UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...
234
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS INFLUÊNCIA DOS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) NA FORMAÇÃO DO SABOR INFLUENCE OF THE MICROORGANISMS INVOLVED IN THE PROCESS OF CUPUASSU FERMENTATION (Theobroma grandiflorum Schum) ON THE FLAVOR FORMATION CAMPINAS 2015
-
Upload
truongmien -
Category
Documents
-
view
218 -
download
0
Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS
INFLUÊNCIA DOS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE
FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) NA
FORMAÇÃO DO SABOR
INFLUENCE OF THE MICROORGANISMS INVOLVED IN THE PROCESS OF
CUPUASSU FERMENTATION (Theobroma grandiflorum Schum) ON THE
FLAVOR FORMATION
CAMPINAS
2015
SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS
INFLUÊNCIA DOS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE
FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) NA
FORMAÇÃO DO SABOR
INFLUENCE OF THE MICROORGANISMS INVOLVED IN THE PROCESS OF
CUPUASSU FERMENTATION (Theobroma grandiflorum Schum) ON THE
FLAVOR FORMATION
Orientadora: Profa Dra PRISCILLA EFRAIM
Campinas – SP
2015
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos, da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Tecnologia de Alimentos.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA POR SIMONE DE
NAZARÉ MELO RAMOS E ORIENTADA PELA
PROF(A). DR(A). PRISCILLA EFRAIM
Thesis presented to the Faculty of Food Engeneer of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in the area of Food Technology.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/00296-4; CNPq,
485287/2011-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Ramos, Simone de Nazaré Melo Ramos, 1968-
R147i Influência dos microrganismos envolvidos no processo de fermentação
de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) na formação do sabor /
Simone de Nazaré Melo Ramos. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Priscilla Efraim.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
1. Cupuaçu. 2. Polpa de frutas. 3. Fermentação. 4. Compostos
orgânicos voláteis. 5. Metagenômica. I. Efraim, Priscilla. II. Universidade
Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Influence of the microorganisms involved in the process of
cupuassu fermentation (Theobroma grandiflorum Schum) on the flavor formation
Palavras-chave em inglês:
Cupuassu
Fruit pulp
Fermentation
Volatile organics compounds
Metagenomic
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos
Titulação: Doutora em Tecnologia de Alimentos
Banca examinadora:
Priscilla Efraim [Orientador]
Eliete da Silva Bispo
Jorge Herman Behrens
Maristela da Silva do Nascimento
Suzana Caetano da Silva Lannes
Data de defesa: 18-12-2015
Programa de Pós-Graduação: Tecnologia de Alimentos
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Priscilla Efraim DTA/FEA/ UNICAMP (orientadora)
Profa. Dra. Eliete da Silva Bispo Universidade Federal da Bahia (titular)
Prof. Dr. Jorge Herman Behrens DEPAN/FEA/UNICAMP (titular)
Profa. Dra. Maristela Silva Nascimento DTA/FEA/ UNICAMP (titular)
Profa. Dra. Suzana Caetano da Silva Lannes Faculdade de Ciências Farmacêuticas / USP (titular)
Dra. Aparecida das Graças Claret de Souza Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (suplente)
Dra. Marcela Mendes Salazar Instituto Senai de Inovação em Biomassa (suplente)
Profa. Dra. Nathalia Cristina Cirone Silva
DCA/FEA/UNICAMP
(suplente)
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do aluno.
Cupuaçu
És soberano
Do pomolário
Americano
Num cofre pardo
Guardas com ciúmes
Raros sabores
Vivos perfumes
Urna selvagem,
Ubre silvestre,
Moreno seio,
Tanta delícia
Tua curva crosta
Retém no meio
Luiz Bacellar, Rondel do Cupuaçu
DEDICATÓRIA
Com muito amor e carinho:
A Deus,
Aos meus pais Marlene e Osmar,
Minha irmã Marcia
Ao meu sobrinho Francisco
Ao filho do coração Cassiano
Dedico
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido Deus, por ter colocado essa nobre etapa na minha vida.
Aos meus pais, Marlene e Osmar, que me forneceram instrumentos e
ensinamentos para minha caminhada.
À minha irmã, Marcia, pelo apoio, incentivo, compreensão e,
principalmente, por ter me dado o Francisco como sobrinho, que adoçou vários
momentos em Campinas, assim como meu filho do coração, Cassiano.
Aos meus primos Rodrigo e Junior e ao cunhado Roosevelt pelo apoio e
torcida em Manaus. À minha prima Andréia, por ter me acompanhado no início do
curso em Campinas.
À minha querida tia Nice in memoriam, por ter compartilhado comigo
momentos de alegria e torcido por mim à distância.
À minha querida orientadora e agora amiga, Profa Dra Priscilla Efraim, por
ter me aceitado como orientada, conduzindo com profissionalismo e ética um
trabalho tão enriquecedor para ambas, com oportunidades de mais trabalhos
futuros.
Ao estimado e muito humano Prof. Dr. Flávio Schmidt, pela oportunidade
concedida.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através da Faculdade
de Engenharia de Alimentos (FEA) e Departamento de Tecnologia de Alimentos
(DTA) pelo privilégio de fazer parte do quadro discente de pós-graduação.
À minha querida amiga e eterna professora, Dra. Ângela Líbia Cardoso, por
ter influenciado na minha decisão de cursar doutorado.
Ao casal amigo Célia Regina, pela “influencia terapêutica” e Wolfgang
Bourier, pela super ajuda na Alemanha.
À D. Fátima e Sr. Alcides da CUPUAMA, pelas sementes de cupuaçu
fornecidas para a realização dos trabalhos.
Ao Dr. Homero de Miranda Leão, da Secretaria Municipal de Saúde de
Manaus, pelo apoio à minha participação no curso.
À Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas (FVS), na
pessoa do Dr. Bernardino Cláudio Albuquerque e ao Laboratório Central de Saúde
Pública (LACEN), representado pela Dra. Tirza Mattos, por autorizar minha liberação
para participação no curso e permissão de uso das instalações e equipamentos do
LACEN para realização da primeira fase dos experimentos.
Aos colegas do setor de produtos do LACEN: Dra. Rejane Ortis, Daniel,
Juliana, Leonardo, Neide e D. Rai, pela super ajuda, apoio e compreensão ao nosso
trabalho durante as análises em Manaus.
Às amigas Louzamira e Ângela Rocha, que de longe me deram amplo
apoio no que eu precisava.
Aos alunos de graduação do Amazonas: Adriane, Kelly, Klaucio, Lawrence,
Luiz, Mairlon, Natasha, Rosilene e Tatiane, pela colaboração nos ensaios realizados
em Manaus.
À amiga Dra. Paula Hehl, pela força e carinho.
Aos queridos amigos de Campinas: Margarete Batistella (Meg), Jane e Bal,
que me acolheram em suas casas, dividindo comigo momentos inesquecíveis.
Às amigas Diana e Kazumi, pelo super apoio, companheirismo,
conselhos, dicas, cafés, batatas assadas e guaranás de desabafo (choros).
Aos amigos do DTA Lidiane, Sebastian, Tchuby, Ingrid, Mária, Ludmilla,
Laura, Bruna, Miguel, Franklin, Bruno, pelos momentos saudáveis e divertidos nas
horas de folga.
À querida amiga Carol Bittencourt que me “co-orientou” em vários
momentos no laboratório.
À amiga Adriana pela ajuda nos experimentos realizados em Manaus e ao
amigo Júlio, pelas dicas valiosas sobre cromatografia.
À querida amiga e “chefe” do laboratório de frutas, Aninha Koon, pelo
imenso apoio, paciência, doçura e compreensão e a Juliana Hashimoto, pelas dicas
oferecidas.
Ao Wolfgang Danzl e Alexandre Martins do Instituto Fraunhofer, pela
autorização e viabilização da realização de uma parte dos experimentos no IVV em
Freising – Alemanha.
Ao Prof. Dr. Gotfried Ziegleder, pela valiosa orientação na interpretação
dos resultados analíticos no IVV.
Ao Christopher Schmidt e Brigitte Stumpf do IVV, pela excelente
colaboração técnica e científica.
À Sra. Arali da Jaf Inox pela autorização da utilização dos equipamentos e
instalações e apoio do corpo técnico da empresa, no processamento dos produtos.
Á Dra Aline Oliveira do Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) e Prof.
Jorge Behrens da FEA pela colaboração na análise estatística dos resultados de
sensorial.
À amiga Izabela Rocha e Juliana Glezer, pela imensa colaboração na
análise sensorial dos produtos no laboratório do DTA.
Aos estagiários Rafael, Deisi, Tiago Aleluia e Carole pela colaboração no
processamento das amostras e análises físico-químicas.
Ao Prof. Dr. Gonçalo Pereira por autorizar a realização de extração das
amostras de DNA no Laboratório de Genômica e Expressão da Unicamp.
À amiga Dra Marcela Salazar pela orientação valiosa no laboratório de
genômica, assim como análise dos resultados de sequenciamento juntamente com o
doutorando Leandro Nascimento e Marcelo Carazzole.
À querida Profa. Valéria Maia e Tiago Palladino, pela excelente ajuda na
análise estatística dos resultados de biologia molecular.
À FAPEAM pela concessão da bolsa. À FAPESP e CNPq pelos recursos
concedidos para a realização dos trabalhos.
E a todos que indiretamente participaram deste trabalho.
Muito obrigada!
RESUMO GERAL
O cupuaçu é um fruto popular de sabor exótico e agradável originário da região
amazônica brasileira. Da sua polpa podem ser preparados sucos, geleias, licores,
etc. Na composição da polpa e sementes estão presentes macro e micronutrientes
que lhes conferem alto valor nutricional, além da presença de compostos bioativos e
baixíssima concentração de cafeína e teobromina. A elevada quantidade de lipídeos
nas sementes representa excelente matéria-prima para a produção de cosméticos.
As sementes são fermentadas para obter produto similar ao chocolate, o cupulate,
sendo antes realizado o seu despolpamento, pois a quantidade excessiva de polpa
inviabiliza a fermentação. Por representar importante fonte de substratos que
contribuem para a formação de precursores de sabor durante a fermentação, foram
testadas três concentrações de polpa em relação à quantidade inicial aderida às
sementes: 0, 7,5 e 15%, e duas formas de revolvimento para cada experimento (fixo
– R1 e realizado de acordo com a temperatura – R2), totalizando 6 experimentos
assim codificados: 0R1, 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2. Foi constatado que
quanto maior a concentração de polpa, mais prolongado o tempo de fermentação e
mais altas as temperaturas registradas. Não houve diferença significativa entre os
dois tipos de revolvimentos aplicados. Maior concentração de ácidos orgânicos foi
observada nos experimentos com maior concentração de polpa (15R1 e 15R2),
especialmente o ácido acético. Na prova de corte para avaliação do grau de
fermentação, os experimentos 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2 apresentaram os
melhores resultados. As amêndoas foram processadas para obtenção dos cupulates
e estes submetidos às seguintes avaliações sensoriais: análise descritiva
quantitativa (ADQ) e Check-All-That-Apply (CATA), além do teste de aceitação. Na
ADQ os experimentos 15R1 e 15R2 apresentaram as maiores médias em quase
todos os atributos, embora não diferissem estatisticamente das outras amostras. No
CATA os atributos amargo, terra, café, firme ao morder e sabor residual ruim foram
os mais citados. No teste de aceitação as amostras 0R1 e 15R2 obtiveram os
melhores resultados, e por este motivo, foram submetidas à análise de compostos
voláteis através de GC-MS. Os resultados demonstraram que a amostra 15R2
contribuiu para a formação de importantes compostos de sabor, especialmente
linalol e acetofenona, além de apresentar maiores concentrações de pirazinas. Na
enumeração de micro-organismos durante a fermentação (métodos culturais), os
resultados demonstraram que houve desenvolvimento simultâneo de leveduras,
bactérias láticas e acéticas ao longo da fermentação, com declínio de acéticas nos
momentos finais. Em métodos não culturais (Metagenômica) através de
sequenciamento do DNA extraído nas amostras em plataforma Illumina MiSeq, para
identificação dos níveis taxonômicos de leveduras e bactérias envolvidos no
processo (métodos não culturais), os resultados demonstraram haver maior
diversidade bacteriana em 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2, e maior diversidade de
leveduras em 0R1 e 0R2, indicando influência negativa da polpa sobre as leveduras.
Nas análises de estimativa de diversidade e riqueza (Índice de Shannon e Chao1) o
domínio bactéria apresentou os maiores índices no ambiente de fermentação.
Palavras chave: cupuaçu, polpa de fruta, fermentação, compostos voláteis,
metagenômica
ABSTRACT
Cupuassu is a popular fruit with exotic and pleasant flavor originated from the
Brazilian Amazon region. Cupuassu’s pulp can be used to prepare juices, jellies,
liqueurs, etc. In the pulp and the seeds composition, macro and micronutrients give a
nutritional value, and bioactive compounds and very low concentration of caffeine
and theobromine. The seeds have a high amount of lipids, making them an excellent
raw material for cosmetics. The seeds can be fermented to produce a product similar
to chocolate, the cupulate, being depulping, as the excessive amount of pulp can
derail fermentation. As the pulp represents an important source of substrates that
contribute to the formation of flavor precursors during the fermentation, three
concentrations of pulp were tested relative to the initial amount adhered to seeds: 0,
7.5 and 15%, and two types of turning for each experiment (fixed - R1 and performed
according to the temperature - R2), totalizing 6 experiments: 0R1, 0R2, 7.5R1,
7.5R2, 15R1 and 15R2. It was found that the higher pulp concentrations resulted in
longer fermentation times and higher registered temperatures. There was no
significant difference between the two types of applied turnings. Higher
concentrations of organic acids were observed in the experiments with higher pulp
concentrations (15R1, and 15R2), especially acetic acid. In cut test for assessing the
degree of fermentation, the experiments 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2 showed
the best results. Beans were processed in order to obtain the cupulate and the final
products were submitted to sensory evaluation: Quantitative Descriptive Analysis
(QDA) and Check-All-That-Apply test (CATA), and the acceptance test. In the QDA,
15R1 and 15R2 samples obtained higher scores in almost all the attributes, although
they did not statistically differ from the other samples. In CATA, the attributes bitter,
earth, coffee, firm to the bite and bad aftertaste were the most cited ones. In the
acceptance test, the 15R2 and 0R1 samples achieved the best results, and for this
reason, their volatile compounds were analyzed by GC-MS. The results showed that
15R2 sample contributed to the formation of important flavor compounds, particularly
linalool and acetophenone, and have higher concentrations of pyrazines. In the
microorganisms counting during fermentation (culturable methods), the results
showed that there was a simultaneous growth of yeasts, lactic and acetic acid
bacteria throughout the fermentation with acetic acid bacteria declining in the final
moments. In non-culturable methods (Metagenomic) by sequencing of the DNA
extracted from the samples MiSeq Illumina platform, for identifying the taxonomic
levels of yeasts and bacteria involved in the process (non-culturable methods), the
results demonstrated a greater bacterial diversity in 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2,
and greater diversity of yeasts in 0R1 and 0R2, indicating negative influence of pulp
on the yeast growth. In diversity and richness estimation analysis (Shannon and
Chao1 Index), the bacteria domain had the highest rates in the fermentation room.
Keywords: cupuassu, fruit pulp, fermentation, volatile compounds, metagenomic
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................... 1
OBJETIVO GERAL............................................................................................ 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 4
CAPÍTULO 1 – CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL ..................................... 6
RESUMO ........................................................................................................... 6
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 7
2. CUPUAÇU .................................................................................................... 9
2.1 Aspectos botânicos...................................................................................... 9
2.2 Distribuição geográfica, aspectos de propagação, produção e doenças do cupuaçuzeiro ....................................................................................................
10
3. FRUTOS ....................................................................................................... 12
3.1 Composição física e química ...................................................................... 12
4. SEMENTE .................................................................................................... 18
4.1 Histologia ................................................................................................... 18
4.2 Fermentação .............................................................................................. 19
4.2.1 Aspectos físico-químicos ........................................................................ 19
4.2.2 Aspectos microbiológicos ....................................................................... 22
4.3 Secagem ................................................................................................... 25
5. PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO ......................................................... 26
5.1 Produtos de cupuaçu ................................................................................. 26
6. IMPORTÂNCIA NUTRICIONAL .................................................................. 28
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 29
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 30
CAPÍTULO 2 - EVOLUTION OF THE FERMENTATION OF CUPUASSU SEEDS (Theobroma grandiflorum Schum): PHYSICAL AND CHEMICAL CHARACTERIZATION ……………………………………………………………...
44
ABSTRACT ………………………………………………………………………….. 44
1. INTRODUCTION …………………………………………………………………. 44
2. MATERIAL AND METHODS ……………………………………………………. 47
2.1 Preliminary fermentation test ………………………………………………….. 47
2.2 Raw material …………………………………………………………………….. 47
2.3 Processing ………………………………………………………………………. 47
2.3.1 Fermentation ………………………………………………………………….. 47
2.3.2 Drying ………………………………………………………………………….. 48
2.4 Physical and Chemical Determinations ………………………………………. 48
2.4.1 Temperature and pH of the Fermenting Mass …………………………….. 48
2.4.2 Moisture and Water Activity (Aw) …………………………………………… 48
2.4.3 Titratable acidity and pH of seeds during fermentation and dried beans.. 49
2.4.4 Total Nitrogen ………………………………………………………………… 49
2.4.5 Total phenolic compounds …………………………………………………. 49
2.4.6 Organic acids …………………………………………………………………. 49
2.5 Cut test fermented and dried seeds …………………………………………... 50
2.6 Statistical analysis ………………………………………………………………. 51
3. RESULTS AND DISCUSSION …………………..……………………………... 51
3.1 Evolution of the fermentation ………………………………………………….. 51
3.1.1 Fermentation time/turning …………………………………………………… 51
3.1.2 Temperature and pH of the fermenting mass ……………………………... 51
3.2 Physical and chemical characterization of the seeds during fermentation .. 53
3.2.1 Moisture and water activity ………………………………………………….. 56
3.2.2 Titratable acidity (TA) and pH of crushed seeds …………………………. 56
3.2.3 Organic acids …………………………………………………………………. 57
3.2.4 Total nitrogen …………………………………………………………………. 57
3.2.5 Total phenolic compounds ………………………………………………….. 58
3.3 Characterization of dried beans ………………………………………………. 58
3.3.1 Cut test ………………………………………………………………………… 60
3.4 Correlations ……………………………………………………………………… 61
4. CONCLUSIONS ………………………………………………………………...... 64
5. REFERENCES …………………………………………………………............... 65
CAPÍTULO 3 - CUPUASSU CANDY BAR ....................................................... 72
ABSTRACT ...................................................................................................... 72
1. INTRODUCTION .......................................................................................... 73
2. MATERIAL AND METHODS ........................................................................ 75
2.1 Fermentation ............................................................................................... 75
2.2 Drying ......................................................................................................... 76
2.3 Processing .................................................................................................. 76
2.4 Sensory Analysis ........................................................................................ 77
2.4.1 Quantitative Descriptive Analysis (QDA)................................................... 77
2.4.2 Affective test............................................................................................. 79
2.4.3 Statistical Analysis ................................................................................... 80
3. RESULTS AND DISCUSSION .................................................................... 80
3.1. Quantitative Descriptive Analysis (QDA) ................................................... 80
3.1.1 Sensory profile of cupulates samples ...................................................... 80
3.2 Affective test ………………………………………………….......................... 85
3.3 CATA (Check All That Apply ...................................................................... 87
4. CONCLUSION ……………………………………………………………............ 92
5. REFERENCES………....................…………………………………………….. 93
CAPÍTULO 4 - PULP CONCENTRATION INFLUENCES ON THE FORMATION OF VOLATILE COMPOUNDS ON CUPUASSU SEEDS (Theobroma grandiflorum Schum) …………………………………………………
99
ABSTRACT ………………………………………………………………………….. 99
1. INTRODUCTION …………………………………………………………………. 100
2. MATERIAL AND METHODS ……………………………………………………. 103
2.1 Cupuassu Seeds Fermentation ………………….……………………………. 103
2.2 Drying …………………………………………………………………………….. 103
2.3 Obtaining processing for nibs and cupulates …….…………………………. 104
2.4 Analysis of volatile compounds …….………………………………………… 104
2.4.1 Sample preparation and fractioned steam distillation …………………… 104
2.4.2 Extraction and flavor analysis ………………………………………………. 105
2.5 Identification and quantification of volatile compounds …………………… 106
2.6 Principal component analysis of GC-MS peak areas ………………………. 107
3. RESULTS AND DISCUSSION …………………………………………………. 107
3.1 Identification of volatile compounds during fermentation ……………….…. 107
3.2 Major volatile compounds identified in dried beans, nibs and cupulates .. 113
3.2.1 Dried beans …………….…………………………………………………….. 116
3.2.2 Nibs ………………………………………………………………………….. 117
3.2.3 Cupulates …………………………………………………………………….. 118
4. CONCLUSIONS ………………………………………………………………….. 120
5. REFERENCES …………………………………………………………………… 121
CAPÍTULO 5 - PLANT AND METAGENOMIC DNA EXTRACTION OF MUCILAGINOUS SEEDS …………………………………………………………..
129
ABSTRACT ………………………………………………………………………….. 129
BACKGROUND INFORMATION ………………………………………………….. 131
METHOD DETAILS …………………………………………………………………. 132
Preparation of material ……………………………………………………………… 132
Maceration and fat removal ………………………………………………………… 132
DNA extraction ………………………………………………………………………. 132
Purification …………………………………………………………………………… 133
DNA yields, quality and PCR conditions ………………………………………….. 133
ADDITIONAL INFORMATION ……………………………………………………... 135
REFERENCES …………………………………………………………………….... 136
CAPÍTULO 6 - A POLPA INFLUENCIA NA DIVERSIDADE MICROBIANA EM FERMENTAÇÃO DE SEMENTES DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) ..............................................................................................................
139
RESUMO .......................................................................................................... 139
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 140
2. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 145
2.1 Fermentação das sementes de cupuaçu .................................................... 145
2.2 Coleta das amostras ................................................................................... 145
2.3 Análises microbiológicas ............................................................................. 145
2.4 Análise estatística ....................................................................................... 146
2.5 Sequenciamento (16S e ITS4) ................................................................... 147
2.5.1 Extração de DNA .................................................................................... 147
2.5.2 Sequenciamento ..................................................................................... 147
2.6 Análise das sequencias do DNA 16S ......................................................... 147
2.7 Análise das sequências do DNA ITS4 ........................................................ 147
2.8 Análise estatística de diversidade ............................................................. 148
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 148
3.1 Análises microbiológicas ............................................................................. 148
3.1.1 Leveduras ................................................................................................ 150
3.1.2 Bactérias acéticas (AAB) .......................................................................... 151
3.1.3 Bactérias láticas (LAB) ............................................................................. 152
3.1.4 Esporos de bactérias mesófilas aeróbias (EBM) e esporos de bactérias termófilas aeróbias (EBT) .................................................................................
154
3.2 Sequenciamento ......................................................................................... 156
3.2.1 Análise geral das sequencias do DNA 16S e ITS4 .................................. 156
3.3 Análise de rarefação para estimativa de riqueza das populações de bactérias ............................................................................................................
157
3.4 Composição do perfil taxonômico das comunidades de leveduras e bactérias identificadas .......................................................................................
163
4. CONCLUSÃO ................................................................................................ 176
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 177
DISCUSSÃO GERAL ........................................................................................ 187
CONCLUSÃO GERAL ...................................................................................... 209
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 210
1
INTRODUÇÃO GERAL
O cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) é uma das frutas nativas
mais populares da região amazônica, com grande aceitação pelo seu sabor e aroma
agradáveis. Além disso, é um fruto que apresenta alto rendimento, já que a polpa
pode ser utilizada para o preparo de diversos produtos, tais como doces, compotas,
geléias, bombons; a placenta no preparo de adubo; a casca como embalagem
artesanal; e as sementes para a produção de cupulate, produto similar ao chocolate
(Venturieri, 1993; Nazaré, Barbosa & Viegas, 1990; Gondim, Thomazini, Cavalcante
& Souza, 2001).
Apesar de o cupuaçu ser abundante na região amazônica, na maioria dos
casos ocorre perda dos frutos devido a diversos fatores, entre os quais, a ausência
de boas práticas agrícolas, que dificulta a obtenção de frutos sadios. O plantio
adensado e desordenado, além das formas inadequadas de controle de pragas,
coleta de frutos, condições de armazenamento e transporte, são outras questões
recorrentes. A inexistência de agroindústrias em quantidade suficiente para
beneficiamento agrava o problema de escoamento da produção na região (Souza,
2007).
Assim como ocorre com o cacau (Theobroma cacao L.), e dada a relativa
similaridade química e estrutural entre os frutos (Mattietto, 2001), é na etapa de
fermentação que ocorre principalmente a formação de compostos precursores de
sabor. O processo inicia no momento em que é feita a abertura dos frutos (Schwan
& Wheals, 2004). Sabe-se que o controle do processo natural de fermentação tanto
do cacau quanto do cupuaçu é complexo e é nesta etapa que o sabor desejável
começa a ser formado.
Apesar dos principais compostos envolvidos na fermentação de cacau já
terem sido identificados, os processos químicos e bioquímicos que levam ao sabor e
percepção da qualidade do chocolate ainda não estão bem esclarecidos (Afoakwa,
Paterson, Fowler, & Ryan, 2008). Quanto à fermentação do cupuaçu as informações
são ainda mais escassas.
Cabe destacar que, apesar de apresentar similaridades em relação ao
cacau, as sementes de cupuaçu possuem teor de polpa consideravelmente maior,
2
sendo inviável a fermentação sem um despolpamento prévio das sementes. Esta
prática pode levar a profundas alterações da diversidade microbiana envolvida, e a
formação dos compostos precursores de sabor. Em fermentação de cacau foi
demonstrado que um consórcio de micro-organismos está envolvido de forma um
tanto quanto sincronizada na fermentação e com funções essenciais no processo
(Schwan & Wheals, 2004; Camu et al., 2007; Ho, Zhao & Fleet, 2014).
Os métodos de cultivo usuais são limitados e não permitem conhecer
profundamente a comunidade microbiana em amostras ambientes. Cada vez mais
ferramentas moleculares são desenvolvidas e tem permitido avançar no
conhecimento dos microrganismos presentes em fermentação de cacau e sua
possível relação com o processo (Camu et al., 2007; Hamdouche et al., 2014;
Illeghems, Weckx, & De Vuyst, 2014). Na fermentação de cupuaçu, as pesquisas
para identificação de microrganismos foi feita por métodos convencionais de cultivo
(Oliveira, 2001). Em cacau, nos últimos anos tem se intensificado a utilização de
ferramentas moleculares para a identificação dos microrganismos. Os métodos,
como a metagênomica, por exemplo, permitem conhecer populações microbianas
em um dado ambiente e que não podem ser recuperadas pelos métodos de cultivo
usuais (Guazzaroni, Beloqui, Golyshin, & Ferrer, 2009; Simon & Daniel, 2011). Estes
métodos, também chamados de sequenciamento de nova geração, permitem obter
dados de sequenciamento em larga escala a partir de diversos ambientes, com
construição de bibliotecas de DNA (Simon & Daniel, 2011).
O uso das sementes de cupuaçu para produção de alimentos ainda é
incipiente, e a otimização das etapas de processamento permitiria a obtenção de
produto com melhor qualidade reduzindo o seu descarte. O cupuaçu é um fruto com
potencial, visto que alguns estudos demonstram uma aceitação satisfatória do
produto final (cupulate) em análises sensoriais (Nazaré et al., 1990; Cohen et al.,
2004; Lopes et al., 2008).
O cupuaçu é um fruto com aroma intenso, tendo sido identificados
diversos compostos voláteis na polpa (Quijano & Pino, 2007). Estudos apontam uma
composição química no cupuaçu diversa da de cacau (Mattietto, 2001; Kuskoski,
Asuero, Morales & Fett, 2006), que pode conferir ao produto final sabor diferenciado
e característico. Em cacau, alguns compostos voláteis migram da polpa para o
3
interior da semente durante a fermentação, reagindo quimicamente com as enzimas
presentes para formar importantes compostos de sabor (Kadow, Bohlmann, Phillips,
& Lieberei, 2013).
Assim, o aprofundamento dos estudos sobre a etapa de fermentação,
assim como a influência forma de revolvimento, para a obtenção de produtos de boa
qualidade sensorial é extremamente relevante para entender a dinâmica bioquímica
que ocorre no processo. Neste sentido, a identificação e função dos microrganismos
presentes na fermentação, bem como dos compostos orgânicos formados e outras
mudanças que ocorrem são uma contribuição para favorecer o aproveitamento desta
parte do fruto, que apresenta elevado valor nutricional e grande potencial para ser
usado como matéria-prima de um produto alimentício promissor.
4
OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência da polpa sobre os microrganismos na fermentação de
sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) e na formação do sabor,
em função de diferentes condições de fermentação utilizadas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar, através de ensaios físico-químicos, a influência de diferentes
teores de polpa e formas de revolvimento sobre os microrganismos
durante a fermentação;
Identificar, através de sequenciamento de larga escala, os
microrganismos presentes durante a fermentação;
Estimar a riqueza microbiana envolvida na fermentação de sementes de
cupuaçu e a influência da polpa sobre a mesma;
Caracterizar sensorialmente os cupulates e identificar os compostos
orgânicos voláteis nas amostras com melhor aceitação.
5
CAPÍTULO 1: CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL
Simone de Nazaré Melo Ramos, Aparecida das Graças Claret de Souza, Priscilla Efraim
_________________________________________________________________
Este capítulo será submetido à Trends in Food Science and Technology
6
CAPÍTULO 1
CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL
Simone de Nazaré Melo Ramosa, Aparecida das Graças Claret de Souzab, Priscilla
Efraima*
aDepartamento de Tecnologia de Alimentos, FEA, UNICAMP. Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade
Universitária Zeferino Vaz. Campinas-SP. Brasil. CEP 13.083-862
bEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA Amazônia Ocidental. Rodovia AM 010
Km 29. Manaus-AM. Brasil. CEP 69010-970.
*Autor correspondente: Tel.+55 19 3521-3998. E-mail: [email protected]
RESUMO
O cupuaçu é um fruto nativo da região amazônica, do mesmo gênero do cacau,
popular pelo sabor característico e agradável da polpa, principal parte de interesse
comercial, utilizada para o preparo de sucos, geleias, licores, doces, etc. A semente
e a polpa apresentam em sua composição macro e micronutrientes que lhes
conferem alto valor nutricional. Apesar disso, as sementes ainda são negligenciadas
como matéria-prima, sendo, na maioria das vezes, consideradas resíduos. Pelo
elevado teor de lipídiosque possuem, representam para a indústria de cosméticos,
excelente matéria-prima na elaboração de produtos de beleza que requerem
estabilidade e funcionalidade, sendo possível obter também, através da sua
fermentação, produto análogo ao chocolate, o cupulate. Após o processamento, as
amêndoas sofrem transformação conferindo ao cupulate características sensoriais
apreciáveis. Estudos realizados têm comprovado que os compostos químicos
identificados na polpa influenciam também no sabor final. Além disso, a baixíssima
concentração de cafeína e teobromina representa uma boa alternativa para pessoas
com intolerância às xantinas a presença de compostos bioativos. Neste trabalho,
são apresentadas evidências de que o cupuaçu é um fruto com alto potencial de
aproveitamento industrial, com promissoras chances de se tornar, assim como o
cacau, um fruto com ampla aceitação global.
Palavras-chave: cupuaçu, sementes, manteiga de cupuaçu, nutrientes, compostos
orgânicos, cupulate
7
1. INTRODUÇÃO
O cupuaçu é um fruto muito apreciado pelo sabor exótico, principalmente
da polpa, a parte mais utilizada para o preparo de sucos, doces, entre outros
produtos. A descoberta e aceitação do fruto pelo mercado externo tem se
expandido, sobretudo, pelas características sensoriais que apresenta (Venturieri,
2011).
O nome cupuaçu é derivado da língua Tupi, e significa kupu: similar ao
cacau e açu: grande (Santos, 2003). Também é conhecido por nomes vernaculares
como “copoasu, cupuaçuzeiro, cupuarana, cupu-assu, copoaçú, cupu do mato,
pupú, pupuaçú” e na língua inglesa como “Brazilian cocoa, copoasu, cupuassu,
large-flowered coca” (Lim, 2012). Devido ao forte valor social e econômico que
representa para o País, em 2008 foi sancionada uma lei designando o cupuaçu
como fruta nacional brasileira (Sousa, 2011). No Brasil, a espécie pré-colombiana de
cupuaçu provavelmente foi disseminada a partir da região pré-amazônica, no
Maranhão, para outros estados da região norte através da intensa migração dos
povos indígenas (Cuatrecasas, 1964; Alves, 2002).
Apesar de ser um fruto com grande potencial, o cupuaçu ainda é
negligenciado por diversos fatores, entre os quais culturais, regionais, econômicos e
sazonais. Embora as pesquisas sobre o aproveitamento de partes do fruto estejam
em ascensão, para a população da região produtora o fruto representa uma
oportunidade comercialmente atraente pela possibilidade de obtenção de vários
produtos. Na Figura 1 está uma representação esquemática de produtos que podem
ser obtidos a partir do fruto (Venturieri, 1993; Gondim et al., 2001).
8
Figura 1. Fluxograma dos produtos obtidos a partir do cupuaçu (Adaptado de Venturieri, 1993)
A sazonalidade do fruto e a escassez de empresas de beneficiamento e
estocagem são também fatores limitantes. Além disso, a produção do cupuaçu
ainda está muito voltada à agricultura familiar com dificuldade no escoamento da
produção na região amazônica levando à perda total da safra em alguns casos
(Scudeller & Santos-Silva, 2009). Segundo Xavier et al. (2009) citado por Jorge
(2011), a perda pós-colheita se situa entre 15 a 50% quando comparada à média
brasileira para frutos tropicais.
Apesar de a região amazônica ser a principal produtora de cupuaçu, o
destino da maior parte dos frutos ainda está restrito à própria região (Souza, 2007).
A oferta irregular de cupuaçu devido a uma série de fatores e a necessidade de
atender às exigências previstas na legislação sanitária de outros países tem sido
impedimento para que o fruto entre no mercado internacional (Alves, 2002).
9
2. CUPUAÇU
2.1 Aspectos botânicos
O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum), pertence à família
Malvaceae. É uma planta que pode atingir até 15 m de altura. Segundo Venturieri
(1993), os estudos mais completos da taxonomia do gênero Theobroma foram
realizados por Cuatrecasas (1964), que o dividiu em 22 espécies repartidas em seis
seções: Andropetalum, Glossopetalum, Oreanthes, Rhytidocarpus, Telmatocarpus e
Theobroma. Destas, apenas a Andropetalum não é encontrada no Brasil. Das vinte e
duas espécies existentes, apenas T. grandiflorum, o T. obovatum, T. subincanum, T.
speciosum, T. sylvestre, T. microcarpum, T. glaucum, T. canumanense, T. bicolor, e
T. cacao estão restritas à Bacia Amazônica.
A floração do cupuaçuzeiro ocorre durante o verão amazônico (julho-
setembro) (Souza, 2007). Segundo Prance & Silva (1975) citados por Alves (2002),
o pico de frutificação ocorre no 1º trimestre do ano e quando maduros, os frutos
caem espontaneamente (Cohen, Luccas, Sousa, & Jackix, 2003).
O cupuaçuzeiro desenvolve bem em temperaturas relativamente
elevadas, com média anual de 21,6C a 27,5 C, umidade relativa de 77% a 88% e
precipitações na faixa de 1900 mm a 3100 mm (Diniz, 1984).
O fruto tem formatos variáveis, oblongo, ovalado, elíptico, obovoide ou
redondo (Figura 2), diâmetro transversal de 9 cm a 15 cm, diâmetro longitudinal de
10 cm a 40 cm, peso variando de 200 g a 4000 g, com média de 1200 g, sendo
38% em média de polpa, 17% de sementes frescas, 2% de placenta e 43% de
casca. A espessura da casca (epicarpo e mesocarpo) varia de 0,6 cm a 1 cm de
espessura, as sementes em número de 15 a 50 são ovoides ou ovoide-elipsoides,
de 2,0 cm a 3,0 cm de comprimento, 2,0 cm a 2,5 cm de largura, 1,0 cm a 1,8 cm de
espessura e, peso de 4 g a 7 g. Nos frutos sem sementes o percentual de polpa é de
60% a 68%. Quando maduro, o fruto se desprende da planta, exalando cheiro
agradável e característico (Souza & Sousa, 2002)
10
Figura 2. Formatos do fruto de cupuaçu (Adaptado de SOUZA, 1996)
2.2 Distribuição geográfica, aspectos de propagação, produção e doenças do
cupuaçuzeiro
No Brasil o cupuaçu está amplamente distribuído pela Floresta
Amazônica Legal Brasileira, em outros países da América do Sul (Equador, Guiana,
Martinica, Costa Rica, São Tomé, Trinidad e Gana) e, de acordo com Venturieri
(1993), alguns indivíduos podem ser encontrados nos Estados do Rio de Janeiro e
Bahia.
A propagação do cupuaçu é feita de forma seminal ou por enxertia.
Entre os tratos culturais empregados para o cultivo de cupuaçuzeiro estão: a
adubação, controle de invasoras e poda fitossanitária para o controle da vassoura-
de-bruxa (Souza et al., 2012).
As sementes de cupuaçu são consideradas recalcitrantes, pois não
podem sofrer dessecação (redução da umidade) ou ser estocadas em baixas
temperaturas, tendendo a perder a viabilidade. Com um teor de umidade entre 49,8
e 51,7% permanecem 100% viáveis, enquanto que com 14,6% morrem (Cruz &
Cicero, 2008). Assim, as sementes tornam-se exigentes quanto às condições de
armazenamento para uso em futuras propagações.
Para o cupuaçu foi criado um banco de germoplasma, que consiste em
depósito da variabilidade genética, a partir de partes do vegetal (plantas, anteras,
pólen, sementes, etc.). A vantagem deste procedimento consiste em identificar
espécies que apresentam características desejáveis, tais como frutos com tamanhos
Oblongo Ovado Elíptico Obovado Redondo
11
maiores, menor quantidade de sementes por fruto e resistência à pragas (Alves,
2002).
Maior concentração na diversidade de espécies nativas foi encontrada
principalmente nas regiões sul e sudeste do Pará e noroeste do Maranhão, com
oportunidade de melhoramento do cupuaçu, pela disponibilidade de genes e
genótipos, e também como reserva biológica, tendo em vista a degradação das
espécies nativas em áreas que estão sendo degradadas para a formação de pastos
(Alves, 2002).
Souza (2007) também cita, segundo dados do Instituto de
Desenvolvimento da Amazônia (IDAM), ter havido de 1996 até 2006 uma baixa
produtividade de frutos por hectare, ocasionada por técnicas variáveis de produção
(algumas em locais de difícil acesso dificultando a logística de transporte),
deficiência de empresas de beneficiamento, assim como locais adequados para
estocagem a frio, e sazonalidade dos frutos. Além disso, o cupuaçu também é
considerado fruta de baixíssima fecundidade tendo sido demonstrado que em
plantas de sete anos a relação flor:fruto é de 2.500:4, sendo necessário o
desenvolvimento de técnicas de polinização para a produção de maior quantidade
de frutos (Venturieri & Ribeiro Filho, 1995). No entanto, a possibilidade de maior
produção pode ser conseguida quando o cultivo está próximo de áreas de floresta,
em função da influência positiva exercida pelo microclima (Reisdorff, Gasparotto, &
Lieberei, 2000).
O crescimento do cupuaçuzeiro também é favorecido em ambiente
parcialmente sombreado (Silva, Freitas, Siebeneichler, Mata, & Chagas, 2007). É
uma planta de fácil associação a outras espécies vegetais, especialmente em solo
arenoso, sendo observado aumento na produtividade quando consorciado ao cultivo
de outras plantas frutíferas (Bicalho & Hoefle, 2010; Falesi, Santana, Homma, &
Gomes, 2010).
No Estado do Amazonas, a produtividade de cupuaçu diminuiu nos
últimos anos, impactando na disponibilidade de frutos. Entre os motivos estão a falta
de boas práticas de manejo e a suscetibilidade a pragas e doenças, principalmente a
“vassoura de bruxa” (Brasil, 2014). Por essa razão, programas de melhoramento
genético vêm sendo desenvolvidos pela Empresa Brasileira de Pesquisa
12
Agropecuária-EMBRAPA visando desenvolver cultivares para aumentar não só a
produção de frutos por hectare, mas também a resistência das plantas ao ataque de
pragas, como a “vassoura de bruxa”. As cultivares de cupuaçu mais recentemente
desenvolvidas no programa de melhoramento da Embrapa são: Belém, Codajás,
Coari e Manacapuru; Carimbó, BRS 227; BRS 228; BRS 229; BRS 311 e BRS 312
(Souza et al. 2012; Brasil, 2014).
A vassoura de bruxa é causada por um fungo (Moniliophtora perniciosa)
que afeta a produção de cupuaçu e outras culturas, estando entre as mais
importantes pragas, pelo prejuízo econômico que causa, com ocorrência
generalizada na Amazônia. Pode levar a planta à morte quando não são aplicadas
medidas de contenção (Lima & Souza, 1998). O fungo acomete o tecido
meristemático nas plantas, atingindo também as flores e os frutos. Os frutos jovens
não se desenvolvem e nos adultos é observado um escurecimento da casca com
apodrecimento da polpa, na parte interna (Souza, 2007). Segundo Ferreira (1989),
citado por Gondim et al. (2001), além da Amazônia brasileira, a doença também é
detectada em plantações de cacau em países da América do Sul, entre os quais
Peru, Bolívia, Equador, Colômbia, Venezuela, Suriname, Guianas e Trinidad.
3. FRUTOS
3.1 Composição física e química
Em sementes de cupuaçu foi detectada a presença de uma purina, a
teacrina (ácido 1,3,7,9-tetrametilúrico) (Vasconcelos, Silva, Maia, & Gottlieb, 1975),
provável precursora da cafeína (Santos, 2003), também encontrada em Cammelia
assamica var. kucha, consumida na forma de chá, e apreciada pelo efeito anti-fadiga
que causa, através da restauração de neurotransmissores como a dopamina (Li et
al., 2015). Estudos indicam que a substância possui potente efeito sedativo e
hipnótico, bem diferente do observado em teobromina e cafeína sobre o sistema
nervoso central. Em associação com o fenobarbital, por exemplo, induz ao sono (Xu;
Kurihara; Zhao; Yao, 2007), tendo sido observadas também atividades anti-
inflamatória e analgésica (Wang et al., 2010). Estudos sobre os efeitos da teacrina
no organismo pelo consumo de cupuaçu ainda são desconhecidos.
Outras xantinas como a teobromina, teofilina e cafeína também são
encontradas em sementes de cupuaçu, porém em concentrações bastante inferiores
13
quando compradas às encontradas em sementes de cacau (Lo Coco, Lanuzza,
Micali, & Cappellano, 2007). No Quadro 1 são apresentadas as concentrações
encontradas das xantinas nas sementes dos frutos
Quadro 1. Concentração de xantinas encontradas em sementes e amêndoas de
cacau e cupuaçu
COMPOSTOS CACAU CUPUAÇU
Teobromina 33 mg.g-1
1.0 mg.g-1
Teofilina 0.20 mg.g-1
* 0.30 mg.g-1
*
Cafeína 5.60 mg.g-1
0.50 mg.g-1
*Amêndoas torradas
Na Tabela 1 são apresentadas características físico-químicas e
concentrações de macro e oligoelementos na polpa, semente, amêndoas secas e
torradas de cupuaçu.
14
Tabela 1. Características físico-químicas e concentrações de macro e oligoelementos na polpa, semente, amêndoas seca e torrada de cupuaçu
físico-química polpa semente amêndoa amêndoa torrada
Umidade (%) 89,2±0,3 [1] 6,92 [4] 6,07 [4]
pH 3,5±0,2 [1] 6,35±0,01 [2] 5,41±0,03 [2] 5,27±0,03 [2]
acidez total titulável 3,5±0,0 [1]* 7,70±0,50 [2]** 11,69±0,75 [2]** 11,74±0,75 [2]**
Proteína (%) 8,8±1 [5] 9,43±0,12 [2] 8,89±0,36 [2] 8,63±0,22 [2]
Lipídios (%) 12,7±2,2 [5] 64,85±0,61 [2] 53,60±1,04 [2] 53,73±0,30 [2]
Cinzas (%) 5,3±0,5 [5] 2,94±0,02 [2] 2,02±0,01 [2] 2,15±0,04 [2]
Fibras (%) 14,3±0,6 [5] 3,28±0,05 [2] 6,51±0,98 [2] 7,638±0,44 [2]
Açúcares (%) 49,0±4,0 [5] - - -
Glicose (% DM) 6,9±0,8 [5] - - -
Frutose (% DM) 8,8±0,5 [5] - - -
Sacarose (% DM) 34,6±1,7 [5] - - -
ácido ascórbico (mg/g) 96-111 [8] - - -
fenóis totais (mmol.L-1 ácido gálico) 0,4±0,0 [1] - - -
ativ. antirradical livre (µmol.L-1 de
Trolox) 0,6±0,2 [1] - - -
aa essenciais (mg/g)
treonina - 59,2±0,4 [3] 57,21±1,5 [3] 56,66±1,1 [3]
valina - 72,60±1,5 [3] 63,36±3,7 [3] 60,63±0,3 [3]
metionina - 4,59±1,1 [3] 4,26±1,1 [3] 2,49±0,6 [3]
cistina - 23,31±0,4 [3] 22,70±1,2 [3] 22,86±1,2 [3]
isoleucina - 45,8±0,3 [3] 41,61±0,4 [3] 42,24±0,8 [3]
leucina - 84,4±1,5 [3] 77,07±1,5 [3] 79,52±1,5 [3]
tirosina - 37,06±0,7 [3] 43,50±1,5 [3] 42,74±1,1 [3]
fenilalanina - 45,47±0,3 [3] 41,13±0,4 [3] 40,26±0,3 [3]
lisina - 53,11±1,5 [3] 45,39±4,7 [3] 43,74±0,3 [3]
histidina - 14,52±0,7 [3] 12,77±1,5 [3] 11,43±1,2 [3]
triptofano - 12,99±0,1 [3] 14,609±0,7 [3] 12,92±0,4 [3]
aa não essenciais (mg/g)
arginina - 56,55±1,5 [3] 56,74±3,7 [3] 52,685±0,4 [3]
ácido aspártico - 123,81±2,6 [3] 144,21±3,4 [3] 151,59±1,5 [3]
serina - 53,11±3,4 [3] 59,57±2,3 [3] 58,15±2,2 [3]
ácido glutâmico - 148,26±1,1 [3] 141,37±3,7 [3] 147,11±3,4 [3]
prolina - 44,33±2,2 [3] 52,01±1,5 [3] 51,19±8,9 [3]
glicina - 57,7±0,3 [3] 69,99±6,1 [3] 62,13±0,8 [3]
alanina - 47,76±0,3 [3] 45,86±2,2 [3] 47,22±0,8 [3]
amônia - 15,28±0,7 [3] 14,66±0,4 [3] 14,41±0,8 [3]
proteína total - 26,17±0,3 [3] 21,15±0,8 [3] 20,12±0,5 [3]
ácidos graxos (g/100g de ácidos graxos totais)
ácido mirístico 0,12±0,03 [5] - - -
ácido palmítico 55,22±0,62 [5] 7,54±0,08 [6] - -
Continua...
15
Continuação
ácido palmitoleico 0,56±0,15 [5] - - -
ácido esteárico 3,12±0,15 [5] 32,6±0,1 [6] - -
ácido oleico 18,8±2,44 [5] 41,31±0,06 [6] - -
ácido linoleico 3,08±0,63 [5] 4,9±0,1 [6] - -
ácido α-linolênico 17,98±2 [5] 0,20±0,01 [6] - -
ácido margárico - 0,19±0,01 [6] - -
ácido vacênico - 0,47±0,02 [6] - -
ácido eicosanóico - 10,51±0,04 [6] - -
ácido eicosenóico - 0,34±0,01 [6] - -
ácido docosanóico - 1,72±0,01 [6] - -
ácido tetracosanóico - 0,19±0,01 [6] - -
ácido graxo saturado 1,4004 [5] 52,81±0,07 [6] - -
ácido graxo monoinsaturado - 42,12±0,04 [6] - -
ácido graxo poliinsaturado - 5,07±0,11 [6] - -
ácido graxo mono e poliinsaturado 0,9782 [5] - - -
ω-6/ω-3 - 0,1713 - -
minerais e traços de elementos (µg/g amostra fresca)
Al 0,8±0,3 [7] 2,1±0,3 [7] - -
B 0,3±0,1 [7] 2,9±0,1 [7] - -
Ca 96±9 [7] 369±9 [7] - -
Cl 87±21 [7] 340±31 [7] - -
Cu 0,4±0,1 [7] 2,7±0,1 [7] - -
Fe 2,7±0,3 [7] 7,5±0,3 [7] - -
K 3439±46 [7] 2621±24 [7] - -
Mg 93±2 [7] 802±9 [7] - -
Mn 0,6±0,1 [7] 2,7±0,1 [7] - -
P 118±2 [7] 730±4 [7] - -
S 334±7 [7] 177±4 [7] - -
Si 3±1 [7] 4±1 [7] - -
Sr 0,7±0,1 [7] 1,6±0,1 [7] - -
Zn 2,2±0,1 [7] 7,3±0,1 [7] - -
[1] (Canuto, Xavier, Neves, & Benassi, 2010) [2] (Carvalho, García, & Wada, 2005) [3] ( Carvalho, Garcia, & Fárfan, 2008) [4] (Santos, 2000) [5] (Rogez et al., 2004) [6] (Pugliese, 2010) [7] (Naozuka, 2008) [8] (PUGLIESE et al, 2013) *expresso em mg de ácido cítrico/100g de polpa; ** expresso em meq NaOH/100g
FW: peso fresco SFA: ácido graxo saturado UFA: ácido graxo insaturado MUFA (PUFA): ácidos graxos mono e poliinsaturados
Tanto a polpa quanto as sementes de cupuaçu possuem alto conteúdo
protéico e lipídico, boa fonte de minerais (macro e oligo-elementos) destacando-a
como fruta de elevado valor nutricional. O açúcar prevalente é a sacarose (Tabela
1).
16
Os diferentes formatos do fruto (oblongo, ovado, elíptico, obovado e
redondo) não apresentam diferenças significativas nas características requeridas
para rendimento industrial com relação à utilização da polpa e sementes (Matos et
al., 2008). Foram constatadas médias percentuais muito próximas no peso dos
frutos (1.305 g), assim como concetração de polpa (37,4%), pH (3,11), umidade
(84,3 %), Brix 13,61o), e acidez titulável (3,02%) (Matos et al., 2008). Assim, a
utilização de frutos para fins industriais pode ser feita com base na seleção de
árvores com maior produção e maturação de frutos em diferentes períodos do ano.
O cupuaçu é uma fruta rica em vitamina C, apresentando concentração
entre 96 a 111 mg/100g na polpa fresca. Quando disponibilizada para
comercialização, a polpa apresenta drástica redução de vitamina C (9 a 13 mg/100g)
(Pugliese, Tomas-Barberan, Truchado, & Genovese, 2013).
Na polpa de cupuaçu foram detectados 21 compostos voláteis, sendo que
os mais predominantes nas amostras eram ésteres, representados principalmente
por butanoato de etila, hexanoato de etila e ácido hexadecanóico. Os dois primeiros
compostos contribuem para o aroma do cupuaçu (Franco; Shibamoto, 2000). A
concentração de compostos voláteis varia de acordo com o pH, sendo maior em
amostras com pH 3.3, próximo ao pH natural do fruto. No total foram identificados 24
ésteres, 13 terpenos, 8 álcoois, 4 carbonilas, 4 ácidos, 2 lactonas e 1 fenol (Tabela
2) (Quijano & Pino, 2007).
17
Tabela 2. Compostos voláteis detectados em polpa de cupuaçu (µg/kg).
COMPOSTOS pH 3,3 pH 7
Acetato de etila 250 102 2-propanol - 4 Etanol 77 29 Propanoato de etila 52 - Propanoato de 3-metilbutila 20 - Butanoato de etila 389 381 2-Metilbutanoato de etila 162 - Acetato de butila 440 7 Acetato de 3-metilbutila 43 - 1-butanol 129 13 1-penten-3-ol 24 - 2-metil-2-pentenal - 5 Mirceno 12 - 3-metilbutanol 3 2 Butanoato de butila - 14 Hexanoato de etila 1253 359 (E)-β-Ocimeno 37 28 Acetato de 3-metil-3-buten-1-il 62 3 Acetato de hexila 201 4 Terpinoleno 15 - 3-hidroxi-2-butanona 102 - 3-metil-2-buten-1-ol 278 - 2-metilpentanoato de etila 40 12 1-hexanol 30 7 3Z-Hexenol 18 6 Nonanal 19 - Hexanoato de butila 79 5 Octanoato de etila 52 10 Óxido de (Z)-linalol (furanóide) 27 0 Óxido de (E)-linalol (furanóide) 31 8 Ácido acético 47 0 (E,E)-2,4-Heptadienal 5 - Sorbato de etila 6 - 3-Hidroxibutanoato de metila 44 - Linalol 986 104 3-Hidroxibutanoato de etila 86 - Β-Cariofileno 23 5 Decanoato de etila 37 6 Ácido butanóico 117 29 Butanoato de propila 48 5 3-Hidroxihexanoato de etila 520 - α-Terpinol 440 89 Propanoato de linalil 111 51 Germacrene D 37 5 Nerol 12 0 Dodecanoato de etila 27 - Geraniol 42 - Ácido hexanóico 21 4 Acetato de 2-fenilpropila 37 2 γ-Octalactona 8 - Ácido octanóico 70 - Acetato de trans-Cinamil 32 21 Eugenol 35 15 δ-Decalactona 9 - Acetato de cedrila 29 6 Acetato de (E,E)-farnesil 10 -
- Não detectado
Fonte: Quijano & Pino (2007)
A complexidade de compostos voláteis presentes na polpa de cupuaçu
justifica o aroma e sabor intenso do fruto, caracterizado como exótico e muito
agradável. Alguns dos compostos identificados têm papel preponderante na
formação do sabor durante a fermentação, secagem e processamento das
18
amêndoas para a obtenção do cupulate. Estudos comprovam que compostos
voláteis presentes na polpa de cacau, por exemplo, migram para a semente durante
a fermentação (Kadow et al., 2013), presumindo-se que o mesmo ocorre com
cupuaçu.
Entre os compostos identificados na polpa de cupuaçu, estão o linalol
(3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol) composto com potencial impacto no aroma, presente
de forma abundante (Oliveira et al., 2004), sendo também encontrado em elevadas
concentrações em cacau fino, contribuindo com um aroma floral e tipo chá (Pino;
Roncal, 1992; Ziegleder, 1990 citados por Lima, 2012); o álcool amil 3-metil-1-
butanol, que quando esterificado, origina o metil-1-butanol acetato, composto com
notas de malte e chocolate (Rodriguez-Campos et al., 2011; Rodriguez-Campos et
al., 2012); a 3-hidroxibutanona (acetoína), composto com sabor de manteiga,
utilizado pela indústria em margarina e pode ser obtido de fermentações láticas
(Schrader, 2007); e o eugenol, com propriedades inibitórias sobre o crescimento de
microrganismos, atividade anti-oxidante. Seu uso combinado em atmosfera
modificada promove a conservação de alimentos prevenindo a perda de ácido
ascórbico, compostos fenólicos totais e antocianinas na casca de frutas (Valero et
al., 2006).
4. SEMENTE
4.1 Histologia
Modificações na estrutura das sementes de cacau e cupuaçu durante a
fermentação foram estudadas comparativamente e os resultados apontam
semelhanças entre os dois frutos com relação à presença e concentração de alguns
compostos químicos (Mattietto, 2001; Martini & Tavares, 2005), embora as sementes
de cupuaçu sejam maiores que as de cacau (Martini, 2004).
As sementes de cupuaçu são constituídas por três regiões: um tegumento
ou envoltório, cotilédones e eixo hipocótilo-radícula, situado na base da semente e
unido aos dois cotilédones. Pelo fato de estar aderida ao cotilédone, há dificuldade
na remoção da casca (tegumento), o que normalmente não ocorre com a amêndoa
de cacau, pela existência de espaço entre as duas estruturas (Santos, 2003).
O mesófilo cotiledonar possui células de reserva (lípide-proteica), feixes
vasculares e idioblastos (células) de polifenóis. Durante a fermentação, com a
19
entrada de água e outros compostos na semente, a parede celular é destruída e os
compostos fenólicos são liberados, entrando em contato com enzimas específicas
originando a coloração marrom nas amêndoas (Mattietto, 2001).
Comparando as sementes de cupuaçu com as de cacau, conclui-se que
as de cupuaçu são superiores em reserva de lipídios e possuem menor teor de
proteínas, polifenóis e carboidratos (Martini, 2004), embora a quantidade de amido
seja maior nas sementes de cupuaçu do que em cacau (Mattietto, 2001). Este último
representa uma importante reserva relacionada com a estrutura de parede (Martini,
2004; Santos, 2003), entremeando, juntamente com os lipídios, a proteínas de
reserva nos cotilédones (Santos, 2003).
As proteínas encontram-se na forma de granulações dispersas no
citoplasma (Santos, 2003). Durante a proteólise, os aminoácidos liberados
combinam-se com constituintes fenólicos formando as quinonas, reduzindo o
amargor e adstringência (Mattietto, 2001). Em sementes de cacau são armazenados
dois tipos de proteínas: globulina-7S (vicilina) e a albumina (Mattietto, 2001). Apenas
a primeira é responsável pela geração dos precursores de aroma. Em cupuaçu
também foram identificadas frações proteicas de globulina e albumina, sendo a
albumina a mais abundante (Carvalho et al., 2008).
A presença de mucilagem nos espaços intercotiledonares e dentro de
estruturas (sacos de mucilagem) no parênquima do tegumento externo também foi
observada no cupuaçu. A mucilagem é um polissacarídeo de caráter ácido e neutro,
provavelmente um mucopolissacarídeo (Santos, 2003).
4.2 Fermentação
4.2.1 Aspectos físico-químicos
As sementes de cupuaçu são submetidas à fermentação para obtenção
de cupulate (Nazaré et al., 1990), sendo previamente despolpadas, para
reaproveitamento da polpa pela indústria. Ainda assim, uma porção permanece
aderida à semente, servindo como substrato para início da fermentação (Cohen et
al., 2003). Assim como ocorre com o cacau, a fermentação das sementes é feita de
forma empírica com contaminação espontânea, desencadeando uma série de
reações bioquímicas, culminando na transformação dos substratos presentes em
20
outros compostos que podem ou não conferir características sensoriais desejáveis,
dependendo da forma como é feita a fermentação (Lagunez Gálvez et al., 2007).
As formas de fermentação de cacau e revolvimento aplicados para
promover a aeração da massa e homogeneização da temperatura, são variáveis em
várias partes do mundo. Pilhas de fermentação sobre folhas de bananeiras em
contato direto com o solo, balaios e cochos de madeira são alguns exemplos
(Beckett, 2009). Na fermentação de sementes de cupuaçu normalmente são usados
cochos de madeira (Cohen, Mattietto & Jackix, 2004; Cohen, Sousa & Jackix, 2009;
Pugliese, 2010; Jorge, 2011). O tempo de fermentação é variável, entre 5 e 7 dias
(Nazaré et al., 1990; Cohen & Jackix, 2005), sendo que o prolongamento representa
um risco para a qualidade do produto final pela obtenção de amêndoas com sabores
estranhos (off-flavors). Durante a fermentação a temperatura máxima pode alcançar
47oC, inferior à de cacau que no mesmo estudo registrou 49oC (Mattietto, 2001). A
quantidade de sementes de cupuaçu também parece influenciar. Quanto maior, mais
elevada a temperatura da massa (Nazaré et al., 1990; Cohen & Jackix, 2005;
Robayo, 2010). Enquanto na fermentação de cacau a temperatura elevada
permanece estável até o final, em cupuaçu foi observado declínio progressivo, com
registros finais na faixa dos 30oC (Nazaré et al., 1990; Mattietto, 2001; Cohen &
Jackix, 2005; Robayo, 2010).
A acidez elevada no início da fermentação de cupuaçu apresenta redução
até o final (Nazaré et al., 1990; Mattietto, 2001), sendo que nas primeiras 24h ocorre
súbita elevação, coincidindo com o aumento dos ácidos lático e acético nesse
período (Mattietto, 2001). Este evento pode estar relacionado com a intensa
atividade microbiana pela formação dos referidos ácidos, a partir do ácido cítrico e
açúcares, respectivamente, embora no mesmo estudo tenha sido observado que
entre o 3o e o 6o dia de fermentação haja elevação no teor de açúcares tanto
redutores quanto da sacarose (Mattietto, 2001).
O pH dos cotilédones de cupuaçu, incialmente em 6,3, apresenta redução
para 5,72 em virtude da entrada de compostos ácidos durante a fermentação. A
testa, em sentido contrário, apresenta elevação de 3,35 para 6,22, (Mattietto, 2001),
ocasionada provavelmente pela hidrólise proteica, no interior dos cotilédones, com
liberação dos compostos para o meio externo.
21
A umidade das sementes de cupuaçu tende a aumentar durante a
fermentação. O aumento é atribuído à elevação da temperatura da massa, causando
maior absorção e retenção de água pelas proteínas vacuolares (Mattietto, 2001), ou
mesmo superoxidação do ácido acético presente, culminando com a liberação de
CO2 e água (Schwan & Wheals, 2004).
As sementes de cupuaçu apresentam diversos aminoácidos essenciais e
não essenciais (Tabela 1). Observa-se aumento no teor de alguns aminoácidos
essenciais após a fermentação (ácido aspártico, serina, prolina, glicina) e após a
torração (ácido aspártico, ácido glutâmico e alanina) (Carvalho et al., 2008). Mattietto
(2001) observou que, com exceção da cistina, aminoácidos como a serina, ácido
glutâmico, prolina, alanina, valina, leucina, tirosina, treonina e fenilalanina
apresentam elevação, com destaque para as duas últimas. Dos aminoácidos
citados, apenas a alanina, tirosina, leucina e fenilalanina são hidrofóbicos.
Os aminoácidos hidrofóbicos (alanina, tirosina, valina, isoleucina, leucina
e fenilalanina), juntamente com os peptídios hidrofílicos e açúcares redutores são
importantes precursores de sabor. São transformados em compostos de sabor
através de reações não enzimáticas (reação de Maillard) durante a secagem e
torração das amêndoas (Rizzi & Bunke, 1998; Biehl & Ziegleder, 2003). Nos casos
em que a fermentação é mais prolongada, microrganismos aeróbicos promovem um
ataque aos aminoácidos e peptídeos liberados, caracterizando a sobre-fermentação
(Biehl & Ziegleder, 2003). O teor de fibras nas sementes de cupuaçu é superior ao
do cacau. Mas ao final da fermentação ocorre uma inversão ficando a concentração
de fibras em cupuaçu abaixo da de cacau (Mattietto, 2001).
A quantidade de polifenóis é maior em cacau do que em cupuaçu. Em
polpa de cupuaçu foram encontrados 20,5 mg.g-1 de polifenóis totais, não sendo
detectadas antocianinas, compostos fenólicos que conferem pigmentação violácea
(Kuskoski et al., 2006). Os polifenóis são estruturas metabólicas secundárias de
vegetais, que vão de simples compostos (ácidos fenólicos) até compostos
estruturalmente mais complexos, como os flavonoides. São substâncias que
conferem cor, sabor e adstringência em alimentos. Funcionam como substratos em
reações enzimáticas culminando com o escurecimento de alimentos (Cheynier,
2012). Além disso, alguns tipos de compostos fenólicos encontrados em cupuaçu
22
são considerados compostos bioativos pela atividade anti-oxidante (Yang et al.,
2003).
Nas sementes, a quantidade de polifenóis é superior a da polpa,
alcançando 42,7 mg.g-1 (Lim, 2012), porém três vezes inferior à de cacau (Pugliese,
2010), sendo que durante a fermentação, ocorre redução durante o processo de
109,7 mg/g para 57,46 mg/g, como resultado da oxidação enzimática, inclusive
durante a secagem das amêndoas (Mattietto, 2001). A perda de compostos fenólicos
em amostras desengorduradas também é expressivamente maior em extratos
metanólicos, ocasionada provavelmente durante o aquecimento em soxhlet
(Galeano & Paladines, 2012). Da mesma forma, também ocorre diminuição dos
compostos fenólicos, flavonóides, proantocianidinas oligoméricas e atividade anti-
oxidante em sementes de cupuaçu após a fermentação e secagem. A perda
aumenta durante o processamento para obtenção do cupulate (Pugliese, 2010).
Durante a fermentação há liberação de enzimas que atuam sobre os
substratos presentes. Algumas estão presentes naturalmente na polpa, nas
sementes ou podem ter origem nos microrganismos que participam do processo. Em
fermentação de sementes de cupuaçu, Garcia (2006) identificou a presença de
amilases, invertases, pectinesterases, poligalacturonases, peroxidases,
polifenoloxidases, proteases e lipases. Foi observado que a atividade dessas
enzimas começa a apresentar elevação a partir das 24 h de fermentação. À medida
que o processo avança, a atividade enzimática diminui até o final. Todas as
enzimas estudadas apresentam ótima atuação em uma faixa de pH entre 4,2 e 4,6.
Os compostos que são formados durante o processo, elevando o pH, interferem
negativamente na atividade enzimática. Porém, maior atividade é observada nos
momentos em que a temperatura da massa de fermentação está elevada, embora o
mesmo estudo não tenha encontrado correlação entre elevação da temperatura com
atividade enzimática, especialmente poligalacturonase, peroxidase, protease e a α e
β amilases (Garcia, 2006).
4.2.2 Aspectos microbiológicos
As classes de microrganismos envolvidos na fermentação de cacau já
foram estudadas através de várias técnicas moleculares (métodos não culturais),
além da metodologia convencional (métodos culturais) (De Vuyst et al., 2008;
23
Nielsen et al., 2008; Santos et al., 2011; Illeghems et al., 2012; Romero-Cortes,
2012; Meersman et al., 2013). Em todos eles foi identificada a predominância de
espécies de bactérias e leveduras com atuação específica sobre substratos dos
frutos para formação de precursores de sabor. A ação dos microrganismos na
fermentação é bastante interessante, pois acontece de forma relativamente
sincronizada e sequencial na qual os metabólitos gerados por uma população
servirão de substrato para outra, culminando na produção de compostos importantes
para a formação de sabor (Schwan & Wheals, 2004).
Estudos apontam que as leveduras parecem ser as responsáveis pelo
“start” do processo, com ação sobre os açúcares presentes na polpa, através da
quebra em compostos mais simples que depois são convertidos em álcoois. São
favorecidas pelas condições ambientais iniciais, predominantemente anaeróbicas
(Schwan & Wheals, 2004). Foi comprovado que a presença de leveduras é
essencial na fermentação, pois sua supressão leva a uma diminuição na
concentração de etanol, com maior formação de outros tipos de álcoois e menos
compostos pirazínicos em amêndoas torradas (Ho et al., 2014).
As leveduras prepararam o ambiente para a próxima etapa através da
liquefação da polpa, pela ação de enzimas específicas (pectinases) sobre a pectina.
O ambiente torna-se mais aerado para as bactérias acéticas, que a partir desse
momento passam a ter uma evolução mais rápida, convertendo o etanol em ácido
acético, já nas horas mais adiantadas da fermentação, caracterizando assim a fase
aeróbica (Schwan & Wheals, 2004; Schwan, 1998). A participação indireta dos
produtores ocorre através do revolvimento aplicado à massa de fermentação, com o
objetivo de aumentar a aeração e elevação da temperatura, que pode alcançar até
50oC, pela conversão do etanol em ácido acético, em uma reação bastante
energética, produzindo até 496 KJ/molécula de energia, levando à perda da
germinação da semente (Lagunes Gálvez et al., 2007).
Em fermentação de cupuaçu, através de método cultural, foram
identificados alguns gêneros de leveduras, tendo sido notada a presença de
Candida sp ao longo de todo o processo, sugerindo a existência de cepas
resistentes à elevação de temperatura que ocorre. Entres os outros
gêneros/espécies identificados estão Kloeckera lindneri, Brettanomyces,
24
Thrichosporum adeninovorans, Pichia fermentans, todos na fase intermediária da
fermentação (Oliveira, 2001).
A participação de bactérias láticas tem sido objeto de vários estudos.
Sabe-se que atuam sobre o ácido cítrico presente na polpa para a produção de
ácido lático, promovendo modificações no pH do ambiente (Schwan & Wheals,
2004). A ação das leveduras torna o ambiente favorável para as bactérias láticas
acidúricas, quando então parte da polpa já está liquefeita. Entre as bactérias láticas
identificadas nas primeiras horas de fermentação de cacau estão o Lactobacillus
fermentum, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides e Lactococcus
lactis (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011), sendo que os gêneros Leuconostoc
e Lactococcus também foram identificados nas primeiras 24 h de fermentação em
sementes de cupuaçu (Oliveira, 2001).
O ácido lático, produzido pelas bactérias láticas, é inconveniente para a
qualidade do produto final, por se tratar de um composto não volátil que confere
acidez indesejável (Schwan & Wheals, 2004). Porém, estudos indicam que as
bactérias láticas têm um importante papel na fermentação, especialmente de
produtos lácteos. Elas atuam sobre o aminoácido leucina, formando o 3-
metilbutanal, um potente composto de sabor, também presente nas amêndoas de
cacau (Ayad, Verheul, Engels, Wouters, & Smit, 2001; Beckett, 2009). Em
fermentação de cacau, também atuam na conversão de açúcares e ácido cítrico em
ácido lático, acético e manitol (Schwan, 1998; Camu et al., 2007; Mai, Ho & Tran,
2014).
A fase aeróbica da fermentação começa a se tornar evidente nas horas
mais adiantadas da fermentação, quando a polpa já está quase toda liquefeita, pela
conversão do etanol em ácido acético e elevação da temperatura sob a ação das
bactérias acéticas (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011). Embora através de
métodos culturais tenham sido identificadas bactérias acéticas em fermentação de
cacau, ferramentas moleculares (métodos não culturais) têm permitido identificar
gêneros e espécies, ainda não catalogados. Utilizando padrões já existentes
também é possível identificar os grupos mais prevalentes na amostra (De Vuyst et
al., 2008). Segundo estudos, a maior frequência de gêneros tais como Acetobacter
em relação ao Gluconobacter, por exemplo, pode estar relacionada à preferência e
25
disponibilidade no meio de substratos específicos, tais como etanol e açúcar,
respectivamente (Schwan & Wheals, 2004; De Vuyst et al., 2008).
Também foi detectada maior frequência da espécie Acetobacter tropicalis
(Pereira, Miguel, Ramos, & Schwan, 2012; Romero et al., n.d.). Em sementes de
cupuaçu, a presença de Acetobacter aceti foi identificada a partir de 96 h até o final
da fermentação (Oliveira, 2001). O metabolismo das bactérias acéticas sobre os
substratos formam importantes compostos precursores de sabor do chocolate,
sendo que na maioria dos estudos as espécies A. aceti e A. pasteurianus são as
mais isoladas em cacau (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011).
Os bacilos são outro grupo de bactérias que apresentam crescimento
significativo nos momentos finais da fermentação, quando a polpa já foi praticamente
liquefeita e o pH do ambiente está mais elevado. São bactérias aeróbias cuja
contribuição na fermentação ainda não está muito clara. Talvez participem no
aumento da permeabilidade da casca (Biehl & Ziegleder, 2003). Foi demonstrado
que em fermentação de cacau alguns tipos de bacilos produzem lipases (Ardhana &
Fleet, 2003), que agem sobre os triglicerídeos presentes liberando ácidos graxos e
glicerol (Afoakwa et al., 2015), formando compostos com sabor indesejável (ranço)
(Afoakwa et al., 2013).
4.3 Secagem
Na etapa de secagem o metabolismo no interior das amêndoas
continua a ocorrer após a fermentação. A qualidade do produto final vai depender do
tempo e forma de secagem aplicada às amêndoas, pois é nesta etapa que ocorre a
volatilização dos compostos indesejáveis, diminuição da umidade e oxidação dos
compostos fenólicos, responsáveis pela adstringência percebida no sabor. Durante a
secagem a taxa de oxidação dos compostos fenólicos aumenta à medida que
aumenta a difusão da umidade no interior das amêndoas, associada à elevação da
temperatura de secagem entre 40-60oC (Kyi et al., 2005; Wan Daud, Meor Talib, &
Kyi, 2007).
A secagem também tem por objetivo cessar o processo de
fermentação para evitar uma sobre-fermentação que culminaria com a formação de
amônia a partir da degradação dos compostos fenólicos, produzindo sabores
indesejáveis (Zahouli, Guehi, Fae, & Nemlin, 2010). Durante a secagem o ideal é
26
que as amêndoas alcancem de 7 a 8% umidade, considerada uma faixa segura na
prevenção do desenvolvimento de bolores. Abaixo, as amêndoas tornam-se
quebradiças (Biehl & Ziegleder, 2003).
De acordo com Mc Donald et al. (1981) citado por Zahouli et al. (2010),
é na etapa de secagem que ocorre também o escurecimento das amêndoas, além
da continuidade na formação do sabor e aumento do número de células danificadas
nas amêndoas, com diminuição do material citoplasmático (De Brito et al., 2001).
Produtores de cacau e cupuaçu utilizam diferentes técnicas de
secagem: de forma natural (secagem solar), artificial (secagem em estufa) ou uma
combinação das duas. A secagem natural é considerada mais vantajosa, por
produzir menor concentração de amônia e melhor qualidade química. Na secagem
artificial é usada uma combinação da velocidade do ar com aquecimento. Assim,
podem ser controlados o tempo e velocidade de secagem, tornando-a mais rápida
que a secagem natural (Zahouli et al., 2010). Entretanto, uma secagem muito rápida
implica em um produto com acidez elevada (Barel, 1997).
5. PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO
5.1 Produtos de cupuaçu
Por ser um fruto cujo principal aproveitamento é a polpa, as outras partes
do cupuaçu, tais como casca e sementes, não são valorizadas como matéria-prima.
Alternativas para aproveitamento da casca, por exemplo, têm sido consideradas. A
casca seca e triturada configura um excelente material bio-adsorvente para remoção
de corantes nas águas de efluentes provenientes da indústria têxtil (Cardoso et al.,
2011). São contaminantes que quando presentes na água impedem a entrada de
luz, fundamental para a fotossíntese da flora aquática. Apesar da existência de
carvão ativado, a casca do cupuaçu é uma boa alternativa, por ser matéria-prima
mais barata.
Segundo Kaminski (2006) citado por Jorge (2011) a casca, quando
submetida à combustão, não produz fumaça, mas um gás, que pode ser utilizado em
motores movidos a diesel, reduzindo em até 80% o consumo. Em localidades que
não dispõem de energia elétrica, representa uma importante fonte de biomassa. A
casca também é aproveitada na produção de adubo, devido a sua composição em
micronutrientes (potássio, ferro, manganês, etc.) e também na confecção de peças
27
de artesanato para embalagem de bombons (Scudeller & Santos-Silva, 2009; Jorge,
2011)
A polpa é largamente utilizada pela indústria para produção de suco,
néctares, licor, doces, geleias (Sousa et al., 2011), sendo assim, considerada
matéria-prima principal, levando ao descarte das sementes, consideradas
subprodutos. Por outro lado, a indústria de cosméticos tem mostrado interesse no
reaproveitamento das sementes por causa da sua composição em gordura
(manteoga). Por ser rica em ácidos graxos e proteínas, além de apresentar maciez
mais acentuada quando comparada com a gordura de cacau e diferente ponto de
fusão, é considerada ideal para a elaboração de produtos de uso dermatológico
(Gilabert-Escrivá, 2002). É possível, por exemplo, obter emulsões estáveis do tipo
O/A de manteiga de cupuaçu e cacau para uso dermatológico (Boock, 2007).
A semente de cupuaçu possui importantes compostos anti-oxidantes,
entre os quais a catequina, epicatequina, quercetina e kampferol. Além destes,
foram descobertos mais dois compostos: a teograndina I e teograndina II, com este
último composto demonstrando maior atividade anti-oxidante e citotoxicidade sobre
linhagens de células cancerígenas (HCT-116 e SW-480) de cólon humano (Yang et
al., 2003).
A produção de cupulate, produto similar ao chocolate, também pode ser
uma alternativa no reaproveitamento das sementes. A produção segue as mesmas
etapas da de chocolate, com algumas modificações, visto que a amêndoa de
cupuaçu é fisicamente diferente da de cacau, e em alguns casos necessitam ser
quebradas para promover uma temperatura de torração homogênea (Cohen et al.,
2003).
Foi observado que o cupuaçu pode oferecer algumas vantagens
tecnológicas na produção de chocolate, por exemplo. Durante a temperagem na
produção de chocolates utilizando na composição manteiga de cupuaçu, é possível
obter as formas mais estáveis de cristais (forma V ou β), confirmando a possibilidade
de seu uso como gordura alternativa (Quast, Luccas, Roth, & Kieckbusch, 2007).
Além disso, o tempo de cristalização é mais curto (Lannes, Medeiros, & Gioielli,
2003). Concentrações maiores de manteiga diminuem o estalo durante a mordida
(snap) e ponto de fusão devido à natureza macia da manteiga de cupuaçu, embora
tenha sido constatado que concentrações de 20% podem ser usadas sem prejuízo
28
às características sensoriais do produto (Quast, Luccas, & Kieckbusch, 2011). A
maciez da manteiga de cupuaçu está relacionada com a concentração de ácidos
graxos mono e poli-insaturados que apresenta (Tabela 1) (Cohen & Jackix, 2005;
Pugliese, 2010). Alguns autores suspeitam que a característica de maciez da
manteiga de cupuaçu seja devido à presença de triacilgliceróis do tipo SOO
(esteárico-oleico-oleico), OOO (oleico-oleico-oleico) e OOA (oleico-oleico-araquidico)
(Gilabert-Escrivá et al., 2002). Este último e o SOA (esteárico-oleico-araquídico) não
são observados em manteiga de cacau (Quast et al., 2011). Por possuir ponto de
fusão mais baixo que a manteiga de cacau, há sugestões de sua utilização em
recheios e produtos de chocolate para consumo em temperaturas mais frias (Lannes
et al., 2003).
Em análise sensorial comparativa entre chocolate e cupulate, os
resultados revelaram não haver diferença significativa para os atributos avaliados
(côr, odor, consistência e sabor), sendo verificada no final uma moderada
preferência ao consumo de cupulate em relação à de chocolate (Nazaré et al.,
1990). Em teste de aceitação de produtos formulados com líquor e gorduras de
cacau e cupuaçu, utilizando escala de 1 a 9, as médias para cupuaçu ficaram entre
7,5 e 8,2 embora a intenção de compra tenha sido baixa (4,2) (Cohen et al., 2009).
De qualquer forma, o perfil sensorial do cupulate atribue ao produto características
próprias, diferenciadas do chocolate. Os compostos químicos identificados na polpa
e reconhecidos como precursores de sabor podem conferir ao cupulate
características sensoriais que o caracterizam como produto mais suave e de sabor
exótico.
6. IMPORTANCIA NUTRICIONAL
Além da polpa, as sementes, amêndoas secas e torradas possuem
elevado valor nutricional. Segundo Lopes (2000) citado por Cohen et.al (2003),
apesar de a composição de proteína nas sementes de cupuaçu ser menor que a do
cacau, o valor biológico é maior (NPR de 3,0 contra 2,03). O teor de aminoácidos
essenciais, por exemplo, é bastante elevado e acima das recomendações para a
necessidade mínima de crianças e adultos (Tabela 1), com alguns aminoácidos,
como a isoleucina, leucina, treonina, triptofano e valina apresentado duas vezes a
concentração recomendada (Carvalho et al., 2008; Conti e Silva, Frota, & Arêas,
29
2012). O mesmo é observado para o teor de vitamina C presente na polpa fresca
(102 mg/100g DW) (Pugliese et al., 2013). É uma concentração bastante significativa
e acima também da recomendada pela FAO/OMS, entre 25 e 30 mg em 1000 kcal, a
partir de várias fontes alimentares (Vannucchi & Rocha, 2012).
As sementes de cupuaçu também apresentam em sua composição os
ácidos graxos linoileico e linolênico (Tabela 1). Ambos são precursores de
importantes ácidos graxos pollinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL): o ácido
eicosapentanoico – EPA e o ácido docosahexaenoico – DHA. A recomendação de
ingestão diária pela Sociedade Brasileira de Cardiologia é de até 10% de AGPI-CL
em calorias totais provenientes de pescado. Outras organizações internacionais
estimam a ingestão entre 200 e 500mg, todos com enfoque na prevenção de
doenças cardiovasculares (Kus & Mancini-Filho, 2010).
A legislação brasileira estipula concentração mínima para ingestão diária
de proteínas, vitaminas e minerais por grupos de indivíduos com o objetivo de
atendimento das necessidades para uma população sadia (BRASIL, 2005). Entre os
minerais recomendados estão o cálcio, ferro, magnésio, zinco, fósforo, cobre e
manganês, alguns minerais (magnésio, fósforo, zinco e manganês) com
concentração nas sementes de cupuaçu acima da recomendada, principalmente
para o magnésio (Tabela 1).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O cupuaçu é um fruto sazonal, sendo necessário, nesse caso, o
beneficiamento e estocagem da polpa por longos períodos para atender ao
mercado. Entretanto, há dificuldades de produção em larga escala do fruto na
região de origem, em virtude da ausência de boas práticas agrícolas, dificuldades na
logística de transporte e armazenamento, com perdas substanciais dos frutos. A sua
composição desde a casca até a semente o caracteriza como um fruto com elevado
potencial, não só nutricional, mas também de promoção à saúde pela presença de
compostos bioativos. A polpa já é relativamente aproveitada pela indústria e
comércio varejista, mas nas sementes a manteiga tem sido utilizada apenas como
matéria-prima para a indústria de cosméticos. A produção de cupulate ainda ocorre
de forma incipiente, embora apresente características sensoriais agradáveis,
diferentes do chocolate. O cupulate que poderá, alternativamente, ser utilizado por
30
apreciadores de chocolate, mas com restrições ao seu consumo por intolerância às
xantinas presentes, visto que no caso do cupuaçu as concentrações encontradas
são ínfimas, tratando-se, portanto, de um produto promissor.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM e
SECT (Secretaria de Ciência e Tecnologia do Amazonas), pela concessão da bolsa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
(Processo n° 485287/2011-0) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo – FAPESP (Processo 2012/00296-4) pelos recursos concedidos para o
desenvolvimento da pesquisa.
REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS
Afoakwa, E. O. (2011). Chocolate Science and Technology (1st ed.). Wiley-
Blackwell.
Afoakwa, E. O., Kongor, J. E., Budu, A. S., Mensah-brown, H., & Takrama, J. F.
(2015). Changes in Biochemical and Physico-chemical Qualities during Drying of
Pulp Preconditioned and Fermented Cocoa ( Theobroma cacao ) Beans. African
Journal of Food, Agriculture, Nutrition and Development, (1), 9651–9670.
Afoakwa, E. O., Paterson, A., Fowler, M., & Ryan, A. (2008). Flavor formation and
character in cocoa and chocolate: a critical review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 48(9), 840–857.
http://doi.org/10.1080/10408390701719272
Afoakwa, E. O., Quao, J., Takrama, J., Budu, A. S., & Saalia, F. K. (2013). Chemical
composition and physical quality characteristics of Ghanaian cocoa beans as
affected by pulp pre-conditioning and fermentation. Journal of Food Science and
Technology, 50(6), 1097–1105. http://doi.org/10.1007/s13197-011-0446-5
Alves, R. M. (2002). Caracterização genética de populações de cupuaçuzeiro,
Theobroma grandiflorum ( Willd . ex . Spreng .) Schum ., por marcadores
31
microssatélites e descritores botânico-agronômicos. 159 p (Doutorado em
Agronomia ) - Universidade de São Paulo, São Paulol.
Ardhana, M., & Fleet, G. (2003). The microbial ecology of cocoa bean fermentations
in Indonesia. International Journal of Food Microbiology, 86(1-2), 87–99.
http://doi.org/10.1016/S0168-1605(03)00081-3
Ayad, E., Verheul, A., Engels, W., Wouters, J., & Smit, G. (2001). Enhanced flavour
formation by combination of selected Lactococci from industrial and artisanal
origin with focus on completion of a metabolic pathway. Journal of Applied
Microbiology, 90(1), 59–67. http://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2001.01219.x
Barel, M. (1997). La Fermentation du Cacao : Le Moyen de L’apprecier Et de La
Maitriser. Revue Des Industries Alimentaires et Agricoles, 14, 211–214.
Beckett, S. T. (2009). Industrial Chocolate Manufacture and Use. (S. T. Beckett, Ed.)
(4th ed.). York, UK: Wiley-Blackwell.
Bicalho, A., & Hoefle, S. (2010). Economic development, social identity and
community empowerment in the central and Western Amazon. Geographical
Research, 48(3), 281–296. http://doi.org/10.1111/j.1745-5871.2009.00626.x
Biehl, B., & Ziegleder, G. (2003). COCOA Chemistry of processing. In Encyclopaedia
of Food Sciences and Nutrition (2nd ed., Vol. 3, pp. 1436–1448). Germany:
Elsevier Science.
Boock, K. (2007). Desenvolvimento e avaliação da estabilidade física de emulsões
tópicas contendo cristais líquidos e ativos hidratantes à base de manteiga de
cupuaçu (Theobroma grandiflorum) ou manteiga de cacau (Theobroma cacao).
112 p (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) Universidade de São Paulo,
Brazil.
BRASIL (2005). ANIVISA/MS. RDC No 269 de 22 de setembro de 2005. Dispõe
sobre a ingestão diária recomendada (IDR) de proteína, vitaminas e minerais.
Diário Oficial da União, Brasília, DF set 2005.
32
BRASIL (2014). Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).
Agricultores terão acesso a cupuaçuzeiro mais produtivo e resistente à
vassoura-de-bruxa. Agricultura familiar. Brasília. Disponível em: <
https://www.embrapa.br/busca-de-noticias/-/noticia/1759756/agricultores-terao-
acesso-a-cupuacuzeiro-mais-produtivo-e-resistente-a-vassoura-de-bruxa>
Camu, N., De Winter, T., Verbrugghe, K., Cleenwerck, I., Vandamme, P., Takrama,
J. S., … De Vuyst, L. (2007). Dynamics and biodiversity of populations of lactic
acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap
fermentation of cocoa beans in Ghana. Applied and Environmental Microbiology,
73(6), 1809–1824. http://doi.org/10.1128/AEM.02189-06
Canuto, G., Xavier, A., Neves, L., & Benassi, M. (2010). Caracterização físico-
química de polpas de frutos da Amazônia e sua correlação com a atividade anti-
radical livre. Revista Brasileira de Fruticultura, 32(4), 1196–1205.
http://doi.org/10.1590/S0100-29452010005000122
Cardoso, N., Lima, E., Pinto, I., Amavisca, C., Royer, B., Pinto, R., … Pereira, S.
(2011). Application of cupuassu shell as biosorbent for the removal of textile
dyes from aqueous solution. Journal of Environmental Management, 92(4),
1237–1247. http://doi.org/10.1016/j.jenvman.2010.12.010
Carvalho, A., García, N., & Wada, J. (2005). Caracterização físico-química e curvas
de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e torradas de
cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of Food
Technology, 8(2), 127–134.
Carvalho, A., Garcia, N., & Fárfan, J. (2008). Proteínas da semente de cupuaçu e
alterações devidas à fermentação e à torração. Ciência e Tecnologia de
Alimentos, 28(4), 986–993.
Cheynier, V. (2012). Phenolic compounds : from plants to foods. Phytochemistry
Reviews, 11, 153–177. http://doi.org/10.1007/s11101-012-9242-8
33
Cohen, K., & Jackix, M. (2005). Estudo do liquor de cupuaçu. Ciência e Tecnologia
de Alimentos, 25(1), 182–190. http://doi.org/10.1590/S0101-
20612005000100030
Cohen, K., Luccas, V., Sousa, M., & Jackix, M. (2003). Processamento tecnológico
das amêndoas de cacau e de cupuaçu. Embrapa. Belém, PA: Embrapa CPATU.
Cohen, K., Mattietto, R., & Jackix, M. (2004). Processo de torração das amêndoas e
nibs de cupuaçu (Theobroma grandiflorum) (No. 35). Belém, PA.
Cohen, K., Sousa, M., & Jackix, M. (2009). Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau (No. 267). Documentos. Planaltina, DF.
Conti e Silva, A., Frota, K., & Arêas, J. (2012). Funções plenamente reconhecidas de
nutrientes - Proteína. ILSI Brasil - International Life Sciences Institute Do Brasil,
20, 1–16.
Cruz, E., & Cicero, S. (2008). Sensitivity of seed to desiccation in cupuassu
(Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum. - sterculiaceae. Scientia
Agricola, 65(5), 557–560. http://doi.org/10.1590/S0103-90162008000500017
Cuatrecasas, J. (1964). Cacao and its allies: a taxonomic revision of the genus
Theobroma. United States Natural Herbarium, Washington, v. 35, n. 6, p. 375-
614. 1964.
De Brito, E., García, N., Gallão, M., Cortelazzo, A., Fevereiro, P., & Braga, M. (2001).
Structural and chemical changes in cocoa (Theobroma cacao L) during
fermentation, drying and roasting. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 81(2), 281–288. http://doi.org/10.1002/1097-
0010(20010115)81:2<281::AID-JSFA808>3.0.CO;2-B
De Vuyst, L., Camu, N., De Winter, T., Vandemeulebroecke, K., Van de Perre, V.,
Vancanneyt, M., … Cleenwerck, I. (2008). Validation of the (GTG)5-rep-PCR
fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid
bacteria, with a focus on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans.
34
International Journal of Food Microbiology, 125(1), 79–90.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.02.030
Diniz, T.; Bastos, T.: Rodrigues, I.; Muller, C.; Kato, A.; Silva, M. (1984). Condições
climáticas em áreas de ocorrência natural e de cultivo de guaraná, cupuaçu,
bacuri e castanha-do-Brasil. Belém, PA. EMBRAPA/CPATU. 4 p.. (Pesquisa em
Andamento, 133)
Falesi, L., Santana, A., Homma, A., & Gomes, S. (2010). Evolução e interação entre
a produção e o preço das frutas no Estado do Pará. Revista de Ciências
Agrárias, 1(53), 69–77. http://doi.org/10.4322/rca.2011.010
Franco, M.; Shibamoto, T. (2000). Volatile composition of some brazilian fruits:
umbu-caja (Spondias citherea), camu-camu (Myrciaria dubia), araçá-boi
(Eugenia stipitata) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum). Journal of Agricultural
and. Food Chemistry n.48, p. 1263-1265.
Galeano, P., & Paladines, M. (2012). Actividad antioxidante de extractos metanolicos
de granos de copoazú (Theobroma grandiflorum). Vitae, 19(1), 1–4.
Garcia, I. (2006). Enzimas produzidas durante os diferentes estágios de fermentação
das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willdenow ex Sprengel)
Schumann). 99 p (Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Federal do
Amazonas, Brazil.
Gilabert-Escrivá, M. (2002). Caracterização e seleção de gorduras do gênero
Theobroma para aplicação tecnológica. 178 p (Doutorado em Tecnologia de
Alimentos). Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brazil.
Gondim, T., Thomazini, M., Cavalcante, M., & Souza, J. (2001). Aspectos da
produção de cupuaçu. Embrapa Acre. Documentos. Rio Branco, AC.
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2014). Yeasts are essential for cocoa bean
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 174, 72–87.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.014
35
Illeghems, K., Vuyst, L. De, Papalexandratou, Z., & Weckx, S. (2012). Phylogenetic
Analysis of a Spontaneous Cocoa Bean Fermentation Metagenome Reveals
New Insights into Its Bacterial and Fungal Community Diversity. PLoS ONE,
7(5), e38040. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0038040
Jorge, L. (2011). Cultivo e Beneficiamento do cupuaçu. SENAI - Dossiê Técnico. 24
p. Manaus, AM.
Kadow, D., Bohlmann, J., Phillips, W., & Lieberei, R. (2013). Identification of main
fine or flavour components in two genotypes of the cocoa tree ( Theobroma
cacao L .). Journal of Applied Botany and Food Quality, 86, 90–98.
http://doi.org/10.5073/JABFQ.2013.086.013
Kus, M., & Mancini-Filho, J. (2010). Funções plenamente reconhecidas de nutrientes
- Ácidos Graxos : Eicosapentaenoico (EPA) e Docosahexaenoico (DHA). ILSI
Brasil - International Life Sciences Institute Do Brasil. Sâo Paulo, Brasil.
Kuskoski, E., Asuero, A., Morales, M., & Fett, R. (2006). Frutos tropicais silvestres e
polpas de frutas congeladas: atividade antioxidante, polifenóis e antocianinas.
Ciência Rural, 36(4), 1283–1287. http://doi.org/10.1590/S0103-
84782006000400037
Kyi, T., Daud, W., Mohamad, A., Samsudin, M., Kadhum, A., & Talib, M. (2005). The
kinetics of polyphenol degradation during the drying of Malaysian cocoa beans.
International Journal of Food Science and Technology, 40(3), 323–331.
http://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2005.00959.x
Lagunes Gálvez, S., Loiseau, G., Paredes, J. L., Barel, M., & Guiraud, J.-P. (2007).
Study on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the Dominican
Republic. International Journal of Food Microbiology, 114(1), 124–30.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.041
Lannes, S., Medeiros, M., & Gioielli, L. (2003). Physical interactions between
cupuassu and cocoa fats. Grasas Y Aceites, 54(3), 253–258.
36
Li, Y.-F., Chen, M., Wang, C., Li, X.-X., Ouyang, S.-H., He, C.-C., … He, R.-R.
(2015). Theacrine, a purine alkaloid derived from Camellia assamica var. kucha,
ameliorates impairments in learning and memory caused by restraint-induced
central fatigue. Journal of Functional Foods, 16(October), 472–483.
http://doi.org/10.1016/j.jff.2015.05.003
Lim, T. (2012). Theobroma grandiflorum. In Edible Medicinal and Non-Medicinal
Plants (Vol. 3, pp. 252–258). Springer Science+Business Media.
http://doi.org/10.1007/978-94-007-2534-8
Lima, L. (2012). Microbial ecology of the cocoa chain. 312 p (PhD Thesis).
Wageningen University, Netherlands.
Lima, M., & Souza, A. (1998). Diagnose das principais doenças do cupuaçuzeiro
(Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng .) Schum .) e seu controle.
Amazonas: Embrapa Amazônia Ocidental.
Lo Coco, F., Lanuzza, F., Micali, G., & Cappellano, G. (2007). Determination of
theobromine, theophylline, and caffeine in by-products of cupuacu and cacao
seeds by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatographic
Science, 45(5), 273–275.
Mai, Ho, & Tran. (2014). Fermentation of Cocoa with Addition of Lactic Acid Bacteria.
In International Science, Social Sciences, Engineering and Energy Conference
(pp. 1–8). Udon Thani, Thailand.
Martini, M. (2004). Caracterização das sementes de seis espécies de Theobroma em
relação ao Theobroma cacao L. 98 p (Doutorado em Alimentos e Nutrição).
Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brazil.
Martini, M., & Tavares, D. (2005). Reservas das sementes de sete espécies de
Theobroma : revisão Seed reserves from seven species of the genus
Theobroma : a review. Revista do Instituto Adolfo Lutz, 64(1), 10–19.
37
Matos, C. , Souza, C., Faria, J., Oliveira, S., Santos, L., & Sacramento, C. (2008).
Características Físicas e Físico-químicas de Cupuaçus de Diferentes Formatos.
Revista de Ciências Agráias, 50, 35–45.
Mattietto, R. (2001). Estudo comporativo das transformações estruturais e físico-
químicas durante o processo fermentativo de amêndoas de cacau (Theobroma
cacao) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum). 164 p (Mestrado em Tecnologia
de Alimentos). Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brazil.
Meersman, E., Steensels, J., Mathawan, M., Wittocx, P. J., Saels, V., Struyf, N., …
Verstrepen, K. J. (2013). Detailed analysis of the microbial population in
Malaysian spontaneous cocoa pulp fermentations reveals a core and variable
microbiota. PLoS ONE, 8(12). http://doi.org/10.1371/journal.pone.0081559
Naozuka, J. (2008). Especiação química elementar em castanha-do-Pará , coco e
cupuaçu. 145 p (Doutorado em Química). Universidade de São Paulo, Brazil.
Nazaré, R. de F. R., Barbosa, W. C., & Viêgas, R. M. F. (1990). Processamento das
sementes de cupuaçu para a obtenção de cupulate. Belém, PA: Embrapa
CPATU.
Nielsen, D., Snitkjaer, P., & Van den Berg, F. (2008). Investigating the fermentation
of cocoa by correlating Denaturing Gradient Gel Electrophoresis profiles and
Near Infrared spectra. International Journal of Food Microbiology, 125(2), 133–
140. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.040
Oliveira, C. (2001). Isolamento e identificação da microbiota nos diferentes estágios
de fermentação das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum).
150 p. (Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Federal do
Amazonas, Brasil.
Oliveira, A., Pereira, N., Marsaioli, A., & Augusto, F. (2004). Studies on the aroma of
cupuassu liquor by headspace solid-phase microextraction and gas
chromatography. Journal of Chromatography A, 1025(1), 115–124.
http://doi.org/10.1016/j.chroma.2003.08.061
38
Pereira, G., Miguel, M., Ramos, C., & Schwan, R. (2012). Microbiological and
physicochemical characterization of small-scale cocoa fermentations and
screening of yeast and bacterial strains to develop a defined starter culture.
Applied and Environmental Microbiology, 78(15), 5395–5405.
http://doi.org/10.1128/AEM.01144-12
Pugliese, A. G. (2010). Compostos fenólicos do cupuaçu ( Theobroma grandiflorum )
e do cupulate : Composição e possíveis benefícios.146 p (Mestrado em Ciência
de Alimentos). Universidade de São Paulo, Brasil.
Pugliese, A. G., Tomas-Barberan, F. A., Truchado, P., & Genovese, M. I. (2013).
Flavonoids, Proanthocyanidins, Vitamin C, and Antioxidant Activity of
Theobroma grandif lorum (Cupuassu) Pulp and Seeds. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 61.
Quast, L., Luccas, V., & Kieckbusch, T. (2011). Physical properties of pre-crystallized
mixtures of cocoa butter and cupuassu fat. Grasas Y Aceites, 62(1), 62–67.
http://doi.org/10.3989/gya.034010
Quast, L., Luccas, V., Roth, T., & Kieckbusch, T. (2007). Influência da Incorporação
de Gordura de Cupuaçu na Temperagem da Manteiga de Cacau. Brazilian
Journal of Food Technology, 10(2), 130–136.
Quijano, C., & Pino, J.. (2007). Volatile compounds of copoazú (Theobroma
grandiflorum Schumann) fruit. Food Chemistry, 104, 1123–1126.
http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.01.006
Reisdorff, C., Gasparotto, L., & Lieberei, R. (2000). Development and production of
Cupuaçu plants (Theobroma grandiflorum) on degraded areas: implications of
water relations. In German-Brazilian Workshop on Neotropical Ecosystems (pp.
661–669). Hamburg, Germany. Retrieved from http://www.biologie.uni-
hamburg.de/bzf/oknu/proceedingsneotropecosys/p0661_reisdorff.pdf
39
Rizzi, G., & Bunke, P. (1998). The use of roasting kinetics data to ch aracterize
natural and artificial chocola te aroma precursors. Food Flavors: Formation,
Analysis and Packaging Influences, 535–546.
Robayo, Z. (2010). Caracterización del proceso de fermentación del grano de
copoazú (Theobroma grandiflorum Willd. ex spreng). 47 p (Especialización em
Ciencia y Tecnologia de Alimentos). Universidad Nacional de Colombia, Bogotá,
Colombia.
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H., Contreras-Ramos, S., Orozco-Avila,
I., Jaramillo-Flores, E., & Lugo-Cervantes, E. (2012). Effect of fermentation time
and drying temperature on volatile compounds in cocoa. Food Chemistry,
132(1), 277–288. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.10.078
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H., Orozco-Avila, I., Lugo-Cervantes, E.,
& Jaramillo-Flores, M. (2011). Dynamics of volatile and non-volatile compounds
in cocoa (Theobroma cacao L.) during fermentation and drying processes using
principal components analysis. Food Research International, 44(1), 250–258.
http://doi.org/10.1016/j.foodres.2010.10.028
Rogez, H., Buxant, R., Mignolet, E., Souza, J. N. S., Silva, E. M., & Larondelle, Y.
(2004). Chemical and composition of the pulp of three typical Amazonian fruits:
araça-boi (Eugenia stipitata), bacuri (Platonia insignis) and cupuaçu (Theobroma
grandiflorum). Eur Food Res Technol, 218, 380–384.
http://doi.org/10.1007/s00217-003-0853-6
Romero-Cortes, T, (2012). Isolation and characterization of acetic acid bacteria in
cocoa fermentation. African Journal of Microbiology Research, 6(2), 339–347.
http://doi.org/10.5897/AJMR11.986
Romero, C., Cuervo, P., Ortíz, Y., Torres, M., Rodriguez, J., & Robles, O. (n.d.).
Influence of acetic acid bacteria on the acidity of the coca beans during
fermentation. Disponível em:
http://www.uaeh.edu.mx/investigacion/productos/6226/extenso_final__teresa_.p
df Acesso em 05 de Junho de 2015.
40
Santos, A. (2000). Estudo químico e nutricional de amêndoas de cacau (Theobroma
cacao L.) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) em função do
processamento. 130 p (Mestrado em Tecnologia de Alimentos). Universidade
Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil, Campinas, SP.
Santos, S. (2003). Estrutura E Histoquímica De Sementes Do Gênero Theobroma L.
(Sterculiaceae).122 p (Mestrado em Recursos Genéticos Vegetais).
Universidade Federal de Santa Catarina, Brazil.
Santos, T., Santana, L, Santos, A., Silva, G., Romano, C., Dias, J., & Rezende, R.
(2011). Lactic acid bacteria dynamics during spontaneous fermentation of cocoa
beans verified by culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis.
Genetics and Molecular Research: GMR, 10(4), 2702–2709.
http://doi.org/10.4238/2011.November.4.3
Schrader, J. (2007). Microbial flavour production. In Flavours and Fragrances:
Chemistry, Bioprocessing and Sustainability (pp. 507–574). Frankfurt:
DECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institute. http://doi.org/10.1007/978-3-540-
49339-6_23
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail
inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–1483.
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4),
205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
Scudeller, V., & Santos-Silva, E. N. (2009). Beneficiamento local e cooperativo da
polpa de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.) em uma comunidade da
RDS-Tupé, Manaus-AM. In Biotupe: meio físico, diversidade biológica e
sociocultural do Baixo Rio Negro (Vol. 2, pp. 173–183). Manaus, AM: UEA
Edições. Disponível em: <http://biotupe.org/livro/vol2/pdf/Capitulo 14 -
Cupuacu.pdf> Acesso em 30 de agosto 2015.
41
Silva, R., Freitas, G., Siebeneichler, S., Mata, J., & Chagas, J. R. (2007).
Desenvolvimento inicial de plântulas de Theobroma grandiflorum ( Willd . ex
Spreng .) Schum . sob influência de sombreamento . Acta Amazonica, 37(3),
365–370.
Souza, A. (2007). Boas Práticas Agrícolas da Cultura do Cupuaçuzeiro. Manaus:
Embrapa Amazônia Ocidental. 56p
Souza, A.; Sousa, N.(2002). Cupuaçuzeiro In: Bruckner, C.H. (Ed.) Melhoramento de
fruteiras tropicais. Viçosa: Editora UFV, 2002, p.251-266.
Souza, A. (1996). Recursos genéticos e melhoramento do cupuaçuzeiro (Theobroma
grandiflorum (Willd. ex Spreng.) Schum.). In: Workshop sobre as culturas de
cupuaçu e pupunha, 1. Anais. Manaus: Embrapa-CPAA. p.110-126. (Embrapa-
CPAA. Documentos, 6).
Souza, A., Souza, M., Pamplona, A., & Wolff, A. (2011). Boas práticas na colheita e
pós-colheita do cupuaçu. Embrapa Amazônia Ocidental. Manaus, AM.
Disponível em: <http://www.bibliotecaflorestal.ufv.br/handle/123456789/7257>
Acesso em: 30 de agosto de 2015.
Souza, A.; Sousa, N.; Lopes, R.; Atroch, A.,;Barcelos Cordeiro, E.; Oliveir, M.; Alves,
R.; Farias Neto, J.; Noda, H; Silva Filho, D.; Yuyama, K.; Almeida, C.; Lopes,
M.; Ohashi, S. (2012). Contribution of the institutions in the Northern region of
Brazil to the development of plant cultivars and their impact on agriculture. Crop
Breeding and Applied Biotechnology S2: 47-56, 2012
Valero, D., Valverde, J., Martínez-Romero, D., Guillén, F., Castillo, S., & Serrano, M.
(2006). The combination of modified atmosphere packaging with eugenol or
thymol to maintain quality, safety and functional properties of table grapes.
Postharvest Biology and Technology, 41(3), 317–327.
http://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2006.04.011
42
Vannucchi, H., & Rocha, M. (2012). Funções plnamente reconhecidas de nutrientes -
Ácido ascórbico ( Vitamina C ). ILSI Brasil - International Life Sciences Institute
Do Brasil. São Paulo, Brazil: ILSI Brasil.
Vasconcelos, M., Silva, M. Maia, J., & Gottlieb, O. (1975). Estudo químico das
sementes de cupuaçu. Acta Amazonica, 5(3), 293–295.
Venturieri, G. A. (1993). Cupuaçu: a espécie, sua cultura, usos e processamento.
Belém, PA: Clube do Cupu.60 p.
Venturieri, G. A. (2011). Flowering levels, harvest season and yields of cupuassu
(Theobroma grandiflorum). Acta Amazonica, 41(1), 143–152.
http://doi.org/10.1590/S0044-59672011000100017
Venturieri, G.A; Ribeiro Filho, A. A polinização manual do cupuaçuzeiro (Theobroma
grandiflorum). Acta Amazônica. 25(3/4), p.181-192, 195
Wan Daud, W. R., Meor Talib, M. Z., & Kyi, T. M. (2007). Drying with Chemical
Reaction in Cocoa Beans. Drying Technology, 25(5), 867–875.
http://doi.org/10.1080/07373930701370241
Wang, Y.; Yang, X.; Zheng, X.; Li, J.; Ye, C.; Song, X. (2010). Theacrine, a purine
alkaloid with anti-inflammatory and analgesic activities. Fitoterapia. sep,
18(6):627-31. http://doi.org/10.1016/j.fitote.2010.03.008
Yang, H., Protiva, P., Cui, B., Ma, C., Baggett, S., Hequet, V., … Kennelly, E. J.
(2003). New bioactive polyphenols from Theobroma grandiflorum (Cupuaçu).
Journal of Natural Products, 66, 1501–1504. http://doi.org/10.1021/np034002j
Xu, J.K.; Kurihara, H.; Zhao, L.; Yao, X.S. (2007). Theacrine, a special purine
alkaloid with sedative and hypnotic properties from Cammelia assamica var.
Kucha in mice. Journal Asian Natural Products Res. sep-dec, 9(6-8): 665-72
Zahouli, G., Guehi, S., Fae, A., & Nemlin, J. (2010). Effect of Drying Methods on the
Chemical Quality Traits of Cocoa Raw Material. Advance Journal of Food
Science and Technology, 2(4), 184–190.
43
CAPÍTULO 2
EVOLUTION OF THE FERMENTATION OF CUPUASSU SEEDS (Theobroma
grandiflorum Schum): PHYSICAL AND CHEMICAL CHARACTERIZATION
Simone de Nazaré Melo Ramos, Kazumi Kawasaki Ramos, Tiago Zacarias de Aleluia, Renata Maria dos Santos Celeghini, Priscilla Efraim
______________________________________________________________
Este capítulo será submetido à Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos
44
CAPÍTULO 2
EVOLUTION OF THE FERMENTATION OF CUPUASSU SEEDS (Theobroma
grandiflorum SCHUM): PHYSICAL AND CHEMICAL CHARACTERIZATION
Simone de Nazaré Melo Ramosa, Kazumi Kawasaki Ramos a, Tiago Zacarias de Aleluiaa, Renata Maria dos Santos Celeghinia, Priscilla Efraima*
aUniversity of Campinas, School of Food Engineering, Department of Food Technology, Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade Universitária Zeferino Vaz. Campinas/São Paulo. Brazil. CEP 13.083-862
* Corresponding author: Tel.+55 19 3521-3998. E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Cupuassu (Theobroma grandiflorum Schum) is a native fruit from the Amazon region.
Through the fermentation of depulped cupuassu seeds, is possible obtaining the
cupulate, a product similar to chocolate. Given the importance of the stage of
fermentation for the formation of flavor compounds, we assessed the influence of the
fermentation conditions of cupuassu seeds without pulp and partially depulped (7.5
and 15%) and two turning types (fixed, R1, and according to temperature, R2) on the
physical and chemical characteristics. Results showed that the experiments with
higher content of pulp (7.5 and 15%) had longer fermentation and increased
temperature. Turning type did not cause significant variations in the physical and
chemical characteristics. The experiments with 15% of pulp presented the best
results regarding the degree of fermentation, which shows that it is possible to
develop the process with a partial amount of pulp.
Key words: cupuassu, pulp, fermentation, seeds, turning, physical and chemical
1. INTRODUCTION
Cupuassu (Theobroma grandiflorum Schum) is one of the most popular
native fruits of the Amazon region with wide acceptance because of its pleasant
flavor and aroma. Through the fermentation of the seeds can be obtained the
cupulate, a product similar to chocolate (Gondim, Thomazini, Cavalcante, & Souza,
2001; Said, 2011). The fermentation of cupuassu is similar to that of cocoa
(Theobroma cacao L.) (Lopes, Garcia, & Vasconcelos, 2003), which also is done
under the action of a microorganisms consortium (yeasts, lactic acid bacteria and
45
acetic acid bacteria) that triggers a series of biochemical reactions on the
compounds, including sugars, organic acids and pectin (Schwan & Wheals, 2004).
The products resulting from the metabolism of those reactions affect the medium,
thus causing changes in abiotic factors (pH, temperature and moisture) (Schwan,
1998).
In some countries, the process of depulping cocoa seeds is done because
the high acidity conferred by the organic acids present in the pulp (Schwan &
Wheals, 2004), which is also rich in other substrates. Depending on the pre-
fermentation and fermentation conditions, the pulp influences the production of flavor
precursors (Afoakwa et al., 2014). In cupuassu, it represents up to 43% of the fruit
(Gondim et al., 2001). The pulp is removed in addition to its greater commercial
value, even though partial depulping (in which 5% of the initial pulp content is kept)
provides substrates to the microorganisms in the fermentation (Matos et al., 2008).
From studies performed with cocoa, it is known that yeasts are predominant
in the first hours of the fermentation, and they act on the sugars present by
transforming them into ethanol, in an exothermic reaction, which causes a moderate
increase in the temperature of the mass (Lagunez Gálvez et al., 2007; Beckett,
2009). During the process, the lactic acid bacteria (LAB) act on the citric acid present
in the pulp, thus causing changes in the pH of the medium from the production of
lactic acid (Afoakwa et al., 2008). As the pulp is liquefied and drained, there is an
increased oxygenation of the medium from the air incorporation, favoring the acetic
acid bacteria (AAB) that use ethanol in an oxidative reaction, which is even more
energetic, for the production of acetic acid, thus increasing the temperature of the
medium, which can reach 50oC (Lagunez Gálvez et al., 2007; Beckett, 2009)..
Relating what has already been described for cocoa, the reactions that
occur during fermentation also cause modification in the structure of the cupuassu
seeds, making them more permeable, allowing the entry of ethanol and others
compounds, which, associated with the increase in the temperature of the medium,
cause the death of the seed (Beckett, 2009). The interior of the seed normally has
low acidity, but the pH tends to decrease with the entry of organic acids (Lopes et al.,
2003). The enzymes present within the seeds are exposed, interacting with the
substrates released (proteins, polyphenols) and, through enzymatic oxidation, they
46
cause darkening of the seed and reduced astringency (Biehl & Ziegleder, 2003;
Beckett, 2009). The whole seed, when cut lengthwise, has a smooth surface.
However, during fermentation, with the entry of chemical compounds, the seed
suffers partitioning and darkening, which will serve as a parameter for the
assessment of the degree of fermentation by the cut test. The higher the degree of
partitioning and the darker the seed, the better the degree of fermentation (Queroz &
Garcia, 1999; Lopes et al., 2003; Carvalho et al., 2005).
After fermentation, the seeds are subjected to the drying process that can
be natural or artificial. The goal is eliminating volatile organic acids, which confer
acidity to the final product, thus compromising the quality (Holm, Astong, & Douglas,
1993). Drying also facilitates the removal of the moisture present in the seed, which
reaches values between 6 and 8%, reducing the water activity and preventing the
development of molds. Molds are considered critical, as some species are producers
of potentially carcinogenic mycotoxins and cannot be eliminated during processing
(Copetti, Iamanaka, Pitt, & Taniwaki, 2014). In addition, flavor precursors are also
developed during drying, since metabolization still happens, even after fermentation
(Biehl & Ziegleder, 2003; Afoakwa et al., 2008)..
Pulp provides substrates for microorganisms in the fermentation, and the
turning applied to the mass offers oxygen and standardizes the temperature of the
environment, causing changes in the evolution of the fermentation (Schwan &
Wheals, 2004). Different forms to turn cocoa seeds are applied in different countries.
Similar techniques have been adopted in the fermentation of cupuassu seeds,
although there is not yet a standard procedure for cocoa and cupuassu (Schwan &
Wheals, 2004; Cohen & Jackix, 2005; Leal et al., 2008; Cohen et al., 2009; Di Mattia
et al., 2013; Nielsen et al., 2013).
As we have already mentioned, the cupuassu fermentation practices
consist in the use of seeds without pulp, which could raise the question about the
suppression of important substrates for flavor development, compromising the quality
of the final product. Thus, the objective of this work was to assess the feasibility of
using seeds with different concentrations of pulp and two turning types during
fermentation, to understand the physical and chemical changes that occur throughout
the process and their influence in the seeds for the production of cupulate.
47
2. MATERIAL AND METHODS
2.1 Preliminary fermentation test
In order to establish the concentrations of pulp that would be studied,
preliminary fermentation tests were conducted for the cupuassu seeds with 0, 20, 30,
40 and 100% of pulp in 4 Kg batches. In the experiment with 100% of pulp, there was
no significant increase in temperature, which remained until the end of day 5 at 30.6°
C, without pulp liquefaction or formation of typical compounds. The experiment with
20% of pulp was the one that presented greater temperature increase (38.3oC), thus
demonstrating that this level would be already high, even after five days of
fermentation. Thus, we set 15% as the maximum concentration of pulp, in addition to
the concentrations of 0 and 7.5 for the fermentations.
2.2 Raw material
We used seeds with pulp extracted from approximately 1 t of ripe and
healthy fruits, collected in a single day or up to three days after being dropped at the
PERI farm, in the city of Presidente Figueiredo, Amazonas state, Brazil.
The fruits were opened with a cleaver and the seeds had their pulp
removed with a pulper (HEER, Brazil), in 10 Kg batches so that we could obtain seed
samples with 0, 7.5 and 15% of pulp, according to the conditions shown in Table 1.
Table 1. Obtained pulping time and average weight of seeds with pulp.
Initial weight (seed with
pulp) (Kg)
Depulping time (min)
Average weight of pulp obtained (10 batches of 10 Kg)
(Kg)
Average weight of seeds obtained (10 batches of 10 Kg)
(Kg)
Final concentration of pulp in the
seeds (%)
10 4 7.09 2.91 0
10 2 6.65 3.35 7.5
10 1 6.07 3.93 15
2.3 Processing
2.3.1 Fermentation
Fermentation was carried out in 8 Kg batches of seeds, in triplicate, in 28
L styrofoam boxes, with holes in the bottom and bottom sides for the flow of the
liquefied pulp. We mixed chopped banana leaves into the mass, which worked as
48
natural inoculum. The boxes were covered with banana leaves, and during
fermentation, every 24 h, we collected from each experiment, ± 150 g of samples for
physical and chemical analysis, and they were kept at -20oC up to beginning of
analysis. For each experiment, we adopted two turning types: fixed (R1) applied after
48 h from the beginning of the fermentation and later with a 24 h frequency; and
according to the temperature (R2), applied with a first turning when the first drop in
temperature was detected. Subsequently, the turning was performed whenever there
was a sudden drop in the temperature of the mass. The six experiments received the
following designations according to the pulp content and the turning applied: 0R1,
0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2.
2.3.2. Drying
At the end of the fermentations, the cupuassu beans were subjected to
natural drying in the first 24 h and then, because of adverse weather conditions, dried
in an oven with air circulation, model Fanem 315 (São Paulo, Brazil), at 40°C for 5 to
7 days until reaching 6.0 - 8.0% of moisture.
2.4 Physical and Chemical Determinations
2.4.1 Temperature and pH of the Fermenting Mass
The first measurements related to the pH and temperature of the mass
occurred with 12 h and every four hours of fermentation, in order to identify the
moment when the first drop of temperature would occur in experiments R2, for the
performance of the first turning. Measurements were made with digital thermometer
(Test Mod. 0526) and portable digital pH meter (Digimed Mod. DM20).
2.4.2 Moisture and Water Activity (Aw)
The determination of moisture was made in the crushed samples according to
Method 931.04 of AOAC (2005). The determination of the Aw was made in
hygrometer (Decagon-Aqualab Mod. CX-2), with a resolution of 0.01 coupled to a
thermostatic bath (Brookfield Mod. TC 500), with a resolution of 0.1°C at 25 ± 0.3°C.
49
2.4.3 Titratable acidity and pH of seeds during fermentation and dried beans
Determinations were carried out with a portable digital pH meter (Digimed
Mod. DM20). The determination of titratable acidity was performed according to
Method 942.15 of AOAC (2005).
2.4.4 Total Nitrogen
From 0.2 g of dry sample in an oven with air circulation (TECNAL Mod. TE-
394/2) at 105oC, we determined the total nitrogen in Nitrogen distiller (TECNAL Mod.
TE-036/1), in triplicate, using the Kjedhal method, 955.04C (AOAC, 2005).
2.4.5 Total phenolic compounds
Total phenolic compounds were determined according to Singleton et al.
(1999), modified by Pugliese (2010). The extraction was performed in duplicate with
0.5 g of freeze dried sample in 20 mL of methanol/water solution in the 70:30 ratio in
Ultra-Turrax® Homogenizer (Janke and Kunkel GmBH & Co. KG IKA-Labortechnik,
Staufen, Germany) with ice bath, speed 2 for one minute. After the extraction,
filtration was conducted on Whatman paper No. 6. The extracts were stored under
refrigeration in amber glass bottle. We added 2 mL of distilled water and 0.25 mL of
Folin-Ciocalteu reagent in 0.25 mL of each sample extract. The solution was
homogenized and kept for three minutes at room temperature, and then we added
0.25 mL of saturated solution of sodium carbonate. After incubation in water bath
(Marconi MA 184, BRAZIL) at 37oC for 30 minutes, we determined absorbance at
750 nm in DU-70 spectrophotometer (Beckman Coulter, Inc., USA). We also built a
standard curve of catechin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) from the
concentrations of 12.5, 25.0, 37.5, 50.0, 62.5, 75.0, 87.5, 100.0, 112.5 and 125.0
µg/mL. The results are expressed in mg/g of catechin on dry basis.
2.4.6 Organic Acids
The determination were carried out through extraction of organic acids in 5
g of sample with 25 mL of deionized water, vortex mixing, centrifuging (centrifuge
Fanem BABY I 206 BL, BRAZIL) at 3000 rpm for 45 minutes at room temperature
(Jinap & Dimick, 1990; Rodriguez-Campos et al., 2011). From there the methodology
had some modifications, in which we extracted the aliquot of 500 µL of sample from
10 mL of supernatant. The aliquot was mixed with 500 µL of MilliQ® water (Millipore
50
Corporation MA, USA) and subjected to centrifugation at 15000 rpm / 4oC for 10
minutes. The supernatant was filtered on a 0.45 µm membrane (Millipore®). The
separation for identification of organic acids was carried out using a modular
Shimadzu LC-10 system (Columbia, MD) comprised of a LC-10AT VP pump, a CTO-
10AS VP column oven, a SPD-M20A VP diode array detector (DAD), a SCL-10A
interface and a Class VP Workstation. The Aminex HPX-87H column (300 x
7.8mmx9 µm) (Bio-Rad, USA) was used with an oven temperature of 30oC. The DAD
was operated between 200 and 800 nm. Chromatograms for quantitative analysis
were extracted at 210 nm. The samples was eluted at 0.6 mL-1 with isocratic elution
in a mobile phase of H2SO4 0.004M. The injection volume was fixed at 20 µL for all
the analysis. The organic acids were quantified by an external standard method.
Standard solutions of known concentrations of citric, malic, lactic and acetic acids
(Sigma Aldrich, São Paulo, Brazil) were used. The standards were injected in
triplicate and the corresponding chromatograms obtained for each one. The graphs
were obtained with at least 6 concentration points. The areas obtained were matched
to their respective concentrations. The concentrations of the organic acids were
calculated for each treatment by interpolation of the areas and expressed in mg.g-1.
The organic acids peaks were identified by a comparison of the retention times (RT)
and confirmed by a comparison of the UV spectra with those of the reference
materials.
2.5 Cut test of fermented and dried beans
The determination was performed in order to assess the quality of the
cupuassu beans according to the degree of fermentation, considering color and
partitioning of cotyledons. A longitudinal cut was made in 300 beans from each batch
(triplicate of 100 seeds) (Cohen & Jackix, 2005; Kongor et al., 2013). To assess the
degree of fermentation regarding color and partitioning, we adopted some criteria
according to Figure 1.
51
Figure 1. (A) poorly fermented bean: without partitioning and of beige color; (B) partially fermented bean: with partial partitioning and of light brown color; (C) well fermented bean: with partitioning and
of dark brown color.
2.6 Statistical Analysis
The results of the physical and chemical analyses were statistically
evaluated with the software SAS (Statistical Analysis System), version 9.0, USA,
using the analysis of variance (ANOVA) and Tukey’s test (p≤0.05). To assess
associations between the physical and chemical parameters and samples, we
calculated the Pearson correlation coefficient (r) in Excel Program (Microsoft 2010®)
using as parameters the following coefficients: very weak 0.000 ≤ r ≥ 0.200, strong
0.601 ≤ r ≥ 0.800 and very strong 0.801 ≤ r ≥ 1.000 (Christmann; Badgett, 2009
mentioned by Copetti et al., 2012).
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Evolution of the Fermentation
3.1.1 Fermentation Time/Turnings
The total fermentation time was 60 hours for 0R1, 84 hours for 0R2, 7.5R1
and 7.5R2 and 108 hours for 15R1 and 15R2 (Figure 2). The experiments R2 with
more pulp (7.5 and 15%) also received more turnings and were fairly effective,
especially 15R2. The latter turning type is applied when there is a decrease in the
temperature of the fermentation (Barel, 1997).
3.1.2 Temperature and pH of the fermenting mass
Experiments 0R1 and 0R2 showed higher temperatures in the first hours,
and experiments 7.5R1 and 7.5R2 almost at the middle of the fermentation, although
below 40oC. For 15R1 and 15R2, the temperature peaks were 41.5oC and 42.0oC,
respectively, with 72 hours of fermentation (Figure 2).
A B C
52
Figure 2. Evolution of the temperature and pH during the fermentation of experiments 0R1, 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2.
Turning (R2) applied during fermentation after a decrease in the temperature of the mass.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
2
4
6
8
10
0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 60
pH
Time (h) 0R1
Temperature pH
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
2
4
6
8
10
0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 60 72 84
Time (h) 0R2
Tem
pe
rature
( oC)
Temperature pH
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
2
4
6
8
10
0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 60 72 84
pH
Time (h) 7.5R1
Temperature pH
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
2
4
6
8
10
0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 60 72 84
Time (h) 7.5R2
Tem
pe
rature
( oC)
Temperature pH
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
2
4
6
8
10
01
21
62
02
42
83
23
64
04
44
86
07
28
49
61
08
pH
Time (h) 15R1
Temperature pH
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
2
4
6
8
10
0
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
60
72
84
96
10
8
Time (h) 15R2
Tem
pe
rature
( oC)
Temperature pH
53
The increase in the temperature during fermentation is the result of the
intense activity of microorganisms on the substrates, forming compounds such as
ethanol and acetic acid (Lopes et al., 2003; Beckett, 2009). In the fermentation of
cocoa and cupuassu, the maximum temperature reached usually varies between
43.5oC and 50oC (Schwan, 1998; Lopes et al., 2003; Schwan & Wheals, 2004; Camu
et al., 2007). This range was not achieved by the experiments during fermentation,
which may be related, among other factors, to the climatic conditions of the region at
that time (Camu et al., 2007). The weather was rainy, with high air moisture (71.5 to
91%), with room temperature between 24.2oC and 26.2oC at night and 32oC and
35oC during the day (BDMEP, 2013). Moreover, the experiments were carried out on
a smaller scale (8 kg batches) in relation to the amount normally used (t) on a
commercial scale, which may have influenced the temperatures obtained.
The increase in pH was quick and continuous for experiments 0R1 and
0R2 after 28 h of fermentation, and for 7.5R1 and R2 the increase happened after 40
h. With 12 h of fermentation, 15R1 and 15R2 had a sudden increase and decrease in
pH, perhaps caused by the intense metabolism of the microorganisms on the
substrates (Figure 2). The amount of pulp present in those experiments seems to
have meant a late and sharp increase of pH for both, after 72 hours until the end of
the fermentation (Table 2). The cupuassu pulp has a pH of approximately 3.30, which
gives it a very acid profile (Gondim et al., 2001). The amount of pulp present in
experiments 7.5 and 15, in addition to maintaining the environment with high acidity
for longer, prolonged the fermentation time. The interruption of the processes was
made because of the increase in pH in all experiments in the last hours. The
maintenance of the fermentation for longer in those conditions would have meant the
development of undesirable flavor compounds (off flavors). At that moment there is a
predominance of some species of Bacillus, whose metabolism produces fatty acids
of low molecular weight, with degradation of precursor amino acids, thus featuring an
over fermentation (Biehl & Ziegleder, 2003).
3.2 Physical and chemical characterization of the seeds during fermentation
The physical and chemical characterization of cupuassu seeds at the
concentrations of pulp and respective turning types during fermentation is presented
in Table 2.
54
Table 2. Physical and chemical characterization of cupuassu seeds during fermentation
EXP Fermentation
Time (h) pH Titratable acidity* Moisture** Aw
Organic Acids *** Total Nitrogen
****
Total Phenolic Compounds
*** citric malic lactic acetic
0 R1
0
4.2a
11.4c
55.2c
0.983c
9.0c
3.2b
0.8b
2.1c
9.7c
25.8b
0 R2 4.2a
11.4c
55.2c
0.983c
9.0c
3.2b
0.8b
2.1c
9.7c
25.8b
7.5 R1 4.1a
13.3b
59.7b
0.985b
11.7b
2.7c
1.0a
2.5b
10.1b
26.5a,b
7.5 R2 4.1a
13.3b
59.7b
0.985b
11.7b
2.7c
1.0a
2.5b
10.1b
26.5a,b
15 R1 4.0a
15.4a
64.5a
0.991a
13.4a
4.1a
1.0a
2.8a
10.2a
27.8a
15 R2 4.0a
15.4a
64.5a
0.991a
13.4a
4.1a
1.0a
2.8a
10.2a
27.8a
0 R1
12
4.4a,b
11.6a
53.7c
0.990a
7.8c
1.0d
1.9c
2.3c
9.9b,c
25.3b
0 R2 4.5a,b
12.5a
54.0c
0.985a
7.6d
1.1c
1.4d
2.6b
9.8c
23.7b,c
7.5 R1 4.6a
9.3a
55.9c
0.986a
1.4f
0.5e
2.1a
4.1a
10.8a
25.3b
7.5 R2 4.6a
8.4a
59.0b
0.985a
6.4e
1.0d
2.0b
2.1d
10.4a,b,c
28.1a
15 R1 4.1b
13.6a
61.4a,b
0.987a
11.5a
2.8a
1.1e
0.1e
10.6a,b
20.1d
15 R2 4.1b
12.7a
63.8a
0.979a
9.9b
2.1b
1.4d
0.1e
10.7a,b
23.0c
0 R1
36
4.7a
7.1a
51.7b,c
0.980c
2.5d
0.3c
1.5e
3.8d
10.7a
25.4a
0 R2 4.7a
8.0a
47.3c
0.980b,c
2.5d
0.3c
1.9d
4.3c
10.3a,b
23.1b
7.5 R1 4.6a
11.2a
51.7b,c
0.984a
0.9e
0.2d
2.5b
10.2b
10.4a,b
22.9b
7.5 R2 4.6a
7.8a
58.4a
0.983a,b
4.9c
0.4b
2.6a
10.8a
10.3a,b
27.0a
15 R1 4.1b
10.3a
57.3a,b
0.982a,b,c
9.2a
0.9a
2.5b
1.8e
9.8b
17.7c
15 R2 4.5a,b
7.7a
60.7a
0.981a,b,c
8.4b
0.9a
2.2c
4.3c
10.4a,b
22.0b
Continua na próxima página…
55
Continuação
EXP Fermentation
Time (h) pH Titratable acidity* Moisture** Aw
Organic Acids ***
citric malic lactic acetic
0 R1
5.7a 2.4
b 54.3
c 0.986
a 1.4
d 0.2
c 0.9
e 4.3
e 10.4
a,b 19.8
b
0 R2 5.6a,b
2.8b 53.3
c 0.982
a 1.6
c 0.4
a 1.3
d 3.8
f 10.1
b 21.4
a
7.5 R1 5.3b 4.1
b 56.1
b,c 0.983
a 0.9
f 0.3
b 1.6
c 7.9
c 10.7
a 17.2
c
7.5 R2 5.4a,b
3.3b 58.5
a,b 0.983
a 1.1
e 0.2
c 0.7
f 5.2
d 10.7
a 21.5
a
15 R1 4.3c
15.3a
62.5a
0.982a
3.2b
0.2c
2.5b
14.3a
10.4a,b
17.7c
15 R2 4.3c
15.1a
62.2a
0.984a
4.5a
0.2c
2.6a
12.7b
10.5a,b
21.5a
0 R2
84
6.0a
1.7b
47.8b
0.984a
1.7b
0.4a
1.3c
3.4d
10.9a,b
18.6a
7.5 R1 5.7a
2.5b
47.8b
0.984a
0.8e
0.2b
0.5d
3.4d
10.9a,b
16.8b
7.5 R2 5.6a
2.7b
51.5b
0.985a
1.0d
0.1c
0.4e
4.5c
10.3b,c
18.4a,b
15 R1 4.5b
12.6a
57.4a
0.979a
3.7a
0.2b
2.3a
10.9a
10.2c
17.7a,b
15 R2 4.7b
8.8a
48.1b
0.981a
1.4c
0.2b
2.0b
10.4b
11.0a
18.0a,b
15 R1 108
5.5a
4.2a
54.2a
0.981a
0.8a
0.2a
1.4a
5.4a
10.4a
18.7a
15 R2 5.7a
3.2a
52.5b
0.983a
0.8a
0.2a
1.0b
3.3b
10.5a
18.1a
Values are expressed as Mean (SD). Samples with the same letters in the same column are not significantly different at the 5% level (Tukey’s test) *meqNaOH/100g **(%) *** (mg.g
-1) **** (g/100g DW)
Total Nitrogen
****
Total Phenolic Compounds
***
60
56
3.2.1 Moisture and Water Activity
Experiments with higher pulp content presented the highest initial values
of moisture also influencing the time required for moisture loss. During
fermentation, we observed a sudden increase in moisture content 60 h after the
beginning of the process in all experiments. Biehl et al (1982) mentioned by
Mattietto (2001) attributes this increase to a greater water retention by the seed
because of the increased temperature and also liquid retention by the vacuolar
proteins. There is also the argument that AAB promote a superoxidation of the
acetic acid with release of CO2 and water in the process (Schwan & Wheals,
2004). The moisture content was increased in experiments from the 3rd day of
fermentation, coinciding with the results obtained by Mattietto (2001) for cupuassu
seeds.
Water activity values fluctuated during fermentation for all experiments
and, at the end of the process, presenting values in the range of 0.98, coinciding
with those found for cocoa (Copetti et al., 2011).
3.2.2 Titratable acidity (TA) and pH of crushed seeds
In the first 12 h of fermentation, 0R1, 0R2 and 7.5R1 showed a rapid
increase in TA, but then there was a constant decrease for all experiments until the
end. Experiments 15R1 and 15R2 alternated moments of decrease and increase of
TA perhaps because of the adaptation of microorganisms to adverse conditions
that were triggered and according to the availability of substrates as the pulp
liquefied. Experiments 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2 presented the highest values
of TA, possibly because of the greater amount of pulp. However, the final values
(between 1.7 and 4.2 meqNaOH/100g) were below compared with those found in
other works with cupuassu beans (Mattietto, 2001).
During fermentation, cupuassu seeds showed increased pH from 4.0-
4.3 to 5.5-6.0. These results are related to the analysis being carried out on the
whole seed (shell + germ + cotyledon + pulp). In this situation, the shell presents a
more acid profile as it is in direct contact with the fermentation mass, and thus it
57
can explain the low initial acidity. In other research with cupuassu seeds at the end
of fermentation, the pH in the shell was at 6.22 while in the cotyledon it was 5.72
(Mattietto, 2001).
3.2.3 Organic Acids
The concentration of organic acids, for citric and malic acids in
particular, was significantly greater in experiments with higher concentrations of
pulp, with linear decrease during fermentation. Only 15R1 presented increased
citric acid with 84 hours. Similarly, higher concentrations, particularly of acetic acid,
are observed in experiments with greater concentration of pulp, and the highest
peaks occurred with 36 hours of fermentation in 7.5 R1 and R2 and 60 hours in
experiments 15R1 and 15R2. In all experiments, the lactic acid production profile
was similar to the acetic acid, although at much lower concentrations, with a
decrease in the last hours for both acids.
Citric acid is an important substrate used by microorganisms at the
beginning of fermentation, causing a change in the pH of the medium for the
production of other compounds, including lactic acid, which represents a problem
in the quality of the final product, as it is not a volatile substance, giving
undesirable acidity (Schwan & Wheals, 2004). Acetic acid, produced from the
metabolization of ethanol, is an important flavor precursor, but its acidity can be
mitigated through the drying of the beans and during processing to obtain
chocolate/cupulate (Schwan & Wheals, 2004; Beckett, 2009).
3.2.4 Total Nitrogen
Experiments with 7.5 and 15% of pulp had higher initial content of total
nitrogen (10.1 and 10.2%, respectively) than the depulped samples (9.7%). During
fermentation, we observed light oscillations in the concentration between
experiments. In the process, protein compounds are lost, either by formation of
volatile nitrogen compounds or even the liquefaction of the pulp, which could
explain the decrease in the levels of nitrogen compounds in some moments.
58
3.2.5 Total phenolic compounds
The total content of phenolic compounds, expressed in mg.g-1 of
catechin, revealed a greater concentration in experiments with greater
concentration of pulp. During fermentation, the decrease in those compounds
occurred progressively for all experiments. The initial concentration of catechin in
the experiments (25.8, 26.5 and 27.8 mg.g-1) was a little above the concentration of
catechin found in another study with fresh cupuassu seeds, which presented 20 to
23 mg.g-1 in dry weight of sample (Pugliese, Tomas-Barberan, Truchado, &
Genovese, 2013a). In the same study, at the end of fermentation, the beans
presented final concentration of catechin of 2.9 mg.g-1, which is l below compared
with the results obtained in this work, 16.8 and 19.8 mg.g-1 of catechin (Table 2).
However, the fermentation time of the experiments of Pugliese et al. (2013) was
longer (seven days), which would explain the increased degradation of phenolic
compounds by the greater exposure to the oxygen inside the beans.
The phenolic compounds present in seeds also play an important role in
the formation of flavor compounds during fermentation. The heat generated by
biochemical reactions, in addition to promoting increased permeability of cell walls,
facilitates the entry of organic compounds and water in the seed and exposes the
phenolic compounds to the enzymes as they are released. In this process, there is
an increase in the formation of canaliculi in the cotyledons from the progress of the
mentioned compounds and changes in the seeds color, noticeable by the
darkening that occurs from the action of polyphenoloxidases (Biehl & Ziegleder,
2003; Afoakwa et al., 2008).
3.3 Characterization of dried beans
The physicochemical characterization of the dried cupuassu beans is
presented in Table 3.
59
Table 3. Physicochemical characterization of dried beans of the different fermentation experiments
EXP pH Titratable
acidity (AT)*
Moisture (%)
Organic acids** Total
Nitrogen (TN)***
Total Phenolic
Compounds (TPC) **
citric malic lactic acetic
0 R1 6.2a
1.2d
5.50c
1.39e
0.30e
2.07f
0.87f
10.1b
13.7a
0 R2 6.2a
1.9c
5.60b,c
1.85b
0.35d
2.13e
1.83c
10.2b
12.3b
7.5 R1 5.8c
3.2a
5.50c
1.79c
0.38b
3.60a
1.63e
10.4b
8.8d
7.5 R2 6.2a
2.5b,c
6.30a
1.40d
0.37c
3.47b
1.70d
11.8a
10.2c
15 R1 5.9b,c
3.0a,b
6.36a
2.14a
0.55a
3.39c
3.30a
10.5b
11.5b
15 R2 6.1a,b
2.9a,b
6.10a,b
1.12f
0.26f
2.46d
2.77b
12.2a
10.3c
Values are expressed as Mean (SD) *meqNaOH/100g ** mg.g-1
***g/100g DW
Samples with the same letters in the same column are not significantly different at the 5% level (Tukey’s test)
The turning type did not influence pH, titratable acidity (AT) and
moisture for 15R1 and 15R2, and there is no difference between the two
experiments. Regarding organic acids and total phenolic compounds (TPC), all
experiments showed difference between themselves. In total nitrogen, only 0R1
and 0R2 were equal (Table 3).
For all experiments, the pH of the beans was high, showing low acidity. In
contrast, TA presented low values. The concentration of organic acids found in the
experiments may be involved with the values found, since the concentration was
also low. During the drying of the beans, a greater evaporation of the volatile
organic acids may have happened. Lower values of pH and higher TA in dried
cupuassu beans have been reported in previous works, raising the possibility that
the seed absorbs the acetic and lactic acids (Carvalho et al., 2005). The
experiments with greater concentration of pulp (7.5 and 15) presented the highest
averages in the concentration of lactic acid, and 15R1 and 15R2 also presented
the highest averages for acetic acid.
The content of total nitrogen (TN) of the experiments was a little above
the range also found in dried cupuassu beans (between 7.81 and 9.80%) in other
60
works (Queiroz & Garcia, 1999; Lopes et al., 2003; Carvalho et al., 2005). The
average moisture for all experiments was within the recommended limits, since, for
cocoa, a high moisture (>8%) could compromise the microbiological safety of the
product and a low moisture (<5%) affects the texture of the seeds making them
more brittle (Biehl & Ziegleder, 2003).
In relation to TPC, 0R1 and 0R2 presented the highest concentrations.
In general, the concentration of all experiments were above the values found in
other works on cupuassu beans (2.9 mg.g-1) (Pugliese, 2010). During fermentation
and the drying step, there is an accelerated oxidation of the TPC with decreased
concentration throughout the process, and 10-20% of catechins can still be found
in dried cocoa beans (Biehl & Ziegleder, 2003). The shorter fermentation time in
the experiments, when compared to other works with cupuassu (Pugliese et al.,
2013), may have contributed to the concentration found.
3.3.1 Cut Test
The results of the cut tests of the beans showed, in general, partial
partitioning and light brown color in all experiments, and 7.5R1 showed the highest
number of beans with good partitioning (21.3%) and 15R2 showed the highest
number of beans with partial partitioning (72.7%).
Experiments 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2 presented a higher amount
of brown beans (between 72.3 and 81.3%) while 0R1 and 0R2 presented a higher
amount of beige beans (23.7 and 23.3, respectively). In cocoa beans considered
poorly fermented, the color is usually purple, while cupuassu beans are white or
beige, because of the absence of anthocyanin pigments (Lopes et al., 2003;
Carvalho et al., 2005; Kuskoski et al., 2006; Efraim et al., 2010).
As with cocoa, cupuassu beans considered as well fermented must be
darker and have sharper partitioning, due the entry of chemical compounds and
heat in the seed. In the partially fermented beans, the coloring is a little lighter than
the previous one and the partitioning is less pronounced. Some authors argue that
under these conditions the beans are able to develop the flavor in the final product
61
(Carvalho et al., 2005). The results are similar to those of Carvalho et al. (2005), in
which most of the beans were classified as partially fermented. The beans of the
0R1 experiment presented a greater amount of beige beans with little or no
partitioning, perhaps because of the shorter fermentation time (three days), which
would be insufficient for the production of the compounds responsible for the
typical characteristics of well fermented beans in a period of up to seven days
(Lopes et al., 2003; Cohen & Jackix, 2005; Garcia, 2006; Cohen et al., 2009).
However, very dark beans can be an evidence of over fermentation, which give a
bland taste in the case of cocoa seeds (Biehl & Ziegleder, 2003).
Another criteria adopted was to assess the degree of fermentation of the
beans by the detachment of the shell, a technique adopted by producers in the
Amazonas state. According to them, when partially or well fermented, the shell
tends to come off more easily. Of all experiments, 0R1 presented the worst degree
of shell loosening (5%).
3.4 Correlations
In Table 4 we present the results of the correlations between the
physicochemical tests performed on the six experiments during fermentation and in
dried beans.
62
Table 4. Correlation coefficient (r) between the results of the physicochemical tests performed in the six experiments in the key moments of the fermentation and in dried beans.
TA* pH citric malic lactic acetic TPC**
0 h
pH -0.99
citric 0.98 -0.99
malic 0.65 -0.63 0.53
lactic 0.85 -0.86 0.92 0.16
acetic 0.99 -0.99 0.99 0.56 0.90
TPC** 0.98 -0.98 0.95 0.75 0.76 0.96
TN*** 0.93 -0.94 0.97 0.34 0.98 0.96 0.87
12h
pH -0.73
citric 0.73 -0.83
malic 0.60 -0.92 0.87
lactic -0.71 0.80 -0.83 -0.87
acetic 0.56 0.90 -0.92 -0.93 0.77
TPC** -0.75 0.81 -0.64 -0.81 0.88 0.61
TN*** -0.35 -0.27 -0.15 0.28 0.02 -0.19 -0.17
60 h
pH -0.99
citric 0.92 -0.88
malic -0.45 0.45 -0.38
lactic 0.93 -0.92 0.86 -0.18
acetic 0.96 -0.97 0.80 -0.46 0.93
TPC** -0.15 0.18 0.17 0.05 -0.28 -0.37
TN*** 0.00 -0.11 -0.17 -0.53 -0.09 0.17 -0.27
84 h
pH -0.97
citric 0.79 -0.64
malic -0.23 0.38 0.13
lactic 0.86 -0.80 0.78 0.24
acetic 0.96 -0.98 0.67 -0.25 0.87
TPC** -0.13 0.16 0.06 0.29 0.12 -0.02
TN*** -0.38 0.32 -0.56 0.50 -0.07 -0.25 -0.14
Dried beans
pH -0.76
citric 0.30 -0.56
malic 0.41 -0.55 0.87
lactic 0.77 -0.68 0.40 0.61
acetic 0.68 -0.40 0.37 0.52 0.30
TPC** -0.87 0.60 -0.04 -0.08 -0.75 -0.28
TN*** 0.41 0.21 -0.60 -0.34 0.18 0.36 -0.48
P<0.05000
63
In Table 4 we can observe that at the beginning of the fermentations
(time = 0 h) there was a weak correlation between pH and TA, TPC, TN and all
organic acids assessed. These results show that, due to the strength the organic
acids (citric, malic), TA was high before fermentation. With 12 h of fermentation, we
can observe a lower significance on the negative correlation between pH and TA
(r= -0.73) and similarly between TA and lactic acid (r= -0.71). From that moment,
the correlations between the citric acid and the lactic and acetic acids and TPC
became weak, thus denoting a decrease in the concentration of citric acid,
because of its metabolization, acceleration of the production of the two acids
mentioned and degradation of TPC. The same seems to have occurred with malic
acid, which had its concentration reduced throughout fermentation. With 60 h,
there was a very strong positive correlation between the acetic and lactic acids (r=
0.93) given the concomitant production of both, also reflected in the strong
correlation of those acids with TA.
From 84 h, with the exception of experiment 0R1 which had already
finalized fermentation, it was demonstrated in the correlation test for the other
experiments that there was a weak correlation between pH and TA and organic
acids, for the reasons already mentioned. However, the very strong correlation
between citric acid and the acetic and lactic acids decreased, as well as between
the acetic and lactic acids (r=0.87) given, perhaps, the imbalance in their
concentration, with predominant acetic acid, in particular in experiments 15R1 and
15R2.
In the dried beans, we can observe that there was a reduction in the
estimate of negative correlation between pH and TA (r= -0.76). However, the
correlation estimate of the TA remained strong between the lactic (r= 0.77) and
acetic acids (r= 0.68). These results are very close to those found in cocoa nibs,
with r= 0.75 between TA/acetic acid and r= 0.63 between TA/lactic acid (Holm et
al., 1993). In the same study, the estimate of negative correlation between pH and
the two acids, according to the author, may be related to the acid flavor. In another
study with cocoa liquor there was also a weak negative correlation between pH
64
and acetic acid (r= -0.69), thus confirming that the higher the concentration of
acetic acid, the lower the pH value, which gives acid flavor to the product (Holm et
al., 1993; Luna et al., 2002).
Before fermentation, the TPC and pH values presented weak
correlation, which became positive in the dried beans, possibly because of the
lower acid profile of the mass. Another interesting fact was the estimation of
correlation observed between TPC/lactic acid, which was strong before
fermentation and reversed in dried beans. This result may indicate that, because it
is not volatile, the acid remained in the beans, also contributing to the reduction of
the TPC by enzymatic oxidation. The estimated correlation between TPC/acetic
acid was weak, thus confirming the results of the average concentrations of this
acid, which were lower than lactic acid in dried beans because of its volatile
characteristic. This leads us to believe that, if noticeable in the final product, the
acidity can be attributed to the lactic acid.
4. CONCLUSIONS
The seeds with a higher amount of pulp (15R1 and 15R2) recorded
higher temperatures and longer fermentation time, which was reflected on the final
quality of the beans, which according to the cut test showed better results, as long
as in the physical and chemical tests. Thus, the experiments have demonstrated
the feasibility of fermenting cupuassu beans with partial depulping. Although
fermentation time was short for some experiments, a longer time is a possibility
that should not be dismissed. If there is a control in the process, there is not an
abrupt increase in pH, as in the final moments of our experiments. Nevertheless,
further research is needed to attest to the viability of the large-scale fermentation of
seeds under these conditions.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank the National Council for Scientific and Technological
Development – CNPq – (Process No. 485287/2011-0) and the São Paulo
65
Research Foundation – FAPESP – (Process 2012/00296-4) for the resources
granted for the development of the research. We thank the Amazonas Research
Foundation – FAPEAM for the granting of scholarship. We also thank the
Amazonas Central Public Health Laboratory – LACEN – and the Federal University
of Amazonas – UFAM – for the permission to use facilities and equipment.
REFERENCES
Afoakwa, E., Budu, A., Mensah-Brown, H., & Felix, J. (2014). Changes in
Biochemical and Physico-chemical Qualities during Drying of Pulp
Preconditioned and Fermented Cocoa ( Theobroma cacao ) Beans. Journal of
Nutritional Health & Food Science, 2, 1–8.
Afoakwa, E., Paterson, A., Fowler, M., & Ryan, A. (2008). Flavor formation and
character in cocoa and chocolate: a critical review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 48(9), 840–857.
http://doi.org/10.1080/10408390701719272
AOAC (2005). Official Methods of Analysis, 18th edn. Association od Official
Analytical Chemists, Washington, D.C. USA.
Barel, M. (1997). La Fermentation du Cacao : Le Moyen de L’apprecier Et de La
Maitriser. Revue Des Industries Alimentaires et Agricoles, 14, 211–214.
Beckett, S. T. (2009). Industrial Chocolate Manufacture and Use. (S. T. Beckett,
Ed.) (4th ed.). York, UK: Wiley-Blackwell.
Biehl, B., & Ziegleder, G. (2003). COCOA Chemistry of processing. In
Encyclopaedia of Food Sciences and Nutrition (2nd ed., Vol. 3, pp. 1436–
1448). Germany: Elsevier Science.
BDMEP (2013). Banco de Dados Meteorológicos para Ensino e Pesquisa.
Available in http://www.inmet.gov.br/projetos/rede/pesquisa/ Acess date
07.31.2015
66
Camu, N., De Winter, T., Verbrugghe, K., Cleenwerck, I., Vandamme, P., Takrama,
J. S., … De Vuyst, L. (2007). Dynamics and biodiversity of populations of lactic
acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap
fermentation of cocoa beans in Ghana. Applied and Environmental
Microbiology, 73(6), 1809–1824. http://doi.org/10.1128/AEM.02189-06
Carvalho, A., García, N., & Wada, J. (2005). Caracterização físico-química e
curvas de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e
torradas de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of
Food Technology, 8(2), 127–134.
Cohen, K., & Jackix, M. (2005). Estudo do liquor de cupuaçu. Ciência e Tecnologia
de Alimentos, 25(1), 182–190. http://doi.org/10.1590/S0101-
20612005000100030
Cohen, K., Sousa, M., & Jackix, M. (2009). Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau (No. 267). Documentos. Planaltina, DF.
Copetti, M., Iamanaka, B., Frisvad, J., Pereira, J., & Taniwaki, M. (2011).
Mycobiota of cocoa: From farm to chocolate. Food Microbiology, 28(8), 1499–
1504. http://doi.org/10.1016/j.fm.2011.08.005
Copetti, M., Iamanaka, B., Pereira, J., Lemes, D., Nakano, F., & Taniwaki, M.
(2012). Co-occurrence of ochratoxin a and aflatoxins in chocolate marketed in
Brazil. Food Control, 26(1), 36–41.
http://doi.org/10.1016/j.foodcont.2011.12.023
Copetti, M., Iamanaka, B., Pitt, J., & Taniwaki, M. (2014). Fungi and mycotoxins in
cocoa: From farm to chocolate. International Journal of Food Microbiology,
178, 13–20. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.023
Di Mattia, C., Martuscelli, M., Sacchetti, G., Scheirlinck, I., Beheydt, B., Mastrocola,
D., & Pittia, P. (2013). Effect of Fermentation and Drying on Procyanidins,
67
Antiradical Activity and Reducing Properties of Cocoa Beans. Food and
Bioprocess Technology, 6(12), 3420–3432. http://doi.org/10.1007/s11947-012-
1028-x
Efraim, P., Pezoa-García, N., Jardim, D., Nishikawa, A., Haddad, R., & Eberlin, M.
(2010). Influência da fermentação e secagem de amêndoas de cacau no teor
de compostos fenólicos e na aceitação sensorial. Ciência e Tecnologia de
Alimentos, 30, 142–150. http://doi.org/10.1590/S0101-20612010000500022
Garcia, I. (2006). Enzimas produzidas durante os diferentes estágios de
fermentação das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willdenow
ex Sprengel) Schumann). 99 p (Mestrado em Ciência de Alimentos).
Universidade Federal do Amazonas, Brasil.
Gondim, T., Thomazini, M., Cavalcante, M., & Souza, J. (2001). Aspectos da
Produção de Cupuaçu. Embrapa Acre. (1a ed.). Rio Branco: Embrapa Acre.
Holm, C. S., Astong, J. W., & Douglas, K. (1993). The effects of the organic acids
in cocoa on the flavor of chocolate. Journal of Science Food Agriculture
61(Shepherd 1976), 65–71.
Jinap, S., & Dimick, P. (1990). Acidic Characteristics of Fermented and Dried
Cocoa Beans from Different Countries of Origin. Journal of Food Science,
55(2), 547–550.
Kongor, J., Takrama, J., Budu, A., & Mensah-Brown, H. (2013). Effects of
Fermentation and Drying on the Fermentation Index and Cut Test of Pulp Pre-
conditioned Ghanaian Cocoa. Journal of Food Science and Engineering, 3,
625–634.
Kuskoski, E., Asuero, A., Morales, M., & Fett, R. (2006). Frutos tropicais silvestres
e polpas de frutas congeladas: atividade antioxidante, polifenóis e
68
antocianinas. Ciência Rural, 36(4), 1283–1287. http://doi.org/10.1590/S0103-
84782006000400037
Lagunes Gálvez, S., Loiseau, G., Paredes, J., Barel, M., & Guiraud, J. (2007).
Study on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the
Dominican Republic. International Journal of Food Microbiology, 114(1), 124–
130. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.041
Leal, G., Gomes, L., Efraim, P., Almeida Tavares, F., & Figueira, A. (2008).
Fermentation of cacao (Theobroma cacao L.) seeds with a hybrid
Kluyveromyces marxianus strain improved product quality attributes. FEMS
Yeast Research, 8(5), 788–798. http://doi.org/10.1111/j.1567-
1364.2008.00405.x
Lopes, A., Garcia, N., & Vasconcelos, M. (2003). Avaliação das Condições de
Torração Após a Fermentação de Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma
grandiflorum Schum) e Cacau (Theobroma cacao L.). Braz. J. Food Technol,
6(2), 309–316.
Luna, F., Crouzillat, D., Cirou, L., & Bucheli, P. (2002). Chemical composition and
flavor of Ecuadorian cocoa liquor. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
50(12), 3527–3532. http://doi.org/10.1021/jf0116597
Matos, C. B., Souza, C. N., Faria, J. C., Oliveira, S. J., Santos, L., & Sacramento,
C. (2008). Características Físicas e Físico-químicas de Cupuaçus de
Diferentes Formatos. Revista de Ciências Agrárias, 50, 35–45.
Mattietto, R. (2001). Estudo comporativo das transformações estruturais e físico-
químicas durante o processo fermentativo de amêndoas de cacau
(Theobroma cacao) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum). 164 p (Mestrado
em Tecnologia de Alimentos). Universidade Estadual de Campinas, São
Paulo, Brazil.
69
Nielsen, D., Crafack, M., Jespersen, L., & Jakobsen, M. (2013). Chocolate in
Health and Nutrition. Chocolate in Health and Nutrition, 39–60.
http://doi.org/10.1007/978-1-61779-803-0
Pugliese, A. G. (2010). Compostos fenólicos do cupuaçu (Theobroma grandiflorum
) e do cupulate : Composição e possíveis benefícios.146 p (Mestrado em
Ciência de Alimentos). Universidade de São Paulo, Brasil.
Pugliese, A., Tomas-Barberan, F., Truchado, P., & Genovese, M. (2013).
Flavonoids, Proanthocyanidins, Vitamin C, and Antioxidant Activity of
Theobroma grandiflorum (Cupuassu) Pulp and Seeds. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 61, 2720–2728. http://doi.org/10.1021/jf304349u
Queiroz, M., & Garcia, N.. (1999). Avaliação da Torração de Amêndoas de
Cupuaçu (Theobroma grandiflorum). Brazilian Journal of Food Technology, 2,
167–173.
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H.., Orozco-Avila, I., Lugo-Cervantes,
E., & Jaramillo-Flores, M. (2011). Dynamics of volatile and non-volatile
compounds in cocoa (Theobroma cacao L.) during fermentation and drying
processes using principal components analysis. Food Research International,
44(1), 250–258. http://doi.org/10.1016/j.foodres.2010.10.028
Said, M. (2011). Aspectos culturais e potencial de uso do cupuaçu ( Theobroma
grandiflorum (Willd. Ex Spreng. Schum.) no Estado do Amazonas. 128 p
(Mestrado em Ciências do Ambiente e Sustentabilidade na Amazônia).
Universidade Federal do Amazonas, Brasil.
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial
cocktail inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–83.
70
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4),
205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
71
CAPÍTULO 3
CUPUASSU CANDY BAR
Simone de Nazaré Melo Ramos, Deise Cristina da Silva, Juliana Weltman Glezer, Aline de Oliveira Garcia, Jorge Herman Behrens, Priscilla Efraim
__________________________________________________________________
RAMOS, S.N.M; GARCIA, A.O.; EFRAIM, P. Influence of the type of fermentation of cupuassu (Theobroma grandiflorum Schum) in the sensory characteristics of a product similar to chocolate. IFT15 Where Sciences Feeds Innovation realizado no período de 11-14 de julho de 2015 em Chicago, Estados Unidos (Resumo e pôster).
Este artigo será submetido à LWT Food Science and Technology
72
CAPÍTULO 3
CUPUASSU CANDY BAR
Simone de Nazaré Melo Ramosa,*, Deise Cristina da Silva
a, Juliana Weltman Glezer
a, Aline de
Oliveira Garciab, Jorge Herman Behrens
c, Priscilla Efraim
a
aDepartment of Food Technology, FEA, UNICAMP. Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade Universitária
Zeferino Vaz. Campinas-SP. Brazil. CEP 13.083-862 b Center of Science and Food Quality, ITAL
c Department of Food and Nutrition, FEA, UNICAMP
*Corresponding author: Tel +55 19 35214006. E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Cupulate is a product similar to chocolate obtained from the fermentation of
cupuassu seeds (Theobroma grandiflorum Schum). The high amount of pulp
adhered to the seeds impedes fermentation. However due to the importance of the
present substrates for the formation of flavor precursors, we performed
fermentation with three pulp concentrations (0, 7.5 and 15%) and two types of
mixing for aeration of mass: fixed (R1) and according to the temperature (R2),
totaling six samples (0R1, 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2). Beans were
processed to obtain cupulates, which were submitted to acceptance test,
quantitative descriptive analysis (QDA) and CATA (Check All That Apply) for
sensory evaluation. In CATA the attributes bitterness, earthy, coffee, firm to the
bite and bad residual were the most frequent, and the perceptions of fruity and
floral tastes was more common to 15R1 and 15R2. The results showed that 0R1
and 15R2 samples were the most accepted and with the highest scores for
purchase intent. In QDA, the type of turning had little or no influence on the
sensory attributes. However, experiments with higher pulp content, 15R1 and
15R2, presented the highest levels in almost all the attributes, although not
statistically differing from the other samples.
Keywords: cupuassu, fermentation, cupulate, quantitative descriptive analysis,
check-all-that-apply
73
1. INTRODUCTION
Cupulate is a product with similar characteristics to chocolate, obtained
by fermentation of the cupuassu seeds (Nazaré et al., 1990; Venturieri, 1993;
Lannes & Mederiros, 2003). As occurs with cocoa (Theobroma cacao L.)
fermentation is an essential step to the sensory characteristics of the final product,
depending on the physical and chemical changes that occur (Schwan, 1998;
Beckett, 2009). In cupuassu seeds, compounds that lead to these characteristics
and to the quality of cupulate are not yet fully elucidated.
Cupuassu seeds are still considered by-product of pulp processing,
resulting in waste of material, despite its high nutritional value by the presence of
essential amino acids and proteins with high biological value, considered superior
compared to cocoa beans (Carvalho et al., 2005; Lopes, Pezoa-garcía, & Amaya-
farfán, 2008). The fermentation time of cupuassu seeds can last for up to seven
days, and the degree of fermentation is evaluated by cutting test, whose result
differs from cocoa by the beans color, because when poorly fermented they are
purple, while the cupuassu are beige. In well fermented beans the brown color
present is due to the oxidation of phenolic compounds (Lopes et al., 2003; Cohen
& Jackix, 2005). To carry out the fermentation, usually the seeds are partially
depulped (5% pulp content) or completely depulped for commercial use of pulp
(Cohen & Jackix, 2005; Matos et al., 2008).
The same way is done with cocoa. Seeds fermentation is not performed
uniformly, making it difficult to achieve the quality standards in the final product
(Schwan & Wheals, 2004; Lehrian, Patterson, 1984 citados por Lagunes Gálvez et
al., 2007; Pereira et al., 2012). The turning applied during fermentation unifies the
temperature throughout the mass, increasing aeration and promoting aerobic
microorganisms, such as acetic acid bacteria (AAB) with important role in the
production of flavor precursors compounds and also involved in the increase of the
mass temperature, which can reach up 50oC (Schwan & Wheals, 2004; Nielsen et
al., 2013).
74
After fermentation, the beans were subjected to the drying process,
which is completed when they reach 6 to 8% moisture (Vilalba et al., 2004;
Carvalho et al., 2005; Cohen & Jackix, 2005). Beans processing for obtaining
cupulate is performed through steps similar to those applied in the production of
chocolate (Cohen & Jackix, 2005). Roasting is an important step, which occurs the
main formation of flavor compounds. Standardization of roasting process of beans
is essential so that there is no destruction of taste or compound formation of
undesirable flavors to the final product by high temperature and/or prolonged
roasting (Serra Bonvehí & Ventura Coll, 2002; Afoakwa et al., 2008). Amino acids
released by the proteolytic enzymes action during fermentation react with reducing
sugars (Maillard Reaction) especially in the steps of roasting, conching and
tempering, forming important flavor compounds, including aldehydes, ketones and
pyrazines (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa et al., 2008; Beckett, 2009).
In order to obtain terms and sensory attributes, targeting not only the
product characterization, but also compliance with the requirements of consumers,
sensory analysis is used as a tool through trained tasters team or not, with
reference materials associated to the characteristics of the product under study, in
an environment with controlled conditions (Teixeira, 2009; Minim et al., 2010;
Jaeger et al., 2015). Some authors believe that the human being adds better
conditions of sensory evaluation, by their subjectivity, coupled with technical and
scientific concepts, cultural and socioeconomic (Teixeira, 2009). Products similar to
chocolate elaborated based to cupuassu have been evaluated by means of
acceptance testing (Lopes et al., 2003; Cohen et al., 2009), including product
composed of cocoa and cupuassu mixture in different proportions, with satisfactory
sensory results (Cohen et al., 2009). However, because it is a new product, it is
very difficult to find specific consumer of cupulate to form the tasters group.
Descriptive sensory studies are also scarce, with attribute survey for its
characterization, while for cocoa and chocolate, there are several works (Bispo et
al., 2005; Ramli et al., 2006; Padilha et al., 2010; Novello et al., 2012; Crafack et
al., 2014; Batista et al., 2015).
75
Searching sensory characteristics in cupulate that can be improved, we
produced six samples from cupuassu seeds with three pulp concentrations
subjected to two types of turning during fermentation. The cupulate samples were
submitted to QDA (Quantitative Descriptive Analysis) and CATA (Check All That
Apply). QDA is a descriptive method in which a team of trained tasters collect the
sensory attributes of a set of products, in addition to reference materials that
represent the variability of intensity of each attribute of the samples, statistically
revealing the similarities and differences among the product and results (Murray,
Delahunty, & Baxter, 2001). CATA, "check all that apply", is a qualitative and
quantitative method by which consumers evaluate a product and qualify it with the
aid of a list of terms (descriptive, aesthetic, hedonic, emotional, etc.), whose choice
is dependent on the individual's perception, considered appropriate to describe a
product in order to find potential attributes (Dooley, Lee, & Meullenet, 2010;
Dutcosky, 2013).
Thus, this work aimed to evaluate the influence of pulp content and
turning form applied to the cupuassu fermentation in the sensory characteristics of
cupulate, a product originated from the by-product, but with potential for high
added value and sensory quality.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1 Fermentation
Cupuassu seeds with pulp were used, extracted from about 1 t of ripe
and healthy fruit, freshly collected after their fall, in Presidente Figueiredo-
Amazonas, Brazil, in January 2013. The seeds suffered depulping (0%) and partial
depulping (7.5 and 15%) and in the fermentation process we applied two types of
turning: R1 (fixed) made 48 hours after the beginning of the fermentation; and R2,
made in accordance with the drop in temperature of the fermentation mass. The
experiments were identified as 0R1 and 0R2; 7.5R1 and 7.5R2; 15R1 and 15R2.
The total fermentation time for the experiment was of 60h 0R1; to 0R2, 7.5R1 and
7.5R2 was 84h; and 15R1 and 15R2 was 108h.
76
2.2 Drying
After fermentation, the beans were subjected to natural drying (solar) in
the first 24h, and then to artificial drying in oven with air circulation (MARCONI MA
035/5/10P São Paulo, BRASIL), set at 40oC for 5-7 days until they reached 6-8%
moisture.
2.3 Processing
The processing of beans for obtaining cupulate was held in the pilot
plant of fruit laboratory, School of Food Technology of Unicamp, following the
same flowchart for chocolate production (Figure 1).
Figura 1. Flow chart of the processing of cupulate used for the diferente experiments.
The beans were roasted at 120°C/120 min in batches of 4.0 kg in a
rotary electric oven (JAF INOX São Roque, Brazil). The formulation (50%
cupuassu) used in the cupulates production consisted of cupuassu mass (48.6%),
RECEPTION
CLEANING
ROASTING
BREAKING
PEELING MILLING
SIEVING
SUGAR ADDITION
MIXING
REFINING ADDING OTHER INGREDIENTS
HOMOGENIZATION
CONCHING
TEMPERING
MOLDING / DEMOLDING
77
milled refined sugar (48.6%), cupuassu butter (1.4%), soybean lecithin (0.4%) and
polyglycerol polyricinoleate-PGPR (0.4%). The prepared cupulates were packed in
aluminium foil, and stored at ±8oC until the analysis.
2.4 Sensory Analysis
The project was submitted and approved by the Research Ethics
Committee of the School of Medical Sciences at the University of Campinas
(Unicamp), n. CAAE 07336612.0.0000.5404.
2.4.1 Quantitative Descriptive Analysis (QDA)
QDA was held in the sensory analysis laboratory of the Department of
Food Technology, School of Food Engineering of Unicamp. Chocolate consumers
were trained and selected tasters over 18 years. From two samples of cupulate
with concentrations of 50 and 70% cupuassu, were collected the terms descriptors
and reference materials (Table 1) by the Kelly’s Repertory Grid Method described
by Kelly and cited by Moskowitz (1983). For the final production of cupulate
samples for sensory analysis, it was used the concentration of 50%.
78
Table 1. Attributes, respective descriptor terms and references used for the sensory profile evaluation of cupulate samples.
DESCRIPTOR DEFINITIONS REFERENCES
AROMA
Roasted Aromatic score associated with roasted cupuassu.
Weak: Cupuassu liquor
Strong: Cupulate whose liquor has gone through over-roasting
Sweet
Intensity of characteristic
caramel aroma.
Weak: Cupuassu liquor
Strong: Cupulate with an increase of 2% aroma identical to natural caramel (Citromax).
Coffee Typical or characteristic aroma of coffee.
Weak: Cupuassu liquor
Strong: Cupulate with an increase of 4% soluble coffee powder (Nescafé – Nestlé)
Fruity Aromatic score associated with yellow fruits
Weak: Cupuassu liquor
Strong: Cupulate with an increase of 0.05% aroma identical to natural orange (Citromax)
FLAVOR
Sweetness Taste associated with
sucrose.
Weak: Cupuassu liquor
Strong: Condensed milk (Nestlé)
Bitterness residual Bitterness taste remaining in
the mouth after ingestion.
Weak: Milk chocolate (Lacta – Mondeléz)
Strong: Cupuassu liquor
Cupuassu flavor
Characteristic flavor of cupuassu.
Weak: Milk chocolate (Lacta – Mondeléz)
Strong: Cupuassu pulp
Coffee flavor Characteristic coffee flavor.
Weak: Cupulate with 50% of liquor
Strong: Cupulate with an increase of 2% soluble coffee powder (Nescafé – Nestlé)
TEXTURE
Hardness Force required for the first
bite of the sample.
Weak: Milk chocolate (Lacta – Mondeléz)
Strong: Compound (fancy chocolate) milk (Bel)
Melting
Characteristic associated with the texture and melting of samples at melting point close to tongue temperature.
Weak: Compound (fancy chocolate) or milk (Bel)
Strong: Milk chocolate (Lacta – Mondeléz)
79
Each descriptor was named by means of a 9 cm unstructured scale
anchored with the intensity terms in its extremes. During training the tasters were
evaluated for discrimination ability (Psample <0.50), reproducibility (Prepetition ≥
0.05) and also for consensus judgment of the samples. The sensory panel
comprised 15 judges. Each the cupulates samples were evaluated in quadruplicate
following a complete blocks design. We offered them mineral water and cream
cracker for cleansing the palate between tasting samples.
2.4.2 Affective test
The test was conducted in the sensory evaluation laboratory of the Food
Technology Institute (ITAL) in Campinas, São Paulo, with 60 consumers of dark
chocolate (14 men and 46 women, over 18 years, most belonging to the B2 class,
which consume chocolate at least from 2 to 3 times per week). The recruitment
was carried out according to the Brazilian Criterion of Economic Classification 2013
(ABEP, 2013). Most recruited consumers (> 50%) to CATA reported to prefer milk
chocolate, and flavor was the most cited attribute. It is usually recommended to
recruit consumers who have appreciation for the product to be tested or similar
(Meilgaard et al., 2007).
The test was conducted in individual booths with fluorescent lighting
equipped with computerized system Compusense Five version 5.4 for collecting
and analyzing data. The samples were monadically evaluated in a single session
according to a complete blocks design with three random numbers, served at room
temperature in napkins. Participants were asked to sip water between samples in
order to clean the palate.
The samples were evaluated for overall and, especially for aroma, flavor
and texture by means of nine points hedonic scale of (9 = I liked a lot, 5 = I did not
like nor disliked and 1 = I very much disliked) and in relation to bitterness, acidity
and sweetness intensity through the five-point ideal scale (5 = much
bitter/acid/sweet than what I like, 3 = the way I like it and 1 = much less
bitter/acid/sweet than what I like). Finally, we questioned regarding intend to
80
purchase (5 = I would certainly buy it, 3 = maybe/maybe not/ 1 = I would certainly
not buy it) (Meilgaard et al., 2006; Dutcosky, 2013).
Complementing the acceptance testing, the perception of cupulates by
consumers was assessed by the CATA methodology (Check-All-That-Apply) (Ares
et al., 2010). We presented the tasters a form with free choice of 27 terms related
to flavor to be marked according to the perception of the sample: sour/aggressive
acidity, fruity, floral, cheese, bitterness, herb/chlorophyll, tobacco, earthy,
fermented, it takes time to melt, pepper/cinnamon, vanilla, coffee, roasted nuts,
caramel/molasses, sweet, citrus, it is too hard to bite, soft to the bite, firm to the
bite (but not hard), granular/sandy, pleasant residual, bad residual, it melts well, it
melts quickly and it melts in the mouth, smooth/creamy, pleasant acidity.
2.4.3 Statistical Analysis
QDA and affective test data were statistically analyzed using the SAS
software (Statistical Analysis System), version 9.0, using analysis of variance
(ANOVA) and Tukey test (p≤0.05) (SAS, 2009). We also performed correlation test
by the method of Pearson and principal component analysis (PCA) with software
®XLSTAT Pro (2011) (p<0.05). For CATA, the attributes were analyzed using
Cochran’s Q test, Correspondence Analysis and Penalty Analysis using the Overall
Acceptance score ®XLSTAT Pro (2015).
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Quantitative Descriptive Analysis (QDA)
3.1.1 Sensory profile of cupulates samples
The results of the analyzed consensus charts of the six cupulate
samples indicated the need for team reduction to 12 tasters, and then three tasters
were excluded due to unsatisfactory results presented in the discriminatory
capacity (Psample <0.50) and reproducibility (Prepetition ≥ 0.05). There was
greater difficulty by the tasters in the discrimination of attributes sweet and coffee
aromas and cupuassu flavor. Thus, the average of repetitions assigned by the final
team of nine tasters of QDA to samples in relation to attributes is shown in Table 2.
81
Table 2 – Average scores given by the tasters to the attributes in the Quantitative Descriptive Analysis (QDA) of the six cupulate samples.
ATTRIBUTE 0R1 0R2 7.5R1 7.5R2 15R1 15R2 MDS1
Roasted aroma 3.9a,b
3.1b
4.6a,b
4.4a,b
3.3b
5.0a
1.7
Sweet aroma 5.0a
3.1a
2.9a
3.0a
4.1a
3.0a
1.7
Coffee aroma 3.0a,b
1.9b
3.1a,b
3.2a,b
2.3a,b
3.5a
1.7
Fruity aroma 1.8a,b
1.4b
2.1a,b
1.4b
3.1a
1.3b
1.4
Sweet taste 5.4a,b
4.7b
5.4a,b
5.0b
6.6a
4.2b
1.6
Residual bitterness 4.0a,b
4.6a
4.2a,b
4.4a
2.3b
4.7a
1.9
Cupuassu flavor 3.0a
2.9a
3.0a
3.1a
3.7a
2.6a
1.6
Coffee flavor 4.1a
3.9a
4.1a
4.0a
2.4a
4.1a
1.9
Texture: hardness 5.2a,b
6.0a
3.2c 4.7
a,b,c 5.0
a,b 4.1
b,c 1.7
Texture: melting 4.8a
3.4a
4.4a
4.2a
5.2a
4.3a
2.1
Equal letters in the same line indicates no significant difference between the sample (p> 0.05)
1MDS: Minimum Significant Difference by the Tukey test (p<0.05)
In general, we noted that the scale from 0 to 9 was not widely used by
the tasters, the average scores given to different attributes concentrated in the
central region of the scale. This is possibly because cupulate is a new product, still
not found in the market. In sensory evaluation by QDA, for attributes sweet aroma,
cupuassu flavor, coffee flavor and texture-melting there were no significant
difference between samples (p ≥ 0.05) (Table 2). We observed that 15R1 and
15R2 presented the highest levels for attributes coffee and roasted aromas,
residual bitterness and coffee flavor (15R2) and fruity and sweet aromas, sweet
flavor, cupuassu flavor and melting texture (15R1). The amount of pulp present in
those samples may have influenced the formation of flavor compounds, by the
highest offer of substrates, and in the difference in the characteristics of attributes
between samples with 15% pulp. The turning form applied at different times may
also favored microorganisms’ metabolism, resulting in the formation of different
compounds. Under controlled conditions of cocoa fermentation, microorganisms,
such as yeasts, can impart to the chocolate strong coffee and acidity notes (Batista
et al., 2015).
The three cupulate samples from fermentations performed with R2
turning showed lower intensities of fruity aroma and sweet taste. Conversely, these
samples showed slightly higher residual bitterness. This type of turning, applied in
82
the cupuassu seeds fermentation, whenever there was decline in the mass
temperature, had the objective to increase the aeration of the fermentation mass.
Figure 2 shows the charts generated from the principal component
analysis of data obtained in the QDA. Table 3 presents the correlation test results
conducted between the averages for the evaluated sensory attributes analyzed by
the Pearson coefficient.
83
Figure 2. Principal component analysis (PCA): (a) factors 1 and 2; (b) factors 1 and 3
0R1
0R2
7.5R1
7.5R2
15R1
15R2
ROASTED aroma
SWEET aroma
COFFEE aroma
FRUITY aroma SWEET taste
BITTERNESS residual
CUPUASSU flavor
COFFEE flavor
HARDNESS texture
MELTING
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
PC
2 (
29,6
2 %
)
PC1 (53,02 %)
Biplot (PC1 e PC2: 82,64 %)
(a)
0R1
0R2
7.5R1
7.5R2
15R1
15R2
ROASTED aroma
SWEET aroma
COFFEE aroma
FRUITY aroma
SWEET taste
BITTERNESS residual
CUPUASSU flavor
COFFEE flavor
HARDNESS texture MELTING
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
PC
3 (
11,6
9 %
)
PC1 (53,02 %)
Biplot (PC1 e PC3: 64,71 %)
(b)
84
In principal component analysis (PCA), PC 1 and 2 explain 82.64% of
the QDA results (Figure 2a). We identified a first group composed of the 0R2,
7.5R1, 7.5R2 and 15R2 samples, characterized by greater intensity of attributes
coffee flavor, bitterness residual flavor, coffee aroma and roasted aroma. On the
other, we identified the 15R1 sample characterized by attributes sweet aroma,
fruity aroma, cupuassu flavor, sweet taste and melting texture. The 0R1 sample,
better represented in PC3, was not correlated to the evaluated attributes (Figure
2b). The lowest concentration of pulp and shorter fermentation (60h to 0R1 against
84 and 108h for the other experiments) may have contributed to a smaller
development of important flavor precursor’s compounds, complicating the tasters'
perception of the attributes. A similar situation was observed in a previous study
with cocoa liquor, in which fermentation was also short, of about two days (Luna et
al., 2002). The fermentation process for all experiments was stopped when there
was a drastic increase of pH in the fermentation (data not shown). Typically,
depulped cupuassu seeds fermentation is conducted for a period of up to 168h
(seven days) and on a larger scale (Lopes et al., 2003; Cohen & Jackix, 2005;
Garcia, 2006).
Table 3. Matrix of Pearson correlations between the attributes in the six cupulate samples.
Variables Rostaa
Saroa
Coara
Afruta
Swtaa
Bitresa
Cupfa
Cofta
Harta
Meltea
Rostaa
Saroa -0.511
Coar a 0.945 -0.489
Afruta -0.417 0.797 -0.362
Swta a -0.493 0.704 -0.374 0.948
Bitres a 0.522 -0.867 0.400 -0.956 -0.947
Cupf a -0.607 0.833 -0.493 0.853 0.925 -0.930
Cofta 0.582 -0.984 0.515 -0.852 -0.796 0.933 -0.896
Harta -0.810 0.228 -0.693 -0.080 0.036 -0.140 0.256 -0.280
Meltea 0.025 0.474 0.227 0.743 0.736 -0.762 0.572 -0.560 -0.243
a Legend: Rosta: roasted aroma; Saro: sweet aroma; Coar: coffee aroma; Afrut: fruity aroma; Swta:
sweet taste; Bitres: bitterness residual; Cupf: cupuassu flavor; Coft: coffee taste; Hart: hardness texture; Melte: melting texture.
85
A positive correlation between attributes sweet aroma, fruity aroma,
sweet taste and cupuassu flavor was observed, signaling a cupuassu characteristic
that may be related to the volatile compounds naturally present in fruit. The existing
negative correlation between fruity aroma and bitterness residual confirms the
results found by Luna et al., (2002) in cocoa liquor. Negative correlations between
fruity aroma and bitterness residual flavor, cupuassu flavor and coffee flavor
indicate that larger scores to the bitterness taste and coffee flavor reflect lower
perception of aroma and flavor related to fruity. Some authors state that those
attributes mask the fruity flavor (Luna et al., 2002). The existing negative
correlation between bitterness residual flavor, sweet and fruity aroma, sweet taste
and cupuassu flavor diminish consumer preference for the product.
3.2 Affective test
Table 4 presents the results of acceptance test of the samples for
aroma, flavor and texture with the use of hedonic scale; to the intensity of
bitterness taste, acidity and sweetness taste with the use of the ideal scale and
purchase intent.
Table 4. Overall liking scores given to the different cupulates evaluated for acceptance* for the six cupulate samples evaluated.
Average scores / Sample
Attributes 0R1 0R2 7.5R1 7.5R2 15R1 15R2 MDS
Hedonic Scale
Overall acceptance
5.8 (1.8) a 5.1 (2.0)
ab 5.4 (2.1)
a 4.5 (2.2)
b 5.2 (2.3)
ab 5.8 (2.0)
a 0.73
Aroma 5.9 (1.6) ab
5.8 (1.5) ab
5.8 (1.5) ab
5.9 (1.5) ab
5.5 (1.8) b 6.1 (1.6)
a 0.57
Flavor 6.0 (1.9) a 5.1 (2.0)
bc 5.6 (2.1)
ab 4.7 (2.3)
c 5.2 (2.3)
bc 5.8 (2.0)
ab 0.74
Texture 6.6 (1.4) a 6.0 (1.9)
bc 6.5 (1.8)
ab 5.0 (2.0)
d 5.8 (1.9)
c 6.6 (1.6)
a 0.62
Ideal Scale
Bitterness 3.5 (0.7) a 3.6 (0.9)
a 3.5 (0.9)
a 3.6 (0.9)
a 3.5 (0.8)
a 3.3 (0.9)
a 0.35
Acidity 3.13(0.6)ab
3.40 (0.7) a 3.20(0.6)
b 3.28(0.7)
ab 3.30(0.7)
b 3.10 (0.6)
b 0.27
Sweetness 2.6 (0.8) ab
2.3 (0.8) b 2.8 (1.0)
a 2.5 (0.9)
ab 2.6 (0.9)
ab 2.6 (0.8)
ab 0.30
Purchase intention
2.9 (1.3) a 2.5 (1.2)
ab 2.6 (1.2)
a 2.1 (1.0)
b 2.6 (1.3)
a 2.9 (1.3)
a 0.43
* Results expressed as mean (standard deviation).
MDS: Minimum Significant Difference (Tukey test). For each attribute (line) values followed by equal letters are not statistically different from each other to the error level of 5%.
86
As for overall liking, 7.5R2 sample stood out as the least accepted. On
the other side, 15R2 and 0R1 samples had the highest averages, including for
flavor and texture attributes. For the aroma attribute, only samples from
fermentations conducted with higher pulp concentrations (15R1, and 15R2) had
difference (p<0.05).
Regarding bitterness, there was no significant difference between
samples (p<0.05). 0R2 sample was considered with optimal acidity and
significantly different (p<0.05) from samples from fermentation with greater
concentration of pulp (7.5R1, 15R1 and 15R2), except 7.5R2. As for sweetness,
7.5R1 was considered optimal. To the purchase intent, samples of experiments
0R1 and 15R2 obtained the highest averages with statistical difference only for
7.5R2 (Table 4).
Figure 3 shows the frequency of "acceptance" (scores from 6.0 to 9.0),
"indifference" (scores equal to 5.0) and "rejection" (scores from 1.0 to 4.0),
associated with the samples for attributes global acceptance, aroma, flavor and
texture through the hedonic scale used. There is also the frequencies of "ideal"
(score 3.0 of scale), "more intense than the ideal" (scores from 4.0 to 5.0 of scale)
and "less intense than the ideal" (scores from 1.0 to 2.0 of scale) for attributes
acidity and bitterness. Finally, the responses frequency for intention to purchase
"positive" (scores 4.0-5.0), "indifferent" (score 3.0) and "negative" (scores 1.0-2.0).
87
Figure 3. Frequency (%) of scores assigned to the samples in relation to acceptance, ideal scale and purchase intent for the six cupulate samples evaluated.
Considering ideal acidity, the 0R1, 7.5R1 and 15R2 samples stood out.
Purchase intent was considered low for all samples, possibly due to not be a
commercially known product, although the overall liking was above 50%. The worst
results were observed for the 0R2, 7.5R1 and 7.5R2 samples. However, 0R1 and
15R2 had the highest positive purchase intent indexes (greater than 30%). In an
overall assessment, 7.5R2 had the highest rejections in most attributes, while 0R1
and 15R2 obtained the best acceptance, even for attributes aroma, flavor and
texture (Figure 3).
3.3 CATA (Check All That Apply)
Table 5 shows the frequency of mentions raised by the tasters for each CATA
attribute for the six cupulate samples evaluated.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
accepta
nce
indiffe
rence
reje
ctio
n
accepta
nce
indiffe
rence
reje
ctio
n
accepta
nce
indiffe
rence
reje
ctio
n
accepta
nce
indiffe
rence
reje
ctio
n
less
ideal
mo
re
less
ideal
mo
re
less
ideal
mo
re
positiv
e
indiffe
rent
negative
globalacceptance
aroma flavor texture bitterness acidity sweet intention topurchase
Fre
quency (
%)
0R1 0R2 7.5R1 7.5R2 15R1 15R2
88
Table 5. Frequency1 of mentions for each CATA attribute.
Attributes p-values
%
0R1 0R2 7.5R1 7.5R2 15R1 15R2
sour 0,531 5,0(a) 10,0(a) 10,0(a) 11,7(a) 11,7(a) 5,0(a)
fruity 0,762 8,3(a) 6,7(a) 8,3(a) 6,7(a) 11,7(a) 10,0(a)
floral 0,594 1,7(a) 1,7(a) 0,0(a) 1,7(a) 3,3(a) 3,3(a)
cheese 0,221 0,0(a) 0,0(a) 1,7(a) 0,0(a) 3,3(a) 0,0(a)
bitterness 0,197 60,0(ab) 73,3(b) 63,3(ab) 58,3(ab) 63,3(ab) 55,0(a)
herby 0,378 0,0(a) 1,7(a) 3,3(a) 5,0(a) 3,3(a) 1,7(a)
tobacco 0,053 13,3(ab) 21,7(b) 13,3(ab) 16,7(ab) 6,7(a) 16,7(ab)
earthy 0,001 35,0(a) 46,7(ab) 45,0(ab) 53,3(b) 31,7(a) 31,7(a)
fermented 0,917 10,0(a) 6,7(a) 10,0(a) 11,7(a) 10,0(a) 10,0(a)
takes time to melt 0,006 8,3(a) 20,0(ab) 11,7(a) 18,3(ab) 28,3(b) 10,0(a)
melt well 0,000 31,7(c) 23,3(abc) 26,7(bc) 8,3(a) 13,3(ab) 38,3(c)
pepper/cinnamon 0,677 3,3(a) 3,3(a) 1,7(a) 3,3(a) 5,0(a) 1,7(a)
vanilla 0,416 1,7(a) 0,0(a) 0,0(a) 0,0(a) 1,7(a) 3,3(a)
coffee 0,382 33,3(a) 28,3(a) 33,3(a) 25,0(a) 36,7(a) 25,0(a)
nuts 0,874 11,7(a) 15,0(a) 13,3(a) 16,7(a) 11,7(a) 13,3(a)
caramel 0,007 8,3(a) 10,0(a) 8,3(a) 8,3(a) 21,7(b) 10,0(a)
sweet 0,003 25,0(bc) 8,3(a) 26,7(bc) 13,3(ab) 28,3(c) 21,7(abc)
citrus 0,609 3,3(a) 5,0(a) 1,7(a) 3,3(a) 6,7(a) 1,7(a)
too hard to bite 0,002 3,3(a) 3,3(a) 6,7(ab) 18,3(c) 15,0(bc) 5,0(ab)
soft to bite 0,300 21,7(a) 21,7(a) 18,3(a) 8,3(a) 15,0(a) 20,0(a)
firm 0,065 41,7(ab) 36,7(ab) 41,7(ab) 26,7(a) 40,0(ab) 51,7(b)
melt quickly 0,009 18,3(b) 8,3(ab) 16,7(b) 5,0(a) 8,3(ab) 5,0(a)
smooth/creamy 0,000 16,7(bc) 8,3(ab) 11,7(ab) 0,0(a) 5,0(ab) 25,0(c)
pleasant acidity 0,176 20,0(a) 11,7(a) 15,0(a) 6,7(a) 15,0(a) 18,3(a)
sandy 0,000 23,3(ab) 41,7(bc) 16,7(a) 56,7(c) 30,0(ab) 15,0(a) pleasant residual flavor 0,093 18,3(b) 5,0(a) 15,0(ab) 8,3(ab) 15,0(ab) 15,0(ab)
bad residual flavor 0,000 33,3(ab) 60,0(c) 43,3(bc) 60,0(c) 35,0(ab) 23,3(a) 1 Frequency expressed on percentage of 60 evaluations.
p-value: represents the probability of the effect (or difference) observed between the samples be due to chance and not to
the factors being studied. Values followed by the same letters are not statistically different from each other to the error level
of 5% (p> 0.05).
Among the attributes raised by the customers there were fruity, floral,
herb/chlorophyll, tobacco, pepper, cinnamon, nuts, caramel, and citrus flavors. All
samples were characterized with higher frequency of mentions for bitterness,
earthy, coffee, bad bitterness residual flavors, and firm to the bite texture. Samples
0R1, 7.5R1 and 15R1 were characterized by coffee flavor and the perception of
89
sweetness, and 15R1 was also characterized by caramel/molasses flavor.
Samples 0R1, 7.5R1 and 15R2 were characterized by melting well and are firm to
the bite, and 0R1 and 15R2 were also considered smooth/creamy with pleasant
acidity. Samples 0R2, 7.5R1 and 7.5R2 were characterized by earthy flavor,
whereas 0R2 also presented tobacco flavor, resulting that 0R2 and 7.5R2 had bad
residual. Samples 15R1 and 15R2 received the highest number of mentions for
fruity and floral flavors.
Among the most frequent comments from consumers about what they
liked best (positive) in the samples are the texture and flavor. Samples 0R1, 7.5R1,
15R1 and 15R2 received the highest number of positive mentions. As for what they
less liked (negative), bitterness received the largest number of comments directed
mainly to 15R2 and 0R1 samples (data not shown). In total, samples 0R2 and
7.5R2 received the highest amount of negative comments and, 0R1 and 15R1
received positive comments. Although flavor was an attribute that most pleased to
consumers, the bitterness was present in all samples, accounting for a reasonable
rejection rate, understandable by the fact that most participant consumers have
reported preference for chocolate milk.
Figure 4 shows the Correspondence Analysis with attributes that
consumers chose to characterize the cupulate samples.
90
Figure 4. Correspondence Analysis showing the attributes that consumer chose to characterize the cupulate samples.
The Correspondence Analysis (Figure 4) showed that 15R1 is stronger
caramel flavor than the other samples, as well as the sweetness compared to 0R2
and 7.5R2. Furthermore, according to the consumers, 7.5R2 also proved to be
harder to bite and was considered the most sandy. 15R2 was perceived as firm
and creamy. 0R1 and 7.5R1 melt quicker than 15R1 and 7.5R2. The pleasant
aftertaste of 0R1 was considered more intense than the 0R2. On this analysis, it is
also clear that the 15R2, 0R1 and 7.5R1 samples were characterized with the
positive attributes, while 0R2 and 7.5R2 were characterized with the negative
attributes. Except for 15R1 was considered with caramel taste, a positive attribute.
Additionally, this analysis coincide with the results of QDA in which the sample
15R1 was considered as the sweetest attributes (aroma and taste) compared to
other samples.
Figure 5 shows the penalty analysis for each sample, demonstrating the
mean impact on Overall Acceptance.
bitterness
tobacco
earthy
takes time to melt
melt well
caramel sweet too hard to bite
firm melt quickly
smooth/creamy
pleasant acidity
sandy
pleasant residual flavor
bad residual flavor
0R1
0R2
15R1
15R2 7.5R1
7.5R2
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
-0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F2
(20,5
7 %
)
F1 (63,40 %)
(axes F1 and F2: 83,97 %)
Attributes Products
91
Figure 5. Penalty Analysis - Mean impact on Overall Acceptance for all samples (0R1, 0R2, 7.5R1,
7.5R2, 15R1 and 15R2).
In general the consumers consider positives the attributes: sweet and
coffee taste, pleasant acidity, firm and melt well texture. However, it was found that
92
the taste attributes of the earthy and bad residual were negative consensus for all
samples (Figure 5). In fact, these attributes reflect an inherent characteristic of the
cupulate which can be strongly correlated to the compounds present in the
cupuassu pulp, that during fermentation migrate to the seed remaining in the
beans, being detected until the final product (Chapter 4). The pulp cupuassu
constitutes a part of the highly aromatic product, due to the chemical composition
and volatile aromatic compounds that are present. The cupulate can be considered
a contrasting product by the extreme characteristics of sweetness and bitter
aftertaste that has at the same time. It is noteworthy that only the earthy taste was
considered significant, unlike the bitter aftertaste. Although it be expected that
there are losses and transformations during fermentation some compounds give
the final product specific characteristics perceived in flavor.
4. CONCLUSION
The pulp attached to the seeds is an obstacle to the fermentation
process, although it contains important substrates for the metabolism of
microorganisms involved. In the sensory analysis, there was no significant
difference (p<0.05) between the forms of turning in the experiments (R1 and R2). A
very short fermentation time (3 days), as occurred with the 0R1 sample, may have
influenced the insufficient formation of flavor compounds. However, in the
acceptance testing, 0R1 and 15R2 showed the highest averages, affecting the
purchase intent. In CATA, between the frequencies of mentions raised by the
consumers, the attributes "bitterness, earthy, coffee, firm to the bite" and "bad
residual flavor" were the most cited for all samples. In an overall assessment, we
found that the applied forms of turning (R1 and R2) had little or no influence on the
sensory characteristics of the samples. The partial presence of pulp positively
impacted on the sensory attributes of cupulate, thus opening the perspective of
maintaining a pulp concentration during fermentation, to obtain a product with
acceptable sensory characteristics and as an alternative for use by the food
industry.
93
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to thank the National Council for Scientific and
Technological Development – CNPq, for the funds granted for the development of
this research. To the Amazonas State Research Foundation – FAPEAM, for the
award granted. To the Food Technology Institute – ITAL, for carrying out the Check
All That Apply (CATA) analysis.
REFERENCES
ABEP (2013). Associação Brasileira de Empresas de Pesquisa. Critério de
Classificação Econômica Brasil. Disponível em:
www.abep.org/codigosguias/Criterio_Brasil_2008.pdf. Acesso em: 15/12/2013.
Afoakwa, E., Paterson, A., Fowler, M., & Ryan, A. (2008). Flavor formation and
character in cocoa and chocolate: a critical review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 48(9), 840–857.
http://doi.org/10.1080/10408390701719272
Ares, G., Barreiro, C., Deliza, R., Giménez, A., & Gámbaro, A. (2010). Application
of a check-all-that-apply question to the development of chocolate milk
desserts. Journal of Sensory Studies, 25, 67–86. http://doi.org/10.1111/j.1745-
459X.2010.00290.x
Batista, N., Ramos, C., Ribeiro, D., Pinheiro, A., & Schwan, R. (2015). Dynamic
behavior of Saccharomyces cerevisiae, Pichia kluyveri and Hanseniaspora
uvarum during spontaneous and inoculated cocoa fermentations and their
effect on sensory characteristics of chocolate. LWT - Food Science and
Technology, 63(1), 221–227. http://doi.org/10.1016/j.lwt.2015.03.051
Beckett, S. (2009). Industrial Chocolate Manufacture and Use. (S. Beckett, Ed.)
(Fourth). York, UK: Blackwell Publishing.
94
Bispo, S., Ferreira, V., Santana, L., & Yotsuyanagi, K. (2005). Perfil sensorial de pó
de cacau (Theobroma cacao L) alcalinizado. Ciência e Tecnologia de
Alimentos, 25(2), 375–381.
Carvalho, A., García, N., & Wada, J. (2005). Caracterização físico-química e
curvas de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e
torradas de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of
Food Technology, 8(2), 127–134.
Cohen, K., Sousa, M., & Jackix, M. (2009). Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau (No. 267). Documentos. Planaltina, DF.
Cohen, O., & Jackix, H. (2005). Estudo do Líquor de Cupuaçu. Ciência e
Tecnologia de Alimentos Tecnol. Aliment., 25(1), 182–190.
Crafack, M., Keul, H., Eskildsen, C., Petersen, M., Saerens, S., Blennow, A., …
Nielsen, D. (2014). Impact of starter cultures and fermentation techniques on
the volatile aroma and sensory profile of chocolate. Food Research
International, 63, 306–316. http://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.04.032
Dooley, L., Lee, Y., & Meullenet, J. (2010). The application of check-all-that-apply (
CATA ) consumer profiling to preference mapping of vanilla ice cream and its
comparison to classical external preference mapping. Food Quality and
Preference, 21(4), 394–401. http://doi.org/10.1016/j.foodqual.2009.10.002
Dutcosky, S.D. (2013). Análise Sensorial de Alimentos. (PUCPRess, Ed.) (4ª. Ed.,
531p). Paraná, Brasil: Champagnat
Garcia, I. (2006). Enzimas produzidas durante os diferentes estágios de
fermentação das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willdenow
ex Sprengel) Schumann). 99 p (Mestrado em Ciência de Alimentos).
Universidade Federal do Amazonas, Brasil.
95
Jaeger, S., Beresford, M., Paisley, A., Antúnez, L., Vidal, L., Silva, R., … Ares, G.
(2015). Check-all-that-apply (CATA) questions for sensory product
characterization by consumers : Investigations into the number of terms used
in CATA questions. Food Quality and Preference, 42, 154–164.
http://doi.org/10.1016/j.foodqual.2015.02.003
Lagunes Gálvez, S., Loiseau, G., Paredes, J., Barel, M., & Guiraud, J. (2007).
Study on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the
Dominican Republic. International Journal of Food Microbiology, 114(1), 124–
30. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.041
Lannes, S., & Medeiros, M. (2003). Processamento de achocolatado de cupuaçu
por spray-dryer. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 39(1), 115–
123.
Lopes, A., Garcia, N., & Vasconcelos, M.. (2003). Avaliação das Condições de
Torração Após a Fermentação de Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma
grandiflorum Schum) e Cacau (Theobroma cacao L.). Brazilian Journal of
Food Technoogy, 6(2), 309–316.
Lopes, A., Pezoa-García, N., & Amaya-Farfán, J. (2008). Qualidade nutricional das
proteínas de cupuaçu e de cacau Nutritional quality of cupuassu and cocoa
proteins. Ciência e Tecnologia de. Alimentos, 28(2), 263–268.
Luna, F., Crouzillat, D., Cirou, L., & Bucheli, P. (2002). Chemical composition and
flavor of Ecuadorian cocoa liquor. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
50(12), 3527–3532. http://doi.org/10.1021/jf0116597
Matos, C., Souza, C., Faria, J., Oliveira, S., Santos, L., & Sacramento, C. (2008).
Características Físicas e Físico-químicas de Cupuaçus de Diferentes
Formatos. Revista de Ciências Agrárias, 50, 35–45.
96
Meilgaard, M.; Civille, G. V., Carr, B. T.(2007) Sensory Evaluation Techniques. 4ª
ed. Boca Raton: CRC Press, p. 55-57.
Minim, V., Silva, R., Milagres, M., Martins, E., Sampaio, S., & Vasconcelos, C.
(2010). Análise descritiva: comparação entre metodologias. Revista do
Institutovde Lacticinios “Candido Tostes,” 65(374), 41–48.
Moskowistz, H.R. (1983) Product testing and sensory evaluation of foods-
marketing and R&D approaches. Food & Nutrition Press, Inc. Westport, 605p,.
Murray, J., Delahunty, I., & Baxter, I. (2001). Descriptive Sensorial Analysis: past,
present and future.pdf. Food Research International, 34, 461–471.
Nazaré, R., Barbosa, W., & Viêgas, R. (1990). Processamento das sementes de
cupuaçu para a obtenção de cupulate. Belém, PA: Embrapa CPATU.
Nielsen, D., Crafack, M., Jespersen, L., & Jakobsen, M. (2013). Chocolate in
Health and Nutrition. Chocolate in Health and Nutrition, 39–60.
http://doi.org/10.1007/978-1-61779-803-0
Novello, D., Conto, L., Campagnol, P., Sewaybricker, M., Lopes, J., Suzart, C., …
Bolini, H. (2012). Perfil sensorial e teste de consumidor de biscoito wafer tipo
tradicional , light e diet sabor chocolate. Ambiência - Revista do Setor de
Ciências Agrárias e Ambientais, 8(2), 245–258.
http://doi.org/10.5777/ambiencia.2012.02.02
Padilha, V., Rolim, P., Salgado, S., Livera, A., Andrade, S., & Guerra, N. (2010).
Perfil sensorial de bolos de chocolate formulados com farinha de yacon (
Smallanthus sonchifolius ). Ciência e Tecnologia de Alimentos, 30(3), 735–
740.
Pereira, G., Miguel, M., Ramos, C., & Schwan, R. (2012). Microbiological and
physicochemical characterization of small-scale cocoa fermentations and
97
screening of yeast and bacterial strains to develop a defined starter culture.
Applied and Environmental Microbiology, 78(15), 5395–5405.
http://doi.org/10.1128/AEM.01144-12
Ramli, N., Hassan, O., Said, M., Samsudin, W., & Idris, N. (2006). Influence of
roasting conditions on volatile flavor of roasted malaysian cocoa beans.
Journal of Food Processing and Preservation, 30, 280–298.
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial
cocktail inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–83.
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4),
205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
Serra Bonvehí, J., & Ventura Coll, F. (2002). Factors affecting the formation of
alkylpyrazines during roasting treatment in natural and alkalinized cocoa
powder. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(13), 3743–3750.
http://doi.org/10.1021/jf011597k
Teixeira, L. (2009). Análise Sensorial Na Indústria De Alimentos. Revista do
Instituto de Laticinios “Candido Tostes,” 12–21.
Venturieri, G. (1993). Cupuaçu: a espécie, sua cultura, usos e processamento.
Belém, PA: Clube do Cupu. 56 p
Vilalba, F., Marsaioli Jr, A., & Garcia, N. (2004). Fragmentação Mecânica de
Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma grandiflorum). Ciência e Tecnologia de
Alimentos, 24(3), 419–426.
98
CAPÍTULO 4
FORMATION OF VOLATILE COMPOUNDS DURING CUPUASSU FERMENTATION: INFLUENCE OF PULP CONCENTRATION
Simone de Nazaré Melo Ramos, Wolfgang Danzl, Gottfried Ziegleder, Priscilla Efraim
________________________________________________________________
Este capítulo foi submetido à Food Research International em 01/10/2015.
99
CAPÍTULO 4
FORMATION OF VOLATILE COMPOUNDS DURING CUPUASSU FERMENTATION: INFLUENCE OF PULP CONCENTRATION
Simone de Nazaré Melo Ramosa, Wolfgang Danzl
b, Gottfried Ziegleder
b, Priscilla Efraim
a*
aFaculty of Food Engineering, University of Campinas. Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade Universitária Zeferino Vaz.
Campinas-SP. Brazil. CEP 13.083-862 b Fraunhofer Institute for Process Engineering and Packaging IVV. Giggenhauser Strasse 35, 85354 Freising. Germany
* Corresponding author.: Phone number +55 19 3521-3998. E-mail address: [email protected]
ABSTRACT
Cupuassu is a native fruit from the Amazon region and the pulp is used to prepare
juices, jams, etc. The seed has high nutritional value and through seeds
fermentation is possible to obtain a product similar to chocolate, known as
cupulate. Despite the presence of essential amino acids of high biological value,
proteins and lipids, seeds are still considered by-products and discarded in most
cases. For the seeds fermentation it is necessary the parcial or total depulping.
The pulp represents an obstacle to the process, mainly because of the high
amount (38%). With the objective of evaluate the influence of the pulp in the
formation of the volatile compounds during fermentation, seeds totally depulped
(0%) and partially depulped (15%) were fermented in triplicate in polystyrene boxes
and processed for obtaining cupulate with the conventional method of chocolate
production for checking the profile of volatile compounds formed. The results of
the identification and relative quantification of volatiles by GC-MS were subjected
to principal component analysis (PCA). A wider variety of volatile compounds such
as aldehydes, ketones and alcohols were found in the experiment with 15% pulp
during fermentation and pyrazines were found in the produced cupulates. Among
the compounds identified, it is important emphasize the presence of compounds
with fruity and floral notes, present in a fine type chocolate. Thus, apparently,
maintaining a minimum amount of pulp is essential to increase the chances of
development of important flavor compounds through the use of seeds of a fruit with
great potential.
100
Keywords: cupuassu, fermentation, pulp, cupulate, volatile compounds, PCA
1. INTRODUCTION
Cupuassu (Theobroma grandiflorum Schum) is an important fruit of the
Brazilian Amazon region and also found in Venezuela, Ecuador, Costa Rica,
Colombia, Guyana, Martinique, Costa Rica, Trinidad, Ghana, Sao Tome, Florida
and Australia (Venturieri, 1993; Martini & Tavares, 2005). Fruits have various
shapes (oblong, oval, elliptical, obovoid or round), weighing between 200 g to 4000
g, containing on average 38% of pulp and seeds in number of 15-50 per fruit
(Souza; Souza, 2002). The pulp is the most abundant part of the fruit (39 to 43%)
and most used for the preparation of juices and jellies. The seeds have high quality
fat, with an average content of 64.85% (Carvalho, Garcia, & Wada, 2005) being
widely used in the cosmetic industry (Gondim, Thomazini, Cavalcante, & Souza,
2001). Through seeds fermentation it is also possible to obtain a product similar to
chocolate, called "cupulate" (Cohen, Sousa, & Jackix, 2009). During that process,
as it occurs for example with cocoa, important chemical reactions happen under
microorganism action, that metabolize sugars producing ethanol, a substrate used
by acetic acid bacteria (AAB) for the production of acetic acid (Schwan & Wheals,
2004; Schwan, 1998). On the other hand lactic acid bacteria (LAB) metabolize
citric acid into lactic acid, which can be a negative factor for causing non-volatile
acidity in the final product (Schwan & Wheals, 2004). However, selected LAB may
be responsible for production of important compounds such as 3-methylbutanal
(Ayad, Verheul, Engels, Wouters, & Smit, 2001), a substance with strong chocolate
notes, by the decomposition of leucine through a transamination reaction followed
by a decarboxylation step in the Strecker reaction (Counet, Callemien, Ouwerx, &
Collin, 2002).
The seeds have a wide range of essential and nonessential amino acids
wherein, after the fermentation and roasting, it is observed increase in the
concentration of the hydrophobic amino acids (alanine, tyrosine, leucine, and
phenylalanine) (Mattietto, 2001) that, together with reducing sugars, are
101
transformed into important flavor compounds through non-enzymatic reactions
(Maillard reaction) (Rizzi & Bunke, 1998; Biehl & Ziegleder, 2003).
After the fermentation, the beans are dried, which is an important step
that also impacts in the quality of the final product since metabolic reactions that
contribute to the formation of flavor still occur (Hii, Law, Suzannah, Misnawi, &
Cloke, 2009). Later, the beans are roasted in order to form flavor compounds, to
eliminate the volatile compounds that give acidity, bitterness and astringency of the
product and facilitate shell detachment (Afoakwa, Paterson, Fowler, & Ryan,
2008). In this step, the condensation of carbonyl groups occurs with free α-amino
acids (Strecker reaction) resulting in the formation of aldehydes and other
important flavor compounds such as pyrazines, pyridines, pyrrols, and oxazoles for
producing chocolate (Counet et al., 2002; Martins, Jongen, & Boekel, 2001;
Oberparleiter & Ziegleder, 1997; Rizzi, 2008; Ziegleder, 2009).
The processing steps for obtaining cupulate are the same used for
chocolate (Afoakwa et al., 2008; Schwan & Wheals, 2004), as mixing, refining,
conching, tempering, moulding, demoulding and packaging. During conching step,
some compounds resulting from the Strecker reaction (aldehydes) are lost due to
evaporation. Other chemical reactions occur resulting in the formation of important
flavor compounds (Counet et al., 2002). However the main aroma improvement
during conching seems to arise from a change in the flavor distribution within the
chocolate matrix, as sugar surfaces are increasingly coated by flavor substances
and lipids (Danzl & Ziegleder, 2014; Ziegleder et al., 2003). After conching, the
tempering is performed, which aims to the formation of stable crystals to obtain
uniform product (Cohen, Luccas, & Jackix, 2004).
Studies have shown that in the case of cocoa, some chemical
compounds found in seeds are not only formed during fermentation but are also
originated from the pulp (Kadow, Bohlmann, Phillips, & Lieberei, 2013). Eskes et
al., (2007), cited by the same author had already reported that compounds related
to aroma, found in cocoa beans, were originated from the pulp, giving to the
products fruity and floral aromas, present in fine chocolate and absent in bulk
102
chocolate (Sukha, Butler, Umaharan, & Boult, 2008). This information reinforces
the importance that pulp’s role plays for the formation of flavor compounds.
Alcohols such as linalool, 3-methyl-2-buten-1-ol, 3-methylbutanol, and ethanol
have been found in cupuassu (Quijano & Pino, 2007). Most of these compounds
are important flavor compounds identified in cocoa beans extracts (Ziegleder,
1991).
Although the cupuassu pulp has in its composition organic compounds
considered essential for the flavor, their removal is a normal practice, and
otherwise the fermentation would not occur. Because of its abundance, the
cupuassu pulp becomes a hindrance, not occurring liquefaction and preventing
aeration of the environment. Thus, there is no temperature increase, which is
important for the loss of seed germination capacity, as a result of cell wall’s
increased permeability, which facilitates the biochemical reactions for the
production of flavor precursors compounds, as occurs with cocoa (Fowler, 2009).
Cupuassu seeds are considered by-products, being discarded after
depulping (Said, 2011) despite their high nutritional value and the presence of
essential amino acids and proteins also with high biological value (Carvalho,
García, & Wada, 2005; Lopes, Pezoa-garcía, & Amaya-farfán, 2008). Producers
usually use the pulp, given its economic value. The composition of the pulp is
complex due to the chemical compounds, and previous studies reveal that some of
them impact on taste (Quijano & Pino, 2007). Moreover, the substrates (sugars
and organic acids) which enter the metabolic pathway of microorganism’s action
can be depleted during normal depulping resulting in change and also in poor
quality of the final product. Despite the fact that the use of cupuassu for cupulate
production is incipient, previous results of sensory analysis showed that its
acceptance is satisfactory, indicating that it could be a potential product (Cohen et
al., 2004; Lopes et al., 2008; Nazaré et al., 1990). Thus, the aim of this study was
to investigate the influence of the pulp in the profile of the volatile compounds
formed during the fermentation of cupuassu seeds by the evaluation of totally
103
depulped (0% of pulp) and partially depulped (15% of pulp) cupuassu seeds of
fermentated and dried beans, roasted beans (nibs) and cupulates.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1 Cupuassu Seeds Fermentation
As mentioned before, the total removal of the pulp is a normal practice.
In order to establish the pulp concentrations that would be studied, preliminary
experiments of fermentation with 0, 20, 30, 40 and 100% of pulp in 4 Kg batches
were conducted (Ramos, 2015). The experiment with 20% of pulp presented the
best results (maximum temperature of the mass temperature: up to 38oC), thus
demonstrating that this level would be already high, due to the delay in the
increase of the temperature of the mass even after five days of fermentation.
Therefore, new experiments of fermentation with 7.5 and 15% were conducted and
the last one showed better results in the sensory analysis (data not shown).
Approximately 1 t of ripe and healthy fruits, collected in a single day or
up to three days after being dropped at the PERI farm, in the city of Presidente
Figueiredo, Amazonas state, Brazil were depulped and partially depulped to obtain
concentration with 0 and 15% pulp, respectively.
The fermentation was performed in polystyrene boxes in triplicate in 8 kg
batches. Generally seed fermentation is carried out in wooden boxes, but in the
present work polystyrene boxes were used with the aim of maintaining the elevated
temperature, also considering of the small amount of sample used in each
experiment. The period of fermentation, respectively for the experiments with 0%
pulp and 15% pulp, was 60 and 108 h, determined by the drop of temperature and
increase of the mass pH (> 7.0) for both experiments and respective triplicate (data
not showed) determined stopping the fermentation, to prevent the formation of
undesirable compounds.
2.2 Drying
The beans were submitted to natural drying (solar) for up to 24 h and also
to artificial drying (oven with air circulation MARCONI MA 035/5/10P São Paulo,
104
BRASIL at 40oC) for 5-7 days until they reached 6-8% moisture, because of the
rainy weather. In Brazil, for cocoa and cupuassu fermentation is common the
combination of natural (solar) and artificial (mechanical dryers) for the draying step
because of the high rainfall and relative humidity. Studies demonstrated that mixed
drying methods (natural and artificial) or only natural are recommended for the
production of raw material of good chemical quality (Zahouli et al., 2010).
2.3 Obtaining processing for nibs and cupulates
The dried beans were subjected to cleaning, classification, roasting at
120°C/120 min in 4.0 kg batches in a rotary electric oven (JAF INOX São Roque,
Brazil) and breaking for obtaining the nibs in a compact equipment (prototype test/
JAF INOX, Brazil). The nibs were ground in a blender, homogenized in planetary
mixer (Kitchen Aid - Artisan Model 5KSM150, EUA) and then refined in a refiner
(PILLON, Brazil), with three cylinders internally cooled with water at 15°C to obtain
powder with particle size less than 26 µm.
The cupulates were produced according to the following formulation:
48.6% cupuassu mass, 50% of refined sugar (Glaçucar Union), 1.4% cupuassu
butter (extracted from other cupuassu mass through hydraulic press), 0.4% soya
lecithin (CH Solec - the Solae Company) and 0.4% polyglycerol polyricinoleate
(Grindsted Super - Danisco). The conching step was performed in a jacketed mixer
(INCO, Brazil) at 70°C for 12 h. The tempering was performed manually in granite
surface in controlled temperature room (20.0 ± 1.0°C). Then, the samples were
placed in PVC bar molds, subjected to cooling and demolding according to Cohen
et al. (2004).
2.4 Analysis of volatile compounds
The extraction of volatile compounds in seeds (collected during
fermentation), dried beans, nibs and cupulates was performed in duplicate
according Ziegleder, Balimann, Mikle and Zaki (2003) and Ziegleder and Biehl
(1988).
2.4.1 Sample preparation and fractioned steam distillation
105
The samples were initially grounded in a mortar and then in a mini
processor. In a distillation tube, 20g of pulverized sample were weighed and 20 mL
of distilled water were added, followed by homogenization. The tube was attached
to a distillation apparatus (Antona apparatus, Greiner & Gassner, Munich). Figure 1
shows the schematic model explaining the principle of extraction of MHE (Multiple
Headspace Extraction) of volatile compounds in a fractional form.
Figure 1. Schematic principle of HME (Multiple Headspace Extraction) extraction
During steam distillation three successive distillated fractions of 9 mL
each were taken. Samples diluted in distilled water underwent exhaustive
extraction by drag steam providing a huge volume of distillation. In the first
distillation fractions, the total concentration of the samples could be determined in
the following fractions since the concentration of volatile compounds decreases
exponentially, as plotted in log-linear in Figure 1 (Ziegleder et al., 2003).
2.4.2 Extraction and flavor analysis
To each tube with the distillate was added 1 g of NaCl (min. 99%, Th.
Geyer, Germany) and 1 mL of diethyl ether (min. 99,8%, Th. Geyer, Germany)
dotted with 0.1 mg/kg benzyl alcohol as an internal standard. The closed tubes
were vortexed for 1 min. Then, the supernatant was transferred to a 2 mL
0
3
6
9
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
Lo
g C
on
cen
trati
on
Fraction
106
graduated test tube, taking care to not drag the aqueous phase. The procedure
was repeated one more time, but without the addition of NaCl. The tubes with the
extracts were kept refrigerated (± 4°C) until the moment of concentration.
The extracts were concentrated in open tubes by injecting nitrogen gas
to reach the volume of 200μL (Barkey TCS Laboratory Techniques). The
concentrated extracts were kept in sealed tubes at ± 0°C in a freezer until the
moment of injection.
The compounds determination was held in Gas Chromatograph GC-
17A (Shimadzu) coupled to Mass Spectrometer QP-5000 (Shimadzu), using a
fused silica capillary column (TG-WaxMS 60m x 0,25 mm x 0,25µm. Thermo
Scientific, USA). The oven temperature was initially kept at 45°C for 4 min, and
then programmed from 60oC to 220oC. Helium was used as carrier gas at a flow
rate of 1.1 ml / min. The injector and detector temperatures were 220 and 230°C,
respectively. Manually, it was injected 3 µL of each fraction of the extract.
2.5 Identification and quantification of volatile compounds
The volatile compounds were tentatively identified based on the
information of probabilities generated by the mass spectrometer through
comparison of their mass spectra with the spectral data of the National Library
database Institute of Standards and Technology (NIST) and retention time.
The concentrations of selected volatiles in every fraction were
determined in relation to the internal standard benzyl alcohol (99,5% by Merck,
Germany), based on peak area size. From the sequence of the three distilled
fractions, the overall concentration of a compound is calculated following multiple
headspace extraction (MHE) based on the equation below. The flavor
concentration decreases exponentially in successive fractions and therefore
appears linear when plotted as a logarithm (Figure 1). From this, the overall
concentration can be calculated as the integral of infinitely many individual
fractions Ai, approximated based on the following equation from the first two
fractions A1 and A2 (Ziegleder et al., 2003; Kolb & Ettre, 1997). The advantages of
107
the fractionated steam distillation in combination with quantification via MHE are
short distillation times, low thermal treatment of the samples, and high flavor
concentration within the first fractions of distillates.
∑
Where:
Ai: Total Concentration
A1: First fraction
A2: Second fraction
2.6 Principal component analysis of GC-MS peak areas
The total concentration of each compound was converted to mg.Kg-1.
For analysis of quality and quantity of volatile profiles on the samples from the
fermentation, in dried beans, nibs and cupulates, Principal Component Analysis
was performed using the statistical package ®XLSTAT Pro (2015).
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Identification of volatile compounds during fermentation
Table 1 shows the major compounds identified in volatile fractions in the
seeds of experiments with 0 and 15% of pulp during fermentation and their
respective concentrations. For verifying of the volatile compounds that have been
most associated with 0 and 15 % pulp experiments and their fermentation times,
PCA was applied (Figure 2) based on the results of GC-MS.
108
Table 1
Volatile compounds identified in the 0 and 15% pulp experiments during fermentation
RT Volatile
Compounds* 0h 12h 36h 60h 84h 108h
Alcohols 0 15 0 15 0 15 0 15 15 15 Odour descriptiona
7499 2-pentanol - - - - - - - - 0.024 ± 0.009 0.002 ± 0.000
7564 ethanol 2.388 ± 0.690 1.634 ± 0.494 0.659 ± 0.030 4.407 ± 0.349 0.103 ± 0.062 1.698 ± 0.101 0.100 ± 0.060 1.024 ± 0.093 - -
7634 2-heptanol - - - - - - - - 0.005 ± 0.002 0.009 ± 0.002 Sweet, citrus
11053 2-methyl-3-buten-2-ol 0.945 ± 0.370 1.911 ± 0.103 0.005 ± 0.001 0.843 ± 0.106 0.019 ± 0.005 0.291 ± 0.058 0.011 ± 0.001 0.098 ± 0.026 0.014 ± 0.005 0.002 ± 0.000
18874 3-methyl-1-butanol 0.095 ± 0.030 0.057 ± 0.032 0.042 ± 0.010 0.888 ± 0.122 0.020 ± 0.013 0.635 ± 0.273 0.070 ± 0.004 0.196 ± 0.018 0.036 ± 0.011 0.007 ± 0.001 Malty, chocolate
24616 3-methyl-2-buten-1-ol 0.022 ± 0.010 0.009 ± 0.000 - 0.022 ± 0.002 - 0.020 ± 0.005 - 0.032 ± 0.006 0.010 ± 0.005 0.001 ± 0.000
35328 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol
0.134 ± 0.050 0.064 ± 0.028 0.005 ± 0.001 0.058 ± 0.010 0.007 ± 0.002 0.070 ± 0.008 0.023 ± 0.002 0.033 ± 0.002 0.008 ± 0.002 0.041 ± 0.002 Floral, green
50304 phenylethyl alcohol 0.009 ± 0.001 - 0.005 ± 0.001 0.091 ± 0.009 0.012 ± 0.000 0.111 ± 0.061 0.09 1 ± 0.000 0.147 ± 0.066 0.024 ± 0.007 0.019 ± 0.007 Honey, floral
Aldehydes
6510 3-methylbutanal - - - - - - 0.008 ± 0.001 - 0.002 ± 0.001 0.001 ± 0.000 Malty, chocolate
34162 benzaldehyde 0.007 ± 0.001 - 0.004 ± 0.000 - 0.002 ± 0.000 0.019 ± 0.001 0.010 ± 0.001 - 0.002 ± 0.000 0.001 ± 0.000 Bitter
39608 benzeneacetaldehyde 0.069 ± 0.001 - 0.009 ± 0.001 - 0.013 ± 0.002 - 0.034 ± 0.002 - 0.021 ± 0.012 0.001 ± 0.000 Berry, nutty
Esters
6425 ethyl acetate 0.015 ± 0.003 0.223 ± 0.024 0.203 ± 0.001 0.295 ± 0.041 0.019 ± 0.003 1.309 ± 0.082 0.034 ± 0.002 0.431 ± 0.253 0.013 ± 0.005 0.001 ± 0.000 Pineapple
15350 3-methylbutyl acetate - - 0.005 ± 0.001 - - 0.017 ± 0.005 - 0.042 ± 0.006 0.002 ± 0.000 0.007 ± 0.000 Fruit notes
Acids
30619 acetic acid - - 0.317 ± 0.018 0.115 ± 0.012 0.187 ± 0.016 0.412 ± 0.231 0.060 ± 0.005 0.274 ± 0.026 0.421 ± 0.099 0.073 ± 0.009 Sour, vinegar
36191 2-methylpropanoic acid
- - - - - - 0.182 ± 0.001 0.018 ± 0.001 0.186 ± 0.074 0.062 ± 0.007 Pungent, rancid
38965 butanoic acid 0.013 ± 0.001 0.018 ± 0.001 0.005 ± 0.001 0.057 ± 0.006 0.007 ± 0.002 0.031 ± 0.002 0.077 ± 0.001 0.022 ± 0.005 0.053 ± 0.014 0.021 ± 0.004 Buttery, rancid
40827 3-methylbutanoic acid 0.024 ± 0.010 - 0.002 ± 0.000 0.045 ± 0.005 0.035 ± 0.005 0.043 ± 0.005 0.502 ± 0.252 0.034 ± 0.013 0.175 ± 0.049 0.002 ± 0.000 Sweaty
Ketones
22691 3-hidroxy 2 butanone 0.262 ± 0.096 0.170 ± 0.049 0.126 ± 0.001 0.128 ± 0.035 0.194 ± 0.058 0.354 ± 0.023 0.373 ± 0.021 0.659 ± 0.218 0.165 ± 0.004 0.011 ± 0.004 Butter, cream
RT: Retention Time aObtained from literature *mg.Kg
-1
109
Fig. 2. Principal component analysis of GC-MS peak area showing the main volatile compounds associated to 0 and 15% pulp experiments during fermentation. Axes D1 and D2 (a); and D1 and D3 (b)
0% (0h)
15% (0h)
0% (12h)
15% (12h)
0% (36h)
15% (36h)
0% (60h)
15% (60h)
15% (84h)
15% (108h)
ALC (1)
ALC (2)
ALC (3)
ALC (4)
ALC (5) ALC (6)
ALC (7)
ALC (8)
ALD (1)
ALD (2) ALD (3)
EST (1)
EST (2)
ACI (1)
ACI (2) ACI (3)
ACI (4)
KET 91)
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
-1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
D2
(2
2,8
3 %
)
D1 (16,19 %)
axes D1 and D2: 39.02 % (a)
0% (0h)
15% (0h)
0% (12h)
15% (12h)
0% (36h) 15% (36h)
0% (60h)
15% (60h)
15% (84h)
15% (108h)
ALC (1)
ALC (2)
ALC (3)
ALC (4) ALC (5) ALC (6)
ALC (7)
ALC (8)
ALD (1) ALD (2)
ALD (3)
EST (1) EST (2)
ACI (1)
ACI (2)
ACI (3)
ACI (4)
KET (1)
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
D3
(1
6,2
6 %
)
D1 (16,19 %)
axes D1 and D3: 32.45 % (b)
110
ALC (1) 2-pentanol; ALC (2) ethanol; ALC (3) 2-heptanol; ALC (4) 2-methyl-3-buten-2-ol; ALC (5) 3-methyl-1-butanol; ALC (6) 3-methyl-2-buten-1-ol; ALC (7) 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol; ALC (8) phenylethyl alcohol; ALD (1) 3-methylbutanal; ALD (2) benzaldehyde; ALD (3) benzeneacetaldehyde; EST (1) ethyl acetate; EST (2) 3-methylbuthyl acetate; ACI (1) acetic acid; ACI (2) 2-methylpropanoic acid; ACI (3) butanoic acid; ACI (4) 3-methylbutanoic acid; KET (1) 3-hidroxy-2-butanone.
With 39.02% (axes D1 and D2) and 32.45% (axes D1 and D3) of the
variance explained, the PCA (Figure 2a, 2b) shows that at the beginning of the
fermentation (12 h) experiment 15% pulp was strongly correlated to alcohols,
certainly for the conversion of sugars in the pulp. The ethanol concentration was
especially higher for the experiment 0% pulp than to 15% pulp (Table 1). The
residues that remain in smaller amount, easily serve as substrates for
microorganisms, being more rapidly degraded with conversion of sugars into
alcohol, as occurred with the experiment 0% pulp (Table 1). In the case of
cupuassu, it is impossible to guarantee the complete depulping because it would
damage the seed, since the pulp is strongly adhered. Thus, highest pulp
concentration (15% pulp) seem to slow the action of yeast on the sugars (data not
shown here), also interfering with the subsequent formation of other compounds.
Due to the higher volume of pulp, it seems that more time is necessary for
microorganism’s adaptation to the established conditions, as it was observed in the
experiment 15% pulp, with later ethanol production (Table 1).
As fermentation progresses, ethanol concentration decreases as a
result of its metabolization by acetic bacteria for the production of acetic acid. With
the liquefaction of the pulp, the environment became more aerated contributing to
volatilization of the compound in both experiments. The initial concentration of
other alcohols (2-methyl-3-buten-2-ol; 3-methyl-2-buten-1-ol; 3-methyl-1-butanol;
3,7-dimethylocta-1,6dien-3-ol) also decreased until the end. Except for the
phenylethyl alcohol, which was in low concentration from the start of the
fermentation. However, it was accentuated in both experiments, and for 15% pulp,
there was a decline in the end. In cocoa, phenylethyl alcohol concentration tended
to increase up to 25 times during the fermentation (Ho, Zhao, & Fleet, 2014). The
111
3-methyl-2-buten-1-ol is present in cupuassu pulp (Quijano & Pino, 2007), whereas
the 2-methyl-3-buten-2-ol was found in cocoa pulp (Kadow et al., 2013).
During the fermentation, the experiment with 15% pulp showed a
discreet increase of 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol (linalool) concentration
compared to the 0% pulp experiment (Table 1). The linalool is a compound present
in the cupuassu pulp (Quijano & Pino, 2007), with potential impact on aroma
(Oliveira, Pereira, Marsaioli, & Augusto, 2004). The secondary alcohols, 2-pentanol
and 2-heptanol, were detected only in the last hours of fermentation in the 15%
pulp experiment. According to Strohalm et al. (2007), cited by Schwab et al.,
(2008) those are important active aroma compounds. These results point to the
possibility of extending the fermentation time, in order to favor the formation of
other aromatic compounds, which are important for the flavor.
There was an increase in the ethyl acetate concentration, especially 12
h (0% pulp) and 36 h (15% pulp) after the beginning of fermentation (Table 1).
Yeasts, microorganisms with intense activity in the process, are also involved in
the production of this compound, especially Kloeckera apiculata and
Sacharomicces cerevisiae (Schwan & Wheals, 2004). The ethyl acetate is an ester
naturally found in cupuassu pulp (Quijano & Pino, 2007). Pulp residue present at
0% pulp seeds explains the presence of ester (0.015 mg kg-1) in the unfermented
sample. The 15% pulp experiment showed a higher concentration in 36 h, in later
period due to the pulp. In the PCA, between 12 and 60 h of fermentation, the 15%
pulp experiment showed a more diverse profile of volatile compounds (alcohols,
aldehydes and esters) compared to 0% pulp (Figure 2b), leading to the conclusion
that greater amount of pulp impacts on the formation of compounds related to the
formation of flavor.
The 3-methylbutyl acetate, compound derived from esterification of 3-
methyl-1-butanol (an amyl alcohol), showed an increase concentration between 12
up 36 h (Table 1). The esterification of these amyl alcohols produces compounds
with malt and chocolate flavor notes (Rodriguez-Campos et al., 2012; Rodriguez-
Campos, Escalona-Buendía, Orozco-Avila, Lugo-Cervantes, & Jaramillo-Flores,
112
2011). In other study with cocoa fermentation, it was observed formation of 3-
methylbutyl acetate during the process (Rodriguez-Campos et al., 2011). That is a
compound with fruity notes (citric, lemon) (Misnawi & Ariza, 2011).
Benzaldehyde and benzeneacetaldehyde were present in the beginning
of the fermentation in 0% pulp experiment, and their concentration increased at the
end. In the experiment 15% pulp those aldehydes were detected mainly in the last
hours of the fermentation (Table 1). The presence of benzaldehyde was associated
with bitter taste cocoa powder by sensory analysis (Bonvehí, 2005). In PCA (Figure
2a, 2b) both experiments were specially correlated with aldehydes with 60 h,
demonstrating that time was happening more formation those compounds.
The concentration of 3-methylbutanal was a slightly higher in the 0%
pulp experiment (0.008 mg kg-1) compared with the 15% pulp experiment (0.002
mg kg-1) in the last days of fermentation. This compound is derived from the amino
acid leucine (Ayad et al., 2001; Rizzi, 2008; Schwab, Davidovich-Rikanati, &
Lewinsohn, 2008) that presents strong and striking odor (Oliveira et al., 2004), malt
notes (Frauendorfer & Schieberle, 2006) or strong chocolate notes (Schnermman
& Schierbele, 1997 cited by Fadel, Abdel Mageed, Abdel Samad, & Lotfy, 2006).
The 3-methylbutanal can be found in cocoa beans during fermentation, and its
concentration tends to increase during roasting (Frauendorfer & Schieberle, 2008).
The formation of acetic acid was observed in both experiments starting
from 12 h of fermentation (Table 1) with higher concentrations between 60 up 84 h
in the 15% pulp experiment and, decreasing on the last day. The highest ethanol
concentrations recorded for the 15% pulp experiment also promoted higher
formation of acetic acid. The butanoic acid and 3-methylbutanoic acid were
detected in the first hours of fermentation in both experiments, with increased
concentration at the end (Tables 1 and 2). 2-methylpropanoic acid, an important
compound responsible for the strong chocolate flavor (Frauendorfer & Schieberle,
2008; Rodriguez-Campos et al., 2012), was detected only on the last day in the 0%
pulp experiment (Table 1), whereas in the 15% pulp experiment the compound was
detected 60 h fermentation, reaching peak concentration in 84 h (Table 2). All
113
these acids are produced by oxidative action of AAB Acetobacter and
Gluconobacter present in the fermentation. They are of great importance for the
flavor industry because of the intense aroma (Schwab et al., 2008).
Some of the aforementioned acids (butanoic, 2-methylpropanoic, 3-
methylbutanoic), considered potent flavor compounds are obtained by the
conversion of alcohols into a dehydrogenation reaction (Schrader, 2007). Late
production of 2-methylpropanoic acid in the 0% pulp experiment indicates that the
fermentation was interrupted at the moment this important compound was
beginning to emerge.
The 3-hydroxy-2-butanone compound (acetoin) was present in the
beginning of fermentation in both experiments, with sudden elevation (0.373 mg
kg-1) in 0% pulp experiment at the end of fermentation (Table 1). In the 15% pulp
experiment, most concentration was achieved in 60 h (Table 1). The acetoin is
resulted from Lactobacillus fermentum strains acting on the citric acid (Crafack et
al., 2013), and odor assigned to the butter cream. Studies also showed that the
production is increased during drying with temperature up to 60°C (Rodriguez-
Campos et al., 2012), and this would explain the higher concentrations of the
compound in the experiments in moments in which the temperature of the
fermentation mass was also high.
In the final stages of fermentation, especially for the 15% pulp
experiment, aldehydes and secondary alcohols were more related to that (Figure
2a), due to the longer fermentation time which favored the development of
compounds.
3.2 Major volatile compounds identified in dried beans, nibs and cupulates
Table 2 shows the main volatile compounds identified in dried beans,
nibs and cupulates of 0% and 15% pulp experiments, and the respective
concentration (mg.Kg-1).
114
Table 2.
Volatile compounds identified in dried beans, nibs and cupulates in the samples of experiments 0 and 15% pulp.
DRIED BEANS* NIBS* CUPULATES*
RT Alcohols 0 15 0 15 0 15 Odour descriptiona
11053 2 Methyl-3-buten-2-ol 0.009 ± 0.003 0.025 ± 0.002 0.007 ± 0.000 0.008 ± 0.000 - -
18874 3-Methyl-1-butanol 0.044 ± 0.013 0.088 ± 0.034 0.018 ± 0.001 0.043 ± 0.014 0.046 ± 0.012 0.008 ± 0.003 Malty, chocolate
35328 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol 0.003 ± 0.001 0.031 ± 0.009 0.002 ± 0.000 0.048 ± 0.007 - 0.006 ± 0.002 Floral, green
50304 Phenylethyl alcohol 0.008 ± 0.000 0.049 ± 0.0015 0.021 ± 0.007 0.029 ± 0.001 0.012 ± 0.005 0.005 ± 0.001 Honey, floral
Aldehydes
6510 3-methylbutanal 0.001 ± 0.000 0.012 ± 0.001 0.140 ± 0.050 0.053 ± 0.001 0.032 ± 0.002 0.011 ± 0.005 Malty, chocolate
34162 Benzaldehyde 0.004 ± 0.000 0.025 ±0.002 0.001 ± 0.000 0.016 ± 0.007 0.015 ± 0.008 0.010 ± 0.003 Bitter
39608 Benzeneacetaldehyde 0.012 ± 0.001 0.030 ± 0.003 0.002 ± 0.000 0.017 ± 0.001 0.014 ± 0.005 0.012 ± 0.003 Berry, nutty
Esters
6425 Ethyl acetate 0.009 ± 0.000 0.001 ± 0.000 0.006 ± 0.000 - - - Pineapple
15350 3-methylbutyl acetate - 0.010 ± 0.000 - - - - Fruit notes
Acids
30619 Acetic acid 0.004 ± 0.000 0.091 ± 0.029 0.029 ± 0.008 0.008 ± 0.000 0.007 ± 0.001 0.005 ± 0.001 Sour, vinegar
36191 2-mehylpropanoic acid - 0.026 ± 0.002 - 0.010 ± 0.000 - 0.003 ± 0.000 Pungent, rancid
40827 3-methylbutanoic acid - 0.090 ± 0.032 0.008 ± 0.003 0.096 ± 0.001 0.046 ± 0.016 0.015 ± 0.006 Sweaty
Ketones
22691 3-Hidroxy-2 butanone - 0.033 ±0.003 0.003 ± 0.000 0.011 ± 0.001 0.004 ± 0.000 0.007 ± 0.003 Butter, cream
39925 Acetophenone - 0.014 ± 0.001 - 0.003 ± 0.000 - - Floral, almond, sweet
Pyrazines
23841 2,5-dimethylpyrazine - - 0.001 ± 0.000 0.001 ± 0.000 0.003 ± 0.000 - Roasted nuts
25952 2,3-dimethylpyrazine - - 0.001 ± 0.000 0.004 ± 0.000 0.006 ± 0.000 0.014 ± 0.006 Caramel, cocoa
28036 trimethylpyrazine - 0.007 ± 0.000 0.002 ± 0.000 0.090 ± 0.007 0.012 ± 0.004 0.027 ± 0.008 Earthy, roasted nuts, peanut
31577 2,3-dimethyl-5-ethylpyrazine - 0.005 ± 0.000 - 0.050 ± 0.017 0.005 ± 0.000 - Roasted cocoa
32258 tetramethylpyrazine 0.033 ± 0.002 0.134 ± 0.040 0.014 ± 0.002 0.047 ± 0.005 0.038 ± 0.013 0.114 ± 0.043 Chocolate
34076 2,3,5-trimethyl-6-ethylpyrazine - - - 0.026 ± 0.011 0.004 ± 0.000 0.011 ± 0.003 Roasted peanut
RT: Retention Time aObtained from literature *mg.Kg
-1
115
To associate the volatile compounds with the products derived from the
0 and 15% pulp experiments (dried beans, nibs and cupulates), PCA was applied
based on the results of GC-MS (Figure 3).
Fig. 3. Principal component analysis (a,b) of GC-MS peak area showing the main volatile compounds associated to samples of dried beans, nibs and cupulates of 0 and 15% pulp samples. Axes D1 and D2 (a); and D1 and D3 (b)
0% (dried beans)
15% (dried beans) 0% (nibs)
15 % (nibs)
0% (cupulate)
15% (cupulate) ALC (1) ALC (2)
ALC (3)
ALC (4)
ALD (1)
ALD (2) ALD (3)
EST (1) EST (2)
ACI (1)
ACI (2) ACI (3)
KET (1)
KET (2) PYR (1)
PYR (2)
PYR (3)
PYR (4)
PYR (5)
PYR (6)
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
-1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
D2
(2
2,4
9 %
)
D1 (50,51 %)
Biplot (axes D1 and D2: 73,0 %) (a)
0% (dried beans)
15% (dried beans)
0% (nibs)
15% (nibs)
0% (cupulate)
15% (cupulate)
ALC (1)
ALC (2) ALC (3)
ALC (4)
ALD (1)
ALD (2)
ALD (3)
EST (1)
EST (2)
ACI (1)
ACI (2)
ACI (3)
KET (1) KET (2)
PYR (1)
PYR (2)
PYR (3)
PYR (4)
PYR (5)
PYR (6)
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
D3
(1
3,5
9 %
)
D1 (50,51 %)
Biplot (axes D1 and D3: 64,1 %) (b)
116
ALC (1) 2-methyl-3-buten-2-ol; ALC (2) 3-methyl-1-butanol; ALC (3) 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol; ALC (4) Phenylethyl alcohol; ALD (1) 3-methylbutanal; ALD (2) Benzaldehyde; ALD (3) Benzeneacetaldehyde; EST (1) Ethyl acetate; EST (2) 3-methylbutyl acetate; ACI (1) Acetic acid; ACI (2) 2-methylpropanoic acid; ACI (3) 3-methylbutanoic acid; KET (1) 3-hidroxy-2-butanone; KET (2) Acetophenone; PYR (1) 2,5-dimethylpyrazine; PYR (2) 2,3-dimethylpyrazine; PYR (3) trimethylpyrazine; PYR (4) 2,3-dimethyl-5-ethylpyrazine; PYR (5) tetramethylpyrazine; PYR (6) 2,3,5-trimethyl-6-ethylpyrazine
3.2.1 Dried beans
Respectively 11 and 17 volatiles compounds were identified in the
samples of dried beans with 0% and 15% pulp (Table 3). 15% pulp dried beans
exhibited a wider variety of volatile compounds (aldehydes, alcohols, ketones and
ester) that contributed to the subsequent formation of flavor compounds (Figure
3b). Both experiments still showed the presence of some alcohols, although in low
concentration, but 15% pulp sample showed higher concentrations of those
compounds. Ethyl acetate was detected in both samples, even in low
concentration, while only 3-methylbutyl acetate was not detected in the 0% pulp
sample. With 73.0 % (axes D1 and D2) and 64.1% (axes D1 and D3) of explained
variance, the PCA (Figure 3a, 3b) shows that there was a separation of products
for identified volatile compounds. The nibs and dried beans of 0% pulp were best
related to the ethyl acetate because of the short fermentation period.
With respect to aldehydes, there was a decrease in the concentration
thereof, especially in the 0% pulp sample, compared with the last day of
fermentation. The same situation was observed for 3-hydroxy-2-butanone
(acetoin), and only in the 15% pulp sample was detected acetophenone (Table 3).
The latter is considered a compound which appears at the end of fermentation and
produces flavor with sweet, floral notes. The concentration tends to increase in
beans submitted to drying at 80°C, and higher concentrations have been detected
in roasted cocoa (Bonvehí, 2005; Rodriguez-Campos et al., 2012).
Of all the acids identified, only acetic acid was present in both samples.
Acetic acid gives sour odor and is found in cocoa products (Frauendorfer &
Schieberle, 2006). Sample of 15% pulp also had the highest concentration, due the
amount of pulp (Table 2).
117
During drying stage was observed the development of pyrazines.
Biochemical reactions still occur in this stage, including the Maillard reaction, in
which the flavor is developed. The development of pyrazines in the drying step is
understandable, since there is an increase in temperature caused by the irradiation
from drying, which triggers chemical reactions between the precursors (Rodriguez-
Campos et al., 2012). The works carried out with cupuassu liquor also detected the
presence of pyrazines before roasting of dried beans (Queiroz & Garcia, 1999).
Within the process the Strecker reaction occurs, in which carbonyl compounds
undergo reductive amination to convert 2-amino ketones, that react with aldehydes
to form heterocyclic flavor compounds, including pyrazines (Van Boekel, 2006;
Yaylayan, 2003).
Tetramethylpyrazine was detected in both samples, while
trimethylpyrazine and 2,3-dimethyl-5-ethylpyrazine were identified only in 15% pulp
(Table 2). Zak et al. (1972) cited by Oberparleiter and Ziegleder (1997), report that
tetramethylpyrazine is seen as one of the first pyrazines compounds produced
after fermentation by the action of microorganisms.
3.2.2 Nibs
The nibs represent peeled and broken dried beans, and, in this case,
after going through the roasting step at 120oC for 2 hours. The nibs of 0% and 15%
pulp samples showed a decrease in the concentration of some volatile compounds
after drying and emergence of other compounds, probably during the roasting step.
The benzaldehyde and benzeneacetaldehyde compounds showed a
reduction in concentration for both samples, increasing in relation to 3-
methylbutanal. Acetic acid also declined at this stage, and nibs of 0% pulp had a
concentration greater than 15% pulp nibs. Acetophenone and 2-methylpropanoic
acid were detected only in 15% pulp nibs (Table 2). It is noteworthy that the 15%
pulp nibs, its higher amount of pulp and longer fermentation time, may have
strongly contributed to the development of these compounds.
118
Out of the six types of pyrazines compounds identified, only 2,3-dimethyl-
5-ethylpyrazine and 2,3,5-trimethyl-6-ethylpyrazine were not detected in 0% pulp
nibs. The other pyrazines, especially trimethylpyrazine, tetramethylpyrazine and
2,3,5-trimethyl-6-ethylpyrazine showed the highest concentrations in the 15% pulp
nibs (Table 2).
The roasting accelerated the production of pyrazines compounds,
especially for 15% pulp nibs. The time of roasting also influences the formation of
aromatic compounds of interest. This was found in roasting cupuassu beans, in
which there was a higher formation of some pyrazines compounds (dimethyl 2,5;
2,3,5-trimethyl, tetramethyl 2,3,5,6) at 150oC / 42 min (Lopes, Garcia, &
Vasconcelos, 2003; Queiroz & Garcia, 1999). Although the time used for roasting
of 0% and 15% pulp beans was longer (120 min) the temperature was milder
(120°C), causing no problems of over-roasting to the samples.
3.2.3 Cupulates
The volatile compounds were measured on cupulate according to
cupuassu mass concentration present in the formula. 14 volatile compounds were
identified for 0% and 15% pulp cupulates. The acetic acid was still present in both
samples, although at a much lower concentration. The same was observed for
alcohols. In the case of aldehydes, there was a slight increase in the concentration
of some compounds, especially 3-methylbutanal in 0% pulp cupulate. Notably, the
15% pulp cupulate revealed the presence of 2-methylpropanoic acid, an important
aromatic compound found in cocoa liquor (Misnawi & Ariza, 2011). The 3,7-
dimethyl octa-1,6-dien-3-ol (linalool) is also a flavor compound of roasted cocoa
and was detected only in 15% pulp cupulate. This suggests that there was
migration of that compound from pulp into the cotyledons during fermentation as it
occurs with other volatile compounds in cocoa (Kadow et al., 2013; Quijano & Pino,
2007).
The 15% pulp cupulate showed the highest concentrations of pyrazines,
especially tetramethylpyrazine with a higher concentration (0.114 mg kg-1) when
compared to 0% pulp cupulate (0.038 mg kg-1) (Table 2). In the PCA, it is better
119
observed that cupulates of both experiments and 15% pulp nibs were strongly
correlated to pyrazines, due not only to the thermal process (roasting) (Figure 3b),
but specially because of the amount of pulp, wich probably provided more
substrates.
Counet et al. (2002) verified, for dark chocolate, that concentrations of
2,5-dimethylpyrazine, trimethylpyrazine and tetramethylpyrazine increased after
conching, while the concentration of 2,3-dimethylpyrazine was reduced. The
analysis of the cupulates samples showed similar results only for
tetramethylpyrazine, whose concentration increased for both 0% and 15% pulp
samples. The latter is a compound that exhibits a milk coffee mocha and roasted
flavor (Counet et al., 2002). That is a desirable on flavor quality for cocoa beans
(Afoakwa et al., 2008; Bonvehí, 2005). The 2,3-dimethylpyrazine increased for
both samples after processing. The 2,5-dimethylpyrazin fairly increased to 0% pulp
and was no longer detected in 15% pulp cupulate.
The trimethylpyrazine showed reduced concentration in the 15% pulp
cupulate after conching (Table 2). Authors associated the trimethylpyrazine and
isomers of 2-ethyl-3 (5,6) -dimethylpyrazine to earthy aroma (Frauendorfer &
Schieberle, 2008). The concentration of pyrazines, such as tetramethylpyrazine
found in both samples (<0.2 ppm) is considerably below in relation to that found in
chocolate (> 6 ppm) (Afoakwa et al., 2008), possibly because of volatilization
during conching.
Studies showed that cupuassu pulp has in its composition flavor
compounds that are found in the beans after fermentation (Quijano & Pino, 2007),
reinforcing what also occurs with cocoa beans, with compounds migrating from the
pulp to the inner seed during fermentation (Kadow et al., 2013). Based on this
principle, it is assumed that the amount of pulp in the seed, although partial, is
fundamental to determine the development of desirable flavor in the final product.
The total quantity of pyrazines found in both samples of cupulates was
the same (Table 2), but the concentration was higher in the 15% pulp sample due
not only to a greater period of fermentation, but also to the greater amount of pulp.
120
However, the standardization of fermentation time would be necessary in order to
prevent the formation of undesirable compounds and providing conditions for the
development of important compounds.
Regarding the concentration of the compounds formed, some authors
argue that the differences between roasted and non-roasted beans are in the
quantitative and not in qualitative change in the composition of key aroma
compounds (Frauendorfer & Schieberle, 2008). That was also observed in the
composition of pyrazines in cupulate samples. Although it showed smaller range of
compounds than 0% pulp sample, 15% pulp sample showed higher
concentrations, especially for trimethylpyrazine, tetramethylpyrazine and 2,3
dimethylpyrazine. The presences of some of the compounds identified in this work
are quite positive features, appreciated and desired by the chocolate consumer.
4. CONCLUSIONS
The pulp adhered to the seed provides important substrates that during
the fermentation step are transformed into chemically important flavor compounds.
During cupuassu fermentation, total depulping of seeds is necessary due to the
excessive amount of pulp, which prevents the process. Thus, cupuassu
fermentation with partially depulped sample (15%) showed greater concentration
and variety of some volatile compounds than the sample completely depulped
(0%). The first is highlighted by the remarkable presence of pyrazines, given their
great aromatic potential. Furthermore, some identified compounds give floral and
fruity notes associated to the characteristics of fine chocolate. Experiment with 0%
pulp showed shorter fermentation time, hindering the development of precursors
which confer desirable characteristic flavor. Nevertheless, applying greater time
control is required in the fermentation step giving a chance to facilitate the
formation of important flavor compounds.
121
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to thank the National Council of Scientific and Technological
Development - CNPq and the Support Foundation of São Paulo Research –
FAPESP for the resources granted to the development of this research. The
Fraunhofer Institute for making systems and equipment available for this research.
Special thanks to Christopher Schmidt, Brigitte Stumpf and Sonja Riedmaier for the
excellent technical and scientific support. To the Amazonas Research Foundation -
FAPEAM, for the scholarship. And specially to Aline de Oliveira Garcia from ITAL
for the help with statistical analysis.
REFERENCES
Afoakwa, E., Paterson, A., Fowler, M., & Ryan, A. (2008). Flavor formation and
character in cocoa and chocolate: a critical review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 48(9), 840–857.
http://doi.org/10.1080/10408390701719272
Ayad, E., Verheul, A., Engels, W., Wouters, J., & Smit, G. (2001). Enhanced
flavour formation by combination of selected Lactococci from industrial and
artisanal origin with focus on completion of a metabolic pathway. Journal of
Applied Microbiology, 90(1), 59–67. http://doi.org/10.1046/j.1365-
2672.2001.01219.x
Biehl, B., & Ziegleder, G. (2003). COCOA Chemistry of processing. In
Encyclopaedia of Food Sciences and Nutrition (2nd ed., Vol. 3, pp. 1436–
1448). Germany: Elsevier Science.
Bonvehí, J. (2005). Investigation of aromatic compounds in roasted cocoa powder.
European Food Research and Technology, 221(1-2), 19–29.
http://doi.org/10.1007/s00217-005-1147-y
Carvalho, A., García, N., & Wada, J. (2005). Caracterização físico-química e
curvas de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e
122
torradas de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of
Food Technology, 8(2), 127–134.
Cohen, K., Luccas, V., & Jackix, M. (2004). Revisão : Temperagem ou Pré-
Cristalização do Chocolate. Brazilian Journal of Food Technologynal, 7(1),
23–30.
Cohen, K., Sousa, M., & Jackix, M. (2009). Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau (No. 267). Documentos. Planaltina, DF.
Counet, C., Callemien, D., Ouwerx, C., & Collin, S. (2002). Use of gas
chromatography-olfactometry to identify key odorant compounds in dark
chocolate. Comparison of samples before and after conching. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50(8), 2385–2391.
http://doi.org/10.1021/jf0114177
Crafack, M., Mikkelsen, M., Saerens, S., Knudsen, M., Blennow, A., Lowor, S.,
Nielsen, D. (2013). Influencing cocoa flavour using Pichia kluyveri and
Kluyveromyces marxianus in a defined mixed starter culture for cocoa
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 167(1), 103–116.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.06.024
Danzl, W., Ziegleder, G. (2014) Chocolate conching: Aroma improvement by a
changed flavour distribution. New Food, 17 (4), 60-66
Fadel, H., Abdel Mageed, M. , Abdel Samad, A. , & Lotfy, S. (2006). Cocoa
substitute: Evaluation of sensory qualities and flavour stability. European
Food Research and Technology, 223(1), 125–131.
http://doi.org/10.1007/s00217-005-0162-3
Frauendorfer, F., & Schieberle, P. (2006). Identification of the Key Aroma
Compounds in Cocoa Powder Based on Molecular Sensory Correlations.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 5521–5529.
123
Frauendorfer, F., & Schieberle, P. (2008). Changes in key aroma compounds of
Criollo cocoa beans during roasting. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 56(21), 10244–10251. http://doi.org/10.1021/jf802098f
Fowler, M. (2009). Cocoa beans: from treento factory. In: Beckett, S (Ed.) Industrial
Chocolate Manufacture and Use. Blackwell Publishing. United Kingdom, pp
10-47
Gondim, T., Thomazini, M., Cavalcante, M., & Souza, J. (2001). Aspectos da
Produção de Cupuaçu. Embrapa Acre. … (1a ed.). Rio Branco: Embrapa
Acre.
Hii, C., Law, C., Suzannah, S., Misnawi, & Cloke, M. (2009). Polyphenols in cocoa
(Theobroma cacao L.). Asian Journal of Food and Agro-Industry, 2(04), 702–
722.
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2014). Yeasts are essential for cocoa bean
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 174, 72–87.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.014
Kadow, D., Bohlmann, J., Phillips, W., & Lieberei, R. (2013). Identification of main
fine or flavour components in two genotypes of the cocoa tree ( Theobroma
cacao L .). Journal of Applied Botany and Food Quality, 86, 90–98.
http://doi.org/10.5073/JABFQ.2013.086.013
Kolb, B., Ettre, L. (1997) Static Headspace Gas Chromatography - Theory and
Practice. Wiley-VCH, New York, Chapter 5; Headspace methods for
quantitative analysis, 149-210
Lopes, A., Garcia, N., & Vasconcelos, M. (2003). Avaliação das Condições de
Torração Após a Fermentação de Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma
grandiflorum Schum) e Cacau (Theobroma cacao L.). Braz. J. Food Technol,
6(2), 309–316.
124
Lopes, A. , Pezoa-García, N., & Amaya-Farfán, J. (2008). Qualidade nutricional
das proteínas de cupuaçu e de cacau Nutritional quality of cupuassu and
cocoa proteins. Ciên. Tecnol. Aliment., 28(2), 263–268.
Martini, M., & Tavares, D. (2005). Reservas das sementes de sete espécies de
Theobroma : revisão Seed reserves from seven species of the genus
Theobroma : a review. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 64(1), 10–19.
Martins, S., Jongen, W. , & Boekel, M.. (2001). A review of Maillard reaction in food
and implications to kinetic modelling. Trends in Food Science & Technology,
11, 364–373.
Mattietto, R. (2001). Estudo comporativo das transformações estruturais e físico-
químicas durante o processo fermentativo de amêndoas de cacau
(Theobroma cacao) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum). 164 p (MS in Food
Technology). University of Campinas, São Paulo, Brazil.
Misnawi, & Ariza, B. T. S. (2011). Use of gas Chromatography-Olfactometry in
combination with solid phase micro extraction for cocoa liquor aroma
analysis. International Food Research Journal, 18(2), 829–835.
Oberparleiter, S., & Ziegleder, G. (1997). Amyl alcohols as compounds indicative
of raw cocoa bean quality. Zeitschrift Fuer Lebensmittel -Untersuchung Und -
Forschung, 204(2), 156–160. http://doi.org/10.1007/s002170050053
Oliveira, A., Pereira, N. , Marsaioli, A., & Augusto, F. (2004). Studies on the aroma
of cupuassu liquor by headspace solid-phase microextraction and gas
chromatography. Journal of Chromatography A, 1025(1), 115–124.
http://doi.org/10.1016/j.chroma.2003.08.061
Queiroz, M., & Garcia, N. (1999). Avaliação da Torração de Amêndoas de
Cupuaçu ( Theobroma grandiflorum ). Brazilian Journal of Food Technology,
2, 167–173.
125
Quijano, C., & Pino, J. (2007). Volatile compounds of copoazú (Theobroma
grandiflorum Schumann) fruit. Food Chemistry, 104, 1123–1126.
http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.01.006
Ramos, S. (2015). Influence of the microorganisms involved in the process of
cupuassu fermentation (Theobroma grandiflorum Schum) on the flavor
formation. 217 p (Doctoral Thesis in Food Technology). University of
Campinas, São Paulo, Brazil.
Rizzi, G., & Bunke, P. (1998). The use of roasting kinetics data to ch aracterize
natural and artificial chocola te aroma precursors. Food Flavors: Formation,
Analysis and Packaging Influences, 535–546.
Rizzi, G. (2008). The Strecker Degradation of Amino Acids: Newer Avenues for
Flavor Formation. Food Reviews International, 24(4), 416–435.
http://doi.org/10.1080/87559120802306058
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H., Contreras-Ramos, S., Orozco-Avila,
I., Jaramillo-Flores, E., & Lugo-Cervantes, E. (2012). Effect of fermentation
time and drying temperature on volatile compounds in cocoa. Food
Chemistry, 132(1), 277–288. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.10.078
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H. , Orozco-Avila, I., Lugo-Cervantes,
E., & Jaramillo-Flores, M. (2011). Dynamics of volatile and non-volatile
compounds in cocoa (Theobroma cacao L.) during fermentation and drying
processes using principal components analysis. Food Research International,
44(1), 250–258. http://doi.org/10.1016/j.foodres.2010.10.028
Schrader, J. (2007). Microbial flavour production. In Flavours and Fragrances:
Chemistry, Bioprocessing and Sustainability (pp. 507–574). Frankfurt:
DECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institute. http://doi.org/10.1007/978-3-540-
49339-6_23
Schwab, W., Davidovich-Rikanati, R., & Lewinsohn, E. (2008). Biosynthesis of
plant-derived flavor compounds. Plant Journal, 54(4), 712–732.
http://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03446.x
126
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial
cocktail inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–
1483.
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,
44(4), 205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
Souza, A. & Sousa, N.(2002). Cupuaçuzeiro In: Bruckner, C.H. (Ed.)
Melhoramento de fruteiras tropicais. Viçosa: Editora UFV, 2002, p.251-266.
Sukha, D., Butler, D., Umaharan, P., & Boult, E. (2008). The use of an optimised
organoleptic assessment protocol to describe and quantify different flavour
attributes of cocoa liquors made from Ghana and Trinitario beans. European
Food Research and Technology, 226(3), 405–413.
http://doi.org/10.1007/s00217-006-0551-2
Van Boekel, M. (2006). Formation of flavour compounds in the Maillard reaction.
Biotechnology Advances, 24(2), 230–233.
http://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.11.004
Venturieri, G. (1993). Cupuaçu: a espécie, sua cultura, usos e processamento.
Belém, PA: Clube do Cupu.60 p.
Yaylayan, V. (2003). Recent Advances in the Chemistry of Strecker Degradation
and Amadori Rearrangement: Implications to Aroma and Color Formation.
Food Science and Technology Research, 9(1), 1–6.
http://doi.org/10.3136/fstr.9.1
Zahouli, G., Guehi, S., Fae, M., & Nemlin, J. (2010). Effect of Drying Methods on
the Chemical Quality Traits of Cocoa Raw Material. Advance Journal of Food
Science and Technology, 2(4), 184–190.
Ziegleder, G., Biehl, B. (1988) Analysis of Cocoa Flavour Components and Flavour
Precursors. In:
127
Modern Methods of Plant Analysis. New Series, Vol. 8. Analysis of nonalcoholic
beverages, ed. Linskens, H.F., Jackson, J.F. Springer, Berlin, 321-393
Ziegleder, G. (1991). Composition of flavor extracts of raw and roasted cocoas.
Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und -Forschung, 192(6), 521–525.
http://doi.org/10.1007/BF01202506
Ziegleder, G., Balimann, G., Mikle, H., Zaki, H. (2003). Neue Erkenntnisse über
das Conchieren. Part II. Süsswaren. No. 4, 16-18.
Ziegleder, G. (2009). Flavour development cocoa and chocolate. In: Beckett, S
(Ed.) Industrial Chocolate Manufacture and Use. Blackwell Publishing. United
Kingdom, pp 169-191
128
CAPÍTULO 5
PLANT AND METAGENOMIC DNA EXTRACTION OF MUCILAGINOUS SEEDS
Simone N. M. Ramos, Marcela M. Salazar, Gonçalo A. G. Pereira, Priscilla Efraim
_________________________________________________________________
Publicado na revista MethodsX com livre acesso em outubro de 2014. Formatado
de acordo com as regras da revista.
RAMOS, S. N. M.; SALAZAR, M.M.; EFRAIM, P. Plant and metagenomic DNA extraction of mucilaginous seeds. MethodsX, v. 1, p. 225–228, out. 2014.
RAMOS, S. N. M.; SALAZAR, M.M.; EFRAIM, P. Genomic DNA extraction of highly mucilaginous Theobroma grandiflorum fermented seeds. V International Conference on Environmental , Industrial and Applied Microbiology realizado no período de 2-4 de outubro de 2013, Madri, Espanha (Resumo e Pôster).
129
CAPÍTULO 5
PLANT AND METAGENOMIC DNA EXTRACTION OF MUCILAGINOUS
SEEDS
Simone N. M. Ramos a*
, Marcela M. Salazarb, Gonçalo A. G. Pereira
b, Priscilla Efraim
a
aDepartment of Food Technology, School of Food Engineering, University of Campinas.
bLaboratory of Genomic and Expression, Institute of Biology, University of Campinas.
__________________________________________________________________
GRAPHICAL ABSTRACT
Stages of sample treatment: (a) seeds in fermentation boxes; (b) frozen cupuassu beans; (c)
maceration of beans with liquid nitrogen; (d) fat extraction under stirring with petroleum ether; (e)
initial step of DNA extraction process
__________________________________________________________________
ABSTRACT
The pulp surrounding the seeds of some fruits is rich in mucilage,
carbohydrates, etc. Some seeds are rich in proteins and polyphenols. Fruit seeds,
like cocoa (Theobroma cacao) and cupuassu (Theobroma grandiflorum), are
subjected to fermentation to develop flavor. During fermentation, ethanol is
produced [2-6]. All of these compounds are considered as interfering substances
that hinder the DNA extraction [4-8]. Protocols commonly used in the DNA
extraction in samples of plant origin were used, but without success. Thus, a
130
protocol for DNA samples under different conditions that can be used for similar
samples was developed and applied with success. The protocol initially described
for RNA samples by Zeng et al. [9] and with changes proposed by Provost et al.
[5] was adapted for extracting DNA samples from those described. However,
several modifications have been proposed:
Samples were initially washed with petroleum ether for fat phase removal.
RNAse was added to the extraction buffer, while spermidin was removed.
Additional steps of extraction with 5M NaCl, saturated NaCl and CTAB
(10%) were included and precipitation was carried out with isopropanol,
followed by washing with ethanol.
© 2014 The Authors.Published by Elsevier B.V. This is an open access
article under the CC BY license (http://creativecommons.org/
licenses/by/3.0/).
__________________________________________________________________
ARTICLE INFO
Method: DNA Extraction of Mucilaginous Seeds
Key words: Plant, Seeds, Cupuassu, DNA extraction, PCR, Metagenomic
Article history: Received 5 June 2014. Received in revised form 20 August 2014. Accepted 17 September 2014
__________________________________________________________________
Corresponding author at: Rua Monteiro Lobato 80, Cidade Universitária, 13083-862. Campinas - São Paulo, Brazil. Tel.: +55 19 35214006.
*E-mail adress: [email protected]; [email protected] (S. N. M. Ramos)
http://dx.doi.org/10.1016/j.mex.2014.09.005
2215-0161/©2014 The Authors. Published by Elsevier B.V. This is an open access article under the
CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/ 3.0/).
131
Background informations
The pulp surrounding the seeds of some fruits is rich in mucilage,
carbohydrates, proteins and polyphenols. Fruits seeds, like cocoa (Theobroma
cacao) and cupuassu (Theobroma grandiflorum) are subjected to fermentation to
develop flavor giving products like chocolate and “cupulate”, respectively. During
fermentation, because of the intense biochemical reactions that occur in the event,
there is the formation and release of ethanol and phenolic compounds such as
flavonoids [1,2,3,6]. Samples of plant origin with high concentration of mucilage
have a difficult DNA extraction. Besides the mucilage, there are other types of
interferences, such as carbohydrates, proteins and phenolic compounds that
hamper the DNA extraction process. To avoid this inconvenience, it is necessary to
test several types of protocols aiming to obtain genomic DNA, and the relationship
between nucleic acid and protein (A260/280), nucleic acid and carbohydrates
(A260/230) must be within acceptable limits [4,8].
Different protocols for DNA extraction, including the use of commercial
Kits were tested with no success for the DNA extraction of fermented cupuassu
seeds (beans). The protocol developed in this work combines different
methodologies to decrease the high carbohydrate content that usually
accompanies the DNA extracted from mucilaginous samples.
Cupuassu seeds have a high concentration of phenolic compounds,
mainly in unfermented seeds [6]. During fermentation, because of the intense
biochemical reactions that occur in the event, there is the formation and release of
phenolic compounds such as flavonoids, but the concentration of these substances
decreases throughout the process and during the drying of beans [1]. Although
there is a decrease in the concentration of polyphenols during fermentation, the
remaining compounds, mainly flavonoids, may interfere in the DNA extraction
procedure of the samples [7]. The aim of this study was to standardize a protocol
for total (plant and metagenomic) DNA extraction of fermented cupuassu seeds,
since protocols commonly used for DNA extraction from samples of plant origin
showed no satisfactory results in this work. Thus, the protocol initially described for
132
RNA samples by Zeng et al. [9] and with changes proposed by Provost et al. [5]
was adapted for extracting DNA samples from those described.
Methods details
Preparation of Material
Seeds of cupuassu (Theobroma grandiflorum Schum) freshly harvested
were used for the fermentation step. The seeds were accommodated in
fermentation boxes of polystyrene with capacity of 24 L. The boxes had holes of 2
cm in diameter at the bottom and sides for the flow of the liquefied pulp from
fermentation. Chopped banana leaves were mixed to the fermentation mass, which
act as a natural inoculum, and then the mass was covered with banana leaves.
The fermentation process had duration between 60 and 108 h. Approximately 12 g
of fermented seeds were collected in triplicate. The procedure of DNA extraction
was developed as follows.
Maceration and fat removal
1) Pulverize, using mortar and pestle, of 12 g of fermented seeds in liquid
nitrogen.
2) Wash samples (1 g of pulverized sample) with 9 mL of petroleum ether (in 15
mL tubes) under agitation for 5 minutes (three times) for fat phase removal.
3) Keep tubes open in a fume hood for total evaporation of petroleum ether (~5
minutes).
4) Transfer approximately 300 mg of defatted samples to a 2 ml tube and
freeze them in liquid nitrogen.
5) For finer material, pulverize again of samples in a MiniBeadBeater (Biospec
Products) for 1 minute and a half with ~9 glass beads (1.0mm diameter).
DNA Extraction
6) Add 1 mL of pre-heated extraction buffer (2% CTAB, 2%
polyvinylpyrrolidone, 100mM TRIS-HCL (pH 8.0), 25mM EDTA, 2.0 M NaCl,
10mg RNAse, 10% ß-mercaptoethanol) to the frozen samples and keep
them for 30 minutes in a dry bath (65°C), vortexing every 5 minutes.
133
7) Wait for samples to reach room temperature and add 300μL of saturated
NaCl. Centrifuge at 10,000g at 4°C for 10 minutes.
8) Transfer the supernatant to another 2 mL tube, add 160μL of 5M NaCl and
homogenize.
9) Add 600μL of CIA (chloroform and isoamyl alcohol 24:1) and centrifuge at
10,000g at 4°C for 10 minutes.
10) Transfer the superior phase to another 2 mL tube. Add 50µL of CTAB (10%)
solution with 1.4 M NaCl solution and vortex. Add 600μL of CIA, homogenize
by inversion and centrifuge.
11) For the superior phase, repeat the CIA extraction.
12) Transfer the resulting superior aqueous phase to a new 1.5 mL tube and add
cold isopropanol (fill the tube) for DNA precipitation (-20°C for 12 hours).
13) Centrifuge samples (10,000g, at 4°C for 30 minutes) and wash the resulting
pellet twice with 400μL of 70% ethanol for 30 minutes and once with
absolute ethanol for three minutes.
14) Dry pellets in a dry-bath at 70°C for 5 minutes and resuspend in 40µL of
DNAse-free water.
Purification
Eventually, a co-extraction of RNA and PCR inhibitors can occurs [7]. In
order to avoid future problems with the genomic analysis, perform the purification
steps using the DNeasy Plant Minikit (Qiagen).
DNA yields, quality and PCR conditions
Verify DNA concentration and quality with a Nanodrop 2000 instrument
(Thermo Scientific). In this work results showed that the concentration in ng of all
samples were within the optimal conditions (low concentration of proteins and great
amount of DNA extracted), varying between samples. Perform a PCR with
universal 16s and ITS primers and with GoTaq polymerase (Promega), as follows:
1X GoTaq Buffer, 10mM MgCl2, 40uM dNTPs, 5mM primers, 10u GoTaq, 100ng
DNA. Carry out PCR with an initial denaturation step at 94° C, 2 minutes; then, 30
cycles of denaturation (94°C, 40 seconds), annealing (50°C, 30 seconds) and
elongation (72°C, 1 and a half minutes) and a final step of elongation for 4 minutes.
134
The results can show that despite small amounts of carbohydrates still being
observed in DNA samples, they did not impair the amplification of bacterial DNA
content present in the total DNA of fermented seeds.
The quality of samples and their concentrations were verified to attest the
efficiency of the DNA extraction method. Results are available in Table 1 and
Figure 1.
Table 1 Concentration and quality of DNA extracted from mucilage samples of fermented cupuassu seeds.
SAMPLE (CODE) DNA AMOUNT ng µL-1
A260/A280 A260/A230
CUP03 104.5 2.13 2.18
CUP06 74.8 2.19 1.90
CUP15 86.5 2.13 2.01
CUP16 222.0 2.13 2.23
CUP18 51.1 2.04 1.07
CUP19 136.4 2.13 2.12
CUP22 70.5 2.13 2.54
CUP28 70.5 2.17 1.85
CUP39 71.4 2.11 1.87
CUP40 64.0 2.09 2.10
CUP41 105.9 2.12 2.18
CUP44 116.3 2.03 1.66
CUP45 96.9 2.12 2.05
CUP47 311.8 2.11 1.96
CUP51 93.7 2.12 2.19
CUP54 141.4 2.12 2.26
CUP58 61.4 2.10 2.23
CUP59 161.5 2.10 2.13
CUP62 67.9 2.14 2.27
CUP63 64.6 1.81 0.78
CUP64 78.9 2.10 2.14
CUP65 64.3 2.11 2.45
CUP66 150.2 1.93 0.94
CUP71 74.6 2.14 2.24
CUP76 51.4 2.08 1.78
CUP78 63.6 2.04 1.28
135
Fig. 1 Agarose gel (2%) showing amplification with 16S primers of the DNA extracted from fermented samples. 2 – 4: samples in the first day of fermentation; 5: non-fermented sample; 6 – 8: samples in the last day of fermentation; 1 and 9: 100bp ladder LifeTechnologies .
Different protocols for DNA extraction, including the use of commercial
Kits were tested with no success for the DNA extraction of fermented cupuassu
seeds (beans). The protocol developed in this work combines different
methodologies to decrease the high carbohydrate content that usually
accompanies the DNA extracted from mucilaginous samples.
Additional information
The results showed that the concentration in ng of all samples were
within the optimal conditions (low concentration of proteins and great amount of
DNA extracted), varying between samples. To confirm the quality of the DNA
samples, a PCR was performed using 16S primers for samples at the third day of
fermentation (with 15% of pulp). These results showed that despite small amounts
of carbohydrates still being observed in DNA samples, they did not impair the
amplification of bacterial DNA content present in the total DNA of fermented seeds.
The protocol developed in this work was successfully applied for the
DNA extraction of fermented Theobroma grandiflorum seeds, thus confirming that
the protocol can be used for the DNA extraction of similar samples. The age and
growth conditions of the plant material influence the isolation efficiency of high-
quality DNA. Currently, it permits further genomic analyses.
136
Acknowledgments
Special thanks to São Paulo Research Foundation (FAPESP) for the
financial support. We thank Espaço da Escrita – Coordenadoria Geral da
Universidade – Unicamp for the text revision. Methods X thanks the reviewers of
this article for taking the time to provide valuable feedback.
References
[1] S. Beckett, Industrial Chocolate Manufacture and Use. 4th ed. Blackwell,
London 2009. 669 pp.
[2] A.V. Carvalho, N.H.P. Garcia, J.K.A. Wada. Caracterização físico-química e
curvas de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e torradas
de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of Food
Technology. v.8, n.2, (2005) p.127-134.
[3] K.d.O. Cohen, M.d.Sousa, M. Jackix. Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau. 1st ed. Planaltina: Embrapa Cerrados (2009)
25 pp.
[4] A. Kundu et al. A simple ethanol wash of the tissue homogenates recovers
high-quality genomic DNA from Corchorus species characterized by highly acidic
and proteinaceous mucilages. Electronic Journal of Biotechnology, v. 14, (1),
(2001) p. 1–8
[5] G.L. Provost, R. Herrera, J.A. Paiva, P. Chaumeil, F. Salin, C. Plomion. A
micromethod for high throughput RNA extraction in forest trees. Biological
Research, v.40, (2007) p. 291 – 297.
[6] A.G. Pugliese et al. Flavonoids, Proanthocyanidins, Vitamin C, and Antioxidant
Activity of Theobroma grandiflorum (Cupuassu) Pulp and Seeds. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 61, (2013) 2720–2728.
[7] C. Schrader et al. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal
of Applied Microbiology, 113 (5), (2012) 1014–1026.
137
[8] P.K. Sharma, N. Capalash, J. Kaur. An improved method for single step
purification of metagenomic DNA. Molecular Biotechnology, 36 (1) (2007) 61–63.
[9] Y. Zeng, T. Yang. RNA isolation from highly viscous samples rich in
polyphenols and polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter, 20, (2002)
417 – 417.
138
CAPÍTULO 6
INFLUENCIA DA POLPA SOBRE A DIVERSIDADE MICROBIANA EM
FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum)
Simone de Nazaré Melo Ramos, Maristela Silva Nascimento Marcela Mendes
Salazar, Leandro Costa Nascimento, Marcelo Falsarella Carazzole, Gonçalo
Amarante Guimarães Pereira, Tiago Palladino Delforno, Priscilla Efraim
__________________________________________________________________
Este capítulo será submetido à revista PLoS One
139
CAPÍTULO 6
INFLUENCIA DA POLPA SOBRE A DIVERSIDADE MICROBIANA EM
FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum)
Simone de Nazaré Melo Ramos1, Maristela Silva Nascimento1 Marcela Mendes
Salazar2, Leandro Costa Nascimento2, Marcelo Falsarella Carazzole2, Gonçalo
Amarante Guimarães Pereira2, Tiago Palladino Delforno3, Priscilla Efraim1*
1 Food Technology Department. University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil. 2 Laboratory of Genomic and Expression, Institute of Biology, University of Campinas, São Paulo, Brazil. 3 Microbial Resources Division, Research Center for Chemistry, Biology and Agriculture (CPQBA), University of Campinas - UNICAMP, São Paulo, Brazil. *Corresponding author e-mail: [email protected]
RESUMO
Muito popular e originário da região amazônica brasileira, o cupuaçu (Theobroma
grandiflorum Schum) é um fruto do mesmo gênero do cacau. Através de
fermentação das sementes também é obtido um produto similar ao chocolate, o
cupulate. Diferente do que ocorre com o cacau, a diversidade microbiana
envolvida na fermentação de cupuaçu é muito pouco conhecida. Além disso, as
sementes são geralmente despolpadas, visto que a polpa apresenta atualmente
maior valor comercial, além de representar uma barreira na evolução da
fermentação. A pesquisa propôs a fermentação de sementes com 3
concentrações de polpa (0, 7,5 e 15%) e 2 formas de revolvimento, com o objetivo
de avaliar sua influência sobre os microrganismos. Sequenciamento massivo dos
genes rDNA 16S e ITS4 (Plataforma Illumina MiSeq) foram utilizados para
caracterização de bactérias e leveduras no ambiente de fermentação. Curvas de
rarefação foram geradas para avaliação da cobertura amostral. Além disso, foram
obtidos resultados de estimadores de riqueza (Chao1) e índice de diversidade
(Shannon) para cada condição. Em paralelo foi realizada a contagem padrão de
leveduras, bactérias láticas, bactérias acéticas, esporos de bactérias mesófilas e
termófilas para entendimento da dinâmica dos eventos microbiológicos que
ocorrem durante todo o processo. Os resultados demonstraram que um maior teor
de polpa influencia positivamente no crescimento de bactérias, tendo sido
140
identificada maior diversidade no nível de gênero, enquanto que para leveduras, a
população presente permaneceu relativamente estável durante todo o processo.
Palavras chave: cupuaçu, fermentação, bactérias, leveduras, sequenciamento de
nova geração, estimativa de riqueza
1. INTRODUÇÃO
As sementes de cupuaçu (Thebroma grandiflorum Schum), assim como
ocorre com o cacau (Theobroma cacao L), também passam por processos de
fermentação e secagem, e depois, etapas similares de processamento (torração,
moagem, refino, conchagem, temperagem) para a obtenção do cupulate, produto
similar ao chocolate (Nazaré et al., 1990; Cohen et al., 2009). No caso do
cupuaçu, antes da fermentação normalmente é realizado o despolpamento total ou
parcial (5%) das sementes (Cohen & Jackix, 2005; Matos et al., 2008), visto que
por ser muito abundante, a polpa interfere negativamente impedindo que a
fermentação avance. Na fermentação de cacau a polpa é mantida e representa
uma importante fonte de substratos que são utilizados pelos microrganismos
durante a fermentação (Ardhana & Fleet, 2003; Guehi et al., 2010). Estudos
indicam que durante a fermentação ocorre a migração de importantes compostos
da polpa para o interior das sementes (Kadow et al., 2013), estando alguns
relacionados aos aromas presentes em chocolate do tipo fino (Sukha et al., 2008).
As mudanças bioquímicas que ocorrem nas sementes são importantes, pois
diminuem a sensação de adstringência e amargor, pela formação de compostos
de sabor (Barel, 1997).
Durante a fermentação, a transformação de substratos na polpa em
importantes precursores de sabor é mediada pela ação de um consórcio de
microrganismos (Ardhana & Fleet, 2003; Schwan & Wheals, 2004). No início há
predomínio de leveduras, principais responsáveis pela metabolização dos
açúcares presentes para a formação de etanol (Beckett, 2009). As bactérias
láticas (LAB), também presentes, utilizam o ácido cítrico da polpa para a formação
de ácido lático, composto orgânico não volátil que confere ao produto final acidez
indesejável (Schwan, 1998; Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011). Entretanto,
141
há estudos indicando que algumas cepas de LAB do tipo heterofermentativas
agem sobre o ácido cítrico produzindo importantes compostos (Lefeber et al.,
2011).
O etanol disponível na massa é oxidado a ácido acético pelas bactérias
acéticas (AAB), em uma reação altamente exotérmica, que culmina com a morte
da semente (Jinap, 1994 citado por Lagunes Gálvez et al., 2007). Durante a
fermentação é necessária a aplicação de revolvimentos para a oxigenação e
consequente elevação e uniformização da temperatura no meio, o que influencia
na obtenção de amêndoas bem fermentadas (Guehí et al., 2010). Além da
influência sobre a temperatura, o revolvimento estimula um aumento em células
de AAB e produção de ácido acético (Camu et al., 2008). Estudos têm sugerido
que o papel da AAB está além da produção de ácido acético. Porém, os métodos
convencionais de cultivo não permitem a observação da riqueza e diversidade dos
microrganismos na fermentação (Lagunes Gálvez et al., 2007). Em estágios mais
adiantados, predominam espécies de Bacillus (Ardhana & Fleet, 2003), cujo papel
era desconhecido, até que nos últimos anos a atividade pectinolítica de algumas
espécies foi constatada em pesquisas com cacau (Ouattara et al., 2011).
A fermentação é desencadeada por contaminação espontânea e ao
longo dos anos foram identificadas espécies em fermentação de cacau,
associadas ao desenvolvimento do sabor em chocolate (Schwan, 1998; Schwan &
Wheals, 2004; Pereira et al., 2012; Crafack et al., 2013; Papalexandratou et al.,
2013). Quanto aos microrganismos presentes na fermentação de cupuaçu, os
estudos ainda são escassos. Oliveira (2001) identificou, através de métodos
culturais, leveduras e bactérias presentes na fermentação de sementes de
cupuaçu, similares às encontradas em cacau.
A diversidade microbiana em ambiente de fermentação tem sido
exaustivamente estudada, pela utilização de ferramentas moleculares que abrem
uma maior perspectiva de conhecer a diversidade presente (Meersman et al.,
2013; Hamdouche et al., 2014; Illeghems et al., 2014) visto que os métodos
culturais, além de demandar tempo, são bastante limitantes não permitindo a
142
identificação das populações envolvidas (Romero-Cortes, 2012). Em muitos
casos, eles têm sido complementados por técnicas moleculares, utilizadas para
identificação de cepas isoladas a partir de meios de cultura (De Vuyst et al., 2008;
Ouattara et al., 2011).
Nos últimos anos, métodos moleculares permitiram a identificação de
níveis taxonômicos de microrganismos na fermentação de cacau e que não
poderiam ser identificados por métodos culturais (Meersman et al., 2013), tais
como a análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA). O métido
permite a análise das regiões espaçadoras do rDNA com estudos comparativos
das sequencias de nucleotídeos dos genes, possibilitando verificar diferenças
entre grupos filogenéticos em um ambiente (Jorgensen; Cluster, 1989 citados por
Oliveira; Costa, 2002). O ARDRA já foi utilizado para identificar espécies de
Bacillus com atividade pectinolítica em fermentação de cacau (Ouattara et al.,
2011). Além daquele, o (GTG)5-rep-PCR fingerprinting foi utilizado na
caracterização de AAB. A técnica consiste na amplificação de região conservada,
distribuída em genomas bacterianos que geram fingerprinting de DNA de bactérias
Gram positivas e negativas, com identificação até o nível de espécie (De Vuyst et
al., 2008).
Atualmente existe uma busca na identificação dos microrganismos
dominantes em ambientes de fermentação de cacau e que podem desempenhar
papel fundamental no processo metabólico para a formação de compostos de
sabor, visto que a comunidade microbiana em fermentação é complexa. Técnicas
como PCR-DGGE (denaturing gradiente gel electrophoresis) já permitiram, por
exemplo, a identificação de leveduras, LAB e AAB dominantes, assim como seus
metabólitos (açúcares e ácidos orgânicos) em fermentação de cacau (Santos et
al., 2011; Meersman et al., 2013; Papalexandratou et al., 2013; Hamdouche et al.,
2014). A DGGE já tinha sido apontada como uma eficiente ferramenta de
monitoramento nas mudanças microbiológicas que ocorrem durante a
fermentação (Nielsen et al., 2008). Alguns desses estudos sugerem a utilização de
microrganismos identificados em determinada etapa da fermentação como
143
marcadores, para definir o estágio em que se encontra o processo (Hamdouche et
al., 2014).
O papel de microrganismos com função ainda não totalmente
esclarecida, como a das LAB, também tem sido abordada em alguns estudos
através de RFPL (Restriction Fragment Length Polymorphism), para
monitoramento das mudanças bioquímicas que ocorrem na fermentação pela sua
presença ou supressão (Ho, Zhao, & Fleet, 2015), visto que em algumas fases da
fermentação populações de LAB têm se mostrado dominantes (Papalexandratou
et al., 2013). Recentemente foi desenvolvido método rápido de detecção de
espécies de LAB por qPCR em fermentação de cacau (Schwendimann et al.,
2015). Todas essas abordagens têm como objetivo chegar a um pool de cultura de
microrganismos com funções definidas, para estabelecer um controle sobre as
técnicas de fermentação e obtenção de produto com características sensoriais
desejáveis de forma padronizada.
A metagenômica é outra abordagem que permite o estudo em larga
escala de diversidade de microrganismos que não podem ser recuperados pelos
métodos culturais. Tal técnica propicia a identificação de diferentes populações em
um dado ambiente (Guazzaroni et al., 2009; Simon & Daniel, 2011). Mas uma
questão proposta é se a diversidade presente em uma dada amostra reflete a
população total de microrganismos no ambiente de onde ela foi extraída
(Haegeman et al., 2013). Há alguns anos atrás a diversidade microbiana era
subestimada e as ferramentas moleculares disponíveis até então, estavam
começando a estimar a população existente em comunidades e estabelecer uma
diferenciação entre as mesmas (Dykhuizen, 1998).
Em metagenômica cresceu a utilização de sequenciamento de nova
geração para obtenção de dados a partir de diversos ambientes (Simon & Daniel,
2011). É uma ferramenta que já foi utilizada no sequenciamento de DNA de uma
comunidade microbiana inteira (metagenoma), utilizando o Pirosequenciador 454,
a partir de ambiente de fermentação de cacau (Illeghems et al., 2014). No estudo
foi correlacionada a participação dos microrganismos identificados com a rota
144
metabólica dos eventos bioquímicos que ocorrem no citoplasma bacteriano na
fermentação e os metabólitos produzidos.
Apesar de ser considerada uma ferramenta poderosa em
sequenciamento de larga escala, o Pirosequenciador 454 tem como desvantagem
o alto custo. Em estudos com comunidade de fungos, os resultados demonstraram
que outro sequenciador de nova geração, o Ilumina MiSeq ou Ilumina
metabarcording, gera reads menores, mas consegue alcançar sequenciamento
maior até que o Pirosequenciador 454, além de ser mais barato (Schmidt et al.,
2013).
A quantificação de comunidades é muito importante para entender a
função, forma de atuação e evolução dos microrganismos no ambiente. Em
metagenomica, a estimativa da diversidade microbiana complementa os
resultados obtidos no sequenciamento em larga escala. Entre os estimadores
aplicados estão o Chao1, Shannon e Simpson (Haegeman et al., 2013). A curva
de rarefação, na qual são plotados os números de OTU’s dos microrganismos
obtidos com os reads registrados, também é importante para demonstrar se os
resultados de sequenciamento alcançaram a saturação dos microrganismos no
ambiente estudado. Em alguns casos, a utilização da curva mostra que a
saturação pode ser alcançada, dependendo da forma como é feita a amostragem
e ferramentas utilizadas para o agrupamento da sequencias (Illeghems et al.,
2014).
Como já foi mencionado, em fermentação de sementes de cupuaçu é
normal o despolpamento completo, visto que o volume abundante de polpa
aderida à semente inviabiliza a fermentação, embora contribua para a formação
dos precursores de sabor. Assim, com o objetivo de aumentar a compreensão
sobre a diversidade e estimativa das populações presentes em fermentação de
cupuaçu, assim como a influência que sofrem pela concentração de polpa aderida
às sementes, foram realizados métodos culturais e não-culturais (sequenciamento
em larga escala) dos microrganismos a partir de amostras coletadas em ambiente
de fermentação.
145
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Fermentação das sementes de cupuaçu
A fermentação de sementes de cupuaçu foi realizada em Manaus
(Amazonas, Brasil). Foram utilizadas sementes com polpa, extraídas de
aproximadamente uma tonelada de frutos maduros e sadios, recém-coletados
após sua queda. As sementes sofreram despolpamento total (0%) e parcial (7,5 e
15%) e durante a fermentação, realizada em triplicata para cada experimento,
foram realizados dois tipos de revolvimento: R1 (fixo), feito após 48 horas do início
da fermentação e a cada 24 h; e R2, feito de acordo com a queda da temperatura
do meio de fermentação. Os experimentos foram identificados como 0R1, 0R2,
7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2.
2.2 Coleta das amostras
Diariamente foram coletadas aproximadamente 30g de amostra a partir
da massa de fermentação de cada triplicata dos experimentos, em embalagem
estéril. As alíquotas para análise metagenômica foram mantidas sob
congelamento (-70oC) até o início das análises, enquanto que as amostras para
contagem em método cultural foram processadas imediatamente.
2.3 Análises Microbiológicas
Diluição: foram pesados aproximadamente 10 g de amostra em saco
plástico estéril sendo que para a enumeração de leveduras, LAB e AAB foram
adicionados 90 mL de água peptonada 0,1% e para enumeração de EBM e EBT
foram adicionados 90 mL de água peptonada salina. As amostras foram
homogeneizadas manualmente por 3 min e depois submetidas à diluição seriada.
Plaqueamento: realizado a partir das diluições com 1 mL de cada
amostra e 20 mL de meio de cultura fundido (pour plate) para enumeração de
leveduras, LAB e AAB. Para LAB, foi efetuada a adição de ±10 mL de
sobrecamada de meio fundido (over lay) para promover a baixa tensão de
oxigênio no meio. Para enumeração de leveduras foi utilizado o ágar extrato de
malte (MEA, Merck®) suplementado com oxitetraciclina (100mg/L). Para
146
enumeração das LAB foi utilizado o ágar Man Rogosa Sharp (MRS, Merck®)
suplementado com ciclohexamida (400mg/L) (Camu et al., 2007). Para
enumeração de AAB foi utilizada a formulação seg. Carr (1968) com modificações:
extrato de levedura (20g/L), ágar No1 (20g/L), verde de bromocresol (0,02g/L),
etanol (2% v/v) esterilizado por filtração em membrana (Millipore 0,45µm de
porosidade), pH final 5,5 (Carr, 1968 citado por Spinosa, 2002; Camu et al., 2007;
Length, 2012). De cada diluição de EBM e EBT foi transferido 1mL para tubos de
ensaio de 50 mL contendo 20 mL do meio de cultura específico fundido: para
enumeração de EBM foi utilizado o meio ágar extrato triptona glicose (TGE,
Merck®) e para enumeração de EBT foi utilizado o meio ágar dextrose triptona
(DTA, Difco®). Os tubos tampados foram colocados em banho-maria com
circulação (Quimis Q215M) regulado a 80 oC/30 min para EBM e 100 oC/30 min
para EBT, com a finalidade de provocar o choque térmico e esporulação dos
microrganismos (Olson; Sorrels, 2001; Stevenson; Segner, 2001). Foi utilizado um
tubo com meio de cultura e termômetro digital para controle da temperatura. Para
controle do tempo foi utilizado cronômetro digital (Incoterm Mod. 7651.02.0.00).
Após o choque, os meios fundidos com as diluições foram vertidos em placas e
incubados em estufas incubadoras (BOD SL 200 Solab) a 35oC/48 h para EBM e a
55oC/48 h para EBT. As leveduras e LAB foram incubadas a 35oC/48 h e AAB a
42oC/ 72 h.
Testes confirmatórios: foi efetuada a contagem das colônias
características que cresceram nos meios e selecionadas até 5 de cada placa para
coloração de Gram e teste de catalase, estimando-se o número de unidades
formadoras de colônias (UFC)/g a partir dos resultados positivos, com limite
mínimo de detecção de 10 UFC. No caso das AAB foram selecionadas colônias
com halo, indicativo de utilização do etanol presente no meio.
2.4 Análise estatística
Os resultados das análises microbiológicas foram avaliados
estatisticamente através do software SAS (Statistical Analyses System), versão
147
9.0, empregando-se a análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey (p≤0,05)
(SAS, 2009).
2.5 Sequenciamento (16S e ITS4)
2.5.1 Extração de DNA
As amostras foram submetidas à extração de DNA no Laboratório de
Genômica e Expressão (LGE) da Unicamp. Inicialmente foi feita a maceração com
nitrogênio líquido, extração de gordura com éter de petróleo, pulverização em
MiniBeadBeater (Biospec Products) por 1 min e meio com ~9 pérolas de vidro (1.0
mm diametro). Em seguida, 300 mg das amostras pulverizadas foram submetidas
à extração de DNA, purificação, avaliação da qualidade e corrida em PCR
utilizando primers universais de 16S e ITS de acordo com protocolo especifico
(Ramos et al., 2014).
2.5.2 Sequenciamento
Foi realizado o sequenciamento de amplicons, regiões ITS4 (leveduras) e
16S (bactéria), a partir de DNA extraído das amostras em sequenciador de larga
escala Illumina MiSeq na Universidade da Carolina do Norte, EUA. Foram gerados
reads do tipo paired-end com 300 bp.
2.6 Análise das sequências do DNA 16S
As OTUs (operational taxonomic units) foram identificadas com 97% de
identidade entre as sequências, sendo que as mais representativas de cada OTU
foram alinhadas com o banco de dados do SILVA (Pruesse et al., 2007)
release119 e utilizado o software Mothur (Schloss et al., 2009), para análise das
sequências de dados. Após exclusão dos cloroplastos e mitocôndrias, estruturas
de origem vegetal, os reads foram normalizados e agrupados sendo excluídas
contagens com menos de 0,5 reads.
2.7 Análise das sequências do DNA ITS4
Os reads foram agrupados em OTUs (operational taxonomic units)
utilizando o módulo “cd-hit-est” do programa Cd-hit (W. Li & Godzik, 2006)
148
exigindo 97% de similaridade entre as sequências. Foram descartadas OTUs cuja
sequência representante era menor que 200 bp e que possuíam “read count”
menor que cinco em todas as bibliotecas. Utilizando um script em PERL, os
arquivos FASTA e Genbank de 790.365 sequências de ITS de fungos foram
obtidos no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As OTUs filtradas foram
comparadas com as sequências ITS utilizando BLASTn (Altschul et al., 1997).
Para o BLAST, foram aceitos somente hits com e-value <= 1e-10 e que cobriam
pelo menos 80% das OTUs. O gênero relativo a cada OTU foi identificado com
base na sequência hit do BLASTn. Os reads foram normalizados e agrupados
sendo excluídas contagens com menos de 0,5 reads.
2.8 Análise estatística de diversidade
Os parâmetros de diversidade analisados foram: alfa (Shannon e
Chao1) e beta diversidade (Bray-Curtis). O índice de Shannon mede a diversidade
presente no ambiente, estando relacionado com o número de táxons na
comunidade (Haegeman et al., 2013), enquanto que o índice de Chao1 estima a
riqueza total de espécies (Hughes et al., 2001). A alfa-diversidade está
relacionada com a diversidade dentro da amostra (intra-amostral) e permite
estimar quantas espécies estão presentes na amostra (riqueza) além do número
total de espécies. A beta-diversidade corresponde ao grau de diferenciação entre
duas ou mais amostras entre si. Assim, por meio do software PAST
(http://folk.uio.no/ohammer/past/index_old.html) foram determinadas a alfa e a
beta diversidade (Hammer et al., 2001).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análises Microbiológicas
A evolução do crescimento de leveduras, LAB, AAB, EBM e EBT ao
longo da fermentação nos seis experimentos é mostrada na Figura 1.
149
Figura 1. Evolução do crescimento microbiano em Unidade Formadora de Colônia (UFC) g
-1
durante a fermentação de sementes de cupuaçu. nos experimentos com 0R1, 0R2, 7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2.
Os experimentos 15R1 e 15R2 apresentaram contagem inicial mais
elevada para leveduras, EBT e EBM; 7,5R1 e 7,5R2 para LAB e 0R1 e 0R2 para
AAB (Figura 1). Microrganismos com menor exigência de oxigênio (leveduras e
LAB) obtiveram maior contagem nas primeiras horas da fermentação (24-28 h)
quando ainda não havia sido aplicado o 1º revolvimento (dados aqui não
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0R1 0R2 0R1 0R2 0R1 0R2 0R1 0R2 0R2
0 12 36 60 84
Log
UFC
g.-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
7.5R1 7.5R2 7.5R1 7.5R2 7.5R1 7.5R2 7.5R1 7.5R2 7.5R1 7.5R2
0 12 36 60 84
Log
UFC
g.-1
0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0
15R1 15R2 15R1 15R2 15R1 15R2 15R1 15R2 15R1 15R2 15R1 15R2
0 12 36 60 84 108
Log
UFC
g.-1
Tempo de fermentação (h)
LEVEDURAS ACÉTICAS LÁTICAS TERMÓFILAS MESÓFILAS
150
mostrados). Na enumeração de microrganismos em amostras com 12 horas de
fermentação, houve diferença em mais de 2 log a partir da contagem inicial de
leveduras, AAB e LAB, em quase todos os experimentos, exceção para 7,5%R2
(LAB) e 15R1 (AAB). Nos experimentos com maior concentração de polpa e em
ambos revolvimentos, EBM e EBT não apresentaram crescimento significativo,
talvez pelas condições iniciais de elevada acidez. Todos os experimentos
apresentaram diferença significativa (p≥0,05) em relação às leveduras, AAB e
EBM após 60 horas de fermentação. Ao final de 108 horas, apenas 15-R1 e 15-R2
ainda estavam sofrendo fermentação e apresentaram diferença (p≥0,05) somente
na contagem de EBT.
3.1.1 Leveduras
Nas primeiras 36 horas em que não foi efetuado qualquer revolvimento,
todos os experimentos apresentaram elevação na contagem de leveduras. Após
este período, passaram a apresentar frequência oscilatória de crescimento. Nesse
período, o experimento 15R2 apresentou crescimento superior ao experimento
15R1. Ao final de cada fermentação, o resultado entre os experimentos ficou entre
6,6 e 7,50 log UFC g-1, diferente de outras fermentações com sementes
despolpadas de cupuaçu, com duração de seis dias, cuja contagem final ficou
entre 1,3 a 1,8 log UFC.g-1 (Robayo, 2010).
A presença de leveduras no processo de fermentação é fundamental,
visto que preparam o ambiente através da produção de etanol para atuação das
AAB (Lefeber et al., 2012; Ho et al., 2014). Quando suprimidas do ambiente de
fermentação, várias situações são observadas, entre elas um aumento
exacerbado de ésteres, lenta produção de ácido acético e diminuição na produção
de pirazinas. Além disso, no caso do cacau, observa-se maior quantidade de
amêndoas menos degradadas, mais úmidas e com coloração púrpura no interior
indicando uma fermentação mal sucedida (Ho et al., 2014). As leveduras são
ainda favorecidas pela baixa disponibilidade de oxigênio no meio, visto que são
pouco exigentes (Dias, 1987 citado por Lopes; Garcia; Vasconcelos, 2003).
Porém, os revolvimentos aplicados não parecem ter exercido influencia sobre
151
aqueles microrganismos nos experimentos 0R2, 7,5R1 e 7,5R2, nos quais houve
discreto aumento. Com relação a 15R1 e 15R2 foi observado declínio com a
aplicação dos revolvimentos em 28 e 48 h, provavelmente pela aeração, mas
apesar disso, retomaram o crescimento até o final. A contagem final elevada de
leveduras nos experimentos pode ser explicada pelo fato do tempo de
fermentação ter sido mais curto quando comparado aos métodos tradicionais, e no
caso dos experimentos com maior quantidade de polpa, esta, de certo modo,
ainda representou uma barreira para a entrada de oxigênio, apesar dos
revolvimentos aplicados, favorecendo assim os microrganismos.
3.1.2 Bactérias acéticas (AAB)
Durante a fermentação observou-se que 0R1 e 0R2 apresentaram
contagem máxima inferior (7,5 e 6,5 log UFC g-1, respectivamente) em relação a
7,5R1 e 7,5R2 (7,9 e 7,7 log UFC g-1, respectivamente) e 15R1 e 15R2 (7,7 e 7,6
log UFC g-1, respectivamente). Esse fato pode estar relacionado com a
concentração de polpa pela menor oferta de substratos. Em fermentação de
sementes de cacau têm sido observados valores mais baixos, na faixa de 5,2 a 6
log UFC g-1 (Ardhana; Fleet, 2003; Copetti et al., 2012), embora em outros
trabalhos com cacau, após 66 horas de fermentação, a população tenha
alcançado 6,4 a 7,5 log UFC g-1 (Camu et al., 2007). As AAB participam da
oxidação do etanol a ácido acético, desencadeando com isso reações que levam à
elevação da temperatura do meio, aumento da permeabilidade da casca, com
intensa difusão de água, ácidos orgânicos e outros compostos culminando com a
morte da semente. Esses fatores (aumento da temperatura e da concentração de
etanol) também contribuem para o declinio da população de AAB (Schwan &
Wheals, 2004), visto que algumas cepas são intolerantes, por exemplo, à
concentração elevada de etanol (Romero-Cortes, 2012). Contagem máxima de
AAB é observada 36 a 72 horas após o início da fermentação em cacau, quando
então acontece um decréscimo (Length, 2012).
Para todos os experimentos foi observado que o crescimento das AAB
foi acelerado após 12 horas do início da fermentação, embora não houvesse sido
152
aplicado revolvimento em nenhum dos experimentos. O fato é que naquele
momento o etanol produzido pela ação das leveduras serviu de substrato para o
desenvolvimento de AAB. Com 84 horas 15R1 e 15R2 apresentaram diminuição
acentuada na população de AAB. Esse declínio em tempo similar também foi
observado em trabalho de fermentação com cacau (Length, 2012). Nesse
momento os experimentos sofreram novo revolvimento, que parece ter favorecido
a retomada do crescimento das AAB até o final da fermentação.
Comparando os experimentos com menor concentração de polpa (0R1,
0R2, 7.5R1, 7.5R2) com os de maior concentração (15R1 e 15R2) nota-se que
nos primeiros o crescimento de AAB foi exponencial, enquanto que nos últimos
houve momentos de declínio e ascensão durante a fermentação, levando a
acreditar que aqueles microrganismos estavam, de certa maneira, se adaptando
às condições do ambiente, pela presença ainda abundante de polpa, a qual
representa uma barreira para a entrada de ar. Mas nas últimas horas de
fermentação, em que a polpa já estava praticamente liquefeita, o aumento da
população de AAB tornou-se mais notável, até pelas condições favoráveis ora
estabelecidas, pelo ambiente mais aerado e também pela disponibilidade de
etanol (Capítulo 4) pela ação das leveduras, cuja população naquele momento
também estava elevada.
3.1.3 Bactérias láticas (LAB)
Os resultados das contagens demonstraram que todos os experimentos
R2 apresentaram maior ascensão de LAB após 36 h. Contudo, todos os
experimentos estudados apresentaram crescimento até o final da fermentação,
com contagem final entre 7,36 e 8,43 UFC g-1.
As LAB são microrganismos que se desenvolvem bem em baixa tensão
de oxigênio (Schwan & Wheals, 2004). Em alguns trabalhos de fermentação de
cacau, o revolvimento é aplicado em um período de 48 a 96 horas após o início da
fermentação para limitar seu desenvolvimento (Guehi et al., 2010), a fim de
minimizar a metabolização de ácido cítrico pelas LAB com produção de ácido
lático, composto não volátil, que confere acidez indesejável ao produto final
153
(Afoakwa et al., 2008). Alguns trabalhos utilizando cultura inicial definida, tais
como cepas de leveduras, AAB, LAB, com atividades específicas (atividade
pectinolítica, ação sobre o ácido cítrico, tolerância à acidez, etc.) em fermentação
de cacau foram bem sucedidas, demonstrando ser importante a participação
desses microrganismos no processo (Schwan, 1998; Leal et al., 2008; Pereira et
al., 2012).
Apesar de a contaminação natural estar presente no início da
fermentação, observa-se que as culturas pré-selecionadas podem ser dominantes
no curso do processo, desde que aplicadas boas práticas agrícolas e de
fermentação (Lefeber et al., 2012). Alguns trabalhos com cacau demonstraram
que após algumas horas de fermentação acontece um declínio na população de
LAB (Ardhana & Fleet, 2003; Schwan & Wheals, 2004), sendo este fenômeno não
observado nos experimentos estudados, pois apresentaram crescimento quase
estável até o final da fermentação, apesar da acentuada elevação do pH entre 6,8
e 8,1 (Capítulo 2). Estudos com leveduras e bactérias apontam para uma possível
adaptação dos microrganismos às condições de stress e oferta reduzida de
nutrientes para o seu desenvolvimento (Gasch & Werner-Washburne, 2002).
As LAB pareceram estar bem adaptadas às condições aplicadas no
estudo tanto que ao final da fermentação, a sua contagem se sobrepôs às das
AAB, com valores de 7,8 a 8,4 log UFC.g-1 nos experimentos estudados. Essa
densidade é muito próxima à população máxima alcançada em fermentação de
cacau, com 7,5 a 8,9 log UFC.g-1 após 30-48 horas de fermentação, estabilizando
no final em 5,0-6,5 log UFC.g-1 (Camu et al., 2007). Em trabalho com fermentação
de sementes despolpadas de cupuaçu, realizadas em balaios, a contagem de LAB
não foi muito expressiva, alcançando contagem máxima de 5,1-5,5 logUFC g-1 em
48-72 horas após o início da fermentação, com a população declinando
drasticamente até o final (Gomez, 2010). Contudo, o tempo de fermentação em
trabalhos com cacau, costuma ser mais longo (5 a 7 dias), o que explicaria a
menor população registrada quando comparada as dos experimentos aqui
estudados (máximo 5 dias). À medida que a fermentação avança, mudam as
154
condições do ambiente, entre as quais a elevação do pH influenciando o
crescimento de populações de LAB, que se torna mais lento até o final da
fermentação (Ouattara et al., 2014).
Da mesma maneira como ocorreu com as AAB, também houve
alternância de no crescimento de LAB em 15R1 e 15R2, enquanto que nos outros
experimentos o crescimento foi quase constante. Apesar de serem
microrganismos que se desenvolvem em ambiente com baixa oxigenação, as LAB
parecem ter se adaptado às condições mais aeradas que ocorreram nas últimas
horas de fermentação.
3.1.4 Esporos de Bactérias Mesófilas Aeróbias (EBM) e Bactérias Termófilas
Aeróbias (EBT)
Nos momentos finais da fermentação foi observado aumento
significativo do número de EBM em todos os experimentos e respectivos
revolvimentos sem, contudo, se sobrepor a alguns grupos de microrganismos.
Exceção apenas para os experimentos 0R2 e 15R1 (Figura 1). Os experimentos
0R1, 0R2, 7,5R1 e 7,5R2 apresentaram contagens mais elevadas com 60 h,
enquanto que15R1 e 15R2 apresentaram as maiores contagens ao término da
fermentação (108 h). No final a contagem do número de EBM para todos os
experimentos ficou entre 6.1 e 7.8 log UFC g-1. Na contagem do número de EBT,
ao contrário dos experimentos 0R1, 0R2, 7,5R1 e 7,5R2 que apresentaram
valores finais iguais à contagem inicial, o comportamento daqueles
microrganismos foi diferente para 15R1 e 15R2, que apresentaram aumento
acentuado do número de esporos nas últimas horas de fermentação.
Durante a sucessão microbiana que ocorre durante a fermentação, nas
últimas horas e na fase de secagem normalmente ocorre aumento acentuado no
número esporos, se sobrepondo algumas vezes à população de outros
microrganismos (Ostovar; Keeney, 1973; Schwan et al., 1986 citados por
Romanczyk et al., 1995; Ardhana; Fleet, 2003). É o que foi observado nos
momentos finais da fermentação, no perfil dos microrganismos para ambos os
revolvimentos sendo semelhante. Nos experimentos 15R1 e R2, as condições
155
adversas estabelecidas, tais como diminuição no aporte de nutrientes, pela
liquefação da polpa, parecem ter favorecido a esporulação como forma de
resistência ao ambiente hostil.
Em fermentação de cacau, por exemplo, bactérias esporuladas
produzem vários compostos químicos durante a fermentação, podendo conferir
acidez e sabores estranhos (Schwan & Wheals, 2004). Compostos como o 2-3-
butanediol, pirazinas, ácido acético e ácido lático também são produzidos por
algumas espécies (Jinap, Harun, & Ghazali, 1994; Schwan, 1998) contribuindo, de
alguma forma, para a formação de sabor (Lopez; Quesnel, 1973; Zak et. al., 1972
citados por Romanczyk et al., 1995). Espécies de Bacillus cereus, por exemplo,
isoladas de fermentação de cacau demonstraram capacidade de produzir 2-acetil-
1-pirrolina, composto responsável pelo aroma de pipoca (Romanczyk et al., 1995).
A contagem final de EBM ficou entre 6.1 e 7.8 log UFC g-1, sendo que
os experimentos com maior quantidade de polpa (7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2)
apresentaram as maiores contagens. Esse aumento foi observado após 36 horas
de fermentação. O aumento no número de EBT só foi observado em 15R1 e
15R2, nos momentos finais da fermentação, pelos motivos já explicados: elevação
acentuada do pH do meio (7,1) para ambos experimentos e diminuição do aporte
de nutrientes.
Bactérias do gênero Bacillus são esporuladas e algumas espécies
degradam a pectina pela produção de poligalacturonase (PG) e pectinaliase (PL).
O rendimento da PG é aumentado a uma temperatura acima de 35oC, alcançando
nível máximo a 50oC (Ouattara et al., 2008). Nessa temperatura são consideradas
termófilas e o crescimento acentuado de Bacillus sp também foi observado em
fermentação de cacau após 48-72h, com contagem de 7 a 8 log UFC g-1 e
significativa reação para protease e lipase (Ardhana; Fleet, 2003). Algumas
espécies de Bacillus sobrevivem ao tratamento térmico no processamento de
cacau (Barrile et al., 1971 citado por Lima et al., 2011), formam endósporos e em
casos de extrema resistência térmica podem causar deterioração e risco à saúde
(Huemer et al., 1998 citado por Lima et al., 2011).
156
O crescimento no número de EBM nos momentos finais de
fermentação em todos os experimentos representa um perigo a ser controlado
durante as etapas de processamento do cupulate, visto que pela resistência
térmica de algumas cepas, a densidade populacional pode chegar a níveis
inaceitáveis. Com relação aos EBT, o crescimento abrupto em 15R1 e 15R2 nas
últimas horas de fermentação chama a atenção para que seja feito um controle
sobre o momento de interromper o processo, prevenindo assim, uma sobre-
fermentação que culminaria com a formação de sabores estranhos (off flavors) no
produto final.
3.2 Sequenciamento
3.2.1 Análise geral das sequências do DNA 16S e ITS4
De forma geral, foram obtidas 1.387 (0R1), 1.901 (0R2), 1.571 (7,5R1),
1.484 (7,5R2), 2.771 (15R1) e 1.846 (15R2) OUT’s para leveduras, todas (100%)
do filo Ascomycota para experimentos 0R1, 0R2, 7,5R2, 15R1. No experimento
7,5R1 foram registrados 85,7% para o filo Ascomycota e 14,3% para
Basidiomycota. Em 15R2 foram 88,9% de Ascomycota e 11,1% de Basidiomycota
(dados aqui não mostrados). Como observado, apenas os experimentos 7,5R1 e
15R2 apresentaram mais de um tipo de filo. Embora os outros experimentos com
a mesma concentração de polpa, mas com revolvimento diferente só tenham
apresentado o filo Ascomycota, é difícil dizer se a concentração de polpa ou
mesmo a forma de revolvimento tenham alguma influência. Quanto ao número de
OTU’s, 0R1 apresentou menor número em relação aos outros experimentos,
embora na contagem em placa de leveduras, a contagem final tenha ficado
próxima aos dos outros experimentos e até mesmo superior ao de 15R1.
Para bactérias foram obtidas 9.919 (0R1), 9.636 (0R2), 10.280 (7,5R1),
11.374 (7,5R2), 10.353 (15R1) e 10.988 (15R2) OUT’s. Comparando-se os
resultados de OTU’s entre as duas comunidades, observa-se que as bactérias,
além de apresentar maior número de OTU’s, apresentaram também os maiores
valores nos experimentos com maior concentração de polpa (7,5R1, 7,5R2, 15R1
e 15R2). Comparando-se com os resultados de leveduras, o número de OTU’s de
157
bactérias foi extremamente superior, o que leva a reforçar a ideia de que a polpa
constitui um fator favorável para o seu desenvolvimento.
Para a obtenção das OTU’s os reads (sequencias) com no mínimo 97%
de similaridade foram agrupados em uma mesma OTU. No caso das bactérias
foram excluídas OTU’s de cloroplastos e mitocôndrias. As OTU’s com menos de
0,5% de reads representativos e as OTU’s que não geraram sequencias
conhecidas pela análise de BLAST não foram incluídas nas análises sendo
denominadas de “unclassified”. Na Figura 2 são apresentados OTU’s para
leveduras e bactérias consideradas “unclassified”. A abundância relativa de
“unclassified” foi maior para bactérias, especialmente no primeiro dia de
fermentação para experimentos 0% polpa e no último dia de fermentação para os
experimentos 7,5 e 15% polpa.
Figura 2. Abundância relativa de OTU’s “unclassified” para leveduras e bactérias observadas em
amostras coletadas de seis experimentos distintos de fermentação de sementes de cupuaçu.
3.3 Análise de rarefação para estimativa de riqueza das populações de
bactérias
Na figura 3 são apresentadas as curvas que indicam a riqueza da
comunidade bacteriana nos experimentos 0R1 e 15R2 pelo cálculo das curvas de
rarefação, cujos resultados foram mais contrastantes em relação à acumulação e
OTU’s.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 12 36 60 0 12 36 60 84 0 12 36 60 84 0 12 36 60 84 0 12 36 60 84 108 0 12 36 60 84 108
0R1 0R2 7.5R1 7.5R2 15R1 15R2
Ab
un
dân
cia
rela
tiva
(%
)
Fermentation (h)
YEASTS BACTERIA
158
Figura 3. Curva de rarefação para bactérias durante a fermentação (h). (A): Experimento 0R1; (B):
Experimento 15R2.
Na curva de rarefação, verifica-se que tanto o experimento 0R1 quanto
15R2 continuaram a apresentar elevação no número de OTU’s, quase alcançando
uma assíntota ao final da fermentação. O experimento 15R2 apresentou também
maior número de OTU’s que 0R1. Não ocorreu estabilização em ambos os
experimentos, provavelmente pela alta diversidade presente, indicando que a
captura de bactérias no ambiente estudado não foi totalmente alcançada. Estudos
também têm demonstrado que aumentando a amostragem, são aumentadas as
0,E+00
5,E+06
1,E+07
2,E+07
2,E+07
3,E+07
1 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000
OTU
's d
e b
acté
rias
No de MiSeq reads
0 h 12 h 36 h 60 h
0,E+00
5,E+06
1,E+07
2,E+07
2,E+07
3,E+07
3,E+07
1 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000
OTU
's d
e b
acté
rias
No de MiSeq reads
0h 12h 36h 60h 84h 108h
(B)
(A)
159
chances de observação das populações de microrganismos em qualquer ambiente
(Hugues et al., 2001). Isso leva a crer que há possibilidade de haver maior
diversidade em ambientes de fermentação na ordem de toneladas em relação ao
ambiente de fermentação como o que foi estudado, no qual a quantidade média
de sementes estava em torno de 8 Kg. Assim, a curva de rarefação indica
claramente que a diversidade de bactérias presentes no ambiente de fermentação
pode ser muito mais ampla. Além disso, a maior parte dos reads obtidos para o
domínio bactéria pertencia a cloroplastos e mitocôndrias, não sendo, portanto,
incluídos nas análises.
Na Figura 4 são apresentados os resultados de beta-diversidade (Bray-
Curtis) para cada condição de fermentação em relação a bactérias (A) e leveduras
(B).
Figura 4. Similaridade de populações de bactérias (A) e leveduras (B) entre os seis experimentos
de fermentação de sementes de cupuaçu.
Para o domínio bactéria observa-se que ocorreu um agrupamento em
função da porcentagem de despolpamento. Para o despolpamento total (0%) a
microbiota entre revolvimento fixo (R1) e revolvimento feito de acordo com a
queda da temperatura do meio de fermentação (R2) apresentou acima de 80% de
similaridade. Para o despolpamento de 7,5 e 15 % a porcentagem de similaridade
entre R1 e R2 foi de aproximadamente 65% (Figura 4A). Observou-se queda de
15% de similaridade entre as condições R1 e R2 quando comparada a
porcentagem de despolpamento de 0% com 7,5 e 15% (Figura 4A). Ou seja, o
despolpamento total (0%) favorece a maior similaridade entre os experimentos nos
(A) (B)
7,5
R2
7,5
R1
0R
1
0R
2
15R
1
15R
2
7,5
R2
15R
2
7,5
R1
15R
1
0R
1
0R
2
160
diferentes processos fermentativos. Foi percebido que a similaridade entre as
populações do domínio bactéria tendem à diminuir com maior concentração de
polpa, concluindo que nesse caso ocorra um aumento na diversidade bacteriana
nessas condições.
Por outro lado, para leveduras as amostras não se agruparam em
função do despolpamento. Além disso, observou-se menor similaridade entre as
amostras com valores que oscilaram entre 45 % e 100%. Mas foi observado índice
maior de similaridade entre experimentos de diferentes concentrações de polpa,
mas com revolvimentos iguais: 0R1 e 15R1 (± 68%); 7,5R2 e 15R2 (100%) (Figura
4B). Apesar desse fato, com exceção de 7.5R2 e 15R2, a similaridade de
leveduras entre os outros experimentos foi menor que o observado em bactérias,
supondo que a aeração fornecida em diferentes momentos causou uma alteração
no ambiente, afetando de alguma forma a população de leveduras independente
da concentração de polpa.
Na Tabela 1 são apresentados os resultados das análises estatísticas
de diversidade e riqueza (Índice de Shannon e Chao1, respectivamente) nos seis
experimentos durante a fermentação. Em relação aos dados de alfa-diversidade
(na qual é feita a observação de diversidade dentro de uma amostra) para cada
tempo e condição de fermentação, observou-se que os valores de Shannon para o
domínio bactéria variaram entre 3,71 a 5,47. Além disso, notou-se aumento dos
valores em função do tempo de fermentação (h). Por outro lado, os valores de
Shannon para leveduras não foram superiores a 1.77, sendo, portanto, indicativo
de baixa diversidade da comunidade nas amostras. Contudo, os valores de
Shannon para experimentos 0R1 e 0R2 nas primeiras horas de fermentação foram
mais elevados que para os experimentos 7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2, indicando
que a polpa exerce uma influência negativa sobre as leveduras. O índice de
Chao1 revelou maior riqueza para o domínio bactéria, que foi aumentando ao
longo da fermentação (Tabela 1).
Embora as leveduras exerçam um importante papel no preparo do
ambiente para a ação das bactérias no início da fermentação, os resultados
161
apresentados na Tabela 1 demonstram que estas últimas são bastante ativas em
todo o processo, tendo sua participação aumentada na metade até o final da
fermentação. Pela grande diversidade encontrada do domínio bactéria em todos
os experimentos supõe-se que as diferentes populações presentes colaboram de
alguma maneira na transformação do ambiente. Pela diversidade e riqueza de
leveduras encontradas nos experimentos, os resultados levam à supor que as
bactérias são dominantes durante o processo, especialmente se a demanda de
polpa é maior.
162
Tabela 1. Análise estatística de diversidade para bactérias e leveduras
BACTÉRIAS LEVEDURAS
EXP Fermentação
(h)
Shannon
Media
Chao1
Media
Shannon
Média
Chao1
Média
0R1
0 3,92 ± 0,02 3349 ± 175 1,60 ± 0,01 15,00 ± 0,71
12 4,27 ± 0,32 3784 ± 945 1,02 ± 0,21 15,67 ± 3,09
36 4,38 ± 0,09 3723 ± 294 1,14 ± 0,22 15,00 ± 2,16
60 4,71 ± 0,15 4103 ± 163 1,31 ± 0,16 13,33 ± 2,62
0R2
0 3,97 ± 0,02 3435 ± 175 1,77 ± 0,01 17,00 ± 2,12
12 4,11 ± 0,16 3267 ± 443 1,44 ± 0,36 13,00 ± 2,45
36 4,53 ± 0,24 3729 ± 144 0,95 ± 0,29 14,33 ± 1,25
60 4,81 ± 0,21 4058 ± 205 1,00 ± 0,20 12,00 ± 1,25
84 5,25 ± 0,23 5338 ± 744 1,32 ± 0,40 16,00 ± 2,94
7,5R1
0 3,82 ± 0,02 8604 ± 265 0,03 ± 0,02 3,00 ± 0,00
12 4,03 ± 0,26 3590 ± 520 0,60 ± 0,24 13,33 ± 3,30
36 4,34 ± 0,22 3732 ± 295 0,67 ± 0,21 10,00 ± 2,94
60 4,80 ± 0,33 4527 ± 420 1,26 ± 0,38 14,67 ± 4,32
84 5,11 ± 0,15 5109 ± 418 1,10 ± 0,08 10,00 ± 0,82
7,5R2
0 3,75 ± 0,02 8524 ± 267 0,04 ± 0,02 4,00 ± 0,71
12 4,07 ± 0,23 3308 ± 555 0,64 ± 0,03 14,33 ± 0,47
36 4,55 ± 0,18 3999 ± 81 0,80 ± 0,19 14,33 ± 0,47
60 4,37 ± 0,50 4046 ± 422 0,92 ± 0,25 10,67 ± 1,89
84 5,47 ± 0,17 6049 ± 505 1,14 ± 0,12 12,67 ± 0,47
15R1
0 3,72 ± 0,02 3311 ± 168 0,82 ± 0,00 11,00 ± 0,71
12 3,79 ± 0,04 3149 ± 105 0,60 ± 0,11 13,33 ± 1,25
36 3,74 ± 0,06 3261 ± 122 0,89 ± 0,21 10,67 ± 0,47
60 4,43 ± 0,36 4015 ± 410 1,19 ± 0,27 11,67 ± 0,82
84 4,36 ± 0,02 3797 ± 206 1,15 ± 0,06 10,33 ± 2,05
108 4,99 ± 0,14 4546 ± 239 1,09 ± 0,21 10,00 ± 0,82
15R2
0 3,71 ± 0,02 3220 ± 172 0,74 ± 0,01 11,00 ± 0,71
12 3,82 ± 0,12 3202 ± 256 0,23 ± 0,02 12,33 ± 0,47
36 3,95 ± 0,11 3197 ± 191 0,63 ± 0,09 12,67 ± 0,47
60 4,43 ± 0,29 3878 ± 248 0,68 ± 0,02 9,67 ± 1,70
84 4,46 ± 0,07 3685 ± 178 1,04 ± 0,17 9,00 ± 0,82
108 5,22 ± 0,14 5451 ± 299 0,80 ± 0,04 7,00 ± 0,00
163
3.4 Composição do perfil taxonômico das comunidades de leveduras e
bactérias identificadas
Na Tabela 2 é apresentado o perfil taxonômico das comunidades de
leveduras e bactérias, a partir do nível CLASSE, ORDEM e FAMÍLIA identificadas
durante a fermentação de sementes de cupuaçu.
Tabela 2. Perfil taxonômico das comunidades de leveduras e bactérias identificadas nos experimentos 0R1, 0R2, 7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2*.
LEVEDURAS
CLASSE ORDEM FAMÍLIA
Cystobasidiomycetes (a) Cystobasidiales Cystobasidiaceae (3,6)
Dothideomycetes (b) Capnodiales Cladosporiaceae (1,2)
Eurotiomycetes (b) Eurotiales Aspergillaceae (1,2)
Malasseziomycetes (a) Malasseziales Malasseziaceae (3)
Saccharomycetes (b) Saccharomycetales
Candidaceae (2,3,4,5,6); Debaryomycetaceae (1,2,3,4,5); Dipodascaceae (3,5); Metschnikowiaceae (2); Phaffomycetaceae
(1,2,3,4,5,6); Pichiaceae (1,2,3,4,5,6); Saccharomycodaceae (1,2,3,4,5,6); Saccharomycopsidaceae (2)
Sordariomycetes (b) Hypocreales Nectriaceae (1,2)
Sordariomycetes (b) Xylariales Xylariaceae (1,2,3,4,5,6)
BACTÉRIAS
CLASSE ORDEM FAMÍLIA
Actinobacteria Corynebacteriales Nocardiaceae (5)
Actinobacteria Streptoporangiales Nocardiopsaceae (5)
Bacilli Bacillales Bacillaceae (5,6); Paenibacillaceae (5,6); Planococcaceae
(1,2,3,4,5,6); Staphylococcaceae (4,5);
Bacilli Lactobacillales Carnobacteriaceae (3,4); Enterococcaceae (5,6);
Lactobacillaceae (1,2,3,4,5,6); Leuconostocaceae (2,3,4,5,6); Streptococcaceae (3,4,6)
Clostridia Clostridiales Clostridiaceae (2,6); Lachnospiraceae (5,6)
Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae (3,4,5,6)
Sphingobacteriia Sphingobacteriales Sphingobacteriaceae (5,6)
α-Proteobacteria Caulobacteriales Caulobacteraceae (5)
α-Proteobacteria Rhizobiales Methylobacteriaceae (5)
α-Proteobacteria Rhodospirillales Acetobacteraceae (1,2,3,4,5,6)
α-Proteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae (5)
α-Proteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae (3,4)
β-Proteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae (5); Comamonadaceae (5)
β-Proteobacteria Hydrogenophilales Hydrogenophilaceae (3,4)
β-Proteobacteria Neisseriales Neisseriaceae (3,4)
γ-Proteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae (1,3,4,5,6)
γ-Proteobacteria Pseudomonadales Moraxellaceae (3,4,5,6); Pseudomonadaceae (3,4,5)
γ-Proteobacteria Xanthomonadales Xanthomonadaceae (5,6)
δ-Proteobacteria Bdellovibrionales Bacteriovoracaceae (3,4)
*Legenda: 1 (0R1); 2 (0R2); 3 (7.5R1); 4 (7.5R2); 5 (15R1); 6 (15R2). (a) Filo Basidiomycota; (b) Filo Ascomycota
164
A ordem Saccharomycetales foi a mais frequente entre todos os
experimentos (Tabela 2), e a única a ter a identificação de leveduras estendida até
o nível gênero (Figuras 5, 6 e 7). Naquela ordem estão incluídos gêneros de
leveduras (Saccharomyces, Issatchenkia, Hanseniaspora, Candida, Pichia)
envolvidos em fermentação de frutas, com comprovadas propriedades
sacarolíticas (Schwan & Wheals, 2004; Oslan et al., 2012).
Ainda no nível ORDEM é possível observar que os experimentos com
sementes despolpadas (0R1 e 0R2) apresentaram maior diversidade de
leveduras, indicando uma influência positiva da ausência de polpa sobre aqueles
microrganismos. Em bactérias, a diversidade apresentou situação inversa. A
ORDEM de bactérias foi mais diversa para os experimentos com maior
concentração de polpa, especialmente o 15R1, enquanto que o 0R1 apresentou a
menor variedade (Tabela 2).
A composição química e concentração da polpa aderida às sementes
de cupuaçu são fatores que influenciam na adaptação de microrganismos ao
ambiente. Em sementes de cacau, as leveduras são os microrganismos que
atuam inicialmente na fermentação, preparando, de certa maneira, o ambiente
para os outros microrganismos. É uma fase considerada anaeróbica na qual os
açúcares são metabolizados pelas leveduras e transformados em etanol para
utilização, na fase aeróbica, pelas bactérias acéticas (Schwan & Wheals, 2004).
A CLASSE de bactérias α-Proteobacteria esteve frequentemente
presente em todos os experimentos, representada por diferentes ordens (Tabela
2). Dentro da ORDEM Rhodospirillales estão membros da família
Acetobacteraceae (bactérias acéticas), cuja presença em fermentação alcança
maior projeção em fase mais adiantada, após a fase anaeróbica, visto que o
ambiente aerado, em conjunto com a presença de etanol, favorece o seu
desenvolvimento.
Observa-se que os experimentos com maior quantidade de polpa
apresentaram maior diversidade no nível de famílias possivelmente favorecendo o
desenvolvimento daquelas populações. Durante a fermentação alterações
165
bioquímicas ocorrem ocasionando alterações no pH do meio, facilitando o
desenvolvimento de algumas espécies de microrganismos, desfavorecendo outros
grupos. Estes fatores podem ter contribuído para a supressão de algumas
populações que estavam presentes logo no início da fermentação.
As Figuras 5, 6 e 7 apresentam os gêneros de leveduras e bactérias
identificadas durante a fermentação nos seis experimentos.
166
0R1 0R2 0R1 0R2
LEVEDURAS 0 12 36 60 0 12 36 60 84 BACTERIA 0 12 36 60 0 12 36 60 84
Candida(1) Acetobacter (8)
Lodderomycesclade(2) Gluconobacter (8)
Meyerozyma(2) Clostridium (9)
Yarrowia (3) Escherichia (10)
Kodamaea (4) Lactobacillus (11)
Starmera (5) Weissella (12)
Wickerhamomyces (5)
Sphingobacterium (13)
Ogataea (6)
Pichia (6)
Saturnispora (6)
Issatchenkia (7)
Saccharomyces (7)
Hanseniaspora (7)
Saccharomycodes (7)
Saccharomycopsis (7)
Figure 5. Taxonomia no nível gênero de leveduras e bactérias identificado durante a fermentação (h) e abundância relativa (%): <1, cinza; 1-10, verde; 10-50, azul; 50-80, vermelho;
80-100, preto. Família (Levedura): (1) Candidaceae; (2) Debaryomycetaceae; (3) Dipodascaceae; (4) Metschnikowiaceae; (5) Phaffomycetaceae; (6) Pichiaceae; (7)
Saccharomycetaceae; Família (Bactéria): (8) Acetobacteraceae; (9) Clostridiaceae; (10) Enterobacteriaceae; (11) Lactobacillaceae; (12) Leuconostocaceae; (13) Sphingobacteriaceae.
167
7,5R1 7,5R2 7,5R1 7,5R2
LEVEDURAS 0 12 36 60 84 0 12 36 60 84 BACTERIA 0 12 36 60 84 0 12 36 60 84
Candida (1) Acetobacter (10)
Cystobasidium (2) Gluconobacter (10)
Kurtzmaniella (3) Peredibacter (11)
Lodderomycesclade (3) Dolosigranulum (12)
Meyerozyma (4) Escherichia (13)
Yarrowia (5) Chryseobacterium (14)
Malassezia (6) Empedobacter (14)
Starmera (7)
Flavobacterium (14)
Ogataea (8) Wautersiella (14)
Pichia (8) Hydrogenophilus (15)
Saturnispora (8) Lactobacillus (16)
Issatchenkia (9) Weissella (17)
Saccharomyces (9) Acinetobacter (18)
Hanseniaspora (9) Pseudomonas (19)
Sphingomonas (20)
Staphylococcus (21)
Streptococcus (22)
Figure 6. Taxonomia no nível gênero de leveduras e bactérias identificado durante a fermentação (h) e abundância relativa (%): <1, cinza; 1-10, verde; 10-50, azul; 50-80, vermelho;
80-100, preto. Família (Levedura): (1) Candidaceae; (2) Cystobasidiaceae; (3) Debaryomycetaceae; (4) Debaryomycetaceae; (5) Dipodascaceae; (6) Malasseziaceae; (7)
Phaffomycetaceae; (8) Pichiaceae; (9) Saccharomycetaceae. Família (Bactéria): (10) Acetobacteraceae; (11) Bacteriovoracaceae; (12) Carnobacteriaceae; (13) Enterobacteriaceae;
(14) Flavobacteriaceae; (15) Hydrogenophilaceae; (16) Lactobacillaceae; (17) Leuconostocaceae; (18) Moraxellaceae; (19) Pseudomonadaceae; (20) Sphingomonadaceae; (21)
Staphylococcaceae; (22) Streptococcaceae.
168
15R1 15R2 15R1 15R2
LEVEDURAS 0 12 36 60 84 108 0 12 36 60 84 108 BACTERIA 0 12 36 60 84 108 0 12 36 60 84 108
Candida (1)
Acetobacter (8)
Cystobasidium (2) Gluconobacter (8)
Lodderomycesclade (3) Komagataeibacter (8)
Yarrowia (4) Bacillus (9)
Starmera (5) Ralstonia (10)
Ogataea (6) Brevundimonas (11)
Pichia (6) Clostridium (12)
Saturnispora (6)
Shigella (13)
Issatchenkia (7)
Enterococcus (14)
Saccharomyces (7)
Chryseobacterium (15)
Hanseniaspora (7) Empedobacter (15)
Flavobacterium (15)
Figura 7. Taxonomia no nível gênero de leveduras e bactérias identificado durante a fermentação (h) e abundância relativa (%): <1, cinza; 1-10, verde; 10-50, azul; 50-80, vermelho; 80-100, preto. Família (Leveduras): (1) Candidaceae; (2) Cystobasidiaceae; (3) Debaryomycetaceae; (4) Dipodascaceae; (5) Phaffomycetaceae; (6) Pichiaceae; (7) Saccharomycetaceae; Família (Bactéria): (8) Acetobacteriaceae; (9) Bacillaceae; (10) Burkholderiaceae; (11) Caulobacteraceae; (12) Clostridiaceae; (13) Enterobacteriaceae; (14) Enterococcaceae; (15) Flavobacteriaceae; (16) Lactobacillaceae; (17) Leuconostocaceae; (18) Methylobacteriaceae; (19) Moraxellaceae;(20) Nocardiaceae;
(21) Nocardiopsaceae; (22) Paenibacillaceae; (23) Planococcaceae; (24) Pseudomonadaceae; (25) Sphingobacteriaceae; (26) Staphylococcaceae; (27) Streptococcaceae; (28) Xanthomonadaceae.
Wautersiella (15)
Lactobacillus (16)
Weissella (17)
Methylobacterium (18)
Acinetobacter (19)
Rhodococcus (20)
Nocardiopsis (21)
Brevibacillus (22)
169
Paenibacillus (22)
Kurthia (23)
Rummeliibacillus (23)
Pseudomonas (24)
Sphingobacterium (25)
Staphylococcus (26)
Streptococcus (27)
Frateuria (28)
Stenotrophomonas (28)
170
Leveduras do gênero Pichia utilizam o etanol como fonte de carbono
(Oslan et al., 2012) e também o ácido cítrico, causando a elevação do pH do meio,
favorecendo o ambiente para as bactérias, algumas com atividade pectinolítica
(Schwan & Wheals, 2004). Com relação ao etanol, de fato a abundância do gênero
em todos os experimentos passou a ser mais expressiva a partir de 36 h para os
experimentos com maior concentração de polpa, quando a produção do composto
(Capítulo 4) por outras leveduras, naquela fase, já está bastante acentuada (Figuras
6 e 7). Nos experimentos com 0% polpa a presença do microrganismo apresentou
elevação desde o início, possivelmente favorecida pela baixa concentração de polpa
(Figura 5). Em fermentação de sementes de cacau, a presença do gênero Pichia
também é mais acentuada a partir da metade da fermentação até os momentos
finais (Schwan, 1998; Nielsen et al., 2007; Hamdouche et al., 2014).
Assim como foi constatado em fermentação de cacau (Schwan & Wheals,
2004), o gênero Saccharomyces foi detectado durante todo o período de
fermentação dos experimentos, exceto para 0R1, por motivos ainda desconhecidos,
com a diferença de que em cupuaçu sua presença não foi dominante quando
comparado com outros gêneros de leveduras.
Conhecido na antiga nomenclatura como Kloeckera, o gênero
Hanseniospora apresentou abundancia relativa durante a fase intermediária da
fermentação em todos os experimentos (Figuras 5, 6 e 7). Desde o início do
processo a sua presença foi dominante em relação aos outros gêneros. Situação
semelhante é observada em fermentação cacau, com a Hanseniospora
predominando na fermentação (Ardhana & Fleet, 2003; Hamdouche et al., 2014).
Em fermentação de cacau, espécies do gênero Hanseniospora e Saccharomyces
têm sido apontadas como as maiores produtoras de compostos voláteis (Schwan &
Wheals, 2004) e, juntamente com espécies de Candida, são as leveduras mais
significativas em relação ao crescimento (Ardhana & Fleet, 2003). Em fermentação
de cacau, através de métodos não culturais, foi possível identificar a predominância
de espécies de Hanseniospora, em contraponto ao gênero Saccharomyces que
foram dominantes em métodos culturais (Papalexandratou et al., 2013). Os autores
acreditam que o meio de cultura utilizado (MEA) favorece o gênero Saccharomyces,
171
por ser um microrganismo que utiliza a maltose, presente no meio de cultura, ao
contrário de Hanseniospora, gênero não fermentador do açúcar.
Apesar de a população de Saccharomyces e Candida não ter sido tão
expressiva, a presença dos gêneros nos experimentos até o final da fermentação
indica uma resistência às condições adversas que ocorrem, tais como elevação
acentuada do pH e temperatura (dados aqui não mostrados). Condições
semelhantes foram observadas em fermentação de cacau com os microrganismos
citados, sendo observado também que quanto maior a concentração de etanol no
meio, mais fraco é o desenvolvimento de algumas espécies de leveduras (Ardhana
& Fleet, 2003). De qualquer maneira, a população de leveduras tende a decair até o
final do processo (Schwan, 1998), embora nos experimentos de cupuaçu, pelo
método cultural, tenha sido observado o contrário (Figura 1). A explicação estaria no
fato de que algumas cepas não podem ser obtidas em meios culturais, com a
contagem refletindo apenas a presença de microrganismos viáveis no meio de
cultura. Um exemplo seria o gênero Pichia que como já foi citado, evoluiu até o final
da fermentação em alguns experimentos (Figuras 5, 6 e 7).
A presença de leveduras em fermentação de cacau é essencial, visto que
sua subtração do processo implica na obtenção de produto (chocolate) com
ausência de sabor característico, além de elevada acidez (Ho et al., 2014). Estudos
comprovam que, dependendo da espécie de levedura presente em fermentação, há
influencia no sabor final do chocolate dependendo da cultura starter utilizada. A
espécie Pichia kluyveri, por exemplo, confere sabor mais doce e frutado ao
chocolate, enquanto que a espécie Kluyveromyces marxianus confere sabor mais
amargo, azedo e adstringente (Crafack et al., 2013). Esta última espécie citada, tem
sua forma sexuada conhecida como Candida kefir (Deak & Beuchat, 1996). Apesar
das espécies dos gêneros encontrados não terem sido identificadas, verifica-se que
a abundância de Pichia foi bem maior que os outros gêneros em todos os
experimentos. Nos resultados de análise sensorial (Capítulo 3) as amostras de
cupulates foram caracterizadas como frutadas e doces, embora todas tenham
também apresentado residual amargo. O gênero Pichia pode ter influência na
característica sensorial descrita.
172
Outros gêneros de leveduras foram identificados nos experimentos, mas
sua abundância foi variável e não chegou a ser dominante como ocorreu com os
gêneros Pichia e Hanseniospora (Figuras 5, 6 e 7). Estes dois últimos, por sinal,
parece terem sido bastante favorecidos pela concentração de polpa, especialmente
a Hanseniospora. Estudos recentes têm demonstrado, de fato, que grupos de
leveduras em fermentação de cacau são constituídos de um pequeno número de
gêneros dominantes (algumas espécies de Saccharomyces, Pichia, Hanseniospora,
Torulaspora, Kluyveromyces) e por um segundo grupo representado por gêneros
variáveis, mas em menor concentração (Meersman et al., 2013; Ho et al., 2015). De
qualquer forma, a fermentação de cupuaçu também apresentou a mesma
característica, sendo que a abundância de algumas populações ocorreu em
diferentes momentos da fermentação, se adequando às condições existentes no
momento. Foi o que aconteceu com o gênero Pichia, com crescimento aumentado
nas últimas horas de fermentação, quando a produção de etanol estava mais
elevada. Vale ressaltar, como já foi mencionado, que aquele microrganismo utliza o
etanol como fonte de carbono.
Para as bactérias láticas, o gênero Weissella da família
Leuconostocaceae, esteve mais abundante nos primeiros dias de fermentação em
todos os experimentos, enquanto que o gênero Lactobacillus da família
Lactobacillaceae, teve presença mais expressiva após o início da fermentação com
leve declínio no final. Há indícios de que LAB do gênero Weissella não suportam
ambiente com temperatura elevada e concentração de etanol em nível também
elevado, enquanto que algumas espécies do gênero Lactobacillus possuem
habilidade de crescimento nessas condições (Pereira et al., 2012). Isso explicaria a
predominância de Lactobacillus e supressão de Weissella durante a fermentação de
cupuaçu nos períodos em que a temperatura do meio esteve aumentada e o nível de
etanol elevado (Capítulo 2).
A predominância do gênero Lactobacillus tem sido bastante observada
em estudos com fermentação de cacau. A maioria das espécies do gênero
identificadas são homofermentativas (Kostinek et al., 2008; Ouattara et al., 2014).
Na fermentação de cupuaçu, foi observado que a abundância de Lactobacillus
acentuou-se a partir de 12 horas, mas especialmente com 36 h nos experimentos
173
0R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2 (Figuras 5, 6 e 7). De fato, tem sido demonstrado que as
LAB apresentam intensa participação algumas horas após o início da fermentação,
evoluindo durante a mesma e apresentando declínio no final. Nos experimentos
analisados, tanto na contagem de LAB (Figura 1) quanto na abundância relativa do
gênero Lactobacillus nos experimentos a concentração dos microrganismos
permaneceu quase estável até o final da fermentação, cujo tempo, quando
comparado ao de cacau, foi bem mais curto, indicando que talvez o processo ainda
estivesse em pleno curso.
A importância do papel das LAB na fermentação de cacau ainda é
questionável por alguns estudiosos. Foi demonstrado, por exemplo, que alguns
aspectos físico-químicos (pH, concentração de ácidos orgânicos e compostos
voláteis) durante a fermentação, não sofrem influencia por LAB (Ho et al., 2015).
Mas no mesmo estudo, os autores verificaram que os chocolates produzidos com e
sem a presença de LAB não diferiram sensorialmente.
Por outro lado, trabalhos realizados com cacau têm demonstrado que a
adição de LAB em concentrações e intervalos definidos durante a fermentação
confere às amêndoas aumento da qualidade com relação ao aspecto de bem
fermentada (Mai et al., 2014). Espécies heterofermentativas como Lactobacillus
fermentum são consideradas desejáveis pela obtenção de compostos de sabor, tais
como acetoína e 2,3-butanediol, por sua ação sobre o ácido cítrico (Lefeber et al.,
2011). Há outros estudos que também defendem o uso de LAB como culturas starter
na fermentação de cacau, pela potente ação heterofermentativa que algumas
espécies possuem (Ouattara et al., 2014). De qualquer maneira, a população de
LAB, especialmente Lactobacillus, esteve aumentada em todos os experimentos,
principalmente a partir de 12 h mantendo o nível quase constante até o final da
fermentação. A produção de acetoína ou 3-hidroxi-2-butanona (Capítulo 4), por
exemplo, esteve elevada no final da fermentação de 0R1 e durante a metade da
fermentação de 15R2, coincidindo com os picos de crescimento de LAB.
No grupo de AAB, o gênero Gluconobacter esteve abundante nos
primeiros dias de fermentação para todos os experimentos, ao contrário do gênero
Acetobacter cuja expressão foi maior nas últimas horas de fermentação,
especialmente quando se observa maior produção de ácido acético no período. Em
174
fermentação de sementes de cacau, a presença do gênero Acetobacter é mais
frequente que o Gluconobacter (Schwan & Wheals, 2004) e costuma ocorrer desde
o início da fermentação (Papalexandratou et al., 2013).
O gênero Gluconobacter possui a habilidade de oxidar a glicose a ácido
glucônico, enquanto que o Acetobacter oxida o etanol a ácido acético (Yamada &
Yukphan, 2008). Assim, a abundância de Gluconobacter nas horas iniciais da
fermentação pode estar relacionada com a maior disponibilidade de glicose,
presente na polpa. Em método cultural a contagem inicial estava baixo para AAB e
com provável predomínio do último gênero citado.
O gênero Acetobacter, especialmente a espécie pasteurianus, é quase
uma unanimidade com relação à predominância no ambiente de fermentação
(Meersman et al., 2013; Papalexandratou et al., 2013), mas em outro trabalho com
fermentação de cacau foi observado que determinadas cepas de Acetobacter
tropicalis eram dominantes (Romero-Cortes, 2012). De qualquer maneira, estudos
indicam que a A. pasteurianus é dominante na primeira metade da fermentação,
sendo que a partir daí até as últimas horas A. tropicalis passa a dominar (Nielsen et
al., 2007).
A. pasteurianus é a espécie mais resistente ao calor e acidez (Camu et
al., 2008). De fato, Acetobacter esteve mais abundante a partir de 36 h de
fermentação na maioria dos experimentos, quando a concentração de etanol já
estava elevada, acentuando-se com 60 h, momento em que o ácido acético passa a
predominar no ambiente (Capítulo 2). AAB também são capazes de converter
álcoois, por desidrogenação, em outros tipos de ácidos (propanoico, butanoico, 2-
metilpropanoico, 2-metilbutanoico, 3-metilbutanoico), que são potentes compostos
de sabor (Schrader, 2007). A produção destes, além de ácido acético, também foi
constatada (Capítulo 4) nos mesmos intervalos de tempo nos quais a população de
AAB estava aumentada em 0R1 e 15R2 0R1 (metade e final da fermentação para
ambos experimentos).
Alguns gêneros da família Enterobacteriaceae (Escherichia, Shigella)
foram identificados nos experimentos. Alguns autores sugerem que estes
microrganismos poderiam ser utilizados como marcadores específicos na etapa de
fermentação de cacau (Hamdouche et al., 2014). Alguns sorotipos de Escherichia
175
coli e espécie de Shigella são potencialmente patogênicos, representando problema
de saúde pública (Balbani & Butugan, 2001). Entretanto, por serem termolábeis,
esses microrganismos podem ser eliminados durante o processamento térmico
(torração das amêndoas).
Nos experimentos com maior quantidade de polpa (15R1 e 15R2) foi
observado o surgimento, ao final da fermentação, de bactérias do gênero Bacillus,
microrganismos esporulados. A família Clostridiaceae se manifestou nos
experimentos 0R2 e 15R2 nas últimas horas de fermentação. De fato, os
microrganismos das famílias citadas são favorecidos quando ocorre mudança no
ambiente de fermentação, pela elevação do pH do meio, a qual foi observada nas
horas finais de fermentação (Schwan & Wheals, 2004). No caso de EBT, a
contagem de esporos foi referente aos microrganismos aeróbios, provavelmente
bacilos termofílicos. Foi observada a elevação do número de esporos de EBT em
15R1 e 15R2 nas últimas horas, claramente relacionada com a diminuição da ofertas
de nutrientes, estímulando a esporulação dos microrganismos, como forma de
resistência às condições que foram se estabelecendo. Da mesma maneira o
crescimento d o número de EBM ocorreu ao longo da fermentação se intensificando
no final. A presença de espécies esporuladas de Bacillus pode representar um
perigo difícil de ser controlado se não forem mantidos níveis mais baixos do
microrganismo no ambiente, como ocorre, por exemplo, com o B. cereus. Algumas
espécies de Bacillus crescem bem à temperatura ambiente. A detecção de
diferentes espécies de Bacillus em chocolate em pó tem demonstrado diferenças na
resistência dos mesmos ao tratamento térmico aplicado, comprometendo a
qualidade do produto final (Lima et al., 2011).
Estabelecendo-se uma comparação entre os microrganismos
identificados por metagenômica e a contagem padrão observa-se relativa
similaridade entre os resultados, principalmente para a família Lactobacillaceae com
tendência de crescimento similar durante o período de fermentação. Na contagem
de esporos, especialmente de bactérias termófilas, a tendência de crescimento
segue o mesmo padrão apresentado para a família Planococcaceae. Com relação
às AAB, a tendência de crescimento apresentada nos dois resultados é semelhante,
sendo que em metagenômica expressaram declínio da família Acetobacteraceae ao
176
final da fermentação. Embora alguns estudos concordem que o crescimento de
leveduras, LAB e AAB aconteça na forma de sucessão (Schwan & Wheals, 2004),
na contagem padrão foi observado que o desenvolvimento desses microrganismos
ocorreu de forma quase simultânea, assim como já ocorreu em fermentação de
cacau (Camu et al., 2008).
4. CONCLUSÃO
Os resultados de sequenciamento de larga escala mostraram que, apesar
de a diversidade bacteriana não ter sido totalmente capturada no ambiente de
fermentação de cupuaçu, foi identificada maior diversidade, especialmente nos
experimentos com maior quantidade de polpa (7,5 e 15%), embora o mesmo
aspecto não tenha sido observado para leveduras. A estimativa de riqueza também
foi baixa para essa comunidade. Vale ressaltar que o método não cultural em
fermentação de cupuaçu possibilitou identificar os microrganismos e sua
predominância em vários momentos da fermentação. Embora limitado, o método
cultural serviu de apoio para balizar a densidade de populações ao longo da
fermentação, quando confrontados os dados aos resultados de sequenciamento por
metagenômica. Esta última mostrou ser uma importante ferramenta para o
aprofundamento e conhecimento da dinâmica de fermentação de cupuaçu, até então
desconhecida, revelando a importância da concentração de polpa na evolução do
processo. O presente trabalho é pioneiro, pois demonstra que a remoção completa
da polpa subtrai substratos que durante a fermentação podem sofrer transformações
bioquímicas, fornecendo importantes compostos de sabor. Assim, o despolpamento
parcial deve ser considerado, para a obtenção de produto com características
sensoriais desejáveis. Além disso, os microrganismos identificados no presente
trabalho poderão servir de parâmetro em fermentações controladas, para produtores
que desejem obter êxito no processo.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq (Processo n° 485287/2011-0) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo – FAPESP (Processo 2012/00296-4) pelos recursos concedidos para
o desenvolvimento da pesquisa. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas – FAPEAM e SECT (Secretaria de Ciência e Tecnologia do Amazonas),
177
pela concessão da bolsa. Ao Laboratório Central de Saúde Pública do Amazonas –
LACEN pela permissão de uso das instalações e equipamentos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Afoakwa, E. (2011). Chocolate Science and Technology (1st ed.). Wiley-Blackwell.
Afoakwa, E., Paterson, A., Fowler, M., & Ryan, A. (2008). Flavor formation and
character in cocoa and chocolate: a critical review. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 48(9), 840–857.
http://doi.org/10.1080/10408390701719272
Altschul, S., Madden, T., Schäffer, A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., & Lipman, D.
J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein
database search programs. Nucleic Acids Research, 25(17), 3389–3402.
http://doi.org/10.1093/nar/25.17.3389
Ardhana, M., & Fleet, G. (2003). The microbial ecology of cocoa bean fermentations
in Indonesia. International Journal of Food Microbiology, 86(1-2), 87–99.
http://doi.org/10.1016/S0168-1605(03)00081-3
Balbani, A.; Butugan, O. (2001). Contaminação biológica de alimentos. Pediatria.
23(4):320-328.
Barel, M. (1997). La Fermentation du Cacao : Le Moyen de L’apprecier Et de La
Maitriser. Revue Des Industries Alimentaires et Agricoles, 14, 211–214.
Beckett, S. T. (2009). Industrial Chocolate Manufacture and Use. (S. T. Beckett, Ed.)
(4th ed.). York, UK: Wiley-Blackwell.
Camu, N., De Winter, T., Verbrugghe, K., Cleenwerck, I., Vandamme, P., Takrama,
J. S., … De Vuyst, L. (2007). Dynamics and biodiversity of populations of lactic
acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap
fermentation of cocoa beans in Ghana. Applied and Environmental Microbiology,
73(6), 1809–1824. http://doi.org/10.1128/AEM.02189-06
178
Camu, N., González, Á., De Winter, T., Van Schoor, A., De Bruyne, K., Vandamme,
P., … De Vuyst, L. (2008). Influence of turning and environmental contamination
on the dynamics of populations of lactic acid and acetic acid bacteria involved in
spontaneous cocoa bean heap fermentation in Ghana. Applied and
Environmental Microbiology, 74(1), 86–98. http://doi.org/10.1128/AEM.01512-07
Cohen, K., Sousa, M., & Jackix, M. (2009). Produto Alimentício Elaborado com
Sementes de Cupuaçu e de Cacau (No. 267). Documentos. Planaltina, DF.
Cohen, O., & Jackix, H. (2005). Estudo do Líquor de Cupuaçu. Ciência E Tecnologia
de Alimentos Tecnol. Aliment., 25(1), 182–190.
Copetti, M., Iamanaka, B., Mororó, R., Pereira, J., Frisvad, J., & Taniwaki, M. (2012).
The effect of cocoa fermentation and weak organic acids on growth and
ochratoxin A production by Aspergillus species. International Journal of Food
Microbiology, 155(3), 158–164. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.01.026
Crafack, M., Mikkelsen, M., Saerens, S., Knudsen, M., Blennow, A., Lowor, S., …
Nielsen, D. S. (2013). Influencing cocoa flavour using Pichia kluyveri and
Kluyveromyces marxianus in a defined mixed starter culture for cocoa
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 167(1), 103–116.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.06.024
Deak, T.; Beuchat, L. (1996). Handbook of food spoilage yeasts. United States: CRC
Press.
De Vuyst, L., Camu, N., De Winter, T., Vandemeulebroecke, K., Van de Perre, V.,
Vancanneyt, M., … Cleenwerck, I. (2008). Validation of the (GTG)5-rep-PCR
fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid
bacteria, with a focus on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans.
International Journal of Food Microbiology, 125(1), 79–90.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.02.030
179
Dykhuizen, D. (1998). Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of
bacteria? Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and
Molecular Microbiology, 73, 25–33. http://doi.org/10.1023/A
Gasch, A., & Werner-Washburne, M. (2002). The genomics of yeast responses to
environmental stress and starvation. Functional and Integrative Genomics, 2(4-
5), 181–192. http://doi.org/10.1007/s10142-002-0058-2
Guazzaroni, M., Beloqui, A., Golyshin, P., & Ferrer, M. (2009). Metagenomics as a
new technological tool to gain scientific knowledge. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 25(6), 945–954. http://doi.org/10.1007/s11274-
009-9971-z
Guehi, S., Dabonne, S., Ban-Koffi, L., Kedjebo, D., & Zahouli, G. (2010). Effect of
turning beans and fermentation method on the acidity and physical quality of raw
cocoa beans. Advance Journal of Food Science and Technology, 2(3), 163–171.
Guehi, T., Dadie, A., Koffi, K., Dabonne, S., Ban-Koffi, L., Kedjebo, K., & Nemlin, G.
(2010). Performance of different fermentation methods and the effect of their
duration on the quality of raw cocoa beans. International Journal of Food
Science and Technology, 45(12), 2508–2514. http://doi.org/10.1111/j.1365-
2621.2010.02424.x
Haegeman, B., Hamelin, J., Moriarty, J., Neal, P., Dushoff, J., & Weitz, J. S. (2013).
Robust estimation of microbial diversity in theory and in practice. The ISME
Journal, 7(6), 1092–101. http://doi.org/10.1038/ismej.2013.10
Hamdouche, Y., Guehi, T., Durand, N., Kedjebo, K. B. D., Montet, D., & Meile, J.
(2014). Dynamics of microbial ecology during cocoa fermentation and drying:
Towards the identification of molecular markers. Food Control, 48, 117–122.
http://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.05.031
Hamer, O.; Harper, D., Ryan, P. (2001). PAST: Paleontological statistics software
package for education and data analysis. Paleontologia Electronica.
<http://palaeo-electronicaorg/2001_1/past/issue1_01htm>
180
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2014). Yeasts are essential for cocoa bean
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 174, 72–87.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.014
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2015). The effect of lactic acid bacteria on cocoa bean
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 205, 54–67.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.031
Hughes, J., Hellmann, J., Ricketts, T., & Bohannan, B. (2001). MINIREVIEW
Counting the Uncountable : Statistical Approaches to Estimating Microbial
Diversity. Applied and Environmental Microbiology, 67(10), 4399–4406.
http://doi.org/10.1128/AEM.67.10.4399
Illeghems, K., Weckx, S., & De Vuyst, L. (2014). Metagenomic analysis of a
spontaneous cocoa bean fermentation process sheds light on the metabolic
capacity and functional properties of the bacterial communities of this
ecosystem. Food Microbiology, 50, 54–63.
http://doi.org/10.1016/j.fm.2015.03.005
Jinap, S., Harun, S., & Ghazali, N. (1994). Formation of Methyl Pyrazine during
Cocoa Bean Fermentation. Pertanika Journal Tropical Agriculture, 17(1), 27–32.
Kadow, D., Bohlmann, J., Phillips, W., & Lieberei, R. (2013). Identification of main
fine or flavour components in two genotypes of the cocoa tree ( Theobroma
cacao L .). Journal of Applied Botany and Food Quality, 86, 90–98.
http://doi.org/10.5073/JABFQ.2013.086.013
Kostinek, M., Ban-Koffi, L., Ottah-Atikpo, M., Teniola, D., Schillinger, U., Holzapfel,
W., & Franz, C. (2008). Diversity of predominant lactic acid bacteria associated
with cococa fermentation in Nigeria. Current Microbiology, 56(4), 306–314.
http://doi.org/10.1007/s00284-008-9097-9
Lagunes Gálvez, S., Loiseau, G., Paredes, J., Barel, M., & Guiraud, J. (2007). Study
on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the Dominican
181
Republic. International Journal of Food Microbiology, 114(1), 124–130.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.041
Leal, G., Gomes, L., Efraim, P., Almeida Tavares, F., & Figueira, A. (2008).
Fermentation of cacao (Theobroma cacao L.) seeds with a hybrid
Kluyveromyces marxianus strain improved product quality attributes. FEMS
Yeast Research, 8(5), 788–798. http://doi.org/10.1111/j.1567-
1364.2008.00405.x
Lefeber, T., Janssens, M., Moens, F., Gobert, W., & De Vuyst, L. (2011). Interesting
starter culture strains for controlled cocoa bean fermentation revealed by
simulated cocoa pulp fermentations of cocoa-specific lactic acid bacteria.
Applied and Environmental Microbiology, 77(18), 6694–6698.
http://doi.org/10.1128/AEM.00594-11
Lefeber, T., Papalexandratou, Z., Gobert, W., Camu, N., & De Vuyst, L. (2012). On-
farm implementation of a starter culture for improved cocoa bean fermentation
and its influence on the flavour of chocolates produced thereof. Food
Microbiology, 30(2), 379–392. http://doi.org/10.1016/j.fm.2011.12.021
Length, F. (2012). Isolation and characterization of acetic acid bacteria in cocoa
fermentation. African Journal of Microbiology Research, 6(2), 339–347.
http://doi.org/10.5897/AJMR11.986
Li, W., & Godzik, A. (2006). Cd-hit: A fast program for clustering and comparing large
sets of protein or nucleotide sequences. Bioinformatics, 22(13), 1658–1659.
http://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl158
Lima, L., Kamphuis, H., Nout, M., & Zwietering, M. (2011). Microbiota of cocoa
powder with particular reference to aerobic thermoresistant spore-formers. Food
Microbiology, 28(3), 573–582. http://doi.org/10.1016/j.fm.2010.11.011
Lopes, A., Garcia, N., & Vasconcelos, M. (2003). Avaliação das Condições de
Torração Após a Fermentação de Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma
182
grandiflorum Schum) e Cacau (Theobroma cacao L.). Braz. J. Food Technol,
6(2), 309–316.
Mai, Ho, & Tran. (2014). Fermentation of Cocoa with Addition of Lactic Acid Bacteria.
In International Science, Social Sciences, Engineering and Energy Conference
(pp. 1–8). Udon Thani, Thailand.
Meersman, E., Steensels, J., Mathawan, M., Wittocx, P. J., Saels, V., Struyf, N., …
Verstrepen, K. J. (2013). Detailed analysis of the microbial population in
Malaysian spontaneous cocoa pulp fermentations reveals a core and variable
microbiota. PLoS ONE, 8(12). http://doi.org/10.1371/journal.pone.0081559
Nazaré, R., Barbosa, W., & Viêgas, R. (1990). Processamento das sementes de
cupuaçu para a obtenção de cupulate. Belém, PA: Embrapa CPATU.
Nielsen, D., Teniola, O., Ban-Koffi, L., Owusu, M., Andersson, T. & Holzapfel, W.
(2007). The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using
culture-dependent and culture-independent methods. International Journal of
Food Microbiology, 114(2), 168–186.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.09.010
Nielsen, D., Snitkjaer, P., & Van den Berg, F. (2008). Investigating the fermentation
of cocoa by correlating Denaturing Gradient Gel Electrophoresis profiles and
Near Infrared spectra. International Journal of Food Microbiology, 125(2), 133–
140. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.040
Oliveira, C. (2001). Isolamento e identificação da microbiota nos diferentes estágios
de fermentação das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum).
150 p (Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Federal do Amazonas,
Brasil.
Oliveira, V. & Costa, J. (2002). Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado
(ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp.
glycines. Fitopatologia Brasileira, 27(079), 631–634.
http://doi.org/10.1590/S0100-41582002000600013
183
Olson, K. E.; Sorrells, K. M. (2001). Thermophilic flat sour sporeformers. In:
DOWNES, F. P.; ITO, K. (Ed.). Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 4 th ed. Washington: APHA, 2001.
Oslan, S., Salleh, A., Abd Rahman, R., Basri, M., & Chor, A. (2012). Locally isolated
yeasts from malaysia: Identification, phylogenetic study and characterization.
Acta Biochimica Polonica, 59(2), 225–229.
Ouattara, D., Ouattara, H., Goualie, B., Kouame, L., & Niamke, S. (2014).
Biochemical and functional properties of lactic acid bacteria isolated from Ivorian
cocoa fermenting beans. J. Appl. Biosci., 77, 6489–6499.
http://doi.org/10.4314/jab.v77i1.9
Ouattara, H., Koffi, B., Karou, G., Sangaré, A., Niamke, S., & Diopoh, J. (2008).
Implication of Bacillus sp. in the production of pectinolytic enzymes during cocoa
fermentation. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(9), 1753–
1760. http://doi.org/10.1007/s11274-008-9683-9
Ouattara, H., Reverchon, S., Niamke, S., & Nasser, W. (2011). Molecular
identification and pectate lyase production by Bacillus strains involved in cocoa
fermentation. Food Microbiology, 28(1), 1–8.
http://doi.org/10.1016/j.fm.2010.07.020
Papalexandratou, Z., Lefeber, T., Bahrim, B., Lee, O., Daniel, H., & De Vuyst, L.
(2013). Hanseniaspora opuntiae, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus
fermentum, and Acetobacter pasteurianus predominate during well-performed
Malaysian cocoa bean box fermentations, underlining the importance of these
microbial species for a successful cocoa . Food Microbiology, 35(2), 73–85.
http://doi.org/10.1016/j.fm.2013.02.015
Pereira, G., Miguel, M., Ramos, C., & Schwan, R. (2012). Microbiological and
physicochemical characterization of small-scale cocoa fermentations and
screening of yeast and bacterial strains to develop a defined starter culture.
Applied and Environmental Microbiology, 78(15), 5395–5405.
http://doi.org/10.1128/AEM.01144-12
184
Pruesse, E., Quast, C., Knittel, K., Fuchs, B., Ludwig, W., Peplies, J., & Glöckner, F.
O. (2007). SILVA: A comprehensive online resource for quality checked and
aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids
Research, 35(21), 7188–7196. http://doi.org/10.1093/nar/gkm864
Ramos, S., Salazar, M., Pereira, G., & Efraim, P. (2014). Plant and metagenomic
DNA extraction of mucilaginous seeds. MethodsX, 1, 225–228.
http://doi.org/10.1016/j.mex.2014.09.005
Robayo, Z. (2010). Caracterización del proceso de fermentación del grano de
copoazú (Theobroma grandiflorum Willd. ex spreng). 47 p (Especialización em
Ciencia y Tecnologia de Alimentos). Universidad Nacional de Colombia, Bogotá,
Colombia.
Romero-Cortes, T, (2012). Isolation and characterization of acetic acid bacteria in
cocoa fermentation. African Journal of Microbiology Research, 6(2), 339–347.
http://doi.org/10.5897/AJMR11.986
Romanczyk, L., Mcclelland, C., Post, L., & Aitkenb, W. (1995). Formation of 2-Acetyl-
I-pyrroline by Several Bacillus cereus Strains Isolated from Cocoa Fermentation
Boxes. J. Agric. Food Chem., 469–475.
Santos, T., Santana, L, Santos, A., Silva, G., Romano, C., Dias, J., & Rezende, R.
(2011). Lactic acid bacteria dynamics during spontaneous fermentation of cocoa
beans verified by culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis.
Genetics and Molecular Research: GMR, 10(4), 2702–2709.
http://doi.org/10.4238/2011.November.4.3Schloss, P., Westcott, S., Ryabin, T.,
Hall, J., Hartmann, M., Hollister, E., … Weber, C. (2009). Introducing mothur:
Open-source, platform-independent, community-supported software for
describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental
Microbiology, 75(23), 7537–7541. http://doi.org/10.1128/AEM.01541-09
Schmidt, P., Bálint, M., Greshake, B., Bandow, C., Römbke, J., & Schmitt, I. (2013).
Illumina metabarcoding of a soil fungal community. Soil Biology & Biochemistry,
65, 128–132. http://doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.05.014
185
Schrader, J. (2007). Microbial flavour production. In Flavours and Fragrances:
Chemistry, Bioprocessing and Sustainability (pp. 507–574). Frankfurt:
DECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institute. http://doi.org/10.1007/978-3-540-
49339-6_23
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail
inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–1483.
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4),
205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
Schwendimann, L., Kauf, P., Fieseler, L., Gantenbein-Demarchi, C., & Miescher
Schwenninger, S. (2015). Development of a quantitative PCR assay for rapid
detection of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum in cocoa bean
fermentation. Journal of Microbiological Methods, 115, 94–99.
http://doi.org/10.1016/j.mimet.2015.05.022
Simon, C., & Daniel, R. (2011). Metagenomic analyses: Past and future trends.
Applied and Environmental Microbiology, 77(4), 1153–1161.
http://doi.org/10.1128/AEM.02345-10
Spinosa, W.. (2002). Isolamento, seleção, identificação e parâmetros cinéticos de
bactérias acéticas provenientes de indústrias de vinagre. 274 p (Doutorado em
Ciência de Alimentos) Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil.
Stevenson, K.E. & Segner, W.P. (2001). Mesophilic aerobic sporeformers . In:
Downes, F.P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Fodds, 4th ed. American Public Health Association, Washington,
D.C., 2001. Chapter 22, p. 223-227.
Sukha, D., Butler, D., Umaharan, P., & Boult, E. (2008). The use of an optimised
organoleptic assessment protocol to describe and quantify different flavour
attributes of cocoa liquors made from Ghana and Trinitario beans. European
186
Food Research and Technology, 226(3), 405–413.
http://doi.org/10.1007/s00217-006-0551-2
Yamada, Y., & Yukphan, P. (2008). Genera and species in acetic acid bacteria.
International Journal of Food Microbiology, 125(1), 15–24.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.077
187
DISCUSSÃO GERAL
O processo de fermentação tem início a partir da quebra dos frutos
quando começam a ocorrer diversas alterações físico-químicas e microbiológicas no
ambiente, desencadeadas pela exposição de substratos às enzimas que são
liberadas e a inoculação espontânea em decorrência de fatores externos (Schwan &
Wheaks, 2004; Beckett, 2009). Antes da fermentação das sementes de cupuaçu
geralmente é realizado o despolpamento, visto que a polpa apresenta maior valor
comercial e, por ser abundante, dificulta a evolução do processo, inviabilizando a
atuação dos microrganismos. Como consequência, a formação de compostos que
promovem a elevação da temperatura e mudança do pH do meio são prejudicadas,
assim como a formação de compostos precursores de sabor, desejáveis para a
obtenção do produto final (cupulate) com características sensoriais apreciáveis.
Assim, foi realizada fermentação utilizando sementes de cupuaçu com três
diferentes concentrações de polpa (0, 7,5 e 15%) e duas formas de revolvimento
(fixo – R1; e de acordo com a temperatura – R2), para avaliar a influência sobre as
diversas reações físicas, químicas e microbiológicas que ocorrem.
1. EVOLUÇÃO DA FERMENTAÇÃO: TEMPERARURA, pH, REVOLVIMENTO
Os experimentos 15R1 e 15R2 (com maior concentração de polpa)
apresentaram os maiores tempos de fermentação, assim como atingiram as maiores
temperaturas (41,5 e 42oC). A elevação da temperatura durante a fermentação está
relacionada principalmente com a intensa atividade bioquímica dos microrganismos
que atuam sobre substratos como os açúcares, em uma forte reação exotérmica,
com intensa liberação de calor (Lagunes Gálvez et al., 2007; Beckett, 2009). Em
fermentação de cacau e cupuaçu a temperatura máxima normalmente alcança entre
43,5oC e 50oC (Schwan, 1998; Lopes et al., 2003; Camu et al., 2007) . É possível
que os experimentos não tenham alcançado temperaturas mais elevadas por fatores
como condições climáticas (no período, com alta incidência de chuvas); massa
reduzida de sementes utilizada nos experimentos (em média 8 Kg, sendo que
normalmente as fermentações são realizadas com massas entre 100 e 1000 Kg)
(Cohen & Jackix, 2005; Carvalho et al., 2008).
Os experimentos com menor concentração de polpa (0R1 e 0R2)
apresentaram evolução rápida e contínua do pH, enquanto que os experimentos
188
com maior concentração de polpa, especialmente 15R1 e 15R2 apresentaram
elevação mais tardia, a partir de 84 e 72 h de fermentação, respectivamente. O
retardo na elevação do pH possivelmente foi influenciado pela concentração de
polpa, que apresenta caráter ácido, com pH em torno de 3,30 (Gondim et al., 2001).
Além de manter baixo pH da massa ao longo da fermentação, a concentração de
polpa também foi determinante para o prolongamento do processo. Em todos os
experimentos a fermentação foi interrompida pelo aumento brusco do pH (entre 6,8
e 8,1), visto que nestas condições pode haver o desenvolvimento de compostos de
sabor indesejáveis (off flavors).
Os experimentos R2 receberam maior número de revolvimentos, que
foram aplicados sempre que era detectada queda na temperatura na massa de
fermentação. Com exceção de 0R2, foi observado que os revolvimentos nos
experimentos 7,5R2 e 15R2 foram um pouco mais efetivos, tendo havido pequena
elevação da temperatura após as manobras. Esses resultados demonstram que os
dois tipos de revolvimentos aplicados não influenciaram de maneira diferente nas
transformações físico-químicas que ocorreram na fermentação. A concentração de
polpa foi com certeza o diferencial em todo o processo, comprovando-se a
importância de mantê-la, pelo menos parcialmente, como forma de aporte de
substratos e também colaborando para a elevação da temperatura, condição
importante para a ação de alguns microrganismos e supressão de outros que não
são de interesse.
2. CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DAS SEMENTES DURANTE A
FERMENTAÇÃO
2.1 UMIDADE E ATIVIDADE DE ÁGUA
Os experimentos com maior concentração de polpa (15%) apresentaram
os maiores valores de umidade. Durante a fermentação houve súbita elevação em
todos os experimentos, relacionada à retenção de água que ocorre na semente em
virtude da elevação da temperatura e também pela superoxidação de ácido acético
pelas bactérias acéticas (Mattietto, 2001; Schwan & Wheals, 2004). Apesar da
flutuação dos valores de atividade de água para todos os experimentos, os
resultados no final da fermentação ficaram na faixa 0.98.
189
2.2 ACIDEZ TITULÁVEL (AT) E pH DAS AMÊNDOAS
Nas primeiras 12 h de fermentação, os experimentos 0R1, 0R2 e 7,5R1
apresentaram brusca elevação na acidez titulável, (AT), seguida de declínio até o
final da fermentação. Somente os experimentos 15R1 e 15R2 apresentaram
alternância nos valores de AT, que pode estar relacionada à ação dos
microrganismos sobre os compostos orgânicos. Ao final da fermentação, os valores
de acidez entre 1,7 e 4,2 meq NaOH/100g dos experimentos ficaram bem abaixo
daqueles encontrados em outros trabalhos com amêndoas de cupuaçu e da faixa
recomendada pelas indústrias para cacau, na ordem de 12 a 15 meq NaOH/100g
(Mattietto, 2001).
Em relação ao pH das sementes integrais com polpa (casca + gérmen +
cotilédone + polpa aderida) observou-se que valor inicial entre 4,0-4,3, sofreu
elevação para valores entre 5,5-6,0 pelas intensas reações químicas que ocorrem
no interior das amêndoas, nas últimas horas de fermentação, conferindo caráter
mais básico ao meio.
2.3 ÁCIDOS ORGÂNICOS, NITROGÊNIO TOTAL E COMPOSTOS FENÓLICOS
Os experimentos com maior concentração de polpa apresentaram
também a maior concentração de ácidos orgânicos, especialmente cítrico e málico.
Ao longo da fermentação, os ácidos sofreram redução. Com 60 h maior produção de
ácido acético foi observada também para 15R1 e 15R2 (14,3 e 12,7 mg.g-1,
respectivamente). São valores próximos aos encontrados em fermentação de cacau
após 72 h (12 e 10 mg.g-1 ) (Ardhana & Fleet, 2003), embora em outros trabalhos a
concentração máxima de ácido acético tenha chegado a 22.5 mg.g-1 no mesmo
período (Lagunes Gálvez et al., 2007). O ácido acético é um importante precursor de
sabor, uma vez que a sua produção durante a fermentação provoca diversas
reações bioquímicas desejáveis à formação do sabor dos produtos obtidos. Além
disso, por ser volátil, é parcialmente eliminado durante a etapa de secagem,
reduzindo a acidez indesejável nos produtos finais (Schwan & Wheals, 2004;
Beckett, 2009). A formação mais elevada de ácido acético nos experimentos citados
(15R1 e 15R2) comprova a importância de manter uma quantidade parcial de polpa
aderida às sementes como forma de garantir produção de ácido acético em maiores
proporções visando a formação de compostos de sabor.
190
Os experimentos com maior teor de polpa apresentaram maior conteúdo
inicial de nitrogênio total (9,7; 10,1 e 10,2, respectivamente para 0, 7,5 e 15% de
polpa). Durante a fermentação houve oscilação na concentração para todos os
experimentos, com poucas diferenças entre os mesmos quanto aos teores finais.
Durante a fermentação, a concentração de compostos fenólicos diminuiu
progressivamente. Apesar de os experimentos com mais polpa apresentarem
conteúdo ligeiramente maior de compostos fenólicos expressos em mg.g-1 de
catequina, não houve diferença significativa nos resultados finais para todos os
experimentos (entre 16,8 e 19,8 mg.g-1). O tempo de fermentação mais curto levou à
obtenção de amêndoas com teor elevado de compostos fenólicos que conferem ao
produto final, características de amargor e adstringência.
2.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS AMÊNDOAS SECAS
As amêndoas foram submetidas à secagem natural e artificial, alcançando
umidade final entre 5,5 e 6,3%, faixa considerada dentro da ideal, 6 a 8%, para
prevenir o desenvolvimento de bolores e não tornar a amêndoa quebradiça (Biehl &
Ziegleder, 2003). As diferentes formas de revolvimento não influenciaram o pH,
acidez titulável e umidade para os experimentos 15R1 e 15R2 e as amêndoas
apresentaram no pH entre 5,8 e 6,2, com baixa acidez titulável, entre 1,2 e 3,2 meq
NaOH/100g.
Em relação aos ácidos orgânicos demonstrou-se novamente que os
experimentos com maiores concentrações de polpa (15R1 e 15R2) também
apresentaram maiores concentrações de ácidos orgânicos, principalmente 15R1,
com maiores teores de ácidos cítrico, málico e acético. O teor de ácido lático nas
amêndoas das amostras esteve entre 2,07 e 3,60 mg.g-1, bem abaixo dos
apresentados por amêndoas de cacau em países, como o Brasil, Malásia e Ilhas
Salomão, cujos valores entre 2,7 e 5,0 mg.g-1 caracterizados como matérias-primas
na categoria de baixo pH e elevada acidez (Jinap; Dimick, 1990). Apesar dos
resultados satisfatórios obtidos ao final da fermentação com concentrações maiores
de ácido acético em relação ao ácido lático, este último, com exceção de 15R2, se
sobrepôs ao ácido acético nos outros experimentos após a secagem das amêndoas.
Embora a diferença entre as concentrações não tenha sido muito grande, o caráter
191
não volátil que o ácido lático apresenta, confere ao produto final (cupulate) acidez
indesejável que não pode ser eliminada durante a secagem.
Com relação aos compostos fenólicos totais, os experimentos com menor
concentração de polpa (0R1 e 0R2) apresentaram valores superiores, possivelmente
pelo tempo mais curto de fermentação, e menor exposição oxidativa das amêndoas.
Os valores finais de todos os experimentos (entre 8,8 – 13,7 mg.g-1) ainda estão
bem acima dos encontrados por Pugliese et. al (2013) (2,9 mg.g-1) em amêndoas de
cupuaçu logo após a fermentação. Estes resultados são indicativos de que as
amêndoas de cupuaçu poderiam apresentar adstringência e amargor acentuado.
Com relação ao nitrogênio total, com exceção de 7.5R2 e 15R2, os outros
experimentos não diferiram entre si.
Na prova de corte, verificou-se que as amêndoas 7,5R1 apresentaram
maior número de amêndoas com boa compartimentação. Nos demais experimentos
verificou-se maior número de amêndoas com compartimentação parcial e coloração
marrom. Assim como ocorre com o cacau, as amêndoas são consideradas bem
fermentadas quando apresentam coloração escura e boa compartimentação devido
à entrada de água e compostos orgânicos durante a fermentação. Em amêndoas
mal fermentadas de cupuaçu a coloração costuma ser bege (Lopes et al., 2003;
Carvalho et al., 2005). De todos os experimentos, 0R1 foi a que apresentou o pior
grau de fermentação, certamente pelo curto tempo de fermentação (3 dias).
2.5 TESTES DE CORRELAÇÃO
Foi observada correlação positiva entre o teor de ácido cítrico e os teores
de compostos fenólicos totais (CFT), ácidos lático e acético no início da fermentação
(0 h). Contudo, a correlação tornou-se fraca com 12 h, tendo em vista a
metabolização de ácido cítrico para a formação de outros compostos, entre eles os
ácidos orgânicos citados. Verificou-se correlação negativa de ácidos cítrico e lático
com CFT provavelmente pela maior formação do último e sua entrada nas sementes
com oxidação de CFT.
Com 60 h de fermentação foi notada uma forte correlação positiva entre
os teores dos ácidos lático e acético (r= 0.93) devido à produção simultânea de
ambos naquele momento. Nas amêndoas secas também ocorreu uma correlação
192
positiva entre acidez titulável (AT) e os teores dos ácidos acético (r= 0,68) e lático (r=
0,77). A correlação negativa, embora fraca (r= -0,68 e r= -0,40), entre pH e ambos
os ácidos apresentada nas amêndoas secas podem indicar, segundo estudos
realizados com amêndoas de cacau, relação com o gosto ácido (Holm et al., 1993).
Essa característica é ocasionada pela elevada a concentração de ácido acético,
baixando o pH (Holm et al., 1993; Luna et al., 2002).
Nas amêndoas secas a correlação entre CFT e ácido lático foi fortemente
negativa (r= -0,75), por causa da não volatilidade do ácido lático e da redução de
CFT pela oxidação. Isto também indica que uma parte do ácido lático permaneceu
nas amêndoas, conferindo caráter ácido.
3. ANÁLISE SENSORIAL DOS CUPULATES
As amêndoas secas foram processadas para obtenção de cupulates com
50% de cupuaçu na formulação, os quais foram submetidos a análises sensoriais
com equipe treinada de provadores de Análise Descritiva Quantitativa (ADQ), Teste
afetivo e CATA (Check All That Apply ou “Marque tudo o que se aplica”).
3.1 ANÁLISE DESCRITIVA QUANTITATIVA (ADQ)
Não houve diferença entre as amostras para os atributos aroma doce,
sabor de cupuaçu, sabor de café e derretimento (p ≥ 0,05). Apesar disso, a amostra
15R2 apresentou as maiores médias para os atributos aroma torrado e aroma de
café, residual amargo e sabor de café, enquanto que a amostra 15R1 apresentou
notas mais altas para aroma frutado e aroma doce, gosto doce, sabor de cupuaçu e
derretimento. A diferente percepção de sabores e aromas naquelas amostras pode
estar relacionada com a concentração de polpa e a forma de revolvimento, embora
nas análises anteriores não tenha sido observada diferença entre as formas de
revolvimento aplicadas (R1 e R2).
Na análise de componentes principais (ACP) as duas dimensões do
gráfico explicaram 82,64% dos resultados de ADQ. Um primeiro agrupamento,
composto pelas amostras 0R2, 7,5R1, 7,5R2 e 15R2 foi caracterizado por maior
intensidade dos atributos sabor de café, sabor residual amargo, aroma de café e
aroma torrado. O outro agrupamento composto apenas pela amostra 15R1 foi
caracterizado pelos atributos aroma doce, aroma frutado, sabor de cupuaçu, gosto
193
doce e derretimento. Em uma 3ª dimensão analisada foi possível observar que a
amostra 0R1 pareceu não estar relacionada a qualquer atributo. O fato de ter
apresentado menor tempo de fermentação e maior quantidade de amêndoas não
fermentadas, quando comparada com as outras amostras, pode ter contribuído para
a reduzida formação de importantes compostos de sabor.
Foi observada correlação positiva entre os atributos aroma doce, aroma
frutado, gosto doce e sabor de cupuaçu, apontando para características do fruto,
possivelmente relacionadas com os compostos voláteis. Houve correlação negativa
entre aroma frutado e sabor residual amargo, sabor cupuaçu e sabor café indicativo
de que quanto maior a percepção de gosto amargo e sabor café, menor é a
percepção de aroma e sabor frutado. Há indícios de que este último é mascarado
pelo gosto amargo e sabor café (Luna et al., 2002). Esta característica pode diminuir
a preferência do consumidor pelo produto.
3.2 TESTE AFETIVO
As amostras 0R1 e 15R2 apresentaram a maior média quanto à aceitação
global, diferindo estatisticamente apenas da amostra 7,5R2. Quanto ao aroma,
apenas as amostras 15R1 e 15R2 diferiram estatisticamente, o que foi confirmado
pelos resultados na ACP, na qual ambas as amostras estiveram agrupadas em
lados opostos. Com relação ao gosto ácido, a amostra 0R2 foi considerada ideal,
talvez pela menor concentração de polpa no início da fermentação, pH das
amêndoas com baixas acidez (6,2) e acidez titulável (1,9 meqNaOH/100g). Quanto à
intensidade do gosto doce, o cupulate formulado com amêndoas do experimento
7,5R1 foi considerado ideal e na intenção de compra os cupulates 0R1 e 15R2
obtiveram as maiores médias, diferindo estatisticamente apenas de 7,5R2. Embora
positiva (maior que 30%), a intenção de compra foi considerada baixa e a amostra
7,5R2 apresentou as maiores rejeições. Isso possivelmente está relacionado ao fato
dos provadores não serem consumidores de cupulate, por este ainda ser um produto
pouco conhecido e consumido.
3.3 CATA (CHECK ALL THAT APPLY)
Na metodologia CATA (Check All That Apply), entre os vários atributos
levantados estavam o sabor frutal, floral, erva, tabaco, pimenta, canela, castanhas,
caramelo, cítrico. No entanto, todas as amostras receberam maior frequência de
194
citações para os sabores amargo, terra, café, residual amargo ruim e textura firme
ao morder. As amostras 0R1, 7,5R1 e 15R1 foram caracterizadas pelo sabor de café
e doçura, sendo que 15R1 também foi caracterizado pelo sabor de
caramelo/melaço.
Os atributos textura e sabor foram aqueles os consumidores mais
gostaram nas amostras. Entre os atributos que menos gostaram está o amargor,
citado principalmente para as amostras 0R1 e 15R2, embora tenham sido as
amostras mais aceitas no teste afetivo. Na análise de penalidade foram
considerados como atributos positivos significativos gosto doce e de café, acidez
agradável, firmeza e derretimento. Os atributos negativos considerados significativos
foram gosto de terra e sabor residual ruim. Vale ressaltar que as amostras 0R2,
7.5R1 e 7.5R2 foram avaliadas com essas características na opinião de 43 a 60%
dos consumidores, enquanto que as amostras 15R1 e 15R2 apresentaram menor
percentual de citações negativas (entre 23,3 a 31,7%). Depreende-se destes
resultados que a polpa suaviza, de alguma maneira, a percepção dos atributos
negativos. Pela característica extremamente aromática que o fruto possui e também
pela sua composição química, é esperado que o produto final (cupulate) apresente
também características sensoriais peculiares e contrastantes, causando percepção
de sabor doce e amargo ao mesmo tempo. Mas é importante também ressaltar que
o tempo curto de fermentação das sementes e a quantidade elevada de compostos
fenólicos, pode ter impactado no sabor final, considerado residual ruim.
4. COMPOSTOS VOLÁTEIS
Foram pesquisadas a presença e concentração de compostos que podem
estar implicados no sabor do cupulate para as amostras 0R1 e 15R2 que
apresentaram melhor aceitação entre os consumidores.
4.1 SEMENTES DURANTE A FERMENTAÇÃO
Álcoois
A concentração de etanol, elevada no início, foi decaindo até o final da
fermentação, como esperado, já que o etanol é oxidado a ácido acético pelas
bactérias acéticas. Além disso, também há perdas do composto pela sua
volatilidade, visto que a liquefação da polpa e os revolvimentos realizados durante a
195
fermentação favorecem essa perda (Schwan & Wheals, 2004; Lagunes Gálvez et al.,
2007; Lefeber et al., 2012). Durante a evolução da fermentação em 0R1 e 15R2, a
concentração dos outros álcoois (2-metil-3-buten-2-ol, 3-metil 2-buten-1-ol, 3-metil-
1-butanol, 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol) também foi diminuindo até o final. Dos
álcoois citados, o 3-metil-1-butanol, 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol, conhecido como
linalol, é um composto presente na polpa de cupuaçu (Quijano & Pino, 2007)
apresentando aroma impactante (Oliveira et al., 2004), sendo que maior
concentração daquele composto foi detectada em 15R2. Álcoois secundários, como
o 2-pentanol e 2-heptanol, foram detectados nas últimas horas de fermentação de
15R2, sendo considerados também importantes compostos aromáticos ativos
(Strohalm et al., 2007 citados por Schwab et al., 2008).
Ésteres
As concentrações de acetato de etila e 3-metil-1-butanol acetato
apresentaram aumento no início e na metade da fermentação para 0R1 e 15R2,
respectivamente. O teor de polpa de 15R2 parece ter contribuído para as maiores
concentrações de acetato de etila, visto que é um composto encontrado
naturalmente na polpa de cupuaçu (Quijano & Pino, 2007), podendo ocorrer sua
produção durante a fermentação, pela ação de leveduras (Schwan & Wheals, 2004).
Aldeídos
O benzaldeído e benzenoacetaldeído foram detectados desde o início da
fermentação em 0R1 e nas últimas horas em 15R2. O benzaldeído é associado ao
gosto amargo em cacau em pó (Bonvehí, 2005) e está presente também em
amêndoas amargas (Schwab et al., 2008). Outro aldeído, o 3-metilbutanal,
apresentou maior concentração em 0R1 que em 15R2 durante a fermentação. Mas
percebe-se que a formação daquele composto em 0R1 estava começando quando
foi finalizada a fermentação. Alguns autores atribuem ao aldeído aroma com nota de
malte (Frauendorfer & Schieberle, 2006). Durante a torração de amêndoas de cacau,
sua concentração tende a aumentar (Frauendorfer & Schieberle, 2008).
Ácidos
O teor de polpa de 15R1 parece ter influenciado nas concentrações mais
elevadas de ácidos orgânicos. Alguns compostos formados durante a fermentação
196
não sofrem muita influência do processo de torração, ao contrário do ácido acético
que tem sua concentração reduzida drasticamente. Os ácidos butanoico e 3-
metilbutanóico foram detectados nos dois experimentos, nas primeiras horas de
fermentação. O ácido 2-metilpropanóico foi detectado somente no último dia de 0R1
e a partir de 60 h em 15R2. É um composto com potente flavor de chocolate
(Frauendorfer & Schieberle, 2008; Rodriguez-Campos et al., 2012). Todos estes
ácidos são de grande importância para a indústria por causa do intenso aroma
(Schwab et al., 2008).
Cetonas
A 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) esteve presente desde o início da
fermentação em ambos os experimentos. É um composto resultante da ação de
bactérias láticas sobre o ácido cítrico (Crafack et al., 2013), com liberação de odor
de manteiga e creme.
4.2 COMPOSTOS VOLÁTEIS IDENTIFICADOS NAS AMÊNDOAS SECAS, NIBS E
CUPULATES
Amêndoas secas: em 0R1 e 15R2 foram identificados 11 e 17 compostos
voláteis, respectivamente. Apesar de estar em baixa concentração nas duas
amostras, os álcoois foram mais abundantes em 15R2 que em 0R1. Os aldeídos
apresentaram concentração diminuída nas amêndoas após a secagem,
especialmente para 0R1. Das cetonas, a acetofenona foi detectada apenas em
15R2. É um composto que apresenta flavor com nota doce e floral, sendo que sua
concentração tende a elevar-se após a secagem sob temperatura mais alta (80oC),
tendo sido detectada em cacau torrado (Bonvehí, 2005; Rodriguez-Campos et al.,
2012). O ácido acético foi detectado ainda nas amêndoas dos dois experimentos,
apesar do processo de secagem.
Nibs: após a torração foi constatada redução na concentração de aldeídos
(benzaldeído e benzenoacetaldeído) nos nibs, com exceção de 3-metilbutanal, que
aumentou. Houve redução também de ácido acético. A acetofenona e o ácido 2-
metilpropanoico foram detectados apenas em 15R2, provavelmente pelo maior teor
de polpa.
Cupulates: foram identificados 14 compostos voláteis tanto na amostra
0R1 quanto em 15R2. O ácido acético e alguns álcoois ainda estavam presentes,
197
embora em menor concentração, tendo em vista o processamento térmico
(conchagem, temperagem) pelo qual passaram os produtos. O 3-metilbutanal
apresentou elevação, especialmente para 0R1. Na amostra 15R2 foi detectada a
presença do ácido 2-metilpropanoico, importante composto aromático encontrado
em liquor de cacau (Misnawi & Ariza, 2011), assim como o linalol. A presença deste
último no cupulate reforça a afirmação de alguns autores que sugerem haver uma
migração de compostos voláteis presentes na polpa para os cotilédones durante a
fermentação (Quijano & Pino, 2007; Kadow et al., 2013). Também existe a tese de
que alguns compostos orgânicos não são formados a partir dos precursores durante
a torração, mas são provenientes da fermentação sofrendo transformações químicas
nas etapas posteriores, principalmente na torração (Frauendorfer & Schieberle,
2008). O mesmo autor argumenta que alguns compostos são raramente afetados
pelos processos térmicos aplicados.
4.3 COMPOSTOS PIRAZÍNICOS NAS AMÊNDOAS SECAS, NIBS E CUPULATES
Amêndoas secas: a presença de pirazinas nas amêndoas secas indica
que durante a secagem houve o desenvolvimento daqueles compostos, pelo
aumento na temperatura do meio causada pela irradiação, que desencadeia reações
químicas entre os precursores presentes (Rodriguez-Campos et al., 2012). A
tetrametilpirazina foi detectada nas duas amostras, enquanto que a trimetilpirazina e
a 2,3-dimetil-5-etilpirazina foram identificadas apenas em 15R2. A primeira é
apontada como um dos primeiros compostos pirazínicos formados após a
fermentação sob a ação de microrganismos (Zak et al., 1972 citados por
Oberparleiter & Ziegleder, 1997). Em outros trabalhos com amêndoas de cupuaçu
também foi detectada a presença de pirazinas (2,6-dimetilpirazina) antes da torração
(Queiroz & Garcia, 1999).
Nibs: foram identificados mais compostos pirazínicos na amostra 15R2
que 0R1, possivelmente pelo teor de polpa e mais substratos disponíveis. A
trimetilpirazina, a tetrametilpirazina e a 2,3,5-trimetil-6-pirazina apresentaram as
concentrações mais elevadas em 15R2.
Cupulates: também nos cupulates foram detectadas maiores
concentrações de pirazinas na amostra 15R2, especialmente a tetrametilpirazina,
com uma concentração superior (0,1136 mg kg-1) quando comparada com a amostra
198
0R1 (0,0379 mg kg-1). As concentrações de 2,5-dimetilpirazina, trimetilpirazina e
tetrametilpirazina tendem a aumentar na etapa de conchagem (Counet et al., 2002) .
Foi o que ocorreu com a tetrametilpirazina que apresentou elevação para as duas
amostras. Apenas a trimetilpirazina apresentou redução na 15R2. O odor de
trimetilpirazina e isômeros de 2-etil-3(5,6)-dimetilpirazinas é associado à terra
(Counet et al., 2002).
A qualidade e quantidade de compostos de sabor encontradas na
amostra 15R2 foram superiores às de 0R1. Além de maior concentração de polpa e,
é claro, maior oferta de substratos, o tempo mais prolongado de fermentação (108 h
de 15R2 contra 60 h de 0R1) pode ter dado mais chances de formação de
compostos de sabor. No último dia de fermentação de 0R1 importante compostos de
sabor como o ácido 2-metilpropanoico e 3-metilbutanal começaram a surgir,
indicando que naquele momento a fermentação estava ainda ocorrendo. Há estudos
indicando que as diferenças entre amêndoas torradas e não torradas estão em
mudanças quantitativas e não qualitativas na composição de um pequeno número
de compostos de aroma, considerados chave (Frauendorfer & Schieberle, 2008). De
fato, foi observado que embora 0R1 tenha apresentado diversidade ligeiramente
maior de compostos pirazínicos em relação à 15R2, esta última apresentou
concentrações maiores de importantes compostos de sabor. Com estes resultados,
e considerando também aqueles apresentados na análise sensorial, conclui-se que
a amostra 15R2 pode ser considerada a melhor dentre as outras.
5. EXTRAÇÃO DE DNA PARA IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
ENVOLVIDOS NA FERMENTAÇÃO
Diferentes protocolos para extração de DNA dos microrganismos
envolvidos na fermentação de cupuaçu foram testados sem sucesso, especialmente
os kits de extração comerciais disponíveis. Uma das dificuldades encontradas no
trabalho está relacionada com a composição da polpa aderida à semente, rica em
mucilagem, açúcares e etanol, além dos lipídios presentes nos cotilédones,
compostos fenólicos e proteínas (Gondim et al., 2001; Rogez et al., 2004). São
materiais interferentes que dificultam a extração e obtenção de DNA com qualidade
para sequenciamento de alto rendimento.
199
5.1 EXTRAÇÃO DE DNA
Após tentativas, foi obtido protocolo de extração de RNA, inicialmente
descrito por Zeng et al. (2002) e com modificações propostas por Provost et al.
(2007), sendo adaptado para extração de DNA nas sementes de cupuaçu das seis
condições coletadas durante a fermentação. Entre as modificações feitas para
obtenção do protocolo, foi incluída na etapa inicial adição de éter de petróleo às
amostras pulverizadas para remoção da fase lipídica, visto que as sementes são
ricas em lipídios. Posteriormente, as amostras sofreram tratamento pela adição de
substâncias que promovem a precipitação e extração de proteínas e
polissacarídeos, adição de RNAse para digestão de RNA, adição de compostos
específicos para precipitação do ácido nucleico (NaCl, isopropanol, clorofórmio +
álcool isoamílico) e lavagem final com etanol, a 70%.
5.2 RENDIMENTO E QUALIDADE DO DNA
A concentração de DNA foi verificada e os resultados demonstraram que
a concentração em ng, de todas as amostras, estava dentro das condições ótimas
requeridas, ou seja, baixa concentração de proteína e maior quantidade de DNA
extraído. Para confirmar a qualidade das amostras de DNA foi feito PCR utilizando
primers 16S em uma das amostras (amostra 15% polpa - 3º dia de fermentação).
Embora pequena, a presença de carboidratos nas amostras não influenciou
negativamente na amplificação do conteúdo de DNA bacteriano.
Durante a fermentação as sementes sofrem profundas transformações
bioquímicas com produção de diferentes compostos orgânicos, culminando com a
liberação, dentro dos cotilédones, de compostos fenólicos e enzimas proteolíticas
(Beckett, 2009). Os compostos fenólicos, por exemplo, estão em maior concentração
em sementes antes da fermentação, visto que durante a fermentação, vão sofrendo
oxidação pelo aumento da aeração (Pugliese et al., 2013). Embora ocorra uma
diminuição na concentração daqueles compostos, muitos flavonoides podem
interferir no processo de extração de DNA (Schrader et al., 2012). A quantidade de
polpa presente nos experimentos com maior quantidade de polpa (7.5 e 15%)
representou uma barreira na obtenção do DNA. Os resultados da quantificação de
DNA mostraram muita variação na concentração de ácido nucleico, embora as
razões ácido nucleico/proteína e ácido nucleico/carboidratos estivessem dentro dos
200
níveis aceitáveis. Essa variação pode estar relacionada com as diferentes
concentrações de polpa existentes nas amostras pelos diferentes tempos em que
foram coletadas durante a fermentação.
A dificuldade em realizar a extração de DNA a partir de matrizes vegetais
é atribuída à presença de polifenóis e polissacarídeos (Japelaghi, Haddad, &
Garoosi, 2011). Segundo Asif et al. (2000) citado por Japelaghi et al. (2011), estas
substâncias afetam a qualidade e/ou quantidade de ácidos nucleicos. O protocolo
desenvolvido mostrou ser eficiente podendo ser aplicado na extração de DNA a
partir de amostras similares, de origem vegetal, que apresentam em sua composição
substâncias interferentes também semelhantes.
6. MICROBIOLOGIA DA FERMENTAÇÃO
Ao longo da fermentação foi efetuada contagem em placa de leveduras,
bactérias láticas (LAB), bactérias acéticas (AAB), esporos de bactérias mesófilas
(EBM) e esporos de bactérias termófilas (EBT) nos seis experimentos.
6.1 CONTAGEM EM PLACA DE LEVEDURAS E BACTÉRIAS
a Leveduras
Com crescimento desde o início da fermentação até o final, as leveduras
apresentaram contagem final nos seis experimentos (6,6 e 7,50 log UFC g-1), bem
acima de outros resultados encontrados em fermentação de cupuaçu, (1,3 a 1,8 log
UFC.g-1) (Robayo, 2010), possivelmente devido ao tempo de fermentação que foi
mais curto (60 a 108 h) contra 144 h.
b. Bactérias acéticas (AAB)
Os experimentos 0R1 e 0R2 apresentaram contagem máxima de AAB
(7,5 e 6,5 log UFC g-1, respectivamente) inferior às de 7,5R1 e R2 (7,9 e 7,7 log UFC
g-1, respectivamente); e de 15R1 e R2 (7,7 e 7,6 log UFC g-1, respectivamente). A
concentração de polpa mais abundante parece favorecer o desenvolvimento das
AAB, além de oferecer mais substratos. Nos experimentos 15R1 e 15R2 foi
observada alternância no crescimento de AAB com diferença entre 1 a 2 log, mas
mantendo níveis elevados ainda no final da fermentação. Aqueles microrganismos
estavam, de certa maneira, se adaptando às condições do ambiente, pela presença
ainda abundante de polpa, a qual representa uma barreira para a entrada de ar. Mas
201
nas últimas horas de fermentação, em que a polpa já estava praticamente liquefeita,
o aumento da população de AAB tornou-se mais notável, até pelas condições
favoráveis ora estabelecidas, pelo ambiente mais aerado e também pela
disponibilidade de etanol.
c. Bactérias láticas (LAB)
Foi observada uma contagem maior de LAB nos experimentos com
revolvimento R2. Mas todos os experimentos apresentaram contagem de LAB
estável, superior às contagens de AAB no final da fermentação. As LAB são
microrganismos que crescem em baixa tensão de oxigênio (Schwan & Wheals,
2004), e por esse motivo é recomendada a aplicação periódica de revolvimentos
para limitar o seu crescimento (Guehi et al., 2010), prevenindo a metabolização de
ácido cítrico em ácido lático, que confere acidez indesejável ao produto final
(Afoakwa et al., 2008). Apesar da aplicação de revolvimento ter sido feita
diariamente (especialmente para os experimentos R1), o crescimento de LAB parece
não ter sido afetado pelas manobras.
d. Esporos de bactérias mesófilas (EBM) e de bactérias termófilas (EBT)
Houve aumento no número de EBM ao longo de toda a fermentação em
todos os experimentos com contagem final entre 6,1 e 7,8 log UFC g-1, embora a
população desses microrganismos estivesse baixa durante toda a fermentação, para
todos os experimentos, apresentando crescimento súbito nas últimas horas somente
para os experimentos 15R1 e 15R2. As condições estabelecidas naquele momento,
que compreendiam além da elevação acentuada do pH, mas também menor
disponibilidade de nutrientes levaram ao aumento da esporulação. De fato, estudos
com fermentação de cacau tem relatado o aumento de bactérias esporuladas nos
momentos finais da fermentação (Ostovar; Keeney, 1973; Schwan et al., 1986
citados por Romanczyk et al., 1995; Ardhana & Fleet, 2003). Apesar de não estar
claro qual o papel das bactérias esporuladas na fermentação, alguns estudos
apontam para uma possível produção de sabores estranhos (off flavors) pelos
microrganismos (Schwan & Wheals, 2004), e mesmo produção de compostos
desejáveis de sabor como o 2-3-butanediol, pirazinas, ácido acético e ácido lático
(Jinap et al., 1994; Schwan, 1998). A produção de protease e lipase tem sido
também relacionada ao Bacillus sp em fermentação de cacau (Ardhana & Fleet,
2003).
202
A presença de maior concentração de polpa prolongou o tempo de
fermentação e, de certa forma, expôs de forma mais clara a competição que existe
entre os microrganismos presentes. A polpa favoreceu as bactérias, embora tenha
influenciado no retardo no tempo de fermentação, na liquefação da polpa e aumento
tardio da temperatura do meio, principalmente nos experimentos com 15 % de polpa.
Aparentemente as leveduras, microrganismos primordiais no processo, precisaram
de mais tempo para se adaptar às condições adversas para conseguir vencer as
barreiras e dar início à metabolização dos açúcares para produção de etanol, por
isso a elevação mais tardia da temperatura para os experimentos com mais polpa.
Na contagem em placa, em todos os experimentos, a concentração de leveduras
aumentou até o final da fermentação, assim como o número de EBM, em vista das
razões já explicadas. O aumento abrupto do número de EBT só ocorreu para 15R1 e
15R2 no final da fermentação.
6.2 SEQUENCIAMENTO: ANÁLISE DAS SEQUENCIAS DO DNA 16S E ITS4
Comparando-se os resultados de OTU’s obtidos entre as comunidades de
leveduras e bactérias, observa-se que estas últimas, além de apresentar maior
número de OTU’s, apresentaram também os maiores valores nos experimentos com
maior concentração de polpa (7,5R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2). As leveduras
apresentaram maior expressão nos experimentos com menor quantidade de polpa
(0R1 e 0R2). Estes resultados reforçam a ideia de que a polpa constitui um fator
facilitador para o desenvolvimento de bactérias.
6.3 ESTIMADORES DE RIQUEZA E SIMILARIDADE
6.3.1 Análise de rarefação para estimativa de riqueza das populações de bactérias
Foi realizada a curva de rarefação de bactérias apenas para os
experimentos 0R1 e 15R2, representantes de extremos da amostra com 0% polpa e
15% polpa. A curva com os resultados dos reads gerados ao longo da fermentação
demonstrou que tanto 0R1 quanto 15R2 continuaram a apresentar elevação no
número de OTU’s. A estabilização não foi alcançada em ambos os experimentos,
provavelmente pela alta diversidade presente, indicando que a captura de bactérias
presentes no ambiente estudado não foi totalmente alcançada. Estudos também têm
demonstrado que aumentando a amostragem, são aumentadas as chances de
observação das populações de microrganismos em qualquer ambiente (Hugues et
203
al., 2001). Isso leva a crer que em um ambiente de fermentação como o que foi
estudado, no qual a quantidade média de sementes estava em torno de 8 Kg, a
possibilidade de haver maior diversidade em ambientes de fermentação na ordem
de toneladas é maior. Assim, a curva de rarefação indica claramente que a
diversidade presente de bactérias presentes no ambiente de fermentação pode ser
muito mais ampla.
6.3.2 Similaridade
No domínio bactéria foi observado um agrupamento entre os
experimentos com mesma concentração de polpa e revolvimentos diferentes. Os
experimentos 0R1 e 0R2, por exemplo, apresentaram 80% de similaridade. Ou seja,
o despolpamento total (0%) favorece a maior similaridade entre os experimentos nos
diferentes processos fermentativos. Foi percebido que a similaridade entre as
populações do domínio bactéria tendem a diminuir com maior concentração de
polpa, concluindo que nesse caso ocorra um aumento na diversidade bacteriana
nessas condições.
No domínio levedura o agrupamento não ocorreu em função do
despolpamento, sendo observada similaridade entre os experimentos com valores
entre 45 e 100%. Mas foi observado índice maior de similaridade entre experimentos
de diferentes concentrações de polpa, mas com revolvimentos iguais: 0R1 e 15R1 (±
68%); 7,5R2 e 15R2 (100%). A similaridade de leveduras entre os outros
experimentos foi menor que o observado em bactérias, supondo que a aeração
fornecida em diferentes momentos causou uma alteração no ambiente, afetando de
alguma forma a população de leveduras independente da concentração de polpa.
6.3.3 Estimadores de diversidade e riqueza (Índice de Shannon e Chao1)
Com relação aos dados de alfa-diversidade (na qual é feita a observação
de diversidade dentro de uma amostra) para cada tempo e condição de
fermentação, observou-se que os valores de Shannon para o domínio bactéria foram
maiores que para leveduras. Além disso, notou-se aumento dos valores em função
do tempo de fermentação (h). Por outro lado, os valores de Shannon para levedura
não foram superiores a 1,77, sendo, portanto, indicativo de baixa diversidade de
leveduras nas amostras. O índice de Chao 1 revelou maior riqueza para o domínio
bactéria, que foi aumentando ao longo da fermentação.
204
Embora as leveduras exerçam um importante papel no preparo do
ambiente para a ação das bactérias no início da fermentação, os resultados
demonstram que estas últimas são bastante ativas em todo o processo, tendo sua
participação aumentada na metade até o final da fermentação. Pela grande
diversidade encontrada do domínio bactéria em todos os experimentos supõe-se
que as diferentes populações presentes colaboram de alguma maneira na
transformação do ambiente. Pela diversidade e riqueza de leveduras encontradas
nos experimentos, a sua participação ao longo da fermentação não parece ter sido
tão expressiva como a do domínio bactéria, indicando uma provável competição
entre essas duas comunidades.
6.4 PERFIL TAXONÔMICO DAS COMUNIDADES DE LEVEDURAS NA
FERMENTAÇÃO
A presença de leveduras na fermentação é essencial, visto que sua
subtração do meio implica na obtenção de produto (chocolate) com ausência de
sabor característico, além de elevada acidez (Ho et al., 2014). Durante a
fermentação foi observada predominância do GÊNERO Hanseniospora em todos os
experimentos nos momentos iniciais com declínio nas últimas horas. No sentido
contrário, o GÊNERO Pichia começou a apresentar elevação a partir de 12h nos
experimentos 0R1 e 0R2; e com 36 h nos outros experimentos até o momento final
da fermentação. A manifestação do GÊNERO Pichia horas após o início da
fermentação com evolução até o final tem explicação no fato daquela levedura
utilizar etanol como fonte de carbono (Oslan et al., 2012). A ascensão da Pichia
ocorreu em um momento no qual a concentração de etanol já estava elevada pela
ação das leveduras sobre os açúcares presentes.
A predominância do GÊNERO Hanseniospora desde o início da
fermentação em relação aos outros gêneros de leveduras também foi observada em
fermentação de cacau (Ardhana & Fleet, 2003; Hamdouche et al., 2014). Ainda em
fermentação de cacau, através de métodos não culturais, foi possível identificar a
predominância de espécies de Hanseniospora, em relação ao GÊNERO
Saccharomyces, dominantes em métodos culturais (Papalexandratou et al., 2013).
Os autores acreditam que a presença no meio de cultura do açúcar maltose
favorece o GÊNERO Saccharomyces, ao contrário de Hanseniospora, GÊNERO não
205
fermentador do açúcar. Foi observado também que a população de Saccharomyces
e Candida não foi expressiva nos experimentos, mas a presença na fermentação até
o final indica uma resistência às condições adversas durante o processo, tais como
elevação da temperatura e pH.
Outros gêneros de leveduras foram identificados nos experimentos, mas
sua abundância foi variável e não chegou a ser dominante como ocorreu com os
gêneros Pichia e Hanseniospora. Esta última foi especialmente favorecida nos
experimentos com maior concentração de polpa. Estudos recentes têm
demonstrado, de fato, que grupos de leveduras em fermentação de cacau são
constituídos de um pequeno número de gêneros dominantes (algumas espécies de
Saccharomyces, Pichia, Hanseniospora, Torulaspora, Kluyveromyces) e por um
segundo grupo representado por gêneros variáveis, mas em baixa concentração
(Meersman et al., 2013; Ho et al., 2014). Situação semelhante foi observada neste
trabalho.
6.5 PERFIL TAXONÔMICO DAS COMUNIDADES DE BACTÉRIAS NA
FERMENTAÇÃO
Para as bactérias láticas, o GÊNERO Weissella (FAMÍLIA
Leuconostocaceae) foi predominante nos primeiros dias de fermentação em todos
os experimentos, enquanto que o GÊNERO Lactobacillus (FAMÍLIA
Lactobacillaceae) teve presença mais expressiva após o início com leve declínio no
final. Tudo indica que ambiente com temperatura e concentração de etanol elevadas
não favorecem o desenvolvimento de Weissella, enquanto que algumas espécies de
Lactobacillus possuem habilidade de crescimento nessas condições (Pereira et al.,
2012). Isso explicaria a prevalência de Lactobacillus e supressão de Weissella
durante a fermentação de cupuaçu nos períodos em que a temperatura do meio
esteve aumentada e o nível de etanol elevado.
A predominância do GÊNERO Lactobacillus tem sido bastante observada
em estudos com fermentação de cacau. A maioria das espécies identificadas são
homofermentativas (Kostinek et al., 2008; Ouattara et al., 2014). Na fermentação de
cupuaçu, foi observado que a abundância de Lactobacillus acentuou-se a partir de
12 horas, mas especialmente com 36 h nos experimentos 0R1, 7,5R2, 15R1 e 15R2.
De fato, tem sido demonstrado que as LAB apresentam intensa participação
206
algumas horas após o início da fermentação, evoluindo durante a mesma e
diminuição no final. Nos experimentos analisados, tanto na contagem padrão de
láticas quanto na abundância relativa do gênero Lactobacillus nos experimentos a
concentração dos microrganismos permaneceu estável até o final da fermentação. O
tempo de fermentação do cupuaçu, quando comparado ao de cacau, foi bem mais
curto, indicando que talvez o processo ainda estivesse em pleno curso.
A importância do papel das LAB na fermentação de cacau ainda é
questionável por alguns estudiosos. Foi demonstrado, por exemplo, que a presença
ou ausência de LAB durante a fermentação não exerce influência sobre o pH da
polpa e amêndoas de cacau, e tão pouco sobre as concentrações de ácidos
orgânicos e compostos voláteis durante a fermentação (Ho et al., 2015). Por outro
lado, trabalhos realizados com cacau demonstram que a adição de LAB em
concentrações e intervalos definidos durante a fermentação confere às amêndoas
aumento da qualidade com relação ao aspecto de bem fermentada (Mai et al.,
2014). Espécies heterofermentativas como Lactobacillus fermentum são
consideradas desejáveis pela obtenção de compostos de sabor, tais como acetoína
e 2,3 butanediol, por sua ação sobre o ácido cítrico (Lefeber et al., 2011). Há outros
estudos que também defendem o uso de LAB como culturas starter na fermentação
de cacau, pela potente ação heterofermentativa que algumas espécies possuem
(Ouattara et al., 2014).
No grupo de AAB, o GÊNERO Gluconobacter esteve mais abundante nos
primeiros dias de fermentação para todos os experimentos, ao contrário de
Acetobacter cuja expressão foi maior nas últimas horas, especialmente quando se
observa maior produção de ácido acético no período. Em fermentação de sementes
de cacau, a presença de Acetobacter é mais frequente que o Gluconobacter
(Schwan & Wheals, 2004) e costuma ocorrer desde o início da fermentação
(Papalexandratou et al., 2013). O GÊNERO Gluconobacter possui a habilidade de
oxidar a glicose a ácido glucônico, enquanto que o Acetobacter oxida o etanol a
ácido acético (Yamada & Yukphan, 2008). A abundância de Gluconobacter nas
horas iniciais da fermentação pode estar relacionada com a maior disponibilidade de
glicose, presente na polpa, que naquele momento começa a ser utilizada pelas
leveduras para produção de etanol.
207
O GÊNERO Acetobacter, especialmente a espécie A. pasteurianus, é
quase uma unanimidade com relação à predominância no ambiente de fermentação
(Meersman et al., 2013; Papalexandratou et al., 2013,), mas quanto aos diferentes
momentos de fermentação pode haver predomínio de uma ou outra espécie de
Acetobacter (Nielsen et al., 2007; Romero-Cortes, 2012). A. pasteurianus é a
espécie mais resistente ao calor e acidez (Camu et al., 2008). Foi observada
abundância de Acetobacter a partir de 36 h de fermentação na maioria dos
experimentos, quando a concentração de etanol já estava elevada, acentuando-se
com 60 h, momento em que o ácido acético passa a ser abundante no ambiente.
AAB também são capazes de converter álcoois, por desidrogenação, em outros
tipos de ácidos (propanoico, butanoico, 2-metilpropanoico, 2-metilbutanoico, 3-
metilbutanoico), os quais são potentes compostos de sabor (Schrader, 2007). A
produção destes compostos, além de ácido acético, também foi constatada (Capítulo
4) nos mesmos intervalos de tempo nos quais a população de AAB estava
aumentada em 0R1 e 15R2 0R1 (metade e final da fermentação para ambos
experimentos).
Alguns GÊNEROS da FAMÍLIA Enterobacteriaceae (Escherichia, Shigella)
foram identificados nos experimentos. Alguns autores sugerem que estes
microrganismos poderiam ser utilizados como marcadores específicos na etapa de
fermentação de cacau (Hamdouche et al., 2014), como forma de avaliar o estágio do
processo. Nos experimentos com maior quantidade de polpa (15R1 e 15R2) foi
observado o surgimento, ao final da fermentação, de bactérias do GÊNERO Bacillus,
microrganismos esporulados. A FAMÍLIA Clostridiaceae se manifestou nos
experimentos 0R2 e 15R2 nas últimas horas de fermentação. Os microrganismos
das FAMÍLIAS citadas são favorecidos quando ocorre mudança no ambiente de
fermentação, pela elevação do pH do meio, observada nas horas finais de
fermentação (Schwan & Wheals, 2004).
Bactérias do gênero Bacillus são termorresistentes, por serem
microrganismos esporulados. No caso de EBT, o aumento no número em 15R1 e
15R2 nas últimas horas está claramente relacionada com a elevação do pH do meio
naquele momento e à diminuição no aporte de nutrientes. O mesmo ocorreu com a
contagem de EBM que também apresentou elevação ao longo da fermentação.
208
Algumas espécies de Bacillus crescem bem à temperatura ambiente, podendo
encontrar condições favoráveis para a esporulação. A detecção de diferentes
espécies de Bacillus em chocolate em pó tem demonstrado diferenças na resistência
dos mesmos ao tratamento térmico aplicado, podendo comprometer a qualidade e
sanidade do produto final (Lima et al., 2011).
Estabelecendo-se uma comparação entre os microrganismos
identificados por metagenômica e o método cultural observa-se relativa similaridade
entre os resultados, principalmente para a FAMÍLIA Lactobacillaceae com tendência
de crescimento similar durante o período de fermentação. Na contagem padrão de
esporos, especialmente de bactérias termófilas, a tendência de crescimento segue o
mesmo padrão apresentado para a FAMÍLIA Planococcaceae. Com relação às AAB,
a tendência de crescimento apresentada nos dois resultados é semelhante, sendo
que nos resultados de sequenciamento de metagenômica expressam uma tendência
de declínio da família Acetobacteraceae ao final da fermentação. Embora alguns
estudos concordem que o crescimento de leveduras, LAB e AAB aconteça na forma
de sucessão (Schwan & Wheals, 2004), na contagem em placa foi observado que o
desenvolvimento desses microrganismos ocorreu de forma quase simultânea, assim
como já ocorreu em fermentação de cacau (Camu et al., 2008). De qualquer
maneira, a maior abundância dos gêneros identificados coincide com os momentos
nos quais ocorreram as mais profundas alterações físicas e químicas nos
experimentos durante a fermentação: 12, 36, 60 e 84 h.
Mas é importante ressaltar que a abundância de alguns gêneros tanto de
bactérias e leveduras identificados por sequenciamento não podem ser comparados
com o crescimento observado por métodos culturais, pois estes, dependendo do
meio de cultura e outras condições de cultivo utilizados, não viabilizam o
crescimento de determinadas espécies. Esta é a razão pela qual os métodos
moleculares estão sendo considerados importantes na identificação de
microrganismos em ambientes de fermentação. A sua utilização no presente
trabalho representou uma poderosa ferramenta que permitiu a identificação de
populações de microrganismos e suas interações não só com o ambiente de
fermentação, mas também a sua vulnerabilidade e/ou favorecimento frente às
condições instaladas, no caso sementes com diferentes concentrações de polpa.
209
CONCLUSÃO GERAL
A polpa de cupuaçu possui naturalmente em sua composição compostos
relacionados ao sabor, que mesmo após a fermentação, secagem e processamento
das amêndoas ainda são detectados, conferindo ao cupulate características que
lembram o chocolate do tipo fino. A demanda maior de polpa sem dúvida ocasionou
também maior formação de compostos orgânicos ao final da fermentação, entre os
quais o ácido acético. Ao longo do processo, um consórcio de microrganismos foi
atuando tendo sido observado nos resultados tanto de método cultural quanto do
sequenciamento de larga escala (metagenômica) que algumas comunidades,
dependendo das condições abióticas existentes no momento da fermentação, se
sobrepuseram às outras, possibilitando também correlacionar as diferentes
populações de microrganismos durante os estágios da fermentação, com os eventos
bioquímicos que ocorreram. Com relação à obtenção de amêndoas bem
fermentadas, os experimentos com menor concentração de polpa e tempo mais
curto obtiveram os piores resultados. Nas análises sensoriais dos cupulates as
amostras provenientes dos experimentos com maior concentração de polpa (15%)
estiveram entre as que obtiveram melhores resultados de aceitação, tendo sido
também consideradas, por número percentual menor de consumidores, como
amostras com sabor residual ruim e gosto de terra em relação às outras amostras.
Apesar da intenção de compra ter sido considerada baixa, o cupulate pode ser
considerado um produto promissor, pelas qualidades que apresenta. A amostra de
cupulate com 15% polpa também apresentou concentração considerável de
importantes compostos de sabor, entre eles as pirazinas (trimetilpirazina e
tetrametilpirazina), quando comparada com amostra de cupulate 0% polpa. Os
resultados apresentados no trabalho são pioneiros, pois demonstram que a
manutenção de uma determinada concentração de polpa aderida às sementes de
cupuaçu antes da fermentação é fundamental para viabilizar a formação de
importantes compostos de sabor, além de favorecer grupos de microrganismos com
importante papel no processo. Além disso, a caracterização das amostras de
cupulate pelos consumidores demonstra que se trata de um produto com
características sensoriais peculiares, contrastantes, exibindo ao mesmo tempo sabor
210
amargo, doce e frutado, herdadas da composição química da polpa de um fruto com
grande potencial.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ardhana, M., & Fleet, G. (2003). The microbial ecology of cocoa bean fermentations
in Indonesia. International Journal of Food Microbiology, 86(1-2), 87–99.
http://doi.org/10.1016/S0168-1605(03)00081-3
Beckett, S. (2009). Industrial Chocolate Manufacture and Use. (S. Beckett, Ed.)
(Fourth). York, UK: Blackwell Publishing.
Biehl, B., & Ziegleder, G. (2003). COCOA Chemistry of processing. In Encyclopaedia
of Food Sciences and Nutrition (2nd ed., Vol. 3, pp. 1436–1448). Germany:
Elsevier Science.
Bonvehí, J. (2005). Investigation of aromatic compounds in roasted cocoa powder.
European Food Research and Technology, 221(1-2), 19–29.
http://doi.org/10.1007/s00217-005-1147-y
Camu, N., De Winter, T., Verbrugghe, K., Cleenwerck, I., Vandamme, P., Takrama,
J. S., … De Vuyst, L. (2007). Dynamics and biodiversity of populations of lactic
acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap
fermentation of cocoa beans in Ghana. Applied and Environmental Microbiology,
73(6), 1809–1824. http://doi.org/10.1128/AEM.02189-06
Camu, N., González, Á., De Winter, T., Van Schoor, A., De Bruyne, K., Vandamme,
P., … De Vuyst, L. (2008). Influence of turning and environmental contamination
on the dynamics of populations of lactic acid and acetic acid bacteria involved in
spontaneous cocoa bean heap fermentation in Ghana. Applied and
Environmental Microbiology, 74(1), 86–98. http://doi.org/10.1128/AEM.01512-07
Carvalho, A., García, N., & Wada, J. (2005). Caracterização físico-química e curvas
de solubilidade proteica de sementes, amêndoas fermentadas e torradas de
cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum). Brazilian Journal of Food
Technology, 8(2), 127–134.
Carvalho, A., Garcia, N., & Fárfan, J. (2008). Proteínas da semente de cupuaçu e
alterações devidas à fermentação e à torração. Ciência E Tecnologia de
211
Alimentos, 28(4), 986–993.
Cohen, K., & Jackix, M. (2005). Estudo do liquor de cupuaçu. Ciência E Tecnologia
de Alimentos, 25(1), 182–190. http://doi.org/10.1590/S0101-
20612005000100030
Counet, C., Callemien, D., Ouwerx, C., & Collin, S. (2002). Use of gas
chromatography-olfactometry to identify key odorant compounds in dark
chocolate. Comparison of samples before and after conching. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50(8), 2385–2391.
http://doi.org/10.1021/jf0114177
Crafack, M., Mikkelsen, M. B., Saerens, S., Knudsen, M., Blennow, A., Lowor, S., …
Nielsen, D. S. (2013). Influencing cocoa flavour using Pichia kluyveri and
Kluyveromyces marxianus in a defined mixed starter culture for cocoa
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 167(1), 103–116.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.06.024
Frauendorfer, F., & Schieberle, P. (2008). Changes in key aroma compounds of
Criollo cocoa beans during roasting. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
56(21), 10244–10251. http://doi.org/10.1021/jf802098f
Gondim, T., Thomazini, M., Cavalcante, M., & Souza, J. (2001). Aspectos da
produção de cupuaçu. Embrapa Acre. Documentos. Rio Branco, AC.
Guehi, S., Dabonne, S., Ban-Koffi, L., Kedjebo, D. & Zahouli, G. (2010). Effect of
turning beans and fermentation method on the acidity and physical quality of raw
cocoa beans. Advance Journal of Food Science and Technology, 2(3), 163–171.
Hamdouche, Y., Guehi, T., Durand, N., Kedjebo, K., Montet, D., & Meile, J. (2014).
Dynamics of microbial ecology during cocoa fermentation and drying: Towards
the identification of molecular markers. Food Control, 48, 117–122.
http://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.05.031
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2014). Yeasts are essential for cocoa bean
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 174, 72–87.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.014
Ho, V., Zhao, J., & Fleet, G. (2015). The effect of lactic acid bacteria on cocoa bean
212
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 205, 54–67.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.03.031
Holm, C., Astong, J., & Douglas, K. (1993). The effects of the organic acids in cocoa
on the flavor of chocolate. Journal of Sci Food Agric, 61(Shepherd 1976), 65–71.
Hughes, J., Hellmann, J., Ricketts, T., & Bohannan, B. (2001). MINIREVIEW
Counting the Uncountable : Statistical Approaches to Estimating Microbial
Diversity. Applied and Environmental Microbiology, 67(10), 4399–4406.
http://doi.org/10.1128/AEM.67.10.4399
Japelaghi, R., Haddad, R., & Garoosi, G. (2011). Rapid and Efficient Isolation of High
Quality Nucleic Acids from Plant Tissues Rich in Polyphenols and
Polysaccharides. Molecular Biotechnology, 49(2), 129–137.
http://doi.org/10.1007/s12033-011-9384-8
Jinap, S., & Dimick, P. (1990). Acidic Characteristics of Fermented and Dried Cocoa
Beans from Different Countries of Origin. Journal of Food Science, 55(2), 547–
550.
Jinap, S., Harun, S. & Ghazali, N. (1994). Formation of Methyl Pyrazine during Cocoa
Bean Fermentation. Pertanika J. Trop. Agric, 17(1), 27–32.
Kostinek, M., Ban-Koffi, L., Ottah-Atikpo, M., Teniola, D., Schillinger, U., Holzapfel,
W. H., & Franz, C. M. a. P. (2008). Diversity of predominant lactic acid bacteria
associated with cococa fermentation in Nigeria. Current Microbiology, 56(4),
306–314. http://doi.org/10.1007/s00284-008-9097-9
Lagunes Gálvez, S., Loiseau, G., Paredes, J., Barel, M., & Guiraud, J. (2007). Study
on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the Dominican
Republic. International Journal of Food Microbiology, 114(1), 124–130.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.041
Lefeber, T., Janssens, M., Moens, F., Gobert, W., & De Vuyst, L. (2011). Interesting
starter culture strains for controlled cocoa bean fermentation revealed by
simulated cocoa pulp fermentations of cocoa-specific lactic acid bacteria.
Applied and Environmental Microbiology, 77(18), 6694–6698.
http://doi.org/10.1128/AEM.00594-11
213
Lefeber, T., Papalexandratou, Z., Gobert, W., Camu, N., & De Vuyst, L. (2012). On-
farm implementation of a starter culture for improved cocoa bean fermentation
and its influence on the flavour of chocolates produced thereof. Food
Microbiology, 30(2), 379–392. http://doi.org/10.1016/j.fm.2011.12.021
Lima, L., Kamphuis, H., Nout, M., & Zwietering, M. (2011). Microbiota of cocoa
powder with particular reference to aerobic thermoresistant spore-formers. Food
Microbiology, 28(3), 573–582. http://doi.org/10.1016/j.fm.2010.11.011
Lopes, A., Garcia, N., & Vasconcelos, M. (2003). Avaliação das Condições de
Torração Após a Fermentação de Amêndoas de Cupuaçu (Theobroma
grandiflorum Schum) e Cacau (Theobroma cacao L.). Braz. J. Food Technol,
6(2), 309–316.
Luna, F., Crouzillat, D., Cirou, L., & Bucheli, P. (2002). Chemical composition and
flavor of Ecuadorian cocoa liquor. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
50(12), 3527–3532. http://doi.org/10.1021/jf0116597
Mai, Ho, & Tran. (2014). Fermentation of Cocoa with Addition of Lactic Acid Bacteria.
In International Science, Social Sciences, Engineering and Energy Conference
(pp. 1–8). Udon Thani, Thailand.
Mattietto, R. (2001). Estudo comporativo das transformações estruturais e físico-
químicas durante o processo fermentativo de amêndoas de cacau (Theobroma
cacao) e cupuaçu (Theobroma grandiflorum). 164 p (Mestrado em Tecnologia
de Alimentos). Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil.
Meersman, E., Steensels, J., Mathawan, M., Wittocx, P. J., Saels, V., Struyf, N., …
Verstrepen, K. J. (2013). Detailed analysis of the microbial population in
Malaysian spontaneous cocoa pulp fermentations reveals a core and variable
microbiota. PLoS ONE, 8(12). http://doi.org/10.1371/journal.pone.0081559
Misnawi, & Ariza, B. (2011). Use of gas Chromatography-Olfactometry in
combination with solid phase micro extraction for cocoa liquor aroma analysis.
International Food Research Journal, 18(2), 829–835.
Nielsen, D., Teniola, O., Ban-Koffi, L., Owusu, M., Andersson, T., & Holzapfel, W..
(2007). The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using
214
culture-dependent and culture-independent methods. International Journal of
Food Microbiology, 114(2), 168–186.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.09.010
Oberparleiter, S., & Ziegleder, G. (1997). Amadori-Verbindungen als Aromavorstufen
in Kakao. Nahrung, 41(3), 142–145. http://doi.org/10.1002/food.19970410305
Oliveira, C. (2001). Isolamento e identificação da microbiota nos diferentes estágios
de fermentação das sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum).
150 p. (Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Federal do
Amazonas, Brasil.
Oslan, S., Salleh, A., Abd Rahman, R., Basri, M., & Chor, A. (2012). Locally isolated
yeasts from malaysia: Identification, phylogenetic study and characterization.
Acta Biochimica Polonica, 59(2), 225–229.
Ouattara, D., Ouattara, H., Goualie, B., Kouame, L., & Niamke, S. (2014).
Biochemical and functional properties of lactic acid bacteria isolated from Ivorian
cocoa fermenting beans. J. Appl. Biosci., 77, 6489–6499.
http://doi.org/10.4314/jab.v77i1.9
Papalexandratou, Z., Lefeber, T., Bahrim, B., Lee, O., Daniel, H., & De Vuyst, L.
(2013). Hanseniaspora opuntiae, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus
fermentum, and Acetobacter pasteurianus predominate during well-performed
Malaysian cocoa bean box fermentations, underlining the importance of these
microbial species for a successful cocoa . Food Microbiology, 35(2), 73–85.
http://doi.org/10.1016/j.fm.2013.02.015
Pereira, G., Miguel, M., Ramos, C., & Schwan, R. (2012). Microbiological and
physicochemical characterization of small-scale cocoa fermentations and
screening of yeast and bacterial strains to develop a defined starter culture.
Applied and Environmental Microbiology, 78(15), 5395–5405.
http://doi.org/10.1128/AEM.01144-12
Provost, G., Herrera, R., Paiva, J.A., Chaumeil, P. Salin, F., Plomion, C. (2007) A
micromethod for high throughput RNA extraction in forest trees. Biological
Research, v.40, p. 291 – 297
215
Pugliese, A., Tomas-Barberan, F., Truchado, P., & Genovese, M. (2013). Flavonoids,
Proanthocyanidins, Vitamin C, and Antioxidant Activity of Theobroma
grandiflorum (Cupuassu) Pulp and Seeds. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 61, 2720–2728. http://doi.org/10.1021/jf304349u
Queiroz, M., & Garcia, N. (1999). Avaliação da Torração de Amêndoas de Cupuaçu (
Theobroma grandiflorum ). Brazilian Journal of Food Technology, 2, 167–173.
Robayo, Z. (2010). Caracterización del proceso de fermentación del grano de
copoazú (Theobroma grandiflorum Willd. ex spreng). Monography. Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
Rodriguez-Campos, J., Escalona-Buendía, H., Contreras-Ramos, S., Orozco-Avila,
I., Jaramillo-Flores, E., & Lugo-Cervantes, E. (2012). Effect of fermentation time
and drying temperature on volatile compounds in cocoa. Food Chemistry,
132(1), 277–288. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.10.078
Rogez, H., Buxant, R., Mignolet, E., Souza, J., Silva, E., & Larondelle, Y. (2004).
Chemical and composition of the pulp of three typical Amazonian fruits: araça-
boi (Eugenia stipitata), bacuri (Platonia insignis) and cupuaçu (Theobroma
grandiflorum). Eur Food Res Technol, 218, 380–384.
http://doi.org/10.1007/s00217-003-0853-6
Romanczyk, L., McClelland, C., Post, L., & Aitken, W. (1995). Formation of 2-acetyl-
1-pyrroline by several Bacillus cereus strains isolated from cocoa fermentation
boxes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43(2), 469–475. Retrieved
from \\Robsrv-05\reference manager\Articles\7513.pdf
Romero-Cortes, T. (2012). Isolation and characterization of acetic acid bacteria in
cocoa fermentation. African Journal of Microbiology Research, 6(2), 339–347.
http://doi.org/10.5897/AJMR11.986
Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., & Johne, R. (2012). PCR inhibitors -
occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology, 113(5),
1014–1026. http://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x
Schrader, J. (2007). Microbial flavour production. In Flavours and Fragrances:
Chemistry, Bioprocessing and Sustainability (pp. 507–574). Frankfurt:
216
DECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institute. http://doi.org/10.1007/978-3-540-
49339-6_23
Schwab, W., Davidovich-Rikanati, R., & Lewinsohn, E. (2008). Biosynthesis of plant-
derived flavor compounds. Plant Journal, 54(4), 712–732.
http://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03446.x
Schwan, R. (1998). Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail
inoculum. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1477–1483.
Schwan, R., & Wheals, A. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its
role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4),
205–221. http://doi.org/10.1080/10408690490464104
Yamada, Y., & Yukphan, P. (2008). Genera and species in acetic acid bacteria.
International Journal of Food Microbiology, 125(1), 15–24.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.077
Zeng, Y. , Yang, T. (2002). RNA isolation from highly viscous samples rich in
polyphenols and polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter, 20, 417 –
417.
