Manual Bioquímica III

7/25/2019 Manual Bioqumica III

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}

Elaboracin

Licda. Eyda Menda de Campollo (QB)

Licda. Ana Ester Barrientos (QB)

Revisin

Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA)Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA)

2,016

Manual de prcticas de

BIOQUIMICA III


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REGLAMENTO GENERAL

MANUALDEPRCTICASBIOQUMICAIII

TERCERAO

QUINTO SEMESTRE

FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS

UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ DE

GUATEMALA

BASADO EN GUAS DE LABORATORIO I2QB3

FECHAS DE MODIFICACIN:AO 2008,AO

2011


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INDICE

NO.DE PRACTICA NOMBRE DE PRACTICA NO.DE HOJA

0 NORMATIVA DE LABORATORIO 31 CAPACIDAD BUFFER 13

2 SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE PROTENAS

EN SUERO Y PLASMA

21

3 COAGULACIN SANGUNEA 28

4 FUNCIN RENAL:DETERMINACIN DE

CREATININA

34

5 FUNCIN RENAL:DETERMINACIN DE UREA 39

6 DETERMINACIN ENZIMTICA DE CIDO RICO 44

7 EL ELISACOMO UN ANLISIS CUALITATIVO Y

CUANTITATIVO

50

8 DETERMINACIN CUALITATIVA DE TIROXINA Y

TRIIODOTIRONINA TOTAL

54

9 DETERMINACIN DE CORTISOL 60

10 DETERMINACIN FSHYLH 66

11 DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN DE

UNA PRUEBA CUALITATIVA

PRUEBA HCGDE EMBARAZO

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INTRODUCCIN AL TRABAJO DENTRO DEL LABORATORIO DE

BIOQUMICA

NORMATIVA DE COMPORTAMIENTO Y DE TRABAJO

Introduccin

Trabajar dentro de un laboratorio de cualquier ndole supone un grado de

responsabilidad del cual muchos estudiantes no estn conscientes. Es necesario

que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del laboratoriosepa comportarse de forma adecuada. Un mal comportamiento no solamente

tendr implicaciones disciplinarias, sino podra tambin tener serias implicaciones

de salud y seguridad. Es absolutamente necesario que tanto el instructor como

el estudiante que trabaja dentro del laboratorio sepan que una accin fuera del

comportamiento adecuado puede desencadenar un serio accidente que puede

afectar tanto la salud y seguridad propia como la de los dems. Para evitar

este tipo de situaciones, se ha diseado una prctica de introduccin para dar

a conocer al estudiante lo que se espera de l o ella durante el transcurso delos laboratorios.

Objetivos

Que el estudiante:

1.Conozca la responsabilidad que adquiere al trabajar dentro del laboratorio

de Bioqumica.

2.Conozca el trabajo que se espera de l o ella antes, durante y despus

de realizarse un laboratorio de Bioqumica3.Se comprometa con los Laboratorios del Instituto a guardar compostura

tanto en su rendimiento acadmico como en su comportamiento personal,

de manera que pueda obtener el mayor provecho de su experiencia en el

laboratorio.


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5

Alcance

Que el estudiante:

1.Conozca la forma de evaluacin dentro del laboratorio

2.Est consciente de las consecuencias de su calidad de trabajo en el

laboratorio

3.Conozca a cabalidad los aspectos que se tomarn en cuenta en la

evaluacin del laboratorio como parte del curso de Bioqumica.

Reglamento para el estudiante

Para que un estudiante tenga derecho a participar en las sesiones del

Laboratorio de Bioqumica, debe cumplir con las siguientes reglas:

1. Estar inscrito en el curso terico de Bioqumica III.

2. Guardar un comportamiento adecuado en las actividades del laboratorio,

adhirindose completamente al REGLAMENTO DEL LABORATORIOestablecido.

Puede encontrar una copia del REGLAMENTO DEL LABORATORIOen el apndiceal final de este manual. El faltar al reglamento tiene consecuencias que

pueden llegar hasta el retiro definitivo del laboratorio.

3. Asistir al laboratorio de manera PUNTUAL. El alumno que no se presente

puntualmente a la puerta del laboratorio, perder el derecho de presentar

examen corto. El alumno que se presente despus de haberse presentado

las instrucciones para el laboratorio, perder el derecho de ingresar a la

prctica.

4. De no asistir a una prctica, el alumno pierde automticamente el derecho a

presentar todos los componentes de la nota de esa prctica, teniendo un

cero inmediato. Sin embargo, si el alumno justifica su ausencia (razones

mdicas o por luto), la nota de ese laboratorio ser eliminada del promedio

para obtener la nota final. Independientemente que su ausencia sea


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6

justificada o no, es responsabilidad del alumno ponerse al da con el

contenido de la prctica perdida. Existe la opcin de reponer prcticas si

el alumno lo tramita con su instructor anticipadamente y si existe espacio

disponible para hacerlo.

5. Haber cumplido con las tareas preparativas de cada prctica, las cuales

incluyen, pero no se limitan a, la informacin solicitada en el cuaderno, una

lectura a conciencia de la prctica y cualquier investigacin previa que se

haya solicitado (ya sea escrita o no). Se practicar un examen corto al inicio

de la prctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y el

procedimiento a seguir. Queda a discrecin del instructor permitir la entrada

de un alumno que evidentemente no maneja el conocimiento previo requerido.

6. Utilizar su equipo de proteccin personal todo el tiempo que se encuentre

dentro de las instalaciones del laboratorio. Como equipo de proteccin

personal se incluye: bata larga (siempre cerrada), de manga larga, sin bolsas

en los costados y deber contar con su respectivo nombre y logo de la

Universidad, anteojos de seguridad y zapatos cerrados. El no cumplir con

esta regla es causa justificada para retirar a un alumno del laboratorio del

da, perdiendo el derecho a presentar examen, cuaderno, prctica y reporte.De reincidir, el alumno incluso puede ser retirado definitivamente de

laboratorio.

7. No llevar consigo bolsas, mochilas ni artculos de uso personal (celulares,

localizadores, joyas, etc.). De descubrirse que un alumno porta consigo una

de estas pertenencias, sta se confiscar y se devolver al final de la prctica.

No utilice su telfono mvil como calculadora; lleve la propia. El laboratorio

no se hace responsable de guardar ninguna pertenencia personal de los

alumnos durante la prctica. Es responsabilidad del estudiante asegurar suspertenencias personalesANTESde llegar al laboratorio.


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7

Trabajo antes de llegar al laboratorio:

El Pre-Lab

El laboratorio es un lugar donde nunca debe llegarse a improvisar. Es

necesario asegurar que el estudiante est familiarizado con el tema a tratarse

en el laboratorio, as como con el procedimiento que se seguir. Como ayuda

al estudiante, se ha diseado un cuestionario que llamaremos Pre-lab.

Responder el Pre-lab a conciencia tiene la ventaja de ayudar a un mejor

rendimiento para el examen corto que se realizar en cada prctica al inicio de

la misma.

El Pre-lab es un cuestionario que queda bajo la responsabilidad del estudiante

el resolver a conciencia para asegurarse que se comprender el trabajo que se

va a realizar durante el laboratorio. La resolucin escrita del Pre-Lab deber

entregarse al Instructor antes de empezar la prctica del da.

Para la presentacin del Pre-Lab se deber incluir:

- Revisin Bibliogrfica acerca de la prctica (No ms de una pgina)

- La importancia Clnica-medica que tiene la prctica

- Cuestionario

- Referencias Bibliogrficas

Trabajo dentro del Laboratorio

Como se indic anteriormente, se espera que el estudiante haga su mejor

esfuerzo para aprovechar al mximo el recurso que se tiene en el laboratorio.

El trabajo que se realice dentro del laboratorio deber ser registrado por cadaestudiante a manera de poder comprobar qu se hizo, cmo se hizo y cundo

se hizo. Para este propsito, es necesario la realizacin de un examen corto

y que cada uno lleve un cuaderno de laboratorio.


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8

oExamen Corto

Al inicio de cada laboratorio se realizar un examen corto que evidenciar el

conocimiento con el que se prepar el estudiante para la prctica. El alumno

pierde el derecho a esta prueba si llega despus de iniciado el laboratorio.

oCuaderno de Laboratorio

El cuaderno de laboratorio est diseado para cumplir como evidencia del

trabajo que se ha realizado durante cada prctica de laboratorio. Lo ms

valioso de su cuaderno de laboratorio es el contenido. Aunque su presentacin

es importante, no es lo principal en un cuaderno de laboratorio, por lo que el

estudiante no debe temer a hacer cualquier anotacin dentro de su cuaderno

en cualquier momento.

Cada estudiante debe poseer un cuaderno de laboratorio que cumpla con

ciertas especificaciones establecidas. Si alguna persona desea usar el

cuaderno de laboratorio de otro curso que haya llevado previamente, puede

hacerlo siempre y cuando se identifique claramente el cuaderno (vuelto a

forrar si hay cambio en el color a usarse) y la seccin que se utiliza. No

puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultneos

en un mismo ciclo.Un trabajo que no puede leerse simplemente no tiene validez alguna, por

lo que se espera que el estudiante tenga un cuaderno tan ordenado como

sea posible, y sobre todo, legible. No se permitir el uso de lpiz o de

corrector en el mismo.

El cuaderno de laboratorio deber contener las siguientes secciones:

Seccin Contenido Valor1

Fecha de

realizacin

Indicar claramente la fecha en que se llevar a cabo la

prctica de laboratorio.

--

Encabezado Indicar claramente el ttulo de la prctica que se llevar a cabo

en el laboratorio y nmero de la misma.

--

Objetivos Enumerar de dos a tres objetivos a conseguir durante la

prctica. Incluir los presentados en la gua y dos personales

ms, distintos.

20


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9

Materiales y Reactivos Enumerar los materiales y reactivos que se requerirn durante

la prctica.

10

Toxicidades Para los reactivos, es necesario incluir la toxicidad del reactivo

que se manejar. Es de vital importancia incluir los efectos de

exposicin, forma de aplicar primeros auxilios y la forma

adecuada de desecho.

10

Clculos previos Cualquier clculo que sea necesario en la preparacin de

soluciones a usarse o de la muestra en s.

10

Reacciones Reacciones qumicas o bioqumicas involucradas en la prctica

de laboratorio.

10

Procedimiento Enumerar los pasos a seguir durante la prctica. Debe

indicarse claramente cada paso, incluyendo los pesos

preparativos involucrados. Debe incluirse al final un diagrama

de flujo para hacer ms fcil el seguimiento del procedimiento.

20

Tablas de resultados Se debe preparar por adelantado las tablas que se usarn para

registrar los resultados de la prctica.

20

Observaciones Es necesario que despus de anotar los resultados obtenidos

en la prctica, se anote tambin cualquier observacin que

posteriormente pueda explicar una alteracin en los resultados.No debe confiarse en la memoria ni debe recurrirse a papelitos

sueltos para anotar esta clase de informacin (Durante el

laboratorio)

--

Nota total del cuaderno de laboratorio 100

1Valor:Algunos rubros no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega puntos de

nota al laboratorio. Sin embargo, su ausencia s resta puntos de la nota del cuaderno

Trabajo posterior al laboratorio

La principal forma de evaluacin del trabajo hecho durante el laboratorio, as

como la comprensin obtenida despus de realizado el laboratorio, es el reporte

del mismo. En l de evidencia el nivel de comprensin y la calidad del trabajo

realizado por el estudiante.


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10

oReporte del Laboratorio

El reporte de laboratorio tiene doble funcin: permite al estudiante entrenarse

en el arte de la escritura cientfica y le brinda la oportunidad de demostrar qu

tanto aprendi durante la realizacin de la prctica. Para presentar un buen

reporte de laboratorio, el estudiante debe esforzarse en varios aspectos. Primero,

debe asegurarse que el contenido del reporte sea acorde al tema que se trat

en el laboratorio. Segundo, es necesario que muestre tanto una buena redaccin

como una buena ortografa. Como futuros mdicos, es importante que los

estudiantes ejerciten su habilidad de escribir bien, ya que forma parte de la

buena formacin de todo profesional.

El reporte debe contener las siguientes secciones:

Seccin Contenido Valor1

Encabezado Ver hoja 13. -

Resumen Se debe incluir de forma sintetizada lo realizado durante la

prctica, principalmente respondiendo las preguntas Cmo lo

hice?, Por qu lo hice? y A qu llegu?. Mximo 10 lneas.

10

Objetivos Se debe de escribir el o los objetivos principales de la prctica.

Recuerde que a partir de ellos, deber realizar sus conclusiones.

10

Resultados Debe presentar de la manera ms ordenada posible, los

resultados obtenidos en la prctica. Debe incluir: el nmero de la

tabla, el ttulo de la tabla entre comillas (). Debajo de la tabla,

incluir la fuente de los datos con tamao 8. Se de presentar en

tablas de fcil entendimiento a manera que alguien que no haya

estado en el desarrollo de la prctica pueda entenderlo con

facilidad. NO se aceptan resultados escritos a mano

20

Discusin de

resultados

Es la seccin en donde el estudiante debe discutir los resultados

obtenidos en la prctica. Por qu obtuve esos resultados,

posibles fuentes de error. Debe refutar su justificacin de fuentes

confiables.

30


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11

Conclusiones Como regla, no se puede concluir teora ni un asunto que no

haya sido incluido en la discusin. Es necesario haber discutido

un punto para poder concluir al respecto. Mnimo deben ser 3

conclusiones.

15

Anexo Debe incluir cualquier informacin adicional que complemente sus

resultados (datos o clculos) o discusin de resultados, as como

imgenes si usted lo desea.

5

Bibliografa Debe escribir toda fuente CONFIABLE que haya consultado para

justificar su discusin, todo de acuerdo a las normas de

laboratorio.

10

Nota total del reporte de laboratorio 1001Valor:Algunos rubros no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega puntos de

nota al laboratorio. Sin embargo, su ausencia s resta puntos de la nota del cuaderno

Formato para entregar el REPORTE DE LABORATORIO:

Hojas tamao carta, blancas.

Fuente: Arial 11.

Interlineado sencillo (1.0). Ttulo de las tablas Entre comillas.

Fuente de los datos obtenidos, Arial 8.

Los objetivos y las conclusiones, se deben escribir con vietas.

Si incluye imgenes en la seccin de ANEXOS debe colocar el nmero de la

figura, nombre y fuente y agregar descripcin, no se otorgara calificacin si la

imagen no tiene descripcin.

El reporte de laboratorio debe ser entregado durante el perodo de laboratoriosiguiente de realizada la prctica. Todo reporte debe presentarse escrito con

mquina de escribir o impreso. No se recibirn reportes parcial o totalmente

escritos a MANO (salvo excepciones precisas indicadas por su instructor), ni en

formato electrnico. Estos debern entregarse debidamente engrapados. Se


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entregar una hoja de control de entrega de reporte, donde se anotar

semanalmente la fecha en que se entreg el informe.

Toda aquella persona que se haya ausentado por cualquier motivo de una

prctica, NO TIENE DERECHOa entregar un reporte, sin importar si la falta ha

sido justificada o no. De ser justificada, la nota de dicho laboratorio se eliminar,

a manera de no ser tomada en cuenta en el clculo de la nota final. Sin

embargo, esto no quiere decir que el estudiante se libere de la evaluacin del

tema de la prctica durante las pruebas finales del laboratorio del curso. ES

RESPONSABILIDAD DEL ALUMNOinvestigar el tema tratado durante la prctica

que faltara, independientemente si la falta ha sido justificada o no.

IMPORTANTE: NOse tolerar ningn tipo de copia en los reportes de

laboratorio.

Cualquier indicio de plagio (reproduccin no autorizada de una publicacin,

palabra por palabra, incluyendo Internet) ser castigado con una nota de cero

en el reporte. Cualquier indicio de copia (entrega de reportes idnticos por parte

de dos o ms alumnos) ser evaluado como un cero para todos aquellos

estudiantes que tengan el reporte igual, sin importar quin lo gener ni quin lo

copi. Todo caso quedar documentado, y una reincidencia puede significar el

retiro definitivo del o los alumnos involucrados del laboratorio del curso.

Los reportes se corregirn durante la semana y se devolvern en la siguiente

semana. Si algn alumno tiene cualquier reclamo sobre la forma en que se ha

calificado su reporte, debe hablar con el catedrtico DENTRO DE LA PRIMERA

SEMANAdespus de haberlo recibido corregido. No se aceptarn reclamos

posteriormente.

Las actividades que se entreguen impresas debern de ir debidamente

identificadas de la siguiente manera:


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UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ

FACULTAD DE MEDICINA

BIOQUIMICA III

NOMBRE DE ALUMNO

CARN

SECCIN

NUMERO DE LA PRACTICA

NOMBRE DE LA PRACTICA

INFORMACIN SOLICITADA

Evaluacin de todo el trabajo del laboratorio

Al final del curso, la nota final de laboratorio se compondr de la siguiente

forma

Rubro a evaluar Puntaje

Exmenes cortos de laboratorio 4

Trabajo terico practico 3

Cuaderno de laboratorio 4

Reportes de laboratorio 4

Texto paralelo 1

Exmenes parciales de laboratorio 2

Examen final de laboratorio (Incluye los temas

vistos en todas las prcticas del laboratorio)

2

Total Nota de Laboratorio 20


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REALIZADO POR:LICDA.SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA/DRA.DORA INS

MAZARIEGOS CORDERO

PRCTICA NO.1

CAPACIDAD BUFFER

Introduccin

El papel de las soluciones buffer son de gran importancia no solamente para

el organismo sino para el trabajo dentro del laboratorio. El pH de los diferentes

fluidos orgnicos vara grandemente. Por ejemplo, el jugo gstrico se encuentra

en el rango de pH 1 y no se regula en gran manera, mientras que el pH de la

sangre ronda los 7.40 y es uno de los parmetros ms regulados del organismo.

Para cumplir esta regulacin, el organismo se vale de las propiedades de algunos

compuestos qumicos que tienen capacidad de resistir cambios de pH drsticos

por la adicin o remocin de iones H+. Estos compuestos forman las conocidas

soluciones buffer, de gran importancia dentro del organismo.

Esta prctica ayuda al estudiante a darle un significado ms all que el

puramente terico a la existencia y comportamiento de las soluciones buffer, as

como a sus propiedades. El significado del pK de disociacin pasa de ser un

valor numrico a un valor prctico que el cuerpo usa en la regulacin del pH.

El principal propsito de esta prctica es ilustrar al estudiante a visualizar algunos

procesos, en su versin simplificada, que se llevan a cabo dentro del organismo.

Objetivos

Que el estudiante

1.Conozca las propiedades de las soluciones buffer y la importancia de su

rol dentro del organismo y dentro de las actividades del laboratorio deBioqumica.

2.Determine el valor de pK de disociacin de un cido dbil (KH2PO4).

3. Identifique una solucin con mejor comportamiento de buffer.


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15

Alcance

Que el estudiante

1.Adquiera destreza en el manejo y preparacin de soluciones.

2.Conozca la forma correcta de utilizar un potencimetro.

3.Aprenda la aplicacin de curvas de calibracin de un aparato simple.

4.Aplique su conocimiento matemtico en la obtencin e interpretacin de

grficos en el laboratorio.

Antecedentes

El agua tiene diversas propiedades que le ha convertido en el solvente

universal adecuado para la vida tal y como la conocemos. Es una molcula

tetradrica con extremos ligeramente cargados, dndole carcter de molcula

polar. Esta caracterstica le permite interaccionar con la gran cantidad de

molculas de diferente naturaleza que nos conforman.

Es capaz de formar puentes de hidrgeno, lo cual estabiliza su relacin con

otras molculas de agua as como otras molculas polares (hidroflicas). Esta

propiedad ayuda a que la estructura tridimensional de las grandes molculas

orgnicas, como protenas y cidos nucleicos, pueda ser estable.

Una de sus propiedades ms importantes fisiolgicamente es la tendencia que

muestran las molculas de agua a que una pequea porcin de ellas se disocien.

El agua tiene capacidad para funcionar como cido o como base, por lo cual su

disociacin puede escribirse como una transferencia de protones entre cido y

base, de la siguiente forma:

Se ha observado que la tendencia del agua a disociarse se comporta de

manera tal que mantiene una constante de disociacin, K, la cual se define dela siguiente manera:


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16

Sin embargo, la disociacin del agua se da en un grado tan pequeo que no

afecta la concentracin total del agua, as que puede incorporarse a la constante

(ya que siempre permanece constante) para dar la siguiente ecuacin:

Esta nueva constante, KW, se conoce como producto inico del agua, y tiene

un valor de 1 x 10 -14, y es vlida para todas las ecuaciones acuosas. Esto

quiere decir que en un vaso de agua pura, por ejemplo, donde no hay influencias

de cidos o bases, se encontrar una concentracin de protones (H+) equivalente

a 1 x 10-7. Este nmero vara y ya no se hace tan sencillo cuando ya se

consideran soluciones con la influencia de cidos y bases. Para facilitar el

manejo de estas concentraciones, se recurre a una escala logartmica mucho

ms fcil de utilizar: el pH.

El pH se define clara y llanamente como el logaritmo negativo de la

concentracin de protones de una solucin, o escrito matemticamente:

Esta ecuacin permite que lo que sera una escala complicada se convierta

en una simple escala lineal que va desde valor 1 a 14, donde el 7 indica

neutralidad (es decir, igual nmero de protones y grupos OH-), un valor menor

a siete indica acidez y uno mayor, basicidad.

El valor del pH del organismo no permite

fluctuaciones muy amplias dentro de la

escala. En el caso especfico de la sangre,

el pH se encuentra alrededor del 7.40, pero

no puede ir ms all de 7.0 ni de 7.7, ya

que ambos casos son generalmente fatales.Por tanto, la regulacin debe hacerse de

forma muy

cercana. Para lograr esto, el organismo

recurre a las llamadas soluciones buffer. El sistema buffer de ms importancia

en el organismo es el de CO2/ bicarbonato.


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17

Las soluciones buffer son soluciones que se resisten a cambiar de pH por

adicin de protones (H+) o grupos hidroxilo (OH-). Estas soluciones generalmente

estn formadas por cidos o bases dbiles (parcialmente ionizados) con la

presencia de una sal del mismo anin que el cido o base fuerte. La capacidad

de resistir a estos cambios, o capacidad buffer, depende de la concentracin del

cido conjugado y de la base conjugada. Una caracterstica nica para cada

sistema buffer es su valor de pK, que no es ms que el logaritmo negativo de

su constante de disociacin. Cuando el pH del medio es igual al pK del buffer

estudiado, se dice que el buffer se encuentra en su capacidad mxima.

EL SISTEMA AMORTIGUADOR QUE SE APLICA EN CLNICA ES LA

ECUACIN DE HENDERSON HASSELBACH LA CUAL DICE QUE:

pH de la sangre

Sustituyendo

En donde 6.1 es el valor del pK del cido carbnico

El cido carbnico (H2CO3) se calcula multiplicando la concentracin del

pCO2 (presin parcial de bixido de carbono) * la constante 0.03 que

convierte los mmHg del CO2en mEq/l

pH = 6.1 + log del bicarbonato/pCO2

pH = 6.1 + log de 24 mEq/L / 40 mmHg (40 por 0.03 = 1.2 mEq/L)pH = 6.1 + log de 24/1.2 (24/1.2 = 20 y logaritmo de 20 = 1.3)

pH = 6.1 + 1.3 = 7.4


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PreLaboratorio

En su trabajo de Pre-Laboratorio, conteste claramente las siguientes preguntas:

1. Soluciones buffer o amortiguadoras:

a. Cmo se definen?

b. Cules son sus principales caractersticas?

c. Cul es su papel dentro del organismo?

d. Cules son los principales sistemas buffer que se encuentran en el

organismo?

e. Qu significa la pK de una solucin buffer?

2. Investigue sobre el potencimetro:

a. Qu es y para qu se usa?

b. Cmo se encuentra diseado?

c. Cmo se calibra?

d. Cmo se maneja y qu cuidados debe tenerse al manejarlo?

Materiales

a.Reactivos

Hidrxido de sodio, NaOH, solucin 1M

Fosfato dicido de potasio, KH2PO4, solucin 0.05M

Fosfato cido de potasio, K2HPO4, solucin 0.05M

b.Cristalera

Baln aforado de 50 mL

Pipeta volumtrica de 1 mL


Pipeta volumtrica de 10 mLBeacker de 100 mL

c.Instrumentacin

Medidor de pH, o potencimetro


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Procedimiento

I.Preparacin de las muestras.

- Usando las soluciones que se le facilitan en el laboratorio, prepare las

muestras siguiendo las indicaciones del cuadro siguiente. Para mayor

facilidad, utilice balones de 50 mL, transfiera el volumen menor usando

pipeta volumtrica y afore con el volumen mayor. Rotule claramente cada

muestra para evitar confusiones.

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8

K2HPO40.05M (mL) 0 1 5 20 30 45 49 50

KH2PO40.05M (mL) 50 49 45 30 20 5 1 0

II. Lectura.

- Obtenga el valor del pH para cada una de las muestras. Siga claramente

las instrucciones del docente de laboratorio y asegrese de se r supervisado

al momento de tomar las lecturas de su muestra. Procese la informacin

que obtuvo como se indica en la seccin de Observaciones importantes.

- Calibracin del potencimetro:

o Retirar la tapa del potencimetro. oRetirar el tapn de plstico que

est en el sensor. oIntroducir el sensor del potencimetro en el buffer

pH 7. oPresionar la tecla ON/OFF. oSeguidamente presionar la tecla

CAL y se escuchara un Beep, esperar a que en la pantalla indique

7.0 y sonara Beep

o Retirarlo del Buffer pH 7. oLavar el sensor con agua destilada y

eliminar el exceso de agua sin tocar al sensor.

o Introducir el sensor del potencimetro en el buffer pH 4.

o Presionar la tecla CAL y se escuchar un Beep, esperar a que en la

pantalla se indique 4.00 y sonara Beep.


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o Retirarlo del buffer pH 4. oLavar el sensor con agua destilada y

eliminar el exceso de agua sin tocar el sensor.

o El potencimetro est listo para leer su muestra. No lo apague.

o Obtenga el valor de pH para cada una de las muestras. oIntroducir

el potencimetro en el beacker con la muestra y presionar la tecla

READ y espere el sonido Beep y en la pantalla se le indicara el pH

de la muestra.

III. Comparacin.

- Coloque en un beacker 50 mL de muestra (un beacker por muestra) y 50

mL de agua en otro beaker.

- Mida el pH de cada solucin.

- Luego de haber medido el pH de cada solucin, aadir 5 gotas de NaOH

al 2.5%

- Vuelva a medir el valor de Ph de cada solucin.

Observaciones importantes

Asegrese de anotar claramente dentro del cuadro que prepar para datos,

en su cuaderno los valores de pH para todas sus muestras.

Para cada muestra, calcule los siguientes parmetros:1. [HPO4

-2] usando la informacin del volumen de K2HPO4que agreg en la

muestra, utilizando la siguiente formula

Concentracin original * Vol. adicionado = [HPO4-2] * Vol. Total

2. [H2PO4-] usando la informacin del volumen de KH2PO4que agreg en la

muestra

Concentracin original * Vol. adicionado = [H2PO4-] * Vol. Total

3. El logaritmo de la relacin de las dos concentraciones usando la siguiente

ecuacin

Haga una grfica en donde se muestre en el eje x el valor de la relacin

de concentraciones obtenidas en el inciso anterior, en el eje y el valor

2


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21

obtenido para cada muestra. Obtenga una regresin lineal en tre estos datos

y el valor que obtenga para el intercepto ser su valor del pK. (Se

recomienda revisar su manual de BQI)

Busque en la literatura el valor terico para el pK de disociacin de la siguiente

ecuacin y calcule el porcentaje de error de su experimento.

Anexo

Investigue lo siguiente

1. Capacidad buffer o de amortiguacin:

a. Qu significa?

b. Qu sucede cuando se excede?

c. Qu significa rango buffer o de amortiguacin y cul es su relacin

con el pK?

d. Por qu una solucin buffer no puede actuar de la misma manera

en todas las situaciones (a varios valores de pH?

2.

D un ejemplo de un buffer o amortiguador mdico y describa su funcin.

Bibliografa de referencia

1. Department of Biochemistry, University of Minnesota. Labotatory Manual

for Biochemistry 5025. 1998. Consultado el 23 de junio, 2005. Modificado

el 23 de diciembre, 2003. http://www.natureandscience.net/labmanual.htm

2. Kaplan, L. A. y A. J. Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry.

Theory, Analysis, Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc. pg. 38-39

3. Devlin, T. (ed) 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations.

5 Edicin. Estados Unidos. Wiley-Liss. Pginas 12-13.
http://www.natureandscience.net/labmanual.htmhttp://www.natureandscience.net/labmanual.htmhttp://www.natureandscience.net/labmanual.htmhttp://www.natureandscience.net/labmanual.htm


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REALIZADO POR:DR.OCHAETA Y LICDA.NANCY DEL CID

PRCTICA NO.2

SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE PROTENAS EN SUERO Y PLASMA

Introduccin

Las protenas estn compuestas por carbono, oxigeno, hidrogeno y

nitrgeno. La mayora de ellas contienen adems azufre y algn fsforo.

Las protenas proporcionan estructuras, catalizan reacciones celulares y

llevan a cabo multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejadoen el hecho que la informacin gentica se expresa en forma de protenas.

Existe para cada protena un segmento de ADN que codifica la informacin que

especifica su secuencia de aminocidos.

Para el estudio de las protenas es necesario que estas se encuentren en

estado puro, existen varias tcnicas para poder separarlas como la precipitacin

por adicin de sales y precipitacin por adicin de aniones y cationes. Luego

de la separacin por medio de la precipitacin es necesaria una purificacin ms

profunda a travs de la cromatografa.Durante esta prctica el estudiante podr poner en prctica la precipitacin

de protenas plasmticas y de huevo; as mismo podr identificar la presencia

de protenas en soluciones de varios alimentos a travs del reactivo de Biuret.

Objetivos

Que el estudiante:

1.Describa que es la sangre y sus constituyentes.

2.Describa cada una de las fracciones que constituyen a las protenas delplasma con base a su origen, concentracin y funcin

3.Conozca e interprete la diferencia entre suero y plasma.

4.Explique cmo se encuentran constituidas las inmunoglobulinas, y las

diferentes caractersticas de cada una de ellas.


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23

Alcance

Que el estudiante

1.Adquiera destreza en el manejo y preparacin de soluciones.

2.Conozca la forma correcta de utilizar un potencimetro.

3.Aprenda la aplicacin de curvas de calibracin de un aparato simple.

4.Aplique su conocimiento matemtico en la obtencin e interpretacin de

grficos en el laboratorio.

Antecedentes

Las protenas plasmticas son un grupo de ms de 100 molculas distintas

con caractersticas y funciones muy diversasLa sangre es considerada como un tejido que circula por un espacio

virtualmente cerrado, que son los vasos sanguneos. Est constituida por una

fraccin celular (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y un lquido llamado plasma,

en el que se encuentran suspendidos los constituyentes de la fraccin celular

adems de nutrientes, metabolitos, hormonas, clulas, electrolitos, protenas,

factores de la coagulacin, sistema del complemento, entre otros. El volumen de

la sangre es de aproximadamente el 8% del peso corporal total, del cual el 55%

est constituido por el plasma y el 45% por clulas sanguneas.- Protenas del plasma

La sangre normal circulante contiene en su plasma alrededor de 7 a 7.5

g/100mL de protenas totales siendo su fraccionamiento el siguiente:

Albmina 4.3 g/100 mL (3.55.5)

Globulina 2.4 g/100 mL (2.03.6)

Fibringeno 0.3 g/100 mL (0.20.6)

7.0 g/100 mL (5.79.7)

oAlbmina

Esta fraccin de las protenas del plasma es la ms abundante, es

sintetizada en el hgado. Tiene un peso molecular aproximado de


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69,000. La estructura primaria de la albmina est constituida por 610

aminocidos dispuestos en una sola cadena peptdica. La estructura

secundaria parece ser solo una, la cual esta plegada sobre si misma,

formando capas que se pueden desplegar bajando el pH y volverse

a plegar cuando se sube el pH. La albumina en el organismo cumple

con varias funciones como por ejemplo: transporte de compuestos

orgnicos y recambio de nutrientes y metabolitos.

oGlobulina

Es una mezcla de varias protenas las cuales se han podido separar

por mtodos especiales de laboratorio, uno de ellos es la electroforesis

son la cual se obtienen fracciones de globulinas conocidas como 1,

2y . Las globulinas 1, 2, al asociarse a carbohidratos forman

gluco y mucoprotenas. Todas las globulinas al asociarse a fracciones

de lpidos (TAG, colesterol libre y esterificado, fosfolpidos), forman las

llamadas lipoprotenas.

Algunas globulinas se unen a metales para transportarlos por el

plasma, como la Siderofilina o Transferrina para el hierro, la

Ceruloplastina para el cobre. Los pesos moleculares de las globulinas

cubren una gama muy amplia, desde cerca de 40,000 hasta algo ms

de 1 milln. El sitio principal de su sntesis es el hgado, con

excepcin de las gamma globulinas que se sintetizan en el sistema

retculo endotelial.

Gamma Globulinas: tambin llamadas Inmunoglobulinas (Ig), tienen

actividad de defensa actuando como anticuerpos. Cada molcula de

Ig est formada por 4 cadenas polipeptdicas (2 pesadas llamadas H

y 2 livianas llamadas L) las que estn unidas por puentes disulfuro.

Se conocen 5 clases de inmunoglobulinas: IgA, IgG, IgD, IgM e IgE.

oFibringeno

Es una protena que est presente en el plasma humano a una

concentracin de 0.3g por 100 mL. La molcula de fibringeno es

un dmero que consta de 2 mnomeros constituidos de 3 cadenas


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polipeptdicas cada uno enlazados por puentes disulfuro. La presencia

de hidratos de carbono en la molcula tiene algn significado en el

mecanismo de la coagulacin.

- Plasma y suero

El plasma se obtiene cuando, inmediatamente despus de extraer la sangre,

se le agregan anticoagulantes como oxalato, citrato, EDTA, o heparina y se

centrifuga. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que est coagule,

el lquido que se separa se llama suero. El suero carece de clulas y de

factores de la coagulacin incluyendo la protena fibringeno, pues sta ha sido

transformada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulacin.

Una de las tcnicas de precipitacin se basa en la baja solubilidad que tienen

las protenas en disoluciones salinas concentradas, la sal que ms se ha utilizado

es el Sulfato de Amonio, (NH4)2SO4. El hecho de que una protena se disuelva

en un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrgeno.

Con el agua a mayor cantidad de puentes de hidrgeno mayor solubilidad. La

accin de la sal es liberar el agua unida a la protena por puen tes de hidrgeno,

lo cual provoca su precipitacin.El reactivo de Biuret se utiliza para la determinacin de protenas, peptidos

cortos y otros compuestos con dos o ms en laces peptdicos. La prueba se

basa en la reaccin del sulfato de cobre con compuestos que tengan dos o ms

enlaces peptdicos, en un medio alcalino. La reaccin final produce un complejo

color violeta, cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de enlaces

peptdicos presentes.

Materiales

a.

ReactivosSolucin 0.1M de Oxalato de sodio

Solucin de hidrxido de sodio al 10%

Solucin saturada y semisaturada de sulfato de amonio

Cristales de sulfato de amonio


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Reactivo de Biuret

Suero y Plasma oxalatado

Agua destilada

b.Cristalera

Tubos de ensayo

Tubos de centrifuga


c.Equipo

Gradillas para tubos de ensayo

Pipetas pasteur

Pipetas de 1 mL y de 5 mL

Esptula

Centrfuga

Procedimiento

I.Presencia de Fibringeno

- Colocar 1 mL de plasma oxalatado en un tubo de centrifuga, agregarle 1

mL de una solucin semisaturada de sulfato de amonio y mezclarlos.- Observe el fibringeno que se precipit.

- Centrifugue el tubo con su contenido durante 5 minutos, descartar todo el

sobrenadante.

- Al sedimento agrguele 1 mL de agua destilada, mzclelo completamente.

- Agrguele 1 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de

reactivo de Biuret.

- Observe el color que se desarrolla.

II.Separacin de Globulinas

- Tomar 1 mL de suero y colocarlo en un tubo de centrifuga, agregarle 1

mL de una solucin saturada de sulfato de amonio y mezclarlos.

- Observe el precipitado.


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27

- Centrifugar durante 10 minutos.

- Pasar el sobrenadante a otro tubo de centrifuga limpio (este se utilizara en

el apartado III).

- Al sedimento agregue 1 mL de agua destilada y mzclelo.

- Agrguele 1 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de

reactivo de Biuret.


III.Separacin de Albmina

- Al sobrenadante del inciso anterior, agrguele unos cristales de sulfato de

amonio y agtelo suavemente hasta que se disuelva (si es necesario

agregue un poco ms).

- Observar el precipitado que se forma.

- Agrguele 2.5 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de

reactivo de Biuret.


AnexoInvestigue lo siguiente:

1.Describir la funcin de por lo menos tres protenas plasmticas que se

incluyen dentro de las globulinas.

Bibliografa

1.Quesada Mora, Silvia. Manual de experimentos para Bioqumica. San Jos

Costa Rica. EUNED. 2007. 148 p.

2.Departamento de Bioqumica, Universidad Autnoma de Mxico. Programaacadmico, objetivos del curso, contenido temtico y manual de practicas

de Laboratorio, Biologa y Biologa Molecular. 2004. Consultado en enero

2010. Reimpreso 2006.


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REALIZADO POR:LICDA.NANCY DEL CID

PRCTICA NO.3

COAGULACIN SANGUNEA

Introduccin

El organismo dispone de un sistema de seguridad que le permite detener una

hemorragia o prdida de sangre debido a la rotura de la pared vascular, a este

mecanismo se le conoce como hemostasia o coagulacin sangunea.

Existen diferentes pruebas para poder evaluar este proceso como el tiempo desangra, tiempo de coagulacin, tempo de protrombina, tiempo de tromboplastina

parcial, entre otras.

Objetivos

Que el estudiante:

1. Conozca las pruebas de coagulacin y la importancia de cada una de

ellas.

2. Conozca que se evala en cada prueba.3. Conozca la forma adecuada de realizar cada una de las pruebas.

Antecedentes

Antecedentes: Fases de la hemostasis:

1.VASOCONSTRICCIN: es la disminucin de la luz del vaso sanguneo,

como un mecanismo de defensa, llevado a cabo por el estmulo directodel sistema nervioso simptico sobre el msculo liso de la pared del

vaso sanguneo.

2.AGREGACUN PLAQUETARIA: es el proceso que se desencadena

cuando una plaqueta se adhiere al factor de Von,Willebrand unido a la


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29

colgena del vaso sanguneo, est plaqueta libera tromboxano A2, lo cual

atrae a otras plaquetas. Las plaquetas que se van agregandoemiten

pseudpodos y sustancias que activan a otras plaquetas para que sigan

unindose hasta formar el cogulo plaquetario.

3.COAGULACIN SANGUNEA: tradicionalmente se le divide en 3 fases:

intrnseca, extrnseca y comn. La va intrnseca comprende los factores

XII, XI, IX y VIII, adems de la calicreina (que existe inicialmente como

precalicreina) y el ciningeno de alto peso molecular. La va intrnseca

se inicia con el contacto con una superficie patolgica como la exposicin

de las cargas negativas en el endotelio lesionado. La va extrnseca se

inicia con la activacin del factor VII y el factor tisular (factor III), tanto

la va intrnseca como la extrnseca convergen en la activacin del factor

X que inicia la va comn la cual comprende la conversin de la

protrombina en trombina y la conversin de fibringeno en el cogulo de

fibrina como se observa en el siguiente esquema:


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Dos pruebas de coagulacin nos sirven para evaluar la va intrnseca y

extrnseca. Por medio del tiempo parcial de tromboplastina (TPTP), evaluamos

la va intrnseca, su valor normal es de 30 a 40 segundos. Con esta prueba

monitorizamos a las personas que estn siendo tratadas con heparina y tambin

refuerza el diagnstico de enfermedades como las hemofilias tipo A (deficiencia

del factor VIII), hemofilia tipo B (deficiencia del factor IX) y hemofilia tipo C

(deficiencia del factor XI), y de la enfermedad de von Willebrand. Con el tiempo

de protrombina (TP: valor normal de 10 a 15 segundos), monitorizamos a las

personas que estn siendo tratadas con warfarina un inhibidor competitivo de la

vitamina K (la vitamina K es necesaria para que se d la gamma-carboxilacin

de los factores II, VII, IX y X), est prueba tambin est alargada. anormalmente

en la deficiencia de vitamina K y en las hepatopatas graves. Actualmente cada

vez que mandamos hacer un tiempo de protrombina el laboratorio nos informa

del INR que significa razn normalizada internacional, esta razn fue propuesta

por la OMS en 1982. Al inicio la INR se calculaba asi: INR = TP del pac. / TP

controlISI. El exponente ISI significaba ndice de sensibilidad internacional, como

se hace muy difcil elevar al exponente, se trat de que este exponente se

aproximara a la unidad y como cualquier nmero elevado a un exponente 1 no

se modifica entonces actualmente solo se utiliza

INR = TP del pac / TP control y su valor normal va de 0.8 a 1.2


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- Tiempo de sangra:

El tiempo de sangrado mide la fase primaria de la hemostasia: la interaccin de

las plaquetas con la pared del vaso sanguneo y la formacin del tapn

hemosttico. El tiempo de sangrado constituye la mejor prueba para detectar

alteraciones de la funcin plaquetaria y es uno de los principales estudios en

los trastornos de la coagulacin. Se hace una pequea herida en el lbulo

auricular o en el antebrazo y se anota el tiempo de sangrado y la velocidad

con que se forma el cogulo plaquetario. La duracin del sangrado de un

capilar depende de la calidad y cantidad de plaquetas y de la vasoconstriccin.

Valor de referencia: 29 minutos. Esta prueba se altera principalmente en la

enfermedad de Von Willebrand (el valor de esta prueba puede pasar los 25

minutos).

Tiempo de coagulacin:

Es el intervalo requerido para que la sangre venosa se coagule en condicin

controlada; es una medicin del tiempo requerido para la formacin de las

primeras trazas de trombina que bastan para formar un coagulo visible. Valor de

referencia: 5 a 8 minutos. Esta prueba casi no se hace actualmente, porque lainformacin que proporciona tiene poco utilidad clnica.


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Pre-laboratorio

De la coagulacin investigue lo siguiente:

1. A qu conocemos como fibrina?

2. Qu son las plaquetas?

3. A que se refiere cuando se habla de la va intrnseca y extrnseca de la

coagulacin

4. Qu tipo de anticoagulante debe de usarse en pruebas de coagulacin?

Materiales

a.Reactivos

Reactivo para Tiempo de Protrombina (TP)

Agua Destilada

Control Normal para TP

Control Patolgico para TP

b.Cristalera

Tubos de ensayo

Laminas porta-objeto

c.Equipo

Gradillas para tubos de ensayo

Micro pipeteador automtico 200L

Micro pipeteador automtico 50 L

Bao de Mara a 37C

d.Otros

Papel mayordomo

Cronometro

Lancetas


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Procedimiento

I.Tiempo de Protrombina (TP)

- Luego de recolectada y separada la sangre

- Calentar el reactivo de TP a 37C

- Colocar 50 L del control normal de TP en un tubo e incubarlo a 37C en

el bao de Maria durante 2 minutos.

- Aadir con fuerza 100 L del Reactivo de TP al tubo del inciso 3) y

cronometrar hasta la formacin de hilos de fibrina.- Repetir el inciso 3) y 4) para el control patolgico y la muestra.

MUESTRA TIEMPO EN

SEGUNDOS

INR

Control Normal --

Control Patolgico --

Muestra No. 1Muestra No. 2

II.Tiempo de Sangra

- Se utiliza la zona que esta 15 a 20 mm por encima de la porcin grasa

redonda del lbulo de la oreja.

- Calentar la oreja.

- Desinfectar el rea a puncionar.

- Colocar una lmina portaobjetos detrs del pabelln de la oreja (esto con

la finalidad de darle firmeza a la puncin que se ejecutar).

- Usando una lanceta, se perfora el lbulo de la oreja mediante un golpe

firme. La herida deber ser lo suficientemente posible profunda para que

fluya libremente la sangre sin apretar con el dedo.


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34

- Activar el cronmetro inmediatamente

- A intervalos de medio minuto, recoger la cota de sangre que se forma en

la oreja con un pedazo de papel mayordomo

- Cuando el papel ya no absorba nada, detener el cronometro. - Reportar el

tiempo transcurrido en minutos y segundos.

Anexo

Investigue lo siguiente

1. Clnicamente cual es el comportamiento del TP, cuando hay administracin

de anticoagulantes en un paciente, explique el por qu.

2. Cuantos factores de la coagulacin existen, mencione cada uno de ellos

Bibliografa

1. Prez Folgar, JR, Fernndez Ch., JG. Manual de Prcticas de Laboratorio

de Hematologa Bsica. Guatemala. USAC. 2002. 102 p.

2. Ficha tcnica NEOPLASTINE CI PLUS. Diagnostica Stago, Francia.


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MAZARIEGOS CORDERO

MODIFICADO POR:LICDA.NANCY DEL CID

(2011)

PRCTICA NO.4

FUNCIN RENAL:DETERMINACIN DE

CREATININA

Introduccin

La prueba que se usar en el laboratorio es un mtodo colorimtrico de punto

final para la deteccin de creatinina en suero u orina. El principio del mtodose basa en que la creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un

complejo de color rojo. La intensidad de color es proporcional a la concentracin

de creatinina en la muestra, lo cual permite su cuantificacin con el uso de

estndares de creatinina de concentracin conocida.

Objetivos

Que el estudiante

1.Realice un mtodo espectrofotomtrico para determinacin de analitos en

muestras biolgicas.

2.Practique la preparacin de curvas de calibracin con estndares de

concentracin conocida.

Alcance

Que el estudiante

1.Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.

2.Aprenda a realizar clculos de concentracin por interpolacin usandocurvas de calibracin

3. Interprete resultados clnicos.


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Antecedentes

Los niveles de creatinina srica y la excrecin urinaria son una funcin de lamasa muscular en personas normales, y muestran muy poca respuesta a cambios

en la dieta. La creatinina deriva de la deshidratacin no enzimtica de la

creatina en msculo esqueltico. La cantidad de creatina por unidad de masa

muscular es constante, y por lo tanto la tasa de deshidratacin de creatina es

constante tambin-. Por lo tanto la concentracin de creatinina srica es muy

estable, con variaciones diarias de menos del 10%.

La creatinina es un compuesto sumamente difusible y se elimina del

organismo casi exclusivamente por filtracin renal: Es filtrada libremen te en elglomrulo y no es reabsorbida en los tbulos. Por estas propiedades, la tasa de

depuracin de creatinina puede ser usada como estimacin de la funcin

glomerular. Su determinacin en suero y la tasa de depuracin de creatinina

endgena constituyen parmetros importantes para el diagnstico de diversas

afecciones renales.

La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el picrato

alcalino para formar un complejo de color rojo. La intensidad del color se

cuantifica con un espectrofotmetro, a una longitud de onda de 510 nm, y por

interpolacin (comparacin) con la absorbancia de un estndar o curva estndar

se obtiene la concentracin de la muestra que se analiza. Como otros

compuestos de la muestra tambin reaccionan con la muestra, para eliminar la

interferencia se agrega cido, el cual destruye el complejo picrato-creatinina pero

no los otros complejos. La concentracin de creatinina se calcula por diferencia

entre la absorbancia (intensidad de color) antes y despus de agregar e l cido.

Pre-laboratorio

1.Qu es la creatinina?

2. Investigue las patologas que presentan alteraciones de los valores de

creatinina srica y urinaria.


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37

3.Haga los clculos necesarios para obtener 1 mL de una muestra de orina

diluida para cada una de las siguientes diluciones: 1:2, 1:50, 1:100 y 1:200

de la muestra de orina.

Materiales

a.Reactivos

Muestras de suero y orina de 24 horas diluida 1:50

Solucin salina, NaCl al 0.9%

Estndar de creatinina, 2.0 mg/dL

Solucin de cido pcrico 41 mmol/L

Solucin de buffer alcalino, pH 12.4

Reactivo de trabajo: Prepare en frasco de plstico mezcla a partes

iguales de cido pcrico y buffer alcalino.

Solucin stop, cido actico al 20%

b.Instrumentacin

Espectrofotmetro, lectura a 510 nmCeldas para espectrofotmetro

Bao de agua a 37C

Reloj o timer

Micropipetas de 2 a 20 L, 10-100 L, 200-1000 L

Puntas para micropipeta

c.Cristalera

Tubos Eppendorf de 1.5 mL

Tubos de vidrio


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Precauciones

Los reactivos utilizados son txicos y corrosivos. Maneje todas las soluciones

con cuidado. Evite derrames y el contacto directo con la piel y mucosas.

Toda muestra biolgica debe tratarse como potencialmente infecciosa, por lo

cual debe cumplirse con las normas de bioseguridad adecuadas. Debe usarse

guantes en todo momento, as como ser cauteloso durante la manipulacin.

Procedimiento

Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo debidamente

identificados:

Blanco Estndar Muestra de

Suero

Muestra de

orina

Estndar -- 10 L -- --

Muestra Suero -- -- 10 L --

Muestra Orina -- -- -- 10 L

Reactivo de

Creatinina

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Mezcle e incube por 10 min en bao a 37C

Dentro de los 15 minutos despus de retirarlo del bao, leer e l

estndar y las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de

onda de 510 nm. Llevando el equipo a cero con el Blanco

Stopper50 L -- 50 L 50 L

Mezclar y dejar los tubos 5 minutos a temperatura ambiente y volvera leer las muestras, llevando a cero con el blanco.


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Calculo de resultados

Creatinina en suero (mg/dL)= (Abs1- Abs2)* F

F= 2.0 mg/dl

Abs. Estndar

Creatinina en orina (g/24 horas)= Abs1-Abs2 * 0.020 g/L * 50 *

Vol en L

Abs. Estndar

Depuracin de Creatinina Endgena (D.C.E)=

La creatinina tiene la ventaja de que es un compuesto endgeno, por lo

tanto lo forma nuestro propio cuerpo. La creatinina se sintetiza por la

deshidratacin de la creatina-P (un reservorio de energa), la cual es

sintetizada a partir de 3 aminocidos: glicina, arginina y metionina.

Si existe por ejemplo 1 mg de creatinina por mililitro de plasma y se

filtran 125 o 130 ml de plasma cada minuto, en la orina aparecen 180

mg de creatinina en cada minuto, esto significa que aparecieron 50 mg

de creatinina ms de lo que podra esperarse si la creatinina solo se

hubiera filtrado, sin embargo la creatinina tambin es secretada en los

tbulos de la nefrona y por eso cada minuto realmente se depura la

creatinina de 180 ml de plasma y no 130 ml como en el caso de la

inulina que solo se filtra.

La UREA, es otro compuesto que en alguna oportunidad tambin se uso

para medir tasa de filtracin glomerular. Si en el plasma existen 20 mg

de urea por cada 100 ml y se filtran 130 ml de plasma cada minuto,

entonces se filtran 26 mg de urea cada minuto, pero en la orina de cada


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40

minuto solo aparecen 12.22 mg, quiere decir que el resto (26-12.22=13.78

mg) se reabsorbi, por lo tanto, del 100 % de urea que se filtr se

reabsorbi el 53 %, en los tbulos y se excret el 47 %

La velocidad del filtrado glomerular o tasa de filtracin glomerular en una

persona adulta sana es de 125 ml por minuto, en las mujeres se debe

de considerar un 10 % menos. Para la eliminacin de creatinina corregida

con la superficie corporal, la TFG es para los hombres adultos de 97

a 137 ml/min y para las mujeres de 88 a 128 ml/min.

TFG = U (mg/dl) x V (ml/24 h) / P (mg/dl x 1440 min x 1.73/A

TFG = tasa de filtracin glomerular

U = concentracin de creatinina urinaria

V = volumen de orina eliminada en 24 horas (1440 minutos)

P = concentracin de creatinina en el plasma

A = Area de superficie corporal de la persona a quien se investiga

Los valores normales de creatinina en orina y plasma son:

Los hombres tienen un valor de creatinina urinaria de 0.8 a 2.4 g/da

Las mujeres tienen un valor de creatinina urinaria de 0.6 a 1.8 g/da

La diferencia consiste en que la creatinina en la orina esta en relacin a

la masa muscular y los hombres tienen ms masa muscular que las

mujeres.

La creatinina en plasma para hombres y mujeres es menor o igual a

1.2 mg/dl

D.C.E. (ml/min)= Creatinina en orina de 24 horas (g/24 horas) * 694 mL/min

Creatinina en suero (mg/L)


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Valores de referencia

Suero: Hombres 0.64 - 1.04 mg/dL

Mujeres 0.57 - 0.92 mg/dL

Orina: Hombres 1.02.0 g /24 horas

Mujeres 0.81.8 g /24 horas

Depuracin de creatinina: 80-140 mL/min


1. Ficha tcnica Creatinina Directa. 864101004. Wiener Lab, Rosario,

Argentina


Theory, Analysis, Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc.


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REALIZADO POR:LICDA.GABRIELA CIFUENTESMODIFICADO POR:LICDA.NANCY

DEL CID (2011)

PRCTICA NO.5

FUNCIN RENAL:DETERMINACIN DE NITRGENO DE UREA

Introduccin

La concentracin de urea ser cuantificada espectrofotomtricamente, en

donde la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, presente en la muestra, en

amonaco (NH3) y anhdrido carbnico (CO2). El amonaco formado se incorpora

al -cetoglutarato por accin de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) conoxidacin paralela de NADH a NAD+.

ureasa

Urea + H2O 2 NH3+ CO2

GIDH

NH3 + NADH + H++ 2-oxoglutarato I-glutamato + NAD++

H2O

Objetivos

Que el estudiante

1.Realice la prueba de determinacin de nitrgeno de urea.

2.Use los valores obtenidos para evaluar la condicin del

paciente.

Alcance

Que el estudiante

1.Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.



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Antecedentes

La urea se forma en el hgado con la ayuda del CO2, y constituyen el

producto final del metabolismo de las protenas. La cantidad de urea excretada

est directamente relacionada con la ingesta de protenas en la dieta, aumentada

en estados febriles, diabetes, y actividad de la glndula adrenal.

El test de Nitrgeno de Urea mide la porcin de nitrgeno de la urea, y es

usada como ndica de funcin glomerular. Sus niveles se aumentan en necrosis

tisular, catabolismo proteico. Sus niveles se correlacionan mejor con la

sintomatologa de uremia que los niveles de creatinina.

Su aumento es signo elemental de insuficiencia renal orgnica, pero hay quetener en cuenta que no todo aumento significa nefropata, pues tambin se eleva

por causas extrarrenales.

Niveles altos se encuentran en uremia aguda, glomerulonefritis aguda, anuria

traumtica, choque hemoltico post-transfusional, nefrosis, esclerosis renal,

hidronefrosis, tuberculosis renal, pielonefritis y rin poliqustico.

Cuando el aumento obedece a causa extrarrenal, es fenmeno agudo o

subagudo, pero reversible a veces en pocas horas, como sucede en la

deshidratacin aguda, donde por la maana se puede encontrar en 40 mg/dL yen la tarde estar dentro de la normalidad.

Igual ocurre en los vmitos intensos, diarreas, sudoracin profusa, quemaduras

extensas, infecciones que ocurren por protelisis tisular aumentada, en el coma

diabtico, en el post-operatorio inmediato, insuficiencia suprarrenal y en la agona,

donde intervienen factores de hipotensin.

Pre-laboratorio

1.Mencione 3 patologas que se asocien a la alteracin del nitrgeno de urea

y mencione los sntomas de cada una de ellas.

Materiales

a.Reactivos

Muestra de suero


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44

Reactivo de trabajo, el cual consta de una mezcla de buffer y

enzimas (2oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato

deshidrogenasa) Estndar con una concentracin de 0.60 g/L

b.Instrumentacin

Espectrofotmetro, lectura a 340 nm

Celdas para espectrofotmetro

Cronometro

Micropipetas de 2 a 20 L, 10-100 L, 200-1000 L

Puntas para micropipeta

Gradilla

c.Cristalera

Tubos de vidrio

Procedimiento

Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo, debidamente

identificados:

Estndar (S) Muestra 1 (Mx1) Muestra 2 (Mx2)

Estndar -- 10 L --

Muestra Suero 1 -- -- 10 L

Muestra Suero 2 -- -- --

Reactivo de trabajo 1 mL 1 mL 1 mL

Mezclar (sin invertir) y disparar un cronometro

A los 60 segundos exactos medir la absorbancia de los tres tubos, la cual ser laABS1para las muestras y S1para el estndar.

Continuar con la incubacin

Medir nuevamente la absorbancia a los 120 segundos (60 segundos despus de la

primera lectura) la cual ser la ABS2para las muestras y S2para el estndar.


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Urea (g/L) = f * (ABS1ABS2)

En donde f = 0.60 g/L

(S1S2)

Para la determinacin del Nitrgeno de Urea: divida el resultado de la Urea /

2.14

Nota:para el reporte de sus resultados, deber de calcular la concentracin

de Nitrgeno de Urea en mg/dL.

Valores de referencia

Urea = 1539 mg/dL

Nitrgeno de Urea = 720

mg/dL

Anexo:

Investigue sobre la reaccin de Berthelot modificada

Bibliografa

1.Ficha tcnica Urea Cintica. 861237005. Wiener Lab. Rosario,

Argentina

2.ngel, Gilberto y ngel, Mauricio. Interpretacin Clnica del

Laboratorio. 7. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. 2006.

Bogot.


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PRCTICA NO.6

DETERMINACIN ENZIMTICA DE CIDO RICO

Introduccin

La concentracin de cido rico ser cuantificada espectrofotomtricamente

a travs de la reaccin de cido rico catalizada por uricasa, acoplada a la

formacin de un complejo de color. La uricasa cataliza la reaccin del cido

ricopresente en la muestra, para formar alantonay perxido de hidrgeno(H2O2). El H2O2formado reacciona por la actividad cataltica de la peroxidasa

con cido 3,5-dicloro-2hidroxibencensulfnico (DCHBS) y 4-aminofenazona

(PAP)para producir un complejo rojo-violeta de quinoneiminaque se cuantifica

en el espectrofotmetro con una longitud de onda de 520 nm.

uricasa

cido rico + O2+ 2H2O Alantona + CO2+ H2O2

peroxidasa

2 H2O2+ DCHBS + PAP Quinoneimina + HCl + 4H2O

Objetivos

Que el estudiante

1.Se introduzca a los mtodos enzimticos para

determinaciones clnicas.

2.Estudie las patologas asociadas con cido rico

elevado.Alcance

Que el estudiante

1.Contine familiarizndose con la aplicacin de mtodos espectrofotomtricos

para determinacin de analitos en muestras biolgicas.


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Antecedentes

El cido rico es el mayor producto del catabolismo de los nuclesidos

de purina. Las purinas provenientes de la dieta se convierten a cido rico

directamente. Sin embargo la mayor parte de las purinas que se excretan como

cido rico en la orina proviene de la degradacin de cidos nucleicos

endgenos. Un 75% del acido rico excretado por los seres humanos es

excretado por la orina, el resto es secretado al tracto gastrointestinal, donde se

degrada a alantona y otros compuestos por las enzimas bacterianas.

El manejo renal es complejo y ocurre en 4 pasos: (1) filtracin glomerular;(2) reabsorcin de 98-100% en el tbulo proximal convolucionado; (3) secrecin

hacia el lumen en la porcin distal del tbulo proximal; y (4) nueva reabsorcin

en el tbulo distal. La filtracin neta de cido rico es de 6 a 12% de la

cantidad filtrada.

La hiperuricemia se define como concentraciones de cido rico en sangre

mayor a 6.0 (mujeres) o 7.0 mg/dL (hombres). La manifestacin clnica extrema

de hiperuricemia ocurre en forma de gota, cuando el urato monosdico precipita

de los fluidos sobresaturados. Los depsitos de urato son los responsables delos sntomas La artritis gotosa puede asociarse con cristales en fluido articular,

y depsitos de cristales en los tejidos que rodean la articulacin. Cuando los

depsitos ocurren en tejido blando, producen una respuesta inflamatoria intensa

mediada por leucocitos polimorfonucleares y macrfagos.

La gota primaria se asocia con hiperuricemia esencial debido a la

sobreproduccin metablica de purinas o excrecin disminuida de cido rico.

La gota secundaria es resultado de hiperuricemia asociada a causas

identificables. La falla renal aguda o crnica puede producir retencin renal decido rico. Algunos medicamentos, en particular diurticos pueden ser la

causa de la falla. La acidemia orgnica por aumento del cido acetoactico en

diabticos, o la acidosis lctica pueden interferir con la secrecin tubular del

urato. En clulas tumorales, el rpido recambio de cidos nucleicos puede

tambin inducir hiperuricemia.


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El nivel de cido rico en la sangre se incrementa gradualmente con la

edad, aumentando un 10% entre los 20 y 60 aos de edad. Las mujeres

muestran un aumento considerable despus del inicio de la menopausia,

alcanzando niveles similares a los reportados en hombres.

Un acercamiento a la interpretacin de valores de cido rico srico es

considerar el grado de hiperuricemia en relacin con el riesgo de desarrollo de

gota. Hombres con valores de cido rico por encima de 9.0 mg/dL tienen

alrededor de 150 veces ms riesgo de tener artritis gotosa que el grupo de

hombres con valores menores a 6.0 mg/dL. La excrecin de cido rico

Los mtodos que involucran reacciones enzimticas tienen mayor

especificidad que otros mtodos colorimtricos debido a que el sustrato reacciona

especficamente con la enzima utilizada. La uricasa cataliza la oxidacin del

cido rico a alantona, con produccin de H 2O2. En este procedimiento se

utiliza un sistema de peroxidasa acoplado con molculas aceptoras de electrones

que producen un cromgeno, o molcula coloreada. Se reducen la interferencias

con metabolitos como bilirrubina o cido ascrbico usando molculas complejas,

como el fenol substituido de la aminofenazona.

Prelaboratorio

1. Investigue en que situaciones se pide anlisis de cido rico.

2.Haga un cuadro de causas de hiperuricemia.

3.Cules son los diferentes mtodos para la identificacin de cido rico?

4. Investigue cuales son los valores normales de cido rico en sangre y en

orina de 24 horas

Materiales

a.Reactivos

- Estndar de cido rico, 8

mg/dL - Solucin de reactivo


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enzimtico Buffer fosfato, pH

7.0, 50 mmol/L

4-aminofenazona, 0.3 mmol/L

DCHBS 4 mmol/L

Uricasa > 200 U/L

Peroxidasa>1000 U/L

b.Cristalera

Tubos de vidrio de 10 mL

c.Instrumentacin

Espectrofotmetro, lectura a 520 nmCeldas para espectrofotmetro

Bao de agua a 37C

Micropipetas de de 2 a 20 L, 20-200 L, 200-1000 L

Puntas para micropipeta azules y amarillas

Procedimiento

1.Prepare una dilucin 1:11 de la muestra de orina.

Blanco Estndar (S) Muestra de

Suero (Mx1)

Muestra de orina

(Mx2)

Estndar -- 20 L -- --

Muestra Suero -- -- 20 L --

Muestra Orina

diluida

-- -- -- 20 L

Reactivo de

Acido Urico

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Mezcle e incube a temperatura ambiente por 20 min o 5 min en el bao de mara.

Mida la absorbancia en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 520 nm


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Para medir la absorbancia, transfiera 1 mL a la celda espectrofotomtrica

Mida en el siguiente orden: Estndar, muestra suero y muestra orina frente al Blanco antes de 15min.


Acido rico en suero (mg/dL): Abs de Mx1 * Concentracin del Estndar

Abs de S

Acido rico en orina (mg/24 horas): Abs de Mx2 * Concentracin S * 11 * Vol

Abs de S

Valores de referenciaSuero:

Hombres: 3.4 a 7.0 mg/dL

Mujeres: 2.4 a 5.7 mg/dL

Orina: 250 a 750 mg/24

horas


3. Ficha tcnica URIC ACID Liquicolor. 106901E Human, Wiesbaden, Alemania.

4. Burtis, C. y E. Ashwood. 2001. Fundamentals of Clinical Chemistry. 5.

Edicin. W.B. Saunders Company, Filadelfia, USA. p 422-426.


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MODIFICADO POR:LICDA.GABRIELA CIFUENTES (2009),LICDA.NANCY DEL CID

(2011)

PRCTICA NO.7

EL ELISACOMO UN ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

Introduccin

El ELISA (por el trmino en ingls Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es

uno de las tcnicas clnicas ms utilizadas para fines de diagnstico humano.Como su nombre lo indica, est relacionado con el uso de partculas inmunolgicas

unidas a un soporte para la deteccin de la especie que se busca. En la presente

prctica se realizar una simulacin de anlisis de ELISA para la mejor comprensin

de la base qumica e inmunolgica de la prueba.

Objetivos

Que el estudiante:

1.Simule una prueba de ELISA para una especie especfica, sea esta patgena

o no

2.Diferencie entre ELISA directo, ELISA tipo sndwich y ELISA indirecto

Alcance

El estudiante

1.Reconocer el esquema de cada uno de los tres tipos diferentes de ELISA

que existen

2.Podr describir la base inmunolgica de una prueba de ELISA3.Explicar el por qu la especificidad del anlisis de ELISA


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Antecedentes

El radio

inmmunoensayo (RIA, por sus siglas en

ingls) y el ensayo inmunoadsorbente

ligado a una enzima (ELISA, por sus

siglas en ingls) son ensayos que

involucran la unin directa de un

anticuerpo para la determinacin de un

antgeno o anticuerpo buscado, aunque

la forma de deteccin final en ambos

procedimientos es diferente. El

radioinmunoensayo generalmente se

Figura 1: Placa de ELISA, con anlisis

terminado.

utiliza para la medicin de hormonas en sangre y tejidos, mientras que el ELISA

se usa frecuentemente en diagnsticos virales (como HIV). Para ambos mtodos,

se requiere la preparacin de un antgeno o anticuerpo conocido puro (o ambos)

para lograr estandarizar la prueba. Estandarizar la prueba significa asegurar que

la prueba funcionar bien y de la misma forma para la muestra de cualquier

paciente, siempre y cuando sea el mismo tipo de muestra.

En el ELISA directo se mide o detecta la presencia de un antgeno especfico

en la muestra, mientras que en el ELISA indirecto se mide o detecta la presencia

de un anticuerpo especfico. Una versin modificada del ELISA directo, llamada

ELISA tipo sndwich, mejora la sensibilidad del anlisis, cuando se requiere, usando

un anticuerpo de captura para el antgeno que se busca. En cualquier caso, el

ELISA se lleva a cabo en placas de 96 pozos de material plstico especial, como

la que se muestra en la Figura 1.

Mientras que el radio inmunoensayo la deteccin se realiza midiendo la cantidad

de radiacin que permanece en el pozo de la placa, en el ELISA se realiza por

una reaccin que convierte un sustrato incoloro a una sustancia coloreada dentro

del pozo, usando para ello una enzima unida a un anticuerpo. El cambio de color

puede verse directamente en la placa, haciendo que la recoleccin de datos sea

ms fcil, a la vez que evita los riesgos del manejo de material radioactivo. Es

por ello que esta tcnica es la preferida por encima del RIA.

PreLaboratorio


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Antes de llegar al laboratorio, investigue:

1. Qu aplicaciones diagnsticas importantes tiene el ELISA?

2. Qu significa un anlisis de tamizaje (o, en ingls, screening test)

3. Explique de qu depende la especificidad de un anlisis de ELISA.

4. En qu consiste el ELISA directo, indirecto y tipo sanwich?

Materiales

a.Reactivos

- Calibrador 1

- Calibrador 2

- Muestra1- Muestra 2

- Enzima conjugada

- Sustrato

- Solucin de lavado- Solucin STOP

b.Otros

- Placa para ELISA

Procedimiento

1.Se le dar una tira con pozos inactivos para ELISA

2.Seguir el siguiente esquema de pipeteo para una prueba de ELISA

Pozo A1 B1 C1 D1

Calibrador 1 20L

Calibrador 2 20L

Muestra 1 20L

Muestra 2 20L

Conjugado 200L 200L 200L 200L

Mezclar e Incubar por 10 minutos a T ambiente

Lavar con 400L cada pozo (repetir 3 veces)

Substrato 100L 100L 100L 100L

Incubar por 5 minutos a T ambiente, en oscuridad

STOP 100L 100L 100L 100L

Mezclar cuidadosamente


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Anexo

Investigue qu pruebas clnicas se realizan con ELISA. Adems, investigue qu

otros tipos de ELISA existen adems de los tres ya mencionados.


1. The Biology Project. ELISA Activity. 1998. Pgina consultada el 25 de

febrero, 2007.

http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html

2. Janeway, C. A. et al. 2001. Inmunobiology. 5a Edicin. Garland Science

Publising, New York.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&dep

th=10
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.htmlhttp://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&depth=10http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.htmlhttp://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html


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MODIFICADO POR:LICDA.NANCY DEL CID (2011)

PRCTICA NO.8

DETERMINACIN CUALITATIVA DE TIROXINA Y TRIIODOTIRONINA

Introduccin

En la presente prctica se llevar a cabo una prueba de ELISA para determinar

la presencia de tiroxina total en muestras desconocidas. Esta prctica pretende

ilustrar al estudiante sobre cmo se lleva a cabo una determinacin sencilla usandola tcnica de ELISA, enfatizando los cuidados que debe tenerse para asegurar el

resultado obtenido.

Objetivos

Que el estudiante:

1.Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de T4

total en muestras desconocidas.

2.Reconozca los cuidados que debe tenerse durante todas las etapas de la

realizacin de una prueba de ELISA

Alcance

Que el estudiante:

1.Explique el esquema de la tcnica de ELISA utilizado.

2.Demuestre la forma correcta de utilizar una micropipeta.

3. Indique la importancia de realizar correctamente los lavados durante una

determinacin por tcnica de ELISA

4.Conozca la forma correcta de manejar una muestra clnica para asegurar su

integridad y la calidad de los resultados obtenidos

5.Practique las precauciones indicadas durante el manejo de muestras clnicas.


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Antecedentes

TiroxinaT4 total Tetraiodotironina

La Tiroxina es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Ms

del 99% de T4 en la sangre est unida reversiblemente a las protenas

plasmticas (principalmente a Globulina unida a Tiroxina, TBG), quedando

una parte muy pequea libre, que es la porcin que controla los procesos

metablicos.

Es parte integrante del perfil tiroideo, el cual se emplea en el diagnostico

de toda afeccin tiroidea y su dosificacin aislada, debe de interpretarse con

reservas. Sin embargo, en el recin nacido, su dosificacin permitediagnosticar precozmente el hipotiroidismo congnito y evitar el retraso

mental.

Niveles elevados de T4 han sido encontrados en hipertiroidismo debido a

enfermedad de Grave y de Plummer as como en tiroiditis aguda y subaguda.

Bajos niveles de T4 han sido asociados con cretinismo, mixedema,

enfermedad de Hashimoto y algunas anormalidades genticas.

TriiodotironinaT3 total

Es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Ms del 99% deT4 en la sangre est unida reversiblemente a las protenas plasmticas. La

concentracin de T3 es mucho ms baja que la de T4, pero su potencia

metablica es mucho ms alta. Al igual que la T4, la T3 representa una

herramienta muy valiosa para el diagnstico de enfermedad tiroidea.

PreLaboratorio

Antes de llegar al laboratorio, investigue:

1. Qu significa el trmino ELISA competitivo?

2. Para la realizacin de T3 y T4 se utilizar un ELISA de tipo competitivo,

hacer un esquema de este tipo de ELISA.

Materiales

a.Reactivos

Calibradores


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Enzima Conjugado-antignico

Solucin de lavado

Reactivo Sustrato

Solucin STOP

Muestra desconocida para T3 y T4

b.Instrumentacin

Tiras de micropocillos

Micropipetas de 10 a 100 L, 100-1000 L

Puntas para micropipeta azules y amarillas

Procedimiento

1. Se le proporcionarn las muestras a utilizar para el anlisis. En este caso,

debe usarse muestras de suero o plasma (Cul es la diferencia?), que se

haya obtenido usando EDTA o heparina como anticoagulantes. No debe

usarse muestras hiperlipidmicas o hemolizadas (Qu quiere decir esto y

por qu?).

2. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarse.

Para obtener resultados reproducibles, es importante agregar los reactivos

en el mismo orden y con el mismo tiempo en todos los pocillos.

Determinacin de T3

Pozo A1 B1 C1 D1 E1

Calibrador 1 50L

Calibrador 2 50L

Calibrador 3 50L

Muestra 1 50L

Muestra 2 50L

Conjugado 100L 100L 100L 100L 100L




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Substrato 100L 100L 100L 100L 100L


STOP 50L 50L 50L 50L 50L

Mezclar cuidadosamente e interpretar

Determinacin de T4

Pozo A1 B1 C1 D1 E1

Calibrador 1 25L

Calibrador 2 25L

Calibrador 3 25L

Muestra 1 25L

Muestra 2 25L

Conjugado 100L 100L 100L 100L 100L



Substrato 100L 100L 100L 100L 100L


STOP 50L 50L 50L 50L 50LMezclar cuidadosamente e interpretar

Observaciones importantes

- Se le darn diferentes calibradores (por mesa se utilizarn 3), los cuales

tienen una concentracin conocida de T3 o T4.

- Calibradores para T3

oA = 0 ng/mL

oB = 0.50 ng/mLoC = 1.00 ng/mL

oD = 2.50 ng/mL

oE = 5.00 ng/mL

oF = 7.50 ng/mL


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- Calibradores para T4

oA = 0 g/mL

oB = 2.0 g/mL

oC = 5.0 g/mL

oD = 10.0 g/mL

oE = 15.0 g/mL

oF = 25.0 g/mL

- Deber de tener en cuenta que prueba est realizando su mesa, si T3 o T4.

- Deber de conocer cuales calibradores est utilizando su grupo de trabajo.

Interpretacin de resultados

Los resultados se interpretaran de la siguiente manera:

- Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio

de cruces, siendo de menor (+) a mayor (+++) intensidad.

- Los calibradores le servirn para que pueda comparar estos contra su muestra

y as saber la concentracin de cortisol presente en sus muestras.

Anexo

Investigue brevemente qu condiciones mdicas pueden dar origen a niveles

alterados (elevados o disminuidos) de la hormona T4 y T3. Existen otras pruebasque deben acompaar a stas?



Theory, Analysis, Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc. pg. 827-848

2. Inserto del producto. T4 Prueba ELISA para la determinacin cuantitativa

de Tiroxina Total (T4) en suero o plasma humanos.


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REALIZADO POR:LICDA.GABRIELA CIFUENTES

MODIFICADO POR:LICDA.NANCY DEL CID (2011)

PRCTICA NO.9

DETERMINACIN CUALITATIVA DE CORTISOL POR EL MTODO DE ELISA

Introduccin

El cortisol es el principal glucococorticoide secretado por la corteza suprarrenal

humana y el esteroide ms abundante en la sangre perifrica. Estudios han

demostrado que todo el cortisol secretado deriva del colesterol circulante en

condiciones basales y como resultado de la estimulacin aguda conadrenocorticotropina (ACTH).

Objetivos

Que el estudiante:

1.Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de

cortisol en muestras desconocidas.

2.Reconozca los puntos crticos en la realizacin de una prueba de ELISA.

Alcance

Que el estudiante

1.Adquiera destreza en el manejo y preparacin de una placa de ELISA.

2.Explique el esquema de la tcnica de ELISA competitivo y pueda reconocer

las diferencias que existen entre cada tipo de ELISA.

Antecedentes

El cortisol, tambin llamado hidrocortisona o componente F, es un esteroide de21 carbonos y es el glucocorticoide ms importante en el humano. Es formado y

secretado por la corteza suprarrenal. El 90% del cortisol est ligado a la protena

plasmtica transcortina, mientras que alrededor del 7% est unida a la albumina.

El resto de forma libre (alrededor de un 3%) es la forma biolgicamente activa del

cortisol, el cual puede determinarse en muestras de suero, plasma, saliva y orina.


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Regulacin de la Secrecin de Cortisol

La secrecin del cortisol est determinada por el ndice de secrecin de ACTH

por parte de la adenohipfisis bajo la estimulacin del factor de liberacin de

corticotropina (CRF) procedente del hipotlamo. El ndice de secrecin de ACTH

presenta el balance entre las influencias estimuladoras del sistema nervioso central

y las inhibidoras del cortisol circulantes sobre la hipfisis o los centros hipotalmicos.

El descenso del cortisol plasmtico no unido a protenas produce un aumento en

la secrecin de ACTH y un ascenso inhibe dicha secrecin. Sin embargo, pueden

producirse variaciones diarias de los niveles de ACTH en el plasma en ausencia

de toda variacin de los niveles plsmaticos de cortisol (Enfermedad de Addison),

por lo que la periodicidad circadiana parece ser secundaria a la periodicidad en la

secrecin de ACTH. Esta secrecin puede comenzar a concentracin cero de

cortisol en plasma o a una alta concentracin de cortisol o ACTH, por lo que es

dudoso que el concepto usual de un mecanismo cerrado de retroaccin negativa

cumpla alguna funcin en la regulacin minuto a minuto de la secrecin de cortisol

en el hombre.

En el hombre, el ndice de secrecin de ACTH d ha calculado en unos 10g/da

y la concentracin plasmtica, entre las 6 y las 9 de la maana, en 20100pg/ml.

Las concentraciones plasmticas de ACTH y cortisol, muestran en individuos

normales no sometidos a estrs, variaciones cclicas constantes en un periodo de

24 horas. En sujetos que tienen un ciclo sueo-vigilia normal, los niveles

plasmticos son el resultado de una serie de episodios secretorios distintos y son

ms elevados entre la 6 y las 9 de la maana, para descender lentamente hasta

alcanzar valores prximos a cero cerca de medianoche. La secrecin episdica

de cortisol y ACTH representa una serie de impulsos de amplitud y duracin

variable; durante estos episodios, el ndice de secrecin de cortisol puede variar

hasta 10 veces. Los impulsos de secrecin guardan correlacin generalmente con

la concentracin plasmtica de ACTH. No obstante, algunos individuos muestran

escasa correlacin entre la ACTH detectable por inmunoensayo o bioensayo y el

cortisol plasmtico. El ritmo circadiano depende del esquema sueo-vigilia, y es

independiente de la ingestin de alimentos, del ejercicio o de la luz. El acto


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inmediato de dormirse o despertarse no es el determinanate directo de la actividad

suprarrenal, y el aumento de ACTH que se produce a diario antes del despertar

es probablemente una respuesta condicionada debida a la anticipacin

subconsciente de dich despertar.

Pre-Laboratorio

1.Qu significa la frase proceso de retroacoplamiento negativo?

2.Que tcnica analtica funciona mejor para la medicin de hormonas y por

qu?

3.Cul es la importancia de realizar una prueba de cortisol?4.Haga un esquema para ejemplificar lo que sucede al realizar un ELISA

COMPETITIVO

Materiales

a.Reactivos

Muestra desconocida

Calibradores para cortisol

Solucin de conjugado

Solucin de lavado (diluida)

Solucin de sustrato

Solucin STOP

Cloro 5%

Alcohol 70%

b.Equipo

Micropipetas de 2 a 20L

Micropipetas de 10 a 100L

Micropipetas de 100 a

1000L

Puntas para micropipetas

Pocillos para ELISA

Procedimiento

Se le proporcionarn las muestras a utilizar para el anlisis, que pueden ser suero

o plasma obtenido con EDTA. No debe usarse muestras hiperlipidmicas o

hemolizadas, ni

Manual Bioquímica III

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