1. Robert K. MURRAY David A. BENDER Kathleen M. BOTHAM Peter J. KENNELLY Victor W. RODWELL P. Anthony WEIL HARPER Bioqumica ilustrada LANGE

2. Harper, Bioqum ica ilustrada mantiene su esencia como un texto completo, conciso y actualizado, que esclarece y explica el vnculo entre la Bioqumica y las bases moleculares de la salud y la enferm edad. En esta 28a edicin el lector encontrar cambios significativos incluyendo una conversin a todo color de las imgenes presentadas , as como una revisin y actualizacin de cada uno de los captulos, todo lo cual refleja los avances ms recientes en el conocimiento y la tecnologa disponibles. De ese modo se convierte en una obra vigente y tambin relevante desde el punto de vista clnico. A travs del contenido el lector notar el justo y preciso equilibrio entre obtener los detalles importantes sobre los temas tratados y, a la vez, mantener el texto con la brevedad indispensable para ser legible y puntual. Todo ello hace de Harper, Bioqum ica ilustrada, 28a edicin, un ttulo fundamental y la mejor referencia para el aprendizaje o consulta de los aspectos bioqumicos aplicados al rea clnica. Lo nuevo en esta edicin Presentacin a todo color, lo cual incluye ms de 600 ilustraciones. Cada captulo inicia con un anlisis titulado "Im portancia biom dica" y concluye con otro apartado que resume los puntos ms significativos que deben tenerse en mente. Dos captulos nuevos: Radicales libres y nutrientes antioxidantes e Historias de caso bioqumicas; este ltimo contiene una amplia presentacin de 16 padecim ientos clnicos. Incluye dos apndices; el primero lista resultados clnicos de laboratorio bsicos y el segundo est conform ado por importantes sitios en la red sobre Bioqumica y revistas en lnea. Se abordan aspectos nuevos o actualizados sobre tem as cruciales en este campo, como el Proyecto del Genom a Humano y la Bioinformtica. Visite: www.mhhe.com/medicina/murray_bi28e g EducacinHill TheMcGraw-Hill Companies 3. Caractersticas clave en esta nueva edicin! Influencia del Proyecto del Genoma Hum ano en varios campos biomdicos Revisin de la utilizacin de enzimas en el diagnstico mdico Material nuevo sobre los descubrimientos de frmacos con ayuda de computadoras Recopilacin de algunas enfermedades conformacionales Informacin nueva sobre productos terminales de glucola- cin avanzada y su importancia en la diabetes mellitus Datos recientes sobre la unin del virus de la influenza a las clulas humanas Retos importantes que enfrenta la medicina actual Las actualizaciones bioqumicas incluyen: Anlisis extendido sobre la espectrom etra de masas, un mtodo analtico clave en la bioqumica contempornea Figuras nuevas que revelan varios aspectos de la estructura protenica Amplio anlisis sobre sitios activos de enzimas y estados transicionales Informacin nueva acerca de mtodos de valoracin enzimticos Cobertura ms amplia en lo referente a diferentes aspectos de la cintica de las enzimas Informacin nueva sobre micro RNA y RNA silenciadores Material reciente acerca de los mecanismos de transcripcin eucaritica, incluyendo la biognesis de micro-RNA y la funcin de los nucleosomas Descripcin de las actividades de los micro RNA Material nuevo relacionado con la siguiente generacin de plataformas de secuencia (NGS) Informacin reciente referente a la tecnologa de inm uno- precipitacin de cromatina (CHIP) y sus aplicaciones Avances acerca de la localizacin subcelular de enzimas clave de sealizacin (cinasas, fosfatasas) Nueva informacin sobre cmo afectan las horm onas la transcripcin gentica C 7 , U i .. Presentacin a todo color que incluye ms de 600 ilustraciones -----m------m 4. Contenido Prefacio ix 1. Bioqumica y medicina Robert K. Murray, M D, PhD 1 2. Agua y pH Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 6 S E C C I N ESTRUCTURAS Y FUNCIONES DE PROTENAS Y ENZIMAS 14 3. Aminocidos y pptidos Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 14 4. Protenas: determinacin de la estructura primaria Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 21 5. Protenas: rdenes de estructura superiores Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 31 6. Protenas: mioglobina y hemoglobina Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 43 7. Enzimas: mecanismo de accin Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 51 8. Enzimas: cintica Peter f. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 62 9. Enzimas: regulacin de actividades Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 75 10. Bioinformtica y biologa computacional Peter J. Kennelly, PhD y Vctor W. Rodwell, PhD 84 S E C C I N BIOENERGTICA Y EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y LPIDOS 92 11. Bioenergtica: la funcin del ATP Kathleen A i Botham, PhD, DSc y Peter A. Mayes, PhD, DSc 92 12. Oxidacin biolgica Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. Mayes, PhD, DSc 98 13. Cadena respiratoria y fosforilacin oxidativa Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. Mayes, PhD, DSc 103 14. Carbohidratos importantes desde el punto de vista fisiolgico D avid A. Bender, PhD 113 15. Lpidos de importancia fisiolgica Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 121 16. Perspectiva general del metabolismo y el suministro de combustibles metablicos D avid A. Bender, PhD 131 17. El ciclo del cido ctrico: el catabolismo de la acetil-CoA D avid A. Bender, PhD 143 18. Gluclisis y la oxidacin de piruvato D avid A. Bender, PhD 149 19. Metabolismo del glucgeno D avid A. Bender, PhD 157 5. v iii CONTENIDO 20. Gluconeognesis y el control de la glucosa en la sangre D avid A. Bender, PhD 165 21. La va de pentosa fosfato y otras vas del metabolismo de hexosas D avid A. Bender, PhD 174 22. Oxidacin de cidos grasos: cetognesis Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 184 23. Biosntesis de cidos grasos y eicosanoides Kathleen M . Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 193 24. Metabolismo de acilgliceroles y esfingolpidos Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 205 25. Transporte y almacenamiento de lpidos Kathleen M . Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 212 26. Sntesis, transporte y excrecin de colesterol Kathleen M. Botham, PhD, DSc y Peter A. M ayes, PhD, DSc 224 s e c c i n H I METABOLISMO DE PROTENAS Y AMINOCIDOS 234 27. Biosntesis de los aminocidos no esenciales desde el punto de vista nutricional Victor W. Rodwell, PhD 234 28. Catabolismo de protenas y de nitrgeno de aminocidos Victor W. Rodwell, PhD 239 29. Catabolismo de los esqueletos de carbono de aminocidos Victor W. Rodwell, PhD 248 30. Conversin de aminocidos en productos especializados Victor W. Rodwell, PhD 262 s e c c i n |/ ESTRUCTURA, FUNCIN Y REPLICACIN DE MACROMOLCULAS INFORMACIONALES 285 32. Nucletidos Victor W. Rodwell, PhD 285 33. Metabolismo de nucletidos, purina y pirimidina Victor W. Rodwell, PhD 292 34. Estructura y funcin del cido nucleico P. A nthony Weil, PhD 302 35. Organizacin, replicacin y reparacin de DNA P. Anthony Weil, PhD 312 36. Sntesis, procesamiento y modificacin del RNA P. A nthony Weil, PhD 335 37. Sntesis de protenas y el cdigo gentico P. A nthony Weil, PhD 353 38. Regulacin de la expresin gnica P. A nthony Weil, PhD 369 39. Gentica molecular, DNA recombinante y tecnologa genmica P. A nthony Weil, PhD 388 s e c c i n/ BIOQUMICA DE LA COMUNICACIN EXTRACELULAR EINTRACELULAR 406 40. Membranas: estructura y funcin Robert K. M urray, M D, PhD y D aryl K. Granner, M D 406 41. La diversidad del sistema endocrino P. Anthony Weil, PhD 425 42. Accin hormonal y transduccin de seal P. A nthony Weil, PhD 444 31. Porfirinas y pigmentos biliares Robert K. M urray, M D, PhD 271 6. CONTENIDO S E C C I N TEMAS ESPECIALES 459 43. Nutricin, digestin y absorcin D avid A. Bender, PhD 459 44. Micronutrientes: vitaminas y minerales D avid A. Bender, PhD 467 45. Radicales libres y nutrientes antioxidantes D avid A. Bender, PhD 482 46. Trfico y distribucin intracelulares de protenas Robert K. Murray, M D, PhD 487 47. Glucoprotenas Robert K. Murray, M D, PhD 506 48. La matriz extracelular Robert K. Murray, M D, PhD y Frederick W. Keeley, PhD 527 49. Msculo y el citoesqueleto Robert K. Murray, M D, PhD 545 50. Protenas plasmticas e inmunoglobulinas Robert K. Murray, M D, PhD 566 51. Hemostasia y trombosis Peter L. Gross, M D, Robert K. Murray, M D, PhD y M argaret L. Rand, PhD 583 52. Eritrocitos y leucocitos Robert K. Murray, M D, PhD 593 53. Metabolismo de xenobiticos Robert K. Murray, M D, PhD 609 54. Historias de caso bioqumicas Robert K. Murray, M D, PhD y Peter L. Gross, M D 616 Apndice I 647 Apndice II 648 ndice alfabtico 651 7. Prefacio Los autores y la editorial se complacen en presentar la vigsimo ctava edicin de Harper, Bioqumica ilustrada. Esta edicin pre- -enta por vez primera mltiples imgenes a color, muchas de ellas neditas, mismas que recalcan de manera vivida la complejidad empre creciente del conocimiento sobre bioqumica. La foto grafa de la portada de protena fluorescente verde (GFP), la cual reconoce el otorgamiento del premio Nobel 2008 en qumica a Martin Chalfie, Roger Y. Tsien y Osamu Shimomura, refleja el incapi de este libro en los nuevos avances. Junto con sus deriva- ios, la GFP cumple con una funcin que crece de manera cons- m te en lo referente al rastreo del movimiento de protenas en clulas y tejidos intactos, adems de que tiene mltiples aplicacio nes en los campos de biologa celular, bioqumica y medicina. En esta edicin damos un triste hasta luego a quien duran- te mucho tiempo fue autor y editor, Daryl Granner. En 1983, en rreparacin para la vigsima edicin, se solicit a Daryl que es cribiera nuevos captulos acerca del sistema endocrino y el m e canismo molecular de hormonas, lo cual hizo con gran xito. En a vigsimo primera edicin asumi la responsabilidad de los ca- r .tulos sobre membranas, sntesis de protena y biologa molecu- r, adems de que escribi un nuevo captulo m uy informativo - ?bre el entonces nuevo campo de la tecnologa del DNA recom- : fiante. En el transcurso de los 25 aos siguientes, hasta la vig- s m o sptima edicin, Daryl revis de m anera continua sus capi llos a fin de proporcionar descripciones concisas e instructivas sobre estos campos complejos y en rpido cambio. Los colegas iitoriales de Daryl expresamos gratitud por sus muchas contri- : aciones inestimables como autor, editor y amigo, y le deseamos : Jo lo mejor en los futuros proyectos que emprenda. David Bender, Kathleen Botham, Peter Kennelly y Anthony ''eil, antes coautores, ahora son autores completos. Rob M urray izradece las importantes contribuciones de Peter Gross, Fred Keeley y Margaret Rand a captulos especficos, y agradece a 3 einhart Reithmeier, Alan Volchuk y David B. Williams por re- _iar los captulos 40 y 46, adems de realizar inestimables suge- rencias sobre los mismos. Tambin expresa gratitud a Kasra Highighat y M ohammad Rassouli-Rashti por leer y proponer eioras para el captulo 54. Cambios en la vigsimo octava edicin I cr.gruente con el objetivo de proporcionar a los estudiantes un ..b:o que describa e ilustre la bioqumica de una m anera integral, concisa y de fcil acceso, los autores hemos incorporado nuevo material importante en esta edicin. Se han aadido muchos cuadros y figuras nuevos. Cada captulo ha sido revisado, actua lizado y en varios casos reescrito, en gran parte a fin de incorpo rar los avances ms recientes tanto en conocimiento como en tecnologa, lo cual es de suma importancia para el entendim ien to y el ejercicio de la medicina. Hay dos captulos nuevos. El captulo 45, titulado Radicales libres y nutrientes antioxidantes, describe las fuentes de radica les libres, sus efectos perjudiciales sobre el DNA, las protenas y los lpidos, as como sus diversas participaciones en la produc cin de enfermedades como cncer y ateroesclerosis. Tambin se aborda la funcin de los antioxidantes en la neutralizacin de sus efectos perjudiciales. El captulo 54, Historias de caso bioqumicas, proporciona extensas presentaciones de 16 estados fisiopatolgicos: deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedad de Alzheimer, clera, cn cer colorrectal, fibrosis qustica, cetoacidosis diabtica, distrofia muscular de Duchenne, intoxicacin por etanol, gota, hemocro- matosis hereditaria, hipotiroidismo, kwasniorfcor (y mainufricn protenico-energtica), infarto de miocardio, obesidad, osteopo rosis y xeroderma pigmentoso. Las nuevas caractersticas importantes de inters mdico comprenden: Influencia del Human Genome Project sobre diversos campos biomdicos. Se reescribi el uso de enzimas en el diagnstico mdico. Nuevo material sobre descubrimiento de frmacos auxiliado con computadora. Compilacin de algunas enfermedades conformacionales. Nuevo material respecto a productos terminales de glucacin avanzada y su importancia en la diabetes mellitus. . Nuevo material acerca de la fijacin del virus de la gripe a las clulas del ser humano. Algunos desafos im portantes que encara la medicina. Los temas que siguen, mismos que han sido aadidos a di versos captulos, son de inters bioqumico bsico: Mayor cobertura sobre la espectrom etra de masa, un m todo analtico clave en bioqum ica contempornea. x i 8. x ii PREFACIO Nuevas figuras que revelan diversos aspectos de la estruc tura de protenas. Mayor cobertura sobre sitios activos de enzimas y estados de transicin. Nueva informacin en cuanto a mtodos de valorar enzimas. Cobertura expandida de aspectos de la cintica de enzimas. Nueva informacin sobre micro-RNA y RNA silenciadores. Nueva informacin acerca de mecanismos de transcripcin eucariticos, incluso la biognesis del mRNA y la funcin de los nucleosomas. Descripcin de actividades de miRNA. Nuevo material respecto a plataformas de Next Generation Sequencing (NGS). Nuevo material en cuanto a la tecnologa de Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) y sus usos. Nueva informacin sobre la localizacin subcelular de enzimas emisoras de seal clave (cinasas, fosfatasas). Nueva informacin acerca de cmo las horm onas afectan la transcripcin de gen. Cada captulo empieza con un resumen de la importancia bio- mdica de su contenido y concluye con un resumen en el que se revisan los principales temas cubiertos. Organizacin del libro Despus de dos captulos introductorios (Bioqumica y medici na y Agua y pH ), el libro se divide en seis secciones principa les. Todas las secciones y captulos recalcan la importancia m di ca de la bioqumica. La Seccin I aborda las estructuras y funciones de protenas y enzimas. Dado que casi todas las reacciones en las clulas son catalizadas por enzimas, es vital entender las propiedades de las enzimas antes de considerar otros temas. Esta seccin tambin contiene un captulo sobre bioinformtica y biologa compu- tacional, lo que refleja la im portancia creciente de estos temas en la bioqumica, biologa y medicina modernas. En la Seccin II se explica cmo diversas reacciones celula res utilizan energa o la liberan, y se rastrean las vas mediante las cuales los carbohidratos y lpidos son sintetizados y degradados. Aqu tambin son descritas las muchas funciones de estas dos clases de molculas. La Seccin III trata de los aminocidos, sus muchos desti nos metablicos, ciertas caractersticas clave del catabolismo de protenas, as como la bioqumica de las porfirinas y los pigm en tos biliares. La Seccin IV describe las estructuras y funciones de los nucletidos y los cidos nucleicos, incluye temas como replica- cin y reparacin del DNA, sntesis y modificacin del RNA, sntesis de protena, los principios de la tecnologa de DNA re- combinante y genmica, adems del nuevo entendim iento sobre cmo est regulada la expresin de gen. En la Seccin V se aborda la comunicacin extracelular e intracelular. Los temas incluyen estructura y funcin de m em brana, las bases moleculares de las acciones de horm onas y el campo clave de la transduccin de seal. La Seccin VI trata 12 temas especiales: nutricin, diges tin y absorcin; vitaminas y minerales; radicales libres y an tioxidantes; trfico intracelular y clasificacin de protenas; glu- coprotenas; la matriz extracelular; msculo y citoesqueleto; protenas plasmticas e inmunoglobulinas; hemostasia y trom bosis; eritrocitos y leucocitos; el metabolismo de xenobiticos; as como 16 historias de caso orientadas hacia la bioqumica. El ltimo captulo concluye con un breve eplogo que indica algu nos desafos importantes para la medicina, en cuya solucin la bioqumica y disciplinas relacionadas tendrn funciones clave. El Apndice I contiene una lista de importantes resultados de laboratorio para los casos comentados en el captulo 54. El Apndice II incluye una lista de sitios Web tiles, as como una gua de revistas de bioqumica o revistas con conside rable contenido bioqumico. Agradecimientos Los autores agradecen a Michael Weitz por su vital participacin en la planeacin y la actualizacin de esta edicin; ha sido un placer trabajar con l. Tambin agradecemos mucho a Kim Da- vis por su profesional supervisin de la edicin del libro, Sherri Souffrance por supervisar su produccin, Elise Langdon por su diseo, y Margaret Webster-Shapiro por su trabajo en la ilustra cin de la portada. Valoramos con gratitud el trabajo de los artis tas, tipgrafos y otros colaboradores a quienes desconocemos pero que participaron en la produccin de la vigsimo octava edicin de Harper. Bioqumica ilustrada. En particular, un pro fundo agradecimiento a Joanne Jay de Newgen North America por su participacin fundamental en la adm inistracin de todo el proyecto, as como a Joseph Varghese de Thomson Digital por su hbil supervisin de la gran cantidad de ilustraciones com prendidas en esta edicin. Las sugerencias de estudiantes y colegas de todo el m undo han sido de enorm e utilidad en la formulacin de esta edicin. Esperamos recibir aportaciones similares en el futuro. Robert K. Murray, Toronto, Ontario, Canad David A. Bender, Londres, Reino Unido Kathleen M. Botham, Londres, Reino Unido Peter J. Kennelly, Blacksburg, Virginia, Estados Unidos Victor W. Rodwell, West Lafayette, Indiana, Estados Unidos P. Anthony Weil, Nashville, Tennessee, Estados Unidos 9. Bioqumica y medicina Robert K. Murray, MD, PhD C A P T U L O 1 INTRODUCCIN La bioqumica puede definirse como la ciencia de la base qumica de la vida (del griego bios, vida). La clula es la unidad estructural de los sistemas vivos. De este modo, tambin es factible describir a la bioqumica como la ciencia de los constituyentes qumicos de las clulas vivas, y de las reacciones y los procesos que experimentan. Me diante esta definicin, la bioqumica abarca grandes reas de la bio loga celular, la biologa molecular y la gentica molecular. El objetivo de la bioqumica es describir y explicar, en trminos moleculares, todos los procesos qumicos de las clulas vivas El principal objetivo de la bioqumica es el entendimiento completo, en el nivel molecular, de todos los procesos qumicos relacionados con las clulas vivas. Para lograr este objetivo, los bioqumicos han buscado aislar las numerosas molculas que se encuentran en las clulas, determinar su estructura y analizar cmo funcionan. Se han usado muchas tcnicas para estos propsitos; algunas de ellas se re sumen en el cuadro 1-1. El conocimiento de la bioqumica es esencial para todas las ciencias de la vida La bioqumica de los cidos nucleicos ocupa un lugar fundamental justo en el corazn de la gentica; a su vez, el uso de mtodos gen ticos ha sido crucial para dilucidar muchas reas de la bioqumica. La fisiologa, el estudio de la funcin del cuerpo, se superpone con la bioqumica casi por completo. En la inmunologa se emplean muchas tcnicas bioqumicas y numerosos mtodos inmunolgicos han encontrado amplio uso por bioqumicos. La farmacologa y la farmacia se fundamentan en un slido conocimiento de la bio qumica y la fisiologa, en particular, casi todos los frmacos son metabolizados mediante reacciones catalizadas por enzimas. Los ve nenos actan sobre reacciones o procesos bioqumicos; ste es el tema de estudio de la toxicologa. Los mtodos bioqumicos cada vez reciben un uso ms amplio en la investigacin relacionada con los aspectos bsicos de la patologa (el estudio de la enfermedad), como la inflamacin, la lesin celular y el cncer. Muchos investiga dores en microbiologa, zoologa y botnica emplean mtodos bioqumicos de manera casi exclusiva. Estas relaciones no sorpren den, porque la vida, como se le conoce, depende de reacciones y pro cesos bioqumicos. De hecho, las antiguas barreras entre las ciencias de la vida estn derrumbndose y la bioqumica est llegando a ser, cada vez de manera ms frecuente, su lenguaje comn. Una relacin recproca entre la bioqumica y la medicina ha estimulado avances mutuos Las dos preocupaciones ms importantes para los investigadores en las ciencias de la salud y en particular para los mdicos son tanto el entendimiento y el mantenimiento de la salud, como la comprensin y el tratamiento efectivo de las enfermedades. La bio qumica tiene enormes repercusiones sobre estas dos preocupa ciones fundamentales de la medicina. De hecho, la interrelacin de la bioqumica y la medicina es una amplia avenida que circula en dos sentidos. Los estudios bioqumicos han esclarecido muchos as pectos de la salud y la enfermedad, a la inversa, el estudio de diver sos aspectos de la salud y la enfermedad ha abierto nuevas reas en la bioqumica. En la figura 1-1 se muestran algunos ejemplos de esta avenida de dos direcciones. Por ejemplo, el conocimiento de la es tructura y la funcin de las protenas fue necesario para dilucidar la diferencia bioqumica nica entre la hemoglobina normal y la de clulas falciformes. Por otra parte, el anlisis de la hemoglobina de clulas falciformes ha contribuido de manera significativa al en tendimiento de la estructura y la funcin tanto de la hemoglobina como de otras protenas normales. Cabra citar ejemplos anlogos de beneficio recproco entre la bioqumica y la medicina para los otros incisos pareados que muestra la figura 1-1. Otro ejemplo es la investigacin pionera de Archibald Garrod, mdico que ejerci en Inglaterra a principios del siglo xx, quien estudi a pacientes con diversos trastornos hasta cierto punto raros (alcaptonuria, albinis mo, cistinuria y pentosuria; los cuales se describen en captulos pos teriores), y estableci que estas enfermedades estaban determinadas por mecanismos genticos. Garrod design a estas enfermedades como errores innatos del metabolismo (metabolopatas); sus ideas proporcionaron un importante fundamento para el desarrollo de la gentica bioqumica humana. Los esfuerzos ms recientes por entender la base de la enfermedad gentica conocida como hiperco- lesterolemia familiar, que origina aterosclerosis grave a una edad temprana, han llevado a alcanzar un progreso notorio del entendi miento de los receptores celulares y de los mecanismos de captacin del colesterol por las clulas. Los estudios de oncogenes en clulas cancerosas han dirigido la atencin hacia los mecanismos molecu lares involucrados en el control del crecimiento celular normal. Ta les ejemplos y muchos otros recalcan la manera en que el estudio de 1 10. 2 CAPTULO 1 Bioqumica y medicina la enfermedad llega a abrir reas de la funcin celular para investi gacin bioqumica bsica. La relacin entre medicina y bioqumica tiene inferencias im portantes para la primera. Mientras el tratamiento mdico est fun damentado con firmeza en el conocimiento de la bioqumica y otras ciencias bsicas, la prctica de la medicina tendr una base racio nal capaz de adaptarse para dar cabida al nuevo conocimiento. Esto contrasta con prcticas de salud no ortodoxas y con al menos algu nas opciones de medicina alternativa que a menudo estn funda mentadas en poco ms que mitos e ilusiones y, por lo general, care cen de base intelectual alguna. CUADRO 1-1 Principales mtodos y preparaciones usados en laboratorios de bioqumica Mtodos para separar biomolculas y purificarlas1 Fraccionamiento de sal (p. ej., precipitacin de protenas con sulfato de amonio) Cromatografa: en papel, de intercambio inico, de afinidad, de capa delgada, de gas-lquido, de lquido a alta presin, de filtracin en gel Electroforesis: en papel, de alto voltaje, en agarosa, en acetato de celu losa, en gel de almidn, en gel de poliacrilamida, en gel de dodecil sulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida Ultracentrifugacin Mtodos para determinar estructuras de las biomolculas Anlisis elemental Espectroscopia con luzultravioleta (UV),visible, infrarroja ycon resonancia magntica nuclear (NMR) Uso de hidrlisis en cido oalcal para degradar la biomolcula en estudio hacia sus constituyentes bsicos Uso de un conjunto de enzimas de especificidad conocida para degradar la biomolcula en estudio (p. ej., proteasas, nucleasas, glucosidasas) Espectrometra de masa Mtodos de secuenciacin especficos (p. ej., para protenas y cidos nu cleicos) Cristalografa con rayos X Preparaciones para estudiar procesos bioqumicos Animal entero (incluye animales transgnicos y animales con genes noqueados) rgano aislado perfundido Corte de tejido Clulas enteras Homogeneizado Organelos celulares aislados Subfraccionamiento de organelos Metabolitos y enzimas purificados Genes aislados (incluso reaccin en cadena de polimerasa y mutagnesis dirigida hacia sitio) 'Casi todos estos mtodos son dneos para analizar los componentes presentes en homogeneizados de clulas y en otras preparaciones bioqumicas. El uso secuencial de varias tcnicas por lo general permitir la purificacin de casi todas las biomolculas. El lector encontrar detalles en libros sobre mtodos de investigacin bioqumica. LOS PROCESOS BIOQUMICOS NORMALES SON LA BASE DE LA SALUD La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) define a la salud como el estado de bienestar fsico, mental y social completo, y no tan slo la ausencia de enfermedad. Desde un punto de vista estrictamente bioqumico, cabe considerar a la salud como aquella situacin en la cual las muchas miles de reacciones intracelulares y extracelulares que ocurren en el cuerpo estn procediendo a ndices acordes con la supervivencia mxima del organismo en el estado fisiolgico. Sin embargo, se trata de un punto de vista en extremo reduccionista, debe quedar de manifiesto que el cuidado de la salud de los pacien tes no slo requiere un amplio conocimiento de los principios bio lgicos, sino tambin de principios psicolgicos y sociales. La investigacin bioqumica tiene repercusiones sobre la nutricin y la medicina preventiva Un prerrequisito importante para el mantenimiento de la salud es la ingestin ptima de diversas sustancias qumicas en la die ta, entre las cuales destacan vitaminas, algunos aminocidos, ciertos cidos grasos, diversos minerales y agua. Dado que gran parte del tema de estudio tanto de la bioqumica como de la nu tricin comprende diversos aspectos de estas sustancias qum i cas, hay una estrecha relacin entre ambas ciencias. Ms an, se est haciendo hincapi en los intentos sistemticos por mantener la salud y prevenir la enfermedad, esto es, en medicina preven tiva, as que se observa un nfasis en los mtodos nutricionales para por ejemplo tratar la prevencin de aterosclerosis y cn cer. El entendimiento de la nutricin depende en gran medida del conocimiento sobre bioqumica. Casi todas las enfermedades (quiz todas) tienen una base bioqumica Los autores creen que casi todas las enfermedades, si no es que to das, son manifestaciones de anormalidades de molculas, reacciones qumicas o procesos bioqumicos. En el cuadro 1-2 se listan los principales factores que generan enfermedades en animales y se res humanos; todos afectan una o ms reacciones qumicas o mo lculas cruciales en el cuerpo. Este libro presenta muchos ejemplos de las bases bioqumicas de las enfermedades; en casi todas ellas los estudios bioqumicos contribuyen tanto al diagnstico como al tratamiento. El cuadro 1-3 resume algunos usos importantes de in vestigaciones bioqumicas y pruebas de laboratorio en relacin con enfermedades. El captulo 54 de este libro provee an ms ayu da para ilustrar la relacin entre bioqumica y enfermedad al co mentar con cierto detalle los aspectos bioqumicos de 16 casos m dicos diferentes. Al final del captulo 54 se esbozan de manera muy sucinta algu nos de los principales desafos que la medicina y las ciencias de la salud relacionadas encaran. Al abordar estos desafos, los estudios bioqumicos ya estn entrelazados, y seguirn estndolo, con estu dios en varias otras disciplinas, como gentica, inmunologa, nutri cin, patologa y farmacologa. 11. CAPTULO 1 Bioqumica y medicina 3 Bioqumica c nuc , dos elcos Prote k t snas i l Lp i dos Carbof 1 ! Idratos ' Enferrr gene i y edades Depran ticas r ocitosisi Ateros r r ' clerosis Diab mel etes itus Medicina FIGURA 1-1 Ejemplos de la avenida en dos direcciones que conecta la bioqumica y la medicina. El conocimiento de las molculas bioqumicas mostradas en la parte superior del diagrama ha esclarecido el entendimiento de las enfermedades mostradas en la mitad inferior y, a la inversa, los anlisis de las enfermedades que se muestran abajo han aclarado muchas reas de la bioqumica. Note que la drepanocitosis es una enfermedad gentica, y que tanto la aterosclerosis como la diabetes mellitus tienen componentes genticos. Repercusiones del Human Genome Project (HGP, Proyecto del Genoma Humano) sobre la bioqumica, biologa y medicina A finales del decenio de 1990, el HGP logr notorios progresos en la secuenciacin del genoma humano. Esto culmin en julio de 2000, cuando lderes de los dos grupos comprendidos en este esfuerzo (el International Human Genome Sequencing Consortium y Celera Ge nomics, compaa privada) anunciaron que se haba secuenciado ms de 90% del genoma. A principios de 2001 se publicaron versio nes borrador de la secuencia. Salvo algunos vacos, la secuencia de todo el genoma humano se complet en 2003, 50 aos despus de la descripcin de la naturaleza de doble hlice del cido desoxirribo- nucleico (DNA) por Watson y Crick. Son enormes las inferencias del HGP para la bioqumica, toda la biologa, as como para la medicina y las ciencias de la salud relacionadas, y aqu slo se mencionan algunos puntos. Ahora es posible aislar cualquier gen y, por lo general, determinar su es- CUADRO 1-2 Las principales causas de enfermedades1 '. Agentes fsicos: traumatismo mecnico, temperatura extrema, cambios repentinos de la presin atmosfrica, radiacin, descarga elctrica. 2. Agentes qumicos, incluso frmacos: ciertos compuestos txicos, fr macos teraputicos, etctera. 3. Agentes biolgicos: virus, bacterias, hongos, formas superiores de pa rsitos. 4. Falta de oxgeno: prdida del aporte sanguneo, disminucin de la capacidad transportadora de oxgeno de la sangre, envenenamiento de las enzimas oxidativas. 5. Trastornos genticos: congnitos, moleculares. 6. Reacciones inmunitarias: anafilaxla, enfermedad autoinmunitaria. 7. Desequilibrios nutricionales: deficiencias, excesos. 8. Desequilibrios endocrinos: deficiencias o excesos hormonales. 'Nota: todas las causas listadas actan al Influir sobre los diversos mecanismos bioqumicos en la clula o en el cuerpo. (Adaptado, con autorizacin, de Robblns SL, Cotram RS, Kumar V: The Pathologic Basis ofDisease, 3a. ed. Saunders, 1984. Copyright 1984 Elsevier Inc. con autorizacin de Elsevier.) tructura y funcin (p. ej mediante experimentos de secuenciacin y de gen noqueado). Muchos genes antes desconocidos han sido revelados; sus productos ya se han establecido o estn bajo estudio. Se han aclarado nuevos aspectos de la evolucin del ser humano y se han refinado los procedimientos para rastrear genes vinculados con enfermedad. En diversas secciones de este libro hay referencias al genoma humano. En la figura 1-2 se muestran reas de gran inters actual que se han desarrollado de manera directa como resultado del progreso logrado en el HGP o cuyo avance se ha visto estimulado por el mis mo. Como resultado del HGP, han surgido muchos de los llamados CUADRO 1-3 Algunos usos de investigaciones bioqumicas y pruebas de laboratorio en relacin con enfermedades Uso Ejemplo 1. Revelar las causas Demostracin de la naturaleza de los y los mecanismos defectos genticos en la fibrosis fundamentales de qustica. enfermedades 2. Suaerir tratamientos Una dieta con bajo contenido de racionales de fenilalanina para el tratamiento enfermedades con de fenilcetonuria. base en el inciso 1 3. Ayudar en el diagnstico Uso de las concentraciones plasmticas de enfermedades de trcponina IoT en el diagnstico de especficas infarto de miocardio. 4. Actuar como pruebas Uso de medicin de la tiroxina o de la de deteccin para el hormona estimulante de la tiroides diagnstico temprano de (TSH) en la sangre en el diagnstico ciertas enfermedades neonatal de hipotlroidismo congnito. 5. Ayudar a vigilar el progreso (esto es, recuperacin, empeoramiento, remisin o recada) de ciertas enfermedades 6. Ayudar en la evaluacin de la respuesta de enfermedades a la terapia Uso de la enzima plasmtica alanina aminotransferasa (ALT) en la vigilancia del progreso de hepatitis infecciosa. Uso de la medicin del antgeno carcinoembrionario (CEA) en la sangre en ciertos pacientes que han recibido tratamiento para cncer de colon. 12. 4 CAPTULO 1 Bioqumica y medicina Transcriptmica Protemica Glucmica Metabolmica BioinformticaFarmacogenmica HGP - (genmica) BiotecnologaBioingeniera BioticaBiofsica Terapia gnicaBiologa de clulas madre Diagnstico molecular Biologa de sistemas Biologa sinttica FIGURA 1-2 El Human Genome Project (HGP) ha influido sobre muchas disciplinas y reas de investigacin. Lipidmica Nutrigenmica campos de -mica, que comprenden estudios integrales de las es tructuras y funciones de las molculas que cada uno estudia. El glo sario de este captulo proporciona las definiciones de los campos listados a continuacin. Los productos de genes (molculas de cido ribonucleico [RNA] y protenas) estn bajo estudio con el uso de las tcnicas de transcriptmica y protemica. Un notorio ejemplo de la rapidez del progreso en transcriptmica es la explosin de conocimiento relacionado con molculas de RNA pequeas como reguladoras de la actividad de genes. Otros campos de -mica com prenden glucmica, lipidmica, metabolmica, nutrigenmica y farmacogenmica. Para mantenerse al da con la cantidad de infor macin que se est generando, la bioinformtica ha recibido mucha atencin. Otros campos relacionados a los cuales se ha transmitido el mpetu del HGP son biotecnologa, bioingeniera, biofsica y biotica. La biologa de clulas madre ocupa un lugar preponde rante en gran parte de la investigacin actual. La promesa que la terapia gnica lleva implcita an no se cumple, pero parece pro bable que eso ocurrir tarde o temprano. Se han creado muchas pruebas diagnsticas moleculares nuevas en reas como pruebas y diagnstico genticos, microbiolgicos e inmunolgicos. La biolo ga de sistemas tambin est en ciernes. La biologa sinttica quiz es la ms interesante de todas, cuenta con el potencial de crear orga nismos vivos (p. ej., en un inicio bacterias pequeas) a partir de material gentico in vitro, el cual quiz podra ser diseado para llevar a cabo tareas especficas (p. ej limpiar derrames de petrleo). Como en el caso de las clulas madre, esta rea atraer mucha aten cin por parte de expertos en biotica y otros. Ms adelante en este libro se hace referencia a muchos de los temas anteriores. Todo lo anterior ha hecho que la poca actual sea muy inte resante para estudiar o participar de manera directa en biologa y medicina. Los resultados de la investigacin en las diversas reas antes mencionadas tendrn grandes repercusiones en el futuro de la biologa, la medicina y las ciencias de la salud. RESUMEN * La bioqumica es la ciencia que se encarga del estudio de las diversas molculas que se encuentran en clulas y organismos vivos, as como sus reacciones qumicas. Dado que la vida depende de reacciones bioqumicas, la bioqumica se ha convertido en el lenguaje bsico de todas las ciencias biolgicas. La bioqumica se encarga del estudio de toda la gama de formas de vida, desde virus y bacterias que pudieran considerarse simples hasta seres humanos complejos. La bioqumica y la medicina estn ntimamente relacionadas. La salud depende de un equilibrio armonioso de reacciones bioqumicas que estn ocurriendo en el cuerpo, en tanto que la enfermedad refleja anormalidades en biomolculas, reacciones bioqumicas o procesos bioqumicos. Los avances en el conocimiento de la bioqumica han esclarecido muchas reas de la medicina. A la inversa, el estudio de las enfermedades a menudo ha revelado aspectos previamente no sospechados de la bioqumica. Los mtodos bioqumicos suelen ser fundamentales para esclarecer las causas de enfermedades y disear terapias apropiadas. El uso juicioso de diversas pruebas bioqumicas de laboratorio es un componente integral del diagnstico y de la vigilancia del tratamiento. Un conocimiento slido de la bioqumica y de otras disciplinas bsicas conexas es esencial para la prctica racional de la medicina y de ciencias de la salud relacionadas. Los resultados del HGP y de investigacin en reas afines tendrn una profunda influencia sobre el futuro de la biologa, la medicina y otras ciencias de la salud. REFERENCIAS Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE: Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4th ed. Elsevier Inc, 2006. Encyclopedia ofLife Sciences. John Wiley, 2001. (Contiene unos 3 000 artculos sobre diversos aspectos de las ciencias de la vida. Est disponible en lnea en www.els.net mediante una suscripcin en bibliotecas.) Fruton JS: Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay ofChemistry and Biology. Yale University Press, 1999. (Provee el contexto histrico de gran parte de la investigacin actual sobre bioqumica.) Garrod AE: Inborn errors of metabolism. (Croonian Lectures.) Lancet 1908;2:1,73,142,214. Guttmacher AE, Collins FS: Genomic medicineA primer. N Engl J Med 2002:347:1512. (Fue el primero de una serie de 11 artculos publicados 13. CAPTULO 1 Bioqumica y medicina 5 mensualmente en el New England Journal ofMedicine, describiendo diversos aspectos de la medicina genmica.) Guttmacher AE, Collins FS: Realizing the promise of genomics in biomedical research. JAMA 2005;294(11):1399. Kornberg A: Basic research: The lifeline of medicine. FASEB 11992;6:3143. Kornberg A: Centenary of the birth of modern biochemistry. FASEB J 1997:11:1209. Manolio TA, Collins FS: Genes, environment, health, and disease: Facing up to complexity. Hum Hered 2007;63:63. McKusick VA: Mendelian Inheritance in Man. Catalogs ofHuman Genes and Genetic Disorders, 12th ed. Johns Hopkins University Press, 1998. [Abreviado como MIM] Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): Center for Medical Genetics, Johns Hopkins University and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 1997. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ (Los nmeros asignados a las entradas en el OMIM sern citados en algunos captulos de este libro. Mediante consultar esta amplia presentacin de enfermedades y otras entradas relacionadas sobre protenas especficas, enzimas y dems, el lector incrementar en gran medida su conocimiento y comprensin de varios temas vinculados con este texto y que son considerados aqu. La versin en lnea es actualizada casi a diario.) Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology, rev. ed. Oxford University Press, 2000. Scriver CR et al (editors): The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill, 2001. (Este texto est ahora disponible en lnea y actualizado como The Online Metabolic & Molecular Bases ofInherited Disease en www.ommbid.com. Se requiere una suscripcin, pero el acceso est disponible en bibliotecas de universidades y hospitales, entre otras opciones.) Scherer S: A Short Guide to the Human Genome. CSHL Press, 2008. GLOSARIO Biotica: rea de la tica que se encarga de la aplicacin de principios morales y ticos a la biologa y medicina. Biofsica: aplicacin de fsica y sus tcnicas a la biologa y medicina. Bioinformtica: disciplina que se encarga de reunir, almacenar y analizar datos biolgicos, en especial secuencias de DNA y protena (vase captulo 10). Bioingeniera: aplicacin de ingeniera a biologa y medicina. Biologa de clulas madre: una clula madre es una clula indiferenciada que tiene el potencial de renovarse por s misma y de diferenciarse hacia cualquiera de las clulas adultas que se encuentran en el organismo. La biologa de clulas madre se encarga del estudio de las propiedades biolgicas de las clulas madre y sus usos en diversas enfermedades. Biologa de sistemas: campo de la ciencia en el cual se estudian sistemas biolgicos completos como enteros integrados (en contraposicin con el mtodo reduccionista de, por ejemplo, la bioqumica clsica). Biologa sinttica: campo que combina tcnicas biomoleculares con mtodos de ingeniera para construir nuevas funciones y sistemas biolgicos. Biotecnologa: campo en el cual se combinan mtodos bioqumicos, de ingeniera y otros, para crear productos biolgicos para uso en medicina y en la industria. Diagnstico molecular: uso de mtodos moleculares (p. ej., sondas de DNA) para ayudar en el diagnstico de diversas enfermedades bioqumicas, genticas, inmunitarias, microbianas y otros padecimientos mdicos. Farmacogenmica: uso de informacin y tecnologas genmicas para optimizar el descubrimiento y desarrollo de blancos teraputicos y de frmacos (vase captulo 54). Genmica: el genoma es el grupo completo de genes de un organismo (p. ej., el genoma humano), y genmica es el estudio a fondo de las estructuras y funciones de genomas (vase captulo 10y otros). Glucmica: el glucoma es la totalidad de carbohidratos simples y complejos en un organismo. La glucmica es el estudio sistemtico de las estructuras y funciones de glucomas (p. ej., el glucoma humano; vase captulo 47). Lipidmica: el lipidoma es la totalidad de lpidos que se encuentran en un organismo. La lipidmica es el estudio a fondo de las estructuras y funciones de todos los miembros del lipidoma, as como de sus interacciones, tanto en salud como en enfermedad. Metabolmica: el metaboloma es la totalidad de metabolitos (molculas pequeas comprendidas en el metabolismo) que se encuentran en un organismo. La metabolmica es el estudio a fondo de sus estructuras, funciones y cambios en diversos estados metablicos. Nutrigenmica: estudio sistemtico de los efectos de los nutrientes sobre la expresin gentica y de los efectos de variaciones genticas sobre el manejo de nutrientes. Protemica: el proteoma es la totalidad de protenas de un organismo. La protemica es el estudio sistemtico de las estructuras y funciones de proteomas, incluso variaciones en la salud y la enfermedad (vase captulo 4). Terapia gnica: se aplica al uso de genes sometidos a procesos de ingeniera gentica para tratar diversas enfermedades (vase captulo 39). Transcriptmica: el transcriptoma es el grupo completo de transcriptos de RNA producidos por el genoma a un periodo fijo en el tiempo. La transcriptmica es el estudio integral de la expresin gnica a nivel del RNA (vase captulo 36 y otros). 14. Agua y pH Peter J. Kennelly, PhD y Victor W. Rodwell, PhD C A P T U L O IMPORTANCIA BIOMDICA El agua es el componente qumico predominante de los organismos vivos. Sus singulares propiedades fsicas, que incluyen la capacidad para disolver una amplia gama de molculas orgnicas e inorgni cas, se derivan de su estructura bipolar y de su excepcional capaci dad para formar enlaces de hidrgeno. La manera en que el agua interacta con una biomolcula disuelta influye sobre la estructura de cada una. El agua, un excelente nuclefilo, es un reactivo o un producto en muchas reacciones metablicas. El agua tiene una pro pensin leve a disociarse hacia iones hidroxilo y protones. La acidez de soluciones acuosas por lo general se reporta usando la escala de pH logartmica. El bicarbonato y otros amortiguadores en circuns tancias normales mantienen el pH del lquido extracelular entre 7.35 y 7.45. Las alteraciones sospechadas del equilibrio acidobsico se verifican al medir el pH de la sangre arterial y el contenido de C 0 2de la sangre venosa. Algunas causas de acidosis (pH sanguneo < 7.35) son cetosis diabtica y acidosis lctica. La alcalosis (pH > 7.45) puede presentarse despus de vmitos de contenido gstrico cido. La regulacin del equilibrio del agua depende de mecanismos hipotalmicos que controlan la sed, de la hormona antidiurtica (ADH), de la retencin o excrecin de agua por los riones, y de la prdida por evaporacin. La diabetes inspida nefrognica, que comprende la incapacidad para concentrar orina o para hacer ajus tes a cambios sutiles de la osmolaridad del lquido extracelular, se produce por falta de capacidad de respuesta de los osmorreceptores de los tbulos renales a la ADH. EL AGUA ES UN SOLVENTE BIOLGICO IDEAL Las molculas de agua forman dipolos Una molcula de agua es un tetraedro irregular, un tanto asimtrico, con oxgeno en su centro (fig. 2-1). Los dos hidrgenos y los electro nes no compartidos de los dos orbitales sp:,-hibridados restantes ocupan los ngulos del tetraedro. El ngulo de 105 grados entre los hidrgenos difiere un poco del ngulo tetradrico ideal, de 109.5 grados. El amoniaco tambin es tetradrico, con un ngulo de 107 grados entre sus hidrgenos. El agua es un dipolo, una molcula con carga elctrica distribuida de manera asimtrica en toda su es tructura. El tomo de oxgeno fuertemente electronegativo empuja los electrones en direccin contraria a los ncleos de hidrgeno, lo que los deja con una carga positiva parcial, mientras que sus dos pares de electrones no compartidos constituyen una regin de carga negativa local. El agua, un fuerte dipolo, tiene una constante dielctrica alta. Como se describe de manera cuantitativa mediante la ley de Coulomb, la fuerza de la interaccin F entre partculas que tienen carga opuesta es inversamente proporcional a la constante dielctri ca del medio circundante. La constante dielctrica para un vaco es la unidad; para el hexano es 1.9; para el etanol, 24.3, y para el agua, 78.5. Por ende, el agua disminuye mucho la fuerza de atraccin en tre especies cargadas y polares en comparacin con ambientes libres de agua que tienen constantes dielctricas ms bajas. Su fuerte dipo lo y constante dielctrica alta permiten al agua disolver grandes can tidades de compuestos cargados, como las sales. Las molculas de agua forman enlaces de hidrgeno Un ncleo de hidrgeno parcialmente desprotegido, unido de ma nera covalente a un tomo de oxgeno o de nitrgeno que extrae electrones, puede interactuar con un par de electrones no compar tidos sobre otro tomo de oxgeno o nitrgeno para formar un enla ce de hidrgeno. Dado que las molculas de agua tienen estas dos caractersticas, la formacin de enlaces de hidrgeno favorece la au- toasociacin de molculas de agua hacia disposiciones ordenadas (fig. 2-2). La formacin de enlaces de hidrgeno ejerce una profun da influencia sobre las propiedades fsicas del agua, lo que explica su viscosidad, tensin superficial y punto de ebullicin excepcional mente altos. En promedio, cada molcula en agua lquida se asocia por medio de enlaces de hidrgeno con otras 3.5. Estos enlaces son hasta cierto punto dbiles y transitorios, con una vida media de un microsegundo o menos. La ruptura de un enlace de hidrgeno en agua lquida slo requiere alrededor de 4.5 kcal/mol, menos de 5% de la energa necesaria para romper un enlace OH covalente. La formacin de enlaces de hidrgeno permite al agua disolver muchas biomolculas orgnicas que contienen grupos funcionales que pueden participar en la formacin de enlaces de hidrgeno. Los tomos de oxgeno de aldehidos, cetonas y amidas, por ejemplo, proporcionan pares de electrones solitarios que tienen la capacidad de servir como aceptores de hidrgeno. Los alcoholes y las aminas pueden servir como aceptores de hidrgeno y como donadores de tomos de hidrgeno desprotegidos para formacin de enlaces de hidrgeno (fig. 2-3). 6 15. CAPTULO 2 Agua y pH 7 H FIGURA 2-1 La molcula de agua tiene geometra tetradrica. i H H H V / 0 ? 1 H | H > ? ,H - < / 0 X < X H - H FIGURA 2-2 Izquierda: asociacin de dos molculas de agua dipolares mediante un enlace de hidrgeno (lnea punteada). Derecha: agrupacin de cuatro molculas de agua con enlaces de hidrgeno. Note que el agua puede servir de manera simultnea como donador y como aceptor de hidrgeno. CH3 C H , O H O H H 1 CH3 CH2 O - " " x ch2 ch 3 R R"/ C = 0 --H N /R1 R1" FIGURA 2-3 Los grupos polares adicionales participan en la formacin de enlaces de hidrgeno. Se muestran los enlaces de hidrgeno formados entre alcohol y agua, entre dos molculas de etanol, y entre el oxgeno del carbonilo peptdico y el hidrgeno del nitrgeno peptdico de un aminocido adyacente. LA INTERACCIN CON AGUA INFLUYE SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS BIOMOLCULAS Los enlaces covalentes y no covalentes estabilizan molculas biolgicas El enlace covalente es la mayor fuerza que mantiene juntas a las mo lculas (cuadro 2-1). Las fuerzas no covalentes, aunque son de menor magnitud, hacen contribuciones importantes a la estructura, esta bilidad y competencia funcional de macromolculas en las clulas vivas. Estas fuerzas, que pueden ser de atraccin o de repulsin, comprenden interacciones tanto dentro de la biomolcula como en tre la misma y el agua, que es el principal componente del ambiente circundante. CUADRO 2-1 Energas de enlace para tomos de importancia biolgica Tipo de enlace Energa (kcal/mol) Tipo de enlace Energa (kcal/mol) 00 34 0 = 0 96 ss 51 CH 99 CN 70 C=S 108 SH 81 0 H 110 CC 82 c = c 147 C0 84 C=N 147 NH 94 c = o 164 Las biomolculas se pliegan para colocar a grupos polares y cargados sobre sus superficies Casi todas las biomolculas son anpticas; esto es, poseen regio nes con alto contenido de grupos funcionales cargados o polares, as como regiones con carcter hidrofbico. Las protenas tienden a plegarse con los grupos R de aminocidos con cadenas laterales hi- drofbicas en el interior. Los aminocidos con cadenas laterales de aminocidos cargadas o polares (p. ej., arginina, glutamato, serina) por lo general estn presentes sobre la superficie en contacto con agua. Un modelo similar prevalece en una bicapa de fosfolpidos, donde los grupos con cabeza cargada de fosfatidil serina o fosfatidil etanolamina tienen contacto con agua, mientras que sus cadenas laterales de cido graso (acilo) hidrofbicas se agrupan juntas y ex cluyen el agua. Este modelo maximiza las oportunidades para la for macin de interacciones de carga-dipolo, dipolo-dipolo, y formacin de enlaces de hidrgeno, favorables desde el punto de vista energ tico entre grupos polares sobre la biomolcula y el agua. Tambin minimiza contactos desfavorables desde el punto de vista energtico entre el agua y grupos hidrofbicos. Interacciones hidrofbicas El trmino interaccin hidrofbica (o hidrfoba) alude a la ten dencia de compuestos no polares a autoasociarse en un ambiente acuoso. Tal autoasociacin no est impulsada por atraccin mutua ni por lo que a veces es denominado de manera incorrecta como enlaces hidrofbicos. La autoasociacin minimiza interacciones desfavorables desde el punto de vista energtico entre grupos no po lares y agua. Dado que los hidrgenos de grupos no polares como los gru pos metileno de hidrocarburos no forman enlaces de hidrgeno, afectan la estructura del agua que los rodea. Las molculas de agua adyacentes a un grupo hidrofbico tienen restriccin en cuanto al nmero de orientaciones (grados de libertad) que les permiten par ticipar en el nmero mximo de enlaces de hidrgeno favorables desde el punto de vista energtico. La formacin mxima de ml tiples enlaces de hidrgeno slo puede mantenerse al aumentar el orden de las molculas de agua adyacentes, con una disminucin agregada de la entropa. 16. 8 CAPITULO 2 Agua y pH La segunda ley de la termodinmica establece que la energa libre ptima de una mezcla de hidrocarburo-agua est en funcin tanto de la entalpia mxima (por formacin de enlaces de hidr geno) como de la entropa mnima (grados mximos de libertad). De este modo, las molculas no polares tienden a formar gotitas a fin de minimizar el rea de superficie expuesta y reducir el nmero de molculas de agua afectadas. De modo similar, en el ambiente acuoso de la clula viva las porciones hidrofbicas de biopolmeros tienden a estar recluidas dentro de la estructura de la molcula o dentro de una bicapa lpida, lo que minimiza el contacto con agua. Interacciones electrostticas Las interacciones entre grupos cargados ayudan a dar forma a la estructura biomolecular. Las interacciones electrostticas entre gru pos que tienen carga opuesta dentro de biomolculas o entre las mismas se denominan puentes de sal, los cuales tienen fuerza com parable a la de los enlaces de hidrgeno, pero actan en distancias mayores; por ende, a menudo facilitan el enlace de molculas y iones cargados a protenas y cidos nucleicos. Fuerzas de van der Waals Surgen por atracciones entre dipolos transitorios generados por el movimiento rpido de electrones de todos los tomos neutros. Las fuerzas de van der Waals mucho ms dbiles que los enlaces de hi drgeno, pero potencialmente abundantes disminuyen en trminos de la sexta potencia de la distancia que separa a los tomos. De este modo, actan en distancias muy cortas, por lo general de 2 a 4 . Fuerzas mltiples estabilizan biomolculas La doble hlice de DNA ilustra la contribucin de mltiples fuerzas a la estructura de biomolculas. Si bien cada cadena de DNA indivi dual se mantiene junta por medio de enlaces covalentes, las dos he bras de la hlice se mantienen unidas de manera exclusiva mediante interacciones no covalentes. Estas ltimas comprenden enlaces de hidrgeno entre bases de nucletido (apareamiento de bases de Wat- son-Crick) e interacciones de van der Waals entre las bases de purina y pirimidina apiladas. La hlice presenta los grupos fosfato carga dos y azcares ribosa polares del esqueleto a agua mientras que res guarda dentro las bases nucletido relativamente hidrofbicas. El esqueleto extendido maximiza la distancia entre fosfatos que tienen carga negativa, lo que minimiza interacciones electrostticas des favorables. EL AGUA ES UN EXCELENTE NUCLEFILO Las reacciones metablicas a menudo comprenden el ataque por pa res solitarios de electrones que residen sobre molculas ricas en electrones llamadas nuclefilos sobre tomos con pocos electrones llamados electrfilos. Los nuclefilos y electrfilos no necesaria mente poseen una carga negativa o positiva formal. El agua, cuyos dos pares solitarios de electrones sp3tienen una carga negativa par cial, es un excelente nuclefilo. Otros nuclefilos de importancia biolgica son los tomos de oxgeno de fosfatos, alcoholes y cidos carboxlicos; el azufre de tioles; el nitrgeno de aminas y el anillo imidazol de la histidina. Los electrfilos comunes son los carbonos carbonilo en amidas, steres, aldehidos y cetonas, y los tomos de fsforo de fosfosteres. El ataque nucleoflico por agua a menudo origina la ruptura de los enlaces amida, glucsido o ster que mantienen juntos a los bio polmeros. Este proceso recibe el nombre de hidrlisis. A la inversa, cuando unidades de monmeros se unen para formar biopolmeros como protenas o glucgeno, el agua es un producto, por ejemplo, durante la formacin de un enlace peptdico entre dos aminocidos: +H,N OH +l-NH Alanina Valina H,0 +H,N NH Si bien la hidrlisis es una reaccin favorecida desde el punto de vista termodinmico, los enlaces amida y fosfoster de polippti- dos y oligonucletidos son estables en el ambiente acuoso de la c lula. Esta conducta al parecer paradjica refleja el hecho de que la termodinmica que rige el equilibrio de una reaccin no determina la velocidad a la cual proceder. En las clulas, catalticos protena llamadas enzimas aceleran el ndice de reacciones hidrolticas cuan do es necesario. Las proteasas catalizan la hidrlisis de protenas hacia los aminocidos que las componen, mientras que las nuclea- sas catalizan la hidrlisis de los enlaces fosfoster en el DNA y el RNA. Se requiere control cuidadoso de las actividades de estas enzi mas para asegurar que slo acten sobre molculas blanco apropia das en momentos apropiados. Muchas reacciones metablicas comprenden transferencia de grupo Muchas de las reacciones enzimticas de las cuales depende la snte sis y desintegracin de biomolculas comprenden la transferencia de un grupo qumico G desde un donador D hacia un aceptor A para formar un complejo de aceptor-grupo, A-G: D -G + A A -G + D La hidrlisis y fosforlisis de glucgeno, por ejemplo, com prenden la transferencia de grupos glucosilo hacia agua o hacia or- tofosfato. La constante de equilibrio para la hidrlisis de enlaces covalentes favorece de manera significativa la formacin de pro ductos de divisin. A la inversa, en muchos casos las reacciones de transferencia de grupo de las cuales depende la biosntesis de ma- cromolculas comprenden la formacin de enlaces covalentes no favorecida desde el punto de vista termodinmico. Las enzimas su peran dicha barrera al acoplar estas reacciones de transferencia de grupo a otras reacciones favorecidas, de modo que el cambio general de energa libre favorece la sntesis de biopolmero. Dado el carcter 17. CAPTULO 2 Agua y pH 9 nucleoflico del agua y su alta concentracin en las clulas, por qu los biopolmeros como las protenas y el DNA son relativamente es tables?, adems, de qu modo la sntesis de biopolmeros puede ocurrir en un ambiente acuoso? Las propiedades de las enzimas son fundamentales para ambas preguntas. En ausencia de catlisis enzi mtica, incluso las reacciones muy favorecidas desde el punto de vista termodinmico no necesariamente tienen lugar con rapidez. El control preciso y diferencial de la actividad enzimtica, as como el secuestro de enzimas en organelos especficos, determinan en qu condiciones fisiolgicas un biopolmero dado se sintetizar o degra dar. Los biopolmeros recin sintetizados no se hidrolizan de in mediato, lo cual en parte se debe a que los sitios activos de enzimas biosintticas secuestran sustratos en un ambiente del cual es factible excluir al agua. Las molculas de agua muestran una tendencia leve pero importante a disociarse La capacidad del agua para ionizarse, si bien es leve, tiene importan cia fundamental para la vida. Dado que el agua tiene la capacidad de actuar como un cido y como una base, su ionizacin puede repre sentarse como una transferencia de protn intermolecular que for ma un ion hidronio (H30 +) y un ion hidroxilo (OH-): H20 +H20 H30 ++OH- El protn transferido en realidad se relaciona con una agrupa cin de molculas de agua. Los protones existen en solucin no slo como H30 +, sino tambin como multmeros tipo H50 2+ y H 70 3+. Sin embargo, el protn se representa de manera sistemtica como H +, aun cuando de hecho est muy hidratado. Dado que los iones hidronio e hidroxilo se recombinan de ma nera continua para formar molculas de agua, es imposible declarar que un hidrgeno u oxgeno individual est presente como un ion o formando parte de una molcula de agua. En un instante es un ion, pero al siguiente forma parte de una molcula de agua; de modo que no se consideran iones o molculas individuales. En lugar de eso, se hace referencia a la probabilidad de que en cualquier instante en el tiempo un hidrgeno estar presente como ion o como parte de una molcula de agua. Dado que 1 g de agua contiene 3.46 X 1022 mo lculas, la ionizacin del agua puede describirse de manera estads tica. Declarar que la probabilidad de que un hidrgeno exista como un ion es de 0.01 significa que, en cualquier momento dado en el tiempo, un tomo de hidrgeno tiene una probabilidad en 100 de ser un ion pero 99 probabilidades en 100 de formar parte de una molcula de agua. La probabilidad real de que un tomo de hidrge no en agua pura exista como un ion hidrgeno es de alrededor de 1.8 X 10~9. De este modo, la probabilidad de que forme parte de una molcula de agua es de casi la unidad. Dicho de otra manera, por cada ion hidrgeno y cada ion hidroxilo en agua pura, hay 1.8 mil millones o 1.8 X 109molculas de agua. Sin embargo, los iones hi drgeno y los iones hidroxilo contribuyen de manera importante a las propiedades del agua. Para la disociacin del agua, K [H+I 0H'] donde los corchetes representan concentraciones molares (estricta mente hablando, actividades molares) y K es la constante de diso ciacin. Puesto que un mol de agua pesa 18 g, 1 litro (L) (1000 g) de agua contiene 1000 -h 18 = 55.56 mol. As, el agua pura es 55.56 molar. Dado que la probabilidad de que un hidrgeno en agua pura exista como un ion hidrgeno es de 1.8 X 10 9, la concentracin molar de iones H + (o de iones OH ) en agua pura es el producto de la probabilidad, 1.8 X 10~9, veces la concentracin molar de agua, 55.56 mol/L. El resultado es 1.0 X 10~7mol/L. Ahora es posible calcular el valor de K para el agua pura: [H20] [55.56] = 0.018 xlO 14 = 1.8 x l O16mol/L La concentracin molar del agua, 55.56 mol/L, es demasiado grande como para que la disociacin la afecte de manera significati va, de modo que se considera que, en esencia, es constante. As, esta constante puede incorporarse en la constante de disociacin K para proporcionar una nueva y til constante Kw (W, de water, agua) llamada el producto inico del agua. La relacin entre Kw y K se muestra a continuacin: rH+T O H K = L rJL , J = 1.8 x 10l6mol/L [h2o ] Kw = (K)[H20] = [H+][OH-] = (i.8 x 10-16mol/l_)(55.56 mol/L) = 1.00 x 10"'4(mol/L)2 Note que las dimensiones de K son mol por litro y las de Kwson mol2por L2. Como su nombre lo sugiere, el producto inico Kw es igual desde el punto de vista numrico al producto de las concentra ciones molares de H + y OH Kw = [H+][OH-] A 25C, Kw = (10 7)2, o 10-14 (mol/L)2; a temperaturas por de bajo de 25C, Kwes un poco menor de 10~14, en tanto que a tempe raturas superiores a 25C es un poco mayor de 1014. Dentro de las limitaciones declaradas del efecto de la temperatura, Kw es igual a 10-14 (mol/L)2para todas las soluciones acuosas, incluso soluciones de cidos o bases. Se usa Kwpara calcular el pH de soluciones cidas y bsicas. EL pH ES EL LOGARITMO NEGATIVO DE LA CONCENTRACIN DE ION HIDRGENO El trmino pH fue introducido en 1909 por Srensen, quien lo defini como el logaritmo negativo de la concentracin de ion hidrgeno: pH = -log [H+] Esta definicin, si bien no es rigurosa, es suficiente para muchos propsitos bioqumicos; a fin de calcular el pH de una solucin: 1. Se calcula la concentracin de ion hidrgeno jH T]. 2. Se calcula el logaritmo base 10 de [H+j. 3. El pH es el negativo del valor que se encuentra en el paso 2. 18. 1 0 CAPTULO 2 Agua y pH Por ejemplo, para agua pura a 25C, pH = -log [H+] = -log 10"7 = -(-7) = 7.0 Este valor tambin se conoce como la potencia (power [ingls],pwzs- sant [francs], o potennz [alemn]) del exponente, de ah el uso de p. Los valores de pH bajos corresponden a concentraciones altas de H +, y los valores de pH altos corresponden a concentraciones bajas de H +. Los cidos son donadores de protones y las bases son acepto- res de protones. Los cidos fuertes (p. ej., HC1, H2S04) se disocian por completo hacia aniones y cationes, incluso en soluciones fuerte mente acdicas (pH bajo). Por su parte, los cidos dbiles se diso cian slo en parte en soluciones acdicas. De modo similar, las bases fuertes (p. ej., KOH, NaOH) no as las bases dbiles (p. ej., Ca[OH]2) estn por completo disociadas a pH alto. Muchas sus tancias bioqumicas son cidos dbiles. Las excepciones son los in termediarios fosforilados, cuyo grupo fosforilo contiene dos proto nes disociables, el primero de los cuales es fuertemente acdico. Los ejemplos que siguen ilustran cmo calcular el pH de solu ciones cidas y bsicas. Ejemplo 1: Cul es el pH de una solucin cuya concentracin de ion hidrgeno es de 3.2 X 1(T4mol/L? pH = -log [ h+] = -og (3.2 xICT') = -log (3.2)-log (lO4) = -0.5 + 4.0 = 3.5 Ejemplo 2: Cul es el pH de una solucin cuya concentracin de ion hidroxilo es de 4.0 X 104mol/L? Primero se define una can tidad pOH que es igual a -log [OH-] y que puede derivarse a partir de la definicin de K-. Por ende * w = [ h+] [ o h -] = io - log[H+] + log[OH ] = logTO pH + pOH = 14 Para resolver el problema mediante este mtodo: [O H ] = 4.0 x 10"4 pOH = -log [O H ] = -log (4.0x10*) = -log (4.0)-log (lO-4) = -0.60 + 4.0 = 3.4 Ahora: traciones de ion hidrgeno que difieren por rdenes de magnitud de otra, esto es, 0.00032 M (pH 3.5) y 0.000000000025 M (pH 10.6). Ejemplo 3: Cules son los valores de pH para KOH de a) 2.0 X 10'2mol/L y de b) 2.0 X 10 6 mol/L? El OH- surge a partir de dos fuentes: KOH y agua. Dado que el pH est determinado por el [H+] total (y el pOH por el [OH-] total), ambas fuentes deben considerar se. En el primer caso, a), la contribucin del agua al [OH] total es insignificante; es imposible decir lo mismo para el segundo caso, b): Concentracin (mol/L) (a) (b) Molaridad de KOH 2.0 x 102 2.0 x 10'6 [OH ] de KOH 2.0 x 10'2 2.0 x 10 6 [OH-] de agua 1.0x 107 1.0 x 107 Total [OH ] 2.00001 x 10'2 2.1 x 10'6 Una vez que se ha llegado a una decisin acerca de la importan cia de la contribucin por el agua, es factible calcular el pH como se mencion. Los ejemplos anteriores suponen que la base fuerte KOH est por completo disociada en solucin y que, entonces, la concentra cin de iones OH fue igual a la del KOH ms la presente al princi pio en el agua. Esta suposicin es vlida para soluciones diluidas de bases o cidos fuertes, no asi para bases o cidos dbiles. Dado que los electrlitos dbiles slo se disocian un poco en solucin, es nece sario usar la constante de disociacin para calcular la concentra cin de [H+] (o de [OH]) producida por una molaridad dada de un cido (o base) dbil antes de calcular el [H+] total (o el [OH] total) y despus el pH. Los grupos funcionales que son cidos dbiles tienen gran importancia fisiolgica Muchas sustancias bioqumicas poseen grupos funcionales que son cidos o bases dbiles. Los grupos carboxilo, los grupos amino y los steres de fosfato, cuya segunda disociacin cae dentro del rango fisiolgico, estn presentes en protenas y cidos nucleicos, en casi todas las coenzimas y en casi todos los metabolitos intermediarios. De este modo, el conocimiento de la disociacin de cidos y bases dbiles es bsico para entender la influencia del pH intracelular so bre la estructura y la actividad biolgica. Las separaciones basadas en carga, como la electroforesis y la cromatografa de intercambio inico, tambin se entienden mejor en trminos de la conducta de disociacin de grupos funcionales. La especie protonada (p. ej., HA o RNH3+) recibe la denomi nacin de cido, en tanto que la especie no protonada (p. ej., A o RNH2) es su base conjugada. De modo similar, puede hacerse referencia a una base (p. ej., A o RNH2) y su cido conjugado (p. ej., HA o RNH3+). Los cidos dbiles representativos (colum na izquierda), sus bases conjugadas (al centro) y valores de pK3(co lumna derecha) incluyen los siguientes: pH = 14-pO H = 1 4 -3 .4 R CH2 COOH R CH2 COO- PK. = 4 - 5 = 10.6 R CH2 NH3+ R CH2 NH2 pKa = 9 - 1 0 Los ejemplos anteriores ilustran de qu modo la escala de pH lo h2co 3 HCO3' pKa = 6.4 gartmica facilita la emisin de reporte y la comparacin de concen- h2po 4- HP04-2 PK = 7.2 19. CAPITULO 2 A gua y pH 11 Las fuerzas relativas de cidos y bases dbiles se expresan en funcin de sus constantes de disociacin. A continuacin se mues tran las expresiones para la constante de disociacin (KJ para dos cidos dbiles representativos, RCOOH y RNH3+. R COOH R COCT + H+ [r c o c r][i-r] K, = [R COOH] R NH3+ oSH O i ^ s ^Ribosoma Fen 2H+2e I Asp Met Met-Asp-Fen-GIn-Val 1 1 Sntesis 4 Modificacin covalente (p. ej., I acilacin de cido graso) V 8 "Envejecimiento" Productos (p. ej., oxidacin, desamidacin, desnaturalizacin) Sustratos 7 Catlisis 5 Translocacinlocacin I Y 9 Ubiquitinacing r6 Activacin ? v s /S s O v y ) s o J s cz> s ----------- Membrana FIGURA 4-1 Representacin esquemtica del ciclo de vida de una protena hipottica. 1)El ciclo de vida empieza con la sntesis en un ribosoma de una cadena polipeptdica, cuya estructura primaria est dictada por un mRNA. 2) A medida que procede la sntesis, el polipptido empieza a plegarse hacia su conformacin natural (azul). 3) El plegado puede acompaarse por eventos de procesamiento, como divisin proteoltica de una secuencia lder N-terminal (Met-Asp-Fen-GIn-Val) o la formacin de enlaces disulfuro (SS). 4) La modificacin covalente subsiguiente puede, por ejemplo, fijar una molcula de cido graso (amarillo) para 5) translocacin de la protena modificada hacia una membrana. 6) La unin de un efector alostrico (rojo) puede desencadenar la adopcin de una conformacin activa desde el punto de vista cataltico. 7) Con el tiempo, las protenas quedan daadas por ataque por sustancias qumicas, desamidacin o desnaturalizacin, y 8) pueden "marcarse" mediante la fijacin covalente de varias molculas de ubiquitina (Ub). 9) La protena ubiquitinada despus se degrada hacia los aminocidos que la componen, que quedan disponibles para la sntesis de nuevas protenas. que est fluyendo y salen antes que las que pueden entrar en los poros (protenas incluidas). As, las protenas surgen a partir de una columna de filtracin en gel en orden descendente de sus radios de Stokes. Cromatografa de absorcin En este caso, la mezcla de protena es aplicada a una columna bajo condiciones donde la protena de inters se asocia con la fase esta cionaria de manera tan estrecha que su coeficiente de particin es, en esencia, la unidad. Las molculas que no se adhieren son objeto de elucin primero y se desechan. Las protenas despus se libe ran de manera secuencial al romper las fuerzas que estabilizan el complejo de protena-fase estacionaria, ms a menudo al usar un gradiente de concentracin creciente de sal. La composicin de la fase mvil se altera de manera gradual, de modo que las molculas son liberadas de manera selectiva en orden descendente de su afini dad por la fase estacionaria. Cromatografa de intercambio inico Aqu, las protenas interactan con la fase estacionaria mediante in teracciones entre una carga y otra. Las protenas que tienen una car ga positiva neta a un pH dado se adhieren a cuentas que tienen gru pos funcionales con carga negativa, como carboxilatos o sulfatos (intercambiadores de cationes). De modo similar, las protenas con una carga negativa neta se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga positiva, por lo general aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores de aniones). Las protenas, que son polianiones, compiten contra iones monovalentes por unin al soporte de ah el trmino intercambio inico. Por ejemplo, las protenas se unen a la dietilaminoetil (DEAE) celulosa al rem plazar los contra-iones (por lo general, Cl~ o CH?COO ) que neutra lizan la amina protonada. Las protenas unidas se desplazan de mane ra selectiva mediante aumento gradual de la concentracin de iones monovalentes en la fase mvil. Las protenas muestran elucin en orden inverso de la fuerza de sus interacciones con la fase es tacionaria. Puesto que la carga neta sobre una protena est determinada por el pH (cap. 3), es factible lograr la elucin secuencial de prote nas mediante cambiar el pH de la fase mvil. De manera alternativa, una protena puede quedar sujeta a rondas consecutivas de croma tografa de intercambio inico, cada una a un pH diferente, de modo que las protenas que muestran coelucin a un pH presentan elucin a distintas concentraciones de sal a otro pH. Cromatografa de interaccin hidrofbica Separa a protenas con base en su tendencia a asociarse con una matriz de fase estacionaria cubierta con grupos hidrofbicos (p. ej., fenil u octil sefarosa [Sepharose]). Las protenas con superficies hi- drofbicas expuestas se adhieren a la matriz por medio de interac- 31. CAPTULO 4 Protenas: determinacin de la estructura primaria 2 3 FIGURA 4-2 Componentes de un aparato de cromatografa lquida tpico. R1 y R2: reservorios del lquido de fase mvil. P: sistema de bombeo programable que contiene dos bombas, 1 y 2, y una cmara de mezcla, M. El sistema puede ajustarse para que bombee lquido desde slo un reservorio, para que cambie reservorios en algn punto predeterminado a fin de generar un gradiente empinado, o para mezclar lquidos desde los dos reservorios en proporciones que varan con el tiempo para crear un gradiente continuo. C: columna de vidrio, metal o plstico que contiene la fase estacionaria. F: recolector de fraccin para recolectar porciones, llamadas fracciones, del lquido de elucin en tubos de ensayo separados. dones hidrofbicas que son incrementadas mediante una fase mvil de fuerza inica alta. Las protenas no adherentes primero se elimi nan mediante lavado. A continuacin se disminuye la polaridad de la fase mvil al reducir de manera gradual la concentracin de sal. Si la interaccin entre protena y fase estacionaria es en particular fuerte, puede aadirse etanol o glicerol a la fase mvil para dismi nuir su polaridad y debilitar ms las interacciones hidrofbicas. Cromatografa de afinidad La cromatografa de afinidad explota la alta selectividad de casi to das las protenas por sus ligandos. Las enzimas pueden purificarse mediante cromatografa de afinidad usando sustratos, productos, coenzimas o inhibidores inmovilizados. En teora, slo se adhieren las protenas que interactan con el ligando inmovilizado. A conti nuacin se efecta elucin de las protenas unidas mediante compe tencia con ligando soluble o, de manera menos selectiva, al alterar las interacciones entre protena y ligando usando urea, clorhidrato de guanidina, pH levemente acdico o altas concentraciones de sal. Las matrices de fase estacionaria disponibles en el comercio contie nen ligandos como NAD+ o anlogos de trifosfato de adenosina (ATP). Entre las matrices de afinidad ms potentes y ampliamente aplicables figuran las que se usan para la purificacin de protenas recombinantes modificadas de manera idnea, las cuales incluyen una matriz de Ni2+ que se une a protenas con una marca de poli- histidina fija, as como una matriz de glutatin que se une a una protena recombinante enlazada a glutatin S-transferasa. Los pptidos se purifican mediante cromatografa de alta presin de fase reversa Las matrices de fase estacionaria usadas en la cromatografa de co lumna clsica son materiales esponjosos cuya compresibilidad li mita el flujo de la fase mvil. En la cromatografa lquida de alta presin (HPLC) se emplean microcuentas de slice o almina in compresibles como la fase estacionaria, y presiones de hasta algunos miles de libras por pulgada cuadrada (psi). Las matrices incompre sibles permiten tanto ndices de flujo altos como resolucin aumen tada. La HPLC puede resolver mezclas complejas de lpidos o ppti dos cuyas propiedades difieren slo un poco. En la HPLC de fase reversa se explota una fase estacionaria hidrofbica de polmeros alifticos de 3 a 18 tomos de carbono de longitud. Se efecta elu cin de las mezclas de pptido usando un gradiente de un solvente orgnico miscible en agua, como acetonitrilo o metanol. La pureza de las protenas se evala mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) El mtodo ms ampliamente usado para determinar la pureza de una protena es la SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida 32. 24 SJECCIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas A B C FIGURA 4 _3 Cromatografa de exclusin de tamao. A: una mezcla de molculas grandes (caf) y pequeas (rojo) se aplica en la parte superior de una columna de filtracin de gel. B: al momento de entrar a la columna, las molculas pequeas entran a poros en la matriz de fase estacionaria (gris) de la cual se excluyen las molculas grandes. C: a medida que la fase mvil (azul) fluye por la columna, las molculas grandes, excluidas, fluyen dentro de la misma, mientras que las pequeas, que estn protegidas de forma temporal del flujo cuando estn dentro de los poros, se quedan cada vez ms atrs. (PAGE) en presencia del detergente aninico duodecil sulfato de so dio (SDS). La electroforesis separa biomolculas cargadas con base en los ndices a los cuales migran en un campo elctrico aplicado; en cuanto a la SDS-PAGE, la acrilamida se polimeriza y se entrecruza para formar una matriz porosa. La SDS se desnaturaliza y se une a protenas a una proporcin de una molcula de SDS por cada dos enlaces peptdicos. Cuando es utilizada en forma conjunta con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir enlaces disulfuro y romperlos (fig. 4-4), la SDS-PAGE separa los polipptidos compo nentes de protenas multimricas. El gran nmero de molculas de SDS aninicas, cada una de las cuales porta una carga de -1, abruma las contribuciones de carga de los grupos funcionales aminocidos endgenos a los polipptidos. Dado que la proporcin entre carga y masa de cada complejo de SDS-polipptido es ms o menos igual, la resistencia fsica que cada pptido encuentra a medida que se mueve por la matriz de acrilamida determina el ndice de migracin. Dado que los complejos grandes encuentran mayor resistencia, los poli pptidos se separan con base en su masa molecular relativa (M^ tambin conocida como peso molecular). Es factible visualizar poli pptidos individuales atrapados en el gel de acrilamida mediante teirlos con colorantes como azul de Coomassie (fig. 4-5). Enfoque isoelctrico (IEF) Se usan amortiguadores inicos llamados anfolitos y un campo elctrico aplicado para generar un gradiente de pH dentro de una matriz de poliacrilamida. Las protenas aplicadas migran hasta que llegan a la regin de la matriz donde el pH coincide con su punto isoelctrico (pl), el pH al cual la carga neta de una molcula es cero. El IEF se usa de manera conjunta con SDS-PAGE para la electrofo resis bidimensional, que separa polipptidos con base en el pl en una dimensin y con base en la Mr en la segunda (fig. 4-6). La elec troforesis bidimensional resulta idnea para separar los componen tes de mezclas de protenas complejas. FIGURA 4-4 La divisin oxidativa de cadenas polipeptdicas adyacentes unidas por medio de enlaces disulfuro (resaltados en azul) al efectuar divisin en cido (izquierda) o reductiva mediante (5-mercaptoetanol (derecha) forma dos pptidos que contienen residuos cido cisteico o residuos cisteinilo, respectivamente. SANGER FUE EL PRIMERO EN DETERMINAR LA SECUENCIA DE UN POLIPPTIDO La insulina madura consta de la cadena A de 21 residuos y la cade na B de 30 residuos unidas mediante enlaces disulfuro. Frederick Sanger redujo los enlaces disulfuro (fig. 4-4), separ las cadenas A y B, y dividi cada cadena hacia pptidos de menor tamao usando 33. CAPTULO 4 Protenas: determinacin de la estructura primaria 25 S E C H D i l l mm 73 um 2 9 *** FIGURA 4-5 Uso de SDS-PAGE para observar la purificacin sucesiva de una protena recombinante. El gel se colore con azul de Coomassie. Se muestran estndares de protena (carril S) del Mr indicado, en kDa, extracto celular bruto (E), citosol (C), liquido sobrenadante a alta velocidad (H [por high-speed]), y la fraccin de DEAE-sefarosa (D). La protena recombinante tiene una masa de alrededor de 45 kDa. pH =3 pH =10 - 1050 conforma ciones distintas, el plegado hacia la conformacin apropiada para su funcin biolgica parecera ser an ms difcil. En la sntesis de los esqueletos polipeptdicos de protenas se emplea un pequeo grupo de bloques de construccin comunes o mdulos, los aminocidos, unidos por una conexin comn, el enlace peptdico (caps. 3 y 4). Una va modular por pasos simplifica el plegado y el procesamiento de polipptidos recin sintetizados hacia protenas maduras. LOS CUATRO RDENES DE LA ESTRUCTURA DE PROTENAS La naturaleza modular de la sntesis y el plegado de protena estn incorporados en el concepto de rdenes de estructura de protena: estructura primaria, la secuencia de los aminocidos en una cade na polipeptdica; estructura secundaria, el plegado de segmentos de polipptido cortos (3 a 30 residuos) y contiguos, hacia unidades 31 40. 32 SECCIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas ordenadas de manera geomtrica; estructura terciaria, el montaje de unidades estructurales secundarias hacia unidades funcionales de mayor tamao como el polipptido maduro y los dominios que lo componen y, por ltimo, estructura cuaternaria, el nmero y los tipos de unidades polipeptdicas de protenas oligomricas y su dis posicin espacial. ESTRUCTURA SECUNDARIA Los enlaces peptdicos restringen posibles conformaciones secundarias La rotacin libre slo es posible alrededor de dos de los tres enlaces covalentes del esqueleto polipeptdico: el carbono a (Ca) el carbono carbonilo (Co), y el Ca al enlace de nitrgeno (fig. 3-4). El carcter de doble enlace parcial del enlace peptdico que une el Co al nitr geno a requiere que el carbono carbonilo, el oxgeno carbonilo y el nitrgeno a permanezcan coplanares, lo que evita la rotacin. El n gulo alrededor del enlace de CaN recibe el nombre de ngulo fi (O), mientras que aquel ubicado alrededor del enlace de CoCa es el ngulo psi (|/). Para aminocidos que no son glicina, casi ninguna combinacin de ngulos fi y psi se permite debido a obstculo est- rico (fig. 5-1). Las conformaciones de prolina son an ms restrin gidas debido a la ausencia de rotacin libre del enlace N Ca. Las regiones de estructura secundaria ordenada surgen cuando una serie de residuos aminoacilo adoptan ngulos fi y psi similares. Los segmentos extendidos (p. ej asas) de polipptidos llegan a po seer diversos ngulos de ese tipo. Los ngulos que definen los dos tipos ms frecuentes de estructura secundaria, la hlice a y la hoja |3, caen dentro de los cuadrantes inferior y superior izquierdos de un grfico de Ramachandran, respectivamente (fig. 5-1). La hlice a El esqueleto polipeptdico de una hlice a est torcido por una can tidad igual alrededor de cada carbono a con un ngulo fi de aproxi madamente -57 y un ngulo psi de alrededor de -47. Un giro completo de la hlice contiene un promedio de 3.6 residuos ami noacilo y la distancia que sube por cada giro (su pendiente) es de 0.54 nm (fig. 5-2). Los grupos R de cada residuo aminoacilo en una hlice a miran hacia afuera (fig. 5-3). Las protenas slo contienen L-aminocidos, para los cuales una hlice a diestra es con mucho la ms estable, y en las protenas slo hay hlices a diestras. En los diagramas esquemticos de protenas se representa a las hlices a como espirales o cilindros. La estabilidad de una hlice a proviene sobre todo de enlaces (puentes) de hidrgeno formados entre el oxgeno del enlace pept dico del grupo carbonilo y el tomo de hidrgeno del grupo amino (que contiene nitrgeno) del enlace peptdico del cuarto residuo en direccin descendente por la cadena de polipptido (fig. 5-4). La capacidad para formar el nmero mximo de enlaces de hidrgeno, complementada por interacciones de van der Waals en el centro de esta estructura estrechamente apretada, brinda la fuerza impulsora termodinmica para la formacin de una hlice a. Dado que el ni trgeno del enlace peptdico de prolina carece de un tomo de hidr geno para contribuir a un enlace de hidrgeno, la prolina slo puede adaptarse de manera estable dentro del primer giro de una hlice a. Cuando est presente en otro sitio, la prolina altera la conformacin - 90 o 90 FIGURA 5-1 Grfico de Ramachandran de los ngulos fi (CD) y psi (ip) de la cadena principal para unos 1000 residuos no glicina en ocho protenas cuyas estructuras se resolvieron en alta resolucin. Los puntos representan combinaciones permisibles, mientras que los espacios indican combinaciones prohibidas de ngulos fi y psi. (Reproducido, con autorizacin, de Richardson JS:The anatomy and taxonomy of protein structures. Adv Protein Chem 1981; 34:167. Copyright 1981. Reimpreso con autorizacin de Elsevier.) FIGURA 5-2 Orientacin de los tomos de la cadena principal de un pptido alrededor del eje de una hlice a. 41. FIGURA 5-3 Eje de una hlice a visto desde arriba. Las cadenas laterales (R) estn en el exterior de la hlice. Los radios de van derWaals de los tomos son de mayor tamao que el que se muestra aqu; por ende, casi no hay espacio libre dentro de la hlice. (Ligeramente modificado y reproducido, con autorizacin, de Stryer L: Biochemistry, 3rd ed. Freeman, 1995. Copyright 1995 W.H. Freeman and Company.) anpticas estn bien adaptadas a la formacin de interfases entre regiones polares y no polares como el interior hidrofbico de una protena y su ambiente acuoso. Las agrupaciones de hlices an tipticas pueden crear un canal, o poro, que permite que molculas polares especficas pasen a travs de membranas celulares hidro- fbicas. La hoja P Es la segunda (de ah su denominacin (3) estructura secundaria regular reconocible en las protenas. Los residuos aminocidos de una hoja (3, cuando se observan de canto, forman un modelo en zig zag o plisado en el cual los grupos R de residuos adyacentes apuntan en direcciones opuestas. A diferencia del esqueleto compacto de la hlice a, el esqueleto peptdico de la hoja (3est muy extendido; sin embargo, al igual que la hlice a, gran parte de la estabilidad de las hojas (3se deriva de enlaces de hidrgeno entre los oxgenos carbo nilo y los hidrgenos amida de enlaces peptdicos. En contraste con la hlice a, estos enlaces se forman con segmentos adyacentes de hoja |3 (fig. 5-5). CAPTULO 5 Protenas: rdenes de estructura superiores 3 3 de la hlice y produce una flexin. Debido a su pequeez, la glicina a menudo tambin induce flexiones en hlices a. En muchas hlices a predominan grupos R hidrofbicos en un lado del eje de la hlice e hidroflicos en el otro. Estas hlices FIGURA 5-4 Los enlaces de hidrgeno (lneas punteadas) formados entre tomos de H y O estabilizan un polipptido en una conformacin helicoidal a. (Reimpreso, con autorizacin, de Haggis GH et al.: Introduction to Molecular Biology. Wiley, 1964, con autorizacin de Pearson Education Limited.) FIGURA 5-5 Espaciamiento y ngulos de enlace de los enlaces de hidrgeno de hojas p plegadas antiparalelas y paralelas. Las flechas indican la direccin de cada hebra. Los enlaces de hidrgeno estn indicados por lneas punteadas; los tomos de nitrgeno a (donadores de hidrgeno) y los tomos de oxgeno (aceptores de hidrgeno) participantes se muestran en color azul y rojo, respectivamente. Los tomos de carbono del esqueleto se muestran en color negro. Para favorecer la claridad en la presentacin, se omitieron los grupos R y los tomos de hidrgeno. Arriba: hoja p antiparalela; pares de enlaces de hidrgeno alternan entre estar muy juntos y muy separados, y estn orientados en direccin aproximadamente perpendicular al esqueleto polipeptdico. Abajo: hoja p paralela, los enlaces de hidrgeno estn espaciados de manera uniforme, pero se inclinan en direcciones alternas. 42. FIGURA 5-6 Ejemplos de estructura terciaria de protenas. Arriba: la enzima triosa fosfato isomerasa formando complejos con el anlogo de sustrato 2-fosfoglicerato (rojo). Note la disposicin armoniosa y simtrica de las hojas p (azul claro) y hlices a (verde) que alternan; las hojas P forman un centro en barril p conjunto rodeado por las hlices. (Adaptado de Protein Data Bank ID no. 1o5x.) Abajo: complejo de lisozima con el anlogo de sustrato penta-N-acetil quitopentaosa (rojo). El color de la cadena de polipptidos est graduado a lo largo del espectro visible desde prpura (N terminal) hacia marrn claro (C terminal). Note de qu modo la forma cncava del dominio forma una bolsa de unin para el pentasacrido, la falta de hoja p, y la alta proporcin de asas y flexiones. (Adaptado de Protein Data Bank ID no. 1sfb.) Las hojas |3 que interactan pueden disponerse para formar una hoja (5paralela, en la cual los segmentos adyacentes de la cade na polipeptdica proceden en la misma direccin amino hacia car- bonilo, o una hoja antiparalela, en la cual proceden en direcciones opuestas (fig. 5-5). Una u otra configuracin permite el nmero mximo de enlaces de hidrgeno entre segmentos, o hebras de la hoja. Casi ninguna hoja (3es perfectamente plana, sino que tiende a mostrar una torsin hacia la derecha. Las agrupaciones de hebras torcidas de hoja (3forman el centro de muchas protenas globulares (fig. 5-6). En diagramas esquemticos se representa a las hojas (3 como flechas que apuntan en la direccin amino hacia carboxilo terminal. Asas y flexiones A grandes rasgos, la mitad de los residuos en una protena globular tpica reside en hlices a y hojas (3, y la otra mitad en asas, giros, flexiones y otras caractersticas conformacionales extendidas. Gi ros y flexiones alude a segmentos cortos de aminocidos que unen dos unidades de estructura secundaria, como dos hebras adyacen tes de una hoja (3 antiparalela. Un giro (3 comprende cuatro resi duos aminoacilo, en los cuales el primer residuo est enlazado con hidrgeno al cuarto, lo que da por resultado una vuelta de 180 ce rrada (fig. 5-7). La prolina y la glicina a menudo estn presentes en giros |3. SECCIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas 43. CAPTULO 5 Protenas: rdenes de estructura superiores 35 H N H J c c ' COOH / c h 2 C O H N fcCH?OH FIGURA 5-7 Un giro (5que enlaza dos fragmentos de la hoja p antiparalela. La lnea punteada indica el enlace de hidrgeno entre el primero y cuarto aminocidos del segmento de cuatro residuos Ala-Gli-Asp-Ser. Las asas son regiones que contienen residuos ms all del n mero mnimo necesario para conectar regiones adyacentes de es tructura secundaria; sin embargo, las asas, que tienen conformacin irregular, desempean funciones biolgicas clave. Para muchas en zimas, las asas que forman puentes entre dominios encargados de la unin de sustratos a menudo contienen residuos aminoacilo que participan en catlisis. Los motivos de hlice-asa-hlice proporcio nan la porcin de unin a oligonucletido de protenas de unin a DNA como represores y factores de transcripcin. Los motivos es tructurales, como el motivo de hlice-asa-hlice que son interme dios entre estructuras secundarias y terciarias, a menudo se deno minan estructuras supersecundarias. Dado que muchas asas y flexiones residen sobre la superficie de protenas y, as, quedan ex puestas a solvente, constituyen sitios fcilmente accesibles, o epto- pos, para reconocimiento y unin de anticuerpos. Si bien las asas carecen de regularidad estructural manifiesta, existen en una