Dr.ssa  M.  Giachelia,  Dr.  S.  Hohaus    

Is#tuto  di  Ematologia  (Università  Ca7olica  del  Sacro  Cuore-­‐Roma)    

 Novità  e  prospe,ve  nello  studio  della  Mala,a  Minima  Residua  (MMR)  nelle  neoplasie  ematologiche  

Linfoci6co  7%  

Burki;  1%  

Linfoblas6ci        2%  

T  periferici   7%  

Anaplas6ci   2%  

Altri   8%  

Linfoplasmacitoide  2%  

Marginali  8%  

Diffusi  a  grandi    cellule  B  

35%  

Mantellari  6%  

Follicolari  (LF)  22%  

Linfomi  Non-­‐Hodgkin  

Aggressivi

Storia  naturale  dei  linfomi  follicolari  

Tempo    (Anni)  

APvità  di  m

alaP

a  

Diagnosi  

Wait  &    Watch  

Terapia  di  1°  linea  

Terapia  di  2°  linea  

Trasformazione  

Terapia  di  3°  linea  

Recidiva   Recidiva  

Zinzani  et  al.  SIE,  SIES,  GITMO  revised  guidelines  for  the  management  of  follicular  lymphoma.  Am  J  Hematol.  2013    

mantenimento

consolidamento

Fa;ori  prognos6ci  no6  nei  LF  

FLIPI  Età  >  60aa  

Stadio  di  Ann-­‐Arbor  III-­‐IV  Hb  <  12  g/dl  

n°  sedi  linfonodali  >  5  LDH  >  UNL  

 

FLIPI  2  Età  >  60aa  

Infiltrazione  midollare  Hb  <  12  g/dl  

Lnf  di  diametro  maggiore  >  6cm  β2-­‐microglobulina  >  UNL  

 

Solal-­‐Céligny  P,  2004   Federico  M,  2009  

Gruppo di rischio   N di fattori di rischio   OS a 5 anni   OS a 10 anni  Basso   0-1   91%   71%  

Intermedio   2   78%   51%  Alto   ≥3   52%   36%  

Frequenza:  80-­‐90%  >90%  iperespressione  di  Bcl-­‐2    Pun6  di  ro;ura  :  -­‐  MBR  (60%)    -­‐  mcr  (10%)    -­‐  icr  -­‐          vcr    MMR:    -­‐  BIOMED-­‐2    -­‐   nested-­‐PCR  -­‐   Q-­‐PCR  

Studio  della  MalaPa  Minima  Residua:  BCL2/IGH  t(14;18)(q21;q32)    

 

Limi6:        -­‐  iden<ficabile  solo  nel  55-­‐60%  dei  casi  (MBR-­‐mcr)        -­‐  presente  anche  nel  5-­‐13%  dei  soggeK  sani  (Limpens  et  al  Blood  1995)          -­‐  Significato  prognos<co?  

Mutazioni  in  geni  regolatori  dei  fenomeni  epigene6ci  nei    B-­‐cell  NHL  (FL  &  DLBCL)  

MLL2  89%  FL  

32%  DLBCL  

CREBBP  32.6%  FL  29%  DLBCL  

EZH2  7-­‐22%  FL  

14-­‐22%  DLBCL  -­‐GC  

(Morin  RD  et  al.  Nature  2011;  Pasqualucci  L.  et  al.  Nature  2011;  Ryan  RJH  et  al.  PloS  ONE  2011)  

Alterazioni  nella  me6lazione  del  DNA  nelle  cellule  tumorali  

Ipome6lazione  globale  →  aKvazione  di  elemen<  trasponibili  e  instabilità  genomica    Iperme6lazione  gene-­‐specifica  dei  promotori  →  silenziamento  genico  e  perdita  di  funzionalità  

Cellula    normale  

Cellula    tumorale  

Trascrizione  aNva  

Silenziamento  genico  

Death  Associated  Protein  Kinase-­‐1  (cr  9q21.33)  

DAPK1:  

• coinvolta  nel  pathway  apopto6co  mediato  da  INFγ,    TGFβ,  FAS,  TNFα,  c-­‐MYC    • silenziamento  mediato  da  iperme6lazione  del  promotore  del  gene    • rido;a  espressione  in  tumori  testa  collo,  della  mammella,  del  rene,  della  vescica,  NSCLC,  malaPe  linfoprolifera6ve  a  cellule  B,  mieloma    • nei  LF  è  l’  alterazione  epigene6ca  più  comune  sinora  descri;a,  con  una  frequenza  del  75-­‐80%  (Rossi  et  al  Haematologica  2004)  

 

Complete  response  

Par<al  remission  

Relapse/progression  

Diagnosis  

P1  P2  P3  P4  P5  P6  P7    

Valutazione  della  MMR  

Domande  aperte:      

• L’iperme<lazione  di  DAPK1  è  un  evento  specifico  nei  LF?  Esiste  un  range  di  me<lazione  «normale»  nei  soggeK  sani?  

 • Rappresenta  un  biomarcatore  prognos<co  per  i  LF,  affiancabile  allo  score  

FLIPI?  

• Può  fornire  informazioni  a  sostegno  delle  aduali  scelte  terapeu<che  in  termini  di  Wait&Watch,  mantenimento  o  consolidamento?    

 • Quale  potrà  essere  la  sua  futura  applicazione  per  lo  studio  della  malaKa  

minima  residua?    

Methylight-­‐PCR  assay  Bisulfite  Con

version  of  gDN

A  

Control  Reac6on  for  Input  DNA  

     

Area  Lacking  CpG  Dinucleo<de  (no  Methyla<on  

Dependent  Sequence  Discrimina<on)  

Quan6ta6ve  MethyLight  Technology  

       

Sequence  Discrimina<on  at  the  

level  of  PCR  Amplifica<on  and  Probe  

Reference  Ge

ne  

Target  Gen

e   Sensibilità: 10-4

ACTB

DAPK1

Diluizioni  seriali  di  DNA  completamente  me<lato  in  DNA  non  me<lato  

Ct  

%  me<lazione  

(Hoque  et  al,  2005)    

Linee  guida  ESG-­‐MRD-­‐ALL  (van  der  Velden  et  al.  2007a)    

               

                                         

STUDY  POPULATION  

(n=107)  

W&W  (n=24)  

OTHER  THERAPIES  

(n=3)  

R-­‐Chemo    (n=75)  

s6ll  in  W&W  (n=14)  

OTHER  THERAPIES  

(n=8)  

R-­‐Chemo  (n=7)  

Pazien6  con  linfoma  follicolare  in  esame  e  strategie  terapeu6che  

R-­‐Chemo  group  (n=82)  

No  post-­‐induc6on  therapy  (43)  Consolida6on  therapy  (15)  

Maintenance  therapy    (24)  

Domande  aperte:      

• L’iperme<lazione  di  DAPK1  è  un  evento  specifico  nei  LF?  Esiste  un  range  di  me<lazione  «normale»  nei  

soggeK  sani?    

• Rappresenta  un  biomarcatore  prognos<co  per  i  LF,  affiancabile  allo  score  FLIPI?  

• Può  fornire  informazioni  a  sostegno  delle  aduali  scelte  terapeu<che  in  termini  di  Wait&Watch,  mantenimento  o  consolidamento?    

 • Quale  potrà  essere  la  sua  futura  applicazione  per  lo  studio  della  malaKa  

minima  residua?    

Bone Marrow Lymph-node Peripheral Blood

FL (n=26) 23%

CTR (n=5)

0.46%

FL (N=107) 0.25%

CTR (N=15) 0.10%

FL (N=63) 0.15%

CTR (N=38) 0.10%

DAPK

1  methyla<o

n  levels  (%

)  

Median

p=0.004 p<0.0001 p<0.0001

Livelli  di  me6lazione  di  DAPK1  alla  diagnosi  

1.4%  

0.2%  

(85%) (58%) (40%)

Domande  aperte:      

• L’iperme<lazione  di  DAPK1  è  un  evento  specifico  nei  LF?  Esiste  un  range  di  me<lazione  «normale»  nei  soggeK  sani?  

 

• Rappresenta  un  biomarcatore  prognos<co  per  i  LF,  affiancabile  allo  score  FLIPI?  

• Può  fornire  informazioni  a  sostegno  delle  aduali  scelte  terapeu<che  in  termini  di  Wait&Watch,  mantenimento  o  consolidamento?    

 • Quale  potrà  essere  la  sua  futura  applicazione  per  lo  studio  della  malaKa  

minima  residua?    

Bone Marrow     N. Pts   median (%)   p value*  

Stage IV   40   0.52   0.005  I-III   67   0.21    

BM positive   41   1.81   <0.00001  negative   58   0.17  

B- Symptoms yes   7   2.15   0.158  no   100   2.25    

LFN >6cm   36   0.37   0.430  ≤6cm   70   0.24  

LFN >4   65   0.69   <0.00001  <4   42   0.16    

LDH >UNL   13   0.37   0.108  <UNL   94   0.25  

β2-m >UNL   35   0.40   0.123  <UNL   51   0.24    

Hb <12   22   0.31   0.455  ≥12   85   0.25  

FLIPI ≥2   41   0.44   0.009  0-1   66   0.21    

FLIPI2 ≥1   68   0.37   0.036  0   18   0.18  

BCL2-IgH positive   45   0.34   0.562  negative   62   0.24    

     

Livelli di metilazione di DAPK1 alla diagnosi e caratteristiche cliniche dei pazienti

PFS  nei  pazien6  tra;a6  in  prima  linea  con  immunochemio-­‐terapia  

Analisi  mulSvariata  per  la  PFS  

Domande  aperte:      

• L’iperme<lazione  di  DAPK1  è  un  evento  specifico  nei  LF?  Esiste  un  range  di  me<lazione  «normale»  nei  soggeK  sani?  

 • Rappresenta  un  biomarcatore  prognos<co  per  i  LF,  affiancabile  allo  score  

FLIPI?  

• Può  fornire  informazioni  a  sostegno  delle  aduali  scelte  terapeu<che  in  termini  di  Wait&Watch,  

mantenimento  o  consolidamento?      

• Quale  potrà  essere  la  sua  futura  applicazione  per  lo  studio  della  malaKa  minima  residua?  

 

PFS  in  base  alla  terapia  di  mantenimento/consolidamento  

Pazien<  iperme<la<  (>0.2%)    alla  diagnosi  

(n=50)  

Pazien<  non  me<la<  (≤0.2%)    alla  diagnosi  

(n=32)    

p=0,02  

PFS  nei  pazien6  che  in  prima  linea  hanno  seguito  un  approccio  Wait&Watch  (n=27)  

Tempo  (mesi)    

Sopravvivenza  libera  da  tra;amento  (n=27)  ROC  analysis  (n=17)  

Cut-­‐off    di  me6lazione  =0.34%  

Prob

abilità  di  sop

ravviven

za  (%

)  Sensibilità  100%  Specificità  83%  

p=0.01  

Domande  aperte:      

• L’iperme<lazione  di  DAPK1  è  un  evento  specifico  nei  LF?  Esiste  un  range  di  me<lazione  «normale»  nei  soggeK  sani?  

 • Rappresenta  un  biomarcatore  prognos<co  per  i  LF,  affiancabile  allo  score  

FLIPI?  

• Può  fornire  informazioni  a  sostegno  delle  aduali  scelte  terapeu<che  in  termini  di  Wait&Watch,  mantenimento  o  consolidamento?    

 • Quale  potrà  essere  la  sua  futura  applicazione  per  lo  

studio  della  malaKa  minima  residua?    

Me6lazione  di  DAPK1  nel  MO  alla  diagnosi  e  dopo  terapia  di  induzione  

(0.2%)  76%  

24%  

100%  

DAPK

1  methyla<o

n  levels  (%

)  DA

PK1  methyla<o

n  levels  (%

)  

Time  (months)  

Me6lazione  di  DAPK1  nel  MO  alla  diagnosi  e  durante  il  follow-­‐up  

Time  (months)  

Is#tuto  di  Ematologia      

V.Bozzoli    F.D’Alò    G.Massini    M.C.Tisi    F.  Guidi    E.  Cupelli    M.T.  Voso    G.  Leone    S.Hohaus  

 

Is#tuto  di  Anatomia  Patologica    

M.  Mar<ni    L.  M.  Larocca    

 Associazione  per  il  PROgresso  della  Terapia  Intensiva  ONcoematologica  

"R.Fasanari  "  

(N=107)  DAPK1

methylation status  

>0.2%   ≤0.2%  

BC

L-2

/IgH

 

Positive  28

(26%)  17

(16%)  

Negative  34

(32%)  28

(26%)  

Concordanza tra DAPK1 e BCL2-IGH nel MO alla diagnosi

Concordanza  del  52%  

Il  74%  è  pos  per  almeno  un  marcatore  molecolare  nel  MO  

58%  

42%