EKSPRESI MATRIKS METALLOPROTEINASE-1,-2 PADA LIGAMEN UTEROSAKRAL DARI WANITA DENGAN PROLAPS ORGAN PELVISTomislav Strinica,b,* , Marko Vulica,b, Snjezana Tomicb,c, Vesna Capkund, Ivica Sipicb ,Ivana Alujevica,baDepartement of Gynecology and Obstetrics, University Hospital Split, Croatia

bSchool of Medicine ,University of Split,Croatia

cInstitute of Pathology, University Hospital Split, Croatia

dDepartement of Nuclear Medicine, University Hospital Split, Croatia

Abstrak

Tujuan : Studi ini meneliti ekspresi matriks metalloproteinase-1 (MMP-1) dan matriks metalloproteinase-2 (MMP-2) secara imunohistokimia dari biopsi ligamen pada wanita dengan prolaps organ pelvis (POP) dan kontrol dengan pelvis yang normal.Rancangan : Penelitian eksperimental observasional prospektif

Setting : Unit Uroginekologi tersier dan institute patologi, University Hospital Split, Croatia

Populasi : Wanita yang dirujuk untuk histerektomi baik prolaps ataupun dengan penyakit ginekologi jinakMetode: Delapan puluh wanita post menopause dilibatkan dalam penelitian setelah mendapatkan persetujuan dari komite etik dan informed cosent. Selama prosedur operasi, biopsi dari ligamen uterosakral diperoleh dari pasien-pasien dengan POP (n=40) dan wanita tanpa adanya bukti kelemahan dinding pelvis (n=40). Imunohistokimia untuk MMP-1 dan MMP-2 telah dilakukan dengan fiksasi dari formalin dan potongan dilapisi dengan paraffin. Evaluasi statistik dibuat dengan student T-test atau 2 test.

Hasil utama pengukuran : ekspresi secara imunohistokimia dari MMP-1 dan MMP-2 pada ligamen uteroskral wanita dengan dan tanpa prolaps genital.

Hasil : Penelitian ini melibatkan empat puluh wanita dengan POP dan empat puluh wanita tanpa POP. Subyek kontrol kemudian disesuaikan dengan wanita POP berdasarkan umur,indeks masa tubuh (IMT), paritas dan durasi post menopause. Didapatkan peningkatan secara signifikan ekspresi imunohistokimia dari MMP-1 dalam jaringan ligamen uterosakral dari wanita dengan POP (P=0,029). Sebaliknya, tidak didapatkan perbedaan ekspresi imunohistokimia dari MMP-2 antara wanita dengan POP dan tanpa POP (P=0,899).Kesimpulan : Data ini menyimpulkan bahwa MMP-1 kemungkinan merupakan marker dari degradasi kolagen. Peningkatan ekspresi imunohistokimia dari MMP-1 dalam ligamen uterosakral memiliki keterkaitan dengan prolaps urogenital.1. Pendahuluan

Prolaps Organ Pelvis (POP) merupakan suatu entitas yang kompleks, multifaktorial dalam etiologi, dengan berbagai kondisi predisposisi seperti kehamilan, persalinan, kelahiran pervaginam, variasi struktur tulang, gangguan neuromuskular, usia lanjut, ras dan faktor genetik dan penyakit jaringan ikat. Kondisi medis kronis seperti Penyakit Paru Obstruktif Kronis (PPOK), obesitas, konstipasi, defisiensi estrogen, malnutrisi, dan anemia juga dapat mengambil peran. Selain itu masalah gaya hidup seperti lingkungan kerja, mengangkat beban yang berat dan merokok, serta faktor iatrogenik misalnya sebelumnya pernah melakukan operasi pelvis, dapat menggambarkan ruang lingkup dan kompleksitas dari patofisiologi prolaps, Begitu juga potensi untuk sejumlah interaksi dari elemen-elemen penyebab. Sistem urogenital wanita disokong oleh otot pelvis, ligamen dan tulang pelvis, yang dimana kesemuanya itu secara konstan mendapatkan trauma dan stress [7]. Stabilitas mekanik dari saluran genito-urinari bergantung pada keutuhan, serabut-serabut kolagen fungsional, yang menyokong leher kandung kemih, uretra, dan organ pelvis [8]. Dalam beberapa tahun ini, beberapa peneliti telah mengidentifikasi reduksi dari kolagen pada struktur yang menyokong pelvis pada wanita dengan POP [8-10]. Matriks metalloproteinase merupakan suatu kumpulan protein-protein yang mendegradasi matriks ekstraseluler. [10-16]. Peningkatan degradasi kolagen yang terjadi, kemungkinan merupakan etiologi dari POP. Kesulitan dalam mengkuantifikasi kolagen dikarenakan struktur supermolekuler yang dimilikinya. Faktanya, protein dengan tingkat kestabilan yang tinggi sangatlah tidak mungkin untuk melarutkannya dalam larutan penyangga yang paling fisiologispun. [14,15]. Uji biokimia yang paling sering digunakan untuk mengkuantifikasi kolagen adalah uji hydroxyproline. Meskipun uji ini membutuhkan jumlah jaringan yang cukup banyak, namun uji ini mengukur secara tidak langsung total kolagen dan tidak spesifik pada jenis kolagen [15]. Untuk menanggulangi keterbatasan ini, suatu kelompok peneliti telah menyelidiki metabolisme kolagen dengan mengukur ekspresi MMP [10-12, 14-16].

Penulis berhipotesis bahwa kolagen akan mengalami perubahan pada jaringan pelvis yang mengalami prolaps yang kemungkinan terkait dengan kondisi ini. Penelitian ini ditujukan untuk meneliti metabolisme kolagen dengan mengukur ekspresi MMP-1 dan MMP-2 pada jaringan ligamen uterosakral dari wanita postmenopause dengan atau tanpa POP.

2. Subyek dan Metode

Protokol penelitian ini telah disetujui oleh Institusi komite etik. Seluruh peserta mendapatkan informed consent tertulis. Total pasien yang ikut berpartisipasi dalam penelitian ini berjumlah 80. Mereka kemudian dibagi menjadi 2 kelompok berdasarkan ada atau tidaknya POP. Dan didapatkan 40 wanita dengan POP dan 40 subyek kontrol. Seluruh pasien. Seluruh pasien yang terlibat merupakan wanita post menopause dan dirawat di rumah sakit untuk dilakukan pembedahan. Wanita dengan operasi pelvis sebelumnya atau penyakit radang panggul, adanya keganasan pelvis atau lainnya, diabetes mellitus dan wanita dengan terapi hormonal telah dieksklusi dari penelitian. Kontrol kemudian disesuaikan berdasarkan usia pasien, indeks masa tubuh, paritas dan durasi dari post menopause. Evaluasi melibatkan riwayat medis dan pemeriksaan ginekologi. Tanda-tanda POP dicatat selama pemeriksaan pelvis, dan dijelaskan berdasarkan klasifikasi International Continence Society Pelvic Organ Prolapse ( POP-Q ) [17]. Kelompok studi adalah yang mengalami prolaps tahap 2 atau lebih berdasarkan POP-Q, dan kelompok kontrol yang dengan tanpa adanya tanda-tanda prolaps. Indeks masa tubuh (IMT, kg/m2) dikalkulasikan untuk setiap wanita. Biopsi dari ligamen uterosakral dilakukan pada saat pembedahan abdominal atau vaginal dari 40 wanita dengan POP dan 40 wanita yang menjalani pembedahan ginekologi untuk indikasi jinak. Kami memfokuskan pada ligamen uterosakral, karena mereka adalah bagian yang terpenting dari sistem yang menyokong pelvis [18]. Semua spesimen biopsy difiksasi dalam formalin dan direndam dalam paraffin, dan potongan 3-5 m disusun kaca slide dan dikeringkan pada suhu 37o C selama 12 jam.

Imunihistokimiauntuk MMP-1 dan MMP-2 dilakukan pada potongan yang sudah terfiksasi dengan formalin dan direndam dengan paraffin.

Antibodi monoklonal dari kambing melawan MMP-1 yang teraktivasi (konsentrasi 0,1 mg/ml, dilusi 1:10, anti human MMP-1, AF 901, sistem R & D, Minneapolis, USA) dan antibodi monoklonal dari tikus melawan MMP-2 yang teraktivasi (konsentrasi 0,2 mg/ml, dilusi 1:30, anti human MMP-2, MAB 902, sistem R & D, Minneapolis, USA) digunakan sebagai antibody primer. Untuk imunohistokimia, spesimen-spesimen dideparaffinisasikan, direhidrasi, dan dipanaskan dalam microwave oven dalam ethylene-diamin-tetraacetic acid (EDTA).

Setiap sampel didinginkan dan dicuci dengan phosphate-buffered saline (BPS) dan air suling, dan kemudian diinkubasi dengan H2O2 untuk menghambat peroksidase endogen selama 15 menit. Kemudian spesimen dibilas dengan PBS dan diinkubasi dalam ruang gelap dalam temperatur ruangan selama 30 menit dengan antibodi yang berikatan. Spesimen kenudian dicuci dengan PBS dan diinkubasi selama 30 menit dengan streptavidin. Kemudian spesimen kembali dibilas dengan PBS dan diinkubasi dengan chromogen diaminobenzidin (DAKO) dalam pemanas selama 15 menit. Setelah prosedur ini potongan tersebut kemudian diwarnai dengan hematoxylin, didehidrasi dengan alkohol dan dibersihkan dengna xylol dan ditutupi dengan Canada balsam dan gelas kaca.

Kontrol positif: Potongan kontrol positif untuk MMP-1 dan MMP-2 dipersiapkan dari jaringan plasenta. Pada jaringan kontrol positif, antibodi monoklonal tercat sama

Kontrol negatif: Potongan kontrol negative dipersiapkan dari jaringan yang sama sebagai specimen. Peneliti menggunakan prosedur standar untuk pengecatan imunohistokimia. Sebagai konstrol negative kami melakukan prosedur yang sama dengan menghilangkan antibodi sekunder. Berdasarkan gambar pengecatan imunohistokimia dalam jaringan dan jaringan kontrol (trophoblast dari plasenta). Tampak jelas terdapat minimal immunostaining yang tidak spesifik bahkan tidak ada. (Gambar 1a (A dan B) dan b (C dan D)).

Semua spesimen jaringan diperiksa secara independen oleh ahli patologi dengan mikroskop cahaya (Olympus BX40). Pemeriksa dibutakan terhadap diagnosis klinisnya. Skor diaplikasikan untuk mengklasifikasi intensitas pengecatan dimanal lemah (1+), sedang (2+), kuat (3+).

Untuk analisis statistik, pasien dibagi menjadi dua kelompok. Untuk perbandingan dari variabel matriks atau kategorikal antara pasien dan kontrol digunakan student T-test atau 2 test. Perbedaan ekspresi MMP-1 dan MMP-2 antara kelompok studi dianalisis dengan 2 test.

Nilai p < 0,05 merupakan nilai signifikan secara statistik. Program satistik 6.0 (SPSS,Chicago, IL, USA) digunakan untuk kalkulasi.

Gambar 1. (a) Ekspresi MMP-1 pada ligamen uterosakral yang diuji dengan imunohistokimia: (A) ekspresi lemah; (B) ekspresi kuat; (b) Jaringan plasenta kontrol: (C) MMP-1; (D) MMP-23. Hasil

Delapan puluh wanita yang berpartisipasi dalam penelitian dan ligamen uterosakral dianalisis. Terdapat 40 wanita dengan prolaps dan 40 kontrol tanpa prolaps. Kelompok pembanding kemudian disesuaikan terhadap demografis dan karakteristik klinis (Tabel 1). Umur rerata dari pasien dengan POP adalah 57,6 tahun, dan umur rerata dari kontrol hampirsama yaitu 56,9 tahun. Tidak ada perbedaan dalam usia, IMT, paritas dan durasi dari post menopause diantara wanita dengan dan tanpa POP (tabel 1).

Imunohistokimia dikerjakan untuk menentukan ekspresi dari MMP-1 dan MMP-2 dalam ligamen uterosakral. Pada kelompol POP, 9 sampel menunjukan lemah, 17 sampel sedang, dan 14 sampel positif kuat untuk MMP-1. Pada kelompok non-POP, 20 sampel menunjukkan lemah, 13 sampel sedang, sedangkan 7 sampel menunjukkan ekspresi MMP-1 yang kuat. Analisis statistik menunjukkan adanya perbedaan antara ekspresi MMP-1 antara wanita dengan POP dan tanpaPOP (2 test = 7,03; p=0,029). Tidak terdapat perbedaan signifikan untuk ekspresi MMP-2 (2 test = 0,214; p=0,899). Tabel 2.

4. Diskusi

Sejak lama, prolaps urogenital telah dipertimbangkan sebagai akibat dari genetika, kelahiran, usia, beban mekanis dan kurangnya kekuatan otot dan fascia dibandingkan wanita normal. Pada sebagian besar kasus, prolaps genital tidak terjadi hingga bertahun-tahun sampai beberapa dekade setelah proses melahirkan, hal ini mengindikasikan bahwa terdapat faktor-faktor lain yang berkontribusi untuk terjadinya POP selain proses kelahiran. Penelitian-penelitian observasional mengajukan bahwa menopause merupakan salah satu faktor [19.20]. Usia merupakan faktor risiko untuk POP. Pada penelitian POSST, terdapat 10% peningkatan risiko dari POP untuk setiap decade kehidupan [21]. Olsen et al. [3] menemukan bahwa insiden kumulatif dari operasi primer untuk POP dan inkontinensia meningkat dari 0,1% pada kelompok usia 20-29 menjadi 11,1% pada kelompok usia 70-79 tahun. Reay Jones dkk [22] menilai uterosacral ligamen Resilience (UsR) dengan tensiometri pada wanita dengan dan tanpa POP untuk menentukan apakah hal tersebut dipengaruhi oleh mobilitas uterus dan dinding pelvis atau apakah bervariasi sesuai usia, persalinan pervaginam, menopause atau variasi histologi dari ligamen. Dia menemukan bahwa UsR mengalami reduksi signifikan pada POP yang simptomatis. Terdapat penurunan yang signifikan dari UsR pada wanita menopause dan usia lanjut, dimana memberi kesan bahwa otot dinding pelvis dan ligamen melemah. Dua mekanisme dari maturasi kolagen telah diketahui. Kedua mekanisme dikontrol oleh MMP dan kedua mekanisme tersebut bertanggung jawab untuk komplikasi dari jaringan ikat yang terlihat pada usia lanjut [23]. Saat ini, hal tersebut telah dibuat secara invitro dan menunjukkan bahwa MMP yang aktif dapat diinaktivasi secara spontan dengan degradasi menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil. Proses ini dinamakan sebagai autokatalisis [23].Defisiensi estrogen dikenal sebagai faktor risiko untuk POP, estrogen replacement therapy (ERT) telah digunakan sejak lama untuk meningkatkan integritas structural dari jaringan pelvis dengan hasil yang memuaskan pada inkontinensia urine. [24]. Reseptor estrogen telah diidentifikasi dalam nukleus jaringan ikat dan dari sel otot polos dari trigonum kandung kemih, uretra, mukosa vagina, levator ani, dan ligamen uterosakral. Reseptor-resptor ini berpartisipasi dalam mempertahankan sistem penyokong pelvis dengan meningkatkan sintesis atau dengan menekan rusaknya kolagen dan MMP [25]. Beberapa laporan penelitian melaporkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi mRNA untuk kolagen I dan III dengan ERT. Penemuan ini menunjukkan bahwa estrogen meningkatkan turnover jaringan ikat dari dinding pelvis. Selain itu juga estrogen memulihkan metabolisme kolagen [16,23]. Pada percobaan double blind, dengan plasebo dan ERT pada wanita post menopause dengan stress inkontinensia urin, Jackson menemukan bukti kuat untuk sintesis baru dan degradasi [8], juga peningkatan dari bentuk aktif dan proaktif dari MMP-2 dan MMP-9 pada wanita yang diobati dengan ERT dibandingkan dengan kontrol. Hal ini mengakibatkan menurunnya jumlah kolagen total [26]. Inhibisi MMP oleh ERT juga dilaporkan [27,28]. Zong et al. [29] menemukan bahwa hanya estradiol yang dikombinasikan dengan progesterone dapat menurunkan bentuk aktif dari MMP-1, yang menyimpulkan bahwa kedua hormon ini penting untuk mempertahankan integritas dari dinding pelvis wanita.Bukti saat ini melaporkan bahwa perubahan dalam komposisi jaringan ikat miminal melibatkan sebagian dari patofisiologi POP [8,9,12]. Penelitian saat ini mengukur ekspresi MMP-1 dan MMP-2 pada jaringan ligamen uterosakral dari wanita postmenopause dengan atau tanpa prolaps.Sangatlah penting untuk menganalisis wanita post menopause, karena post menopause merupakan faktor yang terlibat dalam perkembangan POP. Seluruh sampel jaringan menunjukkan adanya immunoreaktivitas untuk MMP-1 dan MMP-2, menyimpulkan bahwa kedua proteinase memiliki peran fungsional yang penting. Pasien-pasien dengan POP menunjukkan ekspresi MMP-1 yang tinggi secara signifikan dibandingkan kontrol. Di sisi lain, analisis statistic menunjukan tidak ada perbedaan yang bermakna pada ekspresi MMP-2 antara kelompok POP dan kontrol. Sebaliknya, pada jaringan ligamen lumbosakraldari wanita dengan prolaps urogenital, Gabriel dkk. [12] menemukan terjadi peningkatan ekspresi MMP-2, tetapi tidak dengan MMP-1. Sepengetahuan peneliti, artikel ini merupakan laporan imunohistokimia pertama yang menemukan bahwa ekspresi MMP-1 lebih tinggi pada jaringan ligamen uterosakral wanita post menopause dengan POP dibandingkan kontrol. Kekuatan utama dari penelitian ini adalah ukuran sampel dan pasien telah disesuaikan berdasarkan usia, IMT, paritas dan status post menopause. Kesalahan dapat diminimalisir karena pengaruh hormon seks pada aktivitas MMP. Penjelasan untuk hasil penelitian dari Gabriel berbeda dapat diakibatkan karena jumlah sampel yang sedikit dan kelompok kontrol memiliki usia yang lebih muda secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol penelitian kami. Selain itu,sampel penelitiannya sangat bervariasi karena adanya sampel wanita yang pre menopause dan wanita post menopause dengan ERT. Penelitian lain meneliti mengenai jaringan vaginal, Jackson dkk [8] menemukan peningkatan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 pada dinding jaringan vagina. Phillips dkk [10], Alperindan Moalli [15], Moalli dkk [16] pada jaringan yang sama menemukan peningkatan ekspresi MMP-9, tetapi tidak untuk ekspresi MMP-2. Chen dkk [14] menemukan ekspresi MMP-1 lebih tinggi secara bermakna pada dinding jaringan vagina pada wanita potmenopause dengan POP setelah 3 bulan dengan ERT, tetapi hal tersebut tidak ditemukanpada wanita menopause tanp ERT. Hasil yang bertolak belakang ini juga dapat diakibatkan olehperbedaan lokasi biopsy dan jumlah sampel yang terlalu kecil.Kolagen interstisial tipe I, merpakan protein dari jaringan ikat yang terbanyak, dan dipotong oleh kolagenase interstisial,MMP-1. MMP-1 kemungkinan memiliki peran yang penting terhadap hilangnya kekuatan dari kolagen fibrosa dan hilangnya integritas jaringan. Maksud penelitian ini adalah MMP-1 bertanggung jawab untuk terjadinya degradasi dari komponen matriks ekstraseluler. Data ini konsisten dengan teori bahwa peningkatan rusaknya kolagen dapat memainkan peran penting dalam onset dan perkembangan dari prolaps genital. Penuaan secara fisiologis serta menopause merupakan faktor dekompensasi pada proses ini. Sangatlah sulit untuk memastikan pada penelitian ini bahwa ekspresi MMPI-1 yang lebih tinggi pada ligamen uterosakral yang mengalami prolaps merupakan pemyebab prolaps tersebut. Penelitian lain diperlukan untuk meningkatkan pemahaman mengenai penyakit ini.

Kontributor

Peneliti mengkonfirmasi bahwa setiap peneliti berpartisipasi dalam mengambil tanggung jawab terhadap ketepatan isi penelitian. (1) Snjezana Tomic, IvanaAlujevic, Marko Vulic dan Ivica Sipic berpartisipasi dalam proses penelitian dari artikel ini. (2) Vesna Capkun, berpartisipasi dalam proses penelitian, analisis dan interpretasi data. (3) Tomislav Strinic berpartisipasi dalam proses penelitian, analisis, interpretasi data dan penulisan artikel ini.Konflik Perhatian

Tidak ada konflik perhatia dari naskah ini.

Pengakuan

Penelitian ini merupakan bagian dari proyek Croatian Ministry of Science, Education, and Sport (No. 216-0000000-0535); Kepala peneliti Profesor TomislavStrinic, MD, PhD.