Nathalia Andrea Tamayo GonzálezAdolfo Zuluaga Gil

INTRODUCTION

Prostate cancer has not an effective therapy, due

to the high cell’s apoptosis resistance that cause cells proliferation

and cause metastatic tumors.

Recently, science has used gene therapy as a

treatment. They use many techniques to

deliver DNA into cells, but the most useful is

non virus derived ‑ ‑vectors as protein P53.

INTRODUCTION

In this study, they used the wild type P53 as a

gene therapy to treat the prostate cancer and

compared its efficiency with or without other

techniques.

They divided the study in 8 groups and used some techniques as Sonoporation and

ultrasound to spread the effect of wild type

P53

TRANSFECTION

It’s a technique used to introduce additional DNA fragments in mammalian cells

DNA recombinant

virus

P53It’s a tumor suppressor protein, that regulates the cell cycle:

Repairing DNA Stop the cycle Apoptosis

CANCERIt´s the cell apoptosis resistance, proliferation and survival of cells within the primary or metastatic tumors.

PROSTATE CANCERThis cancer originates in peripheral zone of prostate. It’s is the second most frequently men’s cancer, but its cause isn’t even discovered. the signs and symptoms are:

1. slow of urinary spread.2. Leaked of urine. 3. Blood in urine or semen

LIPOSOMES• It is a small vesicle made with the same material of the cell

membrane.• Liposomes can be filled with drugs, and it is used to

administer drugs for cancer and other diseases.

Cancer

Malignant cell’s apoptosis resistance and the proliferation of itself.

What is it?

What answer?

Protein P53

How?

Repairing DNA, stop the cycle and apoptosis.

Type

Malignant cell’s growth in prostate peripheral zone

prostate cancerWhat they used?Liposomes

The way to transport the treatment

And these contain...

Transfection

MATERIALES Y MÉTODOS

PC-3 Banco de célulasDulbecco's modified

Eagle medium (DMEM)

suero fetal bovino

37°C con humidificación de aire con 5% CO2

Cultivo

Se contaron las células con un

hemocitómetro.

MATERIALES Y MÉTODOS

ULTRASONIDO Para la transfección de un gen

Microburbujas eco-contraste

MATERIALES Y MÉTODOSULTRASONIDO

Usar una sonda de ultrasonido a 21 kHz

Se cubre con un gel de transmisión con una

intensidad promedio de 46 mW/cm2

Control de 20% (2 segundos activo y 8 inactivo) por 5 min

A un diámetro de 13mm

MATERIALES Y MÉTODOSPreparación del plásmido.Se corta el ADN en dos sitios a través de 2 ER:

1.Sal1 2.Xho 1

A 37°c por 2h

MATERIALES Y MÉTODOSPreparación del plásmido.

1.Luego del uso de las E.R. la P53 fue clonada en EZNA usando T4 ADN ligasa.

2.El plásmido fue transformado en DH5∝3.Se confirmó la presencia del plásmido a

través de la PCR

MATERIALES Y MÉTODOS

PCRClonación acelular o amplificación in vitro cuya finalidad es aumentar el número de copias de una secuencia particular de ADN, consta de 3 pasos.

Desnaturalización Hibridación Replicación

Lisis celular • Proceso de ruptura de la membrana celular, que produce la

salida del material intracelular.• El número de células fue contado con un hemocitómetro.

MATERIALES Y MÉTODOS

GRUPOS CONTENIDO

1 Control

2 SonoVue

3 Ultrasonido

4 SonoVue + Ultrasonido

MATERIALES Y MÉTODOSTransferencia

1.Se usó uso lipofectamina 2000 kit2.Los reactivos se añadieron a la muestra de

PC33.Se resuspendieron las muestras4.Se añadió SonoVue en los grupos que lo

requerían.

MATERIALES Y MÉTODOSRT-PCR

Su fundamento es la amplificación a través de un ADNc a través de:1.transcriptasa inversa 2.PCR

MATERIALES Y MÉTODOSRT-PCR

Las secuencias de nucleótidos fueron:1. 5' GAC AGC CAA GTC TGT GAC TTG 3' ‑ ‑

Su reversa: 5'-CGC TAT CTG AGC AGC GCT CAT G 3'‑2. 5'-TGA CAA CAG CCT CAA GAT CATC 3' ‑

Su reversa: 5'-AGA GGC AGG GAT GAT GTT CTG G 3'.‑

MATERIALES Y MÉTODOS

Western Blot.

Es un método de identificación de secuencias de ADN, el cual no usa sondas.

Se hace luego de transferir la P53

MATERIALES Y MÉTODOSProliferación celular

Cada grupo de células se sembró en grupos de 3x10^3 células por pocillo en placas de 96 pocillos

24 horas después, fueron incubadas.

Medidas con una densidad óptica de

450 nm.

MATERIALES Y MÉTODOS

Apoptosis

1. La apoptosis celular fue evaluada usando FITC (Fluorescein Isothiocyanate) y PI (Propidium iodide).

2. 24 horas de incubación, las Células fueron cosechadas y lavadas usando PBS (resuspender).

3. Citometría de flujo. donde se determinó una rápida apoptosis celular.

Vía de destrucción o muerte celular programada

o provocada por el organismo

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Citometría de flujo

● Técnica aplicable en el diagnóstico de forma rápida.● Capaz de reconocer una población celular en una muestra donde

predominan otras poblaciones.● Ofrece diversa información de cada una de las células analizadas y

permite la comparación con otras células incluidas en el análisis.

● Tamaño celular.

● densidad● Mecanismos

de fluido en membrana

General objective

Research a way to improve the transfection of wild type P53 into PC3 cell line to make apoptosis and suppress the tumor growth

RESULTADOSEficiencia de trasnfección génica:

RESULTADOS

DISCUSSION

PC-3 Transfection PC3 + P53

That cause

Cell apoptosis

Deletion in P53 gene is associated

with 24% of prostate tumours

AUTHOR What the author said

YES/NO

25. Bai WK, Wu ZH, Shen E, Zhang JZ and Hu B

Low frequency and low energy ultrasound improve the liposome

mediated transfection.

YES

32. Ecke TH, Schlechte HH, Hübsch A, Lenk SV, Schiemenz

K, Rudolph BD and Miller K.

Deletion of P53 gene can cause cell proliferation because of its

suppressor inaction.

YES

33. pta K, Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A,

Babcook MA, Jackson MW and Gupta S

Deletion of P53 gene occurs in 24% of primary prostate tumours

YES

36. Manome Y, Nakayama N, Nakayama K and Furuhata H

Low frequency of ultrasound induce a mechanic and

cavitation effects

NO

RESULTADO

In this study, they used low

frequency ultrasound that

cause less tissue

absorption and tissue injury

Even with low frequency and energy ultrasound, it was registered lysis of PC3 cells.

Low ultrasound could be used as a cancer therapy.

DISCUSSION

CONCLUSIONS1.The cell proliferation is less in groups with

microbubbles and ultrasound because of the induction of apoptosis.

2.Cavitation of microbubbles stimulates the permeability of membrane and that fact let the get in easily.

CONCLUSIONS• liposomes are involved in the increase of the

P53 protein transfection. • The use of sonoVue without ultrasound is not

an efficient technique to treat prostate cancer because the cell lysis is not increased.