UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

ANÁLISE SOBRE A CARACTERIZAÇÃO UTILIZADA NO EXERCÍCIO DE

COMPARABILIDADE DE UM MEDICAMENTO BIOSSIMILAR

Carolina Sayuri Arashiro

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da Universidade

de São Paulo.

Orientador(a):

Prof. Dr. Ricardo Pinheiro de Souza

Oliveira

São Paulo

2018

3

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviaturas .......................................................................... 4

RESUMO .......................................................................................... 7

1. INTRODUÇÃO 8

2. OBJETIVOS 11

3. MATERIAIS E MÉTODOS 11

4. RESULTADOS 12

5. DISCUSSÃO 18

6. CONCLUSÃO 30

7. BIBLIOGRAFIA 31

4

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AUC Ultracentrifugação analítica

CCDA Citotoxicidade celular dependente de anticorpo

CD Dicroísmo circular

CDC Citotoxicidade dependente de complemento

CDR Regiões determinantes de complementaridade

CE-SDS Eletroforese capilar acoplada a SDS

CEX-HPLC Cromatografila líquida de alta performance com troca catiônica

cIEF Focalização isoelétrica capilar

DSC Calorimetria de varredura diferencial

DTT Ditiotreitol

EGA European Generic Agency

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática

EMA European Medicines Agency

ESI Ionização eletrospray

FCDA Fagocitose celular dependente de anticorpo

FcγR Receptor Fc gama

FDA Food and Drug Administration

FTIR Espectrometria infravermelha transformada Fourier

HC Cadeia pesada

HDX Troca Hidrogênio/Deutério

5

HPLAEC-PAD Cromatografia de troca iônica de alta performance com detecção de pulso amperométrico

HPLC Cromatografia líquida de alta performance

HR Alta resolução

ICH International Conference on Harmonisation

IEC-HPLC Cromatorafia líquida de alta performance com troca iônica

IEF Focalização isoelétrica

IgG Imunoglobulina G

IPEA Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada

LC Cadeia leve

m/z massa/carga

mAb Anticorpo monoclonal

MALDI-TOF Ionização e dessorção a laser assistida por matriz

MS Espectrometria de massas

NMR Ressonância magnética nuclear

PB Produto biológico

PBC Produto biológico comparador

pI Ponto isoelétrico

qToF Analise de massas por tempo de vôo

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

RP-HPLC Cromatografia líquida de alta performance com fase reversa

SEC-MALLS Cromatografia de exclusao molecular acoplada ao espalhamento de luz em múltiplos ânguloa

SH Grupo tiol

6

SPR Ressonância de superfície plasmônica

SV Velocidade de sedimentação

Tm temperatura de fusão média

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

WHO/OMS Organização Mundial da Saúde

7

RESUMO

ARASHIRO,C.S. Análise sobre aspectos de qualidade utilizados no exercício de comparabilidade de um medicamento biossimilar. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Palavras-chave: Biológico; Biossimilar; Caracterização; Comparabilidade; Estrutura; INTRODUÇÃO: O biossimilar é um produto semelhante a um produto biológico já registrado e comercializado. Para que seja registrado no Brasil, é necessário demonstrar a similaridade ao produto referência no país em termos de qualidade, segurança e eficácia. Para tanto, é feito o exercício de comparabilidade. Nele, são demonstradas a qualidade, a estabilidade, o processo de fabricação, entre outros. No quesito qualidade, é necessário demonstrar a similaridade nas propriedades físico-químicas, na atividade biológica e especificações. Este trabalho visa analisar as técnicas utilizadas no exercício de comparabilidade para caracterização do produto. OBJETIVO: Análise crítica das técnicas e metodologias utilizadas na caracterização de biossimilares disponíveis na bibliografia. MATERIAL E MÉTODOS: A literatura abordada abrangerá a legislação brasileira vigente, farmacopeias, guias, artigos científicos e outros materiais contendo técnicas dos exercícios de comparabilidade relativas à estrutura funcional, propriedades físico-químicas e biológicas de biossimilares. Na busca de referências foram utilizadas as seguintes bases de dados: PubMed, Web of Science, Science Direct e Scielo. Serão acessados sites de referências como Anvisa, EMA, FDA e WHO. As seguintes palavras-chave foram Biossimilar; Biotecnologia; Caracterização; Comparabilidade; Desenvolvimento; Estrutural; Funcional; Intercambialidade; Imunogenicidade; Inovador; Qualidade; Regulatório. RESULTADOS: As técnicas analíticas se mostraram sensíveis e robustas para caracterização dos biossimilares e dos produtos referência. Foi possível demonstrar as semelhanças e diferenças com o produto comparador. As diferenças encontradas foram investigadas e avaliadas. CONCLUSÃO: Muitas caracterizações utilizam os mesmos tipos de técnicas e mesma estratégia de caracterização, demonstrando convergência das mesmas. Entretanto, as diferenças entre os produtos não podem ser avaliadas apenas pela qualidade, mas também pela eficácia e imunogenicidade, sendo necessários os ensaios pré-clínicos e clínicos.

8

1. INTRODUÇÃO

O surgimento dos medicamentos biológicos possibilitou à sociedade novas

formas de tratamento para diversas doenças que até então eram tratadas apenas

com medicamentos sintéticos ou não possuíam tratamento. Diferentemente dos

medicamentos sintéticos, cuja síntese é química e molécula pequena, os

biológicos são produzidos através de organismos vivos ou tecidos e possuem

moléculas muito maiores e mais complexas. Exemplos de medicamentos

biológicos são: vacinas, enzimas, insulina, hormônio de crescimento, heparinas, e

anticorpos monoclonais (VITOLO et al., 2015).

Os medicamentos biológicos são produzidos através da expansão de

células contendo gene de interesse e posterior expressão da proteína. Depois,

isola-se e purifica-se a proteína para envase e comercialização (AL-SABBAGH et

al., 2016). Todas estas etapas devem ser controladas e implementadas, haja vista

a qualidade, eficácia e segurança do produto final.

Os anticorpos monoclonais são uma classe de medicamentos biológicos, os

quais são utilizados em tratamentos oncológicos, em doenças autoimunes e

outras indicações. Com a entrada dessa classe de medicamentos houve um

avanço na terapia oncológica, que antes era realizada através de quimioterapia e

radioterapia, as quais são muito agressivas ao sistema imune do paciente.

Diferentemente delas, os efeitos colaterais da imunoterapia são bem menores

devido à alta especificidade do tratamento, o que contribui também para a

aderência do paciente no tratamento com anticorpos monoclonais (PINHO, 2004).

A queda da patente dos medicamentos biológicos possibilitou à indústria

farmacêutica criar versões semelhantes a um produto biológico (PB), denominado

biossimilar, também chamado produto biológico comparador (PBC). Mais uma vez,

comparando-se biológicos a sintéticos, é errôneo dizer que os biossimilares são as

versões “genéricas” dos biológicos, pois são medicamentos muito mais complexos

e não necessariamente idênticos, como no caso dos genéricos. Disto deriva seu

nome biossimilar, visto que não é uma cópia idêntica do medicamento

referência/comparador, e sim um medicamento altamente similar (ANVISA, 2017).

9

Apesar dos biossimilares não serem idênticos ao medicamento biológico

comparador, em 2017 a ANVISA emitiu uma nota sobre os biossimilares serem

novas alternativas ao paciente dependendo da especificidade e estágio do

tratamento, resposta imunológica do paciente, dentre outros fatores. Isto não

apenas é benéfico ao paciente, como também gera impactos na economia, pois

pode ser uma alternativa mais acessível ao tratamento contra o medicamento

referência (EGA, 2008).

O advento da entrada dos genéricos no Brasil possibilitou à população

brasileira maior acesso a medicamentos, e também gerou impactos financeiros ao

Estado através de novos medicamentos ao mercado e competitividade. Em

pesquisa feita por Vieira F.S. (2018), analisou-se que o gasto do SUS em 2016

apenas em medicamentos foi de 18,6 bilhões de reais. Além disso, nesta mesma

pesquisa, mostrou-se que entre 2010 e 2016, houve aumento das despesas com

imunobiológicos e hemoderivados (64,7% e 151,9%, respectivamente), somando

2,8 bilhões de reais nestas duas categorias. Os medicamentos biosimilares podem

ser uma alternativa a parte destes custos, haja vista o seu menor custo de

produção comparado ao PBC, o qual utilizou muitos recursos em Pesquisa e

Desenvolvimento. Isto gera ao Sistema de Saúde uma oportunidade de redução

de custos e melhor aproveitamento dos gastos públicos. Para tanto, fez-se

necessário que a Agência Regulatória regulasse a entrada dos medicamentos

biossimilares para que apenas os medicamentos qualificados sejam registrados e

comercializados.

A ANVISA iniciou a regulamentação de biossimilares em 2010, enquanto

FDA e EMA criaram regulamentações em 2009 e 2005, respectivamente

(DALLER, 2015). Até o momento, foram registrados os medicamentos pena

ANVISA os medicamentos da Tabela 1. Apesar da Agência Brasileira

regulamentar os biossimilares posteriormente, a legislação brasileira destes

medicamentos foi baseada fortemente nas regulamentações internacionais, o que

contribui para os critérios de regulamentação deste medicamento. Isto mostra que

há tendências de aceitação e regulamentação harmonizada destes medicamentos

mundialmente.

10

O PB não é produzido com as mesmas linhagens de células, nas mesmas

condições de produção e equipamentos necessariamente iguais a do PBC.

Entretanto, o produto final deve ser altamente similar ao PBC. O medicamento

biossimilar deve demonstrar sua comparabilidade através da qualidade, eficácia e

segurança para que seja registrado em algum país. Para tanto, é descrito um

Exercício de Comparabilidade. Nele, serão discutidas as características do

produto, sua comparabilidade não-clínica e clínica. Desta forma, será possível

verificar a comparação do PB com o PBC nos parâmetros de qualidade, eficácia e

segurança (ANVISA; FDA; EMA). Além disso, dentro do dossiê, deve haver um

plano de avaliação de riscos feito através da farmacovigilância, assim como um

medicamento biológico comparador, a fim de verificar os efeitos pós-

comercialização deste produto.

Todas estas informações visam verificar a similaridade do medicamento

biossimilar ao medicamento comparador e demonstrar que o medicamento possui

resultados não-inferiores ao medicamento referência que não foram sinalizados

antes de obtenção do registro. Este trabalho irá focar nas técnicas de análise da

caracterização utilizada no exercício de comparabilidade de um medicamento

biossimilar, principalmente na classe dos anticorpos monoclonais.

11

Tabela 1. Biossimilares aprovados no Brasil até Setembro de 2018.

Nome comercial

Ativo

Fabricante Data de aprovação

na ANVISA

Admelog

insulina lis/pro

Sanofi-Aventis Farmacêutica Ltda Set/2018

Basaglar

insulina/glargina

Eli Lilly do Brasil Ltda Jun/2016

Fiprima

Filgrastim

Eurofarma Laboratórios S.A

Jan/2016

Glargilin

insulina/glargina

BIOMM S. A. Jul/2018

Remsima

Infliximabe

Cellltrion HealthCare Distribuição de

Produtos Farmacêuticos do Brasil Ltda

Mai/2015

Renflexis

Infliximabe

Zedora

Trastuzumab

Samsumg Bioepis BR

Biopharmaceutical Ltda

Libbs Farmacêutica Ltda

Jul/2018

Dez/2018

Fonte: Anvisa (2018)

2. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho foi analisar criticamente as técnicas utilizadas na

caracterização de um produto biossimilar dentro de um Exercício de

Comparabilidade para fins de registro na ANVISA.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Neste trabalho avaliou-se a literatura científica acerca de biossimilares e sua

caracterização. As referências utilizadas foram as seguintes bases de dados:

PubMed e Scielo. Além disso, foram referenciadas as seguintes agências e/ou

organizações: ANVISA, EMA, FDA, WHO, HEALTH CANADA e ICH. Foram

utilizadas as seguintes palavras-chave: Biossimilar; Biotecnologia; Caracterização;

12

Comparabilidade; Desenvolvimento; Estrutural; Funcional; Intercambialidade;

Imunogenicidade; Inovador; Qualidade; Regulatório.

3.1. Estratégias de pesquisa

3.2. Critérios de inclusão: foram incluídos as referências que contém:

caracterização; produtos biológicos; elucidação de estrutura; ensaios analíticos;

exercício de comparabilidade; guias de Regulamentação de Biossimilares;

3.3. Critérios de exclusão

Não foram consideradas as referências anteriores a 1990 e em idiomas que

não sejam inglês ou português.

4. RESULTADOS

4.1. Produtos biológicos:

Os medicamentos biológicos são usualmente proteínas de alto peso molecular.

Para identificá-las é necessário entender sobre a sua estrutura. Proteínas são uma

estrutura de polímeros de aminoácidos nas quais as ligações pépticas são rígidas

e planas. As proteínas têm quatro padrões estruturais:

Estrutura primária: é a estrutura mais simples, constituída da sequência de

aminoácidos e das ligações de sulfeto (caso existam);

Estrutura secundária: arranjo espacial dos radicais de aminoácidos

próximos, contendo padrões em α-hélice e folha pregueada β, por exemplo.

Estrutura terciária: arranjo espacial de aminoácidos distantes, que

interagem por forças químicas fracas como Força de Van Der Waals, força

hidrofóbica, força eletrostática e força induzida dipolo-dipolo.

Estrutura quaternária: arranjo espacial dos contatos das cadeias

polipeptídicas.

13

Figura 1: Ilustração das estruturas de uma proteína. Imagem retirada de

University of Tokyo CSLS

Modificações pós traducionais:

Algumas modificações ocorrem após a síntese de proteínas, como por

exemplo, a glicosilação. Esta modificação é comum em proteínas extracelulares e

esta relacionada com a meia-vida da proteína e sua solubilidade, melhorando-as.

A Tabela 2 demonstra alguns tipos de modificações pós-traducionais.

14

Tabela 2. Tipos de modificações pós-traducionais.

Modificação Exemplo

Processamento proteolítico Várias proteínas se tornam biologicamente ativas

somente após a clivagem (p. ex.: fatores do

sangue)

Glicosilação Pode aumentar a solubilidade, o transporte

intracelular, a meia-vida e as atividades biológicas

Amidação Influencia a atividade e a estabilidade biológica de

peptídeos

Hidroxilação Importante para estrutura de algumas proteínas

Sulfatação ou sulfação Influencia a atividade biológica de alguns

neuropeptídios e o processamento proteolítico de

polipeptideos

Tabela 2. Adaptada de VITOLO et al., 2015.

Estrutura do anticorpo monoclonal

Os anticorpos são moléculas produzidas e secretadas por um linfócito B, o

qual faz parte do sistema imune. Os anticorpos são responsáveis pela

neutralização de micro-organismos, ativação do sistema complemento,

opsonização de patógenos, citotoxicidade mediada por células dependente de

anticorpos, entre outras (ABBAS et al., 2011). Em um anticorpo típico, como o IgG,

por exemplo, são verificados quatro cadeias: duas leves e duas pesadas. As

cadeias leves se ligam às pesadas através de interações não-covalentes e por

pontes dissulfeto.

As cadeias leves e pesadas são constituídas por cerca de 110 resíduos de

aminoácidos os quais se dobram em uma forma globular denominada domínio Ig.

Este domínio possui duas camadas de lâminas β -pregueadas contento de três a

cinco fitas de cadeias polipeptídicas antiparalelas. As lâminas β-pregueadas são

conectadas por pontes disulfeto e as fitas por alças curtas. Cada uma destas

cadeias tem uma região amino-terminal V variável a qual contribui para o

conhecimento do antígeno e uma região carboxi-terminal constante C, a qual

15

medeia as funções efetoras das moléculas de anticorpo (ABBAS et al., 2011).

Ambos os tipos de cadeia possuem regiões hipervariáveis, as quais possuem

sequências complementares à estrutura tridimensional do antígeno, chamadas

CDR (regiões determinantes de complementaridade). Nas regiões Vh e Vi são

determinadas a CDR1, CDR2, E CDR3, nas quais os resíduos de aminoácidos se

ligam ao antígeno. As figuras 2A e 2B demonstram a estrutura do anticorpo IgG.

Figura 2A. Diagrama esquemático da molécula secretada por IgG. O sítio de ligação ao antígeno é formado pela justaposição dos domínios Vl e Vh. As regiões de cadeia pesada terminam nas caudas. As localizações dos sítios de ligação de proteínas do sistema complemento e do receptor de Fc nas regiões constantes de cadeia pesada são aproximações. Figura 2B. Ligação de um antígeno à molécula de anticorpo mostra que o sítio de ligação ao antígeno acomoda macromoléculas solúveis na sua conformação natural. As cadeias pesadas estão em vermelho, as cadeias leves em amarelo e os antígenos são azuis (ABBAS et al., 2011).

4.2 Exercício de Comparabilidade

A RDC 55 de 16 de Novembro de 2010 denomina comparabilidade como

“comparação científica, no que diz respeito a parâmetros não-clínicos e clínicos

em termos de qualidade, eficácia e segurança, de um produto biológico com um

produto biológico comparador, com o objetivo de estabelecer que não existam

16

diferenças detectáveis em termos de qualidade, eficácia e segurança entre os

produtos”. Ou seja, as diferenças entre o PB e o PBC devem ser mínimas e não

podem interferir na qualidade, eficácia e segurança. Os itens abaixo são os

requerimentos da ANVISA relativos à qualidade que são utilizados no Exercício de

Comparabilidade e que estão disponíveis no Guia para Realização do Exercício de

Comparabilidade para Registro de Produtos biológicos (ANVISA, 2011).

4.2.1. Aspectos de Qualidade

O produto biológico deve demonstrar dados de caracterização e processo

de fabricação similares ao PBC. Quanto maior a semelhança entre o PB e o PBC,

há maior segurança clínica e não-clinica. Além disso, todas as diferenças no

produto e processo de fabricação devem ser justificadas e seus impactos

avaliados. Para demonstrar a comparabilidade entre os dois medicamentos PB e

PBC, é necessário fazer a caracterização de ambos.

4.2.1.1. Técnicas de análise

Segundo a ANVISA, devem ser utilizadas técnicas do estado-da-arte e

cobrir toda a caracterização das proteínas do produto, ou seja, devem demonstrar

“a estrutura, a função, a pureza e a heterogeneidade” dos produtos. Além disso,

deve-se avaliar as limitações analíticas de cada método. Todas essas técnicas

devem cobrir integralmente as características do produto a fim de minimizar os

efeitos na parte clínica. Todos os métodos devem ser validados para utilização na

caracterização e liberação do produto.

4.2.1.2. Caracterização

A ANVISA exige que a caracterização deva ser feita relativo à: (1) princípio

ativo (estrutural): identificação da estrutura primária (deve ser idêntica); (2)

atividade biológica; (3) pureza; (4) impurezas; (5) substâncias (variantes)

relacionadas com o produto; (6) propriedades imunoquímicas (quando aplicável);

(7) investigação das diferenças encontradas entre o PB e o PBC: p.ex: justificativa

17

do perfil da glicosilação, a atividade biológica que sabe-se estar relacionada com

atividade clínica e a atividade de ligação do receptor.

4.2.1.3. Propriedades físico-químicas

A ANVISA exige que sejam demonstrados: (1) o grau de heterogeneidade

da molécula; (2) estruturas de ordem superior (secundária terciária e quaternária,

se for o caso); (3) Ensaio de atividade biológica caso não seja possível obter os

dados necessários relativos às estruturas de ordem superior ; (4) Investigação das

mistura das formas modificadas pós-traducionalmente, caracterização e avaliação

do impacto.

4.2.1.4. Atividade biológica

A atividade biológica está altamente relacionada com o efeito biológico.

Espera-se que a atividade biológica in vitro e in vivo. Além disso, podem-se

estimar as atividades dos variantes da proteína, os quais dependendo serão

substâncias relacionadas ao produto ou impurezas. Os testes biológicos podem

ser utilizados também para substituir a caracterização da estrutura quartenária, ou

também pode-se usar evidências clínicas e não-clinicas para tal. Todos os testes

devem ser feitos em relação à indicação do medicamento, ou seja, deve-se

verificar a atividade de todos os sítios de ação. A atividade biológica in vitro e in

vivo pode ser determinada de várias formas, uma dela é a potência. O

mecanismo de ação de diversos mAbs é através da inibição da ligação ao receptor

alvo de antígeno/anticorpo. A atividade pode ser dividida em dois tipos:

Atividade biológica relacionada à porção Fab;

o Atividade de ligação à célula-alvo

o Atividade de apoptose;

Atividade biológica relacionada à porção Fc (MORAIS et al., 2013):

o Citotoxicidade dependente de complemento (CDC): ligação da

proteína C1q ao complexo antígeno-anticorpo que desencadeia o

sistema complemento.

18

o Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (CCDA): células

efetoras (macrófagos, neutrófilos e células NK) ligadas ao complexo

antígeno-anticorpo pelo receptor Fc (FcR), liberam gramzinas,

granulisina, e perforinas.

o Fagocitose celular dependente de anticorpo (FCDA): fagócitos e

neutrófilos com receptor FcR e receptores complemento (CR)

ativando a fagocitose.

5. DISCUSSÃO

5.1. Caracterização do princípio ativo:

5.1.1. Mapeamento peptídico

A sequência de aminoácido deve ser idêntica a do produto referência,

entretanto, durante a tradução das proteínas, pode haver erros. Caso ocorram,

deve-se justificar as mesmas e avaliar os impactos em segurança, farmacocinética

e farmacodinâmica (BECK et al., 2013). Para a análise da estrutura primária, é

muito utilizada a análise de baixo para cima, “bottom-up”, na qual é feita a

digestão proteica através de enzimas como papaína, pepsina, IdeS, hidrólise

química para frações LC, HC, Fab, Fc, Fab, entre outros (ABBAS et al., 2011).

Depois, as frações proteicas são separadas por um HPLC e analisada por MS

(Figura 3). Com isso, é possível investigar a sequência de aminoácidos, pontes

dissulfeto, e modificações pós-traducionais. É necessário também verificar

possíveis modificações N-terminal e C-terminal, como por exemplo: acetilação,

amidação e heteregeneidades (p. ex.: processamento C-terminal, piroglutamação

N-terminal, oxidação, isomerização, mismatch de pontes dissulfeto, glicação,

agregação) (WHO, 2009). As pontes dissulfeto e grupos sufidrila devem ser

analisados também e comparados ao referência (Tabela 3). Estas mudanças nas

modificações pós traducionais podem alteram a farmacocinética e devem ser

investigadas durante a produção (PARR et al., 2016).

Por ter alta resolução se tornou padrão ouro utilizar o RPLC. Além disso, é

possível acoplá-lo ao MS. O mapeamento peptídico é um parâmetro crítico ao

19

produto, visto que qualquer modificação na sua sequência pode levar a formação

de outro produto que não o desejado, e assim, não obter o resultado esperado.

Em todos os artigos estudados, os PB possuíam a mesma sequência peptídica do

PBC, apenas alguns possuíam variações na terminação C-lys (infliximabe, em

estudo de JUNG et al., 2014).

Figura 3. Cromatograma espelhado de mapeamento peptídico obtido por RP-HPLC do produto teste HS628 e da referência tocilizumabe. Obtida de MIAO et al. (2017). Nota-se que perfil de picos entre os dois produtos são altamente similares.

Tabela 3. Caracterização por LC-ESIMS/MS em condições não redutoras do PB SB2 e PBC imfliximabe. (HONG et al., 2017). P:Cadeia pesada. L: cadeia leve. Região Tipo Peptideos ligados

à ponte dissulfeto

Nº pontes

dissulfeto

m/z esperada m/z

experimental

SB2

m/z

experimental

referência

P Intra-

cadeia

P:Cys22-H:Cys98 (H:T3-

H:T12)

P:Cys147-H:Cys203 (H:T15-P:T16) P:Cys264-H:Cys324 (H:T23-P:T29) P:Cys370-H:Cys428 (H:T37-P:T42)

1

1

1

1

886.90 (4)

1132.00 (7)

777.04 (3)

769.97 (5)

886.90

1131.99

777.04

769.97

886.90

1131.99

777.04

769.97

L L:Cys23-L:Cys88 (L:T2-L:T7)

L:Cys134-L:Cys194 (L:T10-

L:T17)

1

1

1141.71 (5)

712.16 (5)

1141.72

712.16

1141.72

712.16

P e L Inter-

cadeia

H:Cys223-L:Cys214 (H:T20-

L:T19)

1 757.25 (1) 757.25

757.25

Região

hinge

H:Cys229-Cys229DH:Cys232-

Cys232

H:Cys229-Cys229DH:Cys232-

Cys232

2 780.26 (7) 780.27 780.27

20

5.1.2. Grupos tiois livres

O ensaio mais utilizado foi o Teste de Ellman. Por utilizar uma solução que

reage especificamente com os tióis e libera um grupo cromóforo (ácido 5-

mercapto-2-nitrobenzoico) que absorve luz, é possível verificar a presença dos

tiois livres no produto. Entretanto, o range de aceitação foi variável entre produtos,

por exemplo 0.11 – 0.12 ( mols de SH livres/ mols de IgG) em infliximabe e 0,4

mols em tocilizumabe (JUNG et al., 2014; MIAO et al., 2017).

5.1.3. Estrutura secundária e terciária

A estrutura do produto está diretamente relacionada com o seu mecanismo de

ação, porém, diversos fatores podem afetar a estrutura, como por exemplo:

temperatura, pH e reagentes. Devido ao alto peso molecular desses produtos,

técnicas usuais como cristalografia raio X e NMR não são capazes de caracterizar

totalmente uma proteína (KWON et al., 2017). Assim, para verificar as estruturas

secundária e terciária são necessárias várias técnicas ortogonais para demonstrar

a estrutura. Dentre elas:

Espectroscopia de dicroísmo circular (CD): através de diferenças na

absorção entre a luz polarizada à esquerda e direita, demonstra o estado

de enovelamento das proteínas. É possível verificar as estruturas α-Hélice,

folha-β e outros enovelamentos devido ao formato característico e

magnitude do espectro CD e influência dos anéis aromáticos dos

aminoácidos e das pontes dissulfeto. A Figura 4 demonstra um exemplo de

espectrograma de com regiões perto (near-UV) e longe do UV (far-UV).

Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (FTIR): a

radiação infravermelha é absorvida em diferentes comprimentos de onda

pela amostra. O espectro final é característico da amostra, sendo a sua

“digital”

Calorimetria de varredura diferencial (DSC): demonstra as temperaturas de

fusão de uma proteína (Tm). O termograma irá demonstrar a temperatura

de desnaturação das proteínas e assim, verificar os picos e os domínios

que estão sendo desnaturados. Apresentam Tm e desvio padrão.

21

Espectroscopia de massas com troca Hidrogênio-Deutério (HDX-MS):

Outras como cross-linking e espectroscopia de massas com mobilidade

iônica. (IMS).

A WHO indica que para essas técnicas, deve-se atentar a capacidade e

limitações desses métodos, como por exemplo, o impacto da concentração

proteica (WHO, 2009).

Figura 4. Comparação do espectro CD do PB HS628 e do originador tocilizumabe.

(a) Espectro Far-UV e (b) Espectro Near-UV (MIAO et al., 2016)

5.2. Massa molar e tamanho

5.2.1. Massa molar

Para quantificar a massa do PB é feita a separação do composto de outras

impurezas e separação do princípio ativo em partes que possam ser detectadas e

caracterizadas em relação ao seu peso (ex: RP-HPLC-MS, LC-ESI-qToF-MS).

Neste caso, são utilizadas enzimas e agentes redutores para secção das porções

do anticorpo, p. ex.:

Digestão com protease com agente redutor (ex.: DTT): geração de um

fragmento F(ab’)2 , Fc, ou também de cadeias leves e pesadas.

Digestão com protease sem adição de agente redutor: separação do

monômero dos fragmentos e variantes de alto peso molecular.

22

Para descobrir se a massa molecular corresponde ao produto, é feita uma

comparação da massa teórica dos resíduos de aminoácidos com massa obtida

através da proporção m/z (massa/carga) dos resultados. Com isso, é possível

verificar se as clivagens estão ocorrendo nos sítios corretos e se cada cadeia é

constituída de fato por aqueles resíduos. Além disso, a CE-SDC não-redutora

consegue demonstrar presença de pontes dissulfeto e sua posição, o que está

diretamente relacionado com a estrutura da proteína (LIU et al., 2016). Logo, os

espectros gerados devem ser comparáveis e superpostos entre o PB e o PBC.

5.2.2. Agregados e fragmentações

Os agregados são estruturas que podem se formar durante a fabricação do

produto, a partir de pequenos dímeros ou fragmentos. Com o tempo, se tornam

estruturas maiores visíveis ou não caso a transição seja termodinamicamente

favorável (VÁZQUEZ-REY et al., 2011). A técnica de escolha de muitos estudos

foi o AUC (ultracentrifugação analítica) ou SV-AUC (ultracentrifugação analítica de

velocidade de sedimentação), um método ortogonal ao SEC. A partir da

ultracentrifugação, as moléculas se dividem pelo peso respectivo e são analisadas

por detectores UV, por exemplo. Para caracterização de fragmentos de mAbs,

utiliza-se também o CE-SDS, na qual detecção pode ser UV também.

5.3. Glicosilação

A glicosilação é uma modificação pós-traducional que pode ser influenciada

pela cultura celular e pelo sistema de expressão utilizado (NAM et al., 2008), e

está diretamente o efeito terapêutico, como por exemplo, a eficácia, meia-vida,

estabilidade e segurança. (PLANINC et al., 2016). A maior parte dos produs

biológicos possui N-glicanos, os quais são oligossacarídeos ligados a um resíduo

de asparaginina através de um atómo de nitrogênio. Um desse tipo de N-glicano é

a oligomanose, a qual pode ser imunogênicos, então deve ser controlada na

Qualidade. Outros exemplos de alteração do perfil de glicosilação são rituximab e

trastuzumabe, cujas atividades ADCC aumentaram em até 100 vezes após

remoção da fucose (IIDA et al., 2006; MORI et al., 2007).

Para um PB, o perfil de glicosilação deve ser altamente similar ao PBC, pois pode

afetar a farmacocinética, a atividade biológica e a depuração deste produto. Em

23

especial, a EMA sugere atentar-se aos graus de manosilação, galactosilação,

fucosilação, e sialização e determinar a distribuição das estruturas glicanos (EMA,

2014. A Figura 5 mostra um exemplo de perfil de glicosilação do PB e PBC.

Parr et al. (2016) sugere quatro tipos de análise glicoproteicas :

1. Análise glicoproteica intacta: utilização de MALDI-TOF-MS ou para análise

da massa exata de glicoproteinas com massa até 40 kDa e ESI–MS para

diferenciar diferentes tipos de massas na análise de mAbs;

2. Análise de glicopeptídeos pelo sítio de glicosilação: análise bottom-up de

glicoproteínas através da quebra enzimática, separação por LC e

fragmentação por MS/MS. Verificação do sítio correto de glicosilação;

3. Análise dos glicanos liberados através do padrão de oligos-sacarídeos:

redução da glicoproteína através da PNGase (peptídeo-N4-(N-acetil-beta-

glicosaminil)asparagina amidase), que cliva a ligação do oligossacarídeo à

Asp. Análise por HPLC-FLD com fluorescência ou LC-MS. A análise de

glicanos por cromatografia de troca iônica acoplada a detecção

amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Consegue identificar o tipo de

glicano da composição;

4. Análise da composição de monossacarídeos, identificando e quantificando

a concentração de açúcares neutros, amino açúcares e ácido sialico.

PLANINC et al. (2016) desenvolveram uma comparação das técnicas separadas

pelo tipo de análise (Tabela 4).

24

Tabela 4. Resumo dos métodos analíticos de caracterização de glicosilação.

Caracterização

do glicano

Técnica de

separação/detecção

Vantagens Desvantagens

Análise direta CE-HR-MS

LC-HR-MS

-Perfil de massa intacto

-Detecção de MPT

-Detecção de diferentes

isoformas

-Método rápido

Mapeamento

dos glicanos

CE/LC-

fluorescência/MS

MALDI-TOF

-Composição detalhada

dos glicanos

-Separações de alta

resolução

-Qualidade consistente e

performance robusta

- Técnica demorada

Determinação

de N-glicanos

LC-MSMS (CID, ETD)

LC-HRMS

LC-fluorescência

-Determinação de

diferentes sítios de

ocupação

-Técnica demorada

-Requer expertise

Analises da

composição de

monossacaríde

os

AEC-PAD

GC-MS

CE-UVVIS/MS

-Determinação de

complexos de glicanos

-Alta sensitividade

-Separação da linha de

base

-Sem derivação de

açúcares

-Requer expertise

25

Figura 5. Perfil de glicosilação do SB2 e PBC infliximabe. (A) Perfil de glicosilação. (B) %Total glicanosafucosilados (C)%glicanos galactosilados (D) %glicanos com carga. Linha preta: linha de similaridade. (HONG et al., 2017).

5.4. Carga e variantes

5.4.1. Carga

Um dos métodos mais utilizados entre os artigos citados foi a focalização

isoelétrica capilar (CIEF). O método consiste em separar a amostra de acordo com

a carga através de um capilar de carga neutra por eletroforese capilar e utilizar um

método de detecção, como por exemplo, UV. Outro método muito utilizado foi a

focalização isoelétrica (IEF), na qual é feito uma eletroforese em gel em diversos

pHs e marcadores de pI. O resultado deve ser um perfil de cargas comparáveis,

com picos e área sob a curva semelhantes. Caso houvesse variantes não

esperados, o variante era caracterizado. Por exemplo, TOROSANTUCCI et al.

(2013) verificaram que a oxidação de interferon beta-1a formava agregados

imunogênicos.

26

5.4.2. Variantes ácidos e básicos

LIU et al. (2016) utilizaram como método o CEX-HPLC ou IEC-HPLC para

detectar as cargas e variantes ácidos e básicos do PB ABP501. Usando uma

coluna analítica WCX-10 4.0 9 250 mm (Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA) e

detecção UV, os variantes e o PB foram comparáveis ao adalimumab (PBCs da

Europa e dos Estados Unidos). Também foi possível calcular a pureza do produto

a partir do cromatograma obtido. No caso do PB CT-P13 (biossimilar do

infliximab), a análise por IEC-HPLC, houve variantes básicos com terminal C-lys

com proporções diferentes do PBC (Figura 6). Os variantes foram posteriormente

caracterizados e demonstrou-se que in vitro e in vivo são rapidamente clivados,

não tendo efeitos no potencial biológico (JUNG et al., 2014; HARRIS et al., 1995).

Um estudo feito por Miranda-Hernández et al. (2015) demonstrou que

variantes básicos de trastuzumabe ( também devido a presença de terminações

C-lys ) são removidas por carboxipeptidases na corrente sanguínea após duas

horas de administração, não alterando a farmacocinética do produto.

Figura 6. Perfis de carga: comparação entre ABP501 (linha vermelha) adalimumabe (US)(linha preta)e adalimumabe (EU) (linha azul) para perfils de cromatografia líquida de alta performance com troca de cátions tratada com carboxipeptidades B. (a) e perfis de focalização isoelétrica (b). Adalimumabe (EU):

27

registrada na União Europeia. Adalimumabe (US): registrada nos Estados Unidos. AU (unidades de absorbância). pI: ponto isoelétrico. mAU (miliunidades de absorbância) Liu et al. (2016).

5.5. Atividade biológica e propriedades imunoquímicas

Os ensaios a serem feitos dependem do tipo de molécula. Por exemplo,

para bevacizumabe não é necessário os ensaios CDC e CCDA ,pois o VEGF é

um alvo solúvel (EBBERS et al., 2013). Portanto, os ensaios são muito variáveis

de acordo com o produto biológico. Entretanto pode-se verificar que os ensaios

são sempre relacionados à afinidade de ligação com o anticorpo e se há algum

resultado mediado por esta ligação (vide Tabela 5).

Os métodos utilizados em geral se relacionam com:

Medição da potência da ligação ao receptor: através de métodos

fluorimétricos, verifica-se a morte celular liberando compostos

fluorescentes. Ex.: CDC, CCDA. Visser et al. (2013) demonstraram indução

da citotoxicidade (CCDA) pelo PB e PBC de rituximabe. Utilizando método

farmacopeico, eles incubaram células Raji B fluorescentes CD20+ com

concentrações diferentes do PB e PBC e excesso de células NK. Houve a

liberação de fluoróforos das células mortas e pôde-se então medir a

atividade dos produtos.

Método ELISA, o qual detecta a presença de ligação do anticorpo a ao

complemento e adição de enzimas colorimétricas que reagem ao anticorpo-

C1q. Ex.: CDC.

Métodos de ressonância plasmônica de superfície (SPR): através da

imobilização do IgG a uma superfície com biossensor, adiciona-se a

proteína ligante. Depois, verifica-se se houve uma mudança no sinal devido

a acúmulo de massas e, assim calcula-se a constante de dissociação .

Ex.: ligação dos receptores FcγRII/III ao anticorpo adalimumabe

(KRONTHALER et al., 2018).

28

Tabela 5. Resumo dos ensaios funcionais de ABP 501 adalimumabe (US), e adalimumabe (EU). Adalimumabe (EU) registrado na União Europeia. Bioensaio ABP 501

[variação, % (n)]

Adalimumabe (US)

[variação, % (n)]

Adalimumabe (EU)

[variação, % (n)]

Inibição da

apoptose mediada

por TNF

98-110 (10) 95-11 (21) 91-122(18)

CCDA 53-103(10) 41-127(17) 61-114(15)

CDC 94-105(10) 84-105(17) 82-104(15)

Ligação a TNFalfa 96-121(10) 99-128(10) 103-122(10)

Ligaçao a FcRn 86-101(10) 91-114(15) 81-11(14)

Adalimumabe (US) registrado nos Estados Unidos. CCDA: citotoxicidade célula mediada dependente de anticorpo. CDC: citotoxicidade mediada por complemento. FcRn Fc: receptor neonatal, n: número de lotes. TNF: fator de necrose tumoral, TNF-α: fator de necrose tumoral –α, Liu et al. (2016). Resumo de ensaios para APB 501, adalimumabe (US), e adalimumabe (EU).

5.6. Pureza e impurezas

Para caracterizar a pureza do produto e verificar a presença de impurezas

(isoformas, produtos de degradação, da célula hospedeira), é possível utilizar PCR

(reação em cadeia polimerase) (SHAKAR et al., 2008; ZHANG et al., 2014), SEC e

SEC-SDS. O perfil de pureza de SB4 (etanercept) foi maior que o do PBC (CHO et

al., 2016), semelhante entre EP2006 e filgrastim (SÖRGEL et al., 2015), também

entre Hospira filgrastim e Amgem filgrastim (SKRLIN et al., 2010), adalimumabe e

AB 501 (LIU et al., 2016). Caso houvesse diferenças, no guia de avaliação de

produtos bioterapêuticos similares, a WHO explica que as diferenças no grau e

pureza e impurezas devem ser avaliadas pelo potencial impacto clínico e na

eficácia do produto e justificação via resultados ou literatura para tais diferenças.

Diferenças que não se sabe da relevância clínica devem ser avaliadas em outros

estudos ou pós-comercialização

.

29

5.7. Resumo das técnicas analisadas As técnicas utilizadas nos artigos estudados estão descritas na Tabela 6. Tabela 6. Técnicas utilizadas nos artigos estudados para caracterização de anticorpos monoclonais e impacto das modificações do PB. CARACTERIZAÇÃO OBJETIVO METODOLOGIA IMPACTO

BIOLÓGICO/CLÍNICO

Princípio ativo Identificar a sequência de aminoácidos do PB e PBC.

Mapeamento peptídico LC-UV LC-ESI-MS/MS

RP-UPLC-MS reduzido

Pode influenciar potência Pode influenciar farmacocinética

Identificar os padrões de pontes dissulfeto

Mapeamento peptídico não reduzido LC-MS

Pode influenciar potência

Tióis livres Ensaio de Ellman .

Estrutura secundária

Espectroscopia de CD (Far UV, NearUV)

Pode influenciar potência, ligação ao antígeno ou receptor Estrutura

terciária e quartenária

FT-IR DSC H NMR H/DX-MS Cristalografia raio X ITF

Peso e tamanho molecular

Peso molecular

ESI-qToF-MS SEC MALLS MALDI LC-ESI-MS Espectroscopia de CD Far- and near-UV ITF HDX-MS DSC

Pode influenciar potência Pode influenciar farmacocinética.

Dimeros AUC Podem induzir imunogenicidade Pode manter atividade biológica

Fragmentos de anticorpos

SEC

Glicosilação/Glicação e outras modificações postraducionais

Mapeamento de glicanos LC-ESI-MS/MS

Mapeamento peptídico

reduzido RP-UPLC-MS

- Pode influenciar função Fc - Pode induzir imunigenicidade - Pode afetar depuração in vivo - Pode afetar CCDA

Carga Variantes ácidos e básicos:

CEX-HPLC cIEF

- Pode influenciar atividade biológica in vitro

30

pI iCE - Pode influenciar depuração - Pode formar agregados imunigênicos

Atividade biológica

Binding assay Target; Off-target FCy binding; Potência CCDA Potência CDC Inibição da apoptose

SPR ELISA BioensaioCDC Bioensaio CCDA SPR

- Pode afetar o mecanismo de ação - Pode influenciar CCDA, CDC - Pode influenciar na depuração e farmacocinética

Pureza Impurezas

SEC SEC-SDS não reduzido

- Pode levar a imunogenicidade

6. CONCLUSÃO

Os biossimilares são medicamentos que cada vez mais estarão presentes

na indústria farmacêutica e, por serem medicamentos com princípio ativo

complexo e não-idêntico ao produto comparador. É importante que a Agência

Regulatória tenha uma regulamentação cientificamente fundada. As diferenças

entre o PB e o PBC não possuem um critério de aceitação farmacopeico ou

especificação única, sendo o fabricante do PBC responsável por demonstrar que

as diferenças notadas na caracterização não impactarão o produto final nas

etapas clínicas.

Este trabalho demonstrou diversas técnicas do estado-da-arte utilizadas na

caracterização de biossimilares. Os pesquisadores dos artigos estudados

demonstraram a caracterização tanto do PB quanto do PBC e conseguiram

detectar diferenças e semelhanças dos produtos. Ademais, foram investigadas as

diferenças para que não houvesse impacto clínico. Entretanto, apenas a

caracterização não é o suficiente, pois ainda que altamente similar, as diferentes

impurezas, os excipientes ou as características podem causar imunogenicidade

nos ensaios clínicos, o que pode não ser prevista na caracterização. Devido à

extrema complexidade da natureza das proteínas, estas diferenças podem ser

muito singulares e variadas lote-a-lote sendo necessário ter um controle de

31

qualidade com especificações do produto, ainda que diferente do produto

comparador.

A estrutura complexa dos anticorpos monoclonais exige uma caracterização

com métodos robustos e técnicas de estado-da-arte para demonstração dos

dados. Quanto mais se conhece a respeito das características do produto e dos

seus dados clínicos, maior será o desenvolvimento de novos medicamentos

biossimilares.

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Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)

24/09/2017 25/09/2018