UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE …digeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/ROJAS_LARIOS_FABIAN.pdf ·...
Transcript of UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE …digeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/ROJAS_LARIOS_FABIAN.pdf ·...
UNIVERSIDAD
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
IDENTIFICACIÓN DE GENES RESPONSABLES DE
RESISTENCIA A CARBAPENÉMICOS EN CEPAS
NOSOCOMIALES DE Pseudomonas aeruginosa
AISLADAS EN ALGUNOS HOSPITALES DE MÉXICO
Tesis para obtener el grado de
Maestro en Ciencia Médicas:
Fabián Rojas Larios.
Asesores:
D en C. Oscar A. Newton Sánchez.
Facultad de Medicina
Universidad de Colima
M en C. Gerardo Martínez Aguilar.
Unidad Biomédicas del Instituto Mexicano del Seguro Social, Durango,
Durango.
Colima, Col. febrero de 2009
ÍNDICE
Página
Resumen 1
Sumario 2
Introducción 3
Antecedentes 6
Infecciones nosocomiales 6
Pseudomonas aeruginosa 8
Antibióticos β-lactámicos 10
β-lactamasas 11
Metalo- β-lactamasas (MBLs) 13
Identificación del fenotipo a metalo-β-lactamasas 18
Justificación 21
Pregunta de investigación 22
Objetivo general 22
Objetivos específicos 22
Material y Métodos 23
Periodo de estudio 23
Tipo de estudio 23
Universo de estudio 23
Tamaño de la muestra 23
Criterios de selección 24
Variables 25
Identificación de Pseudomonas aeruginosa 25
Prueba de susceptibilidad a carbapenémicos 26
Identificación fenotipo a metalo-β-lactamasas 26
Extracción del DNA bacteriano 27
Identificación del os genes MBLs a través de la
reacción de la cadena de polimerasa (PCR)
27
Análisis estadístico 30
Aspectos éticos 30
Resultados 31
Discusión 39
Conclusiones 44
Perspectivas 44
Glosario 45
Anexos 47
Anexo 1: Tinción de gram 48
Anexo 2: Pruebas bioquímicas 49
Anexo 3: Susceptibilidad a diversos antibióticos 52
Anexo 4: Determinación de fenotípica de metalo-β-
lactamasas
53
Anexo 5: Extracción de DNA 55
Anexo 6: Identificación de genes MBLs 57
Bibliografía 59
Agradecimientos 67
ÌNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Identificación fenotípica de MBLs 20
Figura 2. Plan de trabajo 29
Figura 3. Cepas de P. aeruginosa aislada por servicio hospitalario 31
Figura 4. Interpretación fenotípica de metalo-β-lactamasas a través de la
técnica de doble disco
32
Figura 5. interpretación feotípica de metalo-β-lactamasas a través de la
técnica de E-test
33
Figura 6. Identificación de gen IMP-1 e IMP-2 en muestras procedentes de
los hospitales de Colima, Guadalajara y Durango.
34
Figura 7. Identificación de gen VIM-1 y VIM-2 en muestras procedentes de
los hospitales de Colima, Guadalajara y Durango
34
Figura 8. Comparación de la frecuencia de cepas multiresistentes entre los
diferentes hospitales participantes
38
Figura 9. P. aeruginosa con presencia de MBLs por medio de técnica de
triple disco
53
Figura 10. Estructura de la tira E-test 53
Figura 11. Método de interpretación de E-test 54
Figura 12. Componentes del kit Ultra Clean para extracción de DNA en
bacterias
55
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Comparación de los diferentes métodos para la identificación
fenotípica de MBLs
19
Tabla 2. Indicadores para la identificación de MBLs en cepas de
Pseudomonas aeruginosa
28
Tabla 3. Patrones de sensibilidad a diversos antibiótico en cepas de
Pseudomonas aeruginosa en los hospitales de Colima, Durango y
Guadalajara
32
Tabla 4. Distribución de los genes de MBLs respecto a la ciudad de
procedencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos
35
Tabla 5. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de P.
aeruginosa del HRU en Colima
35
Tabla 6. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de P.
aeruginosa de Hospital General de Durango
36
Tabla 7. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de P.
aerugionsa de CMO en Guadalajara
36
Tabla 8. Comparación de los antibióticos entre cada uno de los hospitales
participantes
37
DEDICATORIA
A las personas que durante estos dos años se han ido,
los que están presentes
y por los que aún tienen que llegar.
A mis asesores:
Gracias Dr. Newton, Dr. Martínez, Dr. Tinoco y Dr. Villaseñor por su confianza, apoyo
incondicional y enseñarme a dar lo máximo en esta profesión. Todo mi respeto y
admiración.
Esperanza y Fabiola:
Gracias familia por estar ahí, por su amor, compresión, consejo, darme el aliento en
seguir. Y enseñarme a que los retos en la vida se logran a base de honestidad, fe,
esperanza y dedicación.
Amigos:
Por permitirme trabajar y aprender con ustedes, por todos lo buenos y malos momentos
que vivimos dentro y fuera del laboratorio y por estar ahí cuando los necesite. Para
aquellos nuevos amigos que hice durante esta aventura llamada maestría gracias por
todo y una disculpa para aquellas personas que descuide o deje abandonados por seguir
este sueño, pero que siempre las llevo en el pensamiento.
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología:
Agradezco la beca brindada durante este periodo de formación
1
RESUMEN
Antecedentes: El desarrollo de resistencia y la aparición de cepas de P. aeruginosa
portadoras de metallo-β-lacatamasas (MBLs) son un problema de salud pública.
Objetivo: Identificar los genes responsables de la resistencia a carbapenémicos en
cepas nosocomiales de P. aeruginosa aisladas en algunos hospitales de México.
Metodología: estudio descriptivo multicéntrico transversal, realizado con cepas de P.
aeruginosa procedentes de hospitales de Colima, Durango y Guadalajara del 2007 a
2008. La identificación se las cepas se realizó con técnicas convencionales de
microbiología; el perfil de susceptibilidad a antibióticos se realizó por Kiby-Bauer de
acuerdo a las recomendaciones del CLSI (Clincal Laboratory Standars Institute). El
fenotipo de resistencia a MBLs se determinó por E-test y doble disco de Hodge y se
confirmó mediante la identificación de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-
1 por reacción en cadena de la polimerasa (PRC). Se utilizaron cepas de P. aeruginosa
productoras de VIM, IMP y ATCC 27853 como control de calidad.
Resultados: Se obtuvieron 253 cepas, 14 se excluyeron, analizándose un total de 239.
El 37% fueron de Guadalajara, 33% de Durango y 30% de Colima. Setenta cepas (29%)
fueron resistentes a carbapenémicos, y en 40 de ellas se encontraron genes MBLs; 25
cepas tuvieron un solo gen (IMP-1, VIM-1, VIM-2), 13 cepas dos genes (VIM-1+IMP-
2, VIM-1+VIM-2, IMP-1+VIM-2, IMP-1+VIM-1) y 2 cepas tres genes (IMP-1+VIM-
1+VIM-2).
Conclusiones: La prevalencia de resistencia a carbapenémicos y la presencia de genes
de MBLs en P. aeruginosas es semejante a la de países europeos y superior a la
reportada en el continente americano. La presencia de cepas con más de un gen de
resistencia es un hallazgo relevante.
Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, infección nosocomial, carbapenémico,
metalo-β-lactamasas, antibiótico, mecanismos de resistencia, multiresistencia.
2
SUMMARY
Background: The development of antibiotic resistance and emergence of metallo-β-
lactamase (MBLs) carrying strains of P. aeruginosa are a public health problem.
Objective: Identify the genes responsible for carbapenem resistance in nosocomial
strains of P. aeruginosa isolated in some Mexican hospitals.
Methods: A multicenter, descriptive, cross-sectional study performed with strains of P.
aeruginosa obtained in hospitals in Colima, Durango and Guadalajara from 2007 to
2008. Conventional microbiology techniques were employed for strain identification.
In accordance with the CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), the Kirby-Bauer
technique was used to obtain the antibiotic susceptibility pattern. The MBLs resistant
phenotype was determined by E-test and Hodge double disk test. Results were
confirmed by positive identification of IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 and SPM-1 genes
with PCR testing. VIM and IMP producing P. aeruginosa strains as well as ATCC
27853 were used for quality control.
Results: In total, 253 strains were obtained, of which 14 strains were excluded for a
final total of 249 strains. Thirty seven (37%) percent were obtained in Guadalajara,
33% in Durango and 30% in Colima. Seventy strains (29%) were resistant to
carbapenems and MBLs genes were found in 40 strains, of which 25 strains had only
one gene (IMP-1, VIM-1, VIM-2), 13 strains had two genes (VIM-1 +IMP-2, VIM-
1+VIM-2, IMP-1+VIM-2, IMP-1+VIM-1) and 2 strains had three genes (IMP-1+VIM-
1+VIM-2).
Conclusions: The prevalence of carbapenem resistance and the presence of MBLs
genes in P. aeruginosa are similar to those found in European countries and higher than
that reported on the American continent. The presence of strains containing more than
one resistant gene is a relevant finding.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, nosocomial infection, carbapenems, metallo-β-
lactamase, antibiotic, resistance mechanisms, multidrug resistance.
3
INTRODUCCIÓN
En el grupo heterogéneo de bacterias gram negativas y de mayor importancia médica se
encuentra la familia de Enterobacteriaceae, en donde algunos géneros de esta familia
son patógenos intestinales importantes (Shigella sp, Salmonella sp, Yersinia sp) y varios
son únicamente colonizadores normales del sistema gastrointestinal del ser humano
(Escherichia sp, Enterobacter sp, Klebsiella sp). La localización extraintestinal de las
Enterobacteriaceae generalmente provoca una amplia gama de procesos infecciosos,
particularmente en el sistema genitourinario. Los individuos con alteración de sus
barreras anatómicas normales con frecuencia son afectados por estas bacterias,
ocasionando infecciones tales como: neumonía, septicemia, meningitis o infecciones de
piel y tejidos blandos. Los pacientes hospitalizados, son particularmente susceptibles a
la colonización y en algunos casos infección por Enterobacteriaceae, de modo que estos
microorganismos se encuentran considerados entre las principales causas de infección
intrahospitalaria. (Eisentein, 2000)
Las Enterobacteriaceae constituyen aproximadamente 80% de los aislamientos de
bacterias gram negativas en el laboratorio de microbiología clínica y alrededor del 50%
de los aislamientos de importancia clínica, la mayoría de ellos de origen
intrahospitalario. (Eisentein, 2000)
A finales de 1989, la Organización Panamericana de la Salud conjuntamente con la
Sociedad de Epidemiología Hospitalaria de Estados Unidos de América (EUA), realizó
una conferencia regional sobre prevención y control de infecciones nosocomiales (IN).
Los objetivos de dicha conferencia fueron implementar normas e instrumentos
homogéneos, para la prevención y control de IN. El objetivo fundamental por el cual se
instituyó el control de las IN fue garantizar la calidad de la atención médica.(NOM-EM-002-
SSA2-2003; NOM-026-SSA2-1998)
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana de Emergencia NOM-EM-002-SSA2-2003 se
define a la IN como la multiplicación de un organismo parasitario dentro del cuerpo y
que puede presentar o no sintomatología; y el cual fue adquirido durante la
4
hospitalización del paciente. Tomando en cuenta el periodo de incubación que pueden
aparecer de 48 a 72 horas de su ingreso.(NOM-EM-002-SSA2-2003) Aunque se debe tomar en
cuenta que cada hospital debe de tener su programa de prevención y control de IN el
cual está regido por la NOM-026-SSA2-1998, en donde se promueve la vigilancia
epidemiológica para la detección oportuna de las IN a través de sistemas de trabajo
multidisciplinario y que permita el manejo ágil y eficiente de la información necesaria
para la prevención y el control de las IN.( NOM-026-SSA2-1998)
Las IN son un problema grave de salud pública, con frecuencias que varían entre 2-18%
dependiendo del tipo de hospital. Repercuten en forma importante en la morbilidad y
mortalidad e incrementan los días de estancia hospitalaria, el número de estudios de
laboratorio, de gabinete y otros procedimientos con el consecuente incremento de los
costos. En EUA se reporta que cada año mueren 62,000 pacientes por IN.(Velazco, 2001)
Estudios multicéntricos sobre infecciones hospitalarias indican que las enterobacterias
como Klebsiella sp, E. coli, Enterobacter sp y Pseudomonas sp son las más frecuentes
entre las bacterias gram negativas, y Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis así como otros Staphylococcus coagulasa negativo predominan entre los
gram positivos.(Domínguez, 2005)
En el 2002 en EUA, The Centers for Disease Control and Prevention (Los Centros de
Control y Prevención de Infecciones) (CDC) estimó que el 5% de los pacientes
hospitalizados padecerían un infección nosocomial con un costo anual de 4.5 billones de
dólares para el país. (Haag, 2002)
En los últimos 20 años, a nivel mundial, P. aeruginosa ha sido una de las bacterias que
con mayor frecuencia causan IN, además desde 1995 la resistencia a carbapenémicos se
ha ido incrementando paulatinamente desde 3% hasta el 38% en diversos lugares tales
como Japón. (Lee, 2002; Kimura, 2005), Colombia (Crespo, 2004; Pagani, 2005) y Corea.(Kim, 2005)
La información sobre la epidemiología de las IN causadas por P. aeruginosa en
hospitales mexicanos es limitada. Se han reportado episodios de infecciones causadas
por este germen en hospitales de tercer nivel con tasas que van desde 4.1 hasta 22.6
episodios por 1000 egresos hospitalarios, en donde los sitios de aislamiento más
5
frecuentes fueron: vías urinarias, cordón umbilical, heridas quirúrgicas, bacteriemias,
venopunción, pulmón, conjuntivas y peritoneo. Las áreas hospitalarias con las tasas más
altas de IN son las unidades de terapia intensiva. (Sifuentes, 1998; Tinoco, 1997)
Entre las infecciones de vías urinarias, Escherichia coli y Candida spp. constituyeron
un 50% del total de microorganismos aislados. De los restantes, Enterococo, Klebsiella
pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa representaron 24.6%. Dentro de las infecciones
de herida quirúrgica, los gérmenes aislados con mayor frecuencia fueron E. coli
(26.1%), Staphylococcus aureus (13.3%), estafilococo coagulasa negativo (11.1%), P.
aeruginosa (9.1%) y Enterobacter cloacae (8.7%) y en las neumonías nosocomiales, P.
aeruginosa fue el patógeno predominante con 35.1% de los aislamientos.(Ponce de León 1999)
,
En nuestro país, se han documentado aislamientos de P. aeruginosa con altos
porcentajes de resistencia a cefalosporinas de tercera generación 65%(Domínguez, 2005) a
carbapenémicos 12%, a aminoglucósidos 21% y a quinolonas 11%. (Pacheco, 2006)
La identificación y clasificación de patógenos nosocomiales a través de la tipificación
molecular es una herramienta importante para los estudios epidemiológicos. (D`Gata, 2006)
La identificación de la huella digital genómica por medio de electroforesis de campos
pulsados, permite identificar las clonas circulantes en los hospitales y seleccionar tipos
representativos de las mismas para corroborar la presencia de los genes productores de
metalo-β-lactamas.
6
ANTECEDENTES
Infecciones nosocomiales
El objetivo primordial de un programa de control de IN es reducir su frecuencia, así
como la morbilidad y la mortalidad asociadas, por medio de la vigilancia continua, el
mejoramiento de las condiciones de atención de los pacientes y la preparación del
personal en materia de prevención y control de infecciones.
Se estima que del total de 35 millones de pacientes que se hospitalizan en EUA, al
menos 2.5 millones desarrollarán una infección nosocomial, es decir, habrá 5.7
infecciones por cada 100 admisiones. En ese país se informan incidencias de
infecciones nosocomiales de 3 al 5%. En América Latina, a pesar de los esfuerzos de los
países por enfrentar este problema, únicamente 5% de los hospitales informan tener
comités con programas regulares de control de infecciones nosocomiales.(Ponce de León,
1999)
La mayoría de los hospitales en la provincia mexicana no cuentan con un programa de
vigilancia y control de IN, por lo tanto la información epidemiológica existente
proviene en su mayoría de instituciones de tercer nivel, cuyas características son muy
diferentes a la mayoría de los hospitales mexicanos, tanto en el tipo de pacientes que se
atienden como en la disponibilidad de recursos. En consecuencia, en hospitales
generales esta información sólo se conoce parcialmente, a través de informes aislados
de programas de vigilancia de algunas instituciones, o bien de brotes de IN. (Tinoco, 1997;
Martínez, 2001)
Los hospitales que han implementado un sistema de vigilancia y control de IN han
logrado reducir sus tasas de incidencia; así como la detección oportuna de brotes, la
identificación de aquellas bacterias que con mayor frecuencia se aíslan en las
infecciones nosocomiales y finalmente la individualización de las áreas de
hospitalización que presentan mayor incidencia. Tal es el caso del Instituto Nacional de
Ciencias Medicas y Nutrición “Salvador Zubirán”, que entre 1982 y 1984 reportó tasas
7
de IN de 19.5 por cada 100 egresos; del 1991 a 1996 Ponce de León y cols. reportaron
8.6% de infecciones nosocomiales por año, traduciéndose en una reducción de la tasa de
IN a un 11.5 por cada 100 egresos. Las áreas de mayor incidencia fueron: terapia
intensiva con una tasa promedio de 26.9 infecciones por 100 egresos, superando hasta
tres veces la tasa promedio de los sectores de hospitalización que fueron de 9.47 a 7.5
infecciones por 100 egresos. Los agentes causales de IN más comunes en vías urinarias
fueron E. coli y Candida sp con el 50%, K. pneumoniae y P. aeruginosa con el 24.6%,
en neumonías por P. aeruginosa se documentó en el 35.1% de los casos. (Ponce de León, 1999)
En el caso de un hospital de segundo nivel como el Hospital General de Durango, desde
1994 Tinoco y cols. implementaron un sistema de vigilancia y control de infecciones
nosocomiales reportándose una tasa de incidencia de 9 por cada 100 egresos,
encontrando las tasas más altas en las unidades de terapia intensiva pediátrica, de
adultos y neonatal, con tasas intermedias en medicina interna y unidad de cuidados
coronarios.(Tinoco, 1997) Para el 2005 la tasa de incidencia de IN se redujo al 2%,
observándose las tasas más altas en las terapias intensivas.
La neumonía y la bacteriemia nosocomial son dos de las IN más frecuentes, la
ventilación mecánica y el uso de catéteres intravenosos, son los principales factores de
riesgo para la adquisición de estas infecciones. La etiología de las neumonías asociadas
a ventilación mecánica en México es poco conocida, en parte por la dificultad para
establecer su diagnóstico, así como por la falta de protocolos específicos de vigilancia
epidemiológica. Las bacterias gram negativas han sido los principales agentes
involucrados, tanto Klebsiella pnemoniae como Pseudomonas sp que se han
identificado como colonizantes en pacientes sometidos a ventilación mecánica en
unidades de cuidados intensivos y en brotes de neumonía nosocomial.(Ponce de León, 1999)
Un buen laboratorio de microbiología que disponga de procedimientos estándar y de
control de calidad incrementa la documentación microbiológica de los episodios de
infecciones nosocomiales y favorece el uso racional de antibióticos. Por ello, la elección
del tratamiento empírico debe basarse en el conocimiento de la microbiología y del
patrón de susceptibilidad propio de cada unidad hospitalaria.(Martínez, 2001)
8
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo móvil, flagelado, aerobio, gram negativo
perteneciente a la familia Pseudomonadaceae. Tiene forma de bastón con un tamaño de
1.5-3 μm. Produce pigmentos fluorescentes difusibles que incluyen pioverdina y un
pigmento fenazínico soluble denominado piocianina; el último, producido por más del
50% de los aislamientos clínicos, aparece azul o verde a pH neutro o alcalino y es el
origen de nombre aeruginosa. Algunas cepas producen también pigmento rojo oscuro o
negro, produce un olor dulzón semejante a jugo de uva o de maíz y es nutricionalmente
versátil. No requiere factores de crecimiento orgánicos y puede utilizar más de 30
compuestos orgánicos para su desarrollo. Es un aerobio obligado, excepto en presencia
de nitrato. (Sanford, 2000; Geo, 2005)
La P. aeruginosa crece bien de 37 a 42° C, su crecimiento a 42° C ayuda a diferenciar a
otras especies de Pseudomonas del grupo fluorescente. No fermenta los carbohidratos,
pero muchas cepas oxidan glucosa. La identificación se basa en la morfología colonial,
prueba de oxidasa y presencia de pigmentos característicos. La diferenciación entre P.
aeruginosa y otras Pseudomonas con base en su actividad bioquímica requiere pruebas
con diversos sustratos.(Geo, 2005)
Pseudomonas aeruginosa produce dos hemolisinas, una es una proteína termolábil
denominada fosfolipasa C y la otra un ramnolípido termoestable. Estas dos sustancias
parecen actuar en forma sinérgica para degradar los lípidos y la lectina. Al igual que las
proteasas, las hemolisinas pueden contribuir a la invasión tisular mediante sus efectos
citotóxicos sobre los tejidos del huésped. Además la fosfolipasa C ejerce un efecto
patológico importante en infecciones del aparato respiratorio inferior por Pseudomonas
mediante la degradación enzimática del componente fosfatidilcolina del surfactante
pulmonar, que conduce a atelectasia. Más aun, los derivados de la fosfatidilcolina
inducen la producción de más fosfolipasa C, reforzando así el efecto de la enzima. La
fosfolipasa C también puede contribuir a la inflamación asociada con la infección por P.
aeruginosa al aumentar la síntesis y liberación de ácido araquidónico. El ramnolípido
puede ejercer un efecto patogénico adicional en las infecciones agudas y crónicas del
tracto respiratorio inferior por Pseudomonas al inhibir el transporte mucociliar y las
funciones ciliares del epitelio respiratorio. En resumen estos factores de virulencia
9
pueden contribuir en la patogenicidad de la P. aeruginosa, incluyendo la formación y
expresión de adesina, endotoxinas y exotoxinas hidrolíticas, que causan destrucción de
los tejidos.
P. aeruginosa se presenta a veces como parte de la flora microbiana normal de los seres
humanos. La prevalencia de colonización en personas sanas fuera de los hospitales o
luego del ingreso a ellos es relativamente baja y se da en sitios húmedos como periné,
axilas y oídos. Las tasas representativas de colonización específica por sitios son piel 0-
2%, mucosa nasal 0-3%, heces 2.6-24%. Por el contrario, la hospitalización puede
conducir a tasas muy altas de colonización, en particular en la piel de pacientes con
quemadura grave, en el aparato respiratorio inferior de pacientes sometidos a
ventilación mecánica, en el aparato gastrointestinal de pacientes que reciben
quimioterapia para enfermedades neoplásicas o prácticamente en cualquier sitio en
personas tratadas con antibióticos de amplio espectro. En cada caso las tasas de
colonización pueden exceder el 50% y la colonización a menudo precede una infección
invasora. (Sanford, 2000)
La P. aeruginosa produce infección en heridas y quemaduras, formando pus color azul
verdoso. Cuando se introduce al sistema nervioso central causa meningitis, cuando la
vía de entrada son catéteres, instrumentos o soluciones irritantes ocasiona infección del
aparto urinario. La infección del aparto respiratorio, en especial por ventiladores
mecánicos contaminados, producen neumonía necrosante. La infección del ojo, puede
conducir a una destrucción rápida de ese órgano, sobre todo cuando se presenta después
de procedimientos o lesiones quirúrgicas. En recién nacidos o personas
inmunocomprometidas, P. aeruginosa puede invadir el torrente sanguíneo y causar
septicemia. En la mayor parte de las infecciones por P. aeruginosa los síntomas y
signos son inespecíficos y se relacionan con el órgano afectado. (Geo, 2005)
P. aeruginosa es uno de los patógenos nosocomiales más frecuente, causante de
infecciones severas, particularmente en pacientes con cáncer, quemaduras y fibrosis
quística. Su tratamiento es complicado debido a que esta bacteria tiene la capacidad de
adaptación, mutación y adquisición de genes de resistencia. Los cuales le confieren
resistencia hacia los β-lactámicos anti-pseudomonas; siendo de mayor trascendencia
clínica los que presentan resistencia hacia los carbapenémicos. En el 2002 en América
10
Latina se reportó un 18% de resistencia a carbapenémicos en cepas de Pseudomonas sp
y Acinetibacter sp; estimándose que el 2% de las P. aeruginosa son productoras de
metalo- β-lactamasas (MBLs).(Crespo, 2004)
Debido a que la P. aeruginosa es uno de lo principales patógenos hospitalarios, se
puede estimar su prevalencia a partir de los datos de vigilancia anual recolectados por el
Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (NNIS) del CDC. Según
estos datos, la incidencia de infecciones por P. aeruginosa en EUA declinó de 4.8/1000
egresos hospitalarios en 1985 a 3.4/1000 en 1991, con un tasa global de infecciones
durante ese periodo de 4 por 1000 egresos, ocupando el cuarto lugar de los patógenos
más frecuentes y constituyó el 10% de todas las infecciones hospitalarias. En 1991, en
USA fue la principal causa de neumonía hospitalaria, la tercera causa de infecciones
hospitalarias en vías urinarias, el quinto en infecciones en heridas quirúrgicas y la
octava en torrente sanguíneo. También es el patógeno asociado con mayor frecuencia
con infecciones en la unidad de cuidados intensivos. Las tasas de mortalidad atribuidas
a infecciones por P. aeruginosa es de aproximadamente el 34%.(Crespo, 2004)
Antibióticos β -lactámicos
Los antibióticos β-lactámicos ejercen su acción por interferencia con la formación de
peptidoglucano, mecanismo compartido por los agentes glucopeptídicos, como la
vancomicina. Los diferentes miembros del gran grupo de los antibióticos β-lactámicos
poseen afinidades distintas para las diversas proteínas fijadoras de penicilina. El
aztreonam no interactúa con las proteínas fijadoras de penicilina de las bacterias gram
positivas, por lo que es el único miembro de este grupo que es ineficaz contra estos
microorganismos. (Peterson, 2005; Wood, 1996)
La actividad bactericida puede requerir la interacción de un antibiótico β-lactámico con
más de una proteína fijadora de penicilina. La saturación de estas proteínas fijadoras no
es esencial y no tiene efecto sobre la sensibilidad microbiana. El efecto de las enzimas
autolíticas también puede ser importante para la actividad bactericida de los antibióticos
β-lactámicos. La otra clase importante de antibióticos que interfiere en forma activa con
la síntesis de la pared celular bacteriana es el grupo glucopeptídico, representado por la
vancomicina y la teicoplanina. (Koneman, 2001; Peterson, 2005; Wood, 1996)
11
A pesar de la gran variedad de mecanismos de resistencia para los antibióticos β-
lactámicos, los más importantes son las β-lactamasas, estas son enzimas capaces de
hidrolizar los anillos β-lactámicos de la penicilina, cefalosporinas y el resto de los
antibióticos inhibiendo su actividad. Hay docenas de β-lactamasas, sin embargo cada
una tiene especificidad por determinado sustrato β-lactámico. El desarrollo de nuevos β-
lactámicos ha surgido en respuesta a la producción de β-lactamasas por las bacterias.
Las cefalosporinas de primera generación son susceptibles a la hidrólisis por diversas β-
lactamasas que frecuentemente se encuentran en bacilos gram negativos, incluyendo las
cefalosporinasas cromosomales de Pseudomonas sp, Enterobacter sp y otros géneros.
También se encuentran presentes β-lactamasas de enterobacterias mediadas por
plásmidos, las cuales también hidrolizan otras penicilinas y a diferencia de las
cefalosporinasas cromosomales, usualmente son inactivadas por inhibidores de β-
lactamasa tales como el ácido clavulánico.(Wood, 1996)
β -lactamasas
Las ß -lactamasas son enzimas con capacidad de hidrolizar el enlace amida del anillo β-
lactámico el cual confiere resistencia a la bacteria y esta es capaz de inactivar a diversos
antibióticos (cefalosporinas, monobactam, carbapenémicos, etcétera). Estas enzimas se
encuentran codificadas en plásmidos lo que les otorga la capacidad de diseminación
entre distintas cepas lo que ha provocado que se hayan difundido a nivel mundial en
pocos años.
Ambler clasificó las β-lactamasas acorde a su estructura molecular en cuatro tipos (A a
la D). La clase A, C y D son las más comunes; la clase B se diferencian por la
producción de metalo-β-lactamasas. Los genes que codifican dicha resistencia son
localizados en el cromosoma bacteriano, los cuales son acarreados por transposones o
están presentes en algunos integrones. Los genes pueden ser identificados en todas las
Enterobacterias, pero en cepas con resistencia a β-lactámicos como E. Coli, Klebsiella
sp y Proteus sp adquieren mayor importancia identificar β-lactamasas de clase A, C y
D, y en Acinetobacter sp y Pseudomonas sp las β-lactamasas de clase B.(Jacoby, 2005)
No se tiene un consenso sobre la definición práctica de las β-lactamasas de espectro
extendido (BLEES); pero comúnmente se manejan los BLEES como las β-lactamasas
12
que confieren resistencia bacteriana hacia las penicilinas, cefalosporinas de primera,
segunda y tercera generación y aztreonam (pero no a carbapenémicos o cefamicinas);
debido a que hidrolizan el antibiótico, este mecanismo puede llegar ha ser inhibido con
el ácido clavulánico. (Jacoby 2005; Koneman, 2001; Peterson, 2005; Piorel, 2001; Shibata, 2003; Walsh, 2005)
Dentro de la clase A, se han identificado β-lactamasas de los tipos TEM, (temoneira) de
los cuales se conocen hasta 130 tipos y SHV (sulfhydryl) donde existen 50 tipos de
enzimas. Los países donde se han identificado cepas de P. aeruginosa con genes de
resistencia son: Francia, Turquía, Italia, Corea, Brasil y Colombia. (Crespo, 2004; Jacoby, 2005;
Peterson, 2005; Wood, 1996)
En la clase C de β-lactamasas, la enzima AmpC, mediada por plásmidos, induce la
resistencia a β-lactámicos y es codificada por genes cromosomales en muchos bacilos
gram negativos. Se han encontrado más de 20 diferentes tipos de β-lactamasas AmpC
en plásmidos, provocando resistencia a cefamicinas, así como a oximino- β-lactámicos,
son resistentes a la inhibición por ácido clavulánico; pero son sensibles a
carbapenémicos, cefalosporinas de cuarta generación y fluoroquinolonas. (Jacoby, 2005;
Thomoson, 2000)
Las β-lactamasas de clase D son poco comunes, se caracteriza por hidrolizar las
oxacilinas y benzilpenicilinas, las cuales se encuentran principalmente en cepas de
Pseudomonas aeruginosa. Los tipos OXA (hidrólisis de oxacilina) se caracterizan por
conferir franca resistencia a cefotaxima y en ocasiones a ceftazidima y aztreonam. Estas
han sido encontradas en cepas de P. aeruginosa de Francia y Turquía, y son
relativamente resistentes a la inhibición por ácido clavulánico. (Crespo, 2004; Jacoby, 2005;
Peterson, 2005)
Las carbapenemasas o metalo-β-lactamasas (MBLs) pertenecen a la clase B y son un
grupo diverso de enzimas representadas por aquellas que hidrolizan imipenem (IMP), de
las cuales se conocen 17 tipos, y fueron identificadas a principios de los años noventas
en Japón en Pseudomonas sp y Acinetobacter sp. La información sobre la circulación de
cepas productoras de MBLs en el mundo aun es limitada, pero en algunos países
europeos, Canadá y Brasil se han reportado de manera creciente este tipo de cepas. Una
segunda familia de MBLs es la enzima imipenemasa veronasa (VIM) debido a que fue
13
en Verona, Italia donde se describió en 1999 identificándose 10 tipos teniendo una
mayor distribución a nivel mundial comparado con MBLs que hidrolizan IMP presente
en varios países de Europa, Sur de América y el este de EUA. Las de más reciente
identificación son la SPM (MBL Sau Pablo) y GIM (imipenemasa Alemania).(Jacoby, 2005;
Suárez, 2006; Walsh, 2005)
Metalo- β-lactamasas (MBLs)
Las metalo-β-lactamasas son capaces de hidrolizar los carbapenémicos. Los reportes de
resistencia varían, pero en consenso general aparecen con mayor frecuencia la
resistencia a β-lactámicos y quinolonas en la familia de Enterobacteriaceae,
Acinectobacter sp, Serratia sp y Pseudomonas sp. (Fritshe, 2005; Walsh, 2005)
Durante los años noventa la adquisición de MBLs provocó la emergencia de resistencia
entre patógenos gram negativos incluyendo Pseudomonas aeruginosa en Japón e Italia.
Estas enzimas, poseen amplias características que les permiten resistir la acción de
inhibidores de β-lactamasas convencionales, permitiendo que estas bacterias sean
resistentes a las β-lactámicos (incluyendo carbapenémicos), reduciendo el repertorio de
agentes antimicrobianos para su tratamiento. Además, los genes MBLs pueden
incorporarse en integrones que determinan diferentes mecanismos por lo que cepas
productoras de MBLs exhiben fenotipos multiresistentes incluyendo a agentes no β-
lactámicos. (Riccio, 2005; Thomson, 2000)
Los carbapenémicos principalmente el imipenem y meropenem son agentes utilizados
para el tratamiento de infecciones por P. aeruginosa multiresistente. La resistencia de
estos antibióticos puede ser de bajo nivel (concentración mínima inhibitoria (CMI)-32
mg/L) determinada por la pérdida de la porina OprD combinada en represión
cromosomal del gen ampC o por sobreexpresión del mecanismo de expulsión activa del
antibiótico, que conduce a una resistencia de alto nivel (CMI-32 mg/L), este último
mecanismo es todavía poco común en P. aeruginosa. (Kim, 2005)
La serina de las carbapenemasas son derivadas de las enzimas de clase A o clase D y
son usualmente mediadas por resistencia a carbapenémicos en Enterobacteriaeae o
Acinetobacter sp. Las enzimas identificadas en Enterobacteriaeae incluyen NmcA,
14
Sme1-3, IMI-1, KPC1-3 y GES-3. A pesar de la avidez de estas enzimas hacia los
carbapenémicos, no siempre confieren altos niveles de resistencia y no todas son
inhibidas por ácido clavulánico. La clase A y D de carbapenemasas son codificadas por
genes que son producidas por la bacteria o codificadas por su cromosoma (algunas
veces asociada a su integrón) o acarreadas por plásmidos. (Walsh, 2005)
Las MBLs fueron formalmente categorizadas por la serina en β-lactamasas en 1980 en
Japón; y en 1989 Bush las clasificó en grupos separados, acorde a sus propiedades
funcionales para quedar referenciada en el sistema general de β-lactamasas. Este
esquema fue inicialmente basado en el perfil de substrato (en particular hidrólisis de
imipenem), con sensibilidad al ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y la falta de
inhibición por los inhibidores de serian β-lactamasa. Este esquema fue actualizado en
1995 y posteriormente modificado en 1997 para acomodarlo en los tres grupos de
enzimas que ha sido clasificado. Solo dos tipos transferibles de MBLs han sido
estudiados, en Bacteroides fragilis CcrA y IMP-1 en P. aeruginosa. El grupo 3a posee
enzimas con actividad de amplio espectro; el grupo 3b posee enzimas con preferencia
hacia los carbapenémicos; el grupo 3c hidroliza pobremente a los carbapenémicos
comparado con otros sustratos de β-lactámicos. Sin embargo, estas enzimas poseen
marcas características que son inhibidas por EDTA, así como agentes quelantes de
cationes divalentes.( Fiett, 2006; Thomsom, 2000; Walsh, 2005)
A nivel molecular, los MBLs son un grupo heterogéneo de proteínas que pueden ser
clasificadas con base en su estructura virtual. Se ha hecho una subclasificación de
enzimas B basadas en la secuencia o por sus características estructurales. El árbol
filogenético indica la relación de unas enzimas con otras a través de la secuencias de
nucleótidos. Las relacionadas con la clase B1 son enzimas que poseen una unión de zinc
coordinada por tres histidinas y una cisteina acomodadas por transferencia en los MBLs
como: IMP, VIM, GIM y SPM-1 pero tienen una actividad marginal de β-lactamasas
AmpC. La clase B2 incluye una asparagina por histidina en la primera posición del
puente de zinc característico, hisitidina-X–histidina-X-ácido aspártico (NXHXD) y
deriva de enzimas SHF-1 en Aeromonas sp y Serratia fonticola. MBLs L1 es exclusiva
de la clase B3, ya que es única entre las β-lactamasas que son funcionalmente
representadas como un tetrámero. (Piorel, 2001; Walsh, 2005)
15
La adquisición de la codificación cromosomal de las MBLs tiene diversos argumentos,
los cuales siguen siendo cuestionados. Se creé que el periodo de tiempo en que las
bacterias han sido expuestas a β-lactámicos y por ello la bacteria adquiere esta
información en sus genes para expresar resistencia al antibiótico. Otro argumento es que
estas enzimas realizan una función celular normal como respuesta al ambiente pero que
aun no ha sido evaluada. (Walsh, 2005)
La diseminación de cepas que poseen genes de MBLs es condicionada por el consumo
de cefalosporinas de espectro extendido y carbapenémicos. Los genes estructurales de
tipo IMP, VIM y GIM-1 que se localizan en integrones clase 1, los genes IMP también
se han encontrado en integrones clase 3. Los integrones son capaces de obtener una vía
de entrada al casete cromosómico y alcanzar un sitio específico de recombinación en el
DNA, y por lo tanto se expresarán en el integrón mismo y en el casete cromosómico.
Los integrones consisten en tres regiones: 5`, 3` y una región variable. La región
5`consiste en un gen integrasa (intl), un sitio de recombinación adyacente (attI), y un
promotor, que facilita la expresión que produce en la región del casete cromosómico. La
región 3` en la mayoría de las ocasiones conserva su estructura parcial, pero en
ocasiones es eliminada por el gen qac (qacEA1) el cual confiere resistencia a los
antisépticos y sulfonamidas.(Walsh, 2005)
Cuando los casetes acarrean genes de resistencia a los aminoglucósidos y β-lactámicos,
estos pueden moverse con libertad de un integrón a otro pero no pueden moverse de un
organismo a otro y requiere de ayuda de otros elementos genéticos como los plásmidos
o transposones. La mayoría de los genes MBLs se encuentran usualmente en plásmidos
de 120 a 180 kb. (Kimura, 2005; Walsh, 2005)
Existen cuatro grupos de MBLs mediados por plásmidos (IMP, VIM, SPM y GIM) que
han sido descritos a nivel mundial, y sus determinantes genéticos asociados con
integrones. En 1991 en Japón se describió el gen IMP-1 en cepas de Serratia
marcescens y P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, y de este se ha partido para la
identificación de nuevos MBLs como VIM-1 en Italia, VIM-2 en Francia, SPM-1 en
Brasil y GIM-1 en Alemania. (Fiett, 2006; Kim, 2005; Riccio, 2005)
16
Cuando se identificó en Japón el primer gen de resistencia a carbapenémicos se
consideró como un problema de salud solo para ese país; pero en 1997 se presentan los
primeros reportes de la presencia del gen IMP en cepas de P. aeruginosa de Italia y
Portugal. Aunque en estudios retrospectivos en cepas colectadas en 1994 en Hong Kong
y en 1995 en Canadá determinaron que la resistencia fue debida a IMP-7 en cepas de P.
aeruginosa y a IMP-4 en cepas de Acinetobacter sp.(Chu, 2001) En Corea existen dos
estudios que reportan cepas resistentes a carabapenémicos debido a la producción de
MBLs (Lee, 2002). En uno de los estudios se encontraron genes IMP en el 35% de las cepas
resistentes a carbapenémicos o ceftazidima (Kim, 2005). Mientras que en otro estudio
realizado en 2000-2001 en hospitales coreanos se presentó el 60% de cepas productoras
de MBLs. (Walsh, 2005)
El segundo grupo más frecuente de MBLs es la familia VIM; presentando resistencia a
los β-lactámicos, monobactámicos y carbapenémicos. Al igual que los genes blaIMP, el
gen blaVIM-1 se integra en el casete cromosómico en una clase de integrón; esta fue
identificada en cepas de P. aeruginosa en tres hospitales de Italia. En 1996 se identificó
en Francia el gen blaVIM-2 en una cepa de P. aeruginosa que en comparación a VIM-1
esta es susceptible a aztreonam; aunque han aumentado los reportes de su presciencia en
otros países como: Japón, Corea, Portugal, España, Polonia, Chile, Venezuela,
Argentina y EUA. En los últimos años se han identificado otros tipos de gen VIM como
VIM-3, VIM-4, VIM-5 y VIM-6 los cuales difieren en la cantidad de aminoácidos, su
susceptibilidad hacia algunos antibióticos debido a que presentan fenotipos de
resistencia diferente entre cada tipo de VIM y la presencia en cierta cepas de K.
pneumoniae, P. aeruginosa y P. putida. (Fiett, 2006; Jacoby, 2005; Laupland, 2005; Peterson, 2003; Piorel,
2001; Riccio, 2005; Suárez, 2006;Walsh, 2005)
En 1997 en Sao Paulo, Brasil se identificó un nuevo gen denominado SPM-1 en cepas
de P. aeruginosa; en su secuenciación se identificó una diferencia no mayor de 24
aminoácidos en comparación con los genes IMP y VIM; otra característica es que está
inmediatamente asociado a regiones comunes y no con integrones o transposones. Una
característica en común con el resto de los genes es que no hidroliza el ácido
clavulánico o aztreonam. En Alemania se identificó el gen GIM-1, presentando una
diferencia en su estructura genética del 31 al 41% con respecto a los genes IMP y VIM;
a su vez este gen es dependiente de zinc (HXHXD). (Riccio, 2005; Walsh, 2005)
17
El incremento de la resistencia a carbapenémicos por cualquier mecanismo ha ido en
aumento de acuerdo con el Programa Internacional de Vigilancia de la Resistencia
SENTRY; en el caso de Japón del 19.3% reportado en 1998, incrementó al 38% para el
2002; y en cepas brasileñas de P. aeruginosa se reportó de 44.8%. (Fritshe, 2005)
De acuerdo con los resultados del SENTRY en el 2002, América Latina presentó una
prevalencia del 18% en cepas de P. aeruginosa y Acinectobacter sp. resistentes a
carbapenémicos, se estimó que el 2% de los aislamientos de P. aeruginosa productoras
de MBL eran procedentes de hospitales. Al menos cinco tipos de MBLs como: IMP-1,
IMP-7, IMP-16, VIM-2, VIM-8 y SPM-1 se han detectado en hospitales de países
como: Chile, Venezuela, Colombia y Brasil. (Laupland, 2005; Lee, 2002; Pagani, 2005; Villegas, 2006)
Mientras que en EUA Cofksky y cols, identificaron que el 25% de las cepas aisladas de
P. aeruginosa fueron resistentes a carbapenémicos y asociados a una tasa de mortalidad
del 20%. (Haag, 2002)
En el caso de Colombia, Cerpo y cols reportaron en un estudio de seguimiento de 1997
al 2003 una prevalencia del 38% de cepas resistentes a carbapenémicos. Identificaron
seis tipos de fenotipos: 1) resistente a imipenem o meropenem, ceftazidima,
aminoglucósidos y quinolonas, pero susceptible a aztreonam y piperacilina; 2) similar a
fenotipo uno pero resistente a aztreonam y piperacilina, 3) resistente solamente a
imipenem, 4) susceptible solamente a piperacilina, 5) resistente a imipenem o
meropenem pero susceptible a cualquier otro antibiótico y 6) solo sensible a cefepime. (Crespo, 2004)
En el 2004, Lagatolla y cols. en hospitales de Italia reportaron una frecuencia del 20%
en cepas P. aeruginosa con genes de MBLs aunque en general y el 70% de ellas
presentaron los genes VIM-1 y VIM-2. (Lagatolla, 2004), En el 2005, Laupland y cols
reportaron en hospitales de Canadá una tasa de incidencia anual de 10.5 casos por cada
100,000 infecciones nosocomiales por P. aeruginosa, de los cuales el 43% (98/228)
presentaron resistencia a carbapenémicos, y de esas cepas aisladas el 39% fueron
identificadas como productoras de MBLs tipo VIM y el 2% productoras de MBLs tipo
IMP. (Laupland 2005) En el 2006, Villegas y cols en Colombia reportaron un promedio de
13.5% de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, siendo de ellos el 26%
aisladas en la unidad de terapia intensiva. (Villegas, 2006)
18
Los factores de riesgo que contribuyen a la colonización e infección con cepas
productoras de MBLs difieren un poco en relación al resto de las infecciones
nosocomiales; uno de los principales factores de riesgo es la estancia hospitalaria
prolongada u hospitalización en terapia intensiva, enfermedades graves como diabetes,
cáncer, VIH, insuficiencia renal, cirugías (transplante o traumatismos), el uso de
catéteres, sondas urinarias, apoyo ventilatorio, hemodiálisis, cirugías abdominales de
emergencia, sondas de gastrostomías o yeyunostomías, y la administración de β-
lactámicos o de otros antibióticos. (Murphy, 2003; Pagani, 2005; Piorel, 2001)
La aparición de P. aeruginosa productora de MBLs representa un riesgo
epidemiológico por dos razones principales: 1) MBLs confieren resistencia no sólo a
carbapenémicos sino a todos los β-lactámicos y con frecuencia se asocian con
resistencia a aminoglucósidos; y 2) los genes que codifican enzimas para MBLs son
acarreadas comúnmente en elementos móviles (genes incluidos en casetes de
integrones) que pueden propagarse horizontalmente entre diferentes amplicones y cepas. (Kim, 2005)
La importancia clínica de identificar los genes productores de MBLs es debido a la
transferencia de estos genes a otras bacterias como: P. aeruginosa, Acinetobacter sp y
Enterococcus sp. y con ello conferir la resistencia a todos los β-lactámicos,
aminoglucósidos y fluoroquinolonas; ofreciendo como única opción terapéutica
polimixinas. (Walsh, 2005)
Identificación de MBLs
Desde la creación de los carbapenémicos en los años ochentas, no se visualizó que en un
periodo de diez años las bacterias, especialmente las enterobacterias no fermentadoras,
adquirieran la capacidad de producir una resistencia hacia este grupo de antibióticos.
Con la creciente prevalencia a nivel mundial de P. aeruginosa y Acinetobater sp
productoras de MBLs, al conferir resistencia a los carbapenémicos coadyuvaron a que
esto se extendiera hacia las cefalosporinas. Se ha buscado una explicación a esta
transferencia de resistencia cruzada a través de técnicas de biología molecular para
identificar lo genes o plásmidos que confieren estas mutaciones en las cepas de P.
19
aeruginosa y hasta el momento se han atribuido a dos mecanismos: alteraciones a nivel
de las porinas y a través de bombas de flujo.
Para la confirmación de los genes causantes de MBLs se requiere de técnicas
moleculares específicas, las cuales no todos los laboratorios de microbiología cuentan
con el equipo necesario para realizar estos estudios por lo que la utilización de técnicas
de identificación fenotípica para las cepas sospechosas de producción de MBLs son una
opción que se pude tener al alcance y que a su vez son sugeridas a realizar por la CLSI
(Clincal Laboratory Standar Institute); pero no sugieren una técnica específica y de ahí
que se han descrito diferentes tipos de procedimientos como: la utilización de discos de
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con imipenem, E-test, sinergismo de discos de
EDTA con imipenem o ceftazidima (técnica de Hodge) y discos con MPA (ácido 2-
mercaptopropionico) con imipenem o ceftazidima (Tabla 1 y Figura 1). (Lee, 2001; Marchiaro
2005; Walsh, 2002)
Tabla 1. Comparación de algunos métodos para la identificación fenotípica de
MBLs (Marchiaro, 2005)
EDTA +
imipenem
E-test Técnica de
Hodge
Sensibilidad 100% 92% 67%
Especificidad 100% 100% 70%
Valor predictivo positivo 100% 100% 32%
Valor predictivo negativo 100% 98% 91% EDTA= Ácido etilendiaminotetraacético
A pesar de los procedimientos fenotípicos existentes para la identificación de MBLs, se
ha intentado unificar criterios para determinar el tipo de gen productor de MBLs (IMP,
VIM, GIM, SPM) en cepas de P. aeruginosa y Acinetobacter sp, a través de la técnica
de Hodge y la prueba de E-test, pero esto no ha sido posible debido a que cada autor ha
propuesto diferentes puntos de cohorte entre las concentraciones de EDTA haciendo
cuestionar la sensibilidad y especificidad de la prueba; una ventaja con lo que cuenta la
E-test con respecto al resto de las pruebas fenotípicas es medir las concentraciones
mínimas inhibitorias la cual reduce el margen de error, motivo por lo cual es el más
utilizado hasta el momento. (Aktas, 2008; Cornaglia, 2007; Picao, 2008)
20
A)
B)
C)
Figura 1. Identificación fenotípica de MBLs: A) Técnica de Hodge
(sinergismo de EDTA + imipenem o ceftazidima), B) E-test y C)
Técnica de EDTA + imipenem.
21
JUSTIFICACIÓN
La resistencia bacteriana es un problema serio, con repercusiones en la morbilidad y
mortalidad de pacientes hospitalizados en general y en particular de los que adquieren
infecciones nosocomiales, condicionando altos costos para su tratamiento y control.
Debido a su patogenicidad y a la resistencia que presenta hacia los antibióticos, la P.
aeruginosa es una de las bacterias que condiciona más problemas a nivel
intrahospitalario. En nuestro país son pocos los hospitales que tiene programas de
vigilancia y control de infecciones nosocomiales validados por lo que no se dispone de
información confiable sobre la epidemiología de las IN por P. aeruginosa.
El uso indiscriminado de antibióticos β-lactámicos ha sido un factor que a nivel mundial
ha incrementado la resistencia de P. aeruginosa, especialmente hacia los
carbapenémicos, con repercusión importante a nivel hospitalario donde se observan
fallas terapéuticas de los esquemas de antimicrobianos utilizados tradicionalmente.
Además, las bacterias que tengan en su casete cromosómico alguno de los genes
productores de MBLs, tendrá la oportunidad de transferirlo a través de plásmidos a
aquellas cepas de P. aeruginosa que no lo contengan e inclusive a otro tipo de bacterias
como Acinectobacter sp y Serratia sp y finalmente propagarse en todos los niveles
hospitalarios y de la región. Este problema se reflejará con aumento en la morbilidad y
mortalidad, así como elevación de costos para el manejo de IN causadas por P.
aeruginosa productoras de MBLs.
En este estudio se determinará la presencia de genes IMP-1, IMP2, VIM-1, VIM-2 y
SMP-1 en cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, así como el patrón de
susceptibilidad a otros antibióticos. La información generada será de gran utilidad para
realizar una descripción de los genes y así fundamentar y realizar propuestas para la
implementación de medidas de control a mediano y largo plazo.
22
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es la frecuencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 en cepas
nosocomiales de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos aisladas en
algunos hospitales de México?
OBJETIVO GENERAL
Identificar la presencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 de
resistencia a carbapenémicos en cepas nosocomiales de P. aeruginosa aisladas en
algunos hospitales de México.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar el perfil de susceptibilidad a carbapenémicos, cefalosporinas,
quinolonas, inhibidores de β-lactamasas y monobactam a través de la técnica de
Kirby Bauer de las cepas de P. aeruginosa aisladas en hospitales de Colima,
Durango y Guadalajara.
- Identificar el fenotipo de metalo-β-lactamasas a través de la técnica de doble disco y
la prueba de E-test de las cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos
aisladas en hospitales de Colima, Durango y Guadalajara.
- Describir la frecuencia de los genes IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1 en la
cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos aisladas en los hospitales
participantes.
23
MATERIAL Y MÉTODOS
Periodo de estudio: El estudio se realizó de febrero de 2007 a diciembre de 2008; se
estudiaron las cepas de P. aeruginosa obtenidas de hospitales de Colima, Durango y
Guadalajara.
Tipo de estudio: multicéntrico, transversal, descriptivo.
Universo de trabajo: Cepas aisladas de pacientes que presentaron infecciones
nosocomiales en los siguientes hospitales: Hospital Regional Universitario (HRU) y
Hospital General de Zona No. 1 del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), en la
ciudad de Colima; Hospital General de Durango (HGD) y Hospital General de Zona
No. 1 del IMSS de la ciudad de Durango y Centro Médico de Occidente del IMSS de la
ciudad de Guadalajara (CMO). El muestro fue no probabilístico de casos consecutivos
no repetidos.
Tamaño de la muestra: fue calculado con la fórmula de una proporción.(Velazco, 2003;
Fernández, 1996)
Donde:
• Zα 2 = 1.962 (ya que la seguridad es del 95%)
• p = proporción esperada
• q = 1 – p
• d = precisión
N= (1.96)2*[(0.37*0.72)]
(0.03)2
N= (3.84)*(0.23)
0.0009
24
Se usaron los estimados de frecuencia esperada con la fuente de información disponible,
la cual indica que la prevalencia en cepas de P. aeruginosa nosocomiales resistentes a
carbapenémicos es alrededor de 37.5% (Crespo, 2004), con una precisión absoluta del 3%.
Resultando un tamaño de muestra de:
n = 995
Se reajustó el tamaño de la muestra utilizando la fórmula de una proporción en
poblaciones finitas menores a 5,000 casos. Tomando en consideración los datos
proporcionados por los Servicios de Epidemiología de los hospitales participantes,
referente al número de infecciones nosocomiales identificadas en el 2006; Colima:
IMSS con 73 casos y HRU con 284 casos; Durango: IMSS con 56 casos y HGD con
394; y Guadalajara: CMO con 129 casos. Dando una media de 187 infecciones
nosocomiales. (Fernández, 1996)
N= n
1 + (n/población)
N= 995
1 + (995/187)
Resultando un tamaño de muestra de:
N= 158 cepas de P. aeruginosa
Criterios de Selección:
Inclusión:
Cepas aisladas de pacientes que presenten infección nosocomial.
No inclusión:
25
Cepas aisladas de pacientes con reingreso menor a 2 semanas
Eliminación
Muerte de la cepa por el transporte inadecuado de la muestra.
Contaminación de las placas de agar por otros gérmenes.
Variables:
Variable Naturaleza Escala de
Medición
Indicador Interrelación
Genes
responsables de
resistencia
Cualitativa Nominal
politómica
IMP1, IMP2,
VIM1, VIM2,
SPM1
Dependiente
Desarrollo de estudio: (Figura 2)
Se recuperaron las cepas aisladas de muestras de sondas urinarias, puntas de catéter,
aspirados bronquiales, hemocultivos y secreciones, las cuales fueron proporcionadas por
el Laboratorio de Microbiología de los hospitales participantes y se enviaron en placas
de agar MacConkey selladas con parafilm y en hielera cerrada con refrigerantes (4-8°C)
al laboratorio de Ecología de la Facultad de Medicina, de la Universidad de Colima, en
forma personal las correspondientes a la ciudad de Colima y por mensajería de 24 horas
del resto de la unidades sedes (Guadalajara y Durango). Todas las cepas fueron
resembradas en placas de agar MacConkey e incubadas a 36 ºC por 24 horas en el
Laboratorio de Ecología de la Facultad de Medicina.
Identificación de P. aeruginosa:
Las características de las colonias en placas MacConkey son: producen pigmento rojo
oscuro o negro, con olor dulce semejante a jugo de uva o de maíz. Como control de
26
calidad para todas las pruebas se utilizó la cepa de P. aeruginosa ATCC 27853
(American Type Culture Collection).
Inicialmente se les realizó a todas las cepa una tinción de gram (Anexo 1), para verificar
que fueran bacilos gram negativos, posteriormente se seleccionaron una colonia
perfectamente aislada de la caja de petri con la cual se inocularon los tubos que
contienen las pruebas bioquímicas (Agar triple azúcar, Citratro de Simmons y
Oxidación-Fermentación de Hugo y Leifson) las cuales se revelaron en 24 horas (Anexo
2).
Prueba de susceptibilidad:
La identificación se realizó mediante la técnica de Kirby Bauer para susceptibilidad en
disco, de acuerdo a lo dispuesto por la CLSI de los EUA y los lineamientos
recomendados por la American Society for Microbiology. Por crecimiento durante 24
horas a 35° C en agar Mueller-Hinton conteniendo cloruro de sodio al 4%. Se utilizaron
como cepa control para P. aeruginosa ATCC 27853. Se emplearon los siguientes
antibióticos: amikacina (30 μg), aztreonam (30 μg), ampicilina con sulbactam (10/10
μg), cefepime (30 μg), cefotaxima (30 μg), ceftazidima (30 μg), ceftriaxona (30 μg),
ciprofloxacina (5 μg), gentamicina(10 μg), imipenem (10 μg), y meropenem (10 μg),
piperacilina con tazobactam (100/10 μg), trimetoprin con sulfametoxazol (1.25/ 23.75
μg) y ticarcilina con ácido clavulánico (75/10 μg). (CLSI, 2006; Weldhagen, 2003) (Anexo 3)
Identificación del fenotipo a metalo-β-lactamasas:
Posteriormente de verificada la resistencia a carbapenémicos en las cepas de P.
aeruginosa, se empleó la técnica de doble y triple disco en placa para la identificación
del fenotipo MBLs; donde se utilizaron discos de EDTA, ceftazidima, imipenem y
meropenem. (Anexo 4). De acuerdo con Kimura y cols se esperó que el 1.9% de las
cepas resistentes a carbapenémicos muestren el fenotipo a metalo-β-lactamasas. Se
realizó al mismo tiempo la prueba de E-test la cual muestra sensibilidad y especificidad
superiores a la técnica de Hodge. (Kimura, 2005; Walsh, 2002) Se utilizó como cepas control
ATCC 27858 (control negativo), la cepa de P. aeruginosa productora de VIM-2 y la
cepa de P. aeruginosa productora de IMP-4677 (controles positivos).
27
Extracción de DNA:
Para la extracción de DNA de las bacterias se realizó mediante las especificaciones del
Kit UltraCleanTM Microbial DNA (MO Bio Laboratories, Inc. Solana Beach, CA).
Donde se obtuvieron aproximadamente 200 ng/μl de DNA. El DNA se conservó en
congelación a -20° C hasta su procesamiento; esta temperatura de conservación lo
mantiene estable por aproximadamente 12 meses. (Anexo 5)
Identificación de los genes de MBLs a través de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR):
Para la determinación de los genes para MBLs (IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-
1) se realizó una mezcla de PCR total de 20μl, con las siguientes concentraciones:
Buffer 2 μl, Mg 1 μl, dNTPs 0.5 μl, DNA 0.5 μl, iniciador R 0.7 μl, iniciador F 0.7 μl
(Tabla 2), Taq a 0.1 μl y H2O 14.4 μl. Las condiciones del termociclador fueron las
siguientes: 94° C por 3 minutos, seguido de 38 ciclos a 94° C por 30 segundos,
alineamientos de 50° C por 40 segundos y extensión de 72° C por 40 segundos, para
terminar con 5 minutos de incubación
La realización de la electroforesis fue con gel de agarosa al 1% y TBE al 1% con un
voltaje de 85 por una hora y media; cada pozo del gel fue cargado con una mezcla de
jugo azul y el marcador syber green (2μl) y mezclado con 10 μl de la muestra a
procesar. Cada corrida cuenta con un control positivo para IMP y VIM, a excepción de
SPM. Se reveló el gel en lámpara UV. (Anexo 6)
28
Tabla 2. Iniciadores para la identificación de MBLs en cepas de P. aeruginosa. (Shibata, 2003)
Gene Secuencia del Primer (5´- 3´) Pb
blaIMP-1 F1 (5`-ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC-3`)
R1 (5´-ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC-3´)
587
blaIMP-2 F2 (5´-GTT TTA TGT GTA TGC TTC C-3´)
R2 (5`-AGC CTG TTC CCA TGT AC-3´)
678
blaVIM-1 F3 (5´-AGT GGT GAG TAT CCG ACA G-3´)
R3 (5´-ATG AAA GTG CGT GGA GAC-3´)
261
blaVIM-2 F4 (5`-ATG TTC AAA CTT TTG AGT AAG-3´)
R4 (5´-CTA CTC AAC GAC TGA GCG-3´)
801
blaSPM-1 F5( 5`GCG TTT TGT TTG TTG CTC-3´)
R5(5`TTG GGG QATG TGA GAC TAC-3`)
786
Obtención de cepas
Siembra e identificación
Morfología
Pruebas bioquímicas Agar triple azúcar Citrato Oxidación-Fermentación (Hugh Y Leifson) Oxidasa
Suceptibilidad a antibióticos por Kirby-Bauer
Identificación de fenotipos de MBLs
Extracción de DNA
Identificación por PCR los genes de MBLs
Tinción de gram
29
Figura 2. Plan de trabajo
30
ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
La información se concentró en una base de datos de Excel y el análisis estadístico se
realizó con el programa SPSS 13.0. Las variables de estudio se colectaron en forma
numérica, se realizó estadística descriptiva (proporción de resistencia a carbapenémicos
y presencia de gen IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 y SPM-1), por lo que se determinó la
frecuencia de cepas resistentes y su genotipo, los cuales se expresaron en porcentajes y
presentados en tablas. Se utilizó la prueba de ji cuadrada para determinar la asociación
entre las variables nominales. Se determino la frecuencia de cepas multiresistentes (> 3
antibióticos) por lugar de origen y se realizó ANOVA para determinar la diferencia
entre los diferentes hospitales y las cepas multiresistentes, acorde al teorema de
tendencia central se justifica el uso de la prueba t de una vía para ubicar
geográficamente la diferencia estadística de las cepas multiresistentes entre los
hospitales participantes.
ASPECTOS ÉTICOS.
Debido a que se utilizaron cepas aisladas de los pacientes con infección nosocomial y a
quienes se les realizó cultivos como parte de los procedimientos clínicos habituales, no
se realizó solicitud de autorización a los pacientes. Durante todo el estudio la
información se manejó de forma confidencial. El proyecto fue aprobado por la
Comisión Nacional de Investigación Científica IMSS con Registro 007-785-043 y en la
Secretaría de Salud autorización HRU 2007-2-SR-EP-INFECT-06.
31
RESULTADOS
Se incluyeron 239/253 cepas de P. aeruginosa, eliminándose 14 por contaminación; las
239 cepas incluidas tuvieron la siguiente distribución de los diferentes centros: 73 cepas
(30%) precedentes del Hospital Regional Universitario, 78 cepas (33%) del Hospital
General de Durango y 88 cepas (37%) del Centro Medico de Occidente de Guadalajara;
no se aislaron cepas nosocomiales en el IMSS Colima y Durango durante el periodo de
estudio.
La distribución respecto a la procedencia de las cepas por servicio hospitalario fue: 41%
(98/239) de Pediatría, 23% (54/239) de Cirugía, 22% (53/239) de Medicina Interna, 6%
(14/239) de Terapia Intensiva, 4% (10/239) de Cuidados Intensivos Neonatales, 3%
(8/239) de Urgencias y 1% (2/239) de Ginecología y obstetricia (Figura 3).
Figura 3. Cepas de P. aeruginosa aislada por servicio hospitalario.
3% 4% 6%
41%
22% 23%
1%0%5%
10%15%20%25%30%35%40%45%
Urg UCIN UTI Ped MI Cx GYO
Los perfiles de susceptibilidad a los antibióticos en forma global se muestran en la tabla
3, en donde los antibióticos que presentaron mayor resistencia fueron ampicilina con
sulbactam (99%), trimetoprin con sulfametoxazol (98%), cefotaxima (45%) y
ceftriaxona (48%).
32
Tabla 3. Patrones de sensibilidad a diversos antibiótico en cepas de Pseudomonas aeruginosa
en los hospitales de Colima, Durango y Guadalajara (n=253)
Resistente Intermedio Sensible
Amikacina 28% 2% 70%
Ampi/Sulbactam 99% 0% 1%
Aztreoam 10% 22% 68%
Cefepime 19% 3% 78%
Cefotaxima 45% 42% 13%
Ceftazidima 28% 5% 67%
Ceftriaxona 48% 32% 20%
Ciprofloxacina 22% 4% 74%
Gentamicina 23% 2% 75%
Imipenem 24% 2% 74%
Meropenem 20% 3% 77%
Piperacilina/Tazobactam 8% 0% 92%
TMP/SMX 99% 0% 1%
Ticarcilina c/ac Clav 33% 0% 67%
De las 239 cepas incluidas, y agrupando a las resistentes (62/237) junto con resistencia
intermedia (8/239), el 29% (70/239) se identificaron con fenotipo resistente a
carbapenémicos, con una distribución geográfica como sigue: Guadalajara 53% (37/70),
Colima 26% (18/70) y Durango 21% (15/62). Al realizar la identificación fenotípica de
metalo-β-lactamasas de estas cepas a través de la técnica modificada de Hodge (doble
disco), el 41% (29/70) se identificó como productoras de MBLs; mientras que por
prueba E-test se identificó al 47% (33/70) con el mismo fenotipo (Figura 4 y 5).
Figura 4. Interpretación fenotípica de metalo-β-lactamasas a través de la técnica de doble disco
33
Figura 5. Interpretación fenotípica de metalo- β-lactamasas a través de E-test
En la identificación de los diferentes genes de resistencia estudiados de estas 70
cepas de P. aeruginosa con patrón de resistencia a carbapenémicos, el 57% (40/70)
presentó al menos un gen productor de MBLs, con la siguiente distribución (Figuras 6 y
7):
• Cepas positivas a un solo gen: 25/40 (62.5%)
o IMP-1: 12 cepas
o VIM-1: 9 cepas
o VIM-2: 4 cepas
• Cepas positivas a dos genes diferentes: 13/40 (32.5%)
o VIM-2 + IMP-1: 8 cepas
o VIM-1 + VIM-2: 3 cepas
o VIM-1 + IMP-2: 1 cepa
o IMP-1 + VIM-1: 1 cepa
• Cepas positivas a tres genes diferentes: 2/40 (5%)
o IMP-1 + VIM-1 + VIM-2: 2 cepas
34
igura 6. Identificación de gen IMP-1 e IMP-2 en muestras procedentes de los hospitales de Colima,
igura 7. Identificación de gen VIM-1y VIM-2 en muestras procedentes de los hospitales de Colima,
uadalajara y Durango.
cepas positivas para el gen SPM-1. Llama la atención que la
ayoría de las cepas con más de un gen positivo a producción de MBLs proceden de un
800 pb 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb
IMP-1
IMP-2
F
Guadalajara y Durango.
800 pb 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb
VIM-1
VIM-2
F
G
No se identificaron
m
tercer nivel de atención (Guadalajara), como se muestra en la tabla 4.
35
Tabla 4. Distribución de los genes productores de MBLs respecto a la ciudad de
procedencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos (n=40)
Gene identificado Guadalajara Colima Durango
VIM-1 6 - 3
VIM-2 4 - -
IMP-1 3 9 -
VIM-1 + IMP-2 1 - -
VIM-1 + VIM-2 3 - -
IMP-1 + VIM-2 7 1 -
IMP-1 + VIM-1 1 - -
IMP-1 + VIM-1 + VIM-2 2 - -
Los patrones de susceptibilidad a los diferentes grupos de antibióticos en cada uno de
los hospitales participantes mostraron una similitud en la prevalencia de resistencia
hacia algunos de ellos como aminoglucósidos, cefalosporinas de tercera generación e
inhibidores de β- lactamasas; aunque se observó diferencias en la prevalencia individual
entre cada antibiótico principalmente en amikacina, cefotaxima, ceftriaxona, cefepime,
imipenem, meropenem y ticarcilina con ácido clavulánico (Tabla 5 a 7). Siendo las
cepas con mayor resistencia las del Centro Médico de Occidente de Guadalajara.
Tabla 5. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de
P. aeruginosa del HRU en Colima (n=73)
Resistente Intermedio Sensible
Amikacina 12% 0% 88%
Ampi/Sulbactam 97% 0% 3%
Aztreoam 15% 15% 70%
Cefepime 15% 2% 84%
Cefotaxima 40% 40% 20%
Ceftazidima 19% 6% 75%
Ceftriaxona 41% 33% 26%
Ciprofloxacina 19% 3% 78%
Gentamicina 20% 3% 77%
Imipenem 18% 3% 79%
36
Meropenem 16% 3% 81%
Piperacilina/Tazobactam 10% 0% 90%
TMP/SMX 96% 0% 4%
Ticarcilina c/ac Clav 27% 0% 73%
Tabal 6. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas de
P. aeruginosa de Hospital General de Durango (n=78)
Resistente Intermedio Sensible
Amikacina 28% 1% 71%
Ampi/Sulbactam 99% 0% 1%
Aztreoam 1% 22% 77%
Cefepime 1% 5% 93%
Cefotaxima 37% 51% 12%
Ceftazidima 15% 6% 78%
Ceftriaxona 41% 38% 20%
Ciprofloxacina 18% 8% 74%
Gentamicina 15% 3% 82%
Imipenem 19% 0% 81%
Meropenem 4% 1% 95%
Piperacilina/Tazobactam 5% 0% 95%
TMP/SMX 100% 0% 0%
Ticarcilina c/ac Clav 24% 0% 76%
Tabla 7. Patrones de sensibilidad a diversos antibióticos en cepas
de P. aerugionsa de CMO en Guadalajara (n=88)
Resistente Intermedio Sensible
Amikacina 40% 3% 57%
Ampi/Sulbactam 100% 0% 0%
Aztreoam 14% 27% 59%
Cefepime 38% 2% 60%
Cefotaxima 56% 34% 8%
Ceftazidima 46% 3% 51%
Ceftriaxona 59% 26% 15%
Ciprofloxacina 28% 1% 71%
Gentamicina 31% 2% 67%
37
Imipenem 34% 2% 64%
Meropenem 37% 6% 57%
Piperacilina/Tazobactam 10% 0% 90%
TMP/SMX 100% 0% 0%
Ticarcilina c/ac Clav 44% 0% 56%
Las sensibilidades intermedias in vitro se interpretaron como resistentes, debido a que
en las decisiones clínico-terapéuticas son considerados resistentes; por lo que las
proporciones de resistencia a cefalosporinas de tercera generación fue 83%, a
aminoglucósidos 30% y carbapenémicos 25%. Se realizaron comparaciones con ji
cuadrada entre el tipo de hospital y los perfiles de susceptibilidad para cada uno de los
antibióticos utilizados (Tabla 8).
La comparación entre un hospital de segundo nivel (Hospital Regional Universitario de
Colima) versus de tercer nivel (Centro Médico de Occidente de Guadalajara) mostraron
una diferencia estadística significativa en la resistencia con los siguientes antibióticos:
amikacina (p=0.000), cefepime (p=0.001), ceftazidima (p=0.002), meropenem
(p=0.001), trimetopin con sulfametoxazol (p=0,0366) y ticarcilina con ácido clavulánico
(p=0.02); en el caso de la comparación del Hospital General de Durango versus el
Hospital Regional Universitario de Colima (ambos de segundo nivel de atención)
presentaron diferencia estadística significativa en la resistencia con amikacina
(p=0.010) y meropenem (p=0.008). Las comparaciones del Centro Médico de Occidente
contra el Hospital General de Durango revelaron una diferencia estadística significativa
en la resistencia con aztreonam (p=0.014), cefepime (p=0.000), ceftazidima (p=0.000),
gentamicina (p=0.028), meropenem (p=0.014) y ticarcilina con ácido clavulánico
(p=0.007).
Tabla 8. Comparación de los antibióticos entre cada uno de los hospitales participantes
Colima vs Guadalajara Durango vs Colima Guadalajara vs Durango
ji cuadrada valor de p ji cuadrada valor de p ji cuadrada Valor de p
Amikacina 18.3752 0.000 6.647 0.010 3.336 0.068
Amp Sulbactam 2.441 0.204* 0.411 0.475* 1,135 0.470*
Aztreonam 2.009 0.156 0.965 0.326 5.991 0.014
Cefepime 10.510 0.001 3.796 0.051 25.164 0.000
Cefotaxima 5.364 0.021 2.290 0.130 0.610 0.435
38
Ceftazidima 9.935 0.002 0.174 0.677 13.127 0.000
Ceftriaxona 3.174 0.075 0.644 0.422 0.945 0.331
Ciprofloxacina 1.204 0.273 0.288 0.592 0.315 0.575
Gentamicina 1.827 0.176 0.659 0.417 4.851 0.028
Imipenem 4.828 0.028 0.041 0.839 5.98 0.014
Meropenem 10.514 0.001 7.089 0.008 31.682 0.000
Piperacilina con
tazobactam
0.018 0.893 1.111 0.292 1.489 0.222
Trimetropin con
slufametoxazol
3.685 0.055* 3.27 0,111* NR NR
Ticarcilina con ac
clavulánico
4.921 0.027 0.182 0.670 7.246 0.007
NR = Sin registro
* = Realización de prueba exacta de Ficher
Se identificaron el 79% (189/239) de las cepas aisladas como cepas multiresistentes (> 3
antibióticos); considerando la diferencia estadísticamente significativa obtenidas por ji
cuadrada, se realizó el análisis de varianza de un factor para comparar la frecuencia de
resistencia entre los hospitales participantes y el lugar de procedencia, donde se revela
que Colima tuvo valores estadísticamente significativos (p=0.009) y menor frecuencia
(43/189) de cepas multiresistentes; ya que la probabilidad del evento (67%) es mayor
del 50% de acuerdo al teorema de limite central, por lo que se justifica la utilización de
estadística paramétrica y a través de la prueba t para dos muestras con varianzas iguales
(t = -1,79) revelaron que las tasas de multiresistencia son estadísticamente significativas
(p< 0.03) por la zona geográfica entre Colima versus Durango y Guadalajara (Figura 8).
Figura 8. Comparación de la frecuecnia de cepas multiresistentes entre los difrentes hospitales participantes
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
COLIMA DURANGO GUADALAJARA
Frec
ueci
a
* *
ANOVA * Prueba F = 4.70 p=0.009
*
39
DISCUSIÓN
Desde la introducción de las cefalosporinas de tercera generación en el tratamiento de
enfermedades infecciosas, la prevalencia de resistencia en cepas de Pseudomonas
aeruginosa y del resto de las Enterobacterias se ha incrementando constantemente. (Castanheira 2008) El mecanismo de resistencia mediado por B lactamasas de espectro
extendido puede ser secundario a la presencia de plásmidos o de cromosomas que posen
genes que producen cantidades importantes de estas enzimas tales como
cefalosporinasas que condicionan resistencia a cefalosporinas y carbapenémicos. Los
genes involucrados en estos mecanismos de resistencia pueden ser trasferidos
fácilmente y aunado al incremento de resistencia a otros tipos de antibióticos
condicionan que los esquemas empíricos convencionales resulten inapropiados para el
tratamiento inicial de pacientes en los que las Pseudomonas tienen un papel importante.
Los genes que codifican para la producción de β-lactamaas pueden estar localizados en
el cromosoma bacteriano, plásmidos o tranposones y su expresión puede ser de tipo
constitutivo o inducible por lo que es necesario realizar la identificación de los mismos. (Courvalin, 2001; McGowan, 2006)
La prevalencia de cada gen de MBLs es variable, debido a la gran diversidad de
subtipos que existen y que se describen actualmente, pero no debemos olvidar que la
mayoría son derivados de los primarios IMP-1, IMP-2, VIM-1 y VIM-2.(Sasha, 2008) La
prevalencia en la producción de MBLs en cepas de P. aeurginosa es muy variable entre
los diferentes tipos de hospital y países; se reporta prevalencias que van del 2% al 39%
en países como Japón (Sasaki, 2004), India (Gupta, 2006; Navaneeth, 2002), Polonia (Fiett, 2006), Italia (Logatolla, 2004) y Canada (Laupland, 2005). En nuestro estudio la frecuencia de genes de MBLs
(57%) es muy similar a la cifra estimada para el 2002 del programa SENTRY en países
latinoamericanos (56%). (Frietche, 2005).
La prevalencia de gen IMP-1 en Japón del año 2000 a la fecha ha sido de 1 al 4.4% en
las cepas de P. aeruginosa, mientras que en Corea el VIM-2 tiene una frecuencia del
95%. En el sur de Europa ha predominado el VIM-1 (especialmente en Italia) con un
6.5 %; Alemania en el 2002 reportó la prevalencia de IMP-1 del 43% seguido de IMP-6
e IMP-4, mientras que VIM-1, VIM-4 y VIM-5 se han encontrado en un 29% de las
40
cepas (Castanheira, 2004) En América del Norte (EUA y Canadá) los reportes existentes
muestran la presencia de diferentes subtipos de IMP (IMP-7, IMP-18) y VIM (VIM-7,
VIM-2); aunque en cepas de Chicago y Texas el VIM-2 ha permanecido como el más
frecuente desde el 2001. Mientras que en América del Sur la identificación de VIM-2 ha
sido del 31% y de IMP-1 de 8.3%. (Villegas, 2006)
En estudios que han caracterizado los mecanismos moleculares de resistencia mediados
por los genes MBLs (principalmente IMP y VIM), han determinado que estos se
encuentran insertados en los integrones de clase I, transposones o plásmidos, elementos
que pueden ser transferidos a otras especies de gram negativos. (Waldehagen, 2004) Los
elementos genéticos movibles que contienen los integrones son fuente importante para
diseminarse los genes bla. Los integrones no son movibles pero su localización con
elementos genéticos movibles (plásmidos, transposones) permiten ese movimiento. Los
genes de β-lactamasas son localizados en integrones y frecuentemente son acompañados
por genes que codifican resistencia a diversos antibióticos. En el caso de MBLs son
localizados en los integrones tipo 1 y 3 y tienen capacidad de que se inserten plásmidos
o transposones al cromosoma bacteriano. (Pournaras, 2002; Sasha, 2008) Aunque recientemente se
ha descrito otro mecanismo de adquisición de dichos genes que es por regiones
comunes, esto ha sido asociado con otras elementos movibles denominados regiones
SXT y cuando se asocian dos regiones comunes se les ha denominado elementos IS
(ISCR). (Toleman, 2006; Toleman, 2002)
Los genes IMP-1 y VIM-1 se localizan en el cromosoma bacteriano; mientras que IMP-
2, VIM-2 y SPM-1 se encuentran en plásmidos. (Sacha 2008) Con este hecho se puede
suponer que las cepas que presentaron más de un gen tienen mayor afinidad en el sitio
de integración del casete integrándolo como propio y además permitiendo el acceso a
más plásmidos o transposones conteniendo genes de resistencia y que estos a su vez
puedan transferirse a otro tipo de bacteria creando clonas altamente virulentas y
resistentes. (Livermore, 2006) Osman, Fiett y Cheng identificaron cepas con más de un gen
de MBLs. El análisis molecular de estas cepas mostró la presencia de genes de tipo
VIM y en 45% de ellas además se encontró el gen IMP-1 en un integrón. (Cheng, 2008; Fiett,
2006; Osman, 2007)
41
Dentro de los patrones de resistencia a diversos antibióticos se encontró que los grupos
que presentaron mayor resistencia fueron las cefalosporinas de tercera generación,
carbapenémicos y aminoglucósidos. Comparando los datos con los reportados por la
NNIS (National Nosocomial Infections Survillance) de EUA las tasas de resistencia
hacia las cefalosporinas de tercera generación, carbapenémicos y quinolonas fue mayor
en este estudio.(McGowan, 2006) Este fenómeno que antes era especifico en las unidades de
cuidados intensivos se ha diseminado ha otras áreas de hospitalización creando datos
alarmantes en la morbi-mortalidad de cada hospital; un caso particular fue reportado en
Nueva York donde el 56% de las cepas nosocomiales fueron resistentes a
ciprofloxacina.(Bratu, 2005) Para Latinoamérica el incremento de resistencia hacia los
carbapenémicos ha sido mayor que en EUA. Andrade y cols reportaron que la
prevalencia en resistencia hacia meropenem se ha incrementado de un 17% en 1997 a
un 36% en el 2001, así como hacia los β-lactámicos, aminoglucósidos y
quinolonas.(Andrade, 2003) Específicamente, P. aruginosa tiene facilidad para desarrollar
resistencia hacia los antibióticos β-lactámicos, debido a la expresión de β-lactamasas
AmpC codificadas cromosomalmente las cuales contribuyen de manera intrínseca al
rápido desarrollo de resistencia hacia β-lactámicos, contribuyendo a la adquisición o
mutación para la expresión de bombas de flujo hacia cefalosporinas, quinolonas,
aminoglucósidos y carbapenémicos; aunque la mayoría de la resistencia hacia los
carbapenémicos causadas por MBLs es por pérdida de porinas. Este párrafo no se
entiende, porque la expresión de AmpC contribuye a la adquisición o mutación para la
expresión de bombas de flujo, creo que es un problema de traducción (Hancock, 2000; Hawkey,
2004; Livermore, 2006)
El reporte de SETNRY en el periodo de 2001 a 2004 reveló que en América Latina y
Europa es mayor la resistencia a los antibióticos que en EUA y Asia del Pacífico. Las
cifras de resistencia a los antibióticos de manera global hacia cefalosporinas,
carbapenémicos y aminoglucosidos son similares a las cifras que reportaron para
Europa, solo en el caso de la piperacilina con tazobactam se encontró por debajo de lo
reportado y con ciprofloxacina la prevalencia reportada por EUA fue similar a la
obtenida en el estudio. (Gales, 2006)
Los reportes de SENTRY sobre las prevalencias de resistencia a diversos antibióticos en
América Latina son similares a lo encontrado en el estudio en el hospital de tercer nivel
42
de atención, pero en el caso de los hospitales de segundo nivel las cifras de resistencia
son similares a las reportadas por EUA y Asia.
Con los resultados obtenidos observamos que la frecuencia de resistencia a
carbapenémicos (25%) está dentro de lo reportado; pero es superior a la resistencia
reportada en hospitales de EUA, e inferior a la países como Canadá, Italia, Japón,
Polonia y Corea (Fiett, 2006; Lagatolla, 2004;Leupland, 2005; Kim, 2005; Kimura, 2005) .
Dentro de los reportes a nivel nacional la prevalencia de resistencia a cefalosporinas y
carbapenémicos está dentro de los reportado en la literatura; como en el caso de
Pacheco y cols en 2006 en un hospital de tercer nivel reportaron la resistencia de 35% a
imipenem y 12% a meropenem y Castillo y cols en 2006 en el Hospital la Raza con una
resistencia de ≈45% a ceftazidima, cefepima, aztreonam e imipenem. (Castillo, 2006)
El estudio TRUST (Tracking Resitance in the United States Today), ha reportado que la
multirresistencia (> 3 antibióticos)en cepas de P. areuginosa se ha incrementado en los
últimos años desde un 7.2% reportado en 2001 a 9.9% en 2003; este aumento fue en un
promedio del 22% hacia cuatro antibióticos específicamente (ceftazidima, imipenem,
gentamicina y ciprofloxacina o levofloxacina). (Landmann, 2005) En comparación con el
estudio encontramos similitudes en la multiresistencia hacia ceflosporinas,
aminoglucósidos, quinolonas y carbapenémicos. Las diferencias en las frecuencia de la
multiresistencias es debidas ha la zona geográfica, tipos de paciente y probablemente a
los esquemas terapéuticos que se utilizan en cada una de las instituciones.
El inicio de tratamientos empíricos inadecuados y el no realizar modificaciones en los
mismos son factores predisponentes en el aumento de la morbimortalidad en los
hospitales, así mismo estos son focos de diseminación de la cepa en los diferentes sitios
de hospitalización por los cuales ingresa el paciente y potenciando la limitación
terapéutica. El uso de piperacilina con tazobactam, cefepime, imipenem o meropenem
se han tomado como opciones terapéuticas empíricas en la unidades de cuidados
intensivos en EUA y por consecuencia han sido factor en el incremento de la resistencia
por P. aeruginosa (Bath, 2007; Rossolini, 2005). Bath y cols concluyeron que en las infecciones
en las cuales inician esquemas antimicrobianos empíricos con base en piperacilina con
tazobactam y/o cefepime del 21% al 26% de las P. aeruginosa son resistentes a estos
43
antibióticos y en un 18% de los casos era innecesario acorde al germen aislado. (Bhat, 2007)
Gupta en el 2008 sugiere que aquellas cepas de P. aeruginosa multiresistentes se les
inicie un esquema con dos antibióticos de diferente familia cefalosporina + quinilona o
cefaloporina + aminoglucósido o monobatam + polimixina B; ya que si la cepa fuese
productora de MBLs no permitirá que se diseminara más su resistencia a cepas
susceptibles a carbapenémicos.(Gupta, 2008)
El conocimiento de la epidemiología y de los perfiles de susceptibilidad a antibióticos
propios de cada unidad hospitalaria es de gran utilidad ya que proporciona herramientas
sólidas a los médicos responsables de la toma de decisiones en el manejo de pacientes
con infecciones graves. Así mismo el conocimiento de los mecanismos moleculares de
resistencia proporciona elementos sólidos para que los comités de prevención y control
de infecciones nosocomiales y de uso de antimicrobianos puedan establecer medidas de
control y prevención de diseminación de cepas resistentes y multiresistentes.
44
CONCLUSIONES
La prevalencia de cepas de Pseudomonas aeruginosa productoras de MBLs se
encuentra dentro de los parámetros esperados y descritos en la literatura internacional.
Se demostraron cepas de Pseudomonas aeruginosa con detección de más de un gen a
MBLs.
Existe diferencia significativa en los patrones de resistencia hacia carbapenémicos,
aminoglucósidos e inhibidores de β-lactamasas entre los hospitales de segundo y tercer
nivel de atención.
Los datos obtenidos en este estudio sobre la identificación de estos genes permiten dar
un panorama de este fenómeno en nuestro país.
PRESPECTIVAS
En las cepas que se les identificó más de un gen es conveniente realizar la identificación
del plásmido, integrón o secuenciación de los fragmentos de gen integrados para definir
su mecanismo de origen.
En aquellas cepas que resultaron negativas a producción de MBLs pero resistentes a
carbapenémicos explorar aquellos genes que están confiriendo esa resistencia como es
el caso de las carbapenemasas de clase A (KPC, IMI/NCM, SME y GES) y clase D
(OXA)
45
GLOSARIO
Amplicón: regiones de DNA que tienen potencial para ser amplificadas.
Clona: es un conjunto de individuos genéticamente idénticos que descienden de un
mismo individuo por mecanismos de reproducción asexual.
B-lactamasa: Enzima que cataliza la hidrólisis del anillo betalactámico de algunas
penicilinas y cefalosporinas, con formación de ácido penicilínico y pérdida de eficacia
del antibiótico
Hemolisinas: Cualquiera de las numerosas sustancias que lisan o disuelven los
hematíes. Las hemolisinas están producidas por cepas de muchas clases de bacterias,
incluidos algunos estafilococos y estreptococos. También están presentes en venenos y
en ciertos vegetales.
Integrón: se encuentra en los plásmidos, comosomas y transposones del sistema de
captura de genes. Piezas de DNA llamadas casetes cromosómicos que puedens se
incorporados, expresados y dieminados.
Peptidoglucano: El peptidoglucano o mureína es un heteropolímero formado por una
secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el ácido N-acetilmurámico unidos
mediante enlaces ß-1,4. La cadena es recta y no ramificada. Constituyendo la estructura
básica de la pared celular de las bacterias.
Piocianina: Pigmento azul o verde azulado que puede ser extraído de Pseudomonas
aeruginosa con cloroformo.
Pioverdina: Pigmento amarillo producido por algunas cepas de Pseudomonas
aeruginosa.
Plásmido: cualquier tipo de inclusión intracelular que se considera tiene una función
genética, especialmente una molécula de ADN procedente del cromosoma bacteriano
46
que determina rasgos no fundamentales para la viabilidad del organismo, aunque de
algún modo cambia la capacidad del organismo para adaptarse.
Porina: son proteínas que se encuentran en la membrana celular y actúan como poros
que permiten el paso de moléculas.
47
ANEXOS
48
ANEXO 1
Tinción de Gram: El procedimiento para la tinción de Gram distingue 2 grupos de
células. Las que retienen el colorante primario son llamadas “Gram positivo” y las que
pierden el color primario y toman otro colorante de contraste, llamadas “Gram
negativas”. El mecanismo se basa en las características fisicoquímicas de las estructuras
de la pared celular de los microorganismos.
- Procedimiento:
1. Preparar y fijar un frotis de la muestras por analizar pasándola
suavemente en la flama del mechero.
2. Cubrir con colorante de violeta de genciana. Esperar 1 minuto.
3. Escurrir el colorante de violeta de genciana sin enjuagar y cubrir
con solución Gram yodo. Esperar 1 minuto.
4. Lavar con solución de alcohol acetona hasta decoloración.
5. Sacudir para evaporar el resto de alcohol acetona.
6. Cubrir el frotis con colorante de safranina. Esperar 1 minuto.
7. Lavar repetidas veces con agua corriente hasta que no haya
restos del colorante.
8. Secar al aire y observar al microscopio de luz.
49
ANEXO 2
Pruebas bioquímicas: se inoculara una colonia en los siguientes medios:
1. Tubos inclinados con agar hierro triple azúcar (TSI) e incubadas de 18 a 24 h en
incubadora a 37º C.
Las reacciones sobre TSI en tubos inclinados pueden ser: 1) superficie inclinada
alcalina/profunda alcalina (ausencia de fermentación de carbohidratos), 2) superficie
inclinada alcalina/profundidad ácida (fermentación de glucosa; ausencia de
fermentación de lactosa), 3) superficie inclinada alcalina/profundidad ácida
(fermentación de glucosa; ausencia de fermentación de lactosa, producción de H2S y 4)
superficie inclinada ácida/profundidad ácida (fermentación de glucosa y
lactosa).(MacFaddin, 2003)
2. Utilización De Citrato: El principio de la prueba de utilización del citrato es
determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato de sodio como
única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. (Koneman, 2001)
El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que se
encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de
Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas a la fermentación
de los carbohidratos, con el citrato como única fuente de carbono. La medición de estas
características es importante para identificar muchos miembros de la familia
Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por
las bacterias a probar debe carecer de proteínas y carbohidratos como fuente de
carbono.(Koneman, 2001)
La utilización del citrato por la bacteria en prueba se detecta en el medio de citrato por
la producción de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, que es un
anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de
50
nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco NH3 lo que lleva a la
alcalinización del medio por conversión del HN3 a hidróxido de amono (NH4OH). El
indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6.0 y azul por
encima de pH 7.6. (Koneman, 2001)
La prueba positiva está representada por la producción de un color azul oscuro que
indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en
el medio, con formación de productos alcalinos. También puede leerse la prueba como
positiva sin que haya color azul si hay desarrollo visible en la estría de inoculación. Esto
es válido para que el desarrollo sea visible el microorganismo debió haber ingresado en
la fase logarítmica de crecimiento, lo que sólo es posible si ha asimilado carbono y
nitrógeno. Una interpretación positiva, basada en la lectura del trazo es incubando el
tubo durante 24 hrs más, momento en el que desarrolla el color azul.(Koneman, 2001)
3. Prueba De Oxidación-Fermentación (Hugh Y Leifson): Los microorganismos
sacarolíticos degradan la glucosa, ya sea por la vía fermentativa u oxidativa. Los
productos finales de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que
pueden ser detectados por las pruebas convencionales de fermentación. Sin
embargo, los ácidos formados en la degradación oxidativa de la glucosa son en
extremo débiles y para detectarlos es necesario el medio más sensible de oxidación-
fermentación de Hugo y Leifson (medio OF). (Koneman, 2001)
La baja relación proteína/carbohidratos reduce la formación de aminas alcalinas que
pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles que pueden formarse a
partir del metabolismo oxidativo. Las cantidades relativamente elevadas de
carbohidratos sirven para aumentar la cantidad de ácido que puede formarse. La
consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se forman en su superficie
se difundan a través del medio; esto facilita la visualización del cambio de pH del
indicador. En este medio también puede observarse la motilidad. (Koneman, 2001)
51
La producción de ácidos se detecta en el medio por la partición de un color amarillo. En
el caso de microorganismos oxidativos, la producción de color se puede notar en primer
lugar cerca de la superficie de medio. Los patrones de reacción son los siguientes:
Tubo abierto Tubo cubierto Metabolismo
Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
Ácido ( amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo
Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacrolítico
52
ANEXO 3
Susceptibilidad a diversos antibióticos:
- Procedimiento:
- Una muestra de la cepa menor a 24 horas de su siembra será suspendida en
un tubo de vidrio estéril de 100 x 75 conteniendo 3 ml de solución salina
estéril y la turbidez se ajustó a una densidad correspondiente a 0.5
McFarland, la cual fue agitada en Vortex.
- Dentro de los 15 minutos posteriores al ajuste de turbidez a 0.5 McFarland
de la suspensión del inóculo, se introducirá un hisopo de algodón estéril en
la suspensión ajustada. El hisopo será girado y presionado en la pared
interior del tubo para quitar el exceso de líquido.
- Con el hisopo se estriará por agotamiento sobre la superficie seca del agar
Müller Hinton. Al final se pasa el hisopo alrededor de la orilla de la placa
con agar.
- La placa inoculada se dejarán en reposo durante 3-5 minutos pero no más de
15 para que seque la superficie del agar antes de agregar y colocar los discos
de antibióticos.
- Se colocaron las placas invertidas a una temperatura de 35° C por 18 horas.
- Transcurrido el tiempo de incubación, cada placa fue revisada desde su área
frontal, la zona de inhibición debían ser uniformemente circular y un
crecimiento confluente. Si hay colonias independientes, el inóculo fue pobre
y la prueba debe ser repetida. La zona de inhibición (en mm) se medirá con
un vernier con una adecuada iluminación y sin la tapadera de la caja petri. El
tamaño de las zonas de inhibición en mm serán interpretados de acuerdo a
los criterios del CLSI de E.U.A.
53
ANEXO 4
Determinación del fenotipo a metalo-B-lactamasas (MBL)
Prueba de doble disco: Se ajustará con espectrofotometría de la suspensión bacteriana
a λ625nm D.O. 0.08-0.1. Posteriormente se impregnarán los discos de papel filtro con
10μl de solución de EDTA 0.5M pH 8.0 y colocar a 1 cm de distancia de borde a borde
de los discos de imipenem, meropenem y ceftazidima, una deformación de halo,
aumento debido a al EDTA indica producción de MBLs positiva. (Walsh, 2005) (Figura 2)
Figura 9. P. aeruginosa con presencia de MBLs por medio de técnica de triple disco.
Prueba de E-test: la prueba consiste en colocar una cintilla (5 x 60mm) calibrada con
la escalas de lectura en μg/ml par determinar en cada extremo su gradiente de
concentración. Contiene concentraciones de imipenem de 4 a 256 μg/ml y de imipenem
+ EDTA con concetaciones de 1 a 64 μg/ml (Figura 10)
Figura 10. Estuctura de tira E-test
54
Procedimiento:
- Una muestra de la cepa menor a 24 horas de su siembra será suspendida en
un tubo de vidrio estéril de 100 x 75 conteniendo 3 ml de solución salina
estéril y la turbidez se ajustó a una densidad correspondiente a 0.5
McFarland, la cual fue agitada en Vortex.
- Dentro de los 15 minutos posteriores al ajuste de turbidez a 0.5 McFarland
de la suspensión del inóculo, se introducirá un hisopo de algodón estéril en
la suspensión ajustada. El hisopo será girado y presionado en la pared
interior del tubo para quitar el exceso de líquido.
- Con el hisopo se estriará por agotamiento sobre la superficie seca del agar
Müller Hinton. Al final se pasa el hisopo alrededor de la orilla de la placa
con agar.
- La placa inoculada se dejarán en reposo durante 3-5 minutos pero no más de
15 para que seque la superficie del agar y colocar la tira E-test.
- Se colocaron las placas invertidas a una temperatura de 35° C por 18 horas.
- Transcurrido el tiempo de incubación, cada placa fue revisada desde su área
frontal y comparar las zonas de inhibición acorde al instructivo del
fabricante (AB BIODISK) o en caso contrario medir las comparaciones de
CMI entra cada extremo de la tira (Figura 11).
Figura 11. Métodos de interpretación de E-test
55
ANEXO 5
Extracción de DNA: Para la extracción de DNA de las bacterias se realizará el
siguiente procedimiento: se tomarán dos colonias de un cultivo de 18 a 24 h de
crecimiento, en agar sangre de carnero al 5%, se colocarán en caldo soya tripticasa y se
crecerán en agitación constante a 35° C durante dos horas. Se realizará un lavado de la
bacteria y la extracción se completa con el UltraCleanTM Microbial DNA Kit (MO Bio
Laboratories, Inc. Solana Beach, CA) (Figura 3). Habitualmente la concentración
obtenida con esta técnica es de 200 ng/μl. La concentración de DNA será corroborada
corriendo una muestra del DNA en geles de agarosa con un marcador de peso molecular
como control. El DNA se conservará en congelación a -20° C, manteniéndose estable
por aproximadamente 12 meses.(Mo Bio Laboratories)
Figura 12. Componentes del kit Ultra Clean para extracción de DNA en bacterias.
Procedimiento:
1. De un cultivo de 24 horas de P. aerugina raspe con ayuda de una asa
bacteriológica las colonias del cultivo y suspenda en 1.5 ml de agua destilada en
un tubo de 1.9 ml (de los que se encuentran en el kit); centrifugue a 10,000 RPM
por 30 segundos. Decante el sobrenadante y centirfuge na vez más por 30
segundos; vuelva a decantar el sobrenadante completamente con ayuda de un
pipeta.
2. Resuspenda el sedimento de células en 300 μl de la solución MicroBead y agite
en el vórtex a una velocidad media. Transfiera las células resuspendidas a un
tubo MicroBead.
3. Agregue 50 μl de solución MD1 al tubo MicroBread.
56
4. Asegure los tubos horizontalmente usando un adaptador en el vórtex para
sotener los tubos y agitelos a su máxima velocidad por 10 minutos.
5. Centrifugue los tubos a 10,000 RPM por 30 segundos. Con la precaución de no
exceder las RPM ya que los tubos pueden romperse.
6. Transfiera el sobrenadante un tubo limpio para microcentrífuga (de lo que se
encuentran en el kit).
7. Llegara a obtener de 300 a 350 μl de sobrenadante.
8. Agregue 100 μl de la solución MD2, l sobrenadante. Agite en vórtex por 5
segundos y posteriormente incubelos por 5 minutos a una temperatura de 4º C.
9. Centrifugue los tubos por 1 minuto a 10,000 RPM.
10. Deseche el sedimento, trasfiera el volumen entero de sobrenadante a un tubo
limpio de 1.9 ml (de los que se encuentran en el kit). Esperando un volumen
aproximado de 450 μl.
11. Agregue 900 μl de solución MD3 al sobrenadante y agite en el vórtex por 5
segundos.
12. Agregue 700 μl dentro del foltro y centrifugue a 10,000 RPM por 30 segundos.
Decante todo el filtrado, y agregue al filtro más sobrenadante, vuelva a
centrifugar a 10,000 RPM por 30 segundos. Nota: se requier un total de 2 a 3
filtrados. Decante todo el líquido filtrado.
13. Agregue 300 μl de solución MD4 y centrifugue a 10,000 RPM por 30 segundos.
14. Desecante todo el filtrado
15. Centrifugue por un minuto
16. Retire con cuidado el filtro y póngalo en un tubo nuevo de 1.9 ml (de los que se
encuentran en el kit).
17. Agregue 50 μl de solución MD5 en el centro de la membrana blanca del filtro.
18. Centrifugue por 30 segundos.
19. Descarte el filtro. El DNA en el tubo esta listo para cualquier aplicación. Se
recomienda almacenarlo a -20º C.
57
ANEXO 6
Identificación de genes MLBs:
Mezcla de reacción:
• Utilizar tubos de pared delgada y estériles
Reactivo Volumen (μl) [ n ] Final
Buffer 2
Mg 1
dNTPS 0.5
Taq DNA pol (0.05 U/μl) 0.1
Primer F (10μM) 0.7
Primer R (10μM) 0.7
DNA 0.5
H2O (libre RNAasa) 14.4
Total 20
Muestras analizar
Muestra Notas
58
Programa de PCR en termociclador: 94° C por 3 minutos, seguido de 38 ciclos a 94° C
por 30 segundos, alineamientos de 50° C por 40 segundos y extensión de 72° C por 40
segundos, para terminar con 5 minutos de incubación.
Se analizó por electroforesis en gel de agarosa 1% en TAE (Trisacetato-EDTA) 1x a 85
Volts durante una hora y media y la muestras fueron cargadas con syber safe (2 μl) con
10 μl de la muestra obtenida por PCR. Posteriormente se visualizaron por
transiluminación en lámpara UV.
59
BIBLIOGRAFÍA
1. Aktaş Z, Kayacan Ć. Investigation of metallo-β-lactamases producing strain of
Pseudomonas aeruginosa an Acintebacter baumanni by E-test diak synergy and
PCR. Scan J Infec Dis 2008;40:320-325.
2. Andrade S, Jone Rn, Gales AC, Sader HS. Increasing prevalence ofa ntimicrobial
resistance among Pseudomonas aeruginosa isolates in Latin America medial
centers: 5 yeras of the SENTRY antimicrobial survillance program (1997-2001). J
Antimicrob Chemother 2003;52:140-141.
3. Bhat S, Fujitano S, Potoski BA, Capitano B, Linden PK, Shutt K, Peterson D.
Psedudomonas aeruginosa infections in the intensive care unit: can the adequacy of
empirical β-lactam antibiotic therapy be improved?. Inter J Antimicrob Agent
2007;30:458-462.
4. Boucher Y, Labbate M, Koening JE, Stokes HW. Integrons: mobilizable platafroms
that promote genetic diversity in bacteria. Trends Microbiol 2007; 15:301-309.
5. Bratu S, Quale J, Cebular S, Heddurshetti R, Landman D. Multidrug resitan
Pseudomonas aeruginosa in Brooklyn, New York: molecular epidemiologý and in
vitro activity of polimixyn B. Eur J Clin Microbiol Inf Dis 2005; 24:196-201.
6. Castanheira M, Sader H, Deshpande, ML, Fritsche RT, Jones NR. Antimicrobial
activities of tigecyline and ohter broad spectrum antimicrobials tested against serine
carbapenemase and metallo-β-lactamase producing Enteroboteriaceae report from
the SENTRY antimicrobial surveillance program. Antimicrob Agent Chemother.
2008;53:570-573.
7. Castillo VJ, Ribas AR, Osorio CL, Aparicio G. Cepas de Pseudomonas aeruginosa
de origen hospitalario multirresistentes a 21 antibióticos. Bioquimia 206; 31:41-48.
8. Cheng X, Wang P, Wang Y, Zhang H, Tao C, Yang W, Liu M, Jia W. Identification
and distribution of the clinical isolates of imipenem-resistant Pseudomonas
aeruginosa carrying metallo-beta-lactamase and/or class 1 integron genes. J
Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2008;28:235-238
9. Chu YW, Afzal SM, Houajng ETS, Palepou MFI, Lyn DJ, Woodford N, et al. IMP-
4 novel metallo-β-lactamase from nosocomial Acinectobacter spp collected in Hong
Kong between 1994 and 1998. Antimicrib Agents Chemother 2001;45:710-714.
60
10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Clinical and Laboratory Standards
Institute/NCCLS. Performance Standards for antimicrobial susceptibility testing;
Fifteenth Informational Supplement. CLSI/NCCLS document M100-S17. Wayne,
PA: Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS, 2007: 1-188.
11. Cornaglia G, Akova M, Amicosante G, Catón R, Cauda R, Docquier JD, Edelstein
M, Frère JM, Fuzi M, Galleni M, Giamarellou H, Gniadkowski M, Koncan R,
Libisch B, Luzzaro F, Miragou V, Navarro F, Nordmann P, Pagani L, Peixe L,
Piorel L, Souli M, Taccomenlli e, Vatopoulos A, Rossolini GM. Metallo β
lactamases as aemerging resistance determinant in gram negative pathogens: open
issues. Int J Antimicrob Agents 2007;29:380-388.
12. Courvalin P, Trieu-Cuot P. Minimizing potential resistance : the molecualr view.
Clin Infec Dis 2001; 33:S138-S146.
13. Crespo MP, Woodford N, Sincalir A, Kaufmann ME, Turton J, Glover J, et al.
Outbreak of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa producing VIM-8, a
novel Metallo-β-Lactamase in a tertiary care center in Cali, Colombia. J Clin
Microbiol 2004; 42: 5094-5101.
14. D´Gata E, Gerrits MM, Tang YW, Samore M, Kusters JG. Comparasion of pulsed
field gel electrophoresis and amplified frament-length polymorphism for
epidemiological investigations of common nosocomial pathogens. Infect Control
Hosp Epidemiol 2001; 22:550-554.
15. Domínguez SJ, Vila RF, Setién CI. Prevalencia y resistencia bacteriana en una
unidad de cuidados intensivos neonatales. Enf Infec Microbiol 2005; 25: 1-7.
16. Eisentein I Barry. Enterobacterias. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael
Dolin; Diana Klajn, Eduardo L. Balbachan et al. 5° ed. Enfermedades Infecciosas
principios y práctica. Buenos Aires, Argentina: México. Médica Panamericana,
2000. Vol. 1. Pp: 2199-2243.
17. Fernández Pita S. Determinación del tamaño muestral. Cad Aten primaria 1996;
3:138-144.
18. Fiett J, Baraniak A, Mrówka A, Fleischer M, Kawa ZD, Naumiuk L, et al.
Molecular epidemiology of Acquired Metallo-β-Lactamase producing bacteria in
Poland. Antimicrob Agent Chemother 2006; 50:880-886.
19. Fritshe TR, Sader HS, Toleman MA, Walsh TR, Jones RN. Emerging Metallo-β-
lactamase mediatede resstences: a summary report from worldwide SENTRY
antimicrobial surveillance program. CID 2005; 41: S276-S278.
61
20. Gales AC, Jones RN, Sader HS. Glbal assessment of te antimictobial activity of
polimyxin B against 54 731 clinical isolates of gram negtive bacilli: report from the
SENTRY antimibrobial surveillance porgremme (2001-2004). CMI 2006;12:315-
321.
21. Geo F. Brooks, Janet S. Butel, Stephen A. Pseudomonas, Acinetobacters y gram
negativos poco comunes. Francisco Sánchez Fragoso. 18° Ed. Microbiología médica
de Jawetz, Melnick y Adelberg. El Manual Moderno. México. 2005. Pp 285-291.
22. Gupta V, Datta P, Chander J. Prevalence of metallo-B-lactamas (MBL) producing
Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. in a tertary care hospital in India. Journal
of Infection 2006; 52:311-314.
23. Gupta Varsha. Metallo beta lactamases in Pseudomonas aeruginosa and
Acinectobacter species. Expert Opin Investig Drugs 2008; 17:131-143.
24. Haag R, Recco R, Macario E, Sathe S, Londman D, Mayorda D, et al. The cost of
antibiotic resistance: effect of resistance among Staphylococcs aureus, Klebsiella
pneumoniae, adn Pseudomonas aeruginosa on length of Hospital Stay. Infect
Control Hosp. Epidemiol 2002; 23: 106-108.
25. Hancock RE, Speert DP. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa
mechanisms and impact on treatment. Drug Resist Updat 2000;3:247-255.
26. Hawkey PM, Munday CJ. Multiple resistance in gram negative bacteria. Rev Med
Microbiol 2004;14:51-61.
27. Jacoby AG, Muñoz PL. The new β-lactamases. N Engl J Med 2005; 352: 380-391.
28. Kim IS, Lee NY, Ki CS, Oh SW, Peck KR, Song JH. Increasing prevalence of
imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa and molecular typing of Metallo-β-
lactamase producers in Korean hospital. Microbial Drug Resistance 2005; 11: 355-
359.
29. Kimura S, Alba J, Shiroto K, Sano R, Niki Y, Maesaki S, et al. Clonal dicersity of
Metallo-β-Lactamase possessing Pseudomonas aeruginosa in geographically
diverse region of Japan. J Clin Microbiol 2005; 43; 458-561.
30. Koneman WE, Allen DS, Janda MW, Schreckenberger, Winn CW. Enterobacteriae.
Fabián Benencia, Maria Courreges, Octavio Giovanniello, et al. 5° ed. Diagnóstico
Microbiológico texto y atlas a color. Buenos Aires, Argentina; México Médica
Panamericana, 2001. Pp. 171-242.
31. Koneman WE, Allen DS, Janda MW, Schreckenberger, Winn CW. Protocolo 12.
Prueba de utilización de citrato. Fabián Benencia, Maria Courreges, Octavio
62
Giovanniello, et al. 5° ed. Diagnóstico Microbiológico texto y atlas a color. Buenos
Aires, Argentina; México Médica Panamericana, 2001. Pp. 1271-1272.
32. Koneman WE, Allen DS, Janda MW, Schreckenberger, Winn CW. Protocolo 58.
Prueba de oxidación-fermentación (Hugo y Leifson). Fabián Benencia, Maria
Courreges, Octavio Giovanniello, et al. 5° ed. Diagnóstico Microbiológico texto y
atlas a color. Buenos Aires, Argentina; México Médica Panamericana, 2001. Pp.
1333-1334.
33. Lagatolla C, Tonin EA, Monti-Bragadin C, Dolzani L, Gombac F, Bearzi C, et al.
Endemic carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa with acquired metallo-β-
lactamase determinants in European hospital.Emerging Infect Dis 2004; 10:535-
538.
34. Landmann D, Bratu S, Alman M, Quale J. Citywide emergence of Pseudomonas
aeruginosa strains with reduced susceptibility to polimyxin B. J Antimibrob
Chemother 2005;55:954-957.
35. Laupland KB, Parkins MD, Church DL, Gregson DB, Loue TJ, COnly JM, et al.
Population bases epidemiological Study of infections caused by carbapenem
resistant Pseudomonas aeruginosa in the Calgary Healt Region: importance of
Metallo-β-lactamase (MBL) producing strains. JID 2005; 192: 1606-1612.
36. Lee K, Chong Y, Shin B, Kim YA, Yong D, Yum JH. Modified Hodge and EDTA
disk synergy test to screen metallo-β-lactamase producing strains of Pseudomonas
and Acenitobacter species. CIM 2001;7:88-102.
37. Lee K, Lim JB, Yum JH, Yong D, Chong Y, Kim JM, et al. blaVIM-2 Caessette-
containing novel integrons in Metallo-β-Lactamase producing Pseudomonas
aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminates in a Korean hospital.
Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 1053-1058.
38. Livermore DM, Woodrford. The β-lactamase threat in Enterobateriaceae,
Pesudmonas earuginosa and Acinetobacter. TREND Microbiol 2006; 14:413-420
39. MacFaddin JF. Prueba en agar con hierro de Kligler/ azúcar y triple hierro. Silva
Rondinone y Octavio Giovaniello. 3ª ed. Pruebas bioquímicas para la identificación
de bacterias de importancia clínica. Argentina: Medica Panamericana 2003. Pp.223-
235.
40. Marchiaro P, Mussi MA, Ballerini V, Pasteran F, Viale AM, Vila AJ, Limansky.
Sensitive EDTA based microbiological assay fro detection of metallo-β-lactamases
in non fementative gram negative bacteria. J Clin Microbiol 2005; 43:5648-5652
63
41. Martínez AG, Anaya AMC, Ávila FC. Incidencia de bacteriemia y neumonía
nosocomial en una unidad de pediatría. Salud Pública Mex 2001; 43:515-523.
42. McGowan JE. Resistance in nonfermeting gram-negative bactrea multidrug
resitance to the maximum. Ame J Med 2006;119:S29-S36
43. Mo Bio Labortories Inc. Ultraclean microbial DNA Isolation kit 12224-50. 2006:1-
5.
44. Murphy TA, Simm AM, Toleman MA, Jones RN, Walsh TR. Biochemical
Characterization of the acquired Metallo-β-Lactamase SPM-1 from Pseudomonas
aeruginosa. Antimicrob Agent Chemother 2003; 47;582-587.
45. Navaneeth BV, Srifaran D, Sahay D, Belwadi M. A preliminary study on metallo B-
lactamae producing Pseudomonas aaeruginosa in hospitalized patients. Indian J
Med Res 2002;116:264-268.
46. NORMA Oficial Mexicana de Emergencia NOM-EM-002-SSA2-2003, Para la
vigilancia epidemiológica, prevención y control de las infecciones nosocomiales.
México, DF. 2003
47. NORMA Oficial Mexicana de NOM-026-SSA2-1998, Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de las infecciones nosocomiales. México D.F.
1998.
48. Osman BG, Caylan R, Tosun I, Sandall C, Aydin K, Koskal I. Molecular
epidemiology of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates carrying the IMP-1
metallo-β-lacatamasese gene in a university hospital turkey. Microb Drug Resis
2007; 13: 191-198.
49. Pacheco RD, Camacho VM, Jiménez GC, Peregrino BJ, Miranda NG. Perfil de
susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos aislados en hemocultivos. Enf
Infec Microbiol 2006; 26; S61.
50. Pagani L, Colinon C, Migliavacca R, Labonia M, Docquier JD, Nucleo E, et al.
Nosocomial outbreak caused by multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa
producing IMP-13 Metallo-β-Lactamase. J Clin Microbiol 2005; 43; 3824-3824
51. Peterson DL, Bonomo RA. Extended spectrum β-lactamases: a clinical update. Clin
Microbiol Rev 2005; 18; 657-686.
52. Peterson DL, Ko ChW, Gottberg VA, Mohopatre S, Casellas JM, Goosens H, et al.
Antibiotic therapy for Klebsiella pneumoniae bacteremia: implication of production
of extended spectrum β-lactamases. Clin Infect Dis 2003; 39: 31-37.
64
53. Picăo RC, Andrade AA, Nicoletti AG, Campana EH, Morales Gc, Mendes RE,
Gales AC. J Clin Microbiol 2008;46:2028-2037.
54. Piorel L, Girlich D, Naas T, nordmann P. OXA-28, an extended spectrum variant of
OXA-10 β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa and its plasmid an integron
located gene. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45; 447-453.
55. Ponce de León S, Rangel FS, Elñias LJ, Romero OC, Huertas JM. Infecciones
nosocomiales: tendencias seculares de un programa de control en México. Salud
Pública Mex. 1999; 41: S5-S11.
56. Pournaras S, Tsakris A, Maniati M, Tzouvelekis LS, Maniatis AN. Novel variant
(blaVIM-4) of the metallo-β-lactamase gene blaVIM-1 in a clinical strain of
Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:4026-4028.
57. Riccio LM, Pallecchi L, Doquier JD, Cresta S, Tatiana MR, Pagani L, et al.
Epidemiologically unrelated Pseudomonas aeruginosa strain producing the VIM-1
Metallo-β-lactamase from different Italian hospitals. Antimicrob Agents Chemother
2005; 49: 104-110.
58. Rossolini GM, Mantengoli E. Treatment and cogtrol of severe infection caused by
multiresistant Pseudomonas aeruginosa. Eur J Clin Microbiol Inf Dis 2005;11:S17-
S32.
59. Sasha P, Wieczorek P, Hauschild T, zorawski M, Olszanska D, Tryniszewska E.
Metallo-β-lactamases of Pseduomonas aeruginosa a novel mechanism resistance to
β-lactam antibiotics. Folia Histochem Cytobiol 2008; 2:137-142.
60. Sanfrod P Jay. Enterobacterias. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin; Diana
Klajn, Eduardo L. Balbachan et al. 5° ed. Enfermedades Infecciosas principios y
práctica. Buenos Aires, Argentina: México. Médica Panamericana, 2000. Vol. 1. Pp:
2243-2254.
61. Sasaki M, HiyamaE, Takesue Y, Kodaira M, Sueda T, Yokohama T. Clinical
surveillance of surgical imipenem-resistant Pseduomonas aeruginonsa infection in a
Japanese hospital. J Hosp. Infect 2004; 56: 111-118.
62. Shibata N, Doi Y, Yamane K, Yagi T, Kurokawa H, Shibayama K, et al. PCR
typing of determinants for metallo-β-lactamases and integrases carries by gram
negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron. J Clin
Microbiol 2003; 41: 5407-5413.
65
63. Sifuentes OJ, GOnzalez R Y Ponce de LA. Epidemiology and prognosis of
Pseudomonas aeruginosa bacteremia in a tertiary care center. Rev Invest Clin 1998;
50: 383-388.
64. Suarez JC, Kattán JN, Guzmán AM, Villegas MV. Mecanismos de resistencia a
carbapenémicos en P. aeruginosa, Acinetobacter y Enterobacteriaceae y estrategias
para su prevención y control. Infecto 2006; 10: 85-93.
65. Thomsom KS, Smith ME. Version 2000: the new β-lactamases of Gram-negative
bacteria at the dawn of the new millennium. Microbies and Infection 2000;2: 1225-
1235.
66. Tinoco JC, Moysen Js, Perez OMC, Santillán MG, Salcido GL. Epidemiología de
las infecciones nosocmiales en un hospital de segundo nivel. Salud Pública Mex
1997; 39: 25-31.
67. Toleman MA, Bennett PM, Walsh TR. ISCR elements: novel gene capturing system
of the 21 st century?. Microbiol Mol Biol Rev 2006;70:296-316.
68. Toleman MA, Simm AM, Murphy TA. Molecular characterzarion of SPM-1, a
novel metallo-β-lactamase isilates in Lartin America: report from SETNRY
antimicrobial surveillance program. J Antimicrob Chemother 2002;50:673-679.
69. Velazco R.V, Martínez MI, Papua GA, Martínez OV, Cicero SR, Calva MJ. Efecto
de un programa educativo en la incidencia de las infecciones intrahospitalarias. Enf
Infec y Micro 2001; 21:73-79.
70. Velazco RV, Martínez OV, Roiz HJ, Huazano GF, Nieves RA. Calculo del tamaño
de muestra.1 ed. Muestreo y Tamaño de Muestra: una guía práctica para el personal
de salud que realiza investigación. Buenos Aires, Argentina. e-libro.net. 2003.
Pp.41-50.
71. Villegas MV, Lolans K, Olivera MR, Suárez CJ, Correa A, Queenan AM, et al. Frist
detection of Metallo-β-lactamase VIM-2 in Pseudomonas aeruginosa isolates from
Colombia. Antimicrob Agent Chemother 2006; 50; 226-229.
72. Walsh S, Evaluation oa a new E-test for detecting metallo-β-lactamases in routine
clinical testing. J Clin Microbiol 2002;40:2755-2759.
73. Walsh TR, Toleran Ma, Poirel L, Nordmann P. Metallo-β-Lactamases: the quiet
before the storm?. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 306-325.
74. Weldhagen FG, Poriel L, Nordamm. Ambler class A extended spectrum β-
lactamases in Pseudomonas aeruginosa: novel developments and clinical impact.
Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 2385-2392
66
75. Weldhagen GF. Integrons and beta-lactamases a novel perspective on resistance. Int
J Antimicrob Agents 2004; 23:556-562.
76. Wood, AIJ, Gold HS y Moellering CR. Antimicrobial drug resistance. N Engl J Med
1996; 335: 1445-1453.
67
AGRADECIMIENTOS
Unidad de Investigación Biomédica IMSS Durango
M en C Irma Ramirez
QFB Yvain Salina
Hospital General de Durango
Dr. Juan Carlo Tinoco
Tec Lab Lorena Salcido
Centro de Investigación Biomédica
D en C Alberto Villaseñor
D en C Mayra Quiñones
M en C Martha Carranza
Hospital Regional Universitario
Dra Claudia Torres
QFB Lorena Garcia
QFB Zoila Carrillo
Laboratorio Estatal de Salud Pública
QFB Sergio Medina
Facultad de Medicina
D en C Iván Delgado
M en C Ignacio Ángel
M en C Héctor Galván