A.C.

- HACH COMPANY

- IDECA, S.A. de C.V. - INDEX-LAB

- INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGÍA DEL AGUA

- INSTITUTO MEXICANO DEL PETRÓLEO

- INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGÍA Y CAMBIO CLIMÁTICO.

- LABORATORIO DE CALIDAD QUÍMICA VERACRUZANA, S.C. - LABORATORIO DE QUÍMICA DEL MEDIO E INDUSTRIAL, S.A. DE C.V.


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- LABORATORIO DE SERVICIOS CLÍNICOS Y ANÁLISIS TOXICOLÓGICOS S.A.

DE C.V.

- LABORATORIOS ABC QUÍMICA, INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS, S.A. DE C.V - MERCURY LAB, S.A. DE C.V.

- MÓNICA OROZCO MÁRQUEZ

- PEMEX PETROQUÍMICA COMPLEJO PETROQUÍMICO CANGREJERA

- PEMEX ETILENO COMPLEJO PETROQUÍMICO MORELOS

- PERKIN ELMER DE MEXICO, S.A.

- PROTECCIÓN AMBIENTAL Y ECOLOGÍA, S.A. DE C.V. - PROYECTOS Y ESTUDIOS SOBRE CONTAMINACIÓN INDUSTRIAL, S.A. DE

C.V.

- SERVICIOS DE AGUA Y DRENAJE DE MONTERREY, I.P.D. Laboratorio Central de Calidad de Aguas

- SISTEMA DE AGUAS DE LA CIUDAD DE MÉXICO DEL GOBIERNO DEL DISTRITO FEDERAL

- UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD AZCAPOTZALCO

División de Ciencias Básicas e Ingeniería Depto. de Ciencias Básicas

Área de Química - UNIVERSIDAD DEL NORESTE, A.C.

UNELAB - Centro multidisciplinario de servicios ambientales y de alimentos

- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Facultad de Química Instituto de Ingeniería


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ÍNDICE DEL CONTENIDO

0 Introducción 4

1 Objetivo y campo de aplicación 4

2 Referencias normativas 5

3 Términos y definiciones 5

4 Principio 5

5 Recolección, almacenamiento y preservación de muestras 6

6 Diluyentes y medios de cultivo 7

7 Equipo y materiales 11

8 Muestreo 11

9 Procedimientos 13

10 Expresión de resultados 15

11 Reporte de la prueba 16

12 Tablas 16

13 Manejo de residuos 23

14 Vigencia 23

15 Concordancia con normas internacionales 23

16 Bibliografía 24


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NORMA MEXICANA NMX-AA-167-SCFI-2017

ANÁLISIS DE AGUA - ENUMERACIÓN DE ORGANISMOS

PATÓGENOS: ENTEROCOCOS FECALES EN AGUAS NATURALES,

RESIDUALES, RESIDUALES TRATADAS, SALINAS Y COSTERAS –

MÉTODO DE PRUEBA.

ENUMERATION OF PATHOGENIC ORGANISMS: FECAL ENTEROCOCCI

IN NATURAL WATERS, WASTEWATERS, TREATED WASTEWATERS,

SALINE AND COASTAL - TEST METHODS

0 Introducción Enterococos es un género que incluye a las bacterias de estructura cocoide gram

positivos, catalasa negativos de origen intestinal.

Las bacterias de origen fecal del género de Enterococos son un indicador útil para medir la amplitud de la contaminación fecal reciente de las aguas naturales, salinas y costeras, así como la calidad del tratamiento del agua residual que puede destinarse a reúso.

Los estudios realizados en sitios de recreo de aguas naturales, salinas, costeras y dulces

indican que las gastroenteritis y otras infecciones están asociadas a aguas contaminadas con este tipo de bacterias e indican directamente la calidad del agua, siendo los Enterococos los mejores indicadores bacterianos de dicha calidad.

1 Objetivo y campo de aplicación

Esta norma mexicana específica tres métodos para la enumeración de Enterococos: a) método del número más probable (NMP) en tubos múltiples;

b) método de filtración por membrana; y

c) método del sustrato cromogénico.


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En aguas naturales, residuales, residuales tratadas, salinas y costeras, es de aplicación

nacional.

La técnica de filtrado por membrana no resulta recomendable en caso de agua muy turbia.

La técnica de sustrato cromogénico es una prueba enzimática rápida (requiere 24 h máximo), es aplicable a todo tipo de agua.

2 Referencias normativas

Para la correcta aplicación de esta norma mexicana se deben consultar las siguientes

normas mexicanas vigentes o las que las sustituyan:

2.1 NMX-AA-089/1-SCFI-2010 Protección al ambiente - Calidad del agua - Vocabulario - Parte 1. (Cancela a la NMX-AA-089/1-1986) Declaratoria de vigencia publicada en el Diario

Oficial de la Federación el 2011-03-03.

2.2 NMX-AA-089/2-SCFI-2010 Protección al ambiente - Calidad del agua - Vocabulario - Parte 2. (Cancela a la NMX-AA-089/2-1992) Declaratoria de vigencia publicada en el Diario

Oficial de la Federación el 2013-09-29.

3 Términos y definiciones

Para los propósitos de esta norma mexicana, aplican los términos y definiciones contenidos en: NMX-AA-089/1-SCFI-2010 y NMX-AA-089/2-SCFI-2010 (ver 2.1 y 2.2) y se establece la siguiente:

3.1

Genero enterococos Se denominan Enterococos aquellas bacterias de forma cocoide Gram positivas, aerobias o anaerobias facultativas, catalasa negativas, inmóviles, que no forman endoesporas o

cápsulas y capaces de fermentar la glucosa con producción de ácido de 36 °C ± 1 °C en un período máximo de 48 h.

Entre las características metabólicas que distinguen al género Enterococos se encuentra

la capacidad para crecer en presencia de 6,5 % de NaCl en agar de bilis esculina, y a 10 °C ± 0,5 °C en agar infusión cerebro corazón y 45 °C ± 0,5 °C en caldo infusión cerebro corazón. Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis.

4 Principio


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4.1 Método del número más probable (NMP)

Consiste en la inoculación de alícuotas de muestra, diluida o no diluida, en una serie de

tubos con medio líquido selectivo conteniendo glucosa como prueba presuntiva. Se examinan los tubos después de un periodo de incubación de 24 h ± 2 h a 35 °C ± 0,5 °C. Si la turbidez no se encuentra bien definida, reincubar nuevamente y tomar lectura a las

48 h ± 3 h.

Proceder a hacer subcultivos de cada tubo que muestre turbidez en agar selectivo incubado a 35 °C ± 0,5 °C por un periodo de 24 h ± 2 h y éstos a su vez en un medio líquido que contenga NaCl al 6,5 % incubados a 45 °C ± 0,5 °C por un período de tiempo

de 48 h ± 3 h. Mediante tabla estadística, obtener el NMP de organismos expresado como NMP/100 mL de la muestra, consultando la tabla 12.1 y 12.2 del capítulo 12.

4.2 Filtración por membrana

Consiste en filtrar la muestra a través de una membrana estéril que debe retener a los microorganismos. La membrana se deposita en una caja de Petri conteniendo un medio

de cultivo selectivo apropiado para una prueba presuntiva que se incuba por 44 h ± 4 h a 36 °C ± 2 °C. Las colonias sospechosas se confirman después de incubar en medio

selectivo a 44 °C ± 0,5 °C por 2 h. (Este método no es recomendable para aguas altamente turbias).

4.3 Método de sustrato cromogénico

El método emplea un sustrato cromogénico tal como el 4-metil-umbeliferil-β-D-glucóronido (MUG) u otro equivalente que emite fluorescencia cuando es hidrolizado por la enzima β-glucosidasa presente en las bacterias del género Enterococos, la fluorescencia

producida es detectada cuando el líquido es expuesto a la luz ultravioleta de longitud de onda a 366 nm.

Este método evita el uso de azida de sodio utilizada en los métodos tradicionales y sustenta una prueba positiva después de 24 h sin procedimientos adicionales.

5 Recolección, almacenamiento y preservación de muestras 5.1 Recolectar en frascos o bolsas estériles mínimo 250 mL de muestra. La toma

de muestra es en recipientes estériles sin tiosulfato de sodio.

5.2 Para su traslado las muestras deben de mantenerse a una temperatura de 4 °C ± 2 °C.

5.3 Conservar dentro del laboratorio en refrigeración a 4 °C ± 2 °C. Atemperar la muestra antes del análisis, sin exceder en todo el proceso las 24 h después


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de la recolección de la última muestra. Se puede analizar la muestra hasta 48 h después de su recolección conservándola a 2 °C ± 1 °C.

6 Diluyentes y medios de cultivo Se describen a continuación los diluyentes y medios de cultivo utilizados para los métodos

de NMP y filtración por membrana.

Usar ingredientes de calidad uniforme y sustancias químicas de grado analítico para la preparación de los medios de cultivo y reactivos, usar medios deshidratados o medios preparados comercialmente y seguir estrictamente las instrucciones del fabricante.

Para la preparación de medios, usar agua destilada o agua desionizada libre de sustancias

que puedan inhibir el crecimiento bacteriano bajo las condiciones de la prueba, con una conductividad ≤ 5 µs/cm.

6.1 Diluyentes

Cuando se requiera ajustar pH usar disoluciones de NaOH y/o HCl 1 mol/L.

Cuando se requieran diluciones de la muestra, usar uno de los siguientes diluyentes: 6.1.1 Disolución madre de fosfato monobásico de potasio (KH2PO4)

Disolver 34 g del fosfato monobásico de potasio en 500 mL de agua destilada. Ajustar el

pH entre 6,7 - 7,7 a 25 °C con una disolución de NaOH (1 mol/L) y completar a 1000 mL con agua destilada.

6.1.1.1 Disolución Buffer de fosfatos de trabajo

Adicionar 1,25 mL de disolución de fosfato a partir de la solución madre y 5,0 mL de disolución de cloruro de magnesio y disolver en 1000 mL de agua destilada. Distribuir en volúmenes de acuerdo a las diluciones a realizar y esterilizar en autoclave de 120 °C a

122 °C o una presión manométrica de 103 kPa durante 15 min. El pH final debe estar entre 6,9 y 7,1, a 25 °C mantener en refrigeración máximo por seis meses.

6.1.1.2 Disolución de cloruro de magnesio (MgCl2)

Disolver 38 g de cloruro de magnesio anhidro u 81 g de cloruro de magnesio hexahidratado en 1000 mL de agua destilada.

6.1.2 Diluyente de peptona al 0,1 %

Disolver 1 g de peptona en un litro de agua si es necesario aplicando calor, distribuir en

volúmenes de acuerdo a las diluciones a realizar y esterilizar en autoclave de 120 °C a


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122 °C o una presión manométrica de 103 kPa durante 15 min, el pH final debe ser de 7,0 ± 0,2 a 25 °C.

6.2 Medios de cultivo 6.2.1 Medios de cultivo para método de NMP

6.2.1.1. Caldo azida dextrosa:

a) extracto de carne 4,5 g;

b) triptona o polipeptona 15,0 g;

c) glucosa 7,5 g;

d) cloruro de sodio (NaCl) 7,5 g; y e) azida de sodio (NaN3) 0,2 g.

Disolver los ingredientes en 1 L de agua grado reactivo, calentar si es necesario,

adicionar la azida de sodio al final. Esterilizar en autoclave de 120 °C a 122 °C o una presión manométrica de 103 kPa durante 15 min, el pH final debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25 °C. Si se usan fórmulas deshidratadas se preparan de acuerdo a las indicaciones del

fabricante.

Distribuir en tubos con suficiente medio para cubrir el tubo Durham invertido y esterilizar de 120 °C a 122 °C o una presión manométrica de 103 kPa durante 15 min.

6.2.1.2. Agar azida bilis esculina (BEA):

a) peptona C (triptona) 17,0 g;

b) peptona B (peptona proteasa) 3,0 g; c) extracto de levadura 5,0 g;

d) bilis bacteriológica (oxgall) 10,0 g;

e) cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g;

f) esculina 1,0 g;

g) citrato de amonio férrico (C6H5+4yFexNyO7) 0,5 g

h) azida de sodio (NaN3) 0,15 g; y


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i) agar 15,0 g.

Disolver los ingredientes en 1 L de agua grado reactivo, calentar si es necesario, adicionar la azida de sodio al final. Esterilizar en autoclave de 120 °C a 122 °C o una

presión manométrica de 103 kPa durante 15 min, el pH final debe ser de 7,1 ± 0,2 a 25 °C. Enfriar aproximadamente a 45 °C y verter el medio en las placas.

Si se usan fórmulas deshidratadas se preparan de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

6.2.1.3 Caldo infusión de cerebro-corazón (BHI):

a) infusión de cerebro de vaca 200,0 g;

b) infusión de corazón de buey 250,0 g;

c) peptona 10,0 g;

d) glucosa 2,0 g;

e) cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g; y

f) fosfato disódico de sodio (Na2HPO4) 2,5 g.

Disolver los componentes en 1 L de agua grado reactivo, calentar si es

necesario, ajustar el pH de la disolución de tal manera que el pH final sea de

7,4 ± 0,2. a 25 °C Para preparar el caldo infusión cerebro corazón (BHI) con

6.5 % de NaCl adicionar otros 60 g de NaCl a la formulación.

Distribuir 10 mL dentro de cada tubo, esterilizar en autoclave de 120 °C a 122

°C o una presión manométrica de 103 kPa durante 15 min.

6.2.3 Medios de cultivo para filtración por membrana: 6.2.3.1 Agar m Enterococos:

a) triptosa 20,0 g;

b) extracto de levadura 5,0 g;

c) glucosa 2,0 g;

d) fosfato dipotásico (K2HPO4) 4,0 g;


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e) azida de sodio (NaN3) 0,4 g;

f) cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (C19H15ClN4) 0,1 g; y

g) agar 10,0 g. Calentar hasta disolver los ingredientes en 1 L de agua grado reactivo. No esterilizar.

Ajustar el pH final de 7,2 ± 0,2 a 25 °C. Verter la cantidad suficiente de agar en cajas de Petri hasta conseguir un grosor de 4 mm a 6 mm y dejar solidificar. Las placas preparadas

se pueden conservar protegidas de la luz y en refrigeración de 4 °C ± 2 °C en un periodo máximo de 2 semanas.

Si se usan fórmulas deshidratadas se preparan de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

6.2.3.2 Agar azida bilis esculina (BEA): a) peptona C (triptona) 17,0 g;

b) peptona B (peptona proteasa) 3,0 g;

c) extracto de levadura 5,0 g;

d) bilis bacteriológica (oxgall) 10,0 g; e) cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g;

f) esculina 1,0 g;

g) citrato de amonio férrico (C6H5+4yFexNyO7) 0,5 g;

h) azida de sodio, (NaN3) 0,15 g; y

i) agar 15,0 g.

Disolver los ingredientes en 1 L de agua grado reactivo, calentar si es necesario, adicionar la azida de sodio al final. Ajustar el pH final de 7,1 ± 0,1 a 25°C. Esterilizar en

autoclave de 120 ºC a 122 ºC o una presión manométrica de 103 kPa, durante 15 min, enfriar aproximadamente a 45 °C ± 1 °C, verter el medio en placas Petri, dejar enfriar en forma horizontal las placas, mantenerlas en refrigeración a 4 °C ± 2 °C máximo por

dos semanas.

6.3 Método del sustrato cromogénico: Para el método del sustrato cromogénico adquirir el paquete de reactivo y seguir las

instrucciones del fabricante para su uso.


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7 Equipo y materiales

Balanza analítica y granataria. Medidor de pH.

Incubadora con control de temperatura de 44 °C ± 0,5 °C. Incubadora con control de temperatura de 36 °C ± 2 °C. Incubadora con control de temperatura de 35 °C ± 0,5 °C.

Autoclave que alcanza y mantenga una temperatura de al menos 121°C o una presión manométrica de 103 KPa durante 15 min.

Horno para esterilizar a temperaturas de 170 °C durante 2 h o a 180 °C durante 1 h con termómetro calibrado.

Unidad de filtración con vacío (para filtración por membrana).

Cuenta colonias, para el conteo de colonias en membranas, o bien, lupa para ayuda en el conteo e identificación de características de las colonias.

Lámpara de luz ultravioleta de onda larga de 366 nm o equivalente para detectar fluorescencia (utilizada para el método cromogénico).

Baño con termostato controlado de 45 °C ± 1 °C. Usar material de vidrio y equipo libre de agentes que pueden afectar el crecimiento bacteriano.

botellas de muestreo o bolsas estériles; pipetas graduadas estériles;

contenedores para medio de cultivo; y cajas Petri, puede utilizarse vidrio o cajas plásticas estériles.

8 Muestreo

La recolección de las muestras de agua para el análisis microbiológico, depende del tipo de agua que se desee muestrear.

Las muestras se deben recolectar en recipientes estériles con un volumen mínimo de

muestra de 250 mL. Para muestras que contengan cloro libre, colocar en su interior, previo a la esterilización, 0,1 mL de disolución de tiosulfato de sodio al 10 %; si son bolsas estériles comerciales, estas deben contener el tiosulfato de sodio.

Durante el muestreo se debe utilizar guantes.

8.1 Muestreo en cuerpos receptores

Siempre que sea posible, llenar el frasco o bolsa hasta 2/3 partes de su capacidad, una cantidad menor sería insuficiente, si fuera mayor, disminuiría el espacio de aire disponible

necesario para homogeneizar la muestra.


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Es importante que todas las muestras se identifiquen con los datos completos en su etiqueta.

El frasco o bolsa donde se colecta la muestra no se acepta destapar sino hasta el

momento en el que se efectúe el muestreo, evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material contaminante.

8.2 Muestreo de agua superficial

8.2.1 Introducir el frasco o bolsa estéril aproximadamente 30 cm bajo la superficie del agua.

8.2.2 Destapar el frasco o bolsa dentro del agua. La boca del envase o bolsa debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente. Si no existe corriente,

como en los embalses, mover el frasco o bolsa de forma horizontal en sentido contrario a la boca del envase o bolsa para crear una corriente.

8.2.3 Una vez que la muestra ocupe el volumen correspondiente tapar el frasco o

bolsa sin sacar del agua. Cerrar correctamente maniobrando en el exterior.

La toma de muestra debe ser en un solo paso.

8.3 Muestreo en aguas profundas en lagos o embalses

Usar aparatos especiales que permitan destapar y tapar mecánicamente el frasco debajo

de la superficie.

8.4 Muestreo en pozos 8.4.1 Si el pozo está provisto de bomba de mano, bombear durante 5 min para que

el agua fluya libremente antes de tomar la muestra.

8.4.2 Si el pozo está dotado de bomba mecánica, tomar la muestra en una llave previamente sanitizada de la descarga dejando que fluya el agua libremente durante 5 minutos antes de tomar la muestra.

8.4.3 Si no se cuenta con equipo de bombeo, tomar la muestra directamente del

pozo por medio de un frasco estéril o con algún otro dispositivo previamente sanitizado.

8.5 Muestreo en grifos

Para la toma de muestra de un grifo, sanitizar y abrir completamente, dejar que el agua fluya de 2 min a 3 min o el tiempo suficiente para permitir la purga de la línea. Controlar el flujo de la llave para que se pueda llenar el frasco o bolsa sin salpicaduras.

8.6 Muestreo en agua salinas y costeras


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8.6.1 Para zonas de oleaje tranquilo

Tomar las muestras en áreas donde la profundidad del agua llegue a un metro

aproximadamente, la muestra debe tomarse a contracorriente del flujo entrante y a 30 cm aproximadamente bajo la superficie del agua.

8.6.2 Para zonas de playa con rompimiento cercana a la orilla

Se pasa el rompimiento a una profundidad de 1 m a 1,15 m. Debe colocarse a contracorriente del flujo entrante y tomar la muestra de agua a 30 cm bajo la superficie del agua. Si la pendiente del fondo es pronunciada, tomar la muestra en la orilla, donde la

profundidad del agua este entre el tobillo y la rodilla, llenar el recipiente procurando que contenga un mínimo de arena.

8.7 Almacenamiento de la muestra

Una vez recolectada la muestra, transportar al laboratorio, debe de mantenerse a una

temperatura de 4 °C ± 2 °C.

9 Procedimientos

9.1 Procedimiento para el NMP: preparación de la muestra e inoculación de tubos.

9.1.1 Prueba presuntiva

Inocular una serie de tubos que contengan caldo azida dextrosa (medio de aislamiento presuntivo).

Medir volúmenes de muestra de 10 mL o menos, emplear caldo de concentración doble para inoculación de volúmenes de 10 mL. Las porciones de muestras pueden variar de

acuerdo a sus características físicas. Utilizar sólo múltiplos decimales de 1 mL.

9.1.2 Incubación Incubar los tubos a 35 °C ± 0,5 °C. Examinar la turbidez de cada tubo después de 24 h

± 2 h. Continuar la incubación por 24 h ± 3 h en aquellos tubos que no presenten estos cambios y examinar nuevamente.

9.1.3 Prueba Confirmativa

Después de 24 h o 48 h de incubación todos los tubos que muestran turbidez en caldo azida dextrosa deben ser confirmados. Realizar subcultivos de cada tubo que haya dado

un resultado positivo en cajas Petri con agar azida bilis esculina (BEA).


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9.1.3.1 Incubación

Incubar las cajas invertidas de agar azida bilis esculina (BEA) a 35 °C ± 0,5 °C por un

periodo de 24 h ± 2 h. Las colonias cafés negruzcas con halos de color café confirman la presencia de Enterococos fecales, transferir éstas colonias a tubos que contengan caldo infusión cerebro corazón con NaCl al 6,5 %, incubar a 35 °C ± 0,5 °C por un período de

tiempo de 48 h ± 4 h.

9.1.3.2 Cuantificación de resultados

Estimar la densidad microbiana de Enterococos fecales a partir del número de tubos de

cada serie de diluciones que fueron positivos en agar azida bilis esculina (BEA) y de la misma forma en tubos positivos en caldo infusión cerebro corazón con 6.5 % de NaCl.

Para la expresión de resultados, véase 10.1.

9.2 Procedimiento de filtración por membrana

9.2.1 Siembra en medio agar m-Enterococos (para prueba presuntiva)

Seleccionar un volumen de muestra y una dilución adecuada, realizar mínimo 3

diluciones, filtrar a través de una membrana cuadriculada estéril de 0,45 µm de tamaño de poro para obtener de 20 a 60 colonias en la superficie de la membrana. Transferir la membrana al agar m- Enterococos contenido en una caja Petri, evitando la formación de

burbujas de aire bajo la membrana, se incuba a 36 °C ± 2 °C por 44 h ± 4 h. Después de la incubación considerar todas las colonias que muestren un color rojo, marrón o rosa en

toda la colonia, en el centro o alrededor de ella. 9.2.2 Siembra para prueba confirmativa en agar azida bilis esculina

Después de la incubación en el medio m-Enterococos transferir cuidadosamente la

membrana al agar azida bilis esculina, el cual ha sido precalentado a 44 °C. Incubar a 44 °C ± 0,5 °C por 2 h. Tomar lectura de manera inmediata. Las colonias de Enterococos fecales muestran un color negro en el medio circundante siendo una reacción positiva. Es

importante que el recuento de colonias en la prueba presuntiva no rebase las 60 colonias marcadas como máximo para evitar interferencias en la prueba confirmativa, debido a la

difusión de color a las colonias adyacentes. El conteo de colonias se hace con ayuda de cuenta colonias o lupa.

9.2.3 Cuantificación

Calcular el número de colonias a partir de las cantidades de muestra que produzcan recuentos en las membranas comprendidos entre 20 y 60 colonias, para la expresión de resultados véase 10.2.

9.3 Procedimiento para el método del sustrato cromogénico


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Preparación de la prueba

Agregar el reactivo a la muestra previamente diluida o directamente según el tipo de

muestra de agua. Tapar y sellar el recipiente utilizado de forma aséptica. Agitar para disolver el reactivo por completo. Verter la mezcla de muestra y reactivo en el recipiente o dispositivo suministrado por el proveedor para llevar a cabo la prueba. Seguir siempre

las especificaciones del fabricante ya que las instrucciones de uso pueden variar según la marca, así como el uso de las tablas correspondientes a NMP de Enterococos en charola

con pozos.

10 Expresión de resultados

10.1 Número más probable (NMP)

Con el número de tubos de las pruebas confirmativas que hayan dado reacciones positivas, calcule el número más probable de Enterococos fecales en 100 mL de muestra, refiriéndose a las tablas del NMP (véase capítulo 12).

En caso de que en la prueba presuntiva no muestre turbidez reportar el valor mínimo

expresado en la tabla correspondiente al número de tubos empleados. Cuando se utilicen diluciones diferentes a las establecidas en las tablas, se aplicará la

siguiente formula:

(1)

En caso de no encontrar en las tablas la combinación obtenida utilizar la siguiente fórmula:

)mL()mL(

100 mL 001/

.

tuboslostodosenmuestradenegativostubosenmuestrade

mLxpositivostubosdeNoNMP (2)

10.2 Método de filtración por membrana

Para el conteo en membrana de 20 a 60 colonias, se utiliza la siguiente ecuación:

filtradamuestrade

dascuantificaColoniascoloniasdeTotal

mL

mL 100mL 100/

(3)

mayorDilución

tablasencontenidoValorNMP


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Reportar como Enterococos fecales UFC por 100 mL

10.3 Método del sustrato cromogénico

Ver referencia del fabricante. Reportar el NMP/100 mL, considerar la dilución.

11 Reporte de la prueba

El reporte de la prueba debe contener la siguiente información: a) hacer referencia a esta norma mexicana NMX-AA-167-SCFI-2017;

b) los resultados expresados de acuerdo al capítulo 10; y c) cualquier otra información relevante al método.

12 Tablas Tablas para obtener los resultados por el método del número más probable (NMP) en la

determinación de Enterococos fecales.

TABLA 12.1.- Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de

confianza (para diversas combinaciones de resultados positivos cuando se

utilizan tres alícuotas de muestra de 10 mL, tres de 1 mL y tres de 0,1 mL)

Número de tubos que dieron

reacción positiva NMP

por 100

mL

Límite de confianza

al 95 %

3 de 10

mL

3 de 1

mL

3 de 0,1

mL Inferior Superior

0 0 0 <3 ---- ------

0 0 1 3 < 1 9

0 1 0 3 < 1 13

1 0 0 4 < 1 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37


17/24

SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

Tabla 12.1 (Concluye)



por 100

mL


al 95 %

3 de 10

mL

3 de 1

mL

3 de 0,1


2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 149

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 379

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

3 3 3 ≥2400 ----- -----


18/24

SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

TABLA 12.2.- Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de

confianza (cuando se utilizan cinco alícuotas de muestra de 10 mL, cinco de 1 mL

y cinco de 0,1 mL)



por 100

mL


al 95 %

5 de 10

mL 5 de 1 mL

5 de 0,1


0 0 0 < 2 < 1 7

0 1 0 2 < 1 7

0 2 0 4 < 1 11

1 0 0 2 < 1 7

1 0 1 4 < 1 11

1 1 0 4 < 1 11

1 1 1 6 < 1 15

1 2 0 6 < 1 15

2 0 0 5 < 1 13

2 0 1 7 1 17

2 1 0 7 1 17

2 1 1 9 2 21

2 2 0 9 2 21

2 3 0 12 3 28

3 0 0 8 1 19

3 0 1 11 2 25

3 1 0 11 2 25

3 1 1 14 4 34

3 2 0 14 4 34

3 2 1 17 5 46

3 3 0 17 5 46

4 0 0 13 3 31

4 0 1 17 5 46

4 1 0 17 5 46

4 1 1 21 7 63

4 1 2 26 9 78


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SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

Tabla 12.2 (continúa)



por 100

mL


al 95 %

5 de 10

mL

5 de 1 mL 5 de 0,1


4 2 0 22 7 67

4 2 1 26 9 78

4 3 0 27 9 80

4 3 1 33 11 93

4 4 0 34 12 93

5 0 0 23 7 70

5 0 1 31 11 89

5 0 2 43 15 110

5 1 0 33 11 93

5 1 1 46 16 120

5 1 2 63 21 150

5 2 0 49 17 130

5 2 1 70 23 170

5 2 2 94 28 220

5 3 0 79 25 190

5 3 1 110 31 250

5 3 2 140 37 340

5 3 3 180 44 500

5 4 0 130 35 300

5 4 1 170 43 490

5 4 2 220 57 700

5 4 3 280 90 850

5 4 4 350 120 1 000

5 5 0 240 68 750

5 5 1 350 120 1 000


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SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

Tabla 12.2 (concluye)



por 100

mL


al 95 %

5 de 10

mL

5 de 1 mL 5 de 0,1


5 5 2 540 180 1 400

5 5 3 920 300 3200

5 5 4 1600 640 5800

5 5 5 ≥ 1800 - -

TABLA 12.3- Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de

confianza (cuando se utiliza una alícuota de ensayo de 50 mL y cinco de 10 mL)

Número de tubos que

dieron reacción positiva NMP

por 100 mL

Límite de confianza al

95 %

1 de 50 mL 5 de 10 mL Inferior Superior

0 0 < 1

0 1 1 < 1 4

0 2 2 < 1 6

0 3 4 < 1 11

0 4 5 1 13

0 5 7 2 17

1 0 2 < 1 6

1 1 3 < 1 9

1 2 6 1 15

1 3 9 2 21

1 4 16 4 40

1 5 > 18


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SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

TABLA 12.4-Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utilizan cinco alícuotas de muestra de 100 mL, una de 10

mL y una de 1 mL)



por 100

mL


al 95 %

5 de 100

mL

1 de 10

mL 1 de 1 mL Inferior Superior

0 0 0 < 1 < 1 1

0 1 0 < 1 < 1 1

1 0 0 < 1 < 1 1

1 1 0 < 1 < 1 2

2a < 1 < 1 2

2 0 0 < 1 < 1 2

2 1 0 < 1 < 1 2

3a < 1 < 1 3

3 0 0 < 1 < 1 3

3 0 1 1 < 1 3

3 1 0 1 < 1 4

4a 2 < 1 5

4 0 0 2 < 1 5

4 0 1 2 < 1 6

4 0 0 2 < 1 6

5 0 0 4 2 36

5 0 1 10 3 54

5 1 0 20 10 380 a Estos resultados se expresan para el caso en el que se utiliza un sólo

nivel con 5 tubos.


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SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

TABLA 12.5.- Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utiliza una alícuota de muestra de 50 mL, cinco de 10 mL y

cinco de 1 mL)



por 100

mL


al 95 %

1 de 50

mL

5 de 10


0 0 0 < 1

0 0 1 1 < 1 4

0 0 2 2 < 1 6

0 1 0 1 < 1 4

0 1 1 2 < 1 6

0 1 2 3 < 1 8

0 2 0 2 < 1 6

0 2 1 3 < 1 8

0 2 2 4 < 1 11

0 3 0 3 < 1 8

0 3 1 5 < 1 13

0 4 0 5 < 1 13

1 0 0 1 < 1 4

1 0 1 3 < 1 8

1 0 2 4 < 1 11

1 0 3 6 < 1 15

1 1 0 3 < 1 8

1 1 1 5 < 1 13

1 1 2 7 1 17

1 1 3 9 2 21

1 2 0 5 < 1 13

1 2 1 7 1 17

1 2 2 10 3 23

1 2 3 12 3 28

1 3 0 8 2 19


23/24

SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

TABLA 12.5 (concluye)



por 100

mL


al 95 %

1 de 50

mL

5 de 10


1 3 1 11 3 26

1 3 2 14 4 34

1 3 3 18 5 53

1 3 4 21 6 66

1 4 0 13 4 31

1 4 1 17 5 47

1 4 2 22 7 69

1 4 3 28 9 85

1 4 4 35 12 101

1 4 5 43 15 117

1 5 0 24 8 75

1 5 1 35 12 101

1 5 2 54 18 138

1 5 3 92 27 217

1 5 4 161 3 450

1 5 5 > 180 - -

13 Manejo de residuos

Cada laboratorio debe contemplar el control, manejo y disposición final de los residuos

generados durante el ensayo.

14 Vigencia

La presente norma mexicana, entrará en vigor a los 120 días naturales después de la publicación de su declaratoria de vigencia en el Diario Oficial de la Federación.

15 Concordancia con normas internacionales


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SECRETARÍA DE

ECONOMÍA

Esta norma mexicana es modificada (MOD) con respecto a la Norma Internacional ISO-7899-2-2000 - Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part

2: Membrane filtration method, y difiere en los siguientes puntos:

Capítulo/Inciso al que aplica la diferencia

Desviación Técnica / Justificación

9.1 Procedimiento para el número más probable (NMP).

El procedimiento de NMP, siendo una determinación de tubos múltiples, se

incluyó por ser el más utilizado en el país, en el momento de elaborarse esta norma mexicana.

9.3 Procedimiento para el método del sustrato

cromogénico.

Este procedimiento se incorpora en esta misma norma por ser un método

enzimático actualizado, y se obtienen resultados rápidos.

16 Bibliografía - NOM-008-SCFI-2002 Sistema General de Unidades de Medida. Publicada en el

Diario Oficial de la Federación el 2002-11-27.

- NMX-AA-120-SCFI-2016 Que establece los requisitos y especificaciones de sustentabilidad de calidad de playas. Cancela a la NMX-AA-120-SCFI-2006. Publicada en el Diario Oficial de la

Federación el 2016-12-07.

- ISO-7899-2_2000 Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 2: Membrane filtration method. 2000-04.

- ISO 8199:2005 Water quality General guidance on the enumeration of

micro-organism by culture. 2005-06. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health

Association/American Water Works Association/Water Environment Federation, Eaton, A., Clesceri, L., Greenberg, A. (eds) 22th edn. Partes 9230, 9230 B, 9230 C. Washington DC,

USA, 2012.

Ciudad de México, a 17 de mayo de 2017

Lic. Alberto Ulises Esteban Marina

El Director General de Normas

DGS/RRM

NORMA MEXICANA NMX-AA-167-SCFI-2017 ANÁLISIS DE AGUA ...

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