DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA

TESIS DOCTORAL

MENCIÓN DOCTOR EUROPEO

UTILIZACIÓN DE SEÑALES FLUORESCENTES PARA EL

ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DE VINOS. MEJORA DE LA

SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE

DERIVATIZACIÓN FOTOQUÍMICA

USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS

AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF

SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF

PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION

Diego Airado RodríguezBadajoz, 2008

Edita: Universidad de Extremadura Servicio de Publicaciones Caldereros 2. Planta 3ª Cáceres 10071 Correo e.: publicac@unex.es http://www.unex.es/publicaciones

UTILIZACIÓN DE SEÑALES FLUORESCENTES PARA EL

ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DE VINOS. MEJORA DE LA

SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE

DERIVATIZACIÓN FOTOQUÍMICA

USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS

AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF

SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF

PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION

por

Diego Airado Rodríguez

VISADO en Badajoz a 30 de Abril de 2008

Dra. Dª Teresa Galeano DíazProfesora TitularDpto. de Química AnalíticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura

Dra. Dª Isabel Durán Martín-MerásProfesora TitularDpto. de Química AnalíticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura

Memoria de Investigación presentada para optar al Grado de Doctor Europeo,dentro del Programa de Doctorado “Ciencias Químicas”, Bienio 2004-2006, yrealizada en el Departamento de Química Analítica de la Universidad deExtremadura.

Fdo.: Diego Airado Rodríguez

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

Campus UniversitarioAvda. de Elvas, s/n06071-BADAJOZ (ESPAÑA)Teléfono (+34 924) 28.93.00 y 28.93.75FAX (+34 924) 28.93.75

ARSENIO MUÑOZ DE LA PEÑA CASTRILLO, Catedrático y Director del

Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad

de Extremadura

I N F O R M A:

Que el trabajo que se presenta en esta TESIS DOCTORAL, con el título de

"UTILIZACIÓN DE SEÑALES FLUORESCENTES PARA EL ANÁLISIS Y

CARACTERIZACIÓN DE VINOS. MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y

SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIÓN FOTOQUÍMICA", ha sido

realizado bajo la dirección de las Dras. Dª Teresa Galeano Díaz y Dª Isabel Durán

Martín-Merás, en el Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias

de la Universidad de Extremadura y reúne todos los requisitos para poder optar al

Grado de Doctor Europeo en Ciencias Químicas.

Badajoz, 30 de Abril de 2008

OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL

El objeto de esta Memoria de Investigación es doble: - Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos métodos

analíticos para la determinación en vino de resveratrol y sus derivados, compuestos con importantes implicaciones en la salud humana y que han despertado un gran interés en la sociedad en los últimos años. Se pretende mejorar los métodos anteriormente propuestos para la determinación de estos compuestos, fundamentalmente en lo referido a su sensibilidad, rapidez y sencillez. Para ello nos basaremos en la fotorreacción que sufren estos compuestos estilbenoides, la cual, probablemente es una reacción de ciclación en la cual se originan derivados del fenantreno, molécula altamente fluorescente.

- Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas metodologías para facilitar la tipificación de muestras de vino y la detección de fraude en la industria del vino, para lo que se pretende hacer uso de señales fluorescentes de tres vías, en combinación con herramientas quimiométricas.

DOCTORAL THESIS OBJECTIVE The purposes of this Report of Investigation are:

- On the one hand, the development of new analytical

methods for the determination of resveratrol derivatives in wine samples. It has been demonstrated that these compounds have beneficial effects on human health, and a great interest has been aroused in society in recent years. The main objective is improving the previously proposed methods for the analysis of these compounds, in terms of sensitivity, speed and simplicity. For that, we will use the photoreaction that stilbenoids compounds suffer, which is probably a cyclation reaction in which phenanthrene derivatives are originated.

- On the other hand, new methodologies for wine

classifications and fraud detection will be developed. Three-way fluorescence signals will be used, in combination with chemometric tools.

ÍNDICE CAPÍTULO I: Introducción Parte I: Resveratrol. El Compuesto………………………………………………………3 Resveratrol en vino…………………………………………………………...…10 Efectos biológicos de resveratrol………………………………………………14 Los compuestos fenólicos de la uva………………………………………..…18 Parte II: Antecedentes bibliográficos para el análisis de resveratrol........................28 Aparatos, reactivos y software utilizados en este trabajo de investigación………...55 Capítulo II: Determinación de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada y extracción líquido-líquido ANTECEDENTES………………………………………………………………………...73 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudio básico sobre las propiedades de interés analítico de trans-resveratrol…...76 Efecto de la irradiación ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol……………………………………………………....87 Estudio extracto-espectrofluorimétrico de trans-resveratrol. Aplicación al análisis de muestras de vino……………………………………………………………………….…98 Perspectivas de futuro………………………………………………………………..…109

Capítulo III: Análisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida aplicando segunda-derivada a los espectros de emisión ANTECEDENTES……………………………………………………………………….113 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudio básico sobre las propiedades de interés analítico de trans-piceido……...115 Efecto de la irradiación ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceido…………………………………………………….......124 Estudio extracto-espectrofluorimétrico de trans-piceido. Aplicación al análisis de muestras de vino…………………………………………………………..…………….135 Perspectivas de futuro………………………………………………………………..…149 Capítulo IV: Determinación de resveratrol y piceido totales en vino, sin tratamiento previo, mediante derivatización fotoquímica off line-HPLC ANTECEDENTES……………………………………………………………………….153 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios fluorescentes previos……………………………………………………...…156 Estudios cromatográficos previos…………………………………………………..…158 Optimización quimiométrica de la composición de la fase móvil para el análisis de vino………………………………………………………………………………………..165 Determinación de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino……………………………………………………………………………..…………171 Perspectivas de futuro…………………………………………………………………..177

Capítulo V: Análisis de los isómeros de resveratrol y piceido en vinos mediante HPLC isocrática, con detección fluorescente previa derivatización post-columna en línea ANTECEDENTES……………………………………………………………………….181 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios fluorescentes previos………………………………………………………...186 Estudios cromatográficos previos……………………………………………………..187 Optimización quimiométrica de las condiciones cromatográficas para el análisis isocrático de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino……………….190 Foto-isomería cis-trans. Evidencia de la presencia de cis-isómeros de resveratrol y piceido en vinos………………………………………………………………………….205 Aplicación: Análisis de los isómeros de resveratrol y piceido en vinos…………...219 Capítulo VI: Utilización de señales fluorescentes de tres vías (matrices de excitación-emisión) para caracterización de vinos ANTECEDENTES……………………………………………………………………….229 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Muestras de vino incluidas en el modelo……………………………………………..235 Matrices de excitación-emisión de fluorescencia…………………………………….237 Construcción del modelo PARAFAC………………………………………………….242 Análisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score………..249 Identificación de los fluoróforos presentes en vino…………………………………..258 Utilización de las señales de autofluorescencia total del vino en combinación con herramientas quimiométricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO….267 Perspectivas de futuro………………………………………………..…………………273

Capítulo VII: Análisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometría de redisolución adsortiva de onda cuadrada ANTECEDENTES……………………………………………………………………….277 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Puesta a punto del procedimiento……………………………………..……………...281 Parámetros analíticos de calidad……………………………………………………...304 Análisis de trans-resveratrol en muestras de vino…………………………………..306 Seguimiento cromatográfico de las etapas de limpieza…………………………….311 Perspectivas de futuro………………………………………………………………..…312

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO I. Introducción

2

CAPÍTULO I. Introducción

3

PARTE I: RESVERATOL. EL COMPUESTO

Se conocen hasta 30 estilbenoides y estilben-glucósidos, que se encuentran naturalmente en diversas especies del reino vegetal, dentro de las espermatofitas1. Como su propio nombre indica, el esqueleto estructural de todos ellos consta de un puente vinílico, que sirve de unión a dos anillos aromáticos (esqueleto estilbenoide). A partir de esta estructura química, relativamente sencilla, la naturaleza ha sido capaz de crear una gran variedad de compuestos, variando entre ellos tanto el número como la posición de grupos hidroxilos, la extensión en que dichos grupos hidroxilos se encuentran a su vez sustituidos por azúcares, por grupos metilo, metoxi u otros residuos y la configuración estérica de moléculas químicamente idénticas. Otra causa de variación que aumenta mucho más el número de sustancias integrantes de esta familia es su habilidad para existir como dímeros, trímeros o polímeros mayores.

Uno de los compuestos más conocidos dentro de este grupo de

estilbenoides es la molécula en la que se centra gran parte del trabajo que se describe en esta memoria, el resveratrol, 3,4’,5-trihidroxiestilbeno, cuya fórmula estructural es la siguiente:

Figura 1.- Fórmula estructural de trans-resveratrol

HO

OH

OH

4' 3

5

CAPÍTULO I. Introducción

4

Respecto al origen del nombre resveratrol, el profesor Yutaka Ebizuka, de la Universidad de Tokio, propone lo siguiente2:

• res: puede estar relacionado con la clase de moléculas a las que pertenece el resveratrol: los resorcinoles

• veratr: abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum, en la que se encontró resveratrol por primera vez en 1940.

• ol: indicativo de la presencia de grupos hidroxilo.

La síntesis de resveratrol en el laboratorio, puede llevarse a cabo a través de una reacción de Witting, uniendo dos anillos fenólicos, apropiadamente sustituidos, a través de un doble enlace de estireno, como describen inicialmente Moreno-Mañas y Pleixats3. Cuando la síntesis se lleva a cabo mediante esta ruta, se parte de precursores metilados, para proteger los grupos hidroxilos, los cuales son posteriormente liberados mediante tribromuro de boro. El producto final de esta ruta sintética es el trans-resveratrol, que es el único isómero del resveratrol que existe en la naturaleza y el único que se comercializa (Sigma-Aldrich).

Como ocurre con otros estilbenoides, el trans-resveratrol se produce de forma natural en un amplio número de familias vegetales, encontrándose en 72 especies vegetales (distribuidas en 31 géneros y 12 familias) y está ampliamente distribuido tanto en gimnospermas como en dicotiledóneas1, algunas de las cuales constituyen productos empleados en la dieta humana, como los cacahuetes o las moras.

El resveratrol es identificado en 1940 por primera vez en la raíz del eléboro

blanco (Veratrum Grandiflurum O. Loes), y después en las raíces secas de la planta Poligonum Cuspidatum, llamada Ko-jo-kon en japonés, siendo ésta una de las fuentes más ricas de resveratrol. La planta es ampliamente empleada en la

CAPÍTULO I. Introducción

5

medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales como dermatitis supurativa, gonorrea, tiña favosa, pie de atleta ehiperlipidemia4-7. En 19768 se descubrió la existencia de este compuesto en la vid, Vitis vinifera.

El trans-resveratrol es una fitoalexina producida en las plantas, a nivel celular y para tratar de ubicar dicha molécula, debe considerarse en primer lugar cómo y por qué se genera.

El metabolismo celular de las plantas puede definirse a través de la suma

de todas las reacciones enzimáticas que tienen lugar en la célula, pudiéndose diferenciar dos fases claramente diferenciadas:

la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es conocida como catabolismo, y

la fase constructiva o biosintética del metabolismo conocida como anabolismo.

Bajo este punto de vista, puede decirse que el trans-resveratrol es un

anabolito, ya que esta molécula se genera en las células de las plantas, con el objetivo de cumplir una misión específica: ser un pesticida natural, a través del cual y junto con otros anabolitos, la plata se defiende de agresiones externas.

Cuando una planta es infectada por un agente patógeno, la primera

respuesta está localizada en las células con las que dicho agente entra en contacto directo. Estas células reconocen la estructura del patógeno, o alguna de las moléculas fundamentales para el desarrollo de su actividad, siendo la respuesta primaria más frecuente de la planta la reacción por necrosis, en la que las células infectadas por el agente patógeno mueren, fenómeno conocido como muerte celular programada (PCD). Además, estas células, directamente afectadas por el

CAPÍTULO I. Introducción

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patógeno, producen una serie de moléculas que alertan a las células adyacentes de la infección, y que reciben el nombre de moléculas elicitadoras9, desarrollándose en dichas células adyacentes la conocida como respuesta secundaria, al reconocer a las moléculas elicitadoras producidas en la interacción primaria. Estas vías de defensa implican que las células de las plantas poseen sistemas permanentes de vigilancia, capaces de detectar los estímulos generados por el agente patógeno, elicitando de este modo la respuesta defensiva en la planta10. El tercer tipo de respuesta defensiva es inducida hormonalmente en la planta11, y es a través de la cual la planta forma compuestos conocidos como fitoalexinas, que tratarán de frenar la actividad patógena.

Muchas plantas producen metabolitos secundarios (no implicados en las reacciones metabólicas vitales para la planta) con funciones antifúngicas. Estos compuestos antifúngicos pueden encontrarse en plantas saludables que no han sufrido infección patógena alguna, actuando como mecanismo de barrera frente a las mismas y recibiendo en este caso el nombre de fitoancipinas. Se reserva la denominación de fitoalexinas para los metabolitos secundarios antifúngicos que son sintetizados en respuesta al ataque patógeno, con el fin de cesar su invasión12. En general, las fitoalexinas pueden definirse como moléculas antimicrobianas de bajo peso molecular, acumuladas en las plantas como resultado de una infección patógena o tras haber sido sometidas a condiciones de estrés13.

Entre los efectos desencadenantes de la producción de trans-resveratrol en plantas, se pueden citar los siguientes:

Infecciones fúngicas como la Botrytis Cinerea14, la Plasmopara Vitícola15, la Phomopsis Vitícola16 o la Rhizopus Stonifer17.

Daño de la planta Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18.

CAPÍTULO I. Introducción

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Tratamiento con ozono19. Radiación Ultravioleta

Como se ve en la Figura 2, los precursores inmediatos de resveratrol son el

p-cumaril-CoA y el malonil-CoA, en una relación molar de 1:3.

Figura 2.- Ruta biosintética desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol

El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina, la cual, en las plantas, es sintetizada a partir de azúcares mediante la ruta del ácido shikímico20: en primer lugar se produce la pérdida del grupo amino de la fenilalanina mediante deaminación oxidativa, catalizada por la enzima específica fenilalanina-amonio-liasa, dando lugar a ácido cinámico, el cual es hidroxilado a ácido p-cumárico por

CAPÍTULO I. Introducción

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acción de la enzima cinamato-4-hidroxilasa, y finalmente transformado en p-cumaril-CoA, por acción de una CoA-ligasa. Sobre este sustrato, pueden entrar en acción dos enzimas clave: la calcona-sintasa (CHS) o la estilbeno-sintasa (STS). En ambos casos, tal y como se indica en la ruta biosintética representada en la Figura 2 (las tres condensaciones son las marcadas en color), se produce la condensación de p-cumaril-CoA con tres moléculas de malonil-CoA, dando lugar a una tetracetona. Hasta este punto, ambas enzimas actúan de manera idéntica.

A continuación se produce la ciclación de la tetracetona lineal, y es

precisamente la manera en la que esta ciclación se lleva a cabo la principal diferencia entre ambas enzimas. En el caso de la CHS, se liberan 3 moléculas de CO2 en el proceso, y el producto final de esta ruta es la calcona, el cual es el precursor común de la familia de los flavonoides, familia a la que pertenece la quercetina. Cuando la enzima que actúa es la STS, el producto final de la reacción es el trans-resveratrol, liberándose cuatro moles de CO2, por mol de resveratrol formado.

La mayoría de las especies de la familia Vitaceae poseen ambos enzimas.

Como dato curioso puede citarse el siguiente: Hain et al21 aíslan el gen de la STS de la vid, y lo transfirieron al tabaco, encontrando que las plantas de tabaco transgénicas resultantes son mucho más resistentes a la infección por Botrytis cinerea. Las fitoalexinas, dado su carácter antifúngico, son candidatos idóneos para ser utilizados como pesticidas naturales. Dichos pesticidas naturales se plantean como una buena alternativa a los sintéticos, teniendo en cuenta la inmunidad desarrollada por ciertas especies patógenas, la toxicidad y los grandes tiempos necesarios para la degradación de estos últimos.

CAPÍTULO I. Introducción

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El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente UVC) produce un estrés en la uva que hace que ésta, en respuesta a dicho daño, induzca la síntesis de resveratrol. Esta misma tecnología se está aplicando actualmente a uvas de mesa y a uvas de vinificación para obtener nuevas frutas “funcionales”22, 23 y vinos enriquecidos en resveratrol24.

Las fuentes de resveratrol en la naturaleza no son muchas, y menos aún

las plantas y vegetales de consumo humano conteniendo este compuesto. En la Figura 3 se representan las fuentes naturales más importantes de aporte de resveratrol y no existe duda acerca de que las fuentes que más aportan a la dieta humana son los productos derivados de la vid, esto es, la uva y el vino25. Figura 3.- Fuentes de resveratrol en la naturaleza

CAPÍTULO I. Introducción

10

En la uva, los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles, estando prácticamente ausente en la pulpa y en las pepitas del fruto26. Otras fuentes de resveratrol son: el cacahuete27, 28, los arándanos29, la Reynoutria Japonica, las moras y en especies herbáceas (Poaceae incluyendo Festuca, Hordeum, Poa, Stipa, y Lolium spp.)

Respecto a la existencia de este compuesto en árboles, merece la pena destacar su presencia en eucalipto, pícea y pino, así como en el árbol tropical de hoja caduca Bauhinia racemosa.

Son pocas las plantas florales en las que se encuentra resveratrol. Las dos

únicas que se conocen son la ya mencionada Veratrum Grandiflurum, en la que se encuentran altas concentraciones de resveratrol en las hojas cuando la planta es dañada por tratamiento con agentes químicos30, y la Veratrum formosanum, cuya raíz y rizomas son relativamente ricos en resveratrol, tanto que ha sido empleada en Oriente como tratamiento alternativo para la hipertensión31. También está descrita la presencia de resveratrol en Pterolobium hexapetallum, una legumbre no comestible32.

Recientemente, Counet et al33 describen la presencia de trans-resveratrol y

trans-piceido, por primera vez, en chocolate negro (al menos 0.4 μg·mL-1 de trans-resveratrol y 1.0 μg·mL-1 de trans-piceido) y licor de cacao (al menos 0.5 μg·mL-1 de trans-resveratrol y 1.2 μg·mL-1 de trans-piceido). Resveratrol en vino

La identificación de resveratol en vinos es relativamente reciente y data de 1992, año en que el isómero trans es identificado por Siemman y Creasy34. Estos

CAPÍTULO I. Introducción

11

autores llevan a cabo la cuantificación de este compuesto en vinos tintos y blancos, encontrando que las concentraciones varían entre 0.66 μg·mL−1 y 0.68 ng·mL−1, en vinos tintos y desde 100 ng·mL−1 a menos de 0.23 ng·mL−1, para vinos blancos. Justifican los menores niveles encontrados en vinos blancos en base al hecho de que, en la uva, el resveratrol se encuentra en las pieles y no en la pulpa, y el proceso de elaboración del vino blanco implica un prensado más ligero del fruto y un menor tiempo de contacto entre el mosto y los hollejos. Se pone de manifiesto en este primer trabajo una gran variabilidad en el contenido de resveratrol en vino, y su dependencia de factores tales como la casta de la uva, el origen geográfico, la cosecha y las técnicas de vinificación. Entre las variables que más influyen en el contenido de los cuatro compuestos en vino, además de las ya mencionadas, se ha encontrado que son muy importantes ciertos aspectos de las técnicas de vinificación, como por ejemplo la maceración con hollejos35.

Un año más tarde, Jeandet et al36, describen la presencia del isómero cis

en vino. En 1994, Waterhouse y Lamuela-Raventós37 publican la existencia de

resveratrol-3-β-D-glucósido (piceido) en uvas. Ese mismo año Roggero y Archier38,

basándose en su espectro de absorción en el ultravioleta, describen la existencia de un glucósido indefinido del resveratrol en vino. Posteriormente, en el año 1995, Lamuela-Raventós et al39 identifican este glucósido en vino tinto como piceido, utilizando un estándar de piceido extraído de la raíz del Poligonum Cuspidatum, y proponen un método para el análisis de los isómeros trans y cis del glucósido y la aglicona (Figura 4) en vino.

CAPÍTULO I. Introducción

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Figura 4.- Estructuras químicas de las formas de resveratrol objeto de esta tesis

Los mismos autores40 proponen en 1996 un método para la cuantificación

de los cuatro analitos en vinos blancos y rosados, siendo en este caso necesario una etapa de preconcentración, dados los menores niveles encontrados en estos vinos.

Fremot, en el año 2000 publica un trabajo de recopilación donde se

recogen las cantidades de resveratol y/o piceido encontradas en vinos de diferentes países y en distintos tipos de vino. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

OH

HO

HO

OH

HOOH OH

HO

OHOH

O

HHO

H

HO

H

H

HO

H

O

OH

O

H

OHH OH

H

H HO

H

O

OH

trans - Resveratrolcis -Resveratrol

trans-Piceido cis-Piceido

CAPÍTULO I. Introducción

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Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto41

Origen Concentración de Resveratrol (μg.mL-1) (1) Ref

USA Chardonnay, hasta 0.1

Los vinos de California presentan concentraciones más bajas que los de New York

Francia Burdeaux, entre 0.3 - 0.6

34

Francia (Burgundy) Pinot noir, entre 0.4 - 2 36

USA (California)

Pinot noir, entre 0.2 - 0.7 Cabernet Sauvignon, < 0.09

42 Comparación entre vinos de Norte América,

Australia y Europa

Todos contienen entre 0.1 - 12 Los procedentes de California, Australia e Italia

presentan concentraciones más bajas que los de Oregón, Canadá y Francia

43

USA (California) < 0.02-1.7 (máximas concentraciones en Pinot noir, 5)

Francia Beaujolais (Gamay), entre 3.2 - 3.6 44

Francia

Resveratrol: 0.5 - 5; piceido: 0 - 14.5 Vinos procedentes de uvas Cabernet franc, Gamay y

Grenache presentan concentraciones menores que los procedentes de Pinot noir, Mourvèdre y Cabernet

Sauvignon

44

USA (California) Isómeros del resveratrol entre 0.3 – 3 38

España

Resveratrol total (aglicona+glucósido) entre 2.5 - 13.8 (trans>cis).

Cantidades totales según el tipo de uva : Pinot noir, 5.1; Merlot, 4; Grenache, 2.4; Cabernet

Sauvignon, 1.4; Tempranillo, 1.3

39

Europa Isómeros de la aglicona (trans>cis),

Contenido medio según país: Francia, 3.7 - 7.1; Italia, 1.2; España, Portugal, 2.8; Europa central, 3.1;

Suiza, 6.9.

45 (1) concentración de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

CAPÍTULO I. Introducción

14

Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto (continuación) Origen Concentración de Resveratrol (μg.mL-1) (1) Ref

América Contenido medio según el origen: América del Sur, 1.8 < California, 3 < Oregon, 6.3 45 Comparación entre vinos de

Italia Reccioto y Amarone (area de Verona), entre 0.05 - 0.8 25

USA (Sureste) Isómeros de la aglicona, 0.1-42, concentraciones má-ximas en Muscadine: trans, hasta 13.4; cis hasta 31.9

Presencia de Tetrahidroxiestilbeno. 46

Japón Estilbenos totales, 0.8-13.4; aglicona (media 1.8, trans > cis), piceido (media 2.5, cis > trans); concentraciones

máximas en los tipos de uva Pinot Noir y Merlot. 47

USA (California)

Contenido según el tipo de uva : Cabernet Sauvignon, 0.4-2;

Pinot noir, 1.2; Merlot, 3.5

48 (1) concentración de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

Debido a la generalmente alta razón entre las concentraciones de trans a

cis isómeros encontradas en vino, se sugiere que el único isómero sintetizado en la uva es el trans, proviniendo el cis de la exposición a la luz del mosto durante el proceso de elaboración del vino, o del vino durante el almacenamiento39. Efectos biológicos de resveratrol

Ya se ha comentado el carácter antifúngico de las fitoalexinas. No obstante, debe tenerse en cuenta que un compuesto natural no tiene por que estar exento de riesgos toxicológicos para el ser humano, ya que los mayores venenos son productos naturales producidos por plantas o animales. Sin embargo, en el caso concreto de algunas fitoalexinas, como el trans-resveratrol no sólo se ha demostrado la ausencia de dicho carácter tóxico, sino que además presenta grandes beneficios para la salud.

CAPÍTULO I. Introducción

15

Este compuesto, como otros polifenoles, es un antioxidante muy efectivo por derecho propio, por lo que ha atraído la atención particular como solución potencial a la denominada “paradoja francesa”. Este es el término usado para describir el fenómeno, que ha sido por mucho tiempo un rompecabezas para la ciencia médica, de que los índices de la enfermedad cardiovascular en Francia son muy bajos con respecto al resto del mundo desarrollado, a pesar del elevado consumo de grasa animal y colesterol, y un hábito firmemente atrincherado del tabaco. Por supuesto Francia también goza de muchas de las ventajas de la dieta mediterránea, pero hay buenas razones para pensar que es el consumo de vino tinto, y en gran medida el resveratrol contenido en éste, el que puede ser la explicación verdadera de la paradoja evidente.

"La paradoja francesa" y "el resveratrol" han abierto las puertas a nuevas

investigaciones, pero no se puede olvidar que las bondades del vino ya las prescribió Hipócrates, padre de la medicina moderna, quien afirmaba que "el vino es cosa admirablemente apropiada al hombre, tanto en el estado de salud como en

el de enfermedad, si se le administra oportunamente y con justa medida, según la

constitución individual".

El resveratrol contribuye al efecto cardioprotectivo del vino tinto, ya que este compuesto ha demostrado inhibir la oxidación del LDL, la peroxidación de lípidos, la agregación plaquetaria, y la síntesis de eicosanoides49, etapa inicial de la patogénesis de la arteriosclerosis.

Actualmente se están realizando numerosos estudios sobre las propiedades

del resveratrol, de los cuales se le han atribuido diversas propiedades “in vitro” e “in vivo” como son:

CAPÍTULO I. Introducción

16

Protección de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) frente a la oxidación50-52.

Inhibición de la agregación plaquetaria y la síntesis de eicosanoides31, 53. Protección del hígado de peroxidación de lípidos54. Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya

dieta estaba suplementada con resveratrol no sólo son más longevos, sino además más activos, presentando en menor medida los efectos negativos de una dieta hipercalórica55.

Reducción de la muerte celular por estrés oxidativo56. Propiedades antiinflamatorias debido a su efecto inhibidor sobre la

ciclooxigenasa57. Regulación del metabolismo de los lípidos34. Protección cardiovascular como fitoestrógeno. Efectos citoprotectores sobre el riñón58. Propiedades anticancerígenas, puesto que inhibe la actividad de la enzima

protein-tirosina kinasa, enzima implicada en la alteración de las células tumorales59, 60.

Previene enfermedades como el Parkinson y el Alzheimer.

Aún no se han estudiado con profundidad las acciones benéficas del resveratrol en función de la dosis y no se sabe si los efectos observados “in vitro” e “in vivo” se pueden extrapolar al ser humano. En los estudios en animales y en los limitados estudios en humanos, se ha observado que el resveratrol se absorbe en el aparato gastrointestinal. Sin embargo, la eficacia de su absorción, así como su distribución, metabolismo y excreción, no está bien definida. Hasta la fecha, son escasos los estudios que se han realizado sobre el metabolismo del resveratrol en humanos, si bien se ha puesto de manifiesto recientemente que el resveratrol se

CAPÍTULO I. Introducción

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metaboliza en el hígado para producir metabolitos resveratrol-glucurónido y resveratrol-sulfato52.

Actualmente, el resveratrol se comercializa para la investigación médica; además, también está disponible como complemento nutricional (no como un agente terapéutico) en forma de extracto seco purificado cuya fuente principal son las uvas tintas. En cuanto a las precauciones de uso, se desaconseja para las personas que padecen trastornos mentales y hepáticos graves y en mujeres embarazadas y en periodo de lactancia, además es un producto reservado a los adultos. El isómero cis y los isómeros trans y cis del piceido son fisiológicamente tan importantes como el trans-resveratrol. cis-Resveratrol posee una actividad similar a la del isómero trans inhibiendo a la enzima protein-tirosina kinasa61 y la agregación plaquetaria62. Los isómeros de piceido tienen propiedades similares a los de resveratrol inhibiendo la agregación plaquetaria31 y la oxidación del LDL en humanos63. Por otra parte, de una manera menos activa que el trans-resveratrol, el trans-piceido reduce la elevación de los niveles lipídicos64 e inhibe la síntesis de eicosanoides53.

En los estudios llevados a cabo con Poligonum Cuspidatum, se ha comprobado que la actividad biológica de piceido es bastante diferente que la de la aglicona, no obstante, el tracto digestivo humano tiene actividad glucosidasa65, de manera que es probable la liberación de la aglicona a partir del glucósido durante la digestión.

CAPÍTULO I. Introducción

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Los compuestos fenólicos de la uva

Dado que la gran mayoría de los métodos que se ponen a punto en este trabajo están basados en fluorescencia molecular, y muchos de los integrantes de este grupo de sustancias presentan fluorescencia nativa o fotoinducida, el último apartado de esta introducción general se dedica a la descripción del grupo de los compuestos fenólicos en vino, en el cual se engloba el resveratrol. No obstante, aparte de los compuestos fenólicos, merece la pena nombrar también como potenciales fluoróforos del vino los aminoácidos fluorescentes triptófano, tirosina y fenilalanina, así como algunas vitaminas.

Los constituyentes fenólicos revisten una gran importancia en enología

debido al papel que juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos. En efecto, son el origen del color y de la astringencia, siendo atribuida esta última en particular a la presencia de taninos. Además, según su naturaleza, pueden tener un interés nutricional y farmacológico.

Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos están

caracterizados por un núcleo bencénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos. Los compuestos fenólicos se clasifican en no flavonoides y flavonoides. Estos últimos tienen un esqueleto en C6-C3-C6. Los polifenoles incluyen también a los derivados (ésteres, metil ésteres, glucósidos, etc) que resultan de las sustituciones de la estructura base. La reactividad de este tipo de molécula es debida tanto a la presencia de la función fenol que presenta un carácter ácido, como al núcleo bencénico que puede sufrir sustituciones electrofílicas.

Los compuestos polifenólicos están distribuidos en las distintas partes de la

uva: pulpa, hollejos, pepitas y raspones. De esta manera, la transformación

CAPÍTULO I. Introducción

19

tecnológica adoptada condiciona la extracción de los polifenoles a partir de las diferentes partes del racimo, contribuyendo así de manera esencial a la composición polifenólica de los vinos. Un conocimiento profundo de las diversas estructuras polifenólicas presentes en la uva y de los mecanismos de su evolución durante el transcurso de la vinificación es una base indispensable en la evaluación de su papel en enología y en el desarrollo de los procesos tecnológicos adaptados a la vez a la materia prima y al tipo de producto deseado.

Compuestos no flavonoides Esta denominación abarca a los ácidos fenólicos, divididos en ácidos

benzóicos (C6-C1) y ácidos cinámicos, portadores de una cadena lateral insaturada (C6-C3), pero también a otros derivados fenólicos, como los estilbenos.

Ácidos fenólicos

En la uva, los ácidos fenólicos son principalmente ácidos hidroxicinámicos

que se encuentran en las vacuolas de las células del hollejo y de la pulpa, bajo la forma de ésteres tartáricos. En el vino, se pueden encontrar en forma libre, procediendo de la hidrólisis de otros polifenoles, especialmente de los antocianos, que se degradan en presencia de oxígeno y calor, lo que supone un mecanismo de la destrucción del color; o bien en forma combinada, parcialmente esterificados, especialmente con el ácido tartárico o con ácidos hidroxicinámicos, destacando entre ellos los ácidos cafeoil tartárico (ácido caftárico), p-cumaroil tartárico (ácido cutárico) y feruloil tartárico (ácido fertárico), Figura 5. La forma natural es la trans, pero los isómeros cis, largo tiempo confundidos con los derivados glucosilados, también existen aunque en débil cantidad. Sólo el derivado glucosilado del ácido trans-cutárico ha podido ser identificado.

CAPÍTULO I. Introducción

20

Figura 5.- Ésteres hidroxicinámicos: ácido trans-cafeoil tartárico (R = OH), trans- p-cumaroil tartárico (R = H) y trans-feruloil tartárico (R = OCH3)

En lo que concierne a los ácidos benzóicos, la uva contiene principalmente ácido gálico (Figura 6).

Figura 6.- Ácido gálico Estilbenos Es de destacar la presencia en la uva de otros compuestos fenólicos como

el isómero trans del resveratrol, como aglicona o 3-β-D-glucósido (piceido).

Compuestos Flavonoides Los flavonoides están caracterizados por un esqueleto de base de 15 átomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenil benzopirona (Figura 7).

R

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H

C

O

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CAPÍTULO I. Introducción

21

Figura 7.- 2-Fenil benzopirona

Esta gran familia se divide en varias subclases, que se distinguen por el

grado de oxidación de su núcleo pirano. Los flavonoides en sentido estricto, basados en su estructura fenil-2-benzopirona, están principalmente representados en la uva por los flavonoles, mientras que los flavonoides en sentido amplio comprenden igualmente los flavanos 3-ol (3-flavanoles) y los antocianos. Las estructuras generales de las subclases más frecuentes en el vino se encuentran en la Figura 8:

Figura 8.- Estructuras químicas de las subclases de flavonoides más usuales en el vino

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O

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CAPÍTULO I. Introducción

22

Flavonoles

Estos flavonoides “en sentido estricto” están únicamente presentes en los hollejos, bajo forma de glicósidos en posición 3. En la Figura 9 se representan los cuatro flavonoles principales de la uva, bajo su forma aglicona.

Figura 9.- Flavonoles de la uva: kaempferol (R = H; R’ = H), quercetol (R = OH; R’ = H), miricetol (R = OH; R’ = H) e isoramnetol (R = OCH3; R’ = H)

Las formas glucosiladas son las más abundantes, pero se encuentran

igualmente cantidades importantes de glucurónidos.

Flavanos 3-oles (3-Flavanoles)

Los flavanos 3-oles (3-flavanoles) están presentes en la uva en estado de monómeros y bajo formas más o menos polimerizadas que constituyen los taninos catéquicos. En el seno de la baya de uva, se localizan principalmente en las semillas, aunque se han detectado también trazas de monómeros y dímeros en la pulpa.

Los principales 3-flavonoles monómeros de la uva son la (+)-catequina y su isómero la (-)-epicatequina, pudiendo ser encontrado este último bajo forma de

O

OH

HO

OH

R

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OH

O

CAPÍTULO I. Introducción

23

éster gálico (3-galato de epicatequina). Las estructuras de los flavanoles monómeros de la uva están representadas en la Figura 10.

Figura 10.- Estructura de los flavanoles monómeros de la uva: catequina (R1= H; R2= OH; R3= H), galocatequina (R1= H; R2= OH; R3= OH), epicatequina (R1= OH; R2= H; R3= H) y epigalocatequina (R1= OH; R2= H; R3= OH)

Flavanonoles y flavonas

Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el

hollejo de uva blanca. Estos son la astilbina (3-ramnósido del dihidroquercetol) y la engelatina (3-ramnósido del dihidrokaempferol), cuyas estructuras se recogen en la Figura 11.

Figura 11.- Flavanonoles de la uva: engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)

O

4

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OH

HO

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Ramnosil

CAPÍTULO I. Introducción

24

En cuanto a las flavonas se han identificado hasta 7-glucósidos de apigenol y luteolina en las hojas de Vitis vinifera. Antocianos

Los antocianos representan una parte importante tanto a nivel cualitativo como cuantitativo de los flavonoides de la baya de uva tinta. Contribuyen de manera preponderante al color de las especies tintas. Desde un punto de vista general, los antocianos se corresponden con unos glicósidos de núcleo flavilium polihidroxilado y/o metoxilado. Las formas agliconas, que responden a la fórmula general, son denominados antocianidinas (o antocianidoles), Figura 12, y las formas heterosídicas se denominan antocianinos, siendo estas últimas más estables.

Figura 12.- Estructura de los antocianidinas (forma flavilium)

Los antocianos se diferencian por sus niveles de hidroxilación y de

metilación, por la naturaleza, el número y la posición de las osas unidas a la molécula, y también por la naturaleza y el número de los ácidos que esterifican los azúcares. Los antocianos del género Vitis son: cianidol, peonidol, delfinidol y malvidol (Figura 13); pero el contenido y la composición en antocianos en la uva varía enormemente en función de la especie y de la variedad.

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CAPÍTULO I. Introducción

25

Figura 13.- Antocianidinas de la uva en forma de catión flavilium: cianidol (R = OH; R’ = H), peonidol (R = OCH3; R’ = H), delfinidol (R = OH; R’ = OH), petunidol (R = OCH3; R’ = OH) y malvidol (R = OCH3; R’ = OCH3)

La V. vinifera presenta la particularidad de contener únicamente 3-

glucósidos de antocianidoles, mientras que otras especies del género Vitis contienen 3,5 diglucósidos. Las numerosas posibilidades de sustitución del núcleo B y las funciones hidroxilo confieren a los antocianos propiedades específicas, concretamente color y estabilidad, que están directamente ligadas a la estructura. Así, el aumento del número de hidroxilos sobre el núcleo B conduce al desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda más altas (efecto batocrómico), lo que se traduce en una modificación del color de la molécula. Por otra parte, la presencia de sustituyentes osídicos se traduce en un ligero efecto hipsocrómico y aumenta la estabilidad de las moléculas antociánicas. Por último, la esterificación de los azúcares, concretamente por ácidos hidroxicinámicos, estabiliza la molécula y sus capacidades colorantes, debido al establecimiento de interacciones hidrófobas intramoleculares (copigmentación intramolecular).

El color de los antocianos en solución depende del medio. En efecto, los antocianos existen en solución bajo diversas formas en equilibrio, de colores diferentes. Estos equilibrios están regidos por el pH de la solución. A pH inferior a

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CAPÍTULO I. Introducción

26

2, la forma flavilium coloreada en rojo, estabilizada por resonancia, domina ampliamente. Además, las interacciones de los antocianos entre ellos y con los otros constituyentes del medio (copigmentación) y la formación de complejos con los iones metálicos, se traducen en modificaciones del color.

Taninos Bajo el nombre genérico de taninos se agrupan una serie de sustancias

fenólicas que pueden contener los vinos; se clasifican en hidrolizables y condensados. Los primeros se basan en fenoles no flavonoides y generalmente se encuentran en forma de ésteres, y los taninos condensados son polímeros más o menos complejos derivados de los 3-flavanoles, especialmente de la (+)-catequina, y de la (-)-epicatequina. Estas moléculas presentan la propiedad de liberar antocianidinas, en medio ácido y en caliente, de donde toman el nombre de procianidinas o proantocinidinas.

Los taninos condensados más sencillos son las procianidinas dímeras, que

se agrupan en dos categorías: procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas tipo B (C30H24O12), Figura 14. Del mismo modo también existen procianidinas trímeras, agrupadas en los tipos C y D.

Figura 14.- Estructuras de procianidinas dímeras

CAPÍTULO I. Introducción

27

Otros taninos más complejos son las procianidinas oligómeros, formados por 3 a 10 unidades de flavanoles, así como las procianidinas condensadas, formadas por más de 10 unidades de flavanoles, alcanzando un peso molecular superior a 3.000, o proantocianidoles.

En definitiva, las formas polímeras cuya estructura general viene dada en la Figura 15, representan la mayor parte de los 3-flavanoles tanto de la uva como de los otros vegetales.

Figura 15.- Proantocianidoles de tipo B

Se localizan en el hollejo, especialmente en las capas externas de la

hipodermis, en forma libre dentro de las vacuolas de las células, o en forma combinada, estando ligados a los polisacáridos de las paredes celulares. Se encuentran también de forma abundante en las pepitas, localizados en la envoltura externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis, y también en la envoltura interna que rodea al albumen. La pulpa no contiene apenas taninos, mientras que el raspón posee una buena cantidad de estas sustancias.

En general, los contenidos en flavanoles de las semillas son siempre

superiores a los de los hollejos, ya se trate de monómeros, oligómeros o de polímeros.

O

4

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CAPÍTULO I. Introducción

28

PARTE II: ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS PARA EL ANÁLISIS DE RESVERATROL

La práctica totalidad de los métodos encontrados en la bibliografía para el análisis de resveratrol y compuestos relacionados hacen uso de técnicas separativas, fundamentalmente cromatografía de líquidos de alta eficacia (LC), cromatografía de gases (GC) y electroforesis capilar (CE).

Así, estas técnicas se han utilizado para analizar dichos compuestos en

muestras muy diversas tales como alimentos, entre ellos fundamentalmente uvas21,66-71, cacahuetes79, 72, arándanos73 o chocolate32 o bien en hojas de parra74, gránulos de lúpulo75, 76 y plantas77-80 usadas con fines medicinales.

En general, en las etapas previas de aislamiento y limpieza se utilizan

diferentes técnicas separativas tales como extracción sólido-líquido (SPE), extracción líquido-líquido (LLE) y extracción con fluidos supercríticos (SFE), para obtener finalmente una disolución de resveratrol y los restantes compuestos de interés que se analiza mediante cromatografía.

En cuanto a los métodos encontrados para análisis de estos compuestos

en vino, en la Tablas 2, 3 y 4, se recogen los antecedentes encontrados acerca de los métodos mediante cromatografía líquida, electroforesis capilar y cromatografía de gases, respectivamente. En este último caso la separación se acopla generalmente a la espectrometría de masas.

En cromatografía de líquidos se utiliza más frecuentemente cromatografía

en fase inversa y los detectores usuales son el detector de serie de diodos (DAD), el detector fluorescente (FLD) o el espectrómetro de masas (MS). También se han usado, en algunos casos, detectores electroquímicos (ECD).

CAPÍTULO I. Introducción

29

También se encuentran algunos métodos de cromatografía en capa fina, en concreto el desarrollado por Chen et al81 que muestran la utilidad del análisis de resveratrol y piceido para distinguir rápidamente entre vinos naturales y falseados y el de Kiraly-Veghely et al82 que utilizan cromatografía en placa a elevada presión y encuentran mayores contenidos de piceido que de aglicona.

CAPÍ

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30Tabla

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31

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-resv

eratr

ol 0.3

2 – 4.

44 y

0.12 –

2.8

0 μg·

mL-1

en tin

tos y

rosa

dos,

resp

ectiv

amen

te.cis

-resv

eratr

ol 0.2

0 – 5

.84 y

0.02 –

3.17

μg·

mL-1

en

tintos

y ro

sado

s, re

spec

tivam

ente

91

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

33

Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)

Anali

to(s

)Si

stem

a cr

omat

ográ

fico:

Col

umna

; F.

Móv

il; S

istem

a de D

etec

ción

Pará

met

ros a

nalít

icos

de ca

lidad

Obse

rvac

ione

s Mu

estra

/ Tra

tam

iento

Refe

renc

ia

Estilb

enos

: -

vinife

rina,

trans

-as

tringin

a,tra

ns-

piceid

o,cis

- y

trans

-resv

eratr

ol y

-vini

ferina

C18

Grad

iente

de ác

ido ac

ético

en ag

ua,

pH 2.

4 a ác

ido ac

ético

en ag

ua, p

H 2.4

: ace

tonitri

lo 20

:80, 0

.5 mL

·min-

1

UV (2

80, 2

86, 3

06 y

321 n

m)

LOD

0.2 μ

g·mL

-1, 0

.2 μg

·mL-1

y 0.3

2 μg·

mL-1

para

trans

-pice

ido,tr

ans-

ycis-

resv

eratr

ol,re

spec

tivam

ente

Extra

cción

con a

cetat

o de e

tilo

limpie

za co

n res

ina in

terca

mbiad

ora

de ca

tione

s y m

edian

te cro

matog

rafía

de pa

rtición

(ce

ntrif

ugal

parti

tion

chro

mat

o-gr

aphy

) y H

PLC

semi

prep

arati

va

92

20 co

mpue

stos

fenóli

cos,

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

XDB-

C8Gr

adien

te de

meta

nol y

ácido

acéti

co 1

% D

AD (3

06 nm

para

tran

s-res

vera

trol)

CLD

(Ce(

IV) –

roda

mina

6G –

comp

uesto

fenó

lico e

n med

io ác

ido

sulfú

rico)

trans

-Res

vera

trol:

Rang

o line

al 0.0

3- 15

0 μg

·mL-1

LOD

(S/N

=3) 8

4.7 y

6.6

ng·m

L-1 en

DAD

y CL

D,

resp

ectiv

amen

te

Inyec

ción d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Detec

ción C

L alta

mente

sens

ible

(LOD

de 1

a 2 ór

dene

s de m

agnit

ud

meno

res q

ue lo

s lím

ites e

n DAD

)

93

Isóme

ros c

is y

trans

de

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18 m

onolí

tica (

Chro

moli

thPe

rform

ance

RP-

18e)

Grad

iente

de ag

ua:ác

ido ac

ético

, 94:6

, a a

gua:a

ceton

itrilo:

ácido

acéti

co,

65:30

:5, 7

mL·m

in-1

DAD

(285

y 30

6 nm

para

cis-

y tra

ns-

resv

eratr

ol, re

spec

tivam

ente)

LOD

32 y

34 ng

·mL-1

y LO

Q 0.1

0 y 0.

11 μ

g·mL

-1

para

tran-

y cis

-re

sver

atrol,

resp

ectiv

amen

te

El em

pleo d

e una

colum

na

mono

lítica

impli

ca ba

jas pr

esion

es y

corto

s tiem

pos d

e aná

lisis.

94

trans

- y ci

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

Estud

ia la

influe

ncia

de la

varie

dad

del la

leva

dura

en la

conc

entra

ción

de lo

s cua

tro co

mpue

stos e

n vino

95

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

34Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Ácido

s hidr

oxibe

n-zo

icos,

ácido

s hid

roxic

inámi

cos y

de

rivad

os, e

stilbe

-no

s (isó

mero

sde

resv

eratr

ol y

piceid

o), a

lcoho

les

fenóli

cos y

com

-pu

estos

relac

io-na

dos,

flava

noles

y f

lavon

oles.

Se si

gue e

l patr

ón de

evolu

ción d

e es

tos co

mpue

stos e

n el v

ino du

rante

el

enve

jecim

iento

en bo

tella

96

trans

-resv

eratr

ol y

trans

-pice

ido97

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Hype

rsil C

18Gr

adien

te lin

eal a

ceton

itrilo-

agua

DA

D (2

88 y

306 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isó

mero

s

SP

E 98

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

35

Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

trans

-resv

eratr

olC8 El

ución

isoc

rátic

a con

meth

anol:

agua

35

:65, 1

mL·

min-1

DAD

(306

nm)

CLD

(Elua

to +

lumino

l + K

3Fe(

CN) 6)

Linea

lidad

0.07

5-10

μg

·mL-1

y 0.5

-750

ng·m

L-1 en

DAD

y CL

D,

resp

ectiv

amen

te.LO

D(S/

N=3)

25 y

0.166

ng

·mL-1

en D

AD y

CLD,

re

spec

tivam

ente.

Inyec

ción d

irecta

de m

uestr

as

filtra

das

Conti

ene u

na re

visión

impo

rtante

de

métod

os en

tre 19

96 y

2002

. En

cuen

tra en

tre 0

y 1.60

7 μg·

mL-1

en vi

nos t

intos

chino

s

99

cis- y

tran

s-res

ve-

ratro

lC1

8El

ución

isoc

rátic

a con

25 %

ac

etonit

rilo, 0

.1 %

de H

3PO 4

y Na

Cl (5

mm

ol·L-1

), 1 m

L·mi

n-1DA

D (3

06 nm

para

ambo

s isó

mero

s)EC

D (e

lectro

do de

carb

ón vi

trifica

doa

+0.75

V)

Linea

lidad

0.01

-10

μg·m

L-1tra

ns-re

sver

atrol.

LOD

(S/N

=3) m

enor

es de

30

y 10

0 ng·

mL-1

(306

nm

) y 3

y 15 n

g·mL

-1

(0.75

V) p

ara t

rans

- y ci

s-re

sver

atrol,

resp

ectiv

amen

te.

Vino

. Filtr

ado e

inye

cción

dire

cta

Uvas

y ho

jas. M

acer

ación

con e

tanol

al 80

%.

Equil

ibrio

entre

los d

os is

ómer

os tr

as

5 hor

as de

expo

sición

a la

luz de

l día

. Equ

ilibrio

no in

fluen

ciado

por la

tem

pera

tura

100

Resv

eratr

ol tot

alDA

D (2

87 y

307 n

m pa

ra ci

s- y t

rans

-isó

mero

s)

Hidr

ólisis

enzim

ática

(-g

lucos

idasa

)de

resv

eratr

ol-glu

cósid

osSP

E10

1

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Fa

se in

versa

DA

D

Se en

cuen

tra de

l 82 a

l 91%

de

resv

eratr

ol co

mo gl

ucós

ido en

estos

vin

os es

paño

les de

uvas

Mon

astre

ll.10

2

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

36Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Scre

ening

de

polife

noles

, entr

e ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

Fase

inve

rsaDA

D - M

S/MS

Piele

s y pe

pitas

de uv

as bl

anca

s y

tintas

Se en

cuen

tran h

asta

13 an

tocian

os,

11 ác

idos h

idrox

ibenz

oicos

e hid

roxic

inámi

cos y

13 ca

tequin

as y

flava

noles

, así

como

2 es

tilben

os en

pie

les y

pepit

as

103

Ácido

s org

ánico

s y

polife

noles

((-)-

epi-

cateq

uina,

quer

cetin

a y

resv

eratr

ol)

Fase

inve

rsa (e

n sil

ica m

odific

ada

con

grup

os fe

nilo)

Grad

iente

de ác

ido tr

ifluoa

cétic

o al 0

.2 %

en ag

ua y

aceto

nitrilo

. 1.5

mL·m

in-1

DAD

a 210

y 28

0 nm

Linea

lidad

resv

eratr

ol 0.0

25-0

.4 mg

·mL-1

104

Flavo

noles

,an

tocian

inas,

ácido

s fen

ólico

s y

trans

-resv

eratr

ol.

C18

Grad

iente

de ác

ido ac

ético

al 5

% en

ag

ua y

aceto

nitrilo

, 1 m

L·mi

n-1DA

D (3

13 nm

para

tran

s-res

vera

trol y

ác

idos f

enóli

cos)

105

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

Es

tudian

el ef

ecto

de di

stinto

s mé

todos

de m

acer

ación

sobr

e la

conc

entra

ción d

e esto

s cua

tro

estilb

enos

106

Polife

noles

ECD

(dete

cción

coulo

métric

a mu

ltielec

trodo

) 10

7

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

37

Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Resv

eratr

ol,pic

eido y

fla

vono

ides.

Vino

s exp

erim

ental

es de

uvas

so

metid

as a

difer

entes

trata

mien

tos

con p

estic

idas

Conte

nido f

enóli

co to

tal po

r el

métod

o de F

olin-

Cioc

alteu

108

27 co

mpue

stos

fenóli

cos,

inclu-

yend

o der

ivado

s de

los á

cidos

ben-

zoico

y cin

ámico

, fla

vona

s, y n

uevo

s glu

cósid

os

relac

ionad

os

Detec

ción e

lectro

quím

ica m

ultica

nal

con d

etecto

r cou

lométr

ico

Cerve

za

109

cis- y

tran

s- re

sve-

ratro

l y pi

ceido

C1

8El

ución

isoc

rátic

a etan

ol:ác

ido ac

ético

al

0.05 %

, 23:7

7, 1 m

L·mi

n-1DA

D a 3

06 nm

Linea

lidad

para

los c

uatro

isó

mero

s 0.2-

50 μ

g·mL

-1

LOD

0.81,

1.20,

0.40 y

0.4

6 ng p

ara c

is- y

trans

-re

sver

atrol

y cis-

y tra

ns-

piceid

o, re

spec

tivam

ente

Hidr

ólisis

con

-gluc

osida

sa pa

ra

liber

ación

de ag

licon

as

conte

nidos

de ci

s- y t

rans

- res

ve-

ratro

l ante

s y de

spué

s de l

a hidr

ólisis

Resv

eratr

ol tot

al 0.8

4-7.3

3 y 0.

12-6

μg

·mL-1

en vi

nos t

intos

y zu

mos,

resp

ectiv

amen

te

110

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

38Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Comp

uesto

sar

omáti

cos,

entre

ell

ostra

ns-

resv

eratr

ol

NMR

NMR/

MS

Vino

: pre

para

ción d

e extr

acto

fenóli

co co

n ace

tato d

e etilo

.Ce

rveza

: deg

asific

ación

y co

ncen

tració

n a 2/

3 del

volum

en

inicia

l Zu

mo de

uva:

diluc

ión co

n agu

a

111

Antoc

ianina

syes

tilben

os (c

is- y

trans

- res

vera

trol y

pic

eido)

Fase

inve

rsaAn

tocian

os D

AD (5

20 nm

) Es

tilben

os F

LD (

ex/em

330/3

74 nm

) 11

2

32 P

olifen

oles d

e ba

jo pe

so

molec

ular,

entre

ell

oscis

- y tr

ans-

resv

eratr

ol y

piceid

o

C18

Grad

iente

de ag

ua y

aceto

nitrilo

co

ntenie

ndo a

mbos

1% de

ácido

ac

ético

, 0.6

mL·m

in-1

PDAD

/API

-MS

113

Estilb

enos

(resv

eratr

ol)Inf

luenc

ia de

difer

entes

técn

icas d

e ma

cera

ción e

n el c

onten

ido en

es

tilben

os11

4

Estilb

enos

(res

ve-

ratro

l, pice

ido,

picea

tanno

l)

DAD-

MS/M

SInd

ucció

n de e

stilbe

nos m

edian

te irr

adiac

ión U

V po

st-co

sech

a 11

5

CAPÍ

TULO

I. In

trodu

cción

39

Tabla

2.- A

nális

is de

resv

eratr

ol en

vino

y otr

as be

bidas

med

iante

croma

togra

fía de

líquid

os (c

ontin

uació

n)An

alito

(s)

Sist

ema

crom

atog

ráfic

o: C

olum

na;

F. M

óvil;

Sist

ema d

e Det

ecció

nPa

rám

etro

s ana

lítico

sde

calid

adOb

serv

acio

nes

Mues

tra / T

rata

mien

toRe

fere

ncia

Flava

noles

,an

tocian

inas,

y 6

deriv

ados

de

resv

eratr

ol:tra

ns-

astrin

gina,

trans

- y

cis-p

iceido

,tran

s-yc

is-re

sver

atrol

y pa

llidol

(dím

ero d

e re

sver

atrol)

C18

Grad

iente

de 1

% ác

ido tr

ifluor

oacé

tico

a ace

tonitri

lo:1 %

, ácid

o trifl

uoro

acéti

-co

, 80:2

0, 1 m

L·mi

n-1DA

D (2

90 nm

) FL

D ( e

x/em 2

90/39

0, 29

0/390

, 260

/400,

300/3

90, 2

60/40

0 y 26

0/400

nm pa

ra

trans

-astr

ingina

,tran

s-pice

ido,c

is-pic

eido,

trans

-resv

eratr

ol, ci

s-re

sver

atrol

y pall

idol

Linea

lidad

0.5-

10, 0

.1-10

, 1-

10, 0

.5-10

, 1-1

0 y 0.

5-10

μg·

mL-1

y LO

D (F

LD) 0

.01, 0

.01,

0.03,

0.01,

0.02

y 0.0

2 μg

·mL-1

, par

a tra

ns-

astrin

gina,

trans

-pice

ido,

cis-p

iceido

,tran

s-re

sver

atrol,

cis-

resv

eratr

ol y p

allido

l

Filtra

do e

inyec

ción d

irecta

de la

s mu

estra

sSe

apor

tan po

r prim

era v

ez da

tos

sobr

e con

tenido

de pa

llidol

en vi

nos

tintos

y no

se en

cuen

tra en

vino

s bla

ncos

Conte

nidos

de lo

s isó

mero

s de

resv

eratr

ol má

s elev

ados

en vi

nos

tintos

116

trans

-resv

eratr

olC1

8Gr

adien

te de

meta

nol :

ácido

acéti

co :

agua

, 10:2

:88 a

metan

ol:ác

ido ac

ético

:ag

ua 90

:2:8,

1 mL·

min-1

DAD

(280

nm)

FLD

ex/em

360/3

74 nm

LOD

en m

uestr

as re

ales

20 y

3 ng·

mL-1

en D

AD y

FLD,

resp

ectiv

amen

te

SPE-

C18

Nive

l med

io en

contr

ado e

n vino

s tin

tos em

botel

lados

2.89

μg·

mL-1

117

cis- y

tran

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sver

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07 nm

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Uvas

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29

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40Tabla

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118

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s-re

sver

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n co

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119

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(256

, 324

y 36

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0 y 30

ng

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cis-

resv

eratr

ol,re

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Resv

eratr

ol y

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os ni

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ores

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iempo

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con l

a piel

du

rante

la fe

rmen

tación

79

trans

- y ci