Acido Lactico Bases

7/14/2019 Acido Lactico Bases

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PORTADA

BSQUEDA DEL MEJOR MEDIO DE CULTIVO Y MODELAMIENTO CINTICO

PARA LA OBTENCIN DEL CIDO LCTICO A PARTIR DE GLUCOSA POR

VA FERMENTATIVA

MARIA PATRICIA OROZCO MURILLO

JUAN ANDRS SOLARTE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIASEDE MANIZALES

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA

INGENIERA QUMICA

2003


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BSQUEDA DEL MEJOR MEDIO DE CULTIVO Y MODELAMIENTO CINTICO

PARA LA OBTENCIN DEL CIDO LCTICO A PARTIR DE GLUCOSA POR

VA FERMENTATIVA

MARIA PATRICIA OROZCO MURILLO

394526

Lnea de Profundizacin en Alimentos

JUAN ANDRS SOLARTE394516

Lnea de Profundizacin en Ingeniera Ambiental

Trabajo para optar al ttulo de

Ingeniero Qumico

DIRECTORA

GLORIA INS GIRALDO

Tecnloga Qumica

Especialista en Ciencia y Tecnologa de Alimentos

Administradora de Empresas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIASEDE MANIZALES

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA

INGENIERA QUMICA

2003


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DEDICATORIA

A Dios por darme la oportunidad de

realizar mi sueo, a mis padres por

su amor, comprensin y esfuerzo, a

mi dems familia por su sacrificio

y apoyo, a mi esposo por su

dedicacin incondicional y constante.

Maria Patricia.


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CONTENIDO

RESUMEN..............................................................................................................11

ABSTRACT.............................................................................................................12

INTRODUCCION....................................................................................................13

1. ASPECTOS FUNDAMENTALES.....................................................................16

1.1 CIDO LCTICO ........................................................................................16

1.1.1 Propiedades del cido lctico......................................................................17

1.1.2 Obtencin de cido lctico ..........................................................................18

1.1.3 Antecedentes ..............................................................................................21

1.1.4 Algunos procedimientos industriales...........................................................24

1.1.5 Recuperacin y purificacin ........................................................................27

1.1.6 Utilizacin del cido lctico .........................................................................28

1.2 MICROORGANISMO (LACTOBACILLUS) .................................................31

1.3 MEDIO DE CULTIVO..................................................................................35

1.3.1 Preparacin del medio de cultivo ................................................................37

1.4 MODELAMIENTO CINTICO.....................................................................39

1.4.1 Modelos cinticos de procesos simples ......................................................401.4.2 Modelos de crecimiento microbial ...............................................................42

1.4.3 Fases del ciclo de crecimiento en un cultivo por lotes ................................43

1.4.4 Modelos de crecimiento no estructurados...................................................48

1.4.5 El modelo de Monod ...................................................................................49

1.4.6 Otros modelos constitutivos del crecimiento celular....................................51

2. DISEO METODOLGICO .........................................................................55

2.1 MATERIALES Y EQUIPOS.........................................................................55

2.1.1 Equipos de anlisis. ...................................................................................56

2.1.2 Equipos de proceso. ...................................................................................57

2.2 MTODOS..................................................................................................57

2.2.1 Mtodos Analticos......................................................................................57


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2.2.2 Mtodo de procedimiento general...............................................................59

2.3 PREPARACIN DE LA CEPA DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII

NRRL B-763...........................................................................................................61

2.3.1 Activacin de la cepa ..................................................................................642.3.2 Mantenimiento de la cepa y seleccin del medio de mantenimiento...........64

2.3.3 Conservacin de la cepa.............................................................................65

2.4 DETERMINACIN DEL MEDIO PTIMO DE FERMENTACIN...............66

2.4.1 Etapa de adaptacin ...................................................................................66

2.4.2 Etapa de produccin ...................................................................................67

2.5 DISEO EXPERIMENTAL PARA EL MEJOR MEDIO DE CULTIVO .........68

2.6 BIOSNTESIS DE CIDO LCTICO...........................................................702.6.1 Recuperacin de cido lctico ....................................................................73

2.6.2 Determinacin de las curvas biocinticas ...................................................74

2.6.3 Modelamiento de la cintica de la fermentacin .........................................75

3. RESULTADOS Y ANLISIS.........................................................................76

3.1 MTODOS ANALTICOS............................................................................76

3.1.1 Caracterizacin del jarabe de glucosa ........................................................76

3.1.2 Curva patrn de azcares reductores .........................................................76

3.1.3 Curva patrn de cido lctico.......................................................................77

3.2 PREPARACIN DE LA CEPA....................................................................78

3.2.1 Seleccin del medio de activacin de la cepa.............................................78

3.2.2 Conservacin de la cepa.............................................................................78

3.3 DISEO EXPERIMENTAL PARA EL MEJOR MEDIO DE CULTIVO .........79

3.4 BIOSNTESIS DEL CIDO LCTICO.........................................................83

3.4.1 Determinacin de las curvas biocinticas ...................................................83

3.4.2 Modelamiento de la cintica de la fermentacin .........................................84CONCLUSIONES...................................................................................................91

RECOMENDACIONES...........................................................................................93

BIBLIOGRAFA.......................................................................................................94


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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades fisicoqumicas del cido lctico........................................17

Tabla 2. Produccin de cido lctico a pequea escala por diferentes cepas

homolcticas..........................................................................................................22

Tabla 3. Produccin de cido lctico a partir de papa. .......................................22

Tabla 4. Resultados de fermentacin de melaza con malta................................23

Tabla 5. Caractersticas de los microorganismos productores de cido lctico..27

Tabla 6. Aplicaciones industriales del cido lctico y algunos de sus

derivados.......... .....................................................................................................30

Tabla 7. Caractersticas en subgrupos del genero Lactobacillus........................34

Tabla 8. Requerimientos de nutrientes de los microorganismos y formas

comunes de satisfacerlos en cultivos.....................................................................37

Tabla 9. Medios de Cultivo..................................................................................38

Tabla 10. Resumen de las relaciones frecuentemente usadas para expresar

cinticas simples en el modelo de simulacin de procesos de fermentacin. .......41

Tabla 11. Parmetros cinticos en experimentos batch a 42C y pH 5,6 usando L.

bulgaricus...............................................................................................................51

Tabla 12. Materiales empleados en el procedimiento experimental para la

obtencin de cido lctico a partir de jarabe de glucosa.. .....................................55

Tabla 13. Composicin del caldo y agar MRS ......................................................56

Tabla 14. Mtodos empleados para la caracterizacin del jarabe de glucosa......57

Tabla 15. Caracterizacin del jarabe de glucosa. .................................................58

Tabla 16. Definicin de los parmetros del proceso fermentativo.........................69

Tabla 17. Variables del plan de experiencia factorial............................................69Tabla 18. Matriz del diseo factorial 23. ................................................................70

Tabla 19. Parmetros fsico-qumicos de control, variables a determinar y de

respuesta *.............................................................................................................72

Tabla 20. Resultados de la caracterizacin del jarabe de glucosa comercial. ......76


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Tabla 21. Datos para la obtencin de la curva patrn de Azucares reductores

(DNS).....................................................................................................................76

Tabla 22. Datos para la obtencin de la curva patrn de cido Lctico. ..............77

Tabla 23. Cuantificacin de los niveles mximos(+) y mnimos ().......................79

Tabla 24. Matriz de combinacin de tratamientos para el plan de diseo

factorial 23............ ..................................................................................................80

Tabla 25. Respuestas obtenidas del diseo factorial (pruebas por duplicado). ....80

Tabla 26. Parmetros estadsticos para cido lctico...........................................81

Tabla 27. Parmetros estadsticos para jarabe de glucosa. .................................82

Tabla 28. Cuantificacin de los factores del diseo experimental.........................83

Tabla 29.Datos experimentales del desarrollo de la fermentacin.......................84

Tabla 30. Sistema de ecuaciones para la simulacin del proceso........................85

Tabla 31. Parmetros cinticos del sistema de ecuaciones..................................85

Tabla B1. Datos para la obtencin de la curva patrn de cido lctico *.............101


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diferentes vas metablicas a partir de glucosa en bacterias cidolcticas................................................................................................................... 20

Figura 2. Morfologa del Lactobacillus delbrueckii sub especie bulgaricus. ........31

Figura 3. Curva tpica de crecimiento celular. .....................................................44

Figura 4. Influencia de la concentracin de substrato limitante en la velocidad de

crecimiento especfico. ..........................................................................................50

Figura 5. Diseo esquemtico global del desarrollo de la fermentacin .............60

Figura 6. Diagrama de flujo para la preparacin de la cepa................................62Figura 7. Fermentacin de los medios de cultivo. ...............................................68

Figura 8. Diagrama de bloques para la produccin de cido lctico va

fermentativa .......................................................................................................... 73

Figura 9. Diagrama de bloques-Produccin de cido lctico-Recuperacin. ......74

Figura 10. Curva patrn de azucares reductores. .................................................77

Figura 11. Curva patrn de cido lctico...............................................................78

Figura 12. Parmetros cinticos de la ecuacin logstica. ....................................86

Figura 13. Perfil del crecimiento de biomasa en funcin del tiempo. ....................87

Figura 14. Perfil del consumo de sustrato en funcin del tiempo. .........................88

Figura 15. Perfil de la aparicin de producto en funcin del tiempo......................89


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LISTA DE ANEXOS

Anexo A Mtodo del DNS para determinacin de azcares reductores.............99Anexo B Mtodo de cloruro frrico para la determinacin de cido lctico ......101

Anexo C Distribucin de los cultivos puros .......................................................103

Anexo D Manejo de las muestras y toma del inculo .......................................105

Anexo E Conservacin y mantenimiento..........................................................107

Anexo F Pruebas microbiolgicas ....................................................................108

Anexo G Biorreactor Applikon...........................................................................111

Anexo H Lista de smbolos ...............................................................................114


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RESUMEN

El proceso biotecnolgico de obtencin de cido lctico por fermentacin con

Lactobacillus Delbrueckii se llevo a cabo con el desarrollo de varias etapas.

La primera etapa fue la activacin y acondicionamiento de la cepa lctica.

En la segunda etapa se seleccion el medio de cultivo especial para el

mantenimiento de la bacteria y se estudiaron las condiciones necesarias para

lograr su conservacin durante toda la investigacin y trabajos posteriores.

En la tercera etapa se estudiaron diferentes combinaciones de concentraciones de

nutrientes, basados en la composicin del medio de cultivo ( Extracto de levadura,

malta y protena), y se estableci cual de estas combinaciones ofreca mejores

rendimientos en cuanto a produccin de cido lctico.

La cuarta etapa consisti en obtener las curvas biocinticas del proceso defermentacin, su modelamiento y simulacin. Este proceso se realiz en un

biorreactor agitado de 3 litros y se bas en las condiciones de operacin, y la

composicin del medio de cultivo obtenido en la etapa anterior.

Este trabajo tiene como propsito presentar un mtodo que permita convertir la

glucosa comercial en una materia prima que genere, por medio de un proceso

fermentativo, productos de alto valor agregado como el cido lctico.


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ABSTRACT

The biotechnical process of obtaining of lactic acid for fermentation with

Lactobacillus Delbrueckii you carries out with the development of several stages

The first stage was the activation and aconditioned of the lactic stump.

In the second stage the means of special cultivation was selected for the

maintenance of the bacteria and the necessary conditions were studied to achieveits conservation during the whole investigation and later works.

In the third stage different combinations of concentrations were studied of

nutritious, based on the composition of the means of cultivation (yeast Extract, malt

and protein), and he/she settled down which offered better yields as for production

of lactic acid of these combinations

The fourth stage consisted on obtaining the curves biocintic of the process of

fermentation, its model and simulation. This process was carried out in an upset

biorreactor of 3 liters and it was based on the operation conditions, and the

composition of the means of cultivation obtained in the previous stage.

This work has as purpose to present a method that allows to transform the

commercial glucose into a matter it prevails that it generates, by means of a

process fermentation, products of high value added as the lactic acid.


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INTRODUCCION

El hombre necesita de los procesos bioqumicos para la obtencin de productos

benficos y necesarios para la industria.

Por ello la biotecnologa se ha constituido como uno de los campos de la actividad

cientfico tcnica de mayor desarrollo y aplicacin en la actualidad. La

biotecnologa se refiere a la aplicacin de bioagentes orgnicos en la produccin

de bienes y servicios. Particularmente, las bacterias son capaces de transformar

diferentes materiales en productos de alto valor agregado como son los cido

orgnicos en general y el cido lctico en particular.

Actualmente l consumo de este cido en nuestro pas esta limitado

principalmente a la industria de alimentos y farmacutica, por ello se hace

necesaria la investigacin de la produccin del mismo a nivel nacional y con una

fuente de sustrato econmica y confiable como los subproductos amilceos

provenientes de los cultivos como el almidn de papa o yuca, Lo que podragenerar a futuro para algunas zonas de obtencin de estos almidones una posible

industria que genere empleo en estas zonas de produccin, y comenzar a

desarrollar en Colombia un proceso bioindustrial que use materias primas de bajo

costo.

los componentes mas importantes del medio de cultivo con respecto al crecimiento

del lactobacilo delbrueckii, son la concentracin de fuentes de carbono y de

nitrgeno. De esta manera se ha planteado como uno de los objetivos principales

del presente trabajo la formulacin de un medio de cultivo que favorezca la

produccin de biomasa y consecuentemente de cido lctico.


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Tambin se pretende plantear otra alternativa de proceso para la obtencin de

cido lctico, que permita obtener un producto de buena clidad implementando

nuevas fuentes de carbono por residuos que permitan que la obtencin de cidolctico sea viable.

El proceso biotecnolgico de obtencin de cido lctico por fermentacin con

Lactobacillus Delbrueckii se llevo a cabo con el desarrollo de varias etapas.

La primera etapa fue la activacin y acondicionamiento de la cepa lctica.

En la segunda etapa se seleccion el medio de cultivo especial para elmantenimiento de la bacteria y se estudiaron las condiciones necesarias para

lograr su conservacin durante toda la investigacin y trabajos posteriores.

En la tercera etapa se estudiaron diferentes combinaciones de concentraciones de

nutrientes, basados en la composicin del medio de cultivo ( Extracto de levadura,

malta y protena), y se estableci cual de estas combinaciones ofreca mejores

rendimientos en cuanto a produccin de cido lctico.

La cuarta etapa consisti en obtener las curvas biocinticas del proceso de

fermentacin, su modelamiento y simulacin. Este proceso se realiz en un

biorreactor agitado de 3 litros y se bas en las condiciones de operacin, y la

composicin del medio de cultivo obtenido en la etapa anterior.

Este trabajo tiene como propsito presentar un mtodo que permita convertir la

glucosa comercial en una materia prima que genere, por medio de un procesofermentativo, productos de alto valor agregado como el cido lctico.


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1. ASPECTOS FUNDAMENTALES

1.1 CIDO LCTICO

El cido lctico es uno de los cidos ms antiguos que se conoce, es el principal

componente de la leche agria de donde deriva su nombre y se obtiene por la

fermentacin del azcar de la leche (lactosa) por el Streptococcus lactis [3].

Fue descubierto en 1780 por un qumico sueco llamado Scheele quien lo aisl de

la leche agria. Posteriormente se apreci este mismo en la sangre humana. En1839 se produjo por primera vez cido lctico por fermentacin de carbohidratos

como sacarosa, lactosa, manitol, almidn etc. Sin embargo, el procedimiento

industrial slo se estableci en 1881 [37].

El cido lctico, cuyo nombre qumico es cido 2-hidroxipropanico o cido

-hidroxipropinico, se representa por la estructura molucular CH3CH(OH)COOH.

Se han reportado tres ismeros de este cido, que son [13]:

El cido L(+) Lctico: Se encuentra en los msculos, donde se forma por

descomposicin del glucgeno debido a esfuerzos continuos, causando fatiga

muscular. Se puede obtener del extracto de la carne, se conoce como cido

sarcolctico (del griego sarkos: (carne).

El cido D(-) Lctico: Se obtiene por fermentacin de azcares como la

sacarosa a travs de bacilos como el Acidi laevolactiti.

El cido d, L-Lctico: Se obtiene por fermentacin de lactosa mediante la

accin de microorganismos como el Lactobacilos bulgaricus.


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1.1.1 Propiedades del cido lctico. El cido lctico es un lquido viscoso, sin

olor, sin color y no voltil. Es soluble en todas las proporciones en el agua, en el

alcohol y en el ter; insoluble en benzol y en cloroformo. Tiene una densidad

relativa entre 1,21 - 1,23 a temperatura de 25 C. El cido lctico comercial puedetener purezas de 40 %, 75 % y 80 %.

El cido lctico que se obtiene por fermentacin es de color amarillento y tiene

impurezas como cidos orgnicos (actico, butrico, tartrico, ctrico), sales

minerales, azcares, glicerina, etc.

En la Tabla 1 se presentan otras propiedades fisicoqumicas del cido lctico.

Tabla 1. Propiedades fisicoqumicas del cido lctico.

Formula emprica C3H6O3

Peso molecular 90,08 g/mol

Gravedad especfica 1,249 15 C / 4 C

Punto de fusinD(+) y L(-): 52,8 a 54 C

D y L (segn su composicin): 16,8 a 33 C

ndice de refraccin 1,4414

Calor de combustin 3616 cal/g

Viscosidad 28,5 cp

Densidad 1,1748 g/mL

Fuente:PERRY, R. et al. Manual del Ingeniero Qumico. Sexta edicin en espaol. Volumen 6, McGraw Hill,Mxico, 1992.

Las cantidades mximas en ppm de cloruros, sulfatos, calcio y hierro presentes en

el cido lctico comercial son 10, 30, 20 y 10 respectivamente. Lo mximo en

cidos voltiles como cido actico es 0,5 % [15].


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1.1.2 Obtencin de cido lctico. El cido lctico es obtenido a escala

industrial por medio de mtodos fermentativos o sintticos. El producto logrado va

fermentativa es pticamente activo y el sinttico es inactivo [37].

En los ltimos aos, la produccin por fermentacin ha sido exitosa debido al

incremento en la demanda de cido lctico obtenido naturalmente.

Va sinttica: Desde 1960 el cido lctico es producido por va sinttica. Sehan considerado varios mtodos para la produccin industrial, el mtodo ms

utilizado se basa en la reaccin del acetaldehdo con el cianuro de hidrgeno,

seguida de la hidrlisis del lactonitrilo resultante.

Otro tipo de mecanismo, se basa en la reaccin a alta presin de

acetaldehdo con monxido de carbono y agua en presencia de cido

sulfrico como catalizador.

Igualmente, puede producirse por cloracin y subsiguiente hidrlisis del

cido propinico.

Va fermentativa: Para la fabricacin industrial de cido lctico, se empleanproductos que contienen gran cantidad de hidratos de carbono como maz, fcula

de papa, melazas y el suero de leche. El almidn ha de someterse previamente a

tratamiento cido o enzimtico para hidrolizarlo a glucosa.

CHOHCNCHHCNCHOCH 3HCl

3 +

ClNHCHOHCOOHCHOH2CHOHCNCH 43HCl

23 ++


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La eleccin del material a fermentar depende de la facilidad de su adquisicin, del

tratamiento que se requiere previo a la fermentacin y del microorganismo que se

debe utilizar segn el sustrato [15].

Entre las bacterias lcticas, adecuadas para fermentar un sustrato se deben

escoger las que acidifican mejor, que preferiblemente no favorezcan la aparicin

de productos secundarios, que no tengan exigencias para su nutricin y que se

puedan seguir cultivando puros fcilmente. Segn Ullman [37], Kownatzki

demostr que en una produccin en gran escala el aire es perjudicial.

El metabolismo de las bacterias lcticas puede dividirse en dos tipos:fermentaciones homolcticas y heterolcticas.

En las fermentaciones homolcticas, partiendo de carbohidratos es

convirtiendo casi por entero el azcar en cido lctico. Solo cuando las

fermentaciones se realizan en un medio alcalino pueden acumularse en

cantidades considerables otros productos, como formiato, acetato y etanol.

o

2ATPCHOHCOOH2CH2Pi2ADPOHC

trifosfat90,08)(PMinorgnicodifosfato180)(PM

sinAdenoLcticoAc.FosfatosinAdenoGlucosa

36126

==

+++

Las bacterias que tienen este tipo de metabolismo son Lactobacillus

delbrueickii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus leichmanii, Lactobacillus

casei y salivarus adems incluyen los gneros Pediococcus y

Streptococcus. [14].

Las fermentaciones heterolcticas producen un menor rendimiento de cido

lctico y convierten una parte del azcar en grandes cantidades de otros


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productos como cido actico, etanol, glicerol y dixido de carbono

dependiendo de las materias primas utilizadas.

Las bacterias que tienen este tipo de metabolismo son: Lactobacillus brevis,

Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bifidus, adems incluye las bacterias

del genero Leuconostoc[14].

Figura 1. Diferentes vas metablicas a partir de glucosa en bacterias cido lcticas.

GLUCOSA

Fructosa 1,6 P Fructosa 6 P Glucosa 6 P

Acetil P + Eritrosa 4 P Gluconato 6 P

Fructosa 6 P

Pentosa P Xilulosa 5P + CO2

Triosa 3P Acetil P + Triosa 3P Acetil P + Triosa 3P

Piruvato Piruvato Piruvato

Lactato Acetato Lactato Lactato Acetato

GLICOLISIS VIA BIFIDA GLUCONATO 6P

(Homofermentativos) (Heterofermentativos)

Fuente: SURIDERP, Chahal. ULLMANS Encyclopedia of industrial chemistry: cido lctico. 5 edition. DeBarbara Elvers editors. A15, (1995); p 97-104.

trifosfatocarbono)46PM()08,90PM(inorgnicodifosfato)180PM(

sinAdenodeDixidoAlcoholLctico.AcFosfatosinAdenoacosGlu

ATP22COOH2CH3CHCHOHCOOH3CHPi2ADP26O12H6C

===

+++++


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Aunque cada tipo de fermentacin ocurre dependiendo el tipo de bacterias

existentes, una fermentacin homolctica se puede convertir en heterolctica

cambiando las condiciones de cultivo.

1.1.3 Antecedentes. El cido lctico obtenido por fermentacin, despierta el

inters de los investigadores a mltiples estudios sobre el proceso metablico de

su obtencin por algunas especies lcticas.

Segn Ullmann [37], antiguamente se obtena el cido lctico agregando a las

soluciones azucaradas, queso en estado de descomposicin y oxido de zinc o

carbonato de zinc, a una temperatura entre 35-50 C. Tambin se produca,cuando al suero extrado por filtracin de la leche agria se le adicionaba xido de

zinc y se dejaba fermentar entre 25-35 C; de esta manera se formaba un lactato

de zinc, que se descompona despus de su cristalizacin por adicin de cido

sulfrico. Estos procesos tienen un rendimiento bajo y frecuentemente se obtiene

mas cido butrico y actico que lctico. Esto oblig a buscar nuevos

procedimientos, para una mayor produccin de cido lctico a escala industrial y a

investigar las especies y sus condiciones de vida antes de utilizarlas para la

produccin de dicho cido.

Segn Pederson1, la produccin comercial de cido lctico se inicio en 1881. En

1893 Lafar y en 1896 Leichmann, se dedicaron a cultivar en estado de pureza los

hongos del cido lctico. Wehmer en 1895, fue el primero que aplic en gran

escala cultivos puros; Kowntzki en 1902 cultivo las bacterias del cido lctico en

equipos con una capacidad de 1000 2000 litros.

Tatum y Peterson (1935), describieron la produccin de cido lctico L(+) a

pequea escala utilizando glucosa como sustrato. Ellos reportan resultados de

1 PEDERSON, Carl S. Microbiology of food fermentations, 2ed, Westport. Edit. Conn Avi, 1979. p 384.Citado por GUZMN,M. Rosmery y HERNANDEZ, A. Martha Lucia. Fermentacin anaerobia del suero lctico desproteinizado. Medelln, 1990.Trabajo de grado. Universidad Nacional de Colombia.


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rendimiento con base a azcar total, lo que corresponde al rendimiento real de la

fermentacin (Rr), a partir de tres cepas diferentes cuyo metabolismo es

homolctico (Tabla 2) [38].

Tabla 2. Produccin de cido lctico a pequea escala por diferentes cepas

homolcticas.

Microorganismog de cido lctico/540 g

de azcar[ g ]

Glucosa convertidaen cido lctico

[%]Streptococcus lactis 510 94

Lactobacillus casei 505 93

Lactobacillusdelbrueckii

517 95

Fuente:TATUM, E. L.; PETERSON, W.H. Fermentation method for production of dextrolactic acid. Ind. Eng.Chem. 27, (1935); p. 1493.

Un mtodo industrial para la obtencin de cido lctico a partir de papa fue

descrito por Cordn et al. En este caso se utilizaron amilasas fngicas de

Aspergillus niger para degradar el almidn. Tres bacterias diferentes fueron

utilizadas para este tipo de proceso (Tabla 3) [9].

Tabla 3. Produccin de cido lctico a partir de papa.

** cepa obtenida por cultivo aerbico a nivel de laboratorio.

Fuente: CORDON, T.C. et al. Lactic acid from potatoes. Ind. Eng. Chem. 42, 1950, p. 1833 1836.

Microorganismo Rendimiento de cido lctico

Basado enmaterial

Orgnico

Basado enazucares totales

Basado enazcar

consumido

Lactobacillus** 52,9 61,9 76,0

Lactobacillus pentosus(124-2) 77,1 91,2 95,2

Lactobacillus delbrueckii(NRLB-445)

64,5 79,4 93,8


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La produccin de cido lctico, as como tambin algunas de sus sales a partir de

suero libre de albmina, con la adicin de nutrientes fue reportada en 1953 por

Cambell [8]. El microorganismo utilizado fue Lactobacillus bulgaricus (ATCC9224),

reportando rendimientos que variaron entre 85-90 % basados en el peso delactosa.

En 1940 fue reportado un mtodo para acelerar la fermentacin cido lctica de

glucosa o melazas de caa, utilizando malta sin calentar como un nutriente para

Lactobacillus delbrueckii [28]. El incremento en la velocidad de fermentacin se

debi a un factor de crecimiento sensible a la temperatura presente en la malta

(Tabla 4).

Tabla 4. Resultados de fermentacin de melaza con malta.

tems Unidades Ensayo

Melaza Libra 120,2

Azcar % P/V 55,9

Malta Libra 14,7

CaCO3 Libra 33,0

Tiempo H 20

Azcar inicial % P/V 12,6

Azcar final % P/V 1,10

cido lctico % P/V 11,0

Rendimiento azcar fermentado % 95,7

Rendimiento azcar en melaza % 87,3

Fuente: STENROOS, S.L; LINKO, Y; y linko, p. Production of L lactic acid with inmmobilized Lactobacillusdelbrueckii. Biotechnol Lett. 4, (1982); p. 159.

Desde hace algunos aos se ha planteado el uso de clulas inmovilizadas para

obtener rendimientos mayores en la produccin de cido lctico. En 1982, se

obtuvo un rendimiento de 97% basado en glucosa, siendo ms del 90% el ismero

L(+) [36].


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1.1.4 Algunos procedimientos industriales. A nivel industrial, la produccin

del cido lctico por fermentacin puede realizarse por diferentes procesos, segn

el sustrato as:

- A partir de Xylosa de maz, segn la reaccin:

lcticoAcidoaceticoAcidoXylosa

OHCOHCOHC 3632425105 +

La xylosa es fermentada por el microorganismo Lactobacillus pentoaceticus [15].

Cerca del 85 90 % de la xylosa puede ser transformada en ambos cidos.

Adicionalmente LUO, Jun, et al. Utilizaron el residuo de la mazorca del maz

obtenido de la manufactura de xylosa y lo emplearon como sustrato en el proceso

simultneo de sacarificacin y fermentacin del cido lctico [21]. La composicin

del residuo de maz fue la siguiente: celulosa 62 %, hemicelulosa 19 %, lignina

13 %. El microorganismo utilizado fue el Lactobacillus delbrium. Adems

reportaron una relacin de conversin de cido lctico del 79 % basada en el

consumo de celulosa.

- Partiendo de la papa, con microorganismos del tipo Lactobacillus pentosus o

Lactobacillus delbrueckii, a temperatura de 45 C y pH entre 5 6.

- De la lactosa del suero, se puede obtener cido lctico por la siguiente

reaccin:

Para esta fermentacin se puede utilizar el Lactobacillus bulgaricus o el

Streptococcus lctis. Segn el microorganismo utilizado diferirn las condiciones

requeridas en el proceso.

lcticocidoLactosa

CHOHCOOHCH4OH.OHC 32112212


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El Streptococcus lctis puede trabajar en un intervalo de temperatura de 30-35 C

y de pH de 5-6; estas condiciones favorecen el crecimiento de otras especies y por

lo tanto se pueden formar otros productos contaminantes, presentndose as una

produccin baja. El Lactobacillus bulgaricus trabaja en un intervalo de temperaturade 41 45 C y de pH de 5-6; estas condiciones no favorecen el crecimiento de

otras especies contaminantes, es homofermentativo y produce mayor cantidad de

cido [15].

La produccin industrial de cido lctico requiere de inculos muy grandes los

cuales tienen que ser cultivados en el laboratorio de acuerdo al microorganismo a

utilizar. Para el Lactobacillus delbrueckii, se requieren las siguientes condiciones

de proceso: pH 5,0 5,8, un agente neutralizante como el carbonato de calcio o la

soda (CaCO3, NaOH) (si el nivel de cido lctico libre alcanza 1-2 % del peso total,

las bacterias pueden morirse), temperatura 43C, tiempo de fermentacin 42 h.

Segn LIMA, et al. [20] realizando esta operacin en tanques construidos en

madera o acero inoxidable con una capacidad de 23 mil litros, se obtuvieron

rendimientos del 85 al 90 % en relacin al azcar consumido.

La temperatura ptima para la cual el Lactobacilo exhibe una actividad mxima es

de alrededor de 50 C y se recomienda un pH entre 5 y 5,5, este tipo de

fermentacin elimina los problemas de contaminacin y permite trabajar el medio

con solo haber realizado una pasteurizacin, sin necesidad de autoclave o

someter el proceso completo a presin, este procedimiento convierte el cido

lctico en lactato de calcio. El hidrxido de magnesio, cal y otros nutrientes e

ingredientes que pueden haber sido adicionados en el agua, son removidos por

filtracin.

En un proceso industrial, el Lactobacilo es trasladado progresivamente desde el

tubo de ensayo a frascos, y por ltimo, a los fermentadores, donde se mantiene un

nivel de inculo del 10%.


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Cada traslado se hace despus de 16 20 horas de crecimiento a 43 C, con

control constante. El medio, consiste en 15% de glucosa, 0,4% de malta

germinada, 0,25% de fosfato diamnico y 10% de carbonato de calcio, no se

esteriliza. La industria se basa en la limpieza, la alta temperatura y el bajo pH pararestringir las contaminaciones, en especial por bacterias butricas.

Esta fermentacin requiere 4 a 6 das, cuando la concentracin de azcar se reduce

al 0,1% o menos y el rendimiento alcanza el 90 al 95%. Como la fermentacin es

anaerbica, debe suprimirse cualquier entrada de aire. Es necesario mantener el

medio en continua agitacin para evitar la precipitacin del agente neutralizante

[13].

El efecto del pH en la fermentacin, para el caso de la -galactosidasa fue

estudiado por BURGOS, et al. [7]. Sin control de pH la velocidad de reaccin es

mucho menor y slo cerca del 20 % del sustrato (lactosa) es consumido. A medida

que la concentracin inicial de sustrato incrementa, la densidad celular, la

concentracin de cido lctico y la productividad incrementan. Cuando el cido

lctico se produce, el pH del medio disminuye, con lo que decrece el crecimiento

del microorganismo y reduce la productividad. El pH necesita ser controlado para

optimizar la fermentacin.

En experimentos con control manual de pH a 5 0,2 con baja concentracin inicial

de sustrato, fue observada una correlacin lineal entre la velocidad de crecimiento

especfico y la velocidad de produccin de cido lctico. Por otro lado, en

experimentos con pH controlado en el mismo rango de pH pero con alta

concentracin inicial de sustrato, dos fases en el crecimiento del microorganismofueron observadas. En la primera fase, el crecimiento del microorganismo est

directamente asociado con la produccin de cido lctico. En la segunda fase, el

crecimiento del microorganismo es aproximadamente constante.


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En consecuencia, la produccin de cido lctico fue incrementando como

resultado de un decrecimiento en el consumo de sustrato para el mantenimiento

del microorganismo. Para la produccin de cido lctico, los experimentos a pH

controlados indicaron altas velocidades de reaccin [7].

En la Tabla 5 se presentan algunos microorganismos empleados en la produccin

de cido lctico.

Tabla 5. Caractersticas de los microorganismos productores de cido lctico.

Microorganismos Morfologa SubstratosTemperatura

optima

cido

producido

Lactobacillusbulgaricus

BaciloLactosa, suero

45 50 C Racmico

Lactobacillusdelbrueckii

Bacilo Glucosa, melazas 45 50 C L (+)

Lactobacillus brevis BaciloPentosas, madera

hidrolizada30 C Racmico

Lactobacillusplantarun

Bacilo Pentosas, lejas sulfticas 30 C Racmico

Streptococcus lactis Coco Lactosa, suero 35 C L (+)

Rhizopus oryzae Moho Glucosa, almidn 30 C L (+)

Fuente: Enciclopedia Salvat. Ciencia y tecnologa. Tomo I. p. 101-103

1.1.5 Recuperacin y purificacin. La recuperacin del cido lctico de los

caldos de fermentacin es dificultosa, debido a la baja tensin del vapor del cido

lctico y su tendencia a formar anhdridos y a experimentar autoesterificacin

cuando se le calienta y concentra por encima del 20 % y tambin a que susolubilidad es similar a la del agua [13]. Los contaminantes importantes son

protenas, azcares no fermentados, sales inorgnicas y materias coloreadas. La

prctica corriente es coagular las protenas y neutralizar completamente el cido

lctico calentando a 90 C con exceso de cal.


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El caldo fermentado es calentado a 70C para matar las bacterias y

posteriormente acidificado hasta un pH de 1,8 utilizando cido sulfrico el cual

regenera el cido lctico y precipita el calcio como sulfato de calcio. No obstante,

en la mayora de procesos, el cido lctico es recuperado bajo la forma de sal decalcio: lactato de calcio.

Las sales y biomasa precipitadas son removidas por filtracin. El filtrado resultante

consiste en una solucin de alrededor del 10 % en cido lctico el cual es

concentrado en un rango del 50 % al 80 % y se purifica por extraccin, intercambio

inico o esterificacin. Se mejora el olor y el sabor con peroxido de hidrgeno y/o

celdas de carbn dependiendo de los requerimientos [20].

El proceso de refinacin incluye un tratamiento con carbn activado que remueve

impurezas orgnicas, seguido de un tratamiento con ferrocianuro que depone los

metales pesados y una filtracin que remueve impurezas que se han coagulado

durante la fermentacin. La solucin es filtrada y pasada dentro de una resina

intercambiadora que remueve las trazas de contaminacin.

1.1.6 Utilizacin del cido lctico. El cido lctico tiene aplicacin en el

tratamiento y teido de pieles, en la tintorera de telas de algodn y seda.

En la industria de alimentos es comnmente usado en esencias, extractos,

jarabes, zumos de fruta, refrescos y otros; adems sustituye los cidos ctricos y

tartrico dando mayor estabilidad y mejor sabor a los productos. En destilera y

fbricas de levaduras se emplea como antisptico contra los hongos perjudiciales.

Tambin es materia prima en la produccin de plsticos acrlicos, que se utilizanen los recubrimientos metlicos resistentes. En forma de lactato se usa para

productos farmacuticos sustituyendo la glicerina [20].


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A partir del cido lctico por un proceso de condensacin se obtienen algunos

polmeros, entre los que se encuentra el cido polilactlico; de este ltimo, puede

obtenerse algunas resinas que reaccionan con diferentes aceites, como ricino,

lino, soya, etc. El tratamiento se hace a temperaturas entre 255-280 C y concatalizadores como xidos de aluminio, cobalto, hierro. Estas resinas, disueltas en

tolueno, acetona y otros derivados del petrleo permiten obtener barnices, tambin

es utilizado como plastificante de materiales a base de cloruro de vinilo, como

acrilatos y metacrilatos que pueden dar lugar a diversas resinas. Los steres

acrlicos y lactamidas se emplean como insecticidas. Las resinas fenlicas,

acrlicas, etc, preparada del cido lctico pueden usarse en la preparacin de

polmeros que reemplazan el vidrio; Tambin se destinan a la elaboracin deagentes impregnadores de materias textiles y como adherentes [15].

Los derivados del cido lctico como steres y teres se emplean como

disolventes en la preparacin de lacas, barnices y tintas, destacndose entre ellos

lactatos como etlico, metlico y butrico.

Regionalmente lo utilizan empresas como Lucta gran Colombiana Ltda.; Specia

fabrica de productos de caucho Eterna S.A.; Industrias Zolaeche Ltda.; Instituto

Farmacolgico Colombiano Ltda.; Quibi S.A.; John Simon y Cia Ltda.; Moderpan

de Colombia S.A.; Griffith de Colombia S.A.; Preparaciones de belleza S.A. Prebel;

Yardley of London Colombiana S.A.; Merck Colombia S.A.; Industrias Philips de

Colombia S.A.

Estas empresas lo importan de pases como Brasil, Espaa, Alemania, Holanda,

Nigeria, USA, Reino Unido, Canad; en diferentes cantidades [15].

La Tabla 6, resume otras aplicaciones industriales del cido lctico y de algunos

de sus derivados [37].


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Tabla 6. Aplicaciones industriales del cido lctico y algunos de sus derivados.

APLICACIONES COMPUESTO

INDUSTRIA ALIMENTICIA

Productos de res y pollo Lactato de sodio potasio y amonio

Nutricin Lactato de calcio

Ensaladas y aderezos cido lctico

Confitera y dulcera cido lctico

Productos libres de azcar LactitolBebidas-Lcteos y alimentoshorneados

Lactato de calcio, Grnulo polvo

INDUSTRIA QUMICA

Aeroespacial Lactato de metilo y etilo

Cuero cido lctico, lactato de sodio, potasio

DetergentesLactato de metilo, etilo y butilo, Ac.lctico

Metlica Lactato y steres de metilo, etilo, butilo

Pintura y tinta cido lctico, lactato y steres

Polmeros biodegradables cido polilctico

Solventes de limpieza Esteres de etilo y butilo

INDUSTRIA COSMTICA

Cuidado de la piel y el cabellocido lctico, lactato de sodio y depotasio

Artculos de tocador y desodorantes Lactato de sodio y potasio

Cuidado oral Lactato de calcio, lactato de aluminio

INDUSTRIA FARMACUTICA

Soluciones normales de dilisis Lactato de sodio y de potasio

Preparaciones minerales Lactato de calcio y aluminio

ImplantesAc. Lctico, gliclidos, lctidos,copolimeros, polilactidos.

Tabletas Lactato de calcio

Fuente: SURIDERP, Chahal. ULLMANS Encyclopedia of industrial chemistry: cido lctico. 5 edition. DeBarbara Elvers editors. A15, (1995); p 97-104.


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1.2 MICROORGANISMO (LACTOBACILLUS)

Las bacterias lcticas como el Lactobacillus delbrueckii son bacilos de longitud

variable y de un grosor de 0,5 0,8 m. Se trata de un grupo de bacterias

fisiolgicamente uniforme, de pared Gram-positiva, que slo utilizan sustratos,

predominantemente azcares, de manera fermentativa con formacin de cido

lctico. Carecen de actividad respiratoria porque les falta una enzima, la

citocromocatalasa, que les permita poner en marcha una cadena respiratoria con

el oxgeno como aceptor de electrones. A pesar de su metabolismo anaerobio, son

aerotolerantes y en los medios de cultivos slidos forman colonias en presencia de

aire.

La principal caracterstica del Lactobacillus es ser generalmente de forma

redonda, variando desde el largo y tenue hacia corto y redondo [3]. En la Figura 2

se esquematiza la morfologa del Lactobacillus delbrueckii sub especie bulgaricus

Figura 2. Morfologa del Lactobacillus delbrueckii sub especie bulgaricus.

Bar: 2 m Bar: 2 m


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Fuente: Tomado de

Las colonias formadas por los Lactobacillus se caracterizan por presentar un

crecimiento uniforme en medios muy ricos, estas colonias de bacterias lcticassiempre permanecen relativamente pequeas. El tamao reducido de las colonias

es atribuido principalmente al bajo rendimiento del crecimiento, como

consecuencia de su metabolismo exclusivamente fermentativo. Raramente son

pigmentadas, como resultado de la ausencia de citocromos.

Los Lactobacillus requieren no slo carbohidratos como energa y fuente de

carbono sino tambin nucletidos, aminocidos y vitaminas. Ninguna bacterialctica crece en un medio constituido exclusivamente por sales minerales y

amnicas como nica fuente de nitrgeno. La mayora necesita distintas vitaminas

del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, cido nicotnico, cido pantotnico, cido

flico) y varios aminocidos. Como su crecimiento disminuye linealmente en

condiciones estndar en funcin de la concentracin del nutriente, se cultivan para

realizar ensayos microbianos especficos y sensibles a la presencia de pequeas

cantidades de vitaminas o aminocidos en los alimentos [17].

En el caso del Lactobacillus delbrueckiise necesitan 14 aminocidos y 4 vitaminas

y es estimulado por otras sustancias. Estos factores de crecimiento pueden ser

proporcionados adicionando pequeas cantidades de malta germinada,

macerados de maz, torta de soya, leche desnaturalizada o extracto de levadura

[13]. Estos requerimientos nutricionales cualitativos y cuantitativos requieren ser

determinados para optimizar el crecimiento y la formacin del producto.

El Lactobacillus ha sido ofrecido durante mucho tiempo en productos de dieta y en

la mayora de casos entraa el uso en la preparacin de productos fermentados.

En primer trmino el Lactobacillus delbrueckiiha sido utilizado en la preparacin


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de yogur, el Lactobacilluscidofilos en la preparacin de leche acidificada y otras

especies estn involucradas en la preparacin de chucrut (leche fermentada con

azcar) y encurtidos. Estos microorganismos han sido usualmente ms resistentes

a las condiciones cidas que otras bacterias lcticas.

Para hacer crecer las clulas se requiere valores de pH de alrededor de 4 y 5. A

causa de esto, se puede llevar a cabo en aislamiento selectivo partiendo de

materiales naturales para usar en medios que contienen carbohidratos y un pH

cido, algunas de estas fuentes pueden ser el jugo de tomate y el agar pectona.

La resistencia cida del Lactobacillus permite entonces el crecimiento continuo

durante las fermentaciones naturales lcticas; cuando el valor de pH ha cado

hacia un valor bajo en comparacin con otras bacterias lcticas el crecimiento del

Lactobacillus es todava apreciable para el final de las etapas de muchas de las

fermentaciones cido-lcticas [2].

El Lactobacillus es raramente o casi nunca patgeno, los dos Lactobacillus

generalmente ms estudiados son los Lactobacillus de las especies aerobios o

facultativos aerobios y el clostridium [6].

Los ms importantes productores de cido lctico son los gneros: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus y Leuconoctoc, todos pertenecientes a la familia

Lactobacillaceae.

Muchas especies son homofermentativas pero algunas son heterofermentativas.

Dentro de la va homofermentativa el Lactobacillus delbrueckii, es uno de los quereporta mejores rendimientos en cido lctico, adems con unas necesidades muy

pequeas de pasteurizacin, debido a los bajos valores de pH en que se produce

esta fermentacin, asociados con los pocos problemas de contaminacin permiten

un control desde el punto de vista microbiolgico adecuado, para que el proceso


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se pueda llevar bajo condiciones de laboratorio y pueda ser despus extrapolado a

un proceso industrial [17].

Segn su tipo de fermentacin los Lactobacillus han sido divididos en tres

subgrupos mayores (Tabla 7):

Tabla 7. Caractersticas en subgrupos del genero Lactobacillus.

Caractersticas Especie DNA[ mol %GC ]

Homofermentativa

Mayor produccin de cido lctico (>85% partiendo de

glucosa) No hay formacin de gas partiendo de laglucosa; hay presencia de aldolasa.

(1) Temperatura optima 45 C y no debe ser menor a

15 C, Largas cadenas; Glicerol y cido teicico.

(2) Temperatura ptima 15 C variable a 45 C, cortas

cadenas de microorganismos y corineformes, hay

presencia de ribitol, glicerol y cido teicoico; y se puedeproducir mucha fermentacin oxidativa como producto del

oxgeno presente.

Heterofermentativa

(3) Produce alrededor del 50% de cido lctico partiendo

de glucosa; produce etanol y CO2; ausencia de aldolasa;

fosfoketolasa presente. Largas y pequeas cadenas;glicerol y cido ticico.

L. cidophilus

L. delbrueckii

L. casei, y

L. plantarun

L. curvatus

L. fermentum

L. brevis, y

L. buchneriL. kefir

34 37

49 51

45 46

42 44

52 54

44 4741 42

Fuente: BROCK Thomas; MICHAEL T; JOHN M and JACK P., Biology of Microorganisms, 7th edition.Prentice Hall. p 367-368,794-799.


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1.3 MEDIO DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que generan las condiciones necesarias para el desarrollo de losmicroorganismos [27].

Los microorganismos necesitan carbono, nitrgeno, minerales, a veces factores de

crecimiento, agua y s son aerobios oxgeno, para formar su biomasa y como

fuente de energa para el mantenimiento celular y la biosntesis del producto de su

metabolismo.

La composicin elemental de la mayora de los microorganismos es muy similar y

en consecuencia puede utilizarse como punto de partida para disear un medio de

fermentacin ptimo. Los valores tpicos de los componentes necesarios son:

C = 45 % en peso

H = 7 % en peso

O = 33 % en peso

N = 10 % en peso

S = 2,5 % en peso

Algunos microorganismos crecen en un medio que no necesitan factores de

crecimiento, mientras que otros necesitan medios complejos que contengan

nutrientes especficos como aminocidos, vitaminas o nucletidos; sin embargo

los organismos que no necesitan estos suplementos tienen frecuentemente

velocidades de crecimiento ms elevadas en medios complejos. Prcticamente entodas las fermentaciones industriales el carbono suministra la energa para el

crecimiento y para la biosntesis. La cantidad de carbono necesaria en condiciones

aerbicas, puede determinarse a partir del coeficiente de rendimiento de biomasa.


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Carbohidratos. Los carbohidratos son polihidroxialdehidos, polihidroxicetonaso sustancias que pueden producir este tipo de compuestos al hidrolizarse.

En una fermentacin los carbohidratos ms utilizados son los azcares simples,como sacarosa o glucosa, ya que la utilizacin de almidn, celulosa o

lignocelulosa implica la hidrlisis para desdoblarlo en azcares reductores.

La sacarosa: se utiliza en forma cristalina o en forma bruta como zumos o

melazas, subproducto de la manufactura de azcares [27].

La celulosa: presente en la madera, es usualmente combinada con lahemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosa. La lignina hace a la celulosa

resistente al ataque microbiano y hasta ahora los mtodos qumicos y enzimticos

que convierten la lingnocelulosa en azcares fermentables no son econmicos.

La glucosa: se obtiene usualmente en los medios de fermentacin, a partir de la

conversin enzimtica directa del almidn.

Nitrgeno. Las fuentes ms importantes de nitrgeno para la fermentacinson el amoniaco, los nitratos, la urea y el nitrgeno presente en los cereales,

races y subproductos de estos.

Azufre. El azufre puede ser suministrado mediante pequeas cantidades denutrientes como Na2SO4, MgSO4 y H2S. Se debe considerar que al agregar

sulfato de magnesio se est adicionando no slo el azufre necesario sino tambin

el magnesio que es un nutriente til en la produccin de cido lctico.

En general los requerimientos de nutrientes que deben estar en la composicin de

un medio de cultivo para brindar el equilibrio entre crecimiento y biosntesis puede

ser suplido por diferentes compuestos segn su elemento esencial [6].


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Algunos requerimientos nutricionales de los microorganismos son mostradas en la

Tabla 8.

Tabla 8. Requerimientos de nutrientes de los microorganismos y formas comunes desatisfacerlos en cultivos.

Nutriente Forma qumica suministrada al medio de cultivo

Carbono

Orgnico: Medios definidos = glucosa, acetato,piruvato, malato, cientos de otros compuestos.Medios complejos = extracto de levadura, extractode carne de res, peptona; muchos otros extractos.Inorgnico: CO2, HCO3.

NitrgenoOrgnico: Aminocidos, bases nitrogenadasInorgnico: NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3, N2

Fsforo KH2PO4, Na2HPO4

Azufre Na2SO4, H2S

Potasio KCl, K2HPO4

Magnesio MgCl2, MgSO4

Sodio NaCl

Hierro FeCl3, Fe(NH4)(SO4)2, quelatos de hierro

Micronutrientes COCl2, ZnCl2, CuCl2, MnSO4, Na2SeO4

Fuente: BROCK Thomas; MICHAEL T; JOHN M and JACK P., Biology of Microorganisms, 7th edition.Prentice Hall. p 367-368,794-799.

1.3.1 Preparacin del medio de cultivo. En la actualidad la mayora de los

medios de cultivo se encuentran comercializados normalmente bajo la forma de

liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de

cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y

redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores de crecimiento) siguiendo las

instrucciones del fabricante y esterilizando en autoclave.


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Antes de su esterilizacin, los medios lquidos en caldo se distribuyen en los

recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningn caso la altura del lquido en

el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste.

El uso de diversos medios semislidos comerciales que difieren en las fuentes de

carbono y nitrgeno, aporta la identificacin de los componentes propios del medio

que suplen las necesidades qumicas de los microorganismos para llevar a cabo

su crecimiento y desarrollo normal.

La Tabla 9 presenta la composicin de algunos medios de cultivo y las

condiciones necesarias para su manejo.

Tabla 9. Medios de Cultivo.

Medio de cultivo Composicin Condiciones

CALDO NUTRITIVO

Peptona 15 gExtracto de levadura 3 gCloruro sdico 6 gD(+) glucosa 1 g

pH : 4,5 0,2Temp. Optima 30 C.

EXTRACTO DE MALTA

Maltosa tcnica 12,75 g,

dextrina 2,75 g, glicerina2,35 g, peptona 0,78 g,agar 15 g.

pH : 4,8 0,2Temp. Optima 30 C.Medio Comercial 65 g/L

PEPTONA UNIVERSAL

Nitrgeno aminico 3,5 %Triptfano 1 2%cenizas de sulfato 15 %.compuestos fosforados 1%

pH : 6 - 7Term. Optima 30 C

EXTRACTO DELEVADURA

Extracto de levadura 5 g,Glucosa 10 g,agar-agar 20 g

pH : 6,5 0,2Temp. Optima 32 C

Medio comercial 65 g/L

EXTRACTO DEPROTENA Bacto Peptona Temp. Optima 30 C

Fuente: Merck. Manual de medios de cultivo, 1996.


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1.4 MODELAMIENTO CINTICO

Se define la fermentacin como aquel proceso en el que un sustrato es

transformado en un producto bajo la accin de microorganismos, dicho proceso selleva a cabo en condiciones determinadas que favorecen este accionar. Durante la

fermentacin el sustrato se consume, los microorganismos crecen y se multiplican

y el producto se forma. La biocintica de las fermentaciones estudia los procesos

de consumo de sustrato, de formacin de biomasa y de biosntesis de productos.

En la industria la mayora de las fermentaciones son por lotes (cultivo batch) y se

realiza en aparatos generalmente cilndricos, que garantizan las condicionesptimas para obtener los ms altos rendimientos de producto. Estos aparatos se

llaman reactores biolgicos o biorreactores, y existen muchas variaciones entre

ellos, todas adaptadas a necesidades prcticas particulares [11].

Los procesos de fermentacin que transcurren dentro de los biorreactores son

bastante complejos, ya que involucran procesos biocinticos, de transferencia de

masa y de calor, y en caso de biorreactores de gran tamao, fenmenos

hidrodinmicos [18].

Para analizar el rgimen de trabajo de los biorreactores y su diseo, es necesario

entonces utilizar modelos matemticos. El modelo matemtico es desarrollado

partiendo de un rgimen ideal de mezclado y a partir de ecuaciones diferenciales

consistentes para la biomasa, el sustrato y el producto.

Una de las principales etapas del modelamiento de un reactor biolgico es laetapa de elaboracin del modelo biocintico. La ecuacin para la acumulacin de

biomasa esta basada regularmente en el modelo de Monod, el cual describe la

velocidad de crecimiento del microorganismo y la influencia sobre ste de las

condiciones del medio.


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Los microorganismos toman los nutrientes del medio y lo utilizan para llevar a

cabo todas sus funciones metablicas: mantenimiento, crecimiento, reproduccin y

biosntesis de metabolitos. En muchos casos el producto de las fermentaciones

industriales es la biomasa, pero en la gran mayora de los esquemas deproduccin de sustancias de alto valor agregado por fermentacin, una vez que se

verifica el crecimiento de la biomasa se favorece la biosntesis de un metabolito

como producto.

Los productos comerciales fermentados son clasificados por Scragg2 en tres

casos [16] :

1) En el primer caso, el microorganismo elabora el producto, el cual permanece

intacto y puede ser un cido orgnico, un alcohol, una enzima u otra protena,

un aminocido, una vitamina o un antibitico.

2) En el segundo caso, el producto es el mismo microorganismo. Por ejemplo la

levadura de panadera y algunas vacunas.

3) En el caso final, el microorganismo convierte durante un proceso de

biotransformacin una sustancia en otra de mayor rentabilidad econmica, tal

es el caso de los esteroides.

1.4.1 Modelos cinticos de procesos simples. El proceso de planteamiento

del modelo matemtico de una fermentacin, usualmente proviene de un esquema

simplificado de la reaccin derivada del conocimiento de la ruta metablica

involucrada. Cada etapa de la reaccin metablica es caracterizada por lareaccin estequiomtrica en un lado y por el flujo de transferencia, representado

por la velocidad de reaccin, en el otro. sta ltima etapa es generalmente

2 Scragg, A. H. Aerobic batch culture ofSaccharomyces cerevisiae using 2% glucose as a carbon source in Biorreactors inBiotechnology, 1991. Citado por HENSIRISAK, Patcharee. "Scale up the use of a microbubble dispersion to increaseoxygen transfer in aerobic fermentation of Baker's yeast". Tesis instituto Politcnico de Virginia. Estados Unidos, 1997.


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aproximada por el uso de una de las relaciones derivadas de la teora de enzimas

o reacciones qumicas. La Tabla 10 resume las relaciones ms frecuentemente

empleadas para describir la dinmica de un sub-sistema metablico individual.

Tabla 10. Resumen de las relaciones frecuentemente usadas para expresar cinticas

simples en el modelo de simulacin de procesos de fermentacin.

Tipo RelacinFenmenocontrolante

Particularidades del modelocintico

1 S1r = DifusinRelacin lineal entre la velocidad delfenmeno y la concentracin del sustrato.Propio de procesos de eliminacin celular.

2 = S2r Adsorcinfsica

Derivado de la obtencin de isotermas deabsorcin sobre superficies slidas.Caracterstico de la mayora de lasreacciones hidrolticas.

3 Ss

K

S3

r+

=

Quimisorcin

Modelo tpico para procesos defermentacin. Quimisorcin de un sustratosobre un sitio activo tal como la molcula deuna enzima.

4+

=

SsK

S4r Quimisorcin

Modificacin del caso previo, donde ms deun sitio activo est presente por molculabiocataltica.

5 ( )[ ]sKSexp15r = Fuerzas dedisipacin

Interpretacin fsica del movimiento de un

punto de masa a un circunvecino.Incorporacin de trazas de elementos a laclula o a la pared celular.

6 ( )sKSexp6r = Disipacinfsica

Modificacin del tipo anterior, solucionado apartir de condiciones de frontera diferentesen la trayectoria metablica. Inhibicinincierta.

7

Ss

Ks

K

7r +=

Inhibicin

Bloqueo reversible hipottico de los sitiosactivos por quimisorcin de un sustrato.Retro-alimentacin negativa en el esquemametablico.

8 +

=

SsK

sK

8r Inhibicin

Variante del tipo r6, derivado de la inhibicinde un gran nmero de sitios activos de

reaccin. Caracterstico de procesos decuello de botella.

Fuente: QUINTERO R., Rodolfo. Ambientes computacionales para el diseo, optimizacin e innovacin enprocesos biotecnolgicos, 1997.Citado por: MONTOYA G.,Didier A. Y BERMDEZ S., Mnica Y.Modelamiento de la transferencia de oxigeno para el cultivo de microorganismos en un biorreactor decolumna de burbujeo. Universidad Nacional de Colombia. Manizales 2003.


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42

Donde:

= constante de velocidad mxima de reaccin a concentracin

infinita de reactante [s-1].

Ks = constante del sustrato en [kg / m3].

= parmetro cintico estipulado para el proceso.

S = concentracin del sustrato en [kg / m3].

La cintica de la mayora de las reacciones enzimticas se representa

razonablemente bien mediante la ecuacin de Michaelis-Menten (tipo 3), la cual no

exhibe las limitantes e imprecisiones de representaciones como las de Eisenthal y

Cornish-Bowden [31].

1.4.2 Modelos de crecimiento microbial. El crecimiento de clulas microbiales

puede ser visto desde varias perspectivas y con diferentes grados de complejidad,

dependiendo si distinguimos entre clulas individuales dentro de un reactor o ya

sea que examinemos la reaccin metablica individual ocurriendo dentro de la

clula. Si bien el modelo ms realista del crecimiento de una poblacin microbial

considera todas las ecuaciones que ocurren al interior de cada clula y las

variaciones de clula a clula en la poblacin, un modelo como este puede

resultar inmanejable. Debemos hacer algunas simplificaciones, la magnitud de

stas depende del propsito del modelo a utilizar.

Se deben hacer las siguientes distinciones en la descripcin de los modelos de

crecimiento celular. Cuando la poblacin esta diferenciada dentro de clulas

individuales que son dismiles una de otra en trminos de alguna caracterstica

distinguible, el modelo es segregado. Por otro lado, el modelo no segregadoconsidera la poblacin como un conglomerado (cmulo) dentro de una biofase la

cual interacta con el ambiente externo, y puede ser vista como una especie en

solucin, as la concentracin celular es descrita por una sola variable. Los

modelos no segregados tienen la ventaja que son matemticamente simples.


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43

La utilidad de los modelos segregados depende de la habilidad experimental para

distinguir las clulas dentro de una poblacin. Con frecuencia esto es dificultoso.

La consideracin de los detalles de las reacciones que ocurren al interior de laclula, lleva al concepto de estructura. Los modelos estructurados consideran las

reacciones individuales o grupos de reacciones que ocurren dentro de la clula;

mientras que los modelos no estructurados simplemente analizan la clula como

un ente en solucin el cual interacta con su entorno.

Un nivel adicional de complejidad resulta cuando se considera que los modelos

pueden ser de naturaleza aleatoria o determinstica. Un modelo aleatorio

considera la distribucin de la clula por caractersticas de inters, por ejemplo, el

tiempo de generacin de una poblacin celular puede originarse de diferentes

muestras de tiempos de generacin de clulas individuales en una poblacin y

calcular una distribucin de tiempos de generacin basados en la muestra.

El modelo aleatorio, sin embargo es solamente til para situaciones en las cuales

el nmero de clulas es muy pequeo y la distribucin de las caractersticas

celulares llegan a ser importantes. Por otro lado, los modelos determinsticos

ofrecen salidas que son completamente determinadas por las variables de entrada

del modelo y en consecuencia, no son consideradas las variaciones aleatorias en

las propiedades del sistema.

Los modelos determinsticos son los ms comunes y tiles y slo se consideraran

modelos semejantes en las siguientes secciones [42].

1.4.3 Fases del ciclo de crecimiento en un cultivo por lotes. Cuando las

clulas microbiales son inoculadas en un reactor por lotes que contienen un medio

de cultivo fresco y su incremento en la concentracin es monitoreado, se observan

diferentes fases de su crecimiento.


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44

Hay una fase de retardo (latencia) inicial, la cual es de duracin variable. Esta es

seguida por la fase de crecimiento exponencial, donde el nmero de clulas

(en base seca) incrementa exponencialmente. Esta es tambin conocida como la

fase logartmica, cuyo nombre proviene del mtodo comn de graficacin dellogaritmo del nmero de clulas frente al tiempo.

Posteriormente hay una corta fase de declinamiento en la fase de crecimiento y se

establece la fase estacionaria, en donde el nmero de clulas es el mayor

alcanzado durante el proceso.

Finalmente el nmero de clulas decrece durante la fase de muerte. Estas fases

son ilustradas en la Figura 3.

Figura 3. Curva tpica de crecimiento celular.

La fase de latencia es el resultado de diversos factores. Cuando las clulas son

sembradas en un medio fresco, cofactores a nivel intracelular, vitaminasaminocidos y iones ( Mg2+, Ca2+, etc) son transportados a travs de la membrana

celular con lo que sus concentraciones en el medio pueden decrecer

apreciablemente. Si se requiere intermediarios para las rutas metablicas de la

actividad enzimtica, la dilucin de estos reduce la velocidad a la cual operan

fase latente

tlag

X [ g / L ]

t [ s ]

fase exponencialo de crecimiento fase estacionaria

fase de muerte

texp

ts


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45

dichas rutas. Las clulas deben metabolizar las fuentes de carbono disponibles a

fin de reabastecer su energa intercelular antes de iniciar la divisin celular.

Igualmente si el inculo esta creciendo en un medio que contiene una fuente decarbono diferente a la del nuevo medio, las nuevas enzimas requieren ser

inducidas a catabolizar el nuevo sustrato, lo que tambin contribuye a el retardo en

el crecimiento celular. El punto en el ciclo de crecimiento desde el cual el inculo

es extrado, tambin es importante. Las clulas tomadas de la fase exponencial y

usadas como inculo, generalmente presentan una fase de latencia menor que las

tomadas de fases posteriores. Este inculo extrado de la fase exponencial tiene

concentraciones adecuadas de intermediarios y puede no sufrir el efecto dilucin.

Si un inculo es sembrado en un medio rico, con un contenido de aminocidos y

fuentes de carbono y nitrgeno complejas, el resultado es una corta fase de

latencia debido a que los intermediarios estn ya provistos en el caldo.

Cuando las clulas son sembradas en un medio que contiene diversas fuentes de

carbono, puede obtenerse diferentes fases de latencia. Esto es conocido como

crecimiento diauxico. La clulas usan preferiblemente una fuente de carbono

antes de consumir la segunda, debido a la represin catablica que las enzimas

experimentan al metabolizar la segunda fuente de carbono; adems puede

presentarse algn tipo de inhibicin. Sonnleithert y K!ppeli [35] explican en detalle

fenmenos como inhibicin por sustrato, represin catablica, inhibicin por

producto y efecto glucosa basados en el estudio de levaduras.

La divisin celular ocurre en la fase exponencial. La velocidad a la que incrementael nmero de clulas (N) es proporcional al nmero de clulas iniciales. Las

clulas incrementan mediante una progresin geomtrica 20, 21, 22...2m hasta m

divisiones. Por ejemplo si el numero de clulas iniciales es N0, el numero despus

de m generaciones es 2mN0.


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46

En vez del nmero de clulas, con frecuencia es ms conveniente usar el peso de

clulas secas por volumen (X) como una medida de la concentracin celular.

Durante la fase exponencial en un reactor por lotes la variacin de la biomasa se

describe por:(1.1)

Donde es la velocidad de crecimiento especifico de las clulas.

La ecuacin anterior puede integrarse desde el final de la fase de latencia

( X=X0 y t=tlag) para cualquier punto en la fase exponencial (X,t).

(1.2)

El tiempo requerido por el nmero de clulas o peso seco para duplicarse,

conocido como tiempo de duplicacin td, esta relacionado con la velocidad de

crecimiento especifico por:

(1.3)

Ocasionalmente se da que el tiempo duplicante para el nmero de clulas y las

clulas en peso seco difieren, como resultado de la inconsistencia de la masa

celular por clula. Sin embargo, se puede definir la velocidad del crecimiento

especifico del nmero de clulas ( en h-1) separadamente de ( ) como sigue:

(1.4)

Cuando y son iguales, se dice que se tiene un crecimiento balanceado. En el

cual existe un adecuado abastecimiento de todos los nutrientes no limitantes del

desarrollo celular, tal que la composicin de la clula permanece constante, an

cuando la concentracin de todos los otros nutrientes (limitantes) decrecen.

Xdt

dx=

( ) ( )lago

tto ttX

Xln0eXX lag =

=

=2ln

td

dt

dX

X

1

dt

dN

N

1v ==


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47

Por otro lado, cuando el crecimiento no es balanceado, ocurren variaciones en la

composicin de la clula (contenido de protenas, viabilidad, etc). Si bien la

velocidad de crecimiento del nmero de clulas puede ser constante, la velocidad

de crecimiento de la masa celular es variable.

A bajas concentraciones de nutriente, se establece que la velocidad de

crecimiento especfica depende de la concentracin de nutrientes. A altas

concentraciones, la velocidad de crecimiento especfica alcanza valores mximos,

fijados por la cintica intrnseca de las reacciones intracelulares, las cuales estn

relacionadas en la trascripcin y traslacin del DNA. El final de la fase exponencial

se presenta cuando algn nutriente esencial, por ejemplo la fuente de carbono onitrgeno es agotado, o cuando un metabolito txico se acumula a un nivel

suficiente como para inhibir el crecimiento.

Aun si son empleadas muy altas concentraciones de nutrientes, la acumulacin de

metabolitos txicos limita la concentracin de las clulas que pueden llegarse a

alcanzaren la fase exponencial. En un biorreactor por lotes esta limitacin puede

superarse reteniendo las clulas por filtracin, tambin manteniendo un flujo

continuo de nutrientes y remocin de los productos.

Concluida la fase exponencial, la velocidad de crecimiento decrece

(declinamiento) lo que es seguido por la fase estacionaria. La duracin de la fase

estacionaria puede variar con el tipo de clula, las condiciones previas al

crecimiento etc. Algunas clulas pueden liberar o producir nutrientes que pueden

ser consumidos por otras clulas y as mantener la poblacin celular.

Finalmente est la fase de muerte, En sta fase las clulas cesan la liberacin de

nutrientes y la poblacin decrece. Los metabolitos intracelulares son barridos por

diferentes sistemas de enzimas dentro de la clula y los metabolitos txicos se

acumulan.


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48

La velocidad a la que declina el crecimiento es tambin exponencial y puede

representarse mediante la ecuacin:

(1.5)

Los modelos de mayor importancia son los que relacionan la velocidad de

crecimiento especifica () con la concentracin de sustrato y otras variables

externas. La simplificacin de estos no consideran las diversas fases del ciclo de

crecimiento, pero predicen la velocidad de crecimiento en la fase exponencial. Es

posible considerar modelos mas complicados.

1.4.4 Modelos de crecimiento no estructurados. Las relaciones simplificadas

que describen el crecimiento exponencial son modelos no estructurados. Estos

modelos analizan la clula como una simple especie en solucin y describen la

cintica del crecimiento celular basados en los perfiles de concentracin de las

clulas y los nutriente. Los primeros modelos que se desarrollaron para el

crecimiento celular no tienen en cuenta la dependencia de la velocidad de

crecimiento exponencial con la concentracin de nutrientes. Tales modelos tienen

hoy da aplicabilidad cuando el sustrato limitante del crecimiento no esta

identificado.El modelo ms simplificado es el Malthus descrito como:

(1.6)

Donde rx es la velocidad volumtrica de incremento celular en peso seco (el cual

puede abreviarse como DCW) en g DCW / L-h y (h-1) es constante. Este modelo

predice un crecimiento ilimitado con el tiempo (crecimiento Malthusiano).

Segn Blanch y Douglas [5], para proveer de un recurso que limitara el

crecimiento, Verlhulst (1844) y despus Pearl y Reed (1920) propusieron la

adicin de un trmino inhibidor el cual es dependiente de la concentracin celular:

XKdtdX d=

XrX =


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49

(1.7)

El cual para un sistema por lotes puede escribirse como:

(1.8)

Donde X=X0 a t=0. Este resultado es conocido como la ecuacin logstica. La

mxima concentracin celular alcanzada en tiempos largos es 1/, y la velocidad

inicial de crecimiento es aproximadamente exponencial. El parmetro es por lo

general considerablemente menor que la unidad.

1.4.5 El modelo de Monod. Uno de los modelos simplificados que incluye el

efecto de la concentracin de nutrientes es el modelo desarrollado por Jacques

Monod, basado en observaciones del crecimiento de E. Coli en varias

concentraciones de glucosa. Este modelo asume que slo un sustrato (el sustrato

limitante de la velocidad del crecimiento, S) es relevante en la determinacin de la

velocidad de proliferacin de la clula. La forma de la ecuacin de Monod es

similar a la cintica enzimtica de Michaelis-Menten; si en realidad el transporte

del sustrato a la clula es limitado por la actividad de una permeasa, el crecimientocelular puede ser descrito de la forma:

(1.9)

As para un crecimiento por lotes a un volumen constante:

(1.10)

Donde max es la velocidad especfica mxima de crecimiento de las clulas y Ks la

constante del sustrato, que es el valor de la concentracin de nutriente cuando la

velocidad de crecimiento especfica est a la mitad de su mximo valor.

( )X1kXrX =

( )kto

kto

X e1X1eX

XasyrdtdX

==

SK

S

s

max

+

=

X

SK

S

dt

dX

s

max

+

=


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50

Esta ecuacin presenta dos formas de limitante. A concentraciones altas de

sustrato, S >> Ks y la ecuacin anterior se reduce a una ecuacin con

dependencia de orden cero en relacin a la concentracin de sustrato. A

concentraciones bajas, S =


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51

Tabla 11. Parmetros cinticos en experimentos batch a 42C y pH 5,6 usando L.

bulgaricus.

SustratoVelocidad decrecimiento

especfico (h-1)Rendimiento de crecimiento(g cel / g sustrato)

Tiempo deresidencia

(h)

Lactosa 0,98 0,097 7,5

Glucosa 0,96 0,093 8,0

galactosa 0,76 0,081 9,5

Fuente: BURGOS-RUBIO, Concepcin N.; OKOS, Martn R.; WANKAT, Phillip C. Kinetic study of theConversion of Different Substrates to Lactic Acid Using Lactobacillus bulgaricus. Biotechnol. Prog.2000, 16, p 305 314.

Los valores de Ks son generalmente bastante pequeos, lo que implica que la

velocidad especfica de crecimiento permanece cerca de su mximo valor durante

gran parte del periodo de crecimiento por lotes. Esta aparente dependencia de

orden cero con la concentracin de sustrato justifica el termino crecimiento

exponencial.

Con el propsito de lograr la representacin de los datos experimentales con un

mayor grado de ajuste, diferentes investigadores han propuesto otros modeloscomo alternativa a la ecuacin de Monod. Entre ellos se encuentran el modelo de

Moser; modelo de Contois y Fijomoto; modelo de Teissier; modelo de Konak;

modelo de Kargi y Shuler; modelo de Meyrath [4,12].

1.4.6 Otros modelos constitutivos del crecimiento celular.

Modelo c intico del co nsumo de s ust rato. Las clulas consumen sustratodel medio ambiente y lo canalizan en diferentes rutas metablicas. Parte del

sustrato puede utilizarse directamente en el crecimiento y en la sntesis de

producto, mientras que otra parte se utiliza para generar la energa necesaria para

las actividades de mantenimiento. El sustrato requerido para el mantenimiento

vara considerablemente dependiendo del organismo y del medio de cultivo.


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De este modo, una estimacin completa del consumo de sustrato debe incluir un

componente de mantenimiento. La velocidad especfica de consumo de sustrato

para actividades de mantenimiento se conoce como el coeficiente de

mantenimiento, ms.

Tanto para cultivos en los que no existe formacin de producto extracelular (por

ejemplo en la fabricacin de levadura de panadera y de protenas de origen

unicelular), donde se supondr que todo el sustrato que entra a la clula se utiliza

para el crecimiento y funciones de mantenimiento, como para modelos en los que

el producto est asociado con el crecimiento microbiano, las velocidades de

consumo de sustrato, crecimiento celular y mantenimiento se relacionan de lasiguiente manera:

(1.11)

En cultivos con formacin de producto no asociada con el crecimiento microbiano,

la relacin entre las velocidades (consumo de sustrato, crecimiento celular,

formacin de producto y mantenimiento) es:

(1.12)

Donde rP y YP/S, velocidad de formacin de producto y rendimiento de sustrato en

producto respectivamente, son tratados posteriormente.

En la ecuacin (1.12), YX/S es el rendimiento de sustrato en biomasa, el cualprovee una medida de la eficiencia del nutriente para soportar biosntesis. Su valor

elevado favorece la productividad del proceso y disminuye el costo de remocin de

calor. Este coeficiente economtrico da la idea de cunta biomasa se puede

formar por cada unidad de masa del sustrato.

Xmdt

dX

Y

1

dt

dSr s

SXS +==

XmY

r

dt

dX

Y

1

dt

dSr s

S/P

P

SXS ++==


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53

dt

dXY

dt

dPr X/PP ==

dt

dSYr S/PP =

Generalmente, cuando el sustrato es el factor limitante del crecimiento, la cantidad

de biomasa producida es proporcional a la cantidad de fuente de carbono

consumida y su rendimiento en sustrato puede definirse de la siguiente manera:

(1.13)

Siendo Xo y So las concentraciones iniciales de biomasa y sustrato,

respectivamente.

Modelo c intico de la form acin de pro duc to. De acuerdo con la relacincuantitativa entre la cantidad de producto y el crecimiento de biomasa puededarse el caso que la formacin de producto est directamente asociada con el

crecimiento, que no haya una relacin entre el crecimiento y la formacin de

producto o que exista una relacin parcial entre el crecimiento y la formacin de

producto[12].

Formacin de prod ucto asociada al crecimiento m icrobiano . Algunas delas ecuaciones que describen la formacin de producto son:

(1.14)

(1.15)

Donde YP/S es el rendimiento de sustrato en producto y YP/X es el rendimiento debiomasa en producto, los cuales se definen como:

(1.16)

o

oS/X SS

XX

S

XY

=

=

SS

PP

S

PY

o

oS/P

=

=


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54

PXPP KXdt

dXY

dt

dPr +==

(1.17)

Siendo Po la concentracin inicial del producto.

Formacin de producto no asociada al crecimiento microbiano.Generalmente, esta cuantificacin es una tarea difcil. En algunos casos se ajusta

a los datos obtenidos experimentalmente.

La expresin se da como:

(1.18)

Donde:

rP = velocidad de formacin de producto

KP = constante de velocidad para formacin de producto [gproducto / (gclulas. h)]

Formacin de pro ducto parc ialmente asociada al crecimiento. El modelopropuesto por Luedeking y Piret es una combinacin de las ecuaciones. (1.18) y

(1.14).

(1.19)

o

oX/P XX

PP

X

PY

=

=

PP KXr =


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55

2. DISEO METODOLGICO

LUGARES DE TRABAJO

Procedimientos microbiolgicos. Reconstitucin y activacin del microorganismo

Laboratorios de bacteriologa de la Universidad Catlica.

Determinacin del crecimiento celular. Laboratorio Anlisis de Aguas y

Alimentos.

Etapa experimen tal (fermentacin). Laboratorios de Procesos Productivos de la

Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales.

2.1 MATERIALES Y EQUIPOS

Tabla 12. Materiales empleados en el procedimiento experimental para la obtencin de

cido lctico a partir de jarabe de glucosa..

Reactivos Casa comercial

Glucosacido lcticoJarabe de glucosaExtracto de protena (Bacto pectona)Extracto de levaduraExtracto de maltaCarbonato de calcioHidrxido de sodioFosfato de potasioFosfato amonico

cido Dinitro Saliclico ( DNS)

Tartrato de sodio y potasioBisulfito de sodio

cido sulfricoCaldo MRS

Agar MRSGlicerol al 10%

Carlo Erba al 99,9%Galactic (Anexo B)Industrias del Maz (Maizena).DifcoDifcoOxoidGrado reactivoCarlo Erba grado reactivoGrado reactivoGrado reactivoCarlo Erba grado reactivo

Mol Labs grado reactivoCarlo Erba grado reactivoGrado reactivo (puro)MerckMerckGrado reactivo


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56

En la Tabla 13 se presenta la composicin del caldo y agar de MAN ROGOSA

SHARPE (MRS) para el enriquecimiento del cultivo y aislamiento de todas las

especies Lactobacillus [23].

Tabla 13. Composicin del caldo y agar MRS

CALDO DECULTIVO

COMPOSICIN [ g /L ] PREPARACIN

Caldo MRS

Disolver 50 g/L,

esterilizado en

autoclave (15 minutos a

121-124C), con un pH

de 6,5,

Agar MRS

Peptona universal 10,0

Extracto de carne 5,0

Hidrogeno fosfato dipotasico

2,0

Tween 80 1,0

Hidrogencitrato diamnico 2,0

Acetato sdico 5,0

Sulfato de magnesio 0,1

Agar-agar 12,0 (ausente en el

calo MRS).

Disolver 62 g/L,

esterilizado en

autoclave (15 minutos a

121-124C), con un pH

de 5,5,

Fuente: Merck. Manual de medios de cultivo, 1996.

Cepa utilizada. La cepa utilizada fue Lactobacillus delbrueckii subespecie

(bulgaricus), suministrada por el Departamento de Agricultura de los Estados

Unidos. En el Anexo C se suministra la informacin sobre los contactos

respectivos de ste laboratorio.

2.1.1 Equipos de anlisis.

Espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 20 (Rango 200-1100 nm)

pH-metro Schoot Handy Lab 1 (Precisin 0,1 unidades de pH)


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57

Refractmetro Extrech, escala 0 32 Brix

Cmara de neubauer

2.1.2 Equipos de proceso.

Biofermentador P 100 / P 140 / P 310

Balanza Analtica Kern (Precisin 0,1 mg)

Bao termostatado Eterna con control PID (Rango 0-200C y precisin 0,1C)

Incubadora

Autoclave

Cmara de a

Acido Lactico Bases

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