AUTOR:
Angarita María.
Abril, 2008
The Leishmania HSP20 Is Antigenic during Natural Infections, but, as DNA Vaccine, It does
not Protect BALB/cMice againstExperimental L. amazonensis Infection
Publicado el 22 de octubre de 2007; revisado de 8 enero de 2008, aceptado 21 Febrero 2008
• Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, La Habana, Cuba
• Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, Madrid, Spain
• Centro colaborador de la OMS para Leishmaniasis, Servicio de Parasitolog´ıa, Centro Nacional de Microbiolog´ıa,
• Instituto de Salud Carlos III, 28220 Madrid, Spain
Estudios previos demostraron que:
• Existen proteínas de choque térmico
• Súper familia Proteínas HSP
• Kinetoplasto
• Sugieren que crea respuesta humoral
La HSP, protege a los protozoarios de los efectos nocivos de la acción
térmica y otros problemas ambientales.
La HSP, protege a los protozoarios de los efectos nocivos de la acción
térmica y otros problemas ambientales.
Describir las características de HSP20 presente en Leishmania amazonensis.
Determinar si es una proteína Inmunogénica.
Crear una posible vacuna.
Asociada con Leishmaniasis cutánea, cutánea difusa, y visceral en América del
Sur y Central.
2 cepas de Leishmania amazonensis2 cepas de Leishmania amazonensis
• Cepa FLA/BR/67Cepa FLA/BR/67
• Cepa MHOM/77 / LTB0016
En la clonación y purificación de la HSP20 recombinante.
Diferentes especies de Leishmania --- HSP
Reacciones Antígeno - Anticuerpo
• PCR
• Análisis filogenético
• ELISA
• Cultivos celulares
BALB / c Se cultivaron a 25 ◦ Cen el medio de cultivo suplementado con un 10% de suero fetal bovino
Cepa de Leishmania amazonensis FLA/BR/67Cepa de Leishmania amazonensis FLA/BR/67
El producto de PCR fue clonado
para generar pCRHSP20 La clon.
En cepas de Escherichia coli (BL21cepa).
Los clones obtenidos fueron expresados
Cultivo celular de 200ul
Plásmido 5ug
Esperma de salmón 100ul
1,5ml de NaCl
200 Volts
72 horas
37º C atmósfera de 5% de CO2
Papel de nitrocelulosa
Anticuerpos diluidos
1/1500
1/2000
Estudiaron diferentes cepas de Leishmania.
Bacterias
Arqueas
Hongos Plantas
Cepas representantes de diferentes Microorganismos:
Ademas de:
Alinearon la HSP, utilizando el algoritmo ClustalW
para construir un árbol filogenético
Demostrando que si se encuentra la HSP en las bacterias, arqueas y
eucariotas
Los Antígenos purificados de Leishmania amazonensis
Suero de hámsters dorados infectados
Suero de pacientes infectados
Suero de caninos infectados
•Inmunofluorescencia Indirecta
•Frotis de Aspirados Medulares
Una vez detectada la Reacción Antígeno Anticuerpo, se procedió a producir antisueros utilizando ratones.
Se preparó el antígeno
antigenoTotal Leishmania Hasta la disminución de la viscosidad
A partir de:
Incubación de los parásitos en buffer de lisis 1%
Se congelo la suspensión
ELISA
Cepa MHOM/77 / LTB0016
BALB / de ratones, se inyectaron en la pierna
Las vacunas de ADN se iniciaron de 6-8 semanas edad
• Como controles negativos, grupos de ratones fueron inyectados, con el vector vacío.
El contra lateral de la pierna de cada animal
Para la inmunización
• La hinchazón se calculará de la siguiente manera: espesor de la pierna izquierda de espesor del derecho pierna.
Secuencia de Saccharomyces cerevisiae
HSP26 secuencia (UniProtKB / Swiss-Prot
entrada P15992).
Secuencia de Saccharomyces cerevisiae
HSP26 secuencia (UniProtKB / Swiss-Prot
entrada P15992).
Los resultados fueron significativos (114 sHSP o superior), lo que sugiere que se puede representar sHSP miembros en las
especies Leishmania.
Los resultados fueron significativos (114 sHSP o superior), lo que sugiere que se puede representar sHSP miembros en las
especies Leishmania.
1.-Identificación de Leishmania sHSPs y análisis de secuencias
UTILIZANDOUTILIZANDO
Leishmania principales, Leishmania infantum,
Leishmania braziliensis
Leishmania principales, Leishmania infantum,
Leishmania braziliensis
una búsqueda BLASTP, para: Como consulta:
También se realizó un análisis filogenético usando representante sHSP secuencias de los diferentes grupos de organismos
También se realizó un análisis filogenético usando representante sHSP secuencias de los diferentes grupos de organismos
Similitudes entre Especies de Leishmania y Trypanosoma Brucei. Forma un grupo monofilético,
separados de los otros grupos de organismos.
Similitudes entre Especies de Leishmania y Trypanosoma Brucei. Forma un grupo monofilético,
separados de los otros grupos de organismos.
Los análisis filogenéticos basados en secuencias con sHSP son suficiente para establecer relaciones evolutivas entre distantes
grupos de organismos.
<< Los análisis muestran que los kinetoplastos sHSPs, estan más cerca de la homólogía con las plantas que a la correspondiente
con las de proteínas animales. >>
2.- El reconocimiento de HSP20 de Leishmania de sueros los animales infectados y pacientes con
leishmaniasis.o El 62% de la Leishmania en animales infectados desarrollo importantes
respuestas humoral contra la HSP20.
o La L. amazonensis HSP20, expresada en E. coli, fue utilizada en ensayos de ELISA para determinar si los anticuerpos contra la HSP20 se obtienen en hámsters infectados experimentalmente .
o Las HSP representan los antígenos dominantes en muchas infecciones y enfermedades autoinmunes.
o Induciendo fuertes reacciones humoral y celular la respuesta inmune Reacciones cruzadas
•Se analizo el tiempo supuesto de aparición de anticuerpos anti-HSP20 a lo largo del proceso de infección
• Se detectó reactividad de anti-HSP20 retardada de los anticuerpos contra las proteínas totales Leishmania.
• Con el fin de saber si la Leishmania HSP20, es reactiva contra rHSP20 durante infecciones naturales de la leishmaniasis, en los
sueros de cánidos y de los pacientes, se determinó de ELISA
todos los sueros de perros con Leishmaniasis reaccionó con
rHSP20,
todos los sueros de perros con Leishmaniasis reaccionó con
rHSP20,
Pocos los sueros de pacientes con leishmaniasis reaccionaron con rHSP20
Pocos los sueros de pacientes con leishmaniasis reaccionaron con rHSP20
La HSP20, no proporciona inmunidad para el sistema
inmunitario humano.
La HSP20, no proporciona inmunidad para el sistema
inmunitario humano.
3.- La inmunoprotección potencial de Leishmania HSP20 como una vacuna de ADN
• Se evaluó la respuesta del ADN en experimentos de vacunación utilizando el modelo de infección de L. amazonensis en ratones.
• A tal efecto, el gen la L. amazonensis HSP20, fue clonado para evaluar la expresión en las células infectadas.
• Hay reactividad contra rHSP20, muy bajos, pero detectables, esto se observó en los sueros de La HSP20 de ADN de ratones.
• No es importante la protección o la reducción de la lesión, la cual fue inducida por el desarrollo en los animales inmunizados con
HSP20 mediante la vacuna de ADN en las condiciones experimentales realizado en este ensayo.
La proteína de Leishmania HSP20 es antigénica durante las infecciones
naturales, pero como vacuna no protege contra la infección por
Leishmania amazonensis aunque no se descarta la posibilidad de que confiera protección contra otras
especies de Leishmania.
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