Manual de Laboratorio de Bacteriologa y Patogenia Bacteriana

Manual de Laboratorio de Bacteriologa y Patogenia BacterianaINSTITUTO TECNOLGICO DE SONORADra. Ana Laura Miranda R. M.C. Jorge Alberto Robles M. - MADN. Maribel Castro U.

INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA

DIRECCIN DE RECURSOS NATURALES

DEPTO. DE CIENCIAS AGRONMICAS Y VETERINARIAS

MANUAL DE PRACTICAS DEL

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y PATOGENIA BACTERIANA

MC JORGE ALBERTO ROBLES MASCAREO

MC ANA LAURA MIRANDA ROMERO

MADN MARIBEL CASTRO URREA

DIRECTORIO

RECTOR

DR. ISIDRO ROBERTO CRUZ MEDINA

VICERECTOR ACADMICO

DR. JESUS HECTOR HERNANDEZ LOPEZ

VICERECTOR ADMINISTRATIVOMTRO. JAIME RENE PABLOS TAVARES

DIRECTOR ACADMICO

DIRECCIN DE RECURSOS NATURALES

DR. JAIME GARATUZA PAYANJEFE DE DEPARTAMENTO

CIENCIAS AGRONMICAS Y VETERINARIASPh.D. JAVIER ROLANDO REYNA GRANADOSINDICE

Pgina

INTRODUCCIN2

REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA BACTERIANA3

PRCTICA 1. Medidas de seguridad en el laboratorio de microbiologa5

PRCTICA 2. Morfologa microscpica y tinciones simples7

PRCTICA 3. Morfologa colonial y aislamiento por estra cruzada11

PRCTICA 4. Tincin de gram17

PRCTICA 5. Tincin de ziehl-nielsen20

PRCTICA 6. Tinciones selectivas23

PRCTICA 7. Aislamiento de hongos y morfologa colonial 26

PRCTICA 8. Cultivo de anaerobios34

PRCTICA 9. Uso de medios selectivos38

PRCTICA 10. Uso de pruebas bioqumicas43

PRCTICA 11. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos47

PRCTICA 12. Coleccin y envo de muestras al laboratorio51

PRCTICA 13. Anlisis bacteriolgico de procesos piognicos54

PRCTICA 14. Anlisis bacteriolgico de heces y orina57

PRCTICA 15. Anlisis bacteriolgico de rganos62

PRCTICA 16. Mecanismos de patogenicidad

PRCTICA 17. Anlisis bacteriolgico de alimentos para consumo animal66

BIBLIOGRAFA70

ANEXO 1. Lineamientos generales de laboratorios del itson 71

ANEXO 2. Riesgo biolgico73

ANEXO 3. Cuidados y manejo del microscopio75

ANEXO 4. Lavado, esterilizacin y desinfeccin de materiales 77

ANEXO 5. Tabla de interpretacin de prueba de sensibilidad a antimicrobianos 78

ANEXO 6. Formatos de reporte79

INTRODUCCIN

La adquisicin de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la Bacteriologa y Patogenia Bacteriana, tiene implcito para el facilitador del curso y el estudiante, el manejo de microorganismos potencialmente patgenos o patgenos para su salud. De ah que resulta indispensable la comunicacin clara y participacin responsable de cada uno de los integrantes del grupo con la finalidad de minimizar y controlar los riesgos biolgicos, fsicos y qumicos que se presentan en la realizacin de cada una de las prcticas que se describen en este manual.El Manual de Bacteriologa y Patogenia Bacteriana del Instituto Tecnolgico de Sonora tiene como objetivo ser una gua para el alumno y el facilitador del curso en el proceso de aprendizaje, da inicio con la presentacin de los lineamientos del Laboratorio de Bacteriologa y Patgena Bacteriana y se desarrolla de tal forma que permite al alumno construir su propio conocimiento a travs de la adquisicin de habilidades manuales, de observacin minuciosa y del conocimiento a un nivel descriptivo, por lo que al inicio las prcticas de laboratorio son muy sencillas y permiten la integracin gradual del conocimiento, hasta la participacin del alumno en actividades de campo como la toma de muestras, la integracin de la historia clnica, que implican el manejo y contacto con las diferentes especies animales, as como la interaccin con los productores para recabar la informacin necesaria, culminando en la aplicacin e integracin del conocimiento para llegar a un diagnstico definitivo. Se incluyen adems en las ltimas sesiones el manejo de pruebas semi automatizadas con principios biotecnolgicos, que tienen gran demanda por su precisin y rapidez, con esto se pretende brindar al alumno herramientas actualizadas y conocimientos de vanguardia para su posterior aplicacin en el rea mdica. LINEAMIENTOS INTERNOSDEL

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA BACTERIANAEste documento tiene como objetivo evitar los riesgos de exposicin y accidentes de contaminacin con microorganismos en el laboratorio.

1. Los maestros, alumnos de servicio social y estudiantes usaran siempre bata blanca, limpia, abotonada y de manga larga.

2. La tolerancia mxima para permitir el acceso de los alumnos al laboratorio es de 10 minutos.

3. Usar el cabello recogido, calzado cerrado. No se permitir el acceso con pantaln corto por riesgo de quemaduras y contaminacin.

4. Los alumnos deben tener las uas cortas, sin alhajas (anillos, reloj, pulsera, etc.)5. No se permite el uso de sombrero y gorras.

6. El alumno guardar sus objetos personales en las gavetas.

7. Est prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y masticar chicle en el laboratorio.

8. Apagar el telfono celular al ingresar al laboratorio, no se permitir su uso interno.

9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello, ojos, etc.

10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio y al trmino de la prctica.

11. Las cajas de petri y materiales de laboratorio contaminados se les retirara la cinta adhesiva y etiquetas y se colocarn en el rea sucia para su posterior esterilizacin y lavado.

12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarn en recipientes con desinfectante, en el rea sucia, para su posterior lavado.

13. Es requisito indispensable para el ingreso al laboratorio que el alumno lleve el manual de practicas correspondiente.14. En caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno dar aviso al maestro, quien evaluar la magnitud de la lesin y aplicar las medidas de seguridad necesarias para el caso.

15. El alumno dar aviso inmediato al maestro en caso de derramarse un cultivo viable o romperse una caja de petri. 16. Antes de salir verifique que las llaves de gas y agua estn bien cerradas.

17. Lavar perfectamente sus manos con agua y jabn y aplicarse el antisptico a disposicin antes de salir del laboratorio.

18. Los reportes de cada prctica se entregarn una semana despus de concluida, sin excepcin.

19. Los exmenes se aplicarn al inicio de cada prctica.

20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo previo a la realizacin de la prctica.

21. Todos los alumnos estn obligados a participar en el da asignado para la esterilizacin y limpieza de los materiales.ATENTAMENTE

Academia de Bacteriologa y Patogenia BacterianaPrctica 1

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGAINTRODUCCINAnte los mltiples casos que se han presentado de infecciones asociadas al laboratorio en los ltimos aos, organismos internacionales como la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), han recomendado tomar medidas preventivas para proteger la salud de los investigadores, tcnicos laboratoristas y estudiantes. Si se consideran estas medidas de seguridad el personal que trabaja en laboratorios de microbiologa puede minimizar el riesgo de infeccin.

Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de microorganismo en estudio, pues estos varan en su capacidad de producir infecciones. Algunos pueden ser inofensivos, otros pueden causar sntomas leves; otros ms pueden ser graves para la salud y los menos pueden tener una amplia capacidad de difundirse y causar brotes epidmicos. Esta gama ha permitido a los investigadores clasificar a los microorganismos en cuatro grupos de riesgo. Estos se han publicado en las Medidas de seguridad del programa de Microbiologa de la Organizacin Mundial de la Salud, (ver anexo 2).

COMPETENCIA: El alumno aplicar las medidas de seguridad que se han implementado en el laboratorio de bacteriologa y patogenia bacteriana para la proteccin de la salud y se comprometer a seguir los lineamientos marcados en el Manual de Laboratorios del ITSON.

DESARROLLO DE LA PRCTICA:Mtodos microbiolgicos

a) El alumno procesar la lectura sealada por el maestro en relacin al Riesgo Biolgico del Manual de Laboratorios del ITSON, as como la clasificacin de los microorganismos, las barreras de proteccin y el tipo de laboratorio. Se sugiere la lectura del Captulo I del libro Mtodos microbiolgicos de Collins (1989). b) El alumno identificar en el laboratorio las reas de trabajo, rea sucia y de lavado; adems del equipo y los materiales de bioseguridad, as como su uso.Equipo de bioseguridad.

Extintor

Materiales para bioseguridad

Guantes de asbesto

Guantes de latex

Cubrebocas

Lentes antisalpicaduras

Bata Desinfectantes y antispticosCofia

Depsitos de material punzocortante

Bolsas de residuos biolgico infecciosos

RESULTADOSLee y analiza en grupo el anexo 1 del lineamiento generales del laboratorio del itson y el anexo 2 de riesgo biolgico.ASIGNACIN

Elaborar un mapa conceptual sobre la importancia de la bioseguridad en la prevencin de enfermedades y accidentes dentro del laboratorio de microbiologa. Del capitulo I medidas de seguridad en laboratorio de Collins (1989). Prctica 2

MORFOLOGA MICROSCPICA Y TINCIONES SIMPLES

INTRODUCCIN

El microscopio es un instrumento que seguramente ha sido utilizado por los estudiantes en otros cursos, sin embargo se ha incluido en este curso para recordar su manejo y desarrollar la habilidad para trabajar con el objetivo de inmersin cuyo uso es obligado en la observacin de microorganismos y sus estructuras.

El microscopio compuesto es un instrumento de precisin que consiste en una serie de lentes diseadas y acomodadas para proveer las mximas amplificaciones posibles del espcimen que se va a observar. El aumento total que se puede alcanzar en un microscopio compuesto depende de la combinacin del ocular con el objetivo y se obtiene multiplicando el nmero de aumento del ocular por el nmero de aumento del objetivo. En el anexo 2, se pueden ver los cuidados y manejo del microscopio.Tratar de observar a los microorganismos con un microscopio ptico sin un contraste adecuado es casi imposible, ya que como los microorganismos estn compuestos sobre todo de agua, que es el medio en el que normalmente estn suspendidos, es como tratar de ver un objeto blanco sobre un fondo blanco. Las tinciones que se usan en microbiologa se desarrollaron para incrementar el contraste entre el espcimen y el fondo que lo rodea, ante la necesidad de poner de manifiesto la forma, tamao y agrupacin de las bacterias, as como sus estructuras. Fue Roberto Koch quien introdujo en microbiologa el uso de preparaciones fijas o permanentes (frotas), al dejar secar al aire las preparaciones en fresco y sin teir, para fijarlas qumicamente y teirlas despus con colorantes derivados de la anilina. En la actualidad, la mayora de las tcnicas de tincin usan frotis fijos que consisten en colocar sobre un portaobjetos, una suspensin de bacterias que se deja secar. A la preparacin as obtenida, se le pasa rpidamente sobre una flama para que el calor fije las clulas al portaobjetos. La accin desnaturalizante del calor deshidrata la suspensin y mata a la mayora de las bacterias, dejndolas en posibilidad de ser teidas posteriormente, as mismo, evita que las bacterias se desprendan del portaobjetos durante los diferentes procesos de tincin. Es importante saber que algunas bacterias pueden sobrevivir a la fijacin del calor, por lo que todo frotis fijo debe considerarse potencialmente infeccioso.

En el procedimiento de tincin se emplea un slo colorante. Una vez fija la preparacin, se le agrega la solucin colorante y se deja actuar aproximadamente un minuto, se enjuaga con agua para quitar el exceso de colorante, se deja secar y se procede a observar al microscopio.

Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina y que qumicamente estn constituidos por uno o ms anillos aromticos. Estos anillos aromticos presentan sustituyentes llamados cromforos que son responsables del color, formando los compuestos cromgenos. Estos cromgenos presentan adems, grupos ionizables llamados auxocromos que permiten unir el colorante a estructuras de carga contraria de clulas y tejidos. Sin estos grupos las soluciones coloridas no podran teir.Figura1. Colorante safranina

Fuente: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v10n3/larez.html

COMPETENCIA: El alumno diferenciar la forma y agrupacin microscpica de los microorganismos mediante el uso de tinciones simples y el microscopio compuesto.MATERIAL:

Microscopio de campo luminoso

Tela suave y papel seda

Aceite de inmersin

Lpices de colores

Soluciones de cristal violeta, azul de metileno, Verde de malaquita, safranina y fucsina bsica.

Cultivo de bacterias

Portaobjetos

Asa bacteriolgica

Mechero de Bunsen

Puente de coloracin.

MTODOS:

Antes de iniciar con los procedimientos de la prctica leer el anexo

1. Elaboracin de frotis a partir de un medio slido

-Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados

-Con el asa bacteriolgica o un gotero, coloca una pequea gota de agua en el centro del portaobjetos.

-Con el asa estril toma una pequea cantidad de crecimiento y con movimientos giratorios haz una suspensin homognea en la gota de agua, extendindola para formar una pelcula delgada.

Esterilice nuevamente el asa.

- Deja secar al aire el frotis

-Fija el frotis al calor pasando la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano. Es importante que la laminilla no se caliente demasiado pues podras calcinar a las bacterias modificando as sus caractersticas morfolgicas y tintoriales.

-Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto- Lavar con chorro de agua suave y escurrir

-dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X

2. Elaboracin de frotis a partir de medio lquido

- Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados.

- Sin poner agua, coloca con el asa estril dos o tres gotas del cultivo en el centro del portaobjetos y extindelas para formar una pelcula delgada y homognea.

- Deja secar al aire los frotis

- Fija los frotis al calor como se explico en el caso anterior.

- Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto

- Lavar con chorro de agua suave y escurrir

- Dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X

- Realizar los dibujos correspondientes de cada una de las observaciones realizadas, indicando formas y agrupaciones. Compara tus observaciones con la figura 2.ASIGNACIN:1. Incluir en el reporte los esquemas de las preparaciones observadas con los objetivos 10x, 40x y100x de cada uno de los microorganismos.

2. Investiga quien fue Roberto Koch y haz una resea de sus principales aportaciones a la microbiologa.

3. Investiga la forma, y caractersticas generales de los microorganismos que observaste e incluye la referencia de las fuentes consultadas.Prctica 3

MORFOLOGA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRA CRUZADAINTRODUCCINAdems del mtodo de las diluciones para aislar microorganismos, existen otros que son cualitativos, siendo el de la estra cruzada el ms comn. Este consiste en tomar directamente de la muestra que nos interesa, una pequea cantidad con ayuda del asa bacteriolgica que se deposita en la superficie del medio de cultivo slido; luego se hacen estras con movimientos sucesivos del asa hacia un lado y otro, a la vez que se recorre de una orilla hacia el centro de la placa. Este procedimiento es equivalente a las diluciones ya que cada vez que se va extendiendo el contenido microbiano a lo largo de la estra, llegar el momento en que an cuando se tenga en un principio una gran cantidad de organismos, se obtendrn colonias aisladas en algn punto a lo largo de la serie de estras. Un buen aislamiento en placa se dar cuando se obtengan colonias aisladas de microorganismos, con una distancia que nos permita distinguir y describir su morfologa colonial. La observacin cuidadosa de las colonias ha mostrado que las caractersticas morfolgicas suelen ser constantes el medio de cultivo usado y que stas varan en apariencia dependiendo del grupo microbiano. Esto ha permitido iniciar el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos sin llegar a ser una identificacin definitiva.

Las caractersticas que se toman en cuenta para describir la morfologa colonial son las descritas a continuacin y que se observan en la figura 2.Tamao: medir el dimetro en milmetros

Color: coloracin de la colonia y del medio de cultivo

Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares

Elevacin: pude ser plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada o crateriforme.

Bordes: pueden ser enteros, lobulados, ramificados, filamentosos, dentados o irregulares.

Superficie: puede ser lisa, rugosa o granular.

Luz reflejada: puede ser brillante o mate

Luz transmitida: puede ser opaca, transparente o translcida.

Consistencia: puede ser dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, mucoide o friable.

Figura 2. Morfologa colonial

FUENTECOMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para diferenciar las formas coloniales bacterianas y desarrollar las habilidades para poder llevar a cabo el aislamiento de bacterias por medio de la tcnica de estra cruzada.

MATERIAL:

Cajas petri con medios de cultivo:

1. Generales (Agar Nutritivo)

2. Diferenciales (Agar Sal Manitol, Verde Brillante y TCBS)3. Caldo tripticaseina de soya (medio lquido en tubo).4. Agar Nutritivo inclinado (en tubo).

Cultivos bacteriolgicos varios:1. Bacillus,

.- Escherichia coli,

- Klebsiella pneumoniae

2. Pseudomonas- Staphylococcus .

Cultivos de levaduras:

1. Torula sp,

- Sacharomyces.

Materiales:

Asa bacteriolgica

Portaobjetos

Mechero de Bunsen

Cubreobjetos

Chispa

Regla Gradilla

Bolsa de plstico transparentePuente para tincin

MTODO

Descripcin de la morfologa colonial.

1. Escoger 2 medios de cultivo diferentes y seleccionar una colonia aislada .

2. Medir cada una de las colonias (usar regla) y expresarlo en mm.

3. Describir el color de cada colonia.

4. Describir la forma, borde, elevacin y superficie de acuerdo a la gua anexa.

5. Observar la luz reflejada y transmitida a contraluz, sin abrir la caja de Petri.

6. Apreciar la consistencia tocando la colonia con el asa previamente flameada y enfriada.

I. Procedimiento para la siembra en estra cruzada.

NOTA IMPORTANTE: Sembrar y manipular los cultivos en un rea aproximada de 20 cm alrededor del mechero de Bunsen.No abrir la caja fuera de esta rea.

No hablar mientras siembres y manipules los cultivos.

1. Flamear y enfriar el asa bacteriolgica.

2. Tomar una pequea porcin de una colonia aislada.

3. Tocar el agar suavemente y deslizar el asa sin rasgarlo a manera de zigzag. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el nmero 1 (primer cuadrante).

4. Flamear al rojo el asa, enfriar y extender las ltimas lneas de siembra del primer cuadrante. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el No.2. (segundo cuadrante).

5. Repetir el mismo procedimiento segn se indica en el esquema, en el tercero y cuarto cuadrante.

6. Practica este procedimiento en las circunferencias anexas al final de esta prctica usando un lpiz.Figura 3. Tcnica de aislamiento por estra cruzada

7. Identifica las cajas con los siguientes datos:

Nmero de equipo.

Horario de laboratorio

Nombre del cultivo bacteriano.

8. Incubar las cajas hasta las 24 horas a 37C. (El maestro indicar el rea a usar de la incubadora).

9. Describir la morfologa colonial de una colonia aislada de cada una de las cepas bacteriolgicas que se proporcionaron.

10. Introducir las cajas de Petri en una bolsa de plstico (solicitarla en el almacn) y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin.

II. Siembra en medios slidos en tubo con agar inclinado1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada

2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera

3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo

4. Arrastrar el asa haciendo zigzag sobre la superficie del agar

5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el rea a usar de la incubadora)

6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin.III. Siembra en medio lquido1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada

2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera

3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo

4. Agitar el asa vigorosamente dentro del medio de cultivo

5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el rea a usar de la incubadora)

6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin

ASIGNACIN

1. Investiga al menos otros 2 mtodos de aislamiento de cultivos bacterianos.

2. Compara el mtodo desarrollado en la practica con los mtodos que investigaste, seala adems las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.

Prctica 4

TINCIN DE GRAM

INTRODUCCIN

En 1884 un mdico dans, Hans Cristian Gram, desarroll y public un mtodo de tincin que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriologa. La tcnica adems de revelar detalles referentes a la forma y agrupacin bacteriana, como cualquier otra tcnica de tincin, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas.

La diferenciacin de Gram se tiene en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solucin yodurada de potasio (lugol), como mordiente o mordente. Ciertas bacterias pierden la coloracin violeta rpidamente cuando se decoloran con alcohol etlico, en tanto que otras la pierden con ms lentitud. Despus de la decoloracin se usa un colorante de contraste que casi siempre es safranina. Las bacterias resistentes a la decoloracin conservan una tonalidad azul o morada clasificndose como Gram positivas. Las bacterias que no pueden retener la tincin con cristal violeta, toman la coloracin de contraste presentando una coloracin rosa o roja; a estas bacterias se les denomina Gram negativas. Es importante observar que la base de esta diferenciacin es ms bien la velocidad de decoloracin que una caracterstica absoluta de las bacterias, por lo que el procedimiento se debe realizar con mucho cuidado.

La afinidad tintorial mostrada por las bacterias Gram positivas y Gram negativas, se debe a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano rodeada de una membrana externa construida de fosfolpidos y lipopolisacrido.

La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de Gram no es de utilidad taxonmica, por ejemplo: las espiroquetas, micobacterias, clamidias, rickettcias y micoplasmas.

El mtodo de la tincin de Gram ha sufrido varas modificaciones y algunas de stas son incluso mejores que el mtodo original. Los objetivos principales para modificar la tincin han sido:

1.Obtener un colorante primario ms estable que el original, ya que ste se deteriora rpidamente

2.Reducir el tiempo requerido para completar la tcnica.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos necesarios para aplicar la tcnica de tincin de Gram en especies bacterianas conocidas y poder determinar si pertenecen al grupo Gram positivo o Gram negativo.

MATERIALSolucin de cristal violeta

Solucin de lugol

Solucin de alcohol-acetona

Solucin de safranina

Portaobjetos

Asa bacteriolgica

Mechero Bunsen

Microscopio

Aceite de inmersin

Cepas de Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus y Escherichia coli.Puente para tincinMTODOS1. Tincin de Gram

- Haga frotis de cada bacteria y fjelos a la flama del mechero, tome en cuenta el procedimiento a seguir si los hace a partir de medio slido o lquido.

- Cubra los frotis con la solucin de cristal violeta (colorante primario).

Deje actuar esta mezcla por 1 minuto.

-Escurra el exceso de colorante y lave con un chorro suave de agua.

-Sacuda la laminilla para evitar gotas gruesas de agua y aplique la solucin de lugol (mordente). Deje actuar por 1 minuto.

-Escurra el exceso de lugol y lave con un chorro suave de agua.

-Sacuda la laminilla y aplique el alcohol-acetona (agente decolarante) durante 3 a 5 segundos. Corte el proceso de decoloracin lavando con agua.

-Sacuda el frotis y aplique safranina (colorante de contraste) y djelo actuar por 10 -20 segundos.

-Lave por ltimo con un chorro de agua suave y deje secar el frotis al aire y use un papel absorbente presionando ligeramente sin tallar.

-Observe al microscopio con el objetivo de inmersin.

INFORME

1.Haga esquemas de las preparaciones realizadas con las cepas de referencia y anote el nombre de las bacterias, la forma, agrupacin y su reaccin de Gram.

2.Haga esquemas de las preparaciones de las mezclas de bacterias teidas.ASIGNACIN1. Explique cual es el paso crtico en la tincin de Gram.

2. Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la tincin de Gram.3. Anote cinco gneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram negativos.PRCTICA 5

TINCIN DE ZIEHL-NIELSEN

INTRODUCCINAdems de la tincin de Gram, hay otra tincin diferencial empleada en bacteriologa que es la tincin de Ziehl-Nielsen o cidorresistente. Esta tincin se fundamenta en que la mayora de las bacterias son decoloradas por una mezcla de alcohol-cido siendo la excepcin las de los gneros Mycobacterium y Nocardia. Estos gneros bacterianos forman un grupo de microorganismos que se definen, con base en sus propiedades tintoriales, como bacilos cido alcohol resistentes (BAAR). Son relativamente impermeables a los colorantes bsicos, pero una vez teidos, retienen fuertemente el colorante y resisten la decoloracin con solventes orgnicos acidificados. La propiedad de ser cido-alcohol resistente est determinada por la composicin de la pared celular, la cual adems de la peptidoglicana, est constituida por un alto porcentaje de glicolpidos hidrofbicos (ceras), como el cido miclico en Mycobacterium y el cido nocrdico en el gnero Nocardia. La presencia de estas cepas hidrofbicas previenen la penetracin de soluciones acuosas, siendo la causa de que estos microorganismos no puedan ser teidos por los mtodos convencionales como la tcnica de Gram.

En la actualidad la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnstico de Mycobacterium tuberculosis agente causal de tuberculosis, enfermedad granulomatosa crnica tanto del hombre como de los animales y cuya incidencia ha aumentado recientemente.

Es importante mencionar que en el anlisis de un frotis de material clnico sospechosos de contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo cido alcohol resistente tiene valor diagnstico ya que en la mayora de los casos no son abundantes. Sin embargo la interpretacin del hallazgo debe hacerse con cautela y con base en la historia clnica y otras pruebas de laboratorio, debido a la existencia de especies saprofitas de Mycobacterium y que podran conducir a un diagnstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias cido-alcohol resistente.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos para llevar a cabo la tincin de Ziehl-Nielsen sobre clulas bacterianas conocidas para poner de manifiesto las diferencias entre las bacterias cido alcohol-resistentes y las que no lo son.

MATERIAL:

Solucin fucsina fenicada

Solucin de alcohol cido

Solucin de azul de metileno

Puente de coloracin

Portaobjetos

Mechero de Bunsen

Microscopio

Asa bacteriolgica

Aceite de inmersin

Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus y Klebsiella

Montajes de Mycobacterium tuberculosis teidos con Zielh-Neelsen

MTODOS:

Tcnica de Ziehl-Neelsen.

1.Haga dos frotis con las cepas asignadas.

2.Deje secar los frotis al aire y fjelos con calor.

3.colocar papel filtro sobre el frotis

4.Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada.

5.Caliente suavemente con la flama del mechero hasta la emisin de vapores y mantenga la emisin durante cinco minutos.

NOTA: El colorante no debe hervir ni secarse, por lo que puede continuar agregando colorante conforme sea necesario.

6.Dejar enfriar

7.Escurra el exceso de colorante y retire suavemente el papel

8.lave con un chorro de agua suave.

9.Decolore exhaustivamente con alcohol cido, realizando dos decoloraciones de un minuto cada una

10.Lave con un chorro suave de agua.

11.Cubra el frotis con azul de metileno y djelo actuar durante un minuto.

12.Lave por ltimo con un chorro suave de agua y deje secar la preparacin.

13.Observe los frotis con objetivo de inmersin.

14.Describa la morfologa microscpica de las cepas a las que realiz la tincin y al montaje de Mycobacterium tuberculosis y realice esquemas de c/u de los frotis.Las bacterias cido alcohol resistentes (BAAR +) se tien de color rojo y las no cido-alcohol resistentes (BAAR -) de color azul.

INFORME1.-Describa la morfologa microscpica de las cepas a las que realiz la tincin de Ziehl-Nielsen y haga esquemas de cada uno de los frotis

ASIGNACIN1 Investigar Por qu es necesario calentar el colorante primario en esta tcnica?

2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser cido-alcohol resistente.PRCTICA 6

TINCIONES SELECTIVAS

INTRODUCCINMuchas estructuras bacterianas se pueden observar en condiciones adecuadas, sobre todo cuando se aplican ciertas tcnicas de tincin. Aunque algunos constituyentes celulares son comunes en todas las clulas, otros solo los poseen ciertas especies. Las tinciones selectivas se utilizan para poner de manifiesto estructuras celulares o bien para obtener informacin acerca de sus componentes a travs de su reaccin con los colorantes. En general las tcnicas de tincin se basan en el hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto tiene mayor grado de afinidad por los colorantes utilizados, que el resto de la clula. As se puede teir o poner de manifiesto estructuras como la cpsula, pared celular, material gentico, fimbrias o pilis, flagelos, endoesporas e inclusiones citoplasmticas.

Los colorantes cidos, que no tien a la clula, son a veces tiles para revelar las capas superficiales con bajo ndice de refraccin, como la cpsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo a las bacterias. La mayora de las cpsulas bacterianas estn compuestas por polisacridos mientras que otras son de naturaleza polipeptdica. La cpsula desempea un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patgenas, ya que les confieren propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de defensa de los organismos infectados. Las cpsulas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales, porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin al calor y el lavado las disuelven; por lo tanto, las tinciones negativas como la de rojo congo y la de tinta china o nigrosina donde no se tie la bacteria pero s su alrededor y no se usa el calor, ni sustancias qumicas fuertes, resultan ser la mejor opcin.

Las esporas bacterianas o endoesporas son estructuras producidas durante el ciclo de vital de ciertos gneros, que presentan una gran resistencia a agentes fsicos y qumicos debido al nmero y estructura qumica de sus cubiertas. Por sta misma razn, las endoesporas son impermeables a los colorantes y en una tincin normal, se observan como estructuras altamente refringentes y sin teir. Sin embargo cuando se aplica calor a un frotis cubierto de verde malaquita como en el caso de la tcnica de Schaeffer y Fulton, se facilita la penetracin del colorante. El lavado y teido posterior con safranina como colorante de contraste, permite ver a las endoesporas de color verde dentro de clulas rojas.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn y aplicaran los conocimientos para realizar algunas tcnicas de tincin selectivas y observar algunas estructuras bacterianas (cpsulas y endoesporas).

MATERIALSolucin de cristal violeta

Solucin de lugol

Solucin de alcohol-acetona

Solucin de verde malaquita

Solucin de safranina

Solucin de rojo congo

Solucin mordente de cpsula

Papel filtro

Agua destilada

Portaobjetos

Pinzas de diseccin sin dientes

Puente de tincin

Mechero de Bunsen

Asa bacteriolgica

Pizeta

Microscopio

Aceite de inmersin

Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus aureus MTODOSI. Observacin de cpsula

Tcnica del rojo congo

1. Coloque una pequea gota de rojo congo en el centro del portaobjetos.

2. Tome un poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae y suspndala en la gota de rojo congo, extindala hasta formar una pelcula delgada.

3. Deje secar al aire y NO FIJE EL FROTIS AL CALOR.4. Cubre el frotis con mordente de cpsula y djelo actuar por un minuto.

5. Lave el frotis con agua destilada y deje secar al aire.

6. Observe el portaobjetos con lente de inmersin.

7. Repita el mismo procedimiento con la cepa de Staphylococcus aureus.

8. Realice los esquemas de sus observaciones.

9. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco con desinfectante.

Figura 4. Estructura bacteriana Figura 5. Observacin microscpica de capsula

Fuente: www.alaquarium.com/bacterias

Fuente: ASM MicrobeLlibrary.org

II. Observacin de esporas.

Tcnica de tincin de Gram.

1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.2. Tia el frotis por la tcnica de Gram.

3. Observe el frotis con lente de inmersin.

4. Repita el mismo procedimiento con el cultivo de K.pneumoniae.

5. Realice los esquemas de sus observaciones.

6. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco con desinfectante.

Tcnica de Schaeffer y Fulton.

1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.2. Cubra el frotis con un papel filtro e imprgnelo con verde malaquita.

3. Caliente el frotis con el mechero hasta la emisin de vapores.

4. Mantenga la emisin por cinco minutos. Evite que el colorante hierva o se seque el frotis.

5. Deje enfriar y desprenda suavemente el papel filtro.

6. Lave el frotis exhaustivamente con un chorro de agua suave y sacdalo para eliminar el exceso de agua.

7. Cubra el frotis con safranina y djela actuar por un minuto.

8. Lave con un chorro de agua suave.9. Secar al aire la preparacin o con ligera presin con toallas absorbentes.10. Observe con lente de inmersin.Figura 6. Esporas bacterianas. A) subterminales b y c) centrales d) terminales Fuente: Johnson T. And Case C (1992).Figura 7. Esporas bacterianas.FuenteASIGNACIN

1. investigue cinco ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que tengan capsula.

2. investiga que compuestos qumicos pueden formar a las capsulas.

3. investigar tres ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que formen esporas.

4. investigar cuales son las partes que forman a una espora bacteriana.

PRCTICA 7

AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGA COLONIAL

INTRODUCCIN

Los hongos son organismos eucariticos unicelulares o filamentosos con paredes celulares compuestas de quitina y otros polisacridos, no fotosintticos, saprofitos o parsitos, quimiorganotrficos aerobios que se nutren por absorcin y se propagan por esporas producidas en condiciones normales de reproduccin sexual y asexual. Esta definicin tan vaga y amplia se hizo para abarcar todas las anomalas morfolgicas y fisiolgicas que ocurren entre los hongos.

La clasificacin de los hongos se basa en gran parte en las estructuras de reproduccin que incluyen la naturaleza del ciclo biolgico, las estructuras reproductoras y las esporas. Los principales grupos taxonmicos se basan en las esporas de reproduccin sexual. Aunque en un sentido sistemtico formal las levaduras no son diferentes del resto de los hongos, en la prctica es frecuente que stas se traten por separado de los hongos filamentosos tanto en los sistemas de clasificacin como de identificacin, ocurriendo lo mismo para otro tipo de hongos como son las setas. Algunos hongos presentan un comportamiento dimrfico, esto significa que pueden presentar una forma filamentosa y otra levaduriforme dependiendo del ciclo de vida, del hbitat en el que se encuentren o de las condiciones de cultivo.

Tradicionalmente los hongos se han separado en dos grandes grupos, los Mixomicetos y los Eumicetos. Los mixomicetos representan la lnea divisoria entre los protozoos y los hongos. Desde el punto de vista veterinario, los hongos tienen gran inters debido a que algunas especies causan enfermedades (micosis) y otras se desarrollan en el alimento para animales produciendo micotoxinas, que pueden provocar intoxicaciones alimenticias.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para llevar a cabo el aislamiento de hongos, y realizar la diferenciacin de las estructuras que los forman mediante una descripcin morfolgica tanto macroscpica como microscpica

MATERIAL

Cajas de petri con agar rosa de bengala

Cajas petri con agar dextrosa Sabouraud

Tubos de ensaye de 16 X 150 con 10 ml de formaldehdo al 10%

Asa en ngulo recto

Portaobjetos y cubreobjetos

Puente de coloracin

Solucin de lactofenol azul de algodn.

Barniz de uas transparente

Fenol al 3 %.

Algodn

Papel Kraft.

Microscopio

Cubrebocas

Guantes de latex

Jabn antisptico lquido verificar con Jorge si esta en el listado de uso del maestro.Cepas de Penicillium sp, Aspergillus sp y Sacharomyces cerevisae o Torula MTODOSPRIMERA SESION

Aislamiento de hongos

1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE.

2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo.

3. Esteriliza al fuego el asa doblada en ngulo recto (90) y toma un poquito del micelio areo.

4. Siembra el hongo por picadura en el centro de una placa de agar dextrosa Sabouraud.

5. Repite el mismo procedimiento con la placa de agar Rosa de Bengala.

6. Siembra el hongo levaduriforme (Sacharomyces o Torula) estriando sobre la placa de agar.(como en la prctica 3)

7. Sella las placas con cinta maskintape.

8. Incuba los medios de cultivo inoculados a temperatura ambiente durante 3 - 4 das.

9. Revisa los medios de cultivo cada 24 a 48 hrs.

10. Anota los cambios de forma y color que se presentan.

Observacin de la morfologa microscpica.1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE.

2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo.

3. Marca con lpiz de cera los portaobjetos y coloca en el centro una gota de lactofenol azul de algodn.

4. Haz una suspensin con un poquito del micelio revolviendo exhaustivamente para separarlo.

5. Coloca un cubreobjeto.

6. Observa con objetivos 10X y 40X.

7. Realiza los dibujos de las estructuras que observes.

8. Compara tus dibujos con los esquemas anexos.

9. Repite el procedimiento para la levadura, pero tiendo con Gram

SEGUNDA SESIN

1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE.

2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos que sembraste en la primera sesin y el mechero de bunsen.

3. Describe la morfologa colonial de los hongos, intercambindolos entre los equipos.

4. Describe las siguientes caractersticas y registrar conforme se pide en el cuadro siguiente. Cuadro 1. Caractersticas a evaluar de la morfologa colonial de los hongos.TamaoAspectoColor del micelio areoColor del micelio vegetativoProduccin y color del pigmento difusible

Mide en cm, el dimetro de la colonia fungal.

Observa la superficie del hongo, que puede ser; algodonoso, aterciopelado, grnulos o pulvurulento.Observa los cambios de color y descrbelos partiendo del centro a la periferia.Observa el grueso del agar y describe el color del crecimiento fungal.

Nota algn cambio de color en el medio de cultivo original.

5. Realiza preparaciones en fresco de los dos hongos seleccionados.

6. Coloca un poco de micelio areo en un portaobjetos que contenga una gota de lactofenol azul de algodn.

7. Dispersa el micelio en el colorante.

8. Cubre la preparacin con un cubreobjetos.

9. Observa la preparacin al microscopio usando objetivos seco dbil y seco fuerte.

10. Describe la morfologa microscpica considerando las siguientes caractersticas mostrados en cuadro 2 y compara con las figuras 8 y 9.Cuadro 2. Morfologa microscpicaDimetro de micelioTipo de micelio

Microsifonado, macrosifonado o cenoctico.Observa las hifas. Describe si son septados, ramificadas, pigmentadas o hialinas

Figura 8.Tipo de esporas y estructuras reproductoras. Fuente: Williams et. al (1997).Figura 9. Tipos de Hifas Fuente: Williams et. al (1997).

ASIGNACIN

1. Realice los esquemas de la morfologa colonial de los hongos que se observaron.2. Investigue en libros, revistas, artculos y fuentes confiables sus caractersticas y estructuras microscpicas.3. Realice esquemas de sus estructuras microscpicas.PRCTICA 8

CULTIVO DE ANAEROBIOS

INTRODUCCIN

Un factor que influye de manera importante en el crecimiento microbiano es el oxgeno y aunque es un gas muy reactivo, muchos microorganismos dependen de la disponibilidad del oxgeno molecular como nutriente. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo a sus necesidades y tolerancia al oxgeno en: aerobios estrictos, microaerofilicos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes. Los aerobios estrictos dependen del oxgeno, ya que lo utilizan como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria y no pueden llevar a cabo la fermentacin. Los microaerofilicos no requieren de oxgeno pero lo toleran a bajas concentraciones. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si est disponible, pero tambin pueden crecer en ausencia del mismo, ya que pueden realizar un metabolismo oxidativo o fermentativo dependiendo de las condiciones de cultivo. Los anaerobios estrictos no pueden utilizar el oxgeno ya que solo pueden efectuar un metabolismo fermentativo e incluso no crecen o mueren en presencia de oxgeno debido a que les resulta txico an a bajas concentraciones, mientras que los anaerobios aerotolerantes crecen a bajas o elevadas concentraciones de oxgeno aunque no lo utilicen en su metabolismo. An cuando la toxicidad del oxgeno se manifiesta claramente sobre los anaerobios, a concentraciones elevadas resulta txico incluso para los aerobios estrictos ya que el oxgeno es un agente oxidante fuerte, capaz de generar un grupo de radicales libres (singlete, superxido, perxido e hidrxilo), que reaccionan sobre molculas orgnicas. Los microorganismos que toleran el oxgeno, por lo general contienen enzimas que los protegen de la toxicidad como son la catalasa, peroxidasa y la superxido dismutasa.

Mientras que la aereacin se emplea para incrementar el crecimiento de los microorganismos aerobios, el oxgeno debe ser excluido del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxgeno molecular disuelto, eliminndolo. Por ejemplo, frecuentemente se aade tioglicolato de sodio, cistena u otros compuestos que contienen grupos sulfhidrilos. En los medios lquidos se suele burbujear nitrgeno, hidrgeno o bixido de carbono para desplazar al oxgeno y posteriormente se sella el recipiente para evitar que entre de nuevo el oxgeno. Adems, hay muchos modelos de cmaras de cultivo para anaerobios que se emplean para eliminar el oxgeno de la atmsfera. Estos modelos como el sistema GasPack, generan hidrgeno el cual reacciona con el oxgeno mediante un catalizador dentro de la campana produciendo agua; tambin se genera bixido de carbono para reemplazar el volumen de gas agotado por la conversin de oxgeno a agua. En todos estos mtodos es recomendable utilizar indicadores de oxido-reduccin como el azul de metileno y la resarzurina que permiten conocer las condiciones del sistema; en condiciones oxidadas los indicadores estn coloreados y en condiciones reducidas son incoloros. La cuantificacin del estado de oxidacin de un medio se expresa por la relacin del potencial de xido-reduccin (O/R). El potencial se puede medir utilizando electrodos y un potencimetro, cuando los valores son positivos significa que hay oxgeno disuelto en el medio y los compuestos orgnicos estn parcialmente oxidados, cuando son negativos significa que no hay oxgeno disuelto y los compuestos orgnicos estn reducidos.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para poner en prctica algunas tcnicas para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.

MATERIAL

Tubos de 16 X 150 con 5 ml de agua destilada estrilTubos de 16 X 150 con tapn de rosca con caldo tioglicolato

Tubos de 16 X 150 con tapn de rosca con caldo nutritivo

Pipetas Pasteur estriles

Cajas de petri con gelosa sangre

Plastilina

Muestra de material fecal animal

Cepas de Clostridium sp, Bacillus subtilis y Escherichia coliMTODOS

PRIMERA SESIN

1. Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal.

- Adicionar aproximadamente un gramo de muestra a un tubo con 5 ml de agua destilada estril, agitar y dejar sedimentar durante 10 minutos.

- Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estra cruzada en una placa de gelosa sangre.

- Agitar de nuevo el tubo y calentar la muestra a ebullicin por 10 minutos y dejar sedimentar otros 10 minutos.

- Sembrar otra placa con gelosa sangre.

- Incubar laS cajas en anaerobiosis a 37 C durante 40 horas.

2. Cultivo de bacterias anaerobias en medios lquidos.

- Inocular con ayuda de una pipeta Pasteur estril cada una de las cepas proporcionadas en los tubos con caldo tioglicolato y caldo nutritivo.

- Incubar a 37 C durante 24 - 48 horas.

3. Cultivo de microorganismos anaerobios por comensalismo.

-Divide una caja de gelosa sangre en dos y en un lado siembra una asada de Clostridium sp y del otro lado una asada de Bacillus subtilis.

-Sella con plastilina los bordes de la caja

-Incuba a 37 C durante 24 - 48 horas.

SEGUNDA SESIN

1.Describe la morfologa colonial de dos colonias aisladas a partir de la muestra de materia fecal y la morfologa microscpica utilizando la tincin de Gram.

2.Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en los medios lquidos y discute los resultados.

3. Observa el crecimiento de la bacteria anaerobia y de la aerobia y realice un frotis y tincin de Gram de cada uno. Haga esquemas.

ASIGNACIN1. Investiga en libros, revistas y artculos confiables al menos tres bacterias anaerobias de importancia en medicina veterinaria.2. Investiga los patrones de crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo de las bacterias anaerobias

PRCTICA 9

USO DE MEDIOS SELECTIVOS

INTRODUCCIN

Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy variados, lo cual hace necesario contar con una amplia gama de medios de cultivo. La seleccin de stos depende de la cantidad y variedad de microorganismos en la muestra a estudiar, del tipo de microorganismo que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar para que su abundancia no los encubra o dificulte el aislamiento.

Basados en la utilidad diagnstica de los medios de cultivo, es posible hacer la siguiente clasificacin:

Medios simples.- Son medios que promueven el desarrollo de microorganismos nutricionalmente poco exigentes. Estos medios reciben tambin el nombre de medios bsicos o generales. Se utilizan principalmente para muestreos de medio ambiente o superficies, anlisis cuantitativos y conservacin de cepas.

Medios enriquecidos.- Son medios que han sido suplementados con nutrientes que proporcionan factores de crecimiento para promover el desarrollo de microorganismos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios contienen generalmente uno o ms de los siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma lquido asctico, huevo carne vitaminas, aminocidos especficos, NAD o hemina, entre otros.

Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias inhibidoras para suprimir parcial o totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las sustancias utilizadas con mayor frecuencia son colorantes, sales inorgnicas, sales biliares, antibiticos y detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de grmenes patgenos a partir de muestras clnicas que contengan bacterias de la microflora normal.

Medios diferenciales.- Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar algunos gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico de sus colonias. La mayora de los medios selectivos son tambin diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar ENDO, agar eosina azul de metileno, agar Salmonella-Shigella, agar McConkey. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de lactosa (coliformes).

Medios de enriquecimiento.- Estos medios son lquidos y poseen efecto inhibitoria sobre ciertos gneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros que se encuentran en menor proporcin en la muestra. Son medios muy utilizados en la bacteriologa del tracto intestinal, principalmente para el enriquecimiento de Salmonella sp. a partir de muestras de heces en las cuales el nmero de salmonelas puede ser muy pequeo en comparacin al elevado nmero de bacterias que normalmente habitan el tracto intestinal. Estos medios se inoculan mediante un hisopo o bien depositando la muestra en el medio a una proporcin de 1:10, ejemplo, un gramo de muestra en 10 ml de medio, El perodo de incubacin de estos medios debe ser de 12-18 horas y es necesario resembrar a partir de ellos, en medios selectivos y diferenciales para identificar colonias caractersticas. Ejemplos de stos medios son el caldo selenito y el caldo tetrationato, medios de enriquecimiento para Salmonella sp.

Medios de transporte.- Son medios utilizados para el transporte de las muestras clnicas desde el lugar de su coleccin hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad de los microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. La composicin de este tipo de medios vara considerablemente de acuerdo al microorganismo cuya viabilidad se desea preservar. Estos medios pueden ser desde una simple solucin fisiolgica amortiguada, hasta medios ms complejos que contengan sustancias inhibidoras, agentes reductores, sustancias osmticamente activas (sacarosa), suero, etc. Algunos ejemplos de estos medios son: Medio de Stuart, medio de Carry-Blair, utilizados como medios de transporte de uso general para un gran nmero de bacterias aerobias y anaerobias. Medio Campy-thio y medio Clark-Dufty, diseados para preservar la viabilidad de Campylobacter sp. y la solucin amortiguadora de Bovarnyk, para preservar la viabilidad de Chlamidias y Riquettsias.

Medios especiales.- Son medios que no pueden ser fcilmente agrupados en alguno de los grupos de medios descritos anteriormente y la mayora son utilizados para comprobar una o ms caractersticas bioqumicas de los microorganismos.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para poder identificar diferentes tipos de medios de cultivo y su utilidad en el aislamiento e identificacin de bacterias.MATERIAL

Caja petri con agar Mac Conkey

Caja petri con agar eosina azul de metileno

Caja petri con agar Staphylococcus

Caja de petri con agar Sal y manitol

Tubo de 13X100 con caldo glucosado

Tubo de 13 X 100 con medio Stuart

Tubo de 16 X150 con Caldo bilis verde brillante al 2%

Cepas de Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Proteus sp y Staphylococcus aureus, Bacillus sp.

MTODOS

1. Medios de cultivo selectivos

1) Sembrar por estra cruzada la mezcla de bacterias (Gram + y -) proporcionada por el profesor en el Agar Sal y manitol y el Agar Verde brillante.

2) Sembrar por estra cruzada los cultivos puros antes mencionados en los medios de cultivo restantes, conforme lo indica las tablas 1 y 2 anexas.3) Identificar las cajas de petri y los tubos con el nombre del cultivo.

4) Formar un paquete con las cajas y los tubos sembrados para incubar a 37C durante 24-48 horas.

5) Observar el cambio de color que se da en los medios de cultivo, la morfologa colonial de los cultivos.

6) Interpretar los resultados, de acuerdo al tipo de medio de cultivo y el microorganismo sembrado, registra conforme se te pide en los cuadros 3 y 4.INFORME1) Describa la morfologa colonial de las cepas proporcionadas y sembradas en los diferentes medios de cultivo.

2) Indica los cambios de color que se aprecian en los medios de cultivo y a que se atribuyen.

3) Interprete y discuta los resultados.

4) Complete las tablas anexas con sus observaciones.ASIGNACIN: 1) Investiga la composicin qumica de los medios de cultivo lquidos y slidos que sembraste.2) Investiga y explica a que se atribuyen los cambios que observaste en los medios de cultivo conforme a la cepa bacteriana que sembraste en cada uno de ellos.

Cuado 3. Caractersticas y composicin qumica del medio de cultivo.Medio de cultivoColor del medio de cultivoIndicador que contiene el medioTipo de medio de cultivoCepa bacterianaForma de siembra en el medio de cultivo

Caldo glucosadoE.coli Salmonella

Caldo bilis verde brillanteE.coli

Medio StuartS.aureus

Mac ConkeySalmonella

Verde brillanteMezcla de bacterias

Eosina Azul de metilenoProteus

A.Estafilococcus 110.S.aureus

Sal y manitolMezcla de bacterias

Agar nutritivo Bacillus

Cuadro 4. Cambios del medio de cultivo y morfologa bacterianaMedio de cultivoCepa bacterianaMorfologa colonialForma y agrupacin bacteriana y tincin de GramModificacin en el medio a las 24 hrs de cultivo

Caldo glucosadoE.coli Salmonella

Caldo bilis verde brillanteE.coli

Medio StuartS.aureus

Mac ConkeySalmonella

Verde brillanteMezcla de bacterias

Eosina Azul de metilenoProteus

A.Estafilococcus 110.S.aureus

Sal y manitolMezcla de bacterias

Agar nutritivoBacillus

PRACTICA 10

USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

INTRODUCCIN

La identificacin de una bacteria a partir de una muestra clnica exige su aislamiento en cultivo puro, de ah que es muy importante la tcnica d siembra y el uso de diferentes medios de cultivo. Sin embargo el crecimiento de las bacterias implica necesidades de ciertos nutrientes para llevar a cabo su metabolismo, el cual puede variar segn el tipo de bacteria de que se trate, de ah el uso de una gran variedad de pruebas bioqumicas que miden la presencia o ausencia d enzimas que participan en el catabolismo del sustrato que se aade al medio diferencial.

Muchas de estas pruebas se leen mediante los cambios de color que se producen en los medios de cultivo por la presencia de indicadores de pH. As se usan medios diferenciales como por ejemplo: el caldo rojo de fenol, al cual se le adicionan carbohidratos (glucosa, trehalosa, maltosa, fructosa) para valorar la fermentacin de azucares mediante la observacin de burbujas de gas de hidrogeno o dixido de carbono atrapadas en un vial invertido y la acidificacin del medio original se har evidente por el viraje de color rojo original a amarillo.

Existe una gran variedad de pruebas bioqumicas que auxilian al mdico clnico o al microbilogo en la identificacin del gnero y la especie del agente patgeno presente en una muestra clnica, esto es de gran importancia, pues con la correcta interpretacin de estos hallazgos podr confirmarse el diagnstico del agente causal de la enfermedad y con ello podrn adoptarse las medidas teraputicas y preventivas idneas segn el caso.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para identificar, inocular e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin bacteriana.

MATERIALTubos de 13x100 con medio SIM

Tubos de 13x100 con citrato de Simmons

Tubos de 13x100 con caldo glucosado

Tubos de 13x100 con medio TSI

Tubos de 13x100 con agar urea

Portaobjetos

Solucin de rojo de metilo

Solucin de alfa-naftol

Solucin de KOH o KOH al 40 %Solucin de KOH al 3%

Reactivo de Kovac`s

Cepas bacterianas de: E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp, Proteus sp, Streptococcus sp y Staphylococcus aureus

METODOS

1. Prueba para confirmacin de la tincin de Gram o de KOH al 3%

Esta prueba consiste en colocar sobre un portaobjetos una gota de KOH al 3% y con el asa hacer una suspensin de la colonia de bacterias a probar

Mezclar con movimientos giratorios de 1 a 3 minutos

Separar el asa de la mezcla, si se forma una hebra o hilo viscoso, indica que se trata de bacterias Gram negativas, si esto no sucede, se tratar de bacterias Gram positivas

Realiza esta prueba con diferentes cultivos Gram + y

Diagrama 1. Pruebas Bioqumicas Gram. (+)

Diagrama 2. Pruebas Bioqumicas Gram (-)

2. Pruebas bioqumicas para bacterias Gram negativas

2.1. Medio TSI

Sembrar por picadura y estra en la superficie de los tubos de TSI cada una de las cepas proporcionadas

Incubar los tubos a 37C durante 24 horas

Observar e interpretar los resultados como sigue:

a) Fermentacin de glucosa: color amarillo en el fondo del tubob) Fermentacin de lactosa: color amarillo en la superficie del medioc) Produccin de gas: burbujas en el fondo del tubod) Produccin de cido sulfhdrico: precipitado de color negro en el fondo del tubo 2.2. Prueba de rojo de metilo y Vogues-Proskauer

Sembrar en dos tubos de caldo glucosado o medio RM-VP las cepas proporcionadas

Incubar a 37C durante 24-48 hrs

Observar e interpretar los resultados como sigue:

a) Prueba de rojo de metilo: Aada al tubo 5 gotas del reactivo rojo de metilo y sin agitar observe la presencia de un anillo de color rojo en la superficie del medio; la prueba ser negativa cuando no exista el color rojob) Prueba de Vogues-Proskauer: Aada al tubo 6 gotas de alfa-naftol y dos gotas de KOH creatina, agitar suavemente y dejar reposar el tubo de 10 a 15 min. La prueba positiva ser la aparicin de color rojo en la superficie del tubo y en la negativa no hay coloracin roja2.3. Utilizacin de citrato

Sembrar un tubo de citrato de Simmons por estra en la superficie, para cada cepa proporcionada

Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs.

Observar e interpretar el resultado como sigue: El crecimiento y vire del indicador de verde a azul, significan que el microorganismo dio la prueba a la utilizacin del citrato.

2.4. Medio SIM

Sembrar por picadura utilizando el asa recta, un tubo con medio SIM para cada cepa proporcionada

Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs

Observe e interprete los resultados como sigue:

a) Produccin de cido sulfhdrico: precipitado de color negro

b) Movilidad: positivo si hay turbiedad, e inmvil si solo hay crecimiento en la picadura

c) Produccin de indol: Aada 5 gotas de reactivo de Kovacs, la coloracin roja indica que la prueba es positiva.

2.5. Produccin de ureasa

Siembre el agar inclinado una asada de cultivo abundante sobre la superficie

Incube a 37C de 1 a 7 das

La reaccin positiva se observa al virar el medio a un color rosa intenso

Si no hay cambios en el medio de cultivo, es negativo

3. Pruebas bioqumicas para bacterias Gram positivas3.1 prueba de catalasa: Esta prueba es muy til para la diferenciacin de los estreptococos de los estafilococos y micrococos

- Sobre un portaobjetos colocar una gota de perxido de hidrgeno al 3%, y con el asa tomar una de las colonias

- Mezclar la colonia con la gota con movimientos giratorios

- La lectura se hace inmediatamente, si aparece un burbujeo la prueba es positivaNOTA: Pueden presentarse falsos positivos si la colonia se toma de un medio adicionado con sangre

3.2 Prueba de coagulasa

- Tomar con el asa aproximadamente 5 colonias del medio de Baird Parker e introducirlas en el vial que contiene el plasma hidratado e incubar a 37C de 1 a 3 hrs

- Evitar agitar el tubo para observar la formacin del coagulo, se considera la prueba positiva si el contenido del tubo en ms de tres cuartas partes presenta la formacin de un coagulo compactoSegunda sesin: Interpreta segn la prueba realizada, revelando las reacciones bioqumicas, a travs de los cambios en medio utilizados. INFORME

Haga una tabla donde coloque los resultados de las pruebas bioqumicas de las cepas utilizadas en la prctica.Defina conforme las reacciones bioqumicas observadas y su morfologa al menos el genero de los microorganismos analizados.ASIGNACIN

Investiga las reacciones bioqumicas en fuentes confiables (Libros, Revistas, Pg. Web y Artculos) de las cepas bacterianas que utilizaste en la prctica.

PRCTICA 11

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

INTRODUCCIN

La observacin del afecto inhibidor de algunos microorganismos sobre otros data desde 1874. Pasteur y otros investigadores observaron que infectando a un animal con Pseudomonas aeruginosa, lo protega contra Bacillus anthrasis.

Posteriormente se us el trmino antibiosis para explicar el efecto de inhibicin sobre otros microorganismos y el trmino de antibitico para la sustancia que causa tal efecto. Este fenmeno puede apreciarse al realizar pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Las pruebas de uso ms comn y comercial son las de difusin en agar, en las que se aplica una fuente de antibitico a una superficie de medio slido: el agente difunde a travs del medio inhibiendo el crecimiento del microorganismo sensible. Sin embargo, en la actualidad se conocen varios factores que pueden influir en el tamao de la zona de inhibicin.

Ejemplo: 1) Los componentes del medio de cultivo: Ingredientes como la peptona, triptona y extracto de levadura, pueden variar en su contenido mineral, y minerales como el calcio, magnesio y el hierro, disminuyen la actividad de los aminoglucsidos y aumentan el efecto del cido fusdico. Otro ejemplo es el efecto de los carbohidratos sobre la ampicilina y la furantona.

2) Efecto del pH: La actividad de los aminoglucsidos se ve aumentada en medio alcalino; as como la presencia de dixido de carbono en la estufa y carbohidratos fermentables en los medios de cultivo, pueden inducir condiciones cidas.

3) Tamao del inculo: Se ha observado que las siembras densas disminuyen en algn grado las zonas de inhibicin, por lo que los cultivos en caldo y las suspensiones en medio slido se pueden diluir para obtener el inculo idneo.

Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el mtodo de difusin en agar, son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes agentes quimioteraputicos (sensidiscos). Estos discos se colocan sobre la superficie del agar previamente sembrado con la cepa problema. Despus de la incubacin, se observan zonas o halos de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con los quimioteraputicos, a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la cepa bacteriana es resistente, se presenta crecimiento alrededor del disco.

El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la seleccin de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que resulta difcil predecir la susceptibilidad con base a la experiencia clnica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a ciertos antibiticos son ahora resistentes, debido principalmente a la amplia distribucin de plsmidos de resistencia mltiple.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para realizar e interpretar las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos por difusin en agar

MATERIAL

Colorantes para tincin de Gram.

2 portaobjetos.

Cajas petri con agar Mueller-Hinton

Hisopos estriles

Discos de papel filtro impregnados con quimioteraputicos

Frascos de alcohol

Pinzas y gradillaMechero Bunsen

2 tubos con Solucin salina fisiolgica

Tubo 0.5 de la serie de Mac Farland.

Cepas crecidas de Escherichia coli y Staphylococcus aureusMTODOS- Realice una tincin de Gram de una colonia caracterstica de E.coli y S. aureus.PREPARACIN DE INOCULO:- Tome varias colonias (2-3) caractersticas de E .coli y suspndalas en una tubo con sol. Salina fisiolgica homogenizando con movimientos suaves para evitar derrames.- Compare la turbidez de esta suspensin con la turbidez del tubo 0.5 de Mac. Farland.- Ajuste la turbidez si es necesario adicionando una colonia ms. - Repita este mismo procedimiento con la cepa de S.aureus. INOCULACIN DE LAS PLACA DE MUELLER HINTON:- Humedezca un hisopo en la suspensin de la cepa de E. coli y exprima el exceso en las paredes del tubo.

- Inocule una placa de agar Mueller-Hinton sembrando en toda la superficie del agar con el hisopo y permita que la placa seque de 3 a 5 minutos.

- Coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar ayudndose con la pinza previamente flameada en alcohol y presinalos ligeramente para poner en contacto el antibitico con la cepa.

- Repita el procedimiento anterior, con la cepa de Staphylococcus aureus.- Incube las placas a 37C durante 24 horas- Mida (en mm) el dimetro de inhibicin del crecimiento producido por cada antibitico y anote los resultados.- Interprete segn la tabla 1. Interpretacin de antibiograma segn los halos de inhibicin.Tabla 1. INTERPRETACIN DE ANTIBIOGRAMATABLA DE INTERPRETACIN DE ANTIBIOGRAMA

R=resistente; I=intermedio; S=sensible

Abreviatura Agente antimicrobiano Contenido del discoDimetro de halo de inhibicin en mm

R I S

AKAmikacinaEnterobacteriaceae 30 g 17

AMAmpicilina10g

Enterobacteriaceae 30 g 17

Staphyloccocus spp 29

Enterococous spp 17

Streptococcus spp - - >24

CBCarbencilina100g

Enterobacteriaceae < 19 20-22 >23

Pseudomonas aeruginosa 17

CFCefalotinaEnterobacteriaceae 30 g 18

FEPCefepimeEnterobacteriaceae 30 g 18

CTXCefotaximaEnterobacteriaceae 30 g 23

CAZCeftazidimaEnterobacteriaceae 30 g 18

CROCeftriaxonaEnterobacteriaceae 30 g 21

CXMCefuroximaEnterobacteriaceae 30 g 23

CLCloranfenicolEnterobacteriaceae 30 g 18

DCDicloxacilina 1 g

Staphyloccocus spp 13

ENXEnoxacinaEnterobacteriaceae 30 g 18

EEritromicina 15 g

Enterococcus spp 23

GEGentamicinaEnterobacteriaceae 10 g 15

LEVLevofloxacinaEnterobacteriaceae 5 g 17

NETNetilmicinaEnterobacteriaceae 30 g 15

NFNitrofurantoinaEnterobacteriaceae 300 g 17

PEFPefloxacina5 g 23

PEPenicilina10U

Staphyloccocus spp 29

Enterococcus spp 15

N. gonorrhoeae 47

Streptococcus spp - - >24

TETetraciclinaEnterobacteriaceae 30 g 19

SXTTrimetoprim-sultametoxazol 25 g 16

NORNafloxacina5 g 21

Ceptioflur 21

ENREnrofluxacina 5 g 22

Florfenicol 21

CIPCiprofluxacin5 g 21

INFORME1.Anote el resultado de la actividad de los antibiticos en placa sobre E. coli y S. aureus en la tabla siguiente.Tabla 2. Actividad de los antibiticos sobre E. coli y S aureus.ANTIBITICO

Nombre / abreviaturaE. coli

Medida en mm del haloSensibilidad

R=resistente; I=intermdio; S=sensibleS.aureus

Medida en mm del haloSensibilidad

R=resistente; I=intermdio; S=sensible

2.Mencione aquellos antibiticos con mejores resultados de inhibicin para cada cepa bacteriana y si se trata del mismo antibitico o no. Explique porqu. Fundamentado con investigacin confiable (libros, artculos, revistas). ASIGNACIN: Investigar acerca de las consecuencias del uso irracional de los antimicrobianos en los animales en produccin y elabora un ensayo. (Incluye las copias de la fuente de informacin).

PRCTICA 12

COLECCIN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO

INTRODUCCIN

La bacteriologa y micologa clnicas se encargan del estudio de las muestras de pacientes de los cuales se sospecha una enfermedad infecciosa. El laboratorio de bacteriologa y micologa veterinaria puede apoyar al mdico veterinario de la siguiente manera:

Confirma el diagnstico presuntivo

Sugiere la quimioterapia de la enfermedad

Colabora en el conocimiento epidemiolgico de las enfermedades

Permite la elaboracin de productos biolgicos como las bacterinas

Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as como la rapidez con que stos sean obtenidos, no dependen solo de los mtodos de laboratorio empleados, sino tambin de la forma en que sean colectadas y envidas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la flora microbiana normal, por la migracin bacteriana post-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de la muestra. El mdico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretacin de los resultados obtenidos por el laboratorio.

Los problemas que con mayor frecuencia se presentan en la identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son:

Envo de muestras no representativas de la enfermedad en cuestin

Toma de muestras sin asepsia

Envo de muestras en condiciones inadecuadas

Falta de historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo

Por lo tanto, es indispensable tener conocimientos previos sobre la correcta obtencin y envo de muestras al laboratorio. A continuacin se enlistan algunas normas generales:

1. Tomar la muestra del sitio anatmico ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad.

2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern tomarse dentro de las tres primeras horas de ocurrida la muerte o sacrificio.

3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de asepsia. Tanto el material de coleccin como el recipiente en que la muestra sea transportada debern ser estriles. Este ltimo preferentemente debe tener un tapn de rosca.

4. Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con desinfectantes

5. Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal, as como la direccin, telfono y nombre del propietario

6. Una vez colectadas las muestras deben enviarse al laboratorio dentro de las siguientes 4-24 hrs, en hielo o congelantes, en cajas de poliuretano

7. Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de muestras, estas deben enviarse en medio de transporte (Stuart, Cary-Blair, etc)

8. Debe de anexarse la historia clnica completa que incluya: La hora de coleccin de la muestra, hora de la muerte del animal (si es el caso), nmero de animales infectados, signos y lesiones que presenta el animal; adems si el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos (cual) y el diagnstico presuntivo.

9. Es muy importante hacer notar que el manejo de las muestras debe realizarse con precaucin, ya que algunos agentes causantes de las enfermedades infecciosas de los animales, constituyen un riesgo para la salud humana.

COMPETENCIA: Los alumnos desarrollaran las habilidades necesarias para seleccionar los procedimientos ms adecuados de la toma y envo de muestras para su envo al laboratorio de diagnstico bacteriolgico.

MATERIAL

Tubos con medio de transporte Stuart

Hisopos estriles

Jeringas desechables estriles

Bolsas de plstico estriles

Recipiente estril para muestra de orina

Guantes de ltex

METODOS

1. Asignar a cada equipo el tipo de muestra que deber traer, de que forma la podr colectar y la forma de transportacin al laboratorio. Es indispensable que provenga de un animal enfermo.Para realizar prctica 13 anlisis bacteriolgico de procesos biognicos Muestra 1: Pus, abscesos, exudado de heridas, hisopos nasales, hisopos auditivos, exudados farngeos, segn lo asignado por el maestro. Farngeo

Exudados nasal

Auditivo

Para realizar prctica 14 anlisis bacteriolgicos de heces y orina Muestra 2: Orina o heces de cerdo, bovino o equino segn lo asignado por el maestroPara realizar prctica 15 anlisis bacteriolgico de rganos 12 Muestra 3: rganos afectados con lesiones visibles de la especie animal asignada por el maestro.

Corazn Rin

Pulmn rganos Intestino Hgado

Bazo

Linfonodulos

Cerebro

Nota: Las muestras correspondern a la solicitada por el maestro en el tiempo indicado para realizacin de cada una de las prcticas 13,14 y 15.

INFORME1. Anexe la historia clnica de la muestra en cuestin en el reporte.

2. Describa detalladamente los pasos seguidos para la toma y envo de la muestra que obtuvo para la prctica de anlisis bacteriolgico de productos biolgicos.ASIGNACINEntregar una secuencia fotogrfica numerada de los pasos de la toma de muestra, con la descripcin del procedimiento en cada imagen. La asignacin se entregar en un disco (por equipo).PRCTICA 13

ANLISIS BACTERIOLGICO DE PROCESOS PIOGNICOS

INTRODUCCIN

El estudio de la microflora normal o patgena de los animales o humanos, requiere de conocimientos previos sobre toma y envo de muestras al laboratorio, tipos de medios de transporte y de aislamiento de microorganismos, as como de antecedentes propios de los microorganismos que se deben estudiar. Para esta prctica se han seleccionado algunos productos biolgicos a estudiar y se hace referencia a los posibles microorganismos involucrados en procesos infecciosos.

Procesos piognicos: Son aquellas infecciones asociadas a microorganismos que estimulan la formacin de pus, que se forma po la acumulacin de leucocitos y restos del microorganismo. Dentro de los procesos infecciosos quedan incluidos los abscesos que son una forma de inflamacin localizada y llena de pus, la mayora estn rodeadas de tejido conectivo, capilares proliferantes y leucocitos. Las manifestaciones clnicas asociadas a la presencia de abscesos dependen de su localizacin y etiologa. Hay abscesos que no son detectados, sino hasta el momento de la necropsia, por ejemplo: abscesos hepticos, cervicales, etc. Mientras que otros producen un malestar generalizado en el animal, como los abscesos en la cavidad oral, pulmn, etc.

La etiologa de los procesos piognicos puede ser muy variada, sin embargo, la ms comn es la bacteriana. Entre los microorganismos piognicos ms comunes se encuentran:

Aerobios y facultativos

AnaerobiosStaphylococus aureus

Actinomyces spp.

Streptococcus spp.

|Fusobacterium necrophorum

Corynebacterium spp.

Clostridium perfringens

Pseudomonas aeruginosa

Peptococcus spp.

Escherichia coli

Peptostreptococcus spp.

Proteus spp.

Propionibacterium spp.

Pasteurella multocida

Bacteroides spp.

Eubacterium spp

COMPETENCIA: El alumno enviara correctamente una muestra de un proceso piognico, para su estudio y seleccionar los materiales necesarios para el aislamiento e identificacin de un posible agente patgeno.MATERIAL

Hisopos estriles

Placas con agar sal manitol

Microscopio

Placas con agar sangre

Asa bacteriolgica

Pruebas bioqumicas para Gram (-)Mechero de bunsen

Agar TSI o Kliger

Puente de tincin

Agar urea de Christensen

Portaobjetos

Agar citrato de SimonsJeringa desechable

Medio SIM

Bolsas de plstico

Prueba de oxidasa

Encendedor de piedra

Reactivo de Kovacs

Regla

Hidrxido de potasio al 3 %

Tubos de solucin salina fisiolgica

Reactivo de rojo de metilo

Tubo 0.5 de serie de MacFarland

Agua destilada

Perxido de hidrgeno al 3%

Colorantes para t. De Gram

Pruebas bioqumicas para Gram (+)Sensidiscos para Gram + y

Prueba de oxidasa

Agar Mueller Hinton

Caldo urea o agar urea de Christensen

Pinzas y tijeras para flamear

Cloruro de sodio al 6.5%

Alcohol al 70%

Caldo sangrePapel Kraft

Metodologa para procesos piognicos:Primera sesin

Con un hisopo estril toma la muestra y depostala en el primer cuadrante de cada una de las placas de agar sangre y agar sal y manitol.

Con el asa bacteriolgica, completa la siembra aislando por estra cruzada e incuba las placas a 37 C durante 24 - 48 horas.

Segunda sesin

Describe en cada placa, la morfologa colonial de aquellas que sospeches sean causantes del proceso infeccioso.

NOTA: Considera a las colonias predominantes de un solo tipo.

Realiza un frotis de cada colonia y telos por Gram.

Si son bacterias gram negativas, siembra las pruebas bioqumicas e incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs.

Realiza un antibiograma.

Si son bacterias gram positivas realiza las pruebas bioqumicas e incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs.

Realiza un antibiograma.

Tercera sesin

Interpreta junto con el profesor los resultados de las pruebas bioqumicas y del antibiograma para identificar al microorganismo aislado y su sensibilidad a los antimicrobianos.

ASIGNACIN

1. Investiga en fuentes de informacin confiables, las caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas

2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo la descripcin de la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisin y tratamiento.

3. Incluye al menos dos referencias bibliogrficas consultadasINSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA BACTERIANA

PRCTICA 14

ANLISIS BACTERIOLGICO DE HECES Y ORINA

INTRODUCCIN

Muestras de orina: Las infecciones urinarias se diagnostican frecuentemente en los perros. Estas se presentan tambin en otras especies, pero por lo general no se envan muestras al laboratorio de estos animales. Algunos de los microorganismos que causan infecciones en los perros, pueden producirlas tambin en otras especies de animales domsticos. Ejemplos:

Perro

Bovinos

PorcinosProteus mirabilis

Corynebacterium renale

Eubacterium suis

Pseudomonas aeruginosa

C.renale

Staphylococcus aureus

Enterococcus

Escherichia coli

Enterobacter spp.

Streptococcus pyogenes

Streptococcus viridans

Corynebaterium renale

Las infecciones urinarias causadas por bacterias del gnero Leptospira, son por lo general enfermedades primarias de los animales, que en ocasiones pueden transmitirse al hombre. Algunas especies o serotipos importantes son:

Leptospira icterohemorragiae

Rata, ratones

L. canicola Perros, bovinos, porcinos, zorrillos, chacales.

L. pomona

Bovinos, porcinos, zorrillos,

mapaches, gato montes.

L. grippotyphosa

Mapache, ratn, zorro, ardilla,,

conejoL. hardjo

Bovinos.

El hombre puede adquirir la enfermedad a partir de animales infectados y aguas contaminadas. Los veterinarios y empleados del rastro se encuentran sujetos a mayor riesgo de adquirir la infeccin.

Para obtener muestras de orina se recomienda tomar en cuenta varias condiciones de bioseguridad como son el uso de bata abotonada, guantes, lentes y cubrebocas. Se puede realizar la puncin de vejiga, la cateterizacin de la uretra o durante la miccin. Para la obtencin de las muestras del tracto reproductor se pueden usar hisopos estriles para el tero, cuello o vagina y de semen en caso de machos, envindolas en un medio lquido, o en un medio de transporte. Las muestras de orina y de semen deben conservarse en refrigeracin.

Muestras de heces: Cuando existe una infeccin bacteriana del intestino, una de las primeras manifestaciones clnicas es la diarrea y ocasionalmente otros signos como deshidratacin, dolor abdominal, septicemia, toxemia y fiebre dependiendo del agente etiolgico, adems de la edad; la especie del animal y la resistencia individual. De acuerdo con la presentacin en el animal, la enteritis puede ser aguda o crnica. En la enteritis aguda la diarrea se presenta sbitamente, las heces son blandas y liquidas con olor desagradable y en algunos casos con moco o sangre abundante. La coloracin es variable dependiendo del agente etiolgico. A este tipo de diarreas se asocian las siguientes bacterias:

Escherichia coli

Salmonella spp.

Serratia spp.

Serpulina hyodisenteriae

Clostridium spp.

Candida spp.

Actinobacillus spp.

Campylobacter spp.

En la enteritis crnica la diarrea se caracteriza por ser de consistencia blanda, con o sin presencia de moco y por lo general su olor es normal. La prdida progresiva de peso y la emaciacin son frecuentes y generalmente no hay anormalidades sistmicas. A estas diarreas se asocian las siguientes bacterias:

Mycobacterium paratuberculosis

Proteus spp.

Pseudomonas

Candida spp.

Salmonella spp.

El diagnstico de los problemas entricos incluye el anlisis por parte del mdico veterinario de los cambios patolgicos funcionales en los animales, as como problemas de higiene en el manejo de excretas, agua y alimentos como posibles fuentes de contaminacin, y del anlisis bacteriolgico para determinar el agente infeccioso involucrado, con el fin de establecer un control epidemiolgico y evitar prdidas econmicas.

COMPETENCIA: El alumno una vez colectada la muestra, la transportara al laboratorio, para llevar a cabo el aislamiento e identificacin de un posible agente patgeno y determinar su sensibilidad a antimicrobianos.

Es indispensable que las muestras provengan de un animal enfermo, la muestra de orina debe ser turbia o sanguinolenta y las heces deben ser diarreicas.

MATERIAL

Hisopos estriles

placas con agar verde brillante

Microscopio

Placas con agar MacConkey

Asa bacteriolgica

Placas con agar sangre

Mechero de bunsen

Placas con agar Mueller-Hinton

Tubos con caldo lactosado

Puente de tincin

Tubos con caldo selenito

Portaobjetos

Pruebas bioqumicas para Gram (-)Encendedor de piedra

Agar TSI o Kliger

Agar urea de Christensen

Agua destilada

Agar citrato de Simons

Prueba de oxidasa

Medio SIM

Perxido de hidrgeno al 3%

Reactivo de Kovacs

Hidrxido de potasio al 3%

Reactivo de rojo de metilo

Colorantes para Tincin de Gram

Pruebas bioqumicas para Gram (+)Sensidiscos para Gram + y

Caldo sangre

Frascos de vidrio

Caldo urea o agar urea de Christensen

Pinzas para flamear

Cloruro de sodio al 6.5%

Alcohol al 70%

Carbohidratos, etc.

Muestras de orina

* Primera sesin

- Usando una pipeta Pasteur estril, inocula aproximadamente 1 ml de orina en un tubo con caldo lactosado e incuba a 37 C durante 18 - 24 horas. Del crecimiento obtenido, siembra una placa con agar verde brillante.

- Siembra con el asa 2 o 3 gotas de orina en una placa de agar sangre y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C por 24 - 48 horas.

* Segunda sesin

- Describe la morfologa colonial de al menos una colonia de las aisladas en las placas de agar sangre y verde brillante, haga los frotis respectivos y telos por la tcnica de Gram para describir la morfologa microscpica.

- Los aislamientos que resultaron simbrelos en los tubos para las pruebas bioqumicas correspondientes. * Tercera sesin

- Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y junto con apoyo del maestro identifica a nivel de gnero tus aislamientos.

- De las bacterias identificadas, selecciona una e inocula una placa de agar para realizar un antibiograma. Interpreta tus resultados a las 24 hrs.

3. Muestras de heces

* Primera sesin

- Siembra una asada de la muestra en la placa de agar Mac Conkey y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C durante 24 - 48 horas.

- Inocula aproximadamente 0.5 g de la muestra en el tubo con caldo selenito. - Incuba a 37C durante 18-24 horas y subcultiva en el medio de verde brillante sembrando por estra cruzada e incuba a 37 C durante 24 horas.

* Segunda sesin

- Describe el crecimiento microbiano en ambos medios de cultivo, selecciona una colonia de cada placa y anota las caractersticas de la morfologa microscpica de las colonias sembradas. Realiza un frotis y tilo con Gram, siembra las pruebas bioqumicas correspondientes.

* Tercera sesin

- Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y con apoyo del maestro, identifica a nivel gnero tus aislamientos.

- De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una placa de agar para realizar el antibiograma.

- Interpreta tus resultados a las 24 hrs.

ASIGNACIN

1. Investiga las caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas

2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluye la descripcin de la enfermedad, especies animales afectadas, modo de transmisin y tratamiento. Consulta al menos 2 autores.PRCTICA 15

ANLISIS BACTERIOLGICO DE ORGANOS

INTRODUCCIN

El anlisis bacteriolgico de rganos est recomendado cuando se sospecha de muertes por septicemia o por el hallazgo de lesiones macroscpicas en uno o varios rganos especficamente relacionados con alguna enfermedad. Ejemplo: en las neumonas (pulmn), enteritis (intestino), abortos (rganos fetales), encefalitis (cerebro), etc. La eleccin de las muestras depender de la experiencia del clnico, del diagnstico presuntivo y de los hallazgos a la necropsia.

El anlisis bacteriolgico y micolgico constituye en estos casos un apoyo en el diagnstico definitivo. Los siguientes son algunos ejemplos de microorganismos tpicamente asociados a septicemias:

Brucella spp

Erysipelothix spp.

Leptospira spp.

Haemophilus spp.

Pasteurella spp.

Bacillus anthracis

Clostridium spp.

Pseudomonas spp.

Listeria monocytogenes

Campylobacter spp.Salmonella spp.

Escherichia coli

Criptococcus spp.

Leccidioides spp.

Histoplasma spp

Blastomyces spp.COMPETENCIA:El alumno enviar una muestra de rganos afectados correctamente al laboratorio, y llevar a cabo la identificacin del agente bacter