UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA: Farmacia y Bioquímica

CURSO: Química orgánica

TEMA: Cromatografía en capa fina de ácido acetil salicílico

PROFESOR: Dr. Cesar Fuertes Ruiton

INTEGRANTES: Cadillo Espinoza Katherine Yuliana

Conislla Vigo Alberto Noé

De la Cruz Tito Fiorella

Quispe Hilario Gisell

Valverde Pingo Exer Leonel

AÑO: Primero

SEMESTRE: 2012-II

Lima, Octubre del 2012.

INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla.Esta separación se logra utilizando un sistema bifásico: fase estacionaria donde se retienen los compuestos a separar y fase móvil que desplaza de forma diferencial los compuestos a través de la fase estacionara.Dependiendo de la naturaleza de las fases, se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía:

Cromatografía sólido-líquido: la fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido. Cromatografía líquido-líquido: ambas fases son líquidos y en la estacionaria el líquido se

ancla a un soporte sólido. Cromatografía líquido-gas: la fase estacionaria es un líquido no volátil sobre soporte

sólido y la fase móvil un gas. Cromatografía sólido-gas: la fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria y la fase móvil atraviesa el sistema desplazándo los componentes de la mezcla a distintas velocidades que dependen de la afinidad de los mismos por cada una de las fases. Se denomina elución a la migración de los componentes de la mezcla a lo largo de la fase estacionaria impulsados por la móvil.

Existen otras clasificaciones para los distintos tipos de cromatografía:

A) En función de la interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y las fases móvil y estacionaria:

Cromatografía de adsorción: se producen interacciones de tipo polar siendo la fase estacionaria un sólido.

Cromatografía de partición: la separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla entre las dos fases siendo ambas líquidas. Cuando la estacionaria es menos polar que la móvil se denomina cromatografía en fase inversa.

Cromatografía de intercambio iónico: se producen intercambios entre iones presentes en la fase estacionaria y los del compuesto orgánico solubilizado e ionizado en la fase móvil.

B) En función del tipo de soporte empleado para la fase estacionaria: Cromatografía en columna: utiliza como soporte una columna de vidrio Cromatografía en capa fina: el soporte es una placa de vidrio, aluminio o plástico

La cromatografía se puede emplear para: Conocer el número de componentes de una mezcla e identificarlos por comparación con

patrones, Cromatografía Analítica. Separar mezclas de compuestos y como método de purificación, Cromatografía

Preparativa.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

La cromatografía de adsorción emplea una fase estacionaria sólida de carácter polar, ADSORBENTE y una fase móvil líquida, ELUYENTE. Se utiliza tanto con fines analíticos como preparativos y la separación de los componentes de la mezcla viene determinada por las interacciones polares de los componentes de la misma con las fases estacionaria y móvil. Por lo tanto, los compuestos más difíciles de separar mediante este tipo de cromatografía, serán aquellos que tengan una polaridad muy similar.

FASE ESTACIONARIA: ADSORBENTE

Está constituida por un sólido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su superficie donde se adsorben las moléculas de los compuestos que se van a cromatografiar. Cuanto menor sea el tamaño de partícula de este material mayor será la capacidad de adsorción.La adsorción se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo dipolo inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente más utilizado es la gel de sílice donde las interacciones tienen lugar entre los grupos Si—OH y Si—O—Si; también se emplea con relativa frecuencia alúmina (Al2O3).

El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a cromatografiar. La gel de sílicepresenta carácter ácido y la alúmina puede adquirirse con carácter neutro, ácido o básico.

FASE MOVIL: ELUYENTEEs un disolvente en el que los componentes de las mezcla son, al menos, parcialmente solubles. Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de elución de los compuestos de la mezcla.Se puede utilizar un único disolvente o una mezcla de disolventes e incluso llevar a cabo la elución con un gradiente de polaridad aumentando progresivamente la proporción del disolvente más polar.

RETENCIÓNLas moléculas de soluto S se adsorben en los centros polares de la fase estacionaria X y, a medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente/s que constituyen la fase móvil M. La retención de un soluto se puede justificar por la competencia que se establece entre S y M por adsorberse a los centros polares X, es decir, depende de los valores de las constantes de los equilibrios:—X + S —X•••S—X + M —X•••MQue están en función de:• Polaridad del compuesto a eluir que depende de sus grupos funcionales• Naturaleza del adsorbente• Naturaleza del disolvente

CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA EN CAPA FINA (CCF)

La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada, formando una capa fina de un espesor uniforme sobre una placa de vidrio, plástico o una lámina metálica. La mezcla a analizar se deposita con un capilar a una pequeña distancia del borde inferior de la placa y se introduce en

una cubeta donde está la fase móvil (eluyente), que ascenderá a lo largo de la capa por capilaridad eluyendo a los componentes de la mezcla a distintas velocidades, lo que provoca su separación. Cuando el frente del disolvente se encuentra a 0.5 cm del borde superior, se saca la placa de la cubeta, se marca hasta donde ha llegado el eluyente y se deja secar para, a continuación, proceder a la visualización de las manchas correspondientes a los productos cromatografiados.Determinación del RfSe conoce como Rf (rate factor) la relación entre las distancias recorridas por un compuesto y por el disolvente desde el origen del cromatograma.

Cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas: adsorbente, disolvente, temperatura, etc., tiene un valor constante y característico de Rf. Sin embargo, solo se pueden establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos cuando los dos se eluyan juntos en la misma placa. La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha.

Visualización del Cromatograma

Con luz UV (ultravioleta).- Las placas suelen llevan incorporado un indicador fluorescente que absorbe luz UV y emite luz visible, generalmente verde. Cuando se cromatografían sustancias que absorben en el UV donde se encuentra el compuesto no absorbe el indicador y como resultado vemos una mancha que indica su presencia.

Con un agente revelador.- Se emplea cuando las sustancias no absorben radiación UV. El revelador reacciona con los productos absorbidos dando lugar a compuestos coloreados y por tanto se utilizará uno u otro en función del compuesto que se quiera visualizar.Algunos ejemplos: H2SO4 concentrado en etanol para azúcares, nihidrina para aminoácidos y yodo para compuestos insaturados y aromáticos.

Aplicaciones de la CCFLa CCF es una técnica cualitativa muy utilizada en los laboratorios de QuímicaOrgánica para:

Determinar el número de componentes de una muestra: Precaución si solo hay una mancha muy retenida o aparece junto al frente del disolvente hay que probar otro eluyente.

Comprobar la pureza de un compuesto: aparecerá una sola mancha. Se debe comprobar que solo hay una mancha utilizando distintos eluyentes.

Determinar la identidad de dos compuestos: Hay que tener precaución, pues valores de Rf iguales (o prácticamente iguales) para dos compuestos en una misma placa no garantizan inequívocamente su identidad. En la misma placa hay que cromatografiar una mezcla de los compuestos cuya identidad se quiere comprobar.

Seguir la evolución de una reacción: cada cierto tiempo se cromatografían en una misma placa los reactivos y la mezcla de reacción.

Determinar el disolvente más apropiado para llevar a cabo una separación mediante una cromatografía preparativa (en columna o en placa).

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC)

Es el método más utilizado para la separación y purificación de compuestos orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. La fase estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase móvil). La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase móvil atraviesa el sistema. Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,...) y se analizan por CCF. Los productos van saliendo de la columna según su polaridad, primero salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más polares por su mayor retención en la fase estacionaria.El adsorbente más utilizado para este tipo de cromatografía es la gel de sílice y en segundo lugar la alúmina.El tamaño de partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección depende en gran medida de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a media presión (flash chromatography). En una elución a media presión se pueden emplear tamaños de partícula más pequeños, que permiten una separación más eficaz. Sin embargo, en una elución por gravedad el uso de tamaños de partícula pequeños impediría el flujo del disolvente.Antes de realizar una separación en cromatografía de columna hay que elegir adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS:

Ácido acetilsalicílico obtenido por extracción (práctica n°2) y por recristalización (práctica n°3). Observar Fig. 1.

Ácido acetilsalicílico (muestra estándar)

N-hexano Metanol Cloroformo

Reactivo de cloruro férrico Iodo metálico Aspersador Cromatoplaca de sílica gel Cámara de revelado UV Tubos capilares de vidrio (50-80 cm) Campana extractora

Fig.1. Ácido acetilsalicílico. El frasco traslúcido contiene cristales obtenidos por extracción y el frasco oscuro contiene los cristales obtenidos por recristalización.

MÉTODO OPERATORIO

1. Diluir 0.5 a 1 ml de Cloroformo y metanol (3:1) en 3 tubos de ensayo que contienen una pequeña muestra de 5 mg de cristales de ácido acetilsalicílico obtenidos por extracción, recristalización y una muestra estándar de dicho compuesto (Fig.2 y 3).

Fig.2. Al llenar los tubos de ensayo, tuvimos en cuenta el método del pergamino para evitar

perder muestra.

Fig.3. El llenado de cloroformo a los tubos de ensayo se realizó en la campana extractora.

2. Sellar los tubos capilares de vidrio de tal manera que quede una punta por la cual pueda aplicarse puntadas a la placa cromatográfica de silica gel (Fig.4).

Fig.4. Romper la punta del tubo de ensayo aplicando una pequeña fuerza de tal manera que ésta sea mínima.

3. En la placa cromatográfica de silica gel, marcar el origen (1 cm contando desde el borde inferior) y las posiciones de las 3 muestras a analizar (Fig.5).

Fig.5. Para evitar errores al observar impurezas en el revelado en cámara UV, no tocar la

cromatoplaca directamente.

4. Preparar el sistema de solventes de 12 ml que consiste en vertir N-hexano en un beaker. Posteriormente, introducir la cromatoplaca con un ángulo de inclinación que se aproxime a 45°. (Fig.6).

Fig.6.Tener en cuenta que hay que tapar el beaker que contiene la cromatoplaca, pues el sistema de solventes contiene un compuesto que se evapora.

5. Realizar puntadas débiles a la cromatoplaca con la fase móvil correspondiente contenida en los tubos capilares (siembra). Posteriormente llevarlo a la cámara de revelación UV e identificar las manchas que probablemente pertenezcan al ácido acetilsalicílico (Fig.7).

Fig.6. Las manchas marcadas en círculo demuestran pertenecer al ácido acetilsalicílico por haber recorrido la misma distancia en las tres muestras.

6. Otra manera de reconocer la presencia de ácido acetil salicílica es usando tricloroférrico (FeCl3) y rociarlo por toda la cromatoplaca. Este indicador tiende a colorearse en presencia de grupos fenoles (Fig. 7).

Fig.7.El anión férrico a partir del cloruro férrico tiende a unirse a los alcóxidos. Al unirse, tiende a colorearse amarillo-ámbar.

RESULTADOS

Para el presente experimento se requirió nuevamente aprox. 5 mg de los cristales de ácido acetil salicílico obtenido de la práctica n°3 – Purificación de compuestos orgánicos por cristalización- e igual cantidad de cristales obtenidos por extracción de metabolitos de la práctica n°2 – Extracción de compuestos orgánicos-.

Al plasmar la parte teórica en la práctica, surgió un interrogante: la elaboración de una fase móvil ideal. Como requeríamos de un solvente que no generara tanto desplazamiento, pues el frente de solvente no era muy alejado del origen, se empleó un

solvente que no fuera tan polar pero a la vez sí; por lo tanto, una combinación de 3:1 en relación al cloroformo y metanol respectivamente era ideal, pues disminuiría la polaridad del metanol. Recordemos que la polaridad está directamente relacionado con el desplazamiento recorrido.

La inclinación de la fase estacionaria tenía que ser la más aproximada a 45° posible debido a que la fuerza contra gravedad que sufre la fase móvil seria menor, pero debido a que la realizamos en un beaker pequeño, nuestro ángulo correspondió a 70.35° (Fig. 8).

Fig.7. Cálculo aproximado del ángulo de inclinación de la cromatoplaca.

Al comparar la cantidad y nivel de marcas de la cromatoplaca visualizadas en la cámara de revelado UV, pudimos percibir la presencia de ácido acetilsalicílico en las 3 muestras tomadas. No obstante, también se percibió la posible cantidad de impurezas existentes en las muestras de cristales por extracción y recristalización. A mayor cantidad de marcas visualizadas, mayor contenido de impurezas.

El otro revelador empleado fue escogido en base a sus cualidades cromatóforas, es decir, un compuesto orgánico que en presencia de algún grupo funcional o ion de algún elemento se colorea; en este caso empleamos al cloruro férrico (FeCl3) debido a que cambia de color en presencia de grupos fenólicos. Si bien el ácido acetil salicílico no es reconocido con este indicador, solo es posible el reconocimiento del ácido salicílico, un subproducto que pudo originarse en la extracción y/o recristalización (Fig.9).

Fig.9 .Ácido salicílico. Se puede observar en su estructura el grupo fenólico.

7 cm

2.5 cm

α

Tg α = 7/ 2.5 Tg α = 2.8ArcTg (2.8) = 70.35°

DISCUSIONES

En esta práctica se realizó la cromatografía en capa delgada (C.C.D) de 3 muestras de ácido acetilsalicílico: una de la clase de extracción, otra de la clase de purificación y una última de patrón estándar.

Se empezó diluyendo cada muestra por separado en 1 ml de cloroformo. ¿Se elige el cloroformo por algún motivo especial? En realidad no, pudo haberse elegido alguna otra sustancia que cumpla la condición que diluya al ácido acetilsalicílico, para así poderlo sembrar en la cromatoplaca (fase estacionaria).

Como fase estacionaria se nos facilitó una lámina de aluminio cubierta con sílica gel. Es común usar, en C.C.D., sílica gel como fase estacionaria debido a que es un compuesto polar, perfecto para absorber al soluto por formación de enlaces dipolo y puentes de hidrógeno, y porque es inerte con respecto a varias muestras, evitando así probables reacciones con las muestras de ácido acetilsalicílico.

Luego se preparó el sistema de solventes (fase móvil), en el cual se eligió cloroformo-metanol (3:1). ¿Qué criterio se utilizó para elegir el sistema de solventes antes mencionado y la proporción entre ellos? Para responder, es necesario mencionar que la mezcla de solutos de la muestra es absorbida en la superficie del absorbente y luego desabsorbida por el solvente de la fase móvil, así el más fuertemente atraído por el absorbente es más difícil de eludir y será el que se desplace menos.

Al ser de nuestro interés el criterio de pureza y separación, necesitamos que el desplazamiento del ácido acetilsalicílico sea el adecuado para poder observar el desplazamiento, tal vez mayor o menor, de las impurezas.

Así, para lograr que el ácido acetilsalicílico no sea tan retenido por la silica gel, se necesita tener un sistema de solventes cuyos enlaces sean más fuertes con el ácido acetilsalicílico que este último con la sílica gel. De esta forma se logra un desplazamiento óptimo y una mejor resolución al momento de observar los resultados.

Justo la proporción también se debe a ello, conviene tener más cloroformo, para que se enlace con el ácido acetilsalicílico y este ascienda por capilaridad, que metanol para que lo retenga a la sílica gel por ser polar.

Por otro lado, para poder observar nuestros resultados usamos como reveladores el espectro UV y FeCl3. Con el espectro UV pudimos observar la posición del ácido acetilsalicílico e impurezas de las 2 primeras muestras y compararlas con la muestra patrón. Los puntos de posición del ácido acetilsalicílico de las 3 muestras no eran tan lejanos y hasta se podría decir que coincidían. También se observó otras manchas debajo de las primeras muestras que al parecer se trataría de impurezas. Es aquí que usamos FeCl3, con la cual confirmamos que aquellas manchas antes mencionadas se trataban de impurezas, pues se colorearon de rojo oscuro, color característico de

la reacción del FeCl3 con grupos fenoles, los cuales en esta práctica, por ser el ácido acetilsalicílico el soluto principal, son considerados impurezas.

CONCLUSIONES

Al realizar la cromatografía de capa fina utilizamos como fase móvil una mezcla de cloroformo y metanol, en una proporción de 3:1 respectivamente con la finalidad de hallar una polaridad media ya que el metanol es muy polar y el cloroformo es apolar y la sustancia de esta manera no subiría lentamente ni muy rápidamente y como fase estacionaria se usó la silica gel.

Se sembró tres tipos el ácido acetilsalicílico, uno el que obtuvimos de la extracción, otro por recristalización y el otro que fue la muestra patrón que supuestamente es ácido salicílico puro. Luego se usó dos tipos reveladores para observar nuestra cromatografía y utilizando el revelador UV observamos que en el frente del solvente aparecían puntos en la columna donde sembramos en los tres casos apareció no a la misma altura ya contienen diferente grado de pureza las muestras, luego como solo eso es visible en presencia de iluminación UV utilizamos otro revelador, en este caso el cloruro férrico, con el cual nuestra silica gel se coloreó medio amarillento o marrón en la parte donde había impurezas , la muestra patrón tenia menor grado de impureza.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Wade L.G. “Química orgánica “7º edición. Editorial Pearson educación, México, 2012.

Wade L.G. “Química orgánica “5º edición. Editorial Pearson educación, México, 2004.