ITP UNS SEMESTER 2 Kromatografi gc dan hplc

04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan1

Kromatografi : GC dan HPLC

Kimia Analitik

Semester Genap 2012/2013

Esti Widowati,S.Si.,MP


Gas Chromatography Basics

Gas Liquid Chromatography (GLC)Gas Solid Chromatography (GSC)Mobile phase does not interact with analyteSeparation occurs by interaction of analyte

differentially w/liquid stationary phase and temperature

GC preferred method, only applicable to volatile substances derivatization


Aspek-aspek percobaan GLC

Gas Pembawa (pengemban/pengangkut) dan Pengatur Aliran

Sistem Injeksi Sampel Jenis-jenis Detektor : - Konduktivitas Termal - Pengionan Nyala Karakteristik Detektor : - Detektor Integral

- Detektor Diferensial - Kepekaan - Stabilitas - Kelinieran - Keserbagunaan - Waktu Respons Kolom : - Kolom Isian

- Kolom Kapiler - Pemilihan Fasa Cair

Materials

Microliter syringe Capillary tube A tank of He/N gas

Depending on the instrument used Vaporization chamber Oven Detector Electric/chart recorder Integrators (if available)

04/10/234 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan


Gas pembawa

Gas yang telah digunakan dalam GLC : Hidrogen, helium, nitrogen, argon, karbon dioksida, dan uap air.

Gas pembawa yang cocok bergantung pada karakteristik detektor tersebut.

Gas hidrogen dan helium digunakan pada detektor konduktivitas termal sedangkan nitrogen digunakan pada detektor pengionan nyala.


Carrier Gas Supply

Must be at a constant flow rate so that retention times and retention volumes may be equated

Choice of detector will often Dictate the gases that

are used, need to be inert Ex. FID used H2, air, and He


Sistem pengambilan sampel

Sampel-sampel cair : diinjeksikan melalui suatu karet septum dengan memakai suntikan syringe.

Sampel-sampel gas : diinjeksikan atau dimasukkan dengan memakai bermacam-macam alat pengambilan sampel gas yang dirancang untuk kromatograf komersial


Injection Port

Heated so sample virtually instantly turns into a vapor as sample plug goes onto column

Septum Split/ Splitless

Want to reproducibly get in and get out Sample focus

Gas Chromatography Inject sample Control temperatures to

vaporize sample Mix with carrier gas Enters column



Flow rate Measurement

Why is a known flow rate critical?


Kolom

Kolom Kapiler - Merupakan tabung yang panjang dan tipis dari kaca atau bahan lainnya seperti baja tahan karat. - Hanya dapat menangani sampel-sampel yang sangat kecil, dan penggunaannya secara luas menunggu pengembangan detektor yang sangat sensitif.


Kolom IsianFasa stasioner dalam GLC adalah cairan, tetapi cairan itu tidak boleh dibiarkan bergerak-gerak di dalam tabung.

Cairan tersebut harus diimobilisasi, biasanya dalam bentuk suatu lapisan tipis dengan luas permukaan besar.

Ini paling lazim dilakukan dengan mengimpregnasi suatu bahan padat dengan fase cair kolom diisi.


Pemilihan fasa cair

- Fasa cair stasioner harus dipilih dengan mempertimbangkan masalah pemisahan tertentu.

- Fasa cair harus stabil secara termal pada temperatur kolom (kecuali dalam kasus-kasus khusus), tidak bereaksi secara kimia dengan komponen-komponen sampel, memiliki daya pelarut yang cukup untuk sampel.


GC Columns

Capillary:

- have i.d. <1mm

- have wide unrestricted flow through center and inner surface is coated with liquid stationary phase

Variety of functional groups have been blended into polysiloxane chain to provide different polarity and selectivity

GC Procedurecolumn

Packed columns 1.5 – 10 m long 2-4 mm diameter Glass, stainless steel Solid packing

Capillary columns 25-60 m long Less 1 mm diameter



HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-OH

polyethylene glycol


Karakteristik Detektor

Detektor Integral

Memberikan suatu pengukuran setiap saat dari jumlah total bahan yang dielusi yang telah melewatinya sampai waktu itu.

Detektor Diferensial

Menghasilkan kromatogram familiar yang terdiri dari puncak-puncak dan bukan langkah-langkah. Dibagi menjadi - detektor yang mengukur konsentrasi zat terlarut dengan memakai beberapa sifat fisika dari aliran gas buangan

- detektor yang merespons secara langsung zat terlarut dengan demikian berarti mengukur laju alir massanya.


Kromatogram yang diperoleh dengan detektor Integral

Kromatogram yang diperoleh dengan detektor diferensial

Detector

Flame ionization detector Destructive H and air is mixed with

sample Ignited Collector electrode

Thermal conductivity detector Universal Nondestructive

Non-selective vs selective detectors



Kepekaan detektor menunjukkan suatu batasan yang paling penting pada jumlah zat terlarut yang paling kecil yang dapat ditentukan dengan GLC

Stabilitas

Garis dasar suatu kromatogram dimaksudkan untuk fluktuasi jangka pendek dari suatu sifat yang sangat acak yang disebut noise.

Noise dapat dihubungkan dengan kepekaan, tingkat noise dan batas deteksi.


Keserbagunaan Waktu Respons

Waktu respons keseluruhan untuk suatu kromatograf adalah fungsi bukan hanya dari detektor itu sendiri, tetapi juga kelembaman komponen-komponen lain. Misalnya perekam.


Jenis-jenis detektor

Detektor Konduktivitas Termal

- Detektor yang banyak digunakan untuk GLC. Alat ini mengandung : filamen logam yang dipanaskan maupun suatu termistor.

- Gas pembawanya adalah hidrogen

dan helium

- Detektor ini relatif sederhana,

tidak mahal, memiliki kepekaan

yang cukup bagi banyak kegunaan


Detektor Pengionan Nyala

Prinsip dasar :

1. Energi kalor dalam hidrogen menyebabkan banyak molekul untuk mengionisasi

2. Gas efluen dari kolom dicampur dengan hidrogen dan dibakar pada ujung jet logam dalam udara berlebih.

3. Potensial diberikan antara jet dan elektroda kedua yang bertempat di atas atau sekitar nyala itu.

4. Ketika ion-ion dibentuk dalam nyala, ruang gas antara kedua elektroda menjadi lebih konduktif, dan arus yang meningkat mengalir dalam sirkuit.

5. Arus melewati resistor, tegangan terbentuk yang dikuatkan untuk menghasilkan isyarat yang diterima perekam.


Gambar Detektor Pengionan Nyala


Temperature


Grafik isotermal

Standards for GC

Calibration – typically preformed with a known volatile compound/mixture

Attenuation – controlling the height of the peaks.



Koefisien distribusiSuatu tetapan tanpa dimensi, K yang

diperoleh dari hukum henry dengan menggantikan tekanan parsial dan fraksi mol suatu zat terlarut dengan dua suku konsentrasi yang sama satuannya.


Kesetimbangan dalam perpindahan massa

Suatu faktor pelebaran pita dalam kromatografi yang disebakan oleh terhingganya waktu yang diperlukan oleh suatu zat terlarut untuk keseimbangan

Dapat dituliskan dari hukum Henry

Cl=KCg .... (1)


Resolusi

Disebut separasiDua zat terlarut yang didasarkan pada waktu-

waktu retensi dan lebar pita

Results

Retention time (Rt)• The time required for the compound to

pass through the column

• Rt is a characteristic value and independent of the presence of any other compound


Peak A

Peak B

Speed of the chart paper is 2 cm per second

Calculate Rt



Penerapan GLC

Identifikasi Senyawa Keserbagunaan GLC Pirolisis Kromatografi Gas Analisis Kuantitatif

Bergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan ukuran dari pita elusi yang

dihasilkan. Analisis Kualitatif


Analisa Kualitatif Dasarnya adalah waktu retensi atau

volume retensi suatu senyawa. Membandingkan t atau V senyawa dalam

sampel yang dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang telah diketahui)


Analisis Kuantitatif Metode pengukuran tinggi puncak

Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.


Metode pengukuran luas puncakDapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan rumus :

Results

An easy way to calculate the area under the curve without integral calculus is to measure the height and the width at half of the height


Calculate Area

Peak A

Peak B


Percentage of Compounds

A percentage can be calculated by dividing the area of the peak by the total area and multiplying by 100%


Ratio

With the area’s, a ratio can be calculated

A ratio of 1.88:1 of compound B to compound A



Metode gunting dan timbangKromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari masing-masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.


Metode IntegratorIntegrator adalah peralatan elektronik yang sering dijumpai pada peralatan kromatografi yang modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram yang dibentuk secara elektronik.

Results

Quantitative measurement• Two Type of Peaks

• Asymmetric peak • Cut the area under the peak out of the read

out and mass the weight. For this to be accurate the GC must be calibrated.

• Symmetric peak• Measure the height and the width at half of

the height


Forensic Analysis using Gas Chromatography Determination of explosives

If a forensic scientist can identify the type of explosive then he/she could possibly identify the source

Ammonium nitrate Water analysis


Speed Resolution Qualitative analysis Quantitative analysis Sensitivity Simplicity Inexpensive



H P

igh

erformance

L iquid

C hromatography


H P

igh

ressure

L iquid

C hromatography


H P

igh

riced

L iquid

C hromatography


Partitioning

Separation is based on the analyte’s relative solubility between two liquid phases

Stationary PhaseMobile Phase

Solvent Bonded Phase


HPLC - Modes

Normal Phase.- Polar stationary phase and non-polar solvent.

• Reverse Phase.- Non-polar stationary phase and a polar solvent.


Common Reverse Phase Solvents

Methanol CH3OH

• Acetonitrile CH3CN

• Tetrahydrofuran

• Water H2O


High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari : Tempat pelarut Pompa Tempat injeksi sampel Kolom Detektor Rekorder

04/10/2304/10/23 S1-Ilmu dan Teknologi PanganS1-Ilmu dan Teknologi Pangan 6060

InstrumentationInstrumentation

Pump

Injector

ColumnDetector

Mobile Phases

Gradient Controller

•


1. Fasa mobile (pelarut)pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk mengeluarkan gas terlarut yang tidak diinginkan.2. Sistem pompaada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu : tekanan tetap dan volume tetap.3. Flow controller (pengendali aliran)untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan tekanan gas, temperatur dan viskositas.4. KolomTidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan kimia terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur yang tinggi.


5. Detektorkarakteristik detektor untuk HPLC- sensivitasnya tinggi- respon yang menyeluruh terhadap sampel- tidak meruska sampel- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fasa mobile- dapat beroperasi secara terus menerus.

6. RekorderMengeluarkan output berupa kromatogram.


Columns

• Analytical - Performs the separation.

Solid Support - Backbone for bonded phases. Usually 10µ, 5µ or 3µ silica or polymeric particles.

Bonded Phases - Functional groups firmly linked (chemically bound) to the solid support. Extremely stable Reproducible

Guard - Protects the analytical column: Particles Interferences Prolongs the life of the analytical column


Bonded Phases

C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN

• C-18C-18 Octadecyl SilylOctadecyl Silyl -Si-(CH -Si-(CH22))1717--

CHCH33

•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3


Detectors

UVSingle wavelength (filter) [610, 8330]Variable wavelength (monochromator) [8316,

8325]Multiple wavelengths (PDA) [555]

Fluorescence [610] Electrochemical [605] Mass Spectrometric [8325]


Chromatograms

Restek® ULTRA C-18 and CN Columns (250mm x 4.6mm, 5µ),

Mobile Phase: (1:1 Methanol:Water), 1.5 mL/min.


Chromatograms

Supelcosil LC-PAH Columns. A BConditions: A: 150mm x 4.6mm, 5µ.

Flow Rate: 1.5 mL/min

Conditions: B: 50mm x 4.6mm, 3µ.

Flow Rate: 3.0 mL/min


Keuntungan HPLC

CepatResolusiSensitivitas detektorKolom yang dapat digunakan kembali Ideal untuk zat bermolekul besar dan

berionikMudah rekoveri sampel


Pertanyaan Apa perbedaan adsorbsi pada kromatografi dan

spektrofotometri ? Apa fase diam dari GLC ? Kapan menggunakan GLC dan HPLC ? Menurut anda, mana yang lebih unggul

kromatografi atau spektrofotometri ? Pada fase normal dan fase terbalik, bagaimana

kondisi analit ? Bagaimana pengaruh diameter kolom dan flow

rate pada kromatogram ?

ITP UNS SEMESTER 2 Kromatografi gc dan hplc

Documents

Transcript of ITP UNS SEMESTER 2 Kromatografi gc dan hplc