AUTOR:

Angarita María.

Abril, 2008

The Leishmania HSP20 Is Antigenic during Natural Infections, but, as DNA Vaccine, It does

not Protect BALB/cMice againstExperimental L. amazonensis Infection

Publicado el 22 de octubre de 2007; revisado de 8 enero de 2008, aceptado 21 Febrero 2008

• Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, La Habana, Cuba

• Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, Madrid, Spain

• Centro colaborador de la OMS para Leishmaniasis, Servicio de Parasitolog´ıa, Centro Nacional de Microbiolog´ıa,

• Instituto de Salud Carlos III, 28220 Madrid, Spain

Estudios previos demostraron que:

• Existen proteínas de choque térmico

• Súper familia Proteínas HSP

• Kinetoplasto

• Sugieren que crea respuesta humoral

La HSP, protege a los protozoarios de los efectos nocivos de la acción

térmica y otros problemas ambientales.

La HSP, protege a los protozoarios de los efectos nocivos de la acción

térmica y otros problemas ambientales.

Describir las características de HSP20 presente en Leishmania amazonensis.

Determinar si es una proteína Inmunogénica.

Crear una posible vacuna.

Asociada con Leishmaniasis cutánea, cutánea difusa, y visceral en América del

Sur y Central.

2 cepas de Leishmania amazonensis2 cepas de Leishmania amazonensis

• Cepa FLA/BR/67Cepa FLA/BR/67

• Cepa MHOM/77 / LTB0016

En la clonación y purificación de la HSP20 recombinante.

Diferentes especies de Leishmania --- HSP

Reacciones Antígeno - Anticuerpo

• PCR

• Análisis filogenético

• ELISA

• Cultivos celulares

BALB / c Se cultivaron a 25 ◦ Cen el medio de cultivo suplementado con un 10% de suero fetal bovino

Cepa de Leishmania amazonensis FLA/BR/67Cepa de Leishmania amazonensis FLA/BR/67

El producto de PCR fue clonado

para generar pCRHSP20 La clon.

En cepas de Escherichia coli (BL21cepa).

Los clones obtenidos fueron expresados

Cultivo celular de 200ul

Plásmido 5ug

Esperma de salmón 100ul

1,5ml de NaCl

200 Volts

72 horas

37º C atmósfera de 5% de CO2

Papel de nitrocelulosa

Anticuerpos diluidos

1/1500

1/2000

Estudiaron diferentes cepas de Leishmania.

Bacterias

Arqueas

Hongos Plantas

Cepas representantes de diferentes Microorganismos:

Ademas de:

Alinearon la HSP, utilizando el algoritmo ClustalW

para construir un árbol filogenético

Demostrando que si se encuentra la HSP en las bacterias, arqueas y

eucariotas

Los Antígenos purificados de Leishmania amazonensis

Suero de hámsters dorados infectados

Suero de pacientes infectados

Suero de caninos infectados

•Inmunofluorescencia Indirecta

•Frotis de Aspirados Medulares

Una vez detectada la Reacción Antígeno Anticuerpo, se procedió a producir antisueros utilizando ratones.

Se preparó el antígeno

antigenoTotal Leishmania Hasta la disminución de la viscosidad

A partir de:

Incubación de los parásitos en buffer de lisis 1%

Se congelo la suspensión

ELISA

Cepa MHOM/77 / LTB0016

BALB / de ratones, se inyectaron en la pierna

Las vacunas de ADN se iniciaron de 6-8 semanas edad

• Como controles negativos, grupos de ratones fueron inyectados, con el vector vacío.

El contra lateral de la pierna de cada animal

Para la inmunización

• La hinchazón se calculará de la siguiente manera: espesor de la pierna izquierda de espesor del derecho pierna.

Secuencia de Saccharomyces cerevisiae

HSP26 secuencia (UniProtKB / Swiss-Prot

entrada P15992).

Secuencia de Saccharomyces cerevisiae

HSP26 secuencia (UniProtKB / Swiss-Prot

entrada P15992).

Los resultados fueron significativos (114 sHSP o superior), lo que sugiere que se puede representar sHSP miembros en las

especies Leishmania.

Los resultados fueron significativos (114 sHSP o superior), lo que sugiere que se puede representar sHSP miembros en las

especies Leishmania.

1.-Identificación de Leishmania sHSPs y análisis de secuencias

UTILIZANDOUTILIZANDO

Leishmania principales, Leishmania infantum,

Leishmania braziliensis

Leishmania principales, Leishmania infantum,

Leishmania braziliensis

una búsqueda BLASTP, para: Como consulta:

También se realizó un análisis filogenético usando representante sHSP secuencias de los diferentes grupos de organismos

También se realizó un análisis filogenético usando representante sHSP secuencias de los diferentes grupos de organismos

Similitudes entre Especies de Leishmania y Trypanosoma Brucei. Forma un grupo monofilético,

separados de los otros grupos de organismos.

Similitudes entre Especies de Leishmania y Trypanosoma Brucei. Forma un grupo monofilético,

separados de los otros grupos de organismos.

Los análisis filogenéticos basados en secuencias con sHSP son suficiente para establecer relaciones evolutivas entre distantes

grupos de organismos.

<< Los análisis muestran que los kinetoplastos sHSPs, estan más cerca de la homólogía con las plantas que a la correspondiente

con las de proteínas animales. >>

2.- El reconocimiento de HSP20 de Leishmania de sueros los animales infectados y pacientes con

leishmaniasis.o El 62% de la Leishmania en animales infectados desarrollo importantes

respuestas humoral contra la HSP20.

o La L. amazonensis HSP20, expresada en E. coli, fue utilizada en ensayos de ELISA para determinar si los anticuerpos contra la HSP20 se obtienen en hámsters infectados experimentalmente .

o Las HSP representan los antígenos dominantes en muchas infecciones y enfermedades autoinmunes.

o Induciendo fuertes reacciones humoral y celular la respuesta inmune Reacciones cruzadas

•Se analizo el tiempo supuesto de aparición de anticuerpos anti-HSP20 a lo largo del proceso de infección

• Se detectó reactividad de anti-HSP20 retardada de los anticuerpos contra las proteínas totales Leishmania.

• Con el fin de saber si la Leishmania HSP20, es reactiva contra rHSP20 durante infecciones naturales de la leishmaniasis, en los

sueros de cánidos y de los pacientes, se determinó de ELISA

todos los sueros de perros con Leishmaniasis reaccionó con

rHSP20,

todos los sueros de perros con Leishmaniasis reaccionó con

rHSP20,

Pocos los sueros de pacientes con leishmaniasis reaccionaron con rHSP20

Pocos los sueros de pacientes con leishmaniasis reaccionaron con rHSP20

La HSP20, no proporciona inmunidad para el sistema

inmunitario humano.

La HSP20, no proporciona inmunidad para el sistema

inmunitario humano.

3.- La inmunoprotección potencial de Leishmania HSP20 como una vacuna de ADN

• Se evaluó la respuesta del ADN en experimentos de vacunación utilizando el modelo de infección de L. amazonensis en ratones.

• A tal efecto, el gen la L. amazonensis HSP20, fue clonado para evaluar la expresión en las células infectadas.

• Hay reactividad contra rHSP20, muy bajos, pero detectables, esto se observó en los sueros de La HSP20 de ADN de ratones.

• No es importante la protección o la reducción de la lesión, la cual fue inducida por el desarrollo en los animales inmunizados con

HSP20 mediante la vacuna de ADN en las condiciones experimentales realizado en este ensayo.

La proteína de Leishmania HSP20 es antigénica durante las infecciones

naturales, pero como vacuna no protege contra la infección por

Leishmania amazonensis aunque no se descarta la posibilidad de que confiera protección contra otras

especies de Leishmania.