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UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA Elucidación estructural y actividad antimicrobiana de los metabolitos presentes en maguey morado (Rhoeo discolor L. Hér Hance) Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias, Área: Biotecnología presenta: Miguel Angel Domínguez Ortíz Asesores: Dr. Javier Farias Larios Dra. Rosa Luisa Santillán Baca Co-Asesores: Dr. Sergio Aguilar Espinosa Dra. María del Rocío Flores Bello Dr. José Gerardo López Aguirre Tecomán, Colima, México. Mayo del 2003
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UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
Elucidación estructural y actividad antimicrobiana de los metabolitos
presentes en maguey morado (Rhoeo discolor L. Hér Hance)
Tesis que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias, Área: Biotecnología
presenta:
Miguel Angel Domínguez Ortíz
Asesores:
Dr. Javier Farias Larios
Dra. Rosa Luisa Santillán Baca
Co-Asesores:
Dr. Sergio Aguilar Espinosa
Dra. María del Rocío Flores Bello
Dr. José Gerardo López Aguirre
Tecomán, Colima, México. Mayo del 2003
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 21112003. C. MIGUEL ANGEL DOMÍNGUEZ ORTIZ EGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIAS ÁREA: BIOTECNOLOGÍA P R E S E N T E.
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: de Biotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis " ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICRORIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Ráoeo discolor L. Her Hance ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Javier Farias Larios, Profesor-investigador de la Universidad de Colima y la Dra. Rosa Luisa Santillán de Baca del CINVESTAV-IPN.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en Ciencias: Arca: Biotecnología y fue revisado en cuanto a fo rma y contenido por los C.C. Dr. José Gerardo López Aguirre, Dr. Jaime Molina Ochoa, Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, Dr. Roberto Lezama Gutiérrez y la Dra. María del Rocío Flores Bello. Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima. Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
C.C.P. EXPEDIENTE ACADÉMICO DEL ALUMNO C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO. RVMD/nlpv** Of No.21112003.
" 2003,415- ANIVERSARIO DE LA FACULTAD DE DERECHO "
Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected]
AGRADECIMIENTOS
• A la Dirección General de Apoyo al Desarrollo Académico de la Universidad
Veracruzana.
• Al programa PROMEP dependiente de la Secretaria de Educación Pública.
• Al Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana.
Por el apoyo que me brindaron para la realización de mis estudios de Doctorado
en Ciencias.
• A las Doctoras Rosa Luisa Santillán Baca y María del Rocío Flores Bello por la
orientación en la realización de éste trabajo y por su amistad que
desinteresadamente me brindan.
• A los Doctores Javier Fardas Larios, Sergio Aguilar Espinosa y )osé Gerardo
López Aguirre por el apoyo y asesoría en el transcurso de mis estudios.
• A los sinodales, Doctores Javier Molina Ochoa, Oscar Rebolledo Domínguez y
Roberto Lezama Gutiérrez por sus valiosas observaciones al presente trabajo.
i
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................. iv ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. v
ANEXOS....................................................................................................................... viii
RESUMEN .................................................................................................................... ix
ABSTRACT................................................................................................................... X
I. INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 1
II. ANTECEDENTES ................................................................................................... 4
2.1. Familia Commelinaceae...................................................................................... 4
2.2. Estudios quimiotaxonómicos de la familia Commelinaceae .......................... 5
2.3. Rhoeo discolor L. Hér Hance ...............................................................................
2.4. Los flavonoides, cumarinas y quinonas............................................................
10
2.5. Flavonoides y quinonas biológicamente activas ............................................. 12
2.6. Cumarinas biológicamente activas.................................................................... 17
2.7. Estudios microbiológicos..................................................................................... 21
2.8. Microorganismos patógenos utilizados en las pruebas antimicrobianas.. 23
2.8.1. Familia Enterobacteriaceae.............................................................................. 23
2.8.2. El género Escherichia ...................................................................................... 24
2.8.3. El género Shigella.............................................................................................. 27
2.8.4. El género Salmonella....................................................................................... 28
2.9. Crecimiento, supervivencia y muerte de los microorganismos ..................... 30
2.9.1. Crecimiento exponencial ................................................................................. 31
2.9.2. Curva de crecimiento ....................................................................................... 31
2.10. Aplicación de los agentes quimioterapéuticos .............................................. 34
III. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 36
3.1. Recopilación y preparación de la materia prima ............................................. 3
3.2. Material para estudios microbiológicos............................................................. 36
3.3. Metodología para los estudios microbiológicos................................................ 36
ii
3.3.1. Conservación de cepas bacterianas .........................................................
3.3.2. Técnicas para efectuar pruebas de susceptibilidad................................
3.3.3. Desarrollo de curvas de crecimiento de la población bacteriana ..........
3.3.4. Método de difusión en disco .......................................................................
3.3.5. Determinación de la actividad antimicrobiana .........................................
3.3.6. Determinación de la susceptibilidad a los antibióticos ............................
3.3.7. Método de dilución en caldo .......................................................................
3.4. Materiales para estudios fitoquímicos ...........................................................
3.4.1. Cromatografía en capa delgada ...............................................................
3.4.2. Cromatografía en columna .........................................................................
3.4.3. Cromatografía en capa preparativa ...........................................................
3.4.4. Equipo para análisis espectroscópicos.....................................................
3.4.5. Agente reveladores .....................................................................................
3.4.6. Identificación de familias de metabolitos ..................................................
3.4.6.1. Reactivos para la identificación de metabolitos ...................................
3.5. Procesos fitoquímicos ...................................................................................
3.5.1. Extracto acetato de etilo de tallo de Rhoeo discolor .............................
3.5.2. Estudio fitoquímico del extracto metanólico de tallo ...............................
3.5.3. Acetilación del compuesto EacEtC2 .........................................................
3.5.4. Metilación del compuesto EacEtC2...........................................................
IV. RESULTADOS .................................................................................................
4.1 Estudio microbiológico ....................................................................................
4.1.2. Características físicas de extractos..........................................................
4.1.3. Pruebas de susceptibilidad antibiótica......................................................
4.1.4. Determinacion de la actividad antimicrobiana por el método de
difusión en disco .....................................................................................................
4.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de
difusión en disco .....................................................................................................
4.2. Estudios cromatográficos ..............................................................................
38
38
40
42
43
44
45
45
46
46
46
46
47
47
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50
54
57
57
59
59
59
60
61
68
76
iii
4.2.1. Identificación de metabolitos secundarios por cromatografía de
gases en los extractos de Rhoeo discolor............................................................
4.2.2. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno del
compuesto EacEtC1 ................................................................................................
4.2.3. Espectroscopia de, masas del compuesto de estructura cumarinica
(acetc2) ......................................................................................................................
4.2.4. Espectroscopia infrarroja del compuesto cumarínico (acet2) .................
4.2.5. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno del
compuesto cumarinico (acet2) ...............................................................................
4.2.6. Espectroscopia infrarroja de la cumarina acetilada .................................
4.2.7. Espectroscopia de la cumarina metilada...................................................
4.2.8. Espectroscopia infrarroja del compuesto cumarinico metilado...............
4.2.9. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno de
la cumarina metilada ................................................................................................
V. DISCUSIÓN................... :.: ...................................................................................
5.1. Proceso microbiológico....................................................................................
5.1.2. Método de difusión en disco ........................................................................
5.1.3. Método de dilución en caldo ........................................................................
5.1.4. Proceso de extracción e identificación de metabolitos ............................
5.1.5. E lucidación del compuesto EacEtC1 .........................................................
5.1.6. Elucidación del compuesto EacEtC2 .........................................................
V.I. CONCLUSIONES..............................................................................................
VII. LITERATURA CITADA....................................................................................
VIII. ANEXOS ............................................................................................................
77
79
80
81
81
84
86
87
88
90
90
90
92
94
95
96
100
101
117
iv
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Título Página
1
2
3
4
5
6
7
8
Algunos géneros de la familia Commelinaceae y su localización
en los diferentes continentes ......................................................
Fases de la curva de crecimiento microbiano ..........................
Concentración de la solución madre y diluciones, alícuotas
tomadas y concentración final de los discos ...........................
Cantidades de extractos obtenidos de la parte aérea de Rhoeo
discolor ..........................................................................................
Susceptibilidad de diferentes microorganismos a diversos
antibióticos .....................................................................................
Actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor
sobre Escheríchia coli .................................................................
Actividad antimicrobiana de extractos de Rhoeo discolor sobre
Salmonella enteritídis ..................................................................
Antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor sobre
Shigella tlexneri.............................................................................
compuestos identificados por cromatografía de gases ............
5
32
43
59
60
61
63
66
80
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Título Página
1 3 4 5 7 6 7 8 9
10
11
12
13
14
Estructura química, 3-O-(6-O-(2,5-di-O-cafeil-a-L- Arabinofuranosl)-β -D-Glucopiranosl)-7-3'-di-O-(6-O-Cafeil-β -D- Glucopiranosil) Cianidina ................................................................. Estructura del compuesto antocianina, 3-O-(6-O-(trans-p- cumaroil)B-D-glucosil-5-O-(6-O-Malon- β D-lucosyl) Delfinidina... Estructura química del compuesto isoflavocommelitina ............. Maguey morado (Rhoeo discolor L.' Hér Hance) ......................... Distribución geográfica de Rhoeo discolor L Hér Hance en la República Mexicana...................................................................... Estructura básica de un flavonoide ............................................... Gráfica del crecimiento bacteriano ................................................. Proceso de extracción de metabolitos de las hojas de Rhoeo discolor L. Hér Hance ...................................................................... Proceso de extracción de metabolitos del tallo de Rhoeo discolor L. Hér Hance ..................................................................................... Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor L Hér Hance........................................................... Proceso del estudio ; fitoquímico del extracto acetato de etilo en tallos de Rhoeo discoior .................................................... Estudio fitoquímico de la parte insoluble del lavado hexánico............................................................................................. Estudio fitoquímico de la parte soluble del lavado hexánico...... Estudio fitoquímico del extracto metanólico del tallo de Rhoeo d. L Hér Hance .....................................................................................
6
6 7 9
9
11
32
37
37
44
50
52
54
56
vi
15 Actividad antibacteriana de extractos clorofórmico de hoja y
acetato de etilo de tallo de Rhoeo discolorsobre Escherichia coli en concentración de 6x10 6 UFC/ml........................................
62
16 Actividad antimicrobiana de extractos clorofórmico y acuoso de Hoja de Rhoeo discolor sobre Escherichia coli en concentración de 1 x105 UFC/ml………………………………………………
62 17 Actividad antimicrobiana del extracto clorofórmico (a) y
etanólico (b) de hoja en diferentes concentraciones sobre Salmonella enterítídis en concentración de 1x106 ..............................................................................................
64
18 Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo tallo sobre
Salmonella enteritidis 65
19 Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de hoja y tallo
de Rhoeo discolor sobre Shigella flexneri.................................... 67
20 Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo de Rhoeo
discolor sobre Shigella flexneri ..................................................... 67
21 Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo de Rhoeo
discolor sobre Shigella flexneri .................................................... 68
22 Efecto del extracto etanólico del tallo de Rhoeo discolor sobre el
crecimiento de Shigella flexneri.................................................... 69
23 Efecto del extracto etanólico del tallo deRhoeo discolor sobre el
crecimiento de Escherichia coli .................................................... 69
24 Efecto del extracto acuoso y concentraciones en el control de. la
bacteria Escherichia coli .................................................................. 70
25 Efecto del extracto etanólico y concentraciones en el control de
Escherichia coli ................................................................................. 71
26 Efecto del extracto acuoso de tallo y concentraciones en el control de Escherichia coli ............................................................... 71
vii
27 Efecto del extracto Acuoso tallo y concentraciones en el control
de Escherichia coli ........................................................................... 72
28 Efecto de los extractos Escherichia coli ......................................... 72
29 Efecto de la concentración de Escherichia coli 73
30 Efectos de los extractos sobre Salmonella enteritidis .................. 73
31 Efectos de las concentraciones de bacterias............................. 74
32 Efecto de los extractos sobre Shigella flexneri.......................... 74
33 Efecto de los extractos sobre Shigella flexneri.......................... 75
34 Efecto de los extractos de R. discolor sobre las concentraciones
de Shigella flexneri ............................................................................ 75 35 Cromatografía en capa delgada del extracto virgen de R. 76
36
L. Hér Hance ......................................................................................
Cromatografía en capa delgada utilizando luz ultravioleta del
extracto virgen de R. Discolor L. Hér Hance.................................. 77
37 Espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno a 270
Mhz del compuesto estigmasterol ............................................ 79
38 Estructura del β -sitosterol aislados del extracto de acetato de
etilo de Rhoeo discolor L. Hér Hance ...................................... 80
39 Espectro de masas del compuesto de estructura cumarínica 80
40 Espectro de infrarrojo del compuesto cumarínico (acetc2) ...... 81
41 Espectro de 1H RMN de 4-(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H
furan-2-ona a 270 Mhz ................................................................. 82
42 Ampliación del espectro de 1 RMN en la zona, aromática del
compuesto cumarínico (500 Mhz) ............................................. 83
43 Espectro de masas del compuesto cumarínico (acet2) después
de ser acetilado con ión molecular de 334 m/z......................... 84
44 Espectro de infrarrojo del compuesto acetilado ....................... 85 45 Espectro de 'H RMN de la cumarina acetilada ......................... 86
viii
46
47
48
49
Espectro de masas del compuesto cumarínico después de. la
reacción de metilación ...............................................................
Espectro de infrarrojo del compuesto cumarínico después de la
reacción de metilación ...................................................................
Espectro de 'H RMN del compuesto cumarínico metilado.......
Conversión de la estructura de cumarina a furanona
87
88
89
97
1
2
3
4
5
6
7
8
Anexos
Localización de las infecciones producidas por las enterobacterias
Método de difusión en disco
Método de dilución en caldo
Estructura y cálculo del peso molecular mónohidroxilado del
cumarínico
Estructura y cálculo del peso molecular del compuesto furanona
Estructura y cálculo del. peso molecular de la furanona metilada
Estructura y cálculo del peso molecular de la furanona acetilada
Reacciones de acetilación y metilación del compuesto furanona
Página
117
118
119
120
121
122
123
124
ix
Actividad antimicrobiana y elucidación estructural de los metabolitos
presentes en "maguey morado" (Rhoeo discolor L. Hér Hance)
RESUMEN
La especie Rhoeo discolor(L. Hér Hance) conocida como “maguey morado
o barquilla” de la familia Commelinaceae, es muy utilizada en la medicina
tradicional de México como antiinflamatoria y en el tratamiento de enfermedades
gastrointestinales.
La acción bactericida de los extractos de esta especie fue comprobada utilizando
los microorganismos Escherichia coli, Salmonella enteritidis y Shigella tlexnery. De
los extractos probados el que mayor acción bactericida mostró, fue el de acetato
de etilo, así también, Shigella flexneri presentó una gran inhibición en su
crecimiento por la acción de los extractos. Por otro lado, el estudio fitoquímico de
esta especie, se encontró la presencia de los compuestos cloruro de sodio, cloruro
de potasio, ácido hexadecanoico, ácido 9,12-octadiecanoico, hidrocarburos
saturados (ceras), carotenos, y-sitosterol, β -sitosterol, estigmasterol y un
compuesto importante de estructura cumarínica hidroxilada 4-(2,4-dihidroxi-fenil)-
5-hidroxi-5H-furan-2- ona) que podría ser la responsable de la acción
antiinflamatoria y bactericida.
La identificación de los compuestos químicos se logró utilizando cromatografía en
capa fina cromatografía de líquidos, espectrometría de masas, espectroscopía
infrarroja y resonancia magnética nuclear.
Palabras claves: Rhoeo discolor L. Hér Hance, Escherichia coli, Salmonella
enteritidis, Shigella flexnari, estudio fitoquímico, acción bactericida.
x
ABSTRACT
Rhoeo discolor (L. Hér Hance) known as "maguey morado" o "barquilla"
belongs to Commellnaceae family and has been used in traditional medicinal
Mexicana as antiinfammatory agent and to treat gastrointestinal disorders
suggesting it has antibacterial properties against enterobacteria. Bactericidal action
of R. discolor extracts was essayed in Escherichía coli, Salmonella enteritidis and
Shigella flexnery cultures. The ethyl acetate extract produced the largest
bactericidal action while S. flexnery showed the major growth inhibition due to
R.discolor extracts. The phytochemical study of R. discolor showed the presence
of several compounds as sodium chloride, potassium chloride, hexadecanoic acid,
1,12-octadiecanoic acid, saturated hydrocarbons (waxes), carotens, gamma-
sitosterol, beta-sitosterol, estigmaterol and a hidroxilated cumarinic compound (4-
(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H-furan-2- ona) that would be able to be the
responsible for the bactericidal action. The identification of the compounds was
achieved utilizing Thin ¡ayer chromatografic, HPLC, mass spectrophotometry, infra
red spectrofotometry and NMR spectroscopy.
Key words: Rhoeo discolor L. Hér Hance, Escherichia coli, Slamonella enteritidis,
Shigella flexnari, phytochamistry study, bactericidal action.
1
I. INTRODUCCIÓN
El conocimiento de la composición química de los seres vivos, en este caso
de las plantas (fitoquímica), no es, una tarea fácil de realizar. Debido al gran
número de compuestos químicos (metabolitos) presentes en los vegetales y a la
enorme diversidad estructural de ellos, los procesos de extracción, separación e
identificación son laboriosos y complicados. Sin embargo, los resultados positivos
de este tipo de investigación son un gran aliciente para continuar contribuyendo en
el conocimiento de la química de las plantas, sobre todo, si se trata de especies
muy utilizadas empíricamente con algún propósito medicinal.
La enorme aplicación de las plantas medicinales con fines terapéuticos crea
a la urgente necesidad de realizar estudios científicos con el objetivo de conocer
los metabolitos contenidos en las especies para su aplicación farmacéutica; es por
ello que se utiliza, dentro del análisis y estudio de las plantas medicinales, la
aplicación especial de procedimientos técnicos y de métodos o principios
empleados en la fitoquímica "clásica". El investigador está comprometido con
estudiar los compuestos presentes en un extracto para determinar nuevas
estructuras químicas o la existencia de otras ya conocidas; Asimismo, para
obtener un conocimiento fundamental acerca del tipo y cantidad de sustancias que
produce un vegetal determinado, con el propósito de encontrar nuevos fármacos
que puedan utilizarse en los tratamientos de enfermedades bacterianas
(Phillipson, 1995; 1999; 2001).
Desde hace años, se tiene conocimiento de que algunas especies
vegetales de ciertas familias -preferentemente labiadas (De Araujo et al., 1974;
Kelecom, 1984; Iwu et al., 1990), compuestas y rutáceas- se caracterizan por
contener aceites esenciales. Éstas fueron denominadas "plantas aromáticas" y
eran muy recomendadas para el alivio de enfermedades intestinales (Wagner,
1977; Kubo, 1978).
El estudio fitoquímico de dichas plantas aromáticas, reveló que el alto
contenido de monoterpenos en sus aceites esenciales era el causante de la acción
medicinal, ya que estos compuestos -casi en su mayoría- presentan acción
2
bactericida y también actúan como sedantes en el aparato digestivo (Lorente et
al., 1989).
En los últimos años, se ha descubierto que existen otras familias de
plantas, que aunque no se caracterizan por ser "aromáticas", sí poseen
propiedades medicinales muy notorias en el tratamiento de enfermedades del
aparato digestivo, preferentemente, aquellas que son utilizadas como
antiinflamatorias y anticancerígenas. El estudio fitoquímico de este nuevo grupo de
plantas comprobó la existencia de compuestos flavónicos y cumarínicos en sus
extractos (Hirano et al., 1994). Las cumarinas, cromonas y flavonas son
metabolitos naturales muy presentes en las plantas comestibles. Éstos
comprenden la gran familia de compuestos polifenólicos que muestran diversas
actividades biológicas; algunos se conocen como inhibidores de la inducción de
tumores por carcinogénesis química (Digiovanni, 1990) y potentes bactericidas
(Mabry, 1970). La presencia de estos metabolitos le confiere a las plantas
propiedades medicinales (Harbone, 1967; Wagner, 1979).
El uso de plantas con propiedades medicinales es una actividad empírica
muy generalizada en diversas civilizaciones. Esta práctica ancestral está muy
arraigada en el país y existe un gran número de especies utilizadas en Medicina
Tradicional. Entre ellas destaca el "maguey morado" (Rhoeo discolor, L. Hér
Hance) que es utilizada para el tratamiento de enfermedades que afectan el
aparato digestivo (Martínez, 1959). A la fecha no existe un conocimiento científico
que explique la acción terapéutica de los compuestos químicos presentes en ella,
por ello, se requiere realizar diversas investigaciones para examinar la estructura
de dichos compuestos y elucidar su posible correlación con la acción terapéutica y
antimicrobiana.
La familia Commelinaceae, a la cual pertenece la planta Rhoeo discolor, L.
Hér Hance ha sido objeto de numerosos estudios fotoquímicos y farmacológicos,
lo que produjo el aislamiento de nuevos compuestos químicos (flavónicos y
cumarínicos) con acción desinflamatoria, pero sobre todo, el descubrimiento de las
propiedades de inhibición en la formación de, tumores o carcinogénisis de estos
compuestos, ya que presentan la ventaja -con respecto de otros- de inhibir el
desarrollo de enzimas en el proceso de carcinogénisis (Nakane, 1990; Malavielle
3
et al., 1996; Sarmishtha et al., 2000).
La pregunta es si los extractos obtenidos de la planta maguey morado
(Rhoeo discolor L. Hér Hance) presentan propiedades bactericidas en los
microorganismos patógenos (Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia
coli) causantes de enfermedades gastrointestinales, y si dichos extractos tendrán
compuestos de tipo flavonoide o cumarínico que justifiquen su acción terapéutica.
En respuesta a esta interrogante, se planteó la hipótesis de que Rhoeo discolor L.
Hér Hance, por ser un miembro de la familia Commelinaceae, posee compuestos
con anillos lactónicos (flavonoides y/o cumarínicos) y la acción terapéutica
atribuida a ella es debido a la presencia de estos metabolitos.
Por esta razón, se plantearon como objetivos:
1. Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos de maguey morado
(Rhoeo discolor L. Hér Hance) sobre diferentes agentes causales de
enfermedades gastrointestinales.
2. Identificar las estructuras químicas de los metabolitos secundarios presentes
en el maguey morado (Rhoeo discolor L. Hér Hance).
4
II. ANTECEDENTES
2.1. Familia Commelinaceae
La familia Commelinaceae abarca 44 géneros y 600 especies
aproximadamente, una gran parte tropicales, subtropicales y otras regiones
templado-cálidas. Se puede encontrar desde el sur de Estados Unidos hasta
Sudamérica, en casi todo el Continente Africano, China, Japón y Australia
(Hutchison, 1979; Heywood, 1985; Gentry, 1993). Está formada por hierbas
suculentas perennes o anuales, muchas de las cuales son muy populares como
plantas de jardín, ornamentales de interior y de invierno.
Son plantas sin tallos o con tallos articulados aéreos suculentos, de hojas
alternas, aplastadas, enteras y con vaina basa) cerrada; con raíces adventicias
fibrosas u ocasionalmente huecas y tuberosas.
En algunas especies, los pétalos están soldados en un tubo, mientras que
raramente aparece uno de ellos reducido en tamaño;, estambres con dos verticilos
trímeros, a veces uno de ellos formado por estaminodios (en un género, sólo un
estambre funcional y ningún estaminodio), con filamentos normalmente libres y a
veces adornados de pelos de colores vivos, con anteras de dehiscencia por poro
apical; ovario súpero con tres carpelos soldados y tres cavidades, rara vez dos;
cada carpelo con uno a varios óvulos ortótropos de placentación axilar; estilo único
terminado, o bien en una cabezuela estigmática aplastada o en tres ramas
estigmáticas.
Fruto en cápsula de pared delgada, aunque alguna vez puede ser carnoso
e indehiscente; semillas con superficie rugosa o acanalada, cubiertas por un arito
con abundante endospermo farinoso y embrión situado bajo una estructura discal
(embriotegio) de la cubierta seminal (Heywood, 1985).
Muchos de los géneros importantes se localizan distribuidos en los
continentes Europeo, Asiático, Africano y Americano. En el Cuadro 1 se
mencionan algunos géneros de esta familia y su localización.
Los géneros utilizados como plantas de jardín, invernaderos e interiores
son: Commelina, Tradescantia, Rhoeo, Cyanotis y Zebrina (Heywood, 1985).
5
Cuadro 1. Algunos géneros de la familia Commelinaceae y su localización en los
diferentes continentes (Hutchinson, 1979; Heywood, 1985; Gentry, 1993).
Europeo Asiático Africano Americano
Generos especies Generos
especies
Generos especies Generos especies Generos
especies
Murdania 5 Streptolirion 1 Stanfeldiella 1 1 Hadrodemas 1 Aneilema 1 Belosynaesis 1 Leptorhoeo 1 Gibasis 11 Tipogandra 22
Forrestia 1 Coleotrype 1 Polyspatha 1 Floscopa 4 Tradescantia 40 Cyanotis 1 Pseudoparis 1 Ballya 1 Tinantia 13 Callisia 20
Polla 1 Triceratella 1 Palisota 1 Geogenanth
us
4 Campelia 3
Spatholirion 1 Anthericopsis 1 Siderasis 1 Setcreasea 1
Aetheolirion 1 Sauvallea 1 Zebrina 1 Commelina 180 Apholeia 1
Commelinop 1 Elasis 1 Dichorisandr
a
30 Cymbispatha 1
Phacosphae 1 Rhoeo 1 Cochliostem
a
2
2.2. Estudios quimiotaxonómicos de la familia Commelinaceae
La familia Commelinaceae es muy numerosa; se han realizado estudios
fitoquímicos detallados que caracterizan metabolitos secundarios de sus géneros
aunque algunos de éstos no han sido objeto de investigación química, como es el
caso de Rhoeo discolor.
Algunos géneros de esta familia son utilizados como plantas de ornato,
debido a los colores intensos que presentan en sus hojas y ,flores, como los
géneros Zebrina y Commelina. Esto mismo ha sido motivo para que algunos
investigadores estudiaran los pigmentos de estas especies, como es el caso de la
investigación fitoquímica realizada a Zebrína pendula, de la cual se aislaron e
identificaron algunos metabolitos contenidos en los pétalos de sus flores, y que
presentaron la estructura del derivado de cianidina (Idaka et al., 1987) (Fig. 1).
6
Figura 1. Estructura química, 3-O-(6-O-(2,5-di-O-cafeil-a-L-Arabinofuranosl)- β-D-
Glucopiranosil)-7-3'-di-O-(6-O-Cafeil-P-D-Glucopiranosil) Cianidina.
Otro grupo de investigadores japoneses realizó estudios fitoquímicos a
Commelina comunis, de la cual se identificó, en los pétalos, el compuesto de tipo
antocianina (Goto-Toshio et al., 1983) (Fig. 2).
Figura 2. Estructura del compuesto antocianina, 3 -O-(6-O-(trans-p-cumaroil)B-D-
glucosil-5-O-(6-O-Malon- β D-Iucosyl) Delfinidina.
7
Sin embargo, quien ha dedicado gran parte de su vida en el estudio de los
compuestos antocianinas presentes en Commelinaceae y otras familias es
Harborne (1957a; 1957b; 1959; 1963; 1964a; 1964b; 1965, 1986a; 1986b; 1988a),
este investigador ha realizado identificaciones cromatográficas y espectroscópicas
de un gran número de metabolitos coloridos.
En esta familia también se han identificado compuestos de tipo flavonoide
como la isoflavocommelitina, aislado de Commelina comunis (Kosaku Takedo et
al., 1966) (Fig. 3).
Figura 3. Estructura química del compuesto isoflavocommelitina
Otras de las plantas estudiadas de esta misma familia es Cyanotis vaga, de
la cual se logró aislar un nuevo compuesto de tipo phytoecdysona, al cual
denominaron commisterona (Santos et al., 1970).
Por estudio fitoquímico de la planta Forrestia mollissima se aisló del
extracto de butano¡, un compuesto interesante que mostró actividad depresiva en
el sistema nervioso central. Este compuesto fue denominado ecdisterona (Tandon
et al., 1982).
Uno de los géneros más estudiados por atribuirle propiedades medicinales
es el género Commelina. Así, Commelina undulata ha sido estudiada y se lograron
identificar los compuestos;. 2-eneicosanona, n-octacosanol, β β -sitosterol, β -D-
glucósido de sitosterol y un triterpeno caracterizado como acetato de dammar-12,
25-dieno (Sharma et al., 1982).
Otra especie del mismo género, Commelina comunis fue estudiada y se
8
demostró que la coloración azul de sus pétalos se debía a la presencia del
compuesto malonilawobaina, es decir, al 3-O-(6-O-(trans-P-cumaroil) β -D-glucosil-
5-O-(6-O-malonil-β -D-glucosil) delfidina (Goto Toshio et al., 1983).
Este mismo grupo de investigadores, dirigido por Goto y Kondo Tadao, ha
realizado numerosos estudios a distintos géneros de la familia Commelinaceae,
dentro de los que se encuentran Zebrina pendola, Rhoeo spathacea y Setcreasa
purpurea y de estas plantas aislaron antocianinas acetiladas. El método de
separación de estos pigmentos fue cromatografía líquida de alta eficiencia.
Los investigadores antes mencionados determinaron la estructura de una
antocianina aislada de Zebrina pendula y la denominaron zebrinina, la cual
corresponde a la estructura 3-O-(6-O (2,5-di-O-caffeil-L-arabinofuranosil-B-D-
glucopiranosl)-7-3-di-O-(6-O-caffeil-β -D-glucopiranosil) cianidina (Idaka et al.,
1987).
También se han realizado estudios fitoquímicos al género Zebrina para
comprobar el origen de su coloración y la estabilidad del mismo, demostrando que
el excepcional color se debe a las antocianinas presentes (Brouillard, 1981).
En la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, de Colombia, se
investigó la actividad antiviral y antitumoral de nueve especies de plantas
medicinales de ese país. Dentro de éstas se mencionaba Callisia grasilis de la
familia Commelinaceae, la cual presentaba actividad antiherpética (Galvis et al.,
1999).
2.3. Rhoeo discolor L. Hér Hance
Planta herbácea de hojas liner-lanceoladas, gruesas, suculentas, jugosas,
acuminadas, sésiles de 20-25 cm de largo con 3.5 cm de ancho, imbricadas, lisas,
de color morado-obscuras en el envés; tallo erecto o reclinado, de 20 cm de
longitud, plano, pero ranurado, con una densa roseta; vaina de 4 cm de ancho;
flores blancas con tres pétalos ovalados de 5-8 mm de largo, densamente
recostado en forma de barquilla, brácteas color púrpura, brotes en medio de la
base de la hojas; semillas rugosas o ásperas de 3 mm de largo y de 1-1.5 mm de
ancho (Martínez, 1979; Brouillard, 1981) (Fig. 4).
9
Figura 4. Maguey morado (Rhoeo discolor L.' Hér Hance).
En la República Mexicana, el género Rhoeo ha sido localizado en los
siguientes estados: Chiapas, Puebla, Tabasco, Yucatán, Quintana Roo y Veracruz
(Del Amo, 1979; Martínez, 1979) (Fig. 5).
Figura 5. Distribución geográfica de Rhoeo discolor L Hér Hance en la República
Mexicana.
10
Clasificación botánica de Rhoeo discolor L' Hér Hance (Cronquist, 1988; Stewart,
1993).
Reino: Plantae
Subreino: Fanerógamas
División: Tracheophyla
Subdivisión: Angiospermophytina
Clase: Monocotiledónea (Liliopsida)
Subclase: Commelinidae
Orden: Commelinidae
Familia: Commelinaceae
Género: Rhoeo
Especie: discolor
2.4. Los flavonoides, cumarinas y quinonas
Los flavonoides son metabolitos secundarios que se encuentran en las
plantas y en algunos insectos, y que les confieren a los organismos vivos una gran
variedad de colores. Estos compuestos están formados por un anillo bencénico
(anillo A), una cadena lactónica que puede estar abierta o cerrada y otro anillo
bencénico (anillo B); tanto el anillo A como el B pueden contener uno o varios
grupos o sustituyentes, preferentemente grupos hidroxilos, metoxilos o cadenas
alifáticas (Ikan, 1969) (Fig. 6).. Esta gran familia de compuestos químicos se
subdivide en subfamilias que presentan cierta variedad en su estructura base, por
ejemplo, flavonas, flavanonas, flavonoles, isoflavonas, catequinas,
leucoantocianinas, antocianinas, auronas y chalconas (Nakanishi, 1975).
11
Figura 6. Estructura básica de un flavonoide.
Actualmente se han reportado 33 diferentes actividades biológicas para
este tipo de compuestos, dentro de las que destacan: actividades antivirales,
antiinflamatorias, antimicrobianas y últimamente, anticancerígenas.
Los flavonoides, al igual que las quinonas -aunque en menor grado estos
últimos- están muy distribuidos en el reino de las plantas en forma de agliconas o
como heterósidos (glicósidos), y se les puede localizar en las flores, frutos, hojas y
cortezas (Rathore y Gupta, 1981).
La presencia de varios grupos hidroxilos en sus estructuras le confieren a
estos compuestos mayor coloración, así también, mayor polaridad, lo que los hace
ser más solubles en disolventes polares como los alcoholes y el agua; por tal
razón, es muy frecuente encontrar en la medicina tradicional la recomendación de
preparar las plantas medicinales en forma de té (Venkataraman, 1955; Harborne,
1975).
La investigación fitoquímica de plantas que contiene este tipo de metabolitos
no se puede realizar aplicando una regla general, ya que debido a la gran variedad
de ellos y por su variable solubilidad, es muy difícil proponer las extracciones con
un determinado disolvente. Por este motivo, es recomendable iniciar el proceso de
investigación a partir de disolventes apolares y proseguir aumentando la polaridad
de los mismos con otros tipos de disolventes, hasta obtener una mejor resolución
en el proceso de aislamiento.
Otra observación importante para el estudio de estos compuestos es
efectuar el experimento utilizando plantas frescas, para así evitar la
descomposición de algunos metabolitos que son muy sensibles a la acción de la
12
luz y del aire, cuando su proceso enzimático ha cambiado.
Los estudios fitoquímicos y farmacológicos enfocados a la acción
terapéutica de las plantas medicinales utilizadas como bactericidas,
antiinflamatorias y anticancerígenas se atribuye a la presencia de metabolitos que
presentan anillos aromáticos y lactónicos, como en las cumarinas, quinonas y
otros derivados. Coincidentemente, las frutas y vegetales que presentan mayor
colorido tienen una mejor acción terapéutica para este tipo de alteraciones en el
organismo.
Por otro lado, el maguey; morado (Rhoeo discolor L. Hér Hance) es una
especie perteneciente a la familia Commelinaceae que se caracteriza por su
contenido de estos metabolitos. Entonces es probable que la acción terapéutica
empíricamente atribuida se deba a la presencia de compuestos de tipo lactónico.
2.5. Flavonoides y quinonas biológicamente activas
La gran mayoría de las plantas utilizadas en medicina tradicional, como
antiinflamatorias contienen compuestos de tipo flavonoides y de tipo quinonas
(Anyanwutaku et al., 1992; Abad, 1993; Chen, 1993; Shoer et al., 1993; Wang,
1994). Es importante hacer notar que esas mismas plantas utilizadas como
antiinflamatorias, tienen aplicación como bactericidas (Jayasuriya, 1989; Hufford,
1993; Sauvain, 1994), es decir, presentan propiedades antimicrobianas y también
una gran utilidad en el tratamiento de úlceras gástricas; inclusive a algunas de
esas especies les atribuyen propiedades anticancerígenas (Lichius, 1994; Khalil,
1994; Jayatilake, 1993).
Un gran número de flavonoides naturales, como quercetina, kaempferol,
naringenina, rutina y glicósido de naringenina son reportados por Roshchin et al.,
(1973) como inhibidores de infecciones y antiinflamatorios. Este grupo de
científicos realizó pruebas de la dosis de compuestos aplicados sobre edemas
inducidos.
Otros investigadores también realizaron estudios con el compuesto
diosmina, el cual presentaba efectividad moderada desinflamatoria en los edemas
13
(Tarayre y Lauressergues, 1975). Es tal la importancia de estos compuestos
químicos, que Kyogoku et al., (1974) aislaron una nueva flavonona de la planta
Sophora angustifolia y patentó dicho compuesto como agente terapéutico en el
tratamiento de úlceras digestivas. Este compuesto fue caracterizado como 2', 4', 7-
trihidroxi-5-metoxi-8-(5hidroxi-5-metil-2-isoprofenilhexil)-flavanona. El mismo grupo
de investigadores, demostró que los compuestos de tipo chalcona (compuestos
derivados de flavonoides) presentan actividad contra úlceras estomacales. Éste
analizó una serie de compuestos de isoprenilchalconas como inhibidoras de
úlceras pépticas.
Otro compuesto de estructura muy relacionada al anterior, la 3, 4', 7-
trihidroxi-3-O-di-D-hexuronato también fue reportado como biológicamente activo
contra las úlceras (Rossler et al., 1974).
En otra investigación realizada con Helichrysum odoratissiumn (Asteraceae) se
encontró que el compuesto 3-O-metilquercetina exhibía importante actividad
antimicrobiana y este resultado comprobaba la acción medicinal de esta planta,
que es muy utilizada en el sureste de África para aliviar dolores abdominales y
contra infecciones de heridas. En este mismo trabajo se publica el aislamiento de
otro compuesto, que corresponde a la 3, 5- dihidroxi-6, 7, 8-trimetoxiflavona, pero
éste no presenta actividad antimicrobiana (Puyvelde et al., 1989).
Nuevamente los flavonoides presentes en algunas plantas son los
causantes de la acción farmacológica, como es el caso de Kalanchoe gracilis
(Crassulaceae) que es un vegetal muy utilizado en Taiwán para el tratamiento de
lesiones de heridas y como antiinflamatoria. De la parte aérea de esta planta se
aislaron nueve flavonoides y una cumarina, dentro de los que se encuentran
quercetina, kaempferol, glucósido de quercetina, glucósido de kaempferol,
glucósido de cianidina, diglucósido de pelargonidina, leucocianidina y kaempferol
cumaroil arabinósido. La presencia de estos metabolitos le confieren a la planta
una marcada acción farmacológica (Chiung et al., 1989).
En la India utilizan la planta medicinal Verbascum thapsus
(Scrophulariaceae) para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y como
antiviral. De esta planta aislaron un nuevo triglicósido de luteolina, determinando
su estructura por espectroscopía. En este trabajo reportaron la identificación del
14
compuesto mencionado que corresponde a un derivado flavonoide, pero no
realizaron estudios de su acción farmacológica (Mehrotra et al., 1989).
Otra planta estudiada fitoquímicamente por sus propiedades
antimicrobianas y citotóxicas es Hypericum drummondii (Hypericaceae), de ésta,
los extractos hexánicos mostraron importante actividad contra las bacterias gram-
positivas: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Mycobacterium smegmatis De
dicha planta se aislaron cuatro nuevos compuestos de tipo Rottlerina
(drummondinas A, B, C y F). Las actividades antimicrobianas de estos
compuestos fueron comparables y aún mayor que la demostrada por la
estreptomicina (Jayasuriya et al., 1989). Es importante hacer notar que esta planta
ha sido utilizada para el tratamiento de tumores.
En la Península Ibérica fabrican un extracto de Prunus spinosa (Rosaceae),
utilizado en medicina tradicional con el nombre de "Pacharan" y recomendado
como agente antihipertensivo, antiespasmódico y antiinflamatorio. El estudio
fitoquímico condujo al aislamiento de heteróxidos de flavonol (quercetina y
kaempferol) y las cumarinas aesculetina, umbelliferona y escopoletina. Estos
metabolitos mostraron propiedades antitóxicas, antiespasmolíticas,
antiinflamatorias y diuréticas (Crespo y Fernández, 1992).
Otra especie de la misma familia, Waldsteinia fragarioides (Rosaceae), fue
estudiada por Abou-Karam et al., (1992) por sus propiedades antivirales y
encontraron que los extractos polares de ésta mostraban un alto nivel de actividad
antiviral, y que el componente activo es glicósido de flavonoide, isoquercitrina (3,
3', 4', 5, 7-pentahidroxiflavona-3-β -O-glucósido). Las leguminosas también
contienen compuestos de tipo preniflavonas que son considerados como
antiinflamatorios, antialergénicos y antihepatotóxicos e inclusive son reconocidos
en la industria farmacéutica. Kajiyama et al., (1992), aisló de las raíces de
Glycyrrhiza inflata (Leguminoceae) dos nuevas preniflavonas -licoflavonas B y C-,
junto con dos flavonas -licoflavona A y 4, 7-dihidroxiflavoná.
De otras especies, como G. uralensis y G. glabra, aislaron el principio dulcificante
glycyrrhizina. Este compuesto es comúnmente utilizado como uno de los
ingredientes en la medicina tradicional China y ha sido considerado como
antiinflamatorio y antialergégico; También se ha empleado para el tratamiento de
15
úlceras gástricas, por lo que se considera de segura eficacia farmacéutica
(Kajiyama et al., 1992).
Se han realizado diferentes estudios fitoquímicos. y farmacéuticos de
plantas que se utilizan en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales o de
úlceras pépticas, y la gran mayoría de los resultados de estos trabajos descubren
la presencia -en dichos vegetales- de compuestos de tipo flavónico o quinónicos;
como por ejemplo, los estudios realizados a Linaria japonica (Scrophulariaceae) -
que es una hierba perenne utilizada como purgativa y diurética- de la cual se
aislaron cinco glicósidos de flavonoides, indican que es muy posible que la acción
terapéutica de este vegetal se deba a estos compuestos (Osuka, 1992).
Varias especies del género Chromolaena (Asteraceae), son utilizadas en la
medicina tradicional de Sudamérica y se ha descubierto que en este género
abundan metabolitos potencialmente activos -principalmente flavonoides y
terpenoidesdentro de los que se encuentran umbelliferona, 5, 7-dihidroxi-8, 4'-
dimetoxiflavona y ácido parametoxibenzoico (Amaro y Delgado-Méndez, 1993).
En otro género de esta misma familia, Tanacetum mícrophyllum
(Asteraceae) se encontraron flavonoides con propiedades antiinflamatorias y
fueron reconocidos como 5, 7, 3'-trihidroxi-3, 6, 4'-trimetoxiflavona (centaureidina)
y 5, 3'-dihidroxi-4'metoxi-7-carbometoxiflavonol. Esta planta es reconocida en
España y utilizada en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del aparato
digestivo (Abad et al., 1993).
De la familia Moraceae también se han aislado compuestos de tipo
prenilflavonas, los cuales ya se habían mencionado anteriormente por sus
propiedades medicinales. Por ejemplo, de Artocarpus altilis se aislaron tres nuevas
prenilfiavonas y se publicaron las estructuras de éstas, pero no se realizaron
estudios de sus propiedades terapéuticas (Chien-Chih et al, 1993).
Los extractos etanólicos de Patalostemum purpureum (Fabaceae)
mostraron actividad antimicrobiana contra las bacterias: Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Trichophyton mentagrophytes, Myobacterium intracellulare,
Crptococcus neoformans y Candida albicans. En este trabajo se reporta el
aislamiento del compuesto denominado petalostemumol como el constituyente
activo (Hufford et al, 1993).
16
Los compuestos afromocina y soiasaponina fueron aislados de Wistaria
brachybotrys y éstos mostraron un remarcado efecto inhibitorio en la formación de
tumores; es por eso que ciertas partes de los tallos de esta planta son utilizados
en la medicina tradicional japonesa para el tratamiento de cáncer gástrico
(Konoshima et al, 1993).
En la búsqueda de nuevos compuestos con acción antitumoral citotóxica de
origen natural, el grupo de Leping Li et al., (1993) encontró ocho compuestos
citotóxicos en el extracto clorofórmico de Amorpha fruticosa (Leguminoceae). La
mayoría de estos compuestos son derivados de rotenoides e isoflavonas entre los
que se encuentran afrormocina, 8-metilretucina, amorfigenina, dalpanol y
tephrosina. Algunos de estos compuestos mostraron propiedad citotóxica
extremadamente potente.
La investigación de los flavonoides se ha extendido también hasta la
búsqueda de agentes antisida, y una de las plantas estudiadas con este propósito
es Chrysantemum morifoliu (Asteraceae). Este grupo de investigadores aisló un
principio activo antiVIH: la acacetina 7-O-β -D-galactopiranósido; además de otros
siete flavonoides relacionados. También encontró que una flavona conocida como
crisina puede ser el compuesto más prometedor para este tipo de actividad. Así
mismo, descubrió que flavonoides con grupos hidroxilos en el carbono 5 y 7 y un
doble enlace en el carbono 2-3 incrementan más la potencia de inhibición del VIH.
También publicó que la presencia de sustituyentes hidroxilos y halógenos en el
anillo B incrementan la toxicidad pero decrece la actividad (Chang-Qi Hu et al,
1994).
En la continua búsqueda de investigaciones químicas de flavonoides
presentes en plantas medicinales se encontró que los extractos alcohólicos de la
especie Ochna afzelii Oliv (Ochnaceae) contenía compuestos flavónicos
(Pegnyemb et al, 1994; 1998). Esta especie es utilizada en África para el
tratamiento de disentería y enfermedades gástricas.
Algunos estudios fitoquímicos recientes realizados a algunas especies de
esta familia demostraron la presencia de compuestos di y tetraflavonoides
(Ghogomu et al., 1989; Tih et al, 1992; Pegnyemb et al, 2001).
Los estudios farmacológicos de los extractos de varias especies del género
17
Reseda, mostraron importantes propiedades antiinflamatorias (susplugas-Taillade
et al., 1993). Una de estas especies, Reseda muricata C. Presa. es muy
recomendada en la medicina tradicional para el tratamiento de hemorroides,
malestares estomacales y diarreas. Por la importancia de esta especie, varios
investigadores han efectuado estudios químicos de sus extractos, encontrando en
ellos compuestos de tipo flavónicos y ácidos fenólicos (Jacquin-Dubreuil, 1972;
Pagana, 1983). En un reciente estudio de esta especie se reportó el aislamiento e
identificación de dos nuevos compuestos flavónicos: el trióxido de Camferol y el
éster para-cumarílico (El-sayed et al, 2001).
Algunos miembros de otras familias de plantas como el género Ferula
distribuidos en Asia central y en el Mediterráneo, son reportados como
medicinales; la resina de Ferula ferulago es ampliamente recomendada para el
tratamiento de enfermedades del aparato digestivo. La química de este género fue
estudiada por varios grupos de investigadores (Murray, 1989; González y Barrera,
1995; Appendino et al., 1997; Ahemed, 1999; Chen et al., 2000;). Recientemente
se reportó que los terpenos cumarínicos de esta planta presentaron actividad anti-
VIH (Zhou et al., 2000), actualmente de esta especie, se demostró la presencia de
dos nuevos compuestos de estructura terpénica cumarínica, designados como
ferulagol A y B (El-Razek et al., 2001).
2.6. Cumarinas biológicamente activas
Esta clase de compuestos se encuentran en las frutas y en algunos
vegetales y en contraste con otras categorías de metabolitos presentan mínima
citotoxicidad o propiedades indeseables.
En la literatura química se encuentran los resultados de las investigaciones
químicas realizadas a estos metabolitos. Los primeros reportes que se tiene son
de los efectos de la cumarina, 4-metilcumarina y otros derivados sobre inhibición
de tumores mamarios en ratas (Feuer et al, 1974; 1976).
Hasta hace algunos años, se demostró que las propiedades de inhibición
de estos compuestos se debía a la habilidad para inhibir el desarrollo de ciertas
18
enzimas como trans-criptasa (Nakane, 1990) o a la relación proteína-ti ros¡naqui
nasa (Geahien et al., 1989). Los estudios de las propiedades anticancerígenas
(citotóxicas) y actividades químíopreventivas han sido realizadas por Cassady et
al., (1990).
Los estudios fitoquímicos realizados actualmente en plantas medicinales,
preferentemente en aquellas que son utilizadas como antiinflamatorios y
anticancerígenos, llevan a comprobar que estas especies contienen compuestos
flavónicos y/o cumarínicos (Hirano et al., 1994).
Algunos trabajos de investigación química se han implementado con el
propósito de descubrir la relación que tiene la actividad química con la estructura
de estos compuestos (Kaul et al., 1985). Los efectos antivirales, antiinflamatorios,
anticarcinogénícos, así como, las propiedades antioxidantes han sido realizadas in
vitro en animales y humanos: Diferentes grupos de investigadores han abordado
estos estudios, por ejemplo: Cody et al., (1986); Cody et al.,(1988); Das, (1989);
Middleton, (1994). El valor medicinal de dichos compuestos es muy amplio, de tal
manera, que también se ha encontrado que el uso de compuestos flavónicos en la
alimentación reduce el riesgo de enfermedades coronarias hasta en 68 por ciento
(Hertog et al., 1993).
Aunque el mecanismo de acción de estos compuestos anticarcinogénicos
no se conocen con exactitud, sí se ha atribuido a diferentes procesos como
alteraciones enzimáticas (Nair et al., 1991).
La actividad biológica de las cumarinas como anticarcinogénica se debe a
la posición del grupo carbonilo y conjugación con el doble enlace en el anillo
lactónico, desarrollando así un dipolo que ayuda a la orientación y acoplamiento
de la molécula en un ambiente biológico apropiado (Nair et al., 1991).
Se ha demostrado que la presencia de un grupo metilo en el anillo
cumarínico tiene un efecto en la actividad biológica, así por ejemplo, el grupo
metilo en el carbono número tres provoca un cambio en la carga parcial negativa
en el átomo de oxígeno del carbonilo y si este grupo metilo se localiza en la
posición cuatro podría reducir la carga y por lo tanto reducir la fuerza de la
actividad biológica (Nair et al., 1991).
La relación tan notoria de los grupos carbonilos y los dobles enlaces
19
conjugados en los compuestos cumarínicos y flavónicos, con respecto de la
actividad anticancerígena y antioxidante, ha motivado a otros investigadores para
proseguir con la investigación química de estos compuestos; un ejemplo claro de
estos estudios es el realizado a la quercetina, que es un ..flavonoide presente en
muchas plantas comestibles, por medio del cual, científicos demostraron la acción
mutagénica del compuesto y la acción antimutagénica del mismo (Malavielle et al.,
1996).
Actualmente, se está experimentando el efecto anticarcinogénesis del
mencionado compuesto en cáncer cervicouterino de ratones y los resultados son
altamente satisfactorios (Sarmishtha et al., 2000). El efecto anticarcinogénico de
este compuesto es atribuido a sus propiedades antioxidantes. No existe alguna
duda de que los compuestos químicos que presentan en su estructura grupos
lactónicos conjugados (flavonoides, cumarinas y quinonas) tienen gran capacidad
antioxidante y que son metabolitos atrapadores de radicales libres. Muchas de las
plantas utilizadas desde la antigüedad como medicinales deben su acción
terapéutica, precisamente, a la presencia de estos compuestos, tal es el caso de
Ginkgo biloba L. (Ginkgoceae) que ha sido utilizada por años en la medicina
tradicional China. El extracto alcohólico de esta especie presentó importantes
propiedades antioxidantes y de él se lograron aislar una gran cantidad de
compuestos de tipo flavonol y cumarínico (Tang et al., 2001).
Otra planta también muy importante que posee una gran reputación en
medicina tradicional iraní y de Afganistán, la Ferula assa-foetida (Umbelliferae) -
recomendada como carminativa, diurética y antiespasmódica- contiene
compuestos cumarínicos (El-Razek et al, 2001).
Los estudios químicos realizados a Eriocaulon buergerianum
(Eriocaulaceae), utilizada en Taiwán como antiinflamatoria, comprobaron la
presencia de metabolitos de tipo flavonoide, incluyendo patuletina,
quercetagenina, y compuestos de estructura flavanestructura flavan (Ho y Chen,
2002).
En México están realizando investigaciones con flavonoides y cumarinas in
vitro para comprobar la citotóxicidad y propiedades anticancerígenas. Este grupo
realizó el estudio del efecto de cinco flavonoides naturales y concluyó que los
20
mecanismos anticarcinogénicos podrían deberse a la incorporación de timidina y
que éste puede suprimir la síntesis de ADN (Sánchez et al., 2001). Diversas
investigaciones anteriores mostraron que los flavonoides o cumarinas inhiben las
células de tumores por un mecanismo de glicólisis aeróbico, bloqueando la
membrana de Na+ y K+ -ATPasa (Suolina et al., 1975; Belt et al., 1979).
Los investigadores Chang y Geahlen (1992) han realizado un trabajo muy
completo sobre el mecanismo de acción de los agentes químicos antitumorales,
descubriendo que esta acción anticancerígena es debido a la inhibición de la
proteína -ti rosinaqui nasa, ocasionado por aquellos compuestos o metabolitos que
presentan funciones lactónicas o carbonílicas, como es el caso de los flavonoides
cumarinas y quinonas.
Por otra parte, los estudios realizados por Patrin Laurin a dos series de
cumarinas sustituidas demuestran la inhibición del ADN girasa y por lo mismo su
potente acción antibacteriana en este trabajo. Estos investigadores presentan los
resultados de inhibición para Escherichia coli causada por los compuestos
novobiocina, clorobiocina y aminocumarinas, y concluyeron que. las cumarinas
muestran características de antibiótico y preservan la inhibición de ADN girasa y
sus propiedades antibacteriales (Laurin et al., 1999).
Actualmente se conoce que los radicales libres están muy relacionados con
la carcinogénesis y el estrés oxidativo, y que son un factor primario para varias
enfermedades degenerativas del sistema nervioso central. Los compuestos
antioxidantes naturales como los flavonoides, cumarinas, quinonas y carotenoides
inhiben los mecanismos de iniciación y propagación de las reacciones oxidativas
(Shahidi, 1996; Velioglu et al., 1998). Estos compuestos antioxidantes naturales
son muy efectivos en la protección del organismo en los efectos biológicos
negativos como la mutagénisis, carcinogénesis y envejecimiento de células (Cook
y Samman, 1996).
Varios grupos de investigadores se han dedicado al estudio químico de las
sustancias antioxidantes presentes en las plantas medicinales (Oomah y Mazza,
1994; Al-Saikhan et al., 1995; Yen y Duh, 1995; Cao et al, 1996; Wang et al.,
1996).
Recientemente se reportó la presencia de antioxidantes naturales en las
21
hojas de. las espinacas (Spinacia oleracea) y se describió la actividad biológica de
sus extractos (Lomnitski et al., 2000 a; b; c). La investigación fitoquímica realizada
a los extractos acuosos de esta planta comprobó la existencia de varios
compuestos antioxidantes de estructura flavónica (Bergman et al., 2001).
2.7. Estudios microbiológicos
Desde hace miles de años se ha tratado a los enfermos por medio de
hierbas, cortezas y otros brebajes. Hubo poca sistematización en la práctica
médica hasta los experimentos de Paul Erhlinch en 1909, que permitieron la
creación de un agente quimioterápico que destruyese selectivamente espiroquetas
sin dañar en forma importante las células del huésped. Esta "bala mágica" recibió
varios nombres: asfernamina, salvarsán y 606, y se utilizó durantes años en el
tratamiento fructífero de la sífilis (Lain et al., 1974; Murray et al., 1995).
Desde 1953 pudo contarse con otros agentes quimioterápicos. La mayor
parte de ellos fueron sintetizados originalmente después de búsquedas extensas e
incansables entre los productos secundarios del metabolismo producidos por
plantas, bacterias y hongos. Se ha aislado un número impresionante de estos
antibióticos y se ha definido su acción en muy diversos tipos celulares.
Los primeros ensayos para cuantificar la potencia antibacteriana de una
sustancia fueron realizados por Fleming en 1924, al evaluar el efecto de diferentes
antisépticos, y en 1929 estableció el principio de la prueba de susceptibilidad por
difusión en agar, al depositar el agente antibacteriano en un orificio cilíndrico
hecho en el agar y midiendo su potencia según el diámetro del halo de inhibición
del .crecimiento del organismo (Lairi et al., 1974).
Los estudios de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales fueron
realizados por algunos investigadores, quienes va loraron la acción bactericida de
éstos (Lorente et al., 1989). La familia Bignonaceae (Trumpet Creeper) es
conocida químicamante por sus propiedades antimicrobianas, antiprotozoarias y
antiinflamatorias (Binutu et al., 1996). La citoxicidad de estas especies fue
22
valorada tomando en cuenta que las naftoquinonas y antraquinonas han sido
reportadas como sustancias con fuertes propiedades de inhibición en la
proliferación de carcinogénesis (Rao y Kingston, 1982). Los metabolitos de tipo
quinónico encontrados en esta familia han sido objeto de númerosos estudios
fitoquímicos antiplasmódica con los compuestos antes mencionados (Onegi et al.,
2002).
Recientemente, se ha estudiado una especie de geranio que es conocida
en medicina tradicional de Turquía como "turnagagasi". Esta planta es utilizada
como antidiarréica, hemostática, estomática y antidiabética. De esta especie
Geraniuir pratense (Woronow) se aislaron glucopiranósido de canferol y 3-O-β -D-
glucopiranósido de canferol, estos compuestos flavónicos son efectivos en el
organismo de eliminación de radicales libres formados en el organismo (Akdemir
et al., 2001).
En el Colegio de Farmacia de la Universidad de Illinois, en Chicago, se
están estudiando plantas con propiedades antimicrobianas y se ha demostrado
que el extracto alcohólico de la corteza de Afzelia bella (Harms) contiene
glicósidos derivados de hidroflavonoles, y que además dicho extracto exhibe
potentes propiedades antimicrobianas sobre bacterias gram positivo y gram
negativo (Binutu et al., 1998; 2001).
Asimismo, en la búsqueda de metabolitos antiinflamatorios se encontró que
las hojas de la planta Arrabidaea chica (Bonpl.) B. Verl. (sin. Bignonia chica
(Bonpl)) son utilizadas como remedios de cólicos intestinales, anemia y leucemia
en la medicina tradicional de América Central. Del extracto de las hojas de esta
planta se aislaron tres compuestos flavónicos y uno de estructura
desoxiantocianina que son los responsables de la acción antiinflamatoria (Zorn et
al., 2001).
En Indonesia, los frutos de Helicteres isora L. (Sterculiaceae) son muy
recomendados para el tratamiento de gastroespasmos y las raíces de esta misma
planta son utilizados en China y Australia para el tratamiento de úlceras gástricas
y nefritis crónica (Romesh y Yuvarajan, 1995). El estudio fitoquímico de esta
planta reporta la presencia en sus extractos de cinco flavonoides, tres de ellos de
estructura nueva (Kamiya et al., 2001).
23
La actividad antimicrobiana fue precisa en términos de las zonas inhibitorias
aparentemente alrededor de los discos de papel filtro. Bauer et al., (1966) publicó
los criterios unificadores de la prueba por difusión en agar o antibiograma y
posteriormente otros expertos han establecido las normas de las diversas técnicas
usadas en la determinación de: la susceptibilidad que les han dado mayor
precisión y reproductibilidad (Barry et al., 1970; Ericsson et al., 1971; Barry et al.,
1973).
Actualmente, la investigación fitoquímica enfocada al descubrimiento de
nuevos metabolitos con propiedades antimicrobianas y antiinflamatorios ha tenido
gran desarrollo y los resultados de todos estos trabajos comprueban la existencia
de compuestos de tipo flavónico, cumarínico y quinónicos que presentan
importantes actividades biológicas (Rimando et al., 1994; Fuendjiep et al., 2002;
Arman y Gray, 2002; Nkengfack et al., 2002; Tada et al., 2002).
2.8. Microorganismos patógenos utilizados en las pruebas antimicrobianas
2.8.1. Familia Enterobacteriaceae
Las enterobacterias constituyen uno de los grupos bacterianos más
importantes, ya que incluye una gran variedad de géneros asociados con el
humano; algunos forman parte de la biota normal, mientras que otros tienen un
papel patógeno ampliamente reconocido como Escherichia sp., Shigella sp., y
Salmonella sp. Los miembros de esta familia causan principalmente infecciones en
los aparatos gastrointestinal y urinario (Anexo 1); sin embargo, a partir de la era de
los antibióticos, de la quimioterapia moderna y de las medidas inmunosupresoras
se ha observado que pueden aislarse de infecciones de cualquier sitio anatómico.
La taxonomía de la familia Enterobacteriaceae es compleja y está
cambiando con rapidez conforme se efectúan estudios de homología del DNA; por
ello, constantemente presenta una nueva clasificación y lo que hoy se afirma
24
mañana puede modificarse para reinstalar un grupo en su antiguo lugar o
cambiarlo.
La clasificación de las enterobacterias se basa inicialmente en la
determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el
material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas involucradas en el
metabolismo bacteriano pueden ser evidenciadas en medios especiales usando
técnicas de cultivo in vitro en las que el sustrato se incorpora junto con un sistema
indicador, que pone de manifiesto su degradación en presencia de un metabolito
específico.
Existen diferentes clasificaciones de la familia Enterobacteriaceae, todas
basadas en los mismos principios básicos. La de Edwards y Ewing consiste en un
sistema de clasificación en tribus que se apoya en resultados de pruebas
bioquímicas (Edwards y Ewing, 1972). Otro es el sistema propuesto en el Manual
de Bacteriología Sistemática de Bergey (1984), que no maneja tribus y agrupa los
géneros con base en el por ciento de similitud en el DNA; esta técnica no es
empleada debido a que es poco práctica. Farmer, en 1985, integró ambos criterios
y los ajustó a una nueva propuesta (Jawet, 1992; Koneman, 1990).
2.8.2. El género Escherichia
Escherichia coli es el microorganismo más importante del género. Se le
puede encontrar como parte de la flora intestinal normal, aunque se le considera
un agente patógeno oportunista, esto es, cuando llega a los tejidos fuera del tubo
intestinal, en particular las vías urinarias, las biliares, los pulmones, el peritoneo,
las meninges y en heridas, produciendo inflamación en estos sitios. Ciertas cepas
de E. coli pueden causar enteritis o gastroenteritis por cuatro mecanismos
diferentes, que dan como resultado cuatro síndromes clínicos distintos.
Las cepas enterotoxigénicas forman enterotoxinas termolábiles y/o
termoestables que producen una diarrea secretora ("diarrea del viajero"); la
adherencia de las células bacterianas al epitelio intestinal es un requisito
25
para la producción de toxinas.. Esta última está medida por plásmidos y con mayor
frecuencia involucra a los serogrupos 06, 015, 0124, 0136, 0143, 0145 y 0147 de
Escherichia coli.
Las cepas enteropatogénicas causan síndromes diarreicos, sobre todo en
niños. La patogenia no está clara; sin embargo, las reacciones inflamatorias y los
cambios degenerativos epiteliales que se observan en los cortes de tejidos pueden
ser secundarios a propiedades adherentes de la bacteria, que se creen
relacionadas con plásmidos. Más habitualmente están involucrados los serogrupos
06, 08, 025, 0111, 0119 y 0142 (Krieg, 1984).
Las cepas enteroinvasivas son capaces de entrar en las células epiteliales
intestinales y producir una diarrea inflamatoria similar a la causada por especies
de Shigella. Estas cepas pueden sospecharse cuando se observa sangre, moco y
neutrófilos segmentados en frotis fecales. Más a menudo se trata de los
serogrupos 028, 0112, 0115, 0124, 0136, 0143, 0145 y 0147.
La colitis hemorrágica es un síndrome reconocido hace poco,
probablemente secundario a daño de células endoteliales vasculares, lo que
produce una diarrea hemorrágica en humanos. El cuadro diarréico se presenta
con deposiciones acuosas con un rango de leves hasta profusas y sanguinolentas,
sin leucocitos en las heces, lo cual establece la diferencia con la shigelosis y la
disenteria por Escherichia coli enteroinvasiva.
Se han demostrado efectos de citotoxinas en células Vero y Hela similares a
los producidos por la toxina de Shigella dysenteriae. El seroptipo principal es
0157:H7, aunque intervienen otros como 026:H11, 0111:H8 y 0104:H21.
La Escherichia coli también es uno de los microorganismos comunes
involucrados en sepsis por gram negativos y shock inducido por endotoxinas. Las
infecciones urinarias y de heridas, la neumonía en pacientes inmunosuprimidos
hospitalizados y la meningitis en neonatos son otras infecciones comunes
causadas por E. coli.
Es un bacilo corto gram negativo móvil, se le puede aislar de secreciones de
heridas, de la orina y el excremento. Produce de manera típica pruebas positivas
al rojo de metilo y el indol además de descarboxilación de lisina y fermentación de
manitol al igual que gas a partir de la glucosa, acidificación del medio KIA ó TSI y
26
negativamente a las pruebas de Vogues Proskauer, Citrato Simmons, ácido
sulfúrico, ureasa y fenilalanina.
En medios de cultivo de 24 h a 37°C produce hemólisis alfa en agar
sangre, observándose colonias grandes redondas planas de color grisáceas de
aspecto poco mucoide (no viscosas). En medio de EMB (eosina azul de metileno),
son fermentadoras de lactosa con colonias grandes redondas lisas, de aspecto
verdosas con brillo metálico a la luz reflejada y con el centro negroazulado a la luz
transmitida. En el medio de XLD (xilosa, lisina, desoxicolato), E coli degrada la
xilosa, lactosa y sacarosa con producción de ácido en donde las colonias son
amarillas y opacas con un halo de precipitación de color claro alrededor de las
colonias. Para el medio de Mac Conkey hay fermentación de lactosa positiva, con
colonias grandes de color rosadas a rojas, no son mucoides, y pueden rodearse
de un halo de precipitación opaco debido al descenso del pH, provocado por las
sales biliares presentes en el medio. En el caso del medio de S S (Sal monella -
Shigella).hay fermentación de lactosa con desarrollo de colonias pequeñas que
van del color rosa al rojo, en el medio Verde Brillante las bacterias fermentan la
lactosa y desarrollan colonias de color amarillas opacas rodeadas de un halo
amarillento después de 24 h de incubación a 37°C (Koneman et al., 1999).
La E. blattae, recuperada del tubo digestivo de cucarachas, es indol-
negativa y no fermenta lactosa. No se ha asociado con infecciones en humanos.
Escherichia vulneris, E. hermannil y E. fergusoni recientemente han recibido
designaciones de especie dentro del género Escherichia. E. vulneris tiene una alta
propensión a causar infecciones en heridas humanas, en particular en brazos y
piernas. No produce indol a partir de triptófano y carece de actividad de ornitina
decaboxilasa.
Si bien se ha aislado E. hermanni de heridas y muestras del aparato
respiratorio humanas, y con menos frecuencia de muestras de heces, sangre y
líquido cefalorraquídeo, no se piensa que cause infecciones. Desde un punto de
vista bioquímico, es similar a E. coli, excepto porque produce un pigmento
amarillo.
La Escherichia fergusonii se ha recuperado de sangre, materia fecal y orina;
sin embargo, no se ha establecido su significado clínico (Jawetz, 1992; Koneman,
27
1990).
2.8.3. El género Shigella
El ser humano es el reservorio natural del género, específicamente las vías
intestinales, hay cuatro especies de importancia clínica: Shigella dysenteriae, S.
fiexneri, S. boydii, y S. sonnei, dicha clasificación se basa en las diferentes
reacciones serológicas y bioquímicas en donde la principal enfermedad que
ocasionan es la disentería bacilar, la severidad de la enfermedad que produce
difieren para cada especie. Filogenéticamente, el género está estrechamente
relacionado con E. coli, sin embargo es mucho menos activo.
Shigeiia es un bacilo Gram negativo delgado, inmóvil, no esporulado. En
cultivos jóvenes pueden presentarse formas cocobacilares. Son microorganismos
anaerobios facultativos, pero crecen mejor en aerobiosis. Forman colonias
redondas, convexas, transparentes, de bordes enteros, que alcanzan un diámetro
de cerca de 2 mm en 24 h. Pueden reconocerse generalmente en los medios
diferenciales por su incapacidad para fermentar la lactosa, permaneciendo por lo
tanto incoloras, mientras que las colonias de los fermentadores de la lactosa
forman colonias cromógenas.
Todas las Shigellas fermentan la glucosa pero no la lactosa, lo que las
distingue de otras enterobacterias; forman ácido a partir de los carbohidratos, pero
rara vez producen gas de sustancias fermentables, no utilizan el citrato como
fuente de carbono. Solamente Shigella sonnei descarboxila la ornitina y Shigella
dysenteriae es la única que no fermenta manitol y no produce lisina
descarboxilasa (Prescott et al, 2000).
Se puede aislar a partir de muestras infectadas de excremento (con sangre
y moco), hisopos rectales ó hisopados de úlceras, en los frotis se observan
leucocitos fecales y eritrocitos la mayoría de las veces. En los medios de cultivo de
EMB y Mac Conkey (medios diferenciales), las colonias son incoloras debido a la
falta de fermentación de lactosa, lo mismo sucede en los medios de S.S., XLD y
verde brillante, sólo que las colonias que desarrollan son de color rosa pálido
transparentes y rodeadas de un halo rojo brillante.
El hábitat natural de los bacilos de la disentería es el intestino grueso del
28
hombre, donde pueden causar disentería bacilar. Las infecciones por Shigella
prácticamente están siempre limitadas al sistema digestivo; la invasión al torrente
circulatorio es muy rara. Las Shigellas son muy contagiosas: la dosis infectiva es
de menos de 200 microorganismos (en tanto que para las Salmonellas es de 105 a
108 microorganismos) (Jawetz, 1992; Koneman, 1990).
2.8.4. El género Salmonella
La clasificación de las Salmonellas es compleja y ha sufrido algunos
cambios. Hasta 1983 se consideraban tres especies primarias o principales:
Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis y Salmonella enteritidis, que agrupaba
a más de 1500 serotipos. Erwing (1986) propuso una nueva nomenclatura con
seis grupos fenotípicos dentro de una sola tribu Salmonellae, apoyada en pruebas
bioquímicas, esta nomenclatura genéticamente es válida; sin embargo, es posible
que la taxonomía resulte extraña para muchos microbiólogos y médicos. Sobre la
base de aplicaciones clínicas, se prefiere usar la taxonomía sugerida en la edición
de 1984 del Bergey 's Manual (Davis, 1996).
Es posible diferenciar cuatro tipos clínicos de infección con Salmonellas:
1).- Gastroenteritis. La manifestación más frecuente, que varía de una diarrea leve
a fulminante acompañada por fiebre de bajo grado y grados variables de naúseas
y vómitos.
2).- Fiebre tifoidea o fiebre entérica. Potencialmente causada por cualquier cepa
de Salmonella sp, que por lo general se manifiesta con fiebre leve y diarrea,
excepto los casos clásicos de fiebre tifoidea (Salmonella typhi), en los que la
enfermedad progresa a través de un período temprano de fiebre y constipación.
3).- Septicemia. Seguida por infecciones localizadas que son producidas por
cualquiera de los muchos serotipos de las otras Salmonellas
4).- Un portador con una infección previa, en especial por Salmonella typhi,
pueden continuar eliminando el microorganismo en sus heces hasta un año
después de la remisión de los síntomas.
Las Salmonellas son bacilos gram negativos, no esporulados, de longitud
variable. La mayoría de las especies son móviles merced a flagelos perítricos.
Crecen fácilmente en los medios de cultivo ordinarios pero no fermentan la lactosa
29
o sucrosa. A partir de la glucosa y la manosa, producen ácidos y en ocasiones
gas. Tienden a producir H2S en agar TSI o en agar de Kliger, da positiva la prueba
de rojo de metilo y negativa la de Vogues Proskauer; no produce indol. Es
catalasa positivo y oxidasa negativo y reduce los nitratos a nitritos. En el medio de
EMB y Mac Conkey, las colonias que desarrollan son no fermentadoras de
lactosa, incoloras, transparentes, observándose del mismo color que el medio de
cultivo; lo mismo sucede en los medios de S.S. y XLD, y en el caso del medio
verde brillante dichos microorganismos desarrollan colonias de color rosa pálido,
transparentes y rodeadas de un halo rojo brillante.
Sobreviven en forma libre en agua durante largos períodos. Las
Salmonellas son resistentes a la congelación en agua y a ciertos agentes
químicos, por ejemplo, el verdee brillante, el tetrationato sódico y el deoxicolato
sódico; tales compuestos inhiben a los bacilos coliformes y son, por lo tanto, útiles
para el aislamiento de Salmonellas a partir de heces.
Salmonella typhi y quizás Salmonella paratyphi A y Salmonella schottmülleri
(inicialmente llamada Salmonella paratyphi B) son las más infecciosas para el
humano y la contaminación con estos, microorganismos implica el contagio de una
fuente humana. Sin embargo, la gran mayoría de las Salmonellas son
particularmente patógenas en animales que constituyen el reservorio para la
infección en humanos. Entre los animales implicados están aves de corral, cerdos,
roedores, ganado, mascotas (desde tortugas hasta loros) y muchos otros. Los
microorganismos casi siempre penetran por la vía bucal, por lo general con
alimentos y bebidas contaminados. La dosis infecciosa media es de 105 a 108
microorganismos para producir manifestaciones de infección clínica (Jawetz, 1992;
Koneman, 1990).
30
2.9. Crecimiento, supervivencia y muerte de los microorganismos
La multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento; en
microorganismos unicelulares, la multiplicación conduce a un aumento en el
número de individuos, dando lugar a una población o cultivo.
El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración
celular (número de células viables por unidad de volumen de cultivo) o de
concentración de la biomasa (peso seco de las células por unidad de volumen de
cultivo). Estos dos parámetros no siempre son equivalentes, debido a que el
promedio de peso seco de la célula varía en las distintas etapas de la historia del
cultivo. Ni tampoco tiene la misma importancia en estudios de genética microbiana
o de inactivación de las células, la cantidad importante es la concentración celular
en estudios de bioquímica o nutrición microbiana, así como la de la concentración
de la biomasa (Bernar et al., 1973).
A. Concentración celular: el número de células viables se considera como una
medida de la concentración celular. Sin embargo, para muchas finalidades es
la turbiedad del cultivo -medida de manera fotoeléctrica- que se relaciona con
la cuenta viable en forma de curva estándar. Cuando se emplean mediciones
turbidimétricas, debe recordarse que puede variar la correlación entre
turbiedad y cuenta viable durante el crecimiento y la muerte de un cultivo: las
células pueden perder viabilidad sin que ocurra pérdida de la turbiedad del
cultivo.
B. Densidad de la biomasa: en la práctica, el investigador suele preparar una
curva estándar que establece una correlación entre el peso seco y la turbiedad.
De manera alternativa, se puede estimar la concentración de la biomasa de
manera indirecta mediante medición de un componente celular importante
como las proteínas, o el volumen ocupado por las células que han
sedimentado de la suspensión.
31
2.9.1. Crecimiento exponencial
Constante de crecimiento
La fase exponencial del crecimiento bacteriano es proporcional a la
cantidad de sustancia presente en un tiempo determinado:
dB / dt = a B ... (1)
Donde B es masa bacteriana, t es igual al tiempo y a es la constante de
crecimiento para cada cultivo.
De aquí que : dB / a dt ( o d In B = a dt ). . . (2)
Integrando la ecuación tenemos:
Bt = Bo eat .. (3)
y In Be/B0 = at, ó i Bt = InBo t at . . . (4)
Donde una gráfica de logaritmos de B contra el tiempo da una línea recta. Esta
gráfica semilogarítmica es generalmente usada para las curvas de crecimiento
bacteriano. La masa bacteriana se incrementa exponencialmente con el tiempo
ecuación 3 (Schaechter et al., 1994).
2.9.2. Curva de crecimiento
Si se inocula un medio líquido con células microbianas, tomadas de un
cultivo que previamente ha crecido hasta la saturación, en el cual periódicamente
se ha determinado el número de células viables -por mililitro- y trazado una gráfica
de él, generalmente se obtiene una curva del tipo que se muestra en la Fig. 3 con
las fases que indican en el Cuadro 2.
32
Cuadro 2. Fases de la curva de crecimiento microbiano
Selección de la curva
Fase
Velocidad de crecimiento
I Rezago Cero II Aceleración Creciente III Exponencial Constante IV De retardo Decreciente V Estacionaria máxima Cero VI Declinación Negativa (muerte)
Figura 7. Gráfica del crecimiento bacteriano (Koneman et al., 1999).
Fase de rezago (A)
Representa un periodo durante el cual las células empobrecidas en
metabolitos y enzimas, como resultado de, las condiciones desfavorables
producidas al final del cultivo previo, se adaptan a su nuevo ambiente. Se forman
enzimas y metabolitos intermediarios que se acumulan hasta alcanzar
concentraciones que permiten que el crecimiento se reinicie.
Si las células se toman de un medio enteramente diferente, ocurre que son
genéticamente incapaces de crecer en el nuevo medio. Puede ocurrir una fase de
rezago, que representa el periodo necesario para que unas cuantas mutantes del
33
inóculo se multipliquen suficientemente y se manifieste un aumento en el número
de células.
Fase exponencial (C)
Durante la fase exponencial -de la cual ya se han descrito los aspectos
matemáticos-, las células se encuentran en una fase sostenida. Se sintetiza nuevo
material celular a velocidad constante, pero éste es en sí catalítico y la masa
aumenta en forma exponencial. Esto continúa hasta que sucede una de dos
cosas: que uno o más nutrimentos del medio se agoten, o que se acumulen
productos tóxicos e inhiban el crecimiento. Para los microorganismos aerobios, el
nutrimiento que se vuelve limitante es generalmente el oxígeno: cuando la
concentración celular pasa de aproximadamente 1x107 por ml (en el caso de las
bacterias), la velocidad de crecimiento decrece. Cuando la concentración
bacteriana alcanza 4 a 5 x 109 /ml, la velocidad de difusión del oxígeno no puede
satisfacer las demandas aun en un medio aireado, y el crecimiento disminuye
progresivamente.
Fase estacionaria máxima (E)
Finalmente, el agotamiento de los nutrimentos o la acumulación de
productos tóxicos hace que el crecimiento cese por completo. Hay una pérdida
lenta de células por muerte, lo cual es compensado exactamente por la formación
de nuevas células, a través de crecimiento y división. Cuando este fenómeno se
presenta, el número total de células aumenta lentamente, aunque la cuenta de
células viables permanece constante.
Fase de declinación (fase de muerte, F)
La velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.
Frecuentemente, después de que la mayoría de las células han muerto, la
velocidad de mortalidad disminuye en forma drástica, de tal manera que un
pequeño número de sobrevivientes pueden persistir en el cultivo por meses o aun
años. En algunos casos, esta persistencia puede indicar recambio celular,
creciendo unas cuantas células que mueren y se lisan (Konernan et al., 1999).
34
2.10. Aplicación de los agentes quimioterapéuticos
La actividad antimicrobiana de los quimioterapéuticos se valoran por
pruebas de inhibición de crecimiento. La sensibilidad relativa de diversas cepas y
tipos de microorganismos se determina empleando concentraciones estándar de
estas substancias.
Valoración de actividad. Los métodos de valoración son de dos tipos generales: el
método del tubo y el método del disco. En el primero se preparan diluciones
seriadas de la substancia en un medio de cultivo líquido estándar; y los tubos (o
frascos) con medio de cultivo se siembran con un número constante de bacteria,
se incuban y se examinan buscando el crecimiento. Se mide la actividad por la
menor cantidad de la substancia activa que impide el crecimiento en las
condiciones especificadas. Cuando procede efectuar un número elevado de
pruebas -como en la valoración sistemática de sensibilidad bacterianas-, este
método consume mucho tiempo.
El llamado "método del disco" se basa en la observación original de una
zona de crecimiento inhibido rodeando una colonia de microorganismos,
productores de antibióticos, que están creciendo en forma continua en la superficie
de un medio de agar. El primer método creado consiste en colocar verticalmente
pequeños cilindros esterilizados de cerámica o de vidrio sobre la superficie del
medio con agar inoculado uniformemente, y poniendo con pipetas en cada uno de
ellos diluciones seriadas de la substancia problema. La actividad difunde hacia
afuera y produce una zona de inhibición de crecimiento. La actividad de la
preparación puede determinarse comparándola con la zona de inhibición de
crecimiento producida por una solución estándar. En una caja petri usual pueden
disponerse seis cilindros sin que se superpongan las zonas de inhibición.
Los discos se colocan sobre la superficie del medio de cultivo, en agar
uniformemente inoculado, con la bacteria de prueba. Hay diversas variedades de
este esquema, incluyendo las piezas de papel de filtro en forma de cresta de gallo
que tienen las proyecciones impregnadas con diferentes substancias; las piezas
circulares con proyecciones impregnadas hacia el centro, etcétera. En todo caso,
suelen utilizarse dos concentraciones de las substancias antibacteria nas, "alta" y
"baja". La concentración "alta" se intenta que se aproxime a las concentraciones
35
sanguíneas máximas que pueden alcanzarse de la substancia.
El principal factor que rige el empleo de los antimicrobianos es el
surgimiento de microorganismos resistentes y el hecho de que estén tan
diseminados, que prácticamente para todos los microbios es necesario realizar
estudios de susceptibilidad a dichos productos antes de elegir racionalmente un
agente quimiotepéutico.
36
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Recolección y preparación de la materia prima
Las muestras de maguey morado (Rhoeo discolor L Hér Hace) fueron
colectadas de un predio ubicado a un costado de la carretera Veracruz-Boca del
Río - Km 3 por la zona de "La Boticaria"- a una altitud 10 m sobre el nivel del mar.
El tipo de suelo era areno-arcilloso; donde se localizó en un remanente de selva
baja caducifolia, clima tropical-cálido. Las plantas fueron separadas en tallo y
hojas y cortadas finamente para el proceso de extracción con disolventes.
3.2. Material para estudios microbiológicos
Para los estudios microbiológicos se utilizó el espectrofotómetro Spectronic
20, un lector de microplacas Spectramax 190 y un leofilizador Labconco Frezone
4.5, así como los medios de cultivo: Caldo nutritivo, agar nutritivo, agar McConkey,
agar Hektoen y agar Mueller Hinton:
3.3. Metodología para los estudios microbiológicos
La parte aérea (tallos y hojas) de Rhoeo discolor se cortó finamente,
posteriormente se depositó en matraces Erlenmeyer de 4 litros, previamente
forrados con papel oscuro para impedir el paso de luz, esto con la finalidad de
evitar el proceso de descomposición de los metabolitos. El material vegetal fue
utilizado en verde, es decir, no se sometió a proceso de secado.
Los 2200 g de muestra se dividió en tres porciones. La primera porción de
hoja -1400 g- se extrajo por maceración utilizando hexano y posteriormente
cloroformo como disolvente. La segunda porción -400 g- se procesó de la misma
manera, pero únicamente con etanol. El resto del material vegetal -400 g- se
extrajo también por maceración utilizando agua destilada (Fig. 8).
37
Figura 8. Proceso de extracción de metabolitos de las hojas de Rhoeo discolor L.
Hér Hance.
Como se puede observar, en los diagramas de extracción no se indica la
cantidad de extractos obtenidos, debido a que el proceso no se realizó hasta
agotamiento total de metabolitos. De la misma forma, 1200 g de tallo fresco se
dividieron en dos porciones. La primera, de 700 g, se extrajo por maceración con
hexano y posteriormente acetato de etilo. Por otro lado, otra porción, de 500 g, se
extrajo con agua destilada (Fig. 9).
Figura 9. Proceso de extracción de metabolitos del tallo de Rhoeo discolor L. Hér Hance.
38
Todos los extractos con sus respectivos disolventes se filtraron y
concentraron a temperatura controlada, dependiendo del disolventes utilizado y a
presión reducida, en rotavapor Büchi R-210. Los extractos de tallo y hoja, en
donde se utilizó como disolvente agua, fueron concentrados por liofilización.
Después del proceso de concentración se obtuvieron las distintas cantidades de
extracto.
3.3.1. Conservación de cepas bacterianas
Las cepas empleadas fueron proporcionadas por el laboratorio de Ecología
y Salud del Instituto de Salud Pública de la Universidad Veracruzana; incluyeron
agentes etiológicos de enfermedades gastrointestinales en humanos, tales como:
Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli enterohemorrágica 157:
H7. Los microorganismos fueron conservados en tubo inclinado con medio de
cultivo agar soya tripticaseína. Se determinaron periódicamente la pureza de las
cepas bacterianas identificándolas por medio de morfología colonial, aislándolas
por estría cruzada en agar EMB, McConckey, SS (Salmonella-Shigella), por
morfología microscópica y pruebas bioquímicas específicas (TSI, SIM, Citrato de
Simmons, Caldo Urea y Kliger) (Jawetz, 1992; Koneman, 1990).
3.3.2. Técnicas para efectuar pruebas de susceptibilidad
Estas técnicas son de dos tipos:
1) De dilución en agar o en medio líquido (caldo).
2) De difusión en agar, también conocida como de difusión en disco o
antibiograma.
Técnicas de dilución.
En las técnicas de dilución el antibiótico se diluyó progresivamente en un
medio de cultivo líquido (caldo) o sólido (agar). Se empleó un medio líquido, el
antibiótico se colocó en el primer tubo y se diluyó en forma seriada en varios de
ellos, al final se obtuvo una cantidad progresivamente menor del antibiótico con un
rango de concentraciones que simularon aquellas que se alcanzarían en suero,
tejidos o líquidos orgánicos (Ocho tubos con las concentraciones de 64, 32, 16, 8,
4, 2, 1 y 0.5 ug/ml). Después se sembró cada tubo con el mismo inóculo (105 a 106
39
bacterias/ml), se incubaron de 18 a 24 h a 35° C y se observaron buscando la
concentración más baja que inhibió el crecimiento.
Técnicas de difusión en agar o antibiograma
La técnica de difusión en agar también conocida como de difusión en disco,
antíbiograma o "Kirby-Bauer" es la más utilizada en los laboratorios de
microbiología clínica. El medio de Barry et al., (1970) es otra buena alternativa,
aunque menos popular por ser un procedimiento más laborioso.
Esta técnica es, en esencia, el resultado de la interacción de tres
elementos: el antibiótico depositado en un reservorio, generalmente un disco de
papel filtro; un microorganismo que será inhibido o no por el antibiótico, y un medio
sólido (agar) que servirá como apoyo al crecimiento de la bacteria y de difusión del
antibiótico. El comportamiento de estos tres elementos a su vez estará
determinado por las condiciones de incubación: temperatura, concentración de
bióxido de carbono y tiempo de incubación.
Se depositó el disco con el antibiótico sobre el agar ya uniformemente
inoculado; se estableció una competencia entre el antibiótico que se difundió a
través del medio y el microorganismo: que comienza a crecer. Si éste es
susceptible, habría un halo de inhibición que se extenderá hasta un límite dado por
la concentración alcanzada por el antibiótico en ese punto (concentración crítica).
Por lo que el diámetro de la zona de inhibición indicó el grado de susceptibilidad
del organismo al antibiótico, cuando éste quedó como única variable del sistema.
A mayor zona de inhibición mayor será la susceptibilidad del organismo.
Categorías de susceptibilidad:
El International Collaborative Study Group on Antimicrobial Susceptibillity
Testing de la Organización Mundial de la Salud (Ericsson, 1971) recomienda
cuatro categorías de susceptibilidad:
Categoría 1: incluye a las bacterias con un grado de susceptibilidad tal, que
la respuesta in vivo es probable en infecciones sistémicas, moderadas a severas,
cuando se tratan con la dosis habitual de un antimicrobiano. Estos organismos se
consideran como susceptibles.
Categoría 2: incluye la susceptibilidad in vitro que hace probable la
respuesta in vivo en infecciones sistémicas, cuando el antibiótico se usa en dosis
40
mayores o cercanas a la toxicidad.
Categoría 3: comprende ciertos grados de susceptibilidad en los que la
respuesta in vivo es probable cuando se tratan infecciones localizadas en sitios
donde el antibiótico puede ser concentrado por procesos fisiológicos o por
aplicación local. Un ejemplo sería el tratamiento correcto de infecciones urinarias
por Proteus con penicilina G, que resultaría inadecuado para tratar al mismo
organismo alojado en una válvula cardiaca.
Categoría 4: Incluye organismos cuya susceptibilidad hace la respuesta in
vivo improbable. Son organismos considerados como resistentes.
Las categorías 2 y 3 corresponden a la susceptibilidad intermedia, como se
informa tradicionalmente, que además de las implicaciones clínicas antes
señaladas sirve para evitar discrepancias significativas que resulten de errores
técnicos no controlables.
3.3.3. Desarrollo de curvas de crecimiento de la población bacteriana
Se utilizaron tres concentraciones bacterianas (1x105, 1x106 y 6x106 UFC/ml). Fue
necesario conocer el comportamiento del crecimiento de cada una de las cepas
bacterianas, por esta razón, se desarrollaron curvas del crecimiento poblacional de
las bacterias.
Las cepas bacterianas se aislaron por estría cruzada: para Escherichia coli
fue en agar Hektoen, para Salmonella enteritidis y Shigella flexneri se aislaron en
agar McConkey. Se incubaron a 37°C por 24 h; después de la incubación se aisló
una colonia y se inoculó en un tubo de ensaye que contenía caldo nutritivo (7 mi);
nuevamente, se incubó a 37°C por 18 h; después del período de incubación se
leyó la densidad óptica (DO) de la suspensión bacteriana en un espectrofotómetro
(Spectronic 20) a 560 nm. De esta suspensión bacteriana se tomaron 4 ml y se
inocularon en 50 ml de caldo nutritivo, y nuevamente se incubaron a 37°C por 18
h. El crecimiento de las bacterias fue acelerado proporcionándole aire al medio de
cultivo. Para esto se utilizó una bomba marca ELITE 800 (Anexo 2).
41
De la suspensión bacteriana contenida en el tubo de ensaye, se tomó 0.1
mi y se diluyó en 0.9 ml de caldo nutritivo; a partir de esta dilución se hicieron otras
posteriores, las cuales dependieron de la densidad óptica de la suspensión
bacteriana leída anteriormente. De cada una de las diluciones se tomó 100 ul, por
medio de una micropipeta, y se inoculó en cajas petri con agar nutritivo. El inóculo
bacteriano se distribuyó mediante una varilla de vidrio con movimientos circulares,
procurando que la distribución fuera homogénea. Se incubó a 37°C por 18 h, lo
cual fue hecho por duplicado.
Del cultivo bacteriano en crecimiento se tomaron alícuotas cada media
hora, se leyó la densidad óptica de cada una de ellas y se realizaron diluciones,
éstas se inocularon en agar nutritivo y se incubaron a 37°C por 18 h; todo esto fue
llevado a cabo hasta que la densidad óptica del cultivo bacteriano fue constante
(Anexo 3).
Después del período de incubación, se realizó un recuento de colonias de
las placas inoculadas con anterioridad. Las placas en donde el número de colonias
era menor de 30 y mayor de 300 fueron descartadas para motivo de recuento.
Finalmente, se construyó una gráfica en donde el eje de las abcisas
correspondió a los diferentes períodos de tiempo en el que se tomaron las
muestras del cultivo bacteriano en crecimiento, y el eje de las ordenadas
correspondió al logaritmo de la densidad óptica del cultivo bacteriano a ese lapso
de tiempo. La densidad óptica se correlacionó con el número de bacterias
existentes a esa densidad. Esto se llevó a cabo multiplicando el factor de dilución
por el número de colonias, obtenidas mediante el recuento. El resultado se
expresó como UFC/ml.
Las curvas de crecimiento de población bacteriana se realizaron para cada
una de las cepas. El experimento fue repetido tres veces. La actividad
antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor se determinó por medio del
método de difusión en disco y el método de dilución en caldo.
42
3.3.4. Método de difusión en disco
Preparación de las concentraciones de extracto
Éstas fueron preparadas utilizando como disolvente etanol, para el caso de
los extractos etanólico; acetato de etilo, clorofórmico y solución Buffer con pH 7
para los extractos acuosos. Los extractos hexánicos presentaron insolubilidad con
los disolventes empleados, por lo tanto,. se optó por no utilizarlos en las pruebas
de determinación antimicrobiana.
Inicialmente se preparó una solución madre, pesando 800 mg de extracto
crudo y llevándola a un volumen de 1 ml del respectivo disolvente. A partir de ésta,
se hicieron diluciones tomando 0.5 ml de la solución madre y agregándole un
volumen de 0.5 ml del respectivo disolvente; de esta forma se hicieron siete
diluciones. Lo anterior se realizó para cada uno de los extractos.
Preparación de los discos
Se utilizó papel filtro Whatman No. 42, al cual se le hicieron lavados con
solventes, hexano y cloroformo, con el fin de eliminar impurezas. Posteriormente
se hicieron los discos, utilizando una perforadora con un diámetro de 6 mm, y se
esterilizaron. Éstos fueron colocados sobre soportes metálicos (agujas
entomológicas) previamente estériles, los cuales fueron fijados a través de una
base de unicel cubierta de papel aluminio.
Mediante una micropipeta con puntas estériles, se adicionaron a cada disco
20 ul de las diluciones de los extractos y se dejaron secar. De la solución madre
se tomaron alícuotas de 20 ul, se dejaron secar y después se repitió la operación
hasta obtener la concentración deseada, que en este caso fue de 20, 40 y 60 ul
(Cuadro 3).
43
Cuadro 3. Concentración de la solución madre y diluciones alícuotas tomadas, y
concentración final de los discos.
Concentración (mg/ml)
Alícuota ( ul )
Concentración final por disco (mg/ml)
Solución madre 800
20 40 60
16 32 48
Diluciones 400
20
8
200 20 4 100 20 2 50 20 1 25 20 0.50
12.5 20 0.25 6.25 20 0.12
3.3.5. Determinación de la actividad antimicrobiana
Se utilizaron cajas petri de 9 cm de diámetro X 1 cm de altura, en las que se
vertieron 15 ml de agar nutritivo. Se preparó el inóculo, tomando 4 ml de una
suspensión bacteriana incubada por 18 h, la cual se agregó a un matraz
conteniendo 50 ml de caldo nutritivo, mismo que se incubó a 37°C hasta obtener
una densidad óptica de 0.55, momento en el cual se tomaron alícuotas
correspondientes a 1x105, 1x106 y 6x106 UFC/ml (el dato que corresponde al
número de bacterias a cierta densidad óptica se conoce por la curva de
crecimiento poblacional de cada bacteria, descrita con anterioridad).
Las alícuotas fueron colocadas en tubos de ensaye que contenían 5 ml de
agar nutritivo. Enseguida fue vertido homogéneamente su contenido en las cajas
de petri. Inmediatamente fueron -depositados los discos con el apoyo de una pinza
estéril, presionándolos ligeramente para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar. Se colocaron 6 discos en cada caja, los cuales contenían
diferentes concentraciones de extracto, además de un disco control con contenido
de las soluciones empleadas como diluyentes.
44
Para prevenir una sobreposición de las zonas de inhibición, la distribución
de los discos fue con un límite no menor de 20 mm entre cada uno, y de 15 mm en
relación con el borde de la placa. Las cajas se incubaron de forma invertida a 37°C
durante 18 h, los diámetros de las zonas de inhibición se midieron por la parte
posterior de la placa con una regla graduada en milímetros, utilizando una fuente
de luz brillante.
3.3.6. Determinación de la susceptibilidad a los antibióticos
Con el fin de obtener un marco de referencia acerca de la resistencia o
sensibilidad de las bacterias objeto de estudio, se realizaron antibiogramas
utilizando multidiscos combinados conteniendo antibióticos para bacterias Gram (-)
(Sanofi Pasteur), mediante el método de difusión en discos descrito anteriormente.
Los experimentos se realizaron cuatro veces (Fig. 10).
Figura 10. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo
discolor L Hér Hance.
45
3.3.7. Método de dilución en caldo
Preparación de las concentraciones de extracto
De la solución madre (800 mg/ml) preparada con anterioridad se tomaron
alícuotas correspondientes a 20, 40, 60 y 100 ul y se adicionaron a una serie de
tubos de ensaye conteniendo 1 ml de caldo nutritivo, teniendo una concentración
final de 16, 32, 48 y 80 mg/ml, respectivamente en cada tubo.
Determinación de la actividad antimicrobiana
El inóculo fue preparado de la misma manera que se utilizó en el método de
difusión en disco, las alícuotas correspondientes a 1 x105 , 1x 106 y 6 x 106
UFC/ml fueron colocadas en los tubos de ensaye que contenían el medio de
cultivo y las concentraciones de los extractos. Los controles utilizados fueron los
tres inóculos de bacteria en medio de cultivo sin extracto y un blanco conteniendo
medio de cultivo. Para determinar si los diluyentes utilizados para la preparación
de las concentraciones de extractos ejercían efecto sobre la viabilidad de los
microorganismos, se inocularon 20, 40, 60 y 100 ul de diluyente en tubos de
ensaye conteniendo caldo nutritivo (1 ml) y los diferentes inóculos de bacterias. Se
incubaron los tubos a 37°C por 18 h.
Después del período de incubación fueron tomados 50 u/ de cada uno de
los tubos de ensaye y se colocaron en los pozos de una microplaca. Se leyó la
densidad óptica (DO) de cada una de las muestras a 560 nm en un Lector de
microplaca (Spectramax 190). Para el caso de las muestras que contenían las
diferentes concentraciones de extracto con bacteria fue utilizado un blanco con las
respectivas concentraciones de cada uno de los mismos. Los extractos se
conservaron en recipientes de vidrio, debidamente cubiertos y protegidos de la luz,
manteniéndose en refrigeración (4°C) durante la realización del trabajo.
Los datos se procesaron ,a través de análisis de varianza y prueba de
Tukey.
3.4. Materiales para estudios fitoquímicos
Se utilizó material de vidrio debidamente lavado con detergente y enjuagándolo
46
con agua destilada. Los disolventes empleados durante los diferentes
procedimientos utilizados fueron previamente purificados sometiéndolos a
oxidación con reactivos como dicromato de potasio para acetona, permanganato
de potasio e hidróxido de potasio para hexano, sulfato férrico para éter etílico y
carbonato de potasio para benceno, cloruro de metileno, etanol o metano) seguida
esta oxidación de una destilación fraccionada con columna Vigreux.
3.4.1. Cromatografía en capa delgada (CCD)
Se utilizaron cromatofolios de sílica-gel de aluminio 60 F 254 de 20 por 29
cm marca Merck, espesor de 0.20 mm con indicador para luz ultravioleta. En esta
cromatografía se emplearon mezclas de disolventes volumen a volumen (v/v) en
diferentes polaridades. Como reveladores se emplearon, luz ultravioleta y solución
de cloruro de cobalto (2 g de CoCI2 aforados a 100 mm con H2SO4 10% acuoso).
La aspersión con cloruro de cobalto va seguida de calentamiento a 100-120°C
hasta aparición de las manchas coloridas en el cromatofolio (Madsen, 1973).
3.4.2. Cromatografía en columna (CC)
Se utilizó sílica-gel número de malla 70-230 (tamaño de partícula = 0.063-
0.2 mm) o 230/400 (tamaño de partícula = 0.040-0.063 mm) ambas de la marca
Merck. La elusión de la CC se realizó siempre con disolventes de menor a mayor
polaridad, haciendo seguimiento de las fracciones obtenidas por CCD (Anwar,
1963; Ruppel et al., 1971).
3.4.3. Cromatografía en capa preparativa (CCP)
Es una CCD, sin embargo se diferencia de ésta en que la CCP se emplearon
placas de vidrio con sílica-gel 60.F 254 marca Merck de 5 por 20 cm y de 20 por
20 cm de 0.25 mm de espesor.
3.4.4. Equipo para análisis espectroscópicos
Los metabolitos secundarios que se aislaron fueron sometidos a las siguientes
técnicas espectroscópicas para la identificación de su estructura:
• Espectroscopía de absorción de infrarrojo, para la que se empleó un equipo
47
Perkin Elmer IGF.
• Espectroscopía de resonancia magnética nuclear de 1 H y 13 C para lo que se
utilizó un equipo leo¡ Eclipse más 400 y un equipo Jeol GSX 270.
• Espectrómetro de masas Hewlett Packard 5989 A acoplado a un cromatógrafo
de gases 5890 serie II.
• Determinación de punto de fusión para lo que se, utilizó un equipo Mel-Temp. II
(Laboratory Devices E.U.A.).
3.4.5. Agentes reveladores'
A los extractos hexánicos, clorofórmico y acetónico de las plantas se les
realizaron ensayos preliminares empleando CCD, en este caso particular se
utilizaron como reveladores luz ultravioleta de longitud de onda larga (365 nm) y
de longitud de onda corta (254 nm) así como, agentes cromogénicos para
identificar la presencia de familias de metabolitos.
3.4. 6. Identificación de familias de metabolitos
Para la realización de estos ensayos se prepararon placas de sílica
soportadas en aluminio de medidas 2 x 5, cm. En estas placas o cromatofolios se
depositaron pequeñas cantidades de los extractos disueltos en cloroformo-acetona
5:5 v/v. Esta aplicación de los extractos se realizó con tubos capilares preparados.
Los cromatofolios con los extractos aplicados fueron sometidos a la elusión con
mezcla de disolventes para así lograr la separación de las distintas familias de
metabolitos. Los cromatofolios así preparados fueron revelados con luz
ultravioleta, yodo metálico y los agentes cromogénicos
3.4.6.1. Reactivos para la identificación de metabolitos
Alcaloides
Para la determinación de la presencia de alcaloides en los extractos se prepararon
las siguientes soluciones:
Solución A: 0.85 g de nitrato de bismuto básico disuelto en una mezcla de 10 ml de
ácido acetico y 40 ml de agua.
Solución B: 8 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua.
48
Solución Stock: volúmenes iguales de solución A y solución B se mezclan
bien y se guardan en un frasco ambar. Con esta solución se impregnaron los
cromatofolios con los extractos y posteriormente se sometieron a calentamiento la
70-80°C en una parrilla; la aparición de manchas color naranja indica la presencia
de alcaloides (Egon, 1969).
Flavonoides
Para determinar la presencia de flavonoides y compuestos afines se preparó una
disolución alcohólica del extracto, a la cual se adicionó 1 g de Mg y 5 ml de HCI,
observándose una coloración rojiza en caso positivo; sin embargo, la variación en
el color puede conducir a apreciaciones falsas y no se toma como positiva (Egon,
1969).
Saponinas
La presencia de saponinas y sapogeninas se analizaron por la prueba de la
espuma, que consiste en depositar una pequeña cantidad del extracto en un tubo
de ensaye con agua y agitar vigorosamente; la formación de espuma en la
disolución indica prueba positiva. Los taninos pueden presentar coloración (incluso
precipitación) azul, azul-negra, verde o azul-verde cuando se adiciona 5 mi de
FeCl3 al extracto (Egon, 1969).
Antraquinonas
La presencia de antraquinonas libres se determinó agregando una pequeña
cantidad de extracto en un tubo de ensaye conteniendo benceno, se agitó
vigorosamente, se filtró y al filtrado se le adicionó una disolución de amoníaco y
posteriormente se volvió a agitar, la aparición de color rosa, rojo o violeta en la
fase amoniacal indica la presencia de estos compuestos (Egon, 1969).
Lactonas
Las lactonas se determinaron mediante la preparación de un extracto clorofórmico,
de donde se extrajeron con EtOH y diluyeron con un volumen igual de una
disolución acuosa de acetato de plomo; posteriormente se eliminó el EtOH y el
49
agua, el residuo se extrajo con CHCI3; nuevamente se eliminó el disolvente, y de
este residuo se preparó para espectroscopía infrarroja, en donde las absorciones
a 1740-1790 cm-1 son características de δ-Iactonas y la intensidad indica su
concentración (Domínguez, 1973). Una vez separadas, se pueden emplear las
pruebas de Legal (color rosa) Legal, Baljet (naranja o rojo oscuro) y Tollens (Fritz,
1978).
3.5. Procesos fitoquímicos
La planta Rhoeo discolor (maguey morado) -peso = 935.4 g- fue separada en
tallos y hojas, cortada finamente, sometiéndose a procesos de extracción a
temperatura ambiente, que consiste en agitar continuamente el material finamente
picado dentro de un matraz junto con el disolvente seleccionado para el proceso
(técnica de maceración). Primeramente se utilizó acetato de etilo como disolvente,
proceso que se repitió tres veces hasta agotar la extracción de los metabolitos,
obtiene así 2.150 g de extracto. Posteriormente el residuo de la planta o marco se
sometió por varios días a proceso de extracción con metano) y de esta manera se
obtuvieron 3.905 g de extracto metanólico (Fig. 11).
50
Figura 11. Proceso del estudio fitoquímico del extracto acetato de etilo en los de
Rhoeo discolor.
3.5.1. Extracto acetato de etilo de tallos de Rhoeo discolor
El extracto acetato de etilo (EAcEtRd) obtenido mostró color ámbar, olor
característico y aspecto terroso, (2.1501 g). De éste se tomaron pequeñas
cantidades para pruebas de precipitación, de solubilidad utilizando distintos
disolventes, obteniendo así, con hexano, una parte insoluble, a las que se asignó
la clave EHI (1.8823 g) y otra soluble con clave EHS (0.2678 g). La parte insoluble
EHI fue lavada repetidas veces con acetona fría hasta observar limpia las aguas
madres, obteniendo dos fases: la soluble EAcS (1.6320 g) y la insoluble EAcl
(0.2501 g) que también fue lavada con metanol, separando un polvo de color gris
claro (impurezas). La fase soluble en acetona se concentró y se lavó repetidas
veces con eter etílico, obteniendo un extracto etílico que se clasificó como EAcSEE
51
(0.8397 g). A esta parte se le realizó cromatografía en capa delgada (CCD) con
polaridad hexano-acetona 6:4 v/v observando una buena separación de
metabolitos, por lo que se procedió a realizar la cromatografía en columna con
sílica gel fina, malla 230-400, iniciando el proceso con hexano y aumentando
polaridad progresivamente con acetona, hasta la polaridad 4:6 v/v hexano-acetona
obteniendo de esta manera 104 fracciones.
A todas estas fracciones, por separado, se les realizaron pruebas de
precipitación, cristalización y cromatografía en capa delgada, y de esta manera se
observó que las fracciones 1 al 47 estaban constituidas por una mezcla compleja
de metabolitos de donde se obtuvieron 0.058 g. Las pruebas de identificación para
estos metabolitos fueron por medio de agentes reveladores y luz ultravioleta,
utilizando cromatografía de sílica en capa fina y como eluyentes, una mezcla de
hexano -acetona 8/2 v/v, así como solución de cloruro de cobalto al 10%.
Las fracciones 48 al 67 fueron analizadas por cromatografía en capa
delgada utilizando como eluyente hexano-acetona 5/5 v/v, observando en luz
ultravioleta (uv) un compuesto azul fluorescente. Como todas estas fracciones
presentaban el mismo compuesto, se procedió a reunirlas y por proceso de
cristalización se obtuvieron 0.2204 g de un compuesto de color blanco que
presentó p.f. 224 - 227° C, asignándole a éste la clave EAcEtC2.
Las fracciones 68 al 104 también analizadas por cromatografía en capa
delgada con una polaridad de 4:6 v/v hexano-acetona, presentaban similitud, es
decir, se observó una mezcla de compuestos con distintos valores de Rf. Por esta
razón se juntaron, dando así 0.145 g de mezcla.
Los otros metabolitos de este extracto se quedaron como residuo en la
columna cromatográfica, por lo que fueron barridos primero con acetona y
posteriormente con metanol, obteniendo así 0.116 g de una mezcla de
compuestos que fue analizada por los procedimientos antes mencionados; sin
embargo, no se logró la separación de ellos (Fig. 12).
52
Figura 12. Estudio fitoquímico de la parte insoluble del lavado. hexánico.
Por otro lado, el extracto EHS (Fig. 12) se trató con acetona fría, logrando
así precipitar 0.243 g de un compúesto blanco de aspecto ceroso, que al
analizarse por CCD y utilizando la mezcla de disolventes hexano/acetato de etilo
8:2 v/v y revelado con solución de cloruro de cobalto al 10%, presentó un
compuesto con valor de Rf = 0.70. Este compuesto presentó coloración rosa y por
estudios en RMN mostró señales características de hidrocarburo saturado (ceras).
Las aguas madres de este compuesto se evaporaron, produciendo así
0.2436 g de una mezcla de metabolitos que fueron analizados por cromatografía
en capa delgada con polaridad hexano-acetato de etilo 8:2 v/v, observando buena
resolución, por lo que se procedió a correr una columna cromatográfica, utilizando
53
como adsorbente una arcilla denominada tonsil, esto es con el propósito de
eliminar la presencia de clorofila en ese extracto. En esta columna se obtuvieron
34 fracciones y los barridos de acetato de etilo y metanol. Todas las fracciones y
los barridos fueron analizados por cromatografía en capa delgada con distintos
disolventes, y cada una de ellas. fueron lavadas y recristalizadas por separado.
Como resultado del estudio en esta nueva columna, de las fracciones 1 al
15 (0.0114 g) se obtuvieron de una mezcla de metabolitos que no fue posible
separar con ninguna mezcla de eluyentes (Fig.13).
De las fracciones 16 al 25, se observó por cromatografía en capa delgada
una mancha de color vino utilizando benceno-acetona 9/1 v/v. Todas estas
fracciones fueron reunidas y el producto fue recristalizado con metanol logrando
así 0.010 g de cristales en forma de agujas de color blanco, asignándole la clave
EacEtC1. Este compuesto fue purificado para su posterior estudio en
espectroscopía.
De las otras fracciones, de la 26 a la 34, sólo se obtuvieron 0.010 g de una
mezcla de metabolitos que debido a la mínima cantidad no fue posible procesarla
para su separación.
La fracción barrida con acetato de etilo produjo 0.0406 g de mezcla de
metabolitos; mientras que la fracción con metanol proporcionó 0.1476 g de
metabolitos, pero debido a las mínimas cantidades obtenidas y a la presencia
abundante de clorofila no fue posible estudiarla (Fig. 13).
54
Figura 13. Estudio fitoquímico de la parte soluble del lavado hexánico.
3.5. 2. Estudio del extracto metanólico de tallo
De 3.9065 g del extractó con aspecto chicloso, de color café oscuro, olor
dulce clasificado con la clave EMRdV, fue lavado con alcohol etílico a 5° C,
obteniendo así dos fases: la insoluble clasificada como EMIEOH con peso de
1.521 g y la soluble clasificada como EMSEOH, que al evaporar la solución dio un
peso de 2.384 g.
Esta parte insoluble fue lavada sucesivamente con metanol y etanol hasta
purificar el precipitado. De esta manera se obtuvo un precipitado blanco cristalino
que resultó insoluble en todos los disolventes orgánicos, por lo que se sometió a
cristalizaciones lentas en una mezcla de alcohol-agua, obteniendo así dos tipos de
sales que por análisis químicos resultaron ser cloruro dé potasio (KCI), con peso
de 1.216 g, y además cloruro de sodio (NaCI),, con peso de 0.1052 g; el resto de
esta mezcla fueron impurezas.
De la parte soluble del alcohol etílico (2.3847 g) se tomaron 0.300 g para la
reacción de acetilación (sin piridina), no logrando resultados satisfactorios. La
muestra restante (2.0847 g) fue procesada por cromatografía en columna
55
utilizando como adsorbente tonsil y como eluyente hexano-acetato de etilo,
aumentando la cantidad de acetato de etilo hasta llegar a una polaridad de 5:5 v/v,
obteniendo así 207 fracciones, más la muestra de barridos.
Todas las fracciones fueron analizadas por cromatografía en capa delgada
(CCD) con distintas mezclas de disolventes, y de esta manera las fracciones
equivalentes se juntaron haciendo tres bloques, más los barridos. Los bloques
fueron tratados nuevamente por lavados, cristalización y cromatografía.
Al primer bloque de las fracciones 1 al 95 (0.2520 g) se le realizó
cromatografía en capa delgada (CCD), utilizando como eluyente una mezcla de
hexano acetato de etilo 8:2 v/v, observando compuestos difíciles de separar
debido a sus condiciones en Rf.
El segundo bloque del 95 al 109 fue analizado por cromatografía en capa
delgada utili zando disolventes hexano-acetato de etilo 8:2 v/v, observando una
mancha color vino y una mancha indefinida de las cuales, por lavado y
recristalización, se logró obtener cristales en forma de agujas blancas que
presentaron Rf de 0.35 en mezcla de benceno-acetona 9:1 v/v, su punto de fusión
fue 135-137°C. Estos cristales pesaron 0.0258 g. Este compuesto fue purificado
por repetidas (3 veces) cristalizaciones y ya puro, se procedió a clasificarlo como
EMC3 para su posterior estudio espectroscópico.
Al tercer bloque de 110, al 207 (0.2520 g) se le realizó una cromatografía
en capa delgada con polaridad de hexano-acetato de etilo 7:3 v/v, observándose
compuestos difíciles de separar; debido a sus condiciones en Rf.
A los barridos con acetato de etilo (0.200 g) y metano) (0.3087 g) se les
realizó una cromatografía en capa delgada con polaridad hexano-acetato de etilo
5:5 v/v, observando metabolitos sobrepuestos y una mancha indefinida de color
verde (clorofila), no logrando su separación por métodos conocidos (Fig. 14).
56
Figura 14. Estudio fitoquímico del extracto metanólico del tallo de R. discolor L.
Hér Hance.
57
3.5. 3. Acetilación del compuesto EacEtC2
A 30 mg de muestra seca de EacEtC2 se le agregó 1 ml de anhídrido
acético seco y 0.5 ml de piridina anhídra. Esta mezcla se sometió a reflujo durante
2 h, terminada la reacción se adicionó hielo raspado. El producto se extrajo con
acetato de etilo y la fase orgánica se trató con 5 ml HCI al 10%; posteriormente, se
lavó con agua destilada varias veces hasta eliminar el exceso de HCI, enseguida
se le agregó bicarbonato de sodio al 10% (10 ml) y se lavó nuevamente con agua
destilada hasta alcanzar un pH neutro, secando la fase orgánica sobre sulfato de
sodio anhídro. El disolvente se evaporó, obteniendo de esta manera 15 mg de
pequeños cristales incoloros, con punto de fusión .169-170°C.
3.5. 4. Metilación del compuesto EacEtC2
A 30 mg de muestra seca de EacEtC2 se le agregó 15 ml de acetona y se
calentó bajo reflujo durante 2 h con 1 ml de disulfato de dimetilo, en presencia de
200 mg de carbonato de sodio anhídro; terminada la reacción, se filtró para
eliminar el carbonato, se extrajo con acetato de etilo y se lavó repetidas veces con
una solución de NaOH, con el fin de eliminar el sulfato de dimetilo sobrante;
posteriormente, se lavó con agua fría hasta un pH neutro, secando la capa
orgánica con sulfato de sodio anhídro. El disolvente se evaporó obteniéndose de
esta manera 10 mg de pequeños cristales color blanco de punto de fusión 166-
167°C.
En este extracto se logró separar e identificar dos metabolitos secundarios:
EacEtC1 y EacEtC2. El primero de ellos de naturaleza esteroidal y el segundo de
naturaleza cumarínica, éste último compuesto presentó fluorescencia intensa a la
luz ultravioleta, así también, dio pruebas positivas para cumarinas, revelando con
diferentes agentes cromogénicos. Además, en estudios de espectroscopía de
resonancia magnética nuclear de hidrógeno, mostró una serie de señales
características para compuestos aromáticos y algunas de ellas de tipo cumarínico.
Como las señales mostradas : en el espectro de RMN, no proporcionaban mayor
información, se tuvo que recurrir a la formación de compuestos derivados,
preferentemente sometiéndolos a reacciones de acetilación y metilación, para que
58
de esta forma se pudiera inferir la presencia de grupos hidroxilos en la molécula.
Posteriormente se describe la discusión e interpretación de los espectros de
ambos metabolitos que llevaron a la identificación de las estructuras químicas.
Del extracto metanólico, por procedimientos ya descritos se pudo aislar e
identificar el compuesto EMC3, el cual fue analizado en cromatografía de capa
fina, dando positivo a la prueba de esteroles.
59
IV. RESULTADOS
4.1. Estudio microbiológico
En el Cuadro 4 se muestran los valores de las diferentes cantidades de
extractos obtenidos por el proceso de maceración a partir de 2200 g de hoja y
1200 g de tallo de la planta Rhoeo discolor L.Hér Hance.
Cuadro 4. Cantidades de extractos obtenidos de la parte aérea de Rhoeo discolor
Parte aérea Tipo de Clave Cantidad (g) extracto Hexánico EHHRd 0.501
Hoja Clorófórmico EaIHRd 5.511
(2200 g) Etanólico EetHRd 3.812
Acuoso EacHRd 3.325
Hexánico EHTRd 0.523 Tallo Acetato de etilo EAcEtTRd 3.015
(1200 g) Acuoso EacTRd 3.425
4.1.2. Características físicas de extractos
Los extractos hexánicos de hoja y tallo presentaron color amarillo, olor
característico y aspecto terroso; el clorofórmico de hoja presentó color verde olivo,
olor penetrante y aspecto terroso. El etanólico de ho ja fue de aspecto chicloso,
color vino y olor dulzón. El acuoso liofilizado de hoja presentó aspecto de hojuelas
con un color morado y olor característico. El acetato de etilo de tallo presentó color
ámbar, olor dulzón y aspecto viscoso. El acuoso liofilizado de tallo mostró un color
parduzco en forma de hojuelas y de olor característico. Todos los extractos se
conservaron en recipientes de vidrio, debidamente cubiertos y protegidos de la luz,
manteniéndose en refrigeración (4°C) durante la realización del trabajo, para evitar
posible descomposición de metabolitos.
60
4.1.3. Pruebas de susceptibilidad antibiótica
Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antibiótica indicaron que
tres de los doce antibióticos empleados presentaron mayor eficacia (cefatoxima,
ceftriaxoma y trimetroprin-sulfametoxasol), ya que las tres bacterias mostraron
sensibilidad hacia ellos. Se escogió a la cefatoxima como el antibiótico de
referencia, tomando como marco los halos de inhibición formados sobre las
bacterias en estudio; esto permitió designar las características de actividad de los
extractos.
Las bacterias empleadas mostraron diferencia en su susceptibilidad a
los antibióticos, por lo que en este trabajo se emplearon bacterias
multirresistentes, y esto permitió comprobar la actividad de los extractos sobre
microorganismos con diversos grados de susceptibilidad a los antibióticos (Cuadro
5).
Cuadro 5. Susceptibilidad de diferentes microorganismos a diversos antibióticos.
Antibióticos Concentración (mcg)
Cepas
Salmonella enteritidis
Shigella flexneri
Escherichia coli
Amikacina 30 R15 R15 R13 Ampicilina 10 R- R- R-
Carbenicilina 100 R- R15 S23 Cefatolina 30 R13 R16 R12 Cefatoxima 30 S21 S22 S20 Ceftriaxona 30 S23 S22 S20
Cloranfenicol 30 S20 R14 R15 Gentamicina 10 R13 S15 S15 Netilmicina 30 R13 520 S20
Nitrofurantoina 300 R15 S25 522 Pefloxacina 5 S23 S25 R14 Trimetropin-
Sulfametoxasol 25 S25 S25 S14
R: Resistente S: Susceptible
(-) Indica la ausencia de halos de inhibición.
Los superíndices indican el diámetro de los halos de inhibición (mm) de los antibióticos.
61
4.1.4. Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión
en disco
Los resultados de la determinación de la actividad antimicrobiana de los
extractos de tallo y hoja de maguey morado (Rhoeo discolor L.Hér Hance), sobre
las tres bacterias estudiadas a diferentes concentraciones, mostraron que el
extracto de acetato de etilo del tallo de Rhoeo discolor (EAcEtTRd) presentó
mayor actividad, en comparación con los demás extractos, ya que inhibió a todas
las bacterias en la mayoría de las diferentes concentraciones.
En el cuadro 6 se muestra la actividad antibacteriana de los extractos de Rhoeo
discolor en las concentraciones experimentales probadas sobre Escherichia coli
Cuadro 6. Actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor sobre
Escherichia coli
Extractos Concentración por disco (UFC/ml)
Soluciones madres Diluciones (mg/ml) (mg/ml)
48 32 16 8 4 1 0.5 0.25 0.12
1x105 - - - - - - - - - EAcEtRTd 1 x106 + + + - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1x105 - - - - - - - - - EAcTRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1x105 + + - - - - - - - ECIHRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1x105 + + + - - - - - - EEtHRd 1 x106 - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1x105 - - - - - - - - - EAcHRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
62
Las figuras 15 y 16 muestran los sensidiscos que fueron impregnados de extractos
en diferentes concentraciones se utilizó como medio de cultivo en agar Hektoen
para Escherichia coli
Figura 15. Actividad antibacteriana de extractos clorofórmico de hoja y acetato de
etilo de tallo de Rhoeo discolor sobre Escherichia coli en
concentración de 6x10 6 UFC/ml.
Figura 16. Actividad antimicrobiana de extractos clorofórmico y acuoso de hoja de
Rhoeo discolor sobre Escherichia coli en concentración de 1x105
UFC/ml.
63
En el Cuadro 7 se muestra la actividad antibacteriana de los extractos de
R. discolor en las concentraciones, experimentales probadas sobre Salmonella
enteritidis.
Cuadro 7. Actividad antimicrobiana de extractos de Rhoeo discolor sobre
Salmonella enteritidis
Extractos Concentración
por disco
(UFC/ml)
Soluciones madres
(mg/ml)
Diluciones (mg/ml)
48 32 16 8 4 1 0.5 0.25 0.12 1x105 + + + + - - - - -
EacEtRTd 1 x106 + + - - - - - - 6x106 - - - - - - - - -
1x105' - - - - - - - - -
EacTRd 1 x106 - - - - - - - - - 6x106 - - - - - - - - -
1x105 + + - - - - - - -
EcIHRd 1 x106 - - - - - - - - - 6x106 - - - - - - - - -
1x105 ++ + - - - - - - -
EEtHRd 1 x106 - - - - - - - - - 6x106 - - - - - - - - -
1 x 105 +++ +++ +++ - - - - - -
EAcHRd 1 x106 - - - - - - - - - 6x106 - - - - - -
Las Figs. 17 y 18 muestran la acción bactericida de los extractos de R.
discolor en las diferentes concentraciones.
- - - -
64
Figura 17. Actividad antimicrobiana del extracto clorofórmico (a) y de etanólico (b)
de hoja en diferentes concentraciones sobre Salmonella enteritidis en
concentración de 1x106 UFC/mI.
65
Figura 18. Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo tallo sobre
Salmonella enteritidis
En el Cuadro 8 se muestra la actividad antibacteriana de los extractos de R.
discoIor en las concentraciones experimentales probadas sobre Shigella flexnen
66
Cuadro 8. Actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor sobre
Shigella flexneri.
Extractos Concentración Soluciones madres Diluciones (mg/ml) por disco (mg/mI) (UFC/ml)
48 32 16 8 4 1 0.5 0.25 0.12 1 x 105 +++ +++ +++ ++ ++ + - - -
EacEtRTd 1 x106 +++ ++ ++ - - - - - - 6 x 106 ++ ++ + + + - - - -
1x105 ++ ++ + + - - - - - EacTRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1x105 + + + - - - - - - EcIHRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1 x 105 ++ + + - - - - - - EetHRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
1 x 105 +++ +++ ++ + - - - - - EacHRd 1 x106 - - - - - - - - -
6x106 - - - - - - - - -
Las Figs. 19, 20 y 21 muestran la acción bactericida de los extractos de
Rhoeo discolor en diferentes concentraciones sobre Shigella flexneri.
Magnolia A Castrejon Delgado
Magnolia A Castrejon Delgado
67
Figura 19. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de hoja y tallo de R.
discolor sobre Shigelia flexneri.
Figura 20. Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo de R. discolor
sobre S. flexneri.
68
Figura 21. Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo de R. discolor
sobre Shigella flexneri.
4.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de difusión
en caldo
Este proceso se basó en la determinación de la disminución de la densidad
óptica provocada por la reducción del crecimiento bacteriano por la acción de los
diferentes extractos de Rhoeo discolor L. Hér Hance. En las figuras se observa el
crecimiento poblacional de los cultivos, así como la disminución de la densidad
óptica de los mismos por la acción inhibitoria de los extractos de Rboeo discolor.
69
A= control de la bacteria, A1= bacteria con extracto etanólico; B= control de la
bacteria a la concentración de 1x106 ufc/ml; B1= bacteria con extracto etanólico; C= control de la bacteria a la concentración de 6x106 ufc/ml; C1= bacteria con extracto etanólico
Figura 22. Efecto del extracto etanólico del tallo de Rhoeo discolor sobre el
crecimiento de Shigelia flexneri. Densidades ópticas después de 18 h
de incubación a 37°C.
A= control de la bacteria a la concentración de 6x106 ufc/ml; B= bacteria con extracto etanólico.
Figura 23. Efecto del extracto etanólico del tallo de Rhoeo discolor sobre el
crecimiento de Escherichia coli. Densidades ópticas después de 18 h
de incubación a 37°C.
70
A= control de la bacteria a la concentración de 1x106 ufc/ml; A1=bacteria con extracto etanólico;
B= control de la bacteria a la concentración de 6x106 ufc/ml; B1= bacteria con extracto
clorofórmico;
B2= bacteria con extracto acuoso.
Figura 24. Efecto de los extractos etanólico de tallo, acuoso y clorofórmico de hoja,
sobre el crecimiento de Salmonella enteritidis. Densidades ópticas
después de 18 h de incubación a 37°C.
La acción bactericida de los extractos sobre el crecimiento de las distintas
bacterias probadas en el experimento se establece por la prueba de Tukey, como
se muestran en las Figs. 24- 34 que presentan las densidades ópticas y su
relación con la concentración de los extractos.
71
Figura 25. Efecto del extracto acuoso y concentraciones de la bacteria Escherichia
coli. Columnas con la misma letra son estadísticamente iguales Tukey (P < 0.05).
Figura 26. Efecto del extracto etanólico y concentraciones en el control de E, coli.
Columnas con la misma letra son estadísticamente iguales Tukey (P < 0.05).
72
Figura 27. Efecto del extracto acuoso de tallo en el control de E coli. Columnas
con la misma letra son estadísticamente iguales Tukey (P < 0.05).
Figura 28. Efecto del extracto acuoso tallo y concentraciones en el control de
Escherichia coli. Columnas con la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey < 0.005).
73
Figura 29. Efecto de los extractos de R. discolorsobre Escherichia coli.
Figura 30. Efecto de los extractos de R. discolor sobre las concentraciones de
Escherichia coli.
74
Figura 31. Efectos de los extractos R. discolor sobre Salmonella enteritidis.
Figura 32. Efectos de los extractos de R. discolor sobre las concentraciones de
Salmonella enteritidis.
75
Figura 33. Efecto de los extractos de R. discolorsobre Shigella flexneri.
Figura 34. Efecto de los extractos de R. discolor sobre las concentraciones de
Shigella flexneri.
76
4.2. Estudios cromatográficos
Veinte miligramos del extracto virgen en acetato de etilo fueron disueltos en
cloroformo-acetona 1:1, v/v y eluídos sobre cromatofolios de sílica gel. El primer
cromatofolio fue analizado en el espectro visible; el segundo fue impregnado con
solución de cloruro de cobalto y por calentamiento en parrilla mostró coloración en
los metabolitos (Fig. 35 a y b). El tercer cromatofolio fue analizado con luz
ultravioleta, mostrando una serie de metabolitos fluorescentes en diferentes
colores (Fig. 36).
Figura 35. Cromatografía en capa delgada del extracto virgen de R. discolor L. Hér
Hance, eluidas en benceno/acetona, 9/1. a) placa sin ningún agente
revelador; b) placa con agente revelador (cloruro de cobalto).
77
Figura 36. Cromatografía en capa delgada utilizando luz ultravioleta del extracto
virgen de R. discolor L. Hér Hance.
4.2.1. Identificación de metabolitos secundarios por cromatografía de gases
en los extractos de Rhoeo discolor
Cien miligramos del extracto virgen fueron analizados por cromatografía de
gases y se comprobó la presencia de los ácidos orgánicos: hexadecanóico y 9,12-
octadiecanóico, hidrocarburo insaturado nonadeceno; hidrocarburos saturados
(ceras); β -sitosterol, estigmasterol, compuestos fenólicos carotenos (Cuadro 9).
78
Cuadro 9. Compuestos identificados por cromatografía de gases en R. discolor.
Compuesto Fórmula
Ácido hexadecanóico CH3-(CH2)14-000H
Ácido 9,12 octadecanóico CH3-(CH2)7-CH=CH-000H
Derivados fenólicos
79
4.2.2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear de hidrógeno del
compuesto EacEtC1
El espectro de RMN 1H de este compuesto presenta dos grupos de señales
en la región de hidrógenos vinílicos, una señal doble a 5.35 ppm y otra señal
múltiple en 5.10 ppm. También se observa en 3.5 ppm una señal múltiple; esta
región es para protones (hidrógenos) vecinos a densidades electrónicas de
oxígenos. En la región de hidrógenos de carbonos alifáticos de 2.5 a 0.5 ppm se
aprecian una serie de señales múltiples en las que sobresalen las intensas
señales características para hidrógenos de. grupos metilos (Nathan y Díaz, 1970)
(Fig. 37).
Figura 37. Espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno a 270 Mhz del
compuesto estigmasterol en el que se observa de 5 a 5.5 ppm los
protones vinílicos y a 3.5 ppm la señal múltiple del protón del carbono
3.
80
Figura 38. Estructura del estigmasterol aislado del extracto de acetato de etilo de
Rhoeo discolor L. Hér Hance.
4.2.3. Espectrometría de masas del compuesto de estructura cumarínica
(acetc2)
Este compuesto, aislado por cromatografía en columna del extracto de
acetato de etilo, fue sometido a espectrometría de masas y se observó un ión
molecular de 208 m/z y un ión de fragmentación de 134 m/z (Fig. 39).
Figura 39. Espectro de masas del compuesto de estructura cumarínica, donde se
observa el ión molecular de 208 y 134 m/z.
81
4.2.4. Espectroscopia infrarroja del compuesto cumarínico (acet2)
El espectro de infrarrojo de este compuesto presentó una señal intensa y
ancha en 33000 cm -1, que indica la presencia de grupos hidroxilos; en 1700 cm -1
señal intensa producida por la presencia de un grupo éster cíclico en la molécula.
En 1600 cm -1 mostró una señal intensa correspondiente al alargamiento de doble
enlace C-C, las demás señales de este espectro son producidas por los metilos y
metilenos (Fig. 40).
Figura 40. Espectro de infrarrojo del compuesto cumarínico (acetc2), en donde se
observa la señal intensa y ancha a 3300 cm -1, característica de grupos
hidroxilos.
82
4.2.5. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno dei
compuesto cumarmico (acet2)
En el análisis que se realizó por espectroscopia de RMN1H a 270 mhz de
este compuesto, se observaron señales de 6.2 a 7.5 ppm, correspondientes a
protones aromáticos, y en 8.5 pp n una señal pequeña ancha que por el valor de
su integral indica la presencia de grupos hidroxilos (Figs. 41 y 42).
Figura 41. Espectro de 1H RMN de 4-(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H-furan-2-ona
a 270 Mhz que demuestra la presencia de anillos aromáticos en la zona
de 6.2a7.5ppm.
83
Figura 42. Ampliación del espectro de 1 RMN en la zona aromática del compuesto
cumarínico (5W Mhz) en donde se observan las señales de los
hidrógenos aromáticos.
La multiplicidad de estas señales se distingue claramente en la ampliación
de la zona aromática 1,2,4-trisustituído y corresponden a los hidrógenos de un
anillo benceníco con base en las constantes de acoplamiento.
84
Figura 43. Espectro de masas del compuesto cumarínico (acet2) después de ser
acetilado con ión molecular de 334 m/z que demuestra la presencia
de grupos acetilos.
4.2.6. Espectroscopía infrarroja de la cumarina acetilada
Por espectroscopía infrarroja de este compuesto derivado se comprobó la
acetilación de tres grupos hidroxilos, por la desaparición de la señal intensa a
3300 cm -1 y la presencia de una nueva señal a 1200 cm -1, debido a los grupos
ésteres (Fg. 44).
85
Figura 44. Espectro de infrarrojo del compuesto acetitado en el que se observa la
desaparición en 3300 cm-1.
El espectro de 'H RMN de este derivado acetilado muestra las nuevas
señales de acetato en una señal a 2.18 ppm que integra para tres protones
(hidrógenos), así como una señal simple intensa en 2.33 ppm que es debida a seis
protones (hidrógenos) ocasionada por dos grupos acetilos (Fig. 45).
86
Figura 45. Espectro de 'H RMN de la cumarina acetilada en el que se demuestra la
presencia de tres hidroxilos acetilados en 2.3 ppm compuesto
acetilado.
4.2.7. Espectroscopía de la cumarina metilada
El compuesto original también fue sometido a una reacción de metilación
utilizando sulfato de dimetilo y así, nuevamente por espectrometría de masas, se
comprobó que la reacción fue positiva, ya que presentó en el espectro un ión
molecular M+ m/z = 250 (Fig. 46).
87
Figura 46. Espectro de masas del compuesto cumarínico después de la reacción
de metilaclón en donde se muestra el Son molecular 250 m/z que
demuestra la presencia de grupos metilos en la estructura.
4.2. 8. Espectroscopía infrarroja del compuesto cumarínico metilado
En el espectro de infrarrojo de este compuesto se observa una banda en
2900 cm -1 debido a la presencia de grupos metilos y la desaparición de la banda
en 3300 cm-1 indicativas de la transformación de los grupos hidroxilos en la
molécula (Fig. 47).
88
Figura 47. Espectro de infrarrojo del compuesto cumarínico después de la
reacción de metilación en el que aparecen señales a 2900 cm -1 por la
presencia de grupos metilos.
4.2.9. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear de hidrógeno de la
cumarina metilada
Por espectroscopia de RMN de 1H se comprobó la metilación de los tres
grupos hidroxilos, ya que el derivado muestra tres señales simples asignadas en
3.95, 3.93 y 3.55 ppm asignándose a los grupos metilos de los metoxilos unidos al
anillo aromático y al anillo del furano (Fig. 48).
89
Figura 48. Espectro de 'H RMN del compuesto cumarínico metilado en el que se
observan dos señales intensas de 3.55 a 3.95 ppm, debido a los
nuevos grupos metilos presentes en la estructura.
90
V. DISCUSIÓN
5.1. Proceso microbiológico
5.1.2. Método de difusión en disco
Las pruebas de susceptibilidad antibiótica realizadas con Escherichia coli,
Salmonella lexneri y Shigella enteritidis, utilizando doce antibióticos, mostraron
que la cefatoxima, ceftriaxoma y trimetroprim-sulfametaxazol fueron los más
eficaces como bactericidas para las cepas utilizadas, y por ésta razón se
seleccionó a la cefatoxima como antibiótico de referencia para la comparación y
evaluación de la actividad bactericida de cada uno de los extractos.
De las tres bacterias estudiadas, Escherichia coli fue la que mostró mayor
resistencia a la acción de los extractos probados, y sólo el extracto etanólico de
tallo (EEtHRd) y acetato de etilo de tallo (EAcEtRd) mostraron una mínima
actividad bactericida; aunque su acción se incrementó ligeramente cuando
aumentó la concentración del extracto.
Los extractos clorofórmicos (ECIHRd) y acuoso de hoja (EAcHRd) no
mostraron un efecto inhibitorio en ninguna de las distintas concentraciones de
extractos evaluados. Esto explica que los extractos mencionados no contienen. los
metabolitos cumarínicos que fueron detectados en el Extracto de acetato de etilo.
También se estudió la actividad antimicrobiana de diferentes
concentraciones de extracto sobre Salmonella enteritidis En la concentración de
1x105 ufc/ml, el extracto ECIHRd presentó una actividad baja, inhibiendo el
crecimiento bacteriano a la concentración mínima de 32 mg/ml (Fig.17 a), mientras
que a la concentración de 48 mg/ml, el extracto EEtHRd mostró una actividad
regular y presentó una actividad baja a la concentración de 32 mg/ml, siendo ésta
última la mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento bacteriano.
El extracto EAcHRd mostró una alta actividad a partir de la concentración
de 16 mg/ml y presentó una actividad baja a 8 mg/ml correspondiendo ésta a la
mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento de la bacteria. Este
extracto fue el único que presentó una actividad alta hacia Salmorsella enteritidis,
en relación con los demás extractos evaluados. Cuadro 7 (Fig. 17 b).
91
El extracto EAcEtTRd inhibió el crecimiento de la bacteria a las
concentraciones de 1x105 ufc/ml y de ix 106 ufc/ml, presentando una actividad baja
en ambos casos. La mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento
de Salmonella enteritidis fue de 8 mg/ml (Fig. 18).
En la concentración bacteriana: de 1 x 105 ufc/ml, el extracto EAcTRd presentó
una actividad baja, la mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento
de Shigella flexneri fue de 8 mg/ml (Cuadro 8).
La concentración mínima de extracto ECIHRd que inhibió el crecimiento fue
de 16 mg/ml, presentándose una actividad baja para dicho extracto.
El extracto EEtHRd a la cantidad de 48 mg/ml mostró una actividad media,
en 32 y 16 mg/ml presentó una actividad baja; fue ésta última la mínima cantidad
extracto que inhibió el crecimiento de Shigella flexneri.
De 32 mg/ml en adelante, el extracto EAcHRd presentó una actividad alta,
en 16 mg/ml una actividad media y en 8 mg/ml una actividad baja, ésta fue la
mínima que inhibió el crecimiento bacteriano.
El extracto EAcEtTRd presentó actividad antimicrobiana a todas las
concentraciones de bacteria. En la cantidad de 1x105 ufc/ml, EAcEtTRd mostró
una actividad alta en 16 mg/ml en adelante; en 8 y 4 mg/ml mostró una actividad
media. La mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento bacteriano
fue de 1 mg/ml, presentándose una actividad baja a este porcentaje. En la
concentración de 1 x 106 ufc/ml, el extracto mostró una actividad media a 32 mg/ml
en adelante y una actividad baja en 16 mg/ml, ésta fue la mínima cantidad del
extracto en la que se inhibió el crecimiento de Shigella flexneri. En 6 x 106 ufc/ml;
el extracto mostró una actividad media para 16 mg/ml en adelante y presentó una
actividad baja a las concentraciones de 8 y 4 mg/ml, esta última fue la mínima
cantidad de extracto que inhibió el crecimiento de Shigella flexneri (Fig. 21). Los
resultados mostraron que la actividad antimicrobiana de los extractos parece estar
relacionada con la concentración bacteriana. Tal es el caso de EAcTRd, ECIHRd,
EEtHRd y EacHRd, los cuales sólo presentaron actividad (que varió desde una
actividad baja hasta una alta) a la concentración de 1x105 UFC/ml. Sin embargo,
el extracto EAcEtTRd ejerció actividad sobre las bacterias estudiadas en la
92
mayoría de las diferentes concentraciones utilizadas (Fig. 20).
Los extractos EAcEtTRd, EAcTRd y EAcHRd presentaron mayor efectividad
antibacteriana que los extractos ECIHRd y EEtHRd. El efecto de los extractos en
la disminución del crecimiento bacteriano de Shigella flexneri (Fig. 21).
5.1.3. Método de dilución en caldo
El efecto de los extractos sobre el crecimiento de las bacterias se aprecia
claramente en las figuras 22, 23 y 24; éstas presentan las densidades ópticas
dadas por los controles (bacterias sin extractos) y las densidades ópticas de las
bacterias bajo la influencia de los extractos. A partir de estos datos se tomó como
punto inicial la densidad óptica de la bacteria control.
La acción bactericida de los extractos sobre la reducción de crecimiento
bacteriano fue medido en términos de densidad óptica y analizado
estadísticamente por el método de Tukey.
Escherichia coli
Para el extracto acuoso de hoja (EAcHRd) a la concentración de 48 mg/ml
empezó a observarse una inhibición para Escherichia coli que aumentó a la
concentración de 80 mg/ml, aun teniendo una considerable concentración de 6 x
106 UF/ml de bacterias (Fig. 25).
Extracto etanólico de hoja en 48 mg/ml presentó una buena actividad
inhibitoria para Escherichia coli a la concentración de 6 x 106 UFC/ml; ésta acción
bactericida se presentó en las tres concentraciones de bacterias (1x105, 1x106 y
6x106 UFC/ml) (Fig. 26).
El extracto Acetato de etilo de tallo mostró también una buena acción
bactericida a la concentración de 16 y 32 mg/ml de extracto para 1x105 y 1x106
UFC/ml, en concentración de bacterias. Sin embargo, al aumentar el número de
bacterias, este extracto perdió su poder inhibitorio (Fig. 27).
El extracto acuoso de tallo de Rhoeo díscolor L. Hér Hance es el de menor
acción bactericida y sólo se observó ligera acción inhibitoria cuando tuvo
93
concentraciones de bacterias de 1x105 y 1x106 UFC/ml; sin embargo, la
concentración de 6x106 no presentó acción inhibitoria aun aumentando la 80mg/ml
de extracto (Fig. 28). En ésta gráfica se observan valores de densidad óptica muy
alta debido a que el extracto acuoso extrajo una cantidad de metabolitos como
carbohidratos, ácidos orgánicos, sales inorgánicas que alteran la densidad óptica
(Fig. 28).
En general, la acción inhibitoria de los extractos de Rhoeo discolor L. Hér
Hance para el tratamiento de Escherichia coli fue mejor el etanólico de hoja,
aunque estuvo en el límite de la acción inhibitoria. Sin embargo, por este motivo
no es recomendable para el tratamiento de infecciones por Escherichia coli (Fig.
29).
Salmonella enteritidis
Para el extracto acuso de hoja de Rhoeo discolor L. Hér Hance se observó
que en la concentración de 16 mg/ml mostró muy buena inhibición para
Salmonella enteritidis y aún aumentando la concentración de bacterias 1x106 y
6x106 UFC /ml conservó su poder inhibitorio. Sin embargo, este mismo extracto
presentó regularidades en su valoración -de densidad óptica cuando aumentó la
concentración de bacterias. Posiblemente debido -como ya se había comentado
anteriormente- a la extracción de metabolitos muy polares (Fig. 31).
Salmonella enteritidis empezó a mostrar inhibición en la concentración de 16
mg/ml de extracto etanólico de hoja; sin embargo, fue mucho mejor a partir de 32
mg/ml, cuando tuvo una concentración de bacterias de 1x106 UFC/ml y conservó
su acción bactericida en la concentración de 6x106 UFC/ml (Fig. 31). El extracto
acuoso de tallo no presenta acción bactericida en ninguna de las concentraciones
de los extractos (Fig. 32).
En general, se puede apreciar en la figura que el único extracto con una
posible acción bactericida es el extracto acuoso de hoja. En esta misma figura se
observa el nulo efecto inhibitorio de los extractos (Fig. 32).
94
Shigella flexneri
De las tres bacterias patógenas analizadas por el método de difusión en
caldo Shigella flexneri fue la más sensible a la acción de los extractos empleados
de Rhoeo discolor L. Hér Hance, y la prueba de Tukey demostró que el extracto
etanólico de hoja tuvo mayor poder de inhibición seguido del extracto acuoso de
hoja. Sin embargo, el extracto acuoso de tallo no presentó ninguna acción
bactericida, posiblemente porque la densidad óptica determinada para este
extracto fue alterada por la presencia de otros metabolitos ya comentados
anteriormente (Figs. 33 y 34). Los resultados en cuanto a inhibición por el método
de difusión en caldo son parecidos pero no iguales a los resultados obtenidos por
el método de difusión en disco.
5.1.4. Proceso de extracción e identificación de metabolitos
La extracción en condiciones de maceración y la separación de metabolitos,
utilizando disolventes de polaridad media e incrementando la misma (Dreyer,
1966; Steck y Bailey, 1969) fue muy eficiente, ya que el extracto virgen de esta
planta presentó gran cantidad de metabolitos secundarios, algunos muy
característicos como clorofilas y carotenos (Fig. 35 a), identificables en el espectro
visible; sin embargo, cuando se reveló el cromatofolio con solución de cloruro de
cobalto, se identificaron otros metabolitos como terpenos y esteroles (Fig. 35 b).
La identificación de cumarinas o compuestos relacionados se realizó
basándose en las propiedades físicas que presentan estos compuestos. La
presencia de dobles enlaces conjugados con anillos lactónicos y. aromáticos le
confieren fluorescencia a esos metabolitos (Horhammer et al., 1966; Nielsen,
1971).
El cromatofolio de sílica gel conteniendo el extracto virgen reveló dos
manchas fluorescentes e intensas de color blanco amarillentas con valor de Rf =
0.42 y 0.54; esas manchas fluorescentes son producidas por la presencia de
95
compuestos de tipo cumarínico (Fig. 36). También en esa misma placa se detectó
la presencia de otro compuesto fluorescente de Rf = 0.90, pero éste fue
identificado como un compuesto insaturado de tipo "aceite". La separación de
compuestos cumarínicos utilizando el método cromatográfico en sílica gel en capa
fina y en columna fue muy eficiente para el extracto.
5.1.5. Elucidación del compuesto EAcEtC1
Este compuesto fue disuelto en deuterocloroformo y analizado por
resonancia magnética nuclear de hidrógeno a 270 mz. Analizando el espectro de
RMN1H del compuesto EAcEtC1 se comprobó que se trataba de un compuesto de
tipo estero) que ya había sido identificado en la cromatografía de capa fina y en la
cromatografía de gases. La señal múltiple a 3.5 ppm es característica del
hidrógeno en el carbono número 3; la señal doble en 5.35 ppm es originada por la
interacción del hidrógeno del carbono número 6 con los hidrógenos del carbono
número, 7, la señal múltiple en 5.10 ppm es producida por los dos hidrógenos del
doble enlace en los carbonos números 22 y 23. Los cuatro grupos de señales
múltiples de 2.25 a 1.5 ppm son muy característicos para hidrógenos metilenos de
ciclos de esteroles o terpenoides y las señales intensas de 1 a 0.70 ppm son
producidas por hidrógenos de metilos en estructuras cíclicas.
Comparando el espectro que se obtuvo con los reportados en la literatura
química (Pouchert, 1993), así como el valor de las constantes químicas y sus
desplazamientos, se pudo inferir que dicho compuesto aislado correspondía a la
estructura del estigmasterol. Sin embargo, para tener mayor seguridad en los
resultados, se realizaron pruebas comparativas con el patrón de estigmasterol,
confirmando así la veracidad de la estructura propuesta por Nakanishi et al.,
(1974) misma que se presenta en la Fig. 38.
96
5.1.6. Elucidación del compuesto EAcEtC2
El compuesto EAcEtC2 analizado por cromatografía en capa fina presentó
fluorescencia intensa a la luz ultravioleta; esta característica indicaba que se
trataba de un compuesto con fuertes densidades electrónicas, además, por el
resultado de su Rf (Resultantes de fuerzas), se comprobó que presentaba fuerte
polaridad y su espectro de infrarrojo mostró una banda ancha e intensa en 3300
cm-1 debido a la presencia de varios grupos hidroxilos y dos bandas en 1600 y
1700 cm-1, producidas por anillos lactónicos en su estructura. Por estos resultados
se pensó. en un principio que se trataba de una hidroxicumarina con un grupo
aldehído en el carbono número 4 (Fig. 40).
Sin embargo, el espectro de masas de este compuesto mostró un ión
molecular de 208 m/z (Fig. 39) y la cumarina propuesta que aparece en la Fig. 51
tendría un ión molecular teórico de 190 m/z (Anexo 4). El espectro de RMN1H de
este compuesto mostraba la presencia de un hidrógeno en un anillo lactónico (H
3), tres hidrógenos de un anillo aromático (H 5, 6 y 8) y una señal ancha en 8.5
ppm que podría ser el hidrógeno del grupo aldehído unido al carbono número 4
(Fig. 41). Ante esta diferencia entre los resultados del espectro de masas y los de
resonancia magnética nuclear de hidrógeno, se procedió a realizar reacciones
químicas al compuesto problema para transformar su estructura. Primeramente se
sometió a reacción de acetilación y dio como resultado un compuesto acetilado
que por espectroscopía infrarroja se comprobó la eliminación de los grupos
hidroxilos de la estructura y la formación de los grupos acetilos (desaparición de la
banda ancha en 3300 cm-1) (Fig. 44). El espectro de masas también reveló un
incremento en el ión molecular de 208 m/z a 334 m/z, una diferencia de 126
unidades, lo que comprobó el incremento de tres grupos acetilos (formados en la
reacción), con 42 unidades por cada grupo acetilo (Fig. 44) (Anexo 7).
Esto demostró que el compuesto tenía tres grupos hidroxilos y no sólo uno
como lo propuesto en la estructura cumarínica (Anexo 4). Este hecho fue
comprobado por el espectro de RMN1 H del compuesto acetilado (Fig. 45). En él
se muestra en 2.18 ppm una señal simple que es ocasionada por los tres
97
hidrógenos de un grupo acetilo y en 2.35 ppm una señal intensa simple,
ocasionadas por seis hidrógenos de dos grupos acetilos. En este espectro ya no
se observan las señales anchas de los grupos hidroxilos del compuesto original.
Sin embargo, para asegurar con mayor veracidad la presencia de los tres grupos
hidroxilos en la estructura original, se procedió a realizar otra reacción química,
esto es, el compuesto problema (EAcEtC2) fue sometido a reacción de metilación.
El resultado de esta reacción comprobó la presencia de tres grupos hidroxilos. El
espectro de masas del compuesto metilado dio un ión molecular de 250 m/z y un
ión de fragmentación de 134 m/z, es decir, un incremento de 42 unidades con
respecto del compuesto original. Como se conoce que cada grupo metilo nuevo
incrementa en la estructura 14 unidades, entonces la diferencia de 42 unidades
indicó la metilación de tres grupos hidroxilos (Fig. 46) (Anexo 6).
También el espectro de RMN1H comprobó la presencia de tres grupos
hidroxilos metilados (grupos metoxilos), ya que la señal intensa en 3.55 ppm es
producida por un grupo metoxilo y la señal doble intensa en 3.95 ppm indicaba la
presencia de dos grupos metoxilos en la estructura. Con estos resultados se
comprobó que .,el compuesto problema analizado no presentaba la estructura de
una cumarina, pero se trataba de una furanona (derivado de cumarina) (Fig. 47).
Existe la posibilidad de que la furanona se formó por la degradación de una
cumarina, como se muestra en la reacción de la Fig. .49
Figura 49. Conversión de la estructura de cumarina a furanona.
98
Existe evidencia de que algunos ..compuestos de tipo cumarínicos se
descomponen cuando están en solución y expuestos al luz. Sin embargo, la
furanona también podría ser producto de reacción de biogénesis en la planta.
Con respecto de esta estructura, el espectro de 1H RMN de la furanona
mostró una señal doble en 6.93 ppm que se asigna al protón (hidrógeno)
localizado en el carbon número 6' (H-6'), con una constante de acoplamiento
(J=8.3 Hz) cuyo valor permite concluir que tiene un hidrógeno en posición orto.
Este hidrógeno (H-6') muestra un acoplamiento con el hidrógeno H-3 'en
posición para, cuyo valor, es menor a 1HZ, por lo que no se logra observar en el
espectro. Asimismo, en 7.25 ppm se observó una señal doble de dobles que se
asigna al protón H-5' y que es debida al acoplamiento en meta (J=2.1 Hz) con H-3'
y además se logra observar la constante de acoplamiento (J) orto (J=8.3 Hz) por
su interacción con H-6'. En este mismo espectro, aproximadamente en 7.33 ppm,
está una señal doble asignada a H-3' debido al acoplamiento meta con H-5
Aproximadamente en 6.30 ppm mostró una señal simple que por el valor de su
integral corresponde a un protón (H) y se asigna al hidrógeno en posición número
3, y por lo tanto, al protón vinílico que se cree que está desplazado a campo bajo
por la influencia del grupo carbonilo vecino a él. En 6.53 ppm, se observó también
una señal simple que integra para protón y corresponde a H-5, que se encuentra
unido a un carbono que soporta a su vez a un grupo hidroxilo, por lo que se
desplaza a campo bajo. La señal simple localizada a 3.00 ppm -que se presenta
en el espectro de la (Fig. 42)- se ha asignado a los protones pertenecientes a los
grupos hidroxilos presentes en la molécula.
Así, por toda la información obtenida por 'H RMN, se propone la estructura
de un metabolito secundario que presenta un anillo lactónico y un anillo bencénico
trisustituídos con tres grupos hidroxilos.
La evidencia espectroscópica está de acuerdo con un anillo de furano α, β
insaturado que soporta un anillo bencénico disustituído por grupos hidroxilos,
como se establece por las reacciones de acetilación y mutilación (Anexo 8).
99
Es recomendable realizar más pruebas de actividad antimicrobiana
utilizando otros microorganismos patógenos, principalmente con Helicobacter
pilory, que es el causante de gran mayoría de enfermedades de tipo gástrico, así
también, se sugiere realizar las pruebas antimicrobianas con cada uno de los
metabolitos aislados de esta planta. Desde el punto de vista fitoquímico, queda por
aislar e identificar estructuralmente otro compuesto flavónico que se localiza en el
extracto de acetato de etilo.
Actualmente se encuentra desarrollandose el proceso de formación de
nuevos derivados al compuesto cumarínico y la obtención de cristales óptimos
para la elucidación estereoquímica por el método de rayos x.
100
VI. CONCLUSIONES
1. El estudio microbiológico mostró que los extractos de acetato de etilo de la
planta R. discolor presentaron mayor efecto inhibitorio en el crecimiento de
Salmonella enteritidis y Shigella flexneri.
2. La bacteria más resistente a la acción de los extractos fue Escherichia coli.
3. La bacteria más sensible a la acción bactericida de los extractos fue Shigella
flexneri.
4. En el proceso fitoquímico se lograron aislar e identificar estructuralmente dos
compuestos esteroidales y un compuesto cumarínico.
5. Las estructuras de los compuestos esteroidales correspondieron a β-sitosterol y
a estigmasterol.
6. La estructura real del compuesto cumarínico fue 4-(2,4-dihidroxi-fenil)-5H-furan-
2-ona y resultó ser un compuesto nuevo de mucho interés químico.
101
VII. LITERATURA CITADA
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117
VIII. ANEXOS
Anexo 1
Localización de las infecciones producidas por las enterobacterias
118
Anexo 2
Método de difusión en disco
119
Anexo 3
Método de dilución en caldo
120
Anexo 4
Estructura y cálculo del peso molecular monohidroxilado del cumarínico
121
Anexo 5
Estructura y cálculo del peso molecular del compuesto furanona
122
Anexo 6
Estructura y cálculo del peso molecular de la furanona metilada
123
Anexo 7
Estructura y cálculo del peso molecular de la furanona acetilada
124
Anexo 8
Reacciones de acetilación y metilación del compuesto furanona que
comprueban la presencia de tres grupos hidroxilos.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL I.P.N.
Abril 29, 2003.
DR: SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA UNIVERSIDAD DE COLIMA PRESENTE:
Por medio de la presente me permito informar a usted que he revisado las correcciones del documento de TESIS DOCTORAL del C. M.C. MIGUEL ÁNGEL DOMÍNGUEZ ORTIZ, que lleva como título "ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Rhoeo discolor L. Hér Hanca) y considero que ya se realizaron las recomendaciones hechas durante su Examen Predoctoral, por lo que expreso a usted mi aprobación para que se imprima y pueda continuar los trámites académicos, necesarios para que sustente su examen doctoral.
Sin otro particular, agradezco la distinción y la oportunidad brindada y me permito enviar un cordial saludo.
ATENTAMENTE
c.c.p. Ing. Rodolfo V. Morentín. Director de la FCBA. c.c.p. Interesado c.c.p. Archivo
Av. Instituto Politécnico Nacional 2508 Col. San Pedro Zacateado México, D.F. C. P. 07360 Tels. 57-47-39-00 Fax: 57-47-70-02
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
Asunto: Aprobación de tesis de Doctorado.
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA
COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
P R E S E N T E.
De la manera más atenta me permito comunicarle que he concluido con la revisión del Informe en Extenso de los estudios de Doctorado en Ciencias del C. Miguel Ángel Domínguez Ortiz, titulado "ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Rhoeo discolor L. Hér Hance)". Luego de su segunda revisión he encontrado que el documento reúne los requisitos necesarios, tanto en su contenido como en su forma. Por lo anterior, deseo expresarle mi aceptación para su impresión final.
Agradezco la oportunidad brindada para fungir como revisor de este documento, a la vez que ratifico mi firme deseo de continuar contribuyendo en la formación de recursos humanos altamente calificados y con carácter independiente.
Sin otro particular, aprovecho la presente para enviarle un cordial saludo.
C.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2. C.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Director de la FCBA. C.c.p. Interesado. C.c.p. Archivo.
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
Asunto: Aprobación de tesis de Doctorado.
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA
COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA P R E S E N T E.
De la manera más atenta me permito comunicarle que he concluido con la revisión del Informe en Extenso de los estudios de Doctorado en Ciencias del C. Miguel Ángel Domínguez Ortíz, titulado "ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Rhoeo discolor L. Hér Hance)". Luego de su segunda revisión he encontrado que el documento reúne los requisitos necesarios, tanto en su contenido como en su forma. Por lo anterior, deseo expresarle mi aceptación para su impresión final.
Agradezco la oportunidad brindada para fungir como revisor de este documento, a la vez que ratifico mi firme deseo de continuar contribuyendo en la formación de recursos humanos altamente calificados y con carácter independiente.
Sin otro particular, aprovecho la presente para enviarle un cordial saludo.
C.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2. C.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Director de la FCBA. C.c.p. Interesado. C.c.p. Archivo.
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA RESPONSABLE DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS PRESENTE
Por este conducto, hago de su conocimiento que después de haber revisado el borrador de tesis de doctorado titulado "Elucidación estructural y actividad antimicrobiana de los metabolitos presentes en maguey morado (Rhoeo discolor L., Hér Hance)", que presenta el C. Miguel Angel Domínguez Ortiz, considero que reúne los elementos suficientes de contenido y forma de un documento de doctorado en ciencias. Por lo que expreso mi aprobación para que se sigan los tramites académicos que correspondan.
Sin otro particular, me despido de usted.
c.c.p. Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado.- Director de la F:C:B:A: c. c. p. Interesado c.c.p. Archivo personal
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE COLIMA PRESENTE:
Por medio de la presente me permito informar a usted que he revisado las correcciones del documento de TESIS DOCTORAL del C. M.C. MIGUEL ANGEL DOMÍNGUEZ ORTIZ, que lleva como título "ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Rhoeo discolor L. Hér Hance", debido a que ya se realizaron las recomendaciones hechas durante su Examen Predoctoral, expreso a usted mi aprobación para que se imprima y pueda seguir con los trámites académicos, necesarios para que sustente su examen doctoral.
Sin otro particular por el momento, agradezco la distinción y la oportunidad brindada, para la lectura del anterior documento y me permito enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
Tecomán, Col. 28 de Abril de 2003
ccp. Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado. Director de la FCBA. ccp. Interesado ccp. Archivo.
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR PROGRAMA DE POSGRADO DE LA FCBA. P R E S E N T E.
Por este conducto informo a usted que he revisado y evaluado el trabajo de Informe Final de investigación de Doctor en Ciencias: Área Biotecnología, titulada, "Elucidación estructural y actividad antimicrobiana de los metabolitos presentes en maguey morado (Rhoeo discolor L. Her Hance)"; dicho documento lo presenta el C. Miguel Ángel Domínguez Ortiz, alumno del programa de Doctorado en Ciencias de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima; en la cual se han incluido, de manera satisfactoria, todas y cada una de las observaciones que hice al borrador de la misma.
Por la razón antes expuesta, considero que este documento reúne las atributos necesarios para su impresión como Tesis de Doctor en Ciencias.
Agradezco la amabilidad de sus atenciones por haberme distinguido como revisor de este documento y sin más por el momento me reitero a sus respetables órdenes.
c.c.p.- Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de la FCBA. c.c.p.- Interesado. c.c.p.- Archivo
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
Asunto: Aprobación de tesis de Doctorado.
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA P R E S E N T E.
De la manera más atenta me permito comunicarle que he concluido con la revisión del Informe en Extenso de los estudios de Doctorado en Ciencias del C. Miguel Ángel Domínguez Ortíz, titulado "ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN MAGUEY MORADO (Rhoeo discolor L. Hér Hance)". Luego de su segunda revisión he encontrado que el documento reúne los requisitos necesarios, tanto en su contenido como en su forma. Por lo anterior, deseo expresarle mi aceptación para su impresión final.
Agradezco la oportunidad brindada para fungir como revisor de este documento, a la vez que ratifico mi firme deseo de continuar contribuyendo en la formación de recursos humanos altamente calificados y con carácter independiente.
Sin otro particular, aprovecho la presente para enviarle un cordial saludo.
C.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado - Regional No. 2. C.c.p. ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Director de la FCBA. C.c.p. Interesado. C.c.p. Archivo.
