Defectos en el splicing in vitro

Análisis de la composición del compuesto X mediante

Northern Blot

Extracto de splicing (Snu17 ó WT)+ pre-mRNA actina

+/- EDTA+/- oligonucleótido d1

Incubación a 30°C

Alícuotas a 0, 15, 20 minutos

Bloqueo con hielo

+ Buffer-Heparina

Electroforesis en gel no desnaturalizante

Northern blot (sondas DNA actina, U1, U2, U4, U5 y U6)

- El complejo X migra como A1 y contiene U1, U2, U4/U6.U5 snRNP- U2 snRNP migra de forma anormal en ausencia de Snu17p, indicando un compromiso en su estructura

Extractos de splicing + pre_mRNA actina biotinilado Incubación a 23° 20 minutos

Alícuota para Heparinaanálisis de RNA total Centrifugación en gradiente de glicerol 10-30%

Inmunoprecipitación de las fracciones con Estreptoavidina-agarosa beads

Extracción del RNA y Northern blot

Este experimento independiente confirma que el complejo X está compuesto por todas las snRNP

Conclusiones:

- Snu17p es una proteína nueva de levaduras que forma parte deU2snRNP.

- Es un componente del spliceosoma que se halla acomplejado antesde que ocurra el segundo paso catalítico del splicing.

- Snu17p presenta un motivo de unión al RNA (RRM), y podría ser elortólogo de la p14 humana. Sin embargo, aún no se ha podidodemostrar su interacción directa con el RNA. Se sugiere queSnu17p se une a U2snRNP por medio de interacciones proteína-proteína.

- In vitro, la ausencia de Snu17p produce una fuerte reducción en laactividad de splicing, inhibiendo el primer paso catalítico del mismo(pudiendo revertirse incorporando Snu17p recombinante).

- Snu17p podría otorgar a U2snRNP una conformación particular queharía efectivo el proceso de splicing. La carencia de la proteínapodría generar un plegamiento anormal de U2snRNP, dando origena un complejo X de migración lenta compuesto por U2, U4/U6.U5 yU1 (que se estabilizaría gracias a un efecto indirecto producido porel cambio en el plegamiento de U2).

- En cepas defectuosas, la U4/U6.U5 tri-snRNP se uniría a uncomplejo U1.U2 snRNP, a pesar de que U1 esté hyperestabilizado,y se vería bloqueada la liberación de U4.

- In vivo, esta proteína no es esencial para la viabilidad de lacélula, pero se observan fenotipos de crecimiento lento en cepasmutantes Snu17p.

- Estas diferencias podrían deberse a que, in vivo, unaconformación aberrante de U2snRNP causada por la falta de laproteína podría ser estabilizada y compensada por otros factorespresentes en el medio.

- La deleción de SNU17 puede ser usada como una herramientapara aislar spliceosomas completamente ensamblados antes delprimer paso catalítico, para estudios detallados de suscomposiciones proteicas.