See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/317488723

Teknik Pengambilan Enzim dari Berbagai Sumber

Book · October 2016

CITATIONS

0READS

2,978

1 author:

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Penelitian Hibah Bersaing-DIKTI View project

Maillard Reaction View project

Ahmad Nimatullah Al-Baarri

Universitas Diponegoro

90 PUBLICATIONS   96 CITATIONS   

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Ahmad Nimatullah Al-Baarri on 10 June 2017.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

i

ISBN 978-602-71169-4-8

ii

TEKNIK PENGAMBILAN ENZIM DARI BERBAGAI SUMBER © Penerbit Indonesian Food Technologists Desain Sampul : Akhmad Rifqi Cahyo Utomo Cetakan Kedua, Oktober 2016 Tim Editor Teknik Pengambilan Enzim dari Berbagai Sumber Disusun oleh : Ahmad Ni’matullah Al-Baarri, Anang Mohamad Legowo, Risa Fazriyati Siregar, Hanif Nur Azhar, Akhmad Rifqi Cahyo Utomo, Fina Fitriana Budiman. Diterbitkan oleh penerbit Indonesian Food Technologists Gedung Laboratorium Terpadu Lantai 3 Jl. Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang Telp. (024) 40123123, (024) 40040080 E-mail : redaksi@ift.or.id ISBN: 978-602-71169-4-8 Hak cipta dilindungi Undang-undang. Dilarang mengutip atau memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku, tanpa izin tertulis tertulis dari penulis & penerbit. Percetakan Indonesian Food Technologists. Isi diluar tanggung jawab percetakan.

iii

KATA PENGANTAR

Buku Teknik Pengambilan Enzim dari Berbagai Sumber merupakan buku yang menjelaskan tentang teknik pengambilan enzim. Mengingat masih sangat sedikit buku yang menjelaskan teknik pengambilan enzim baik berbahasa Indonesia maupun berbahasa asing, penulis berharap buku ini dapat membantu mahasiswa memahami tentang teknik pengambilan enzim.

Buku ini berisi tentang penjelasan enzim secara umum, teknik pengambilan peroksidase dari berbagai sumber contohnya daun tomat dan kubis, mekanisme kerja peroksidase, serta enzim Ovotransferin yang bersumber dari albumin. Buku ini sangat diperlukan sebagai tambahan informasi bagi peneliti terutama pada bidang enzim. Sajian gambar dan tabel diharapkan dapat memperluas isi buku dan dapat memberikan penjelasan lebih kepada pembaca.

Penulis megucapkan terimakasih kepada Tim Cabbage Peroxidase Adhie Wijaya. Tim Tomato Peroxidase Cornelius Wahyu Candra Adi, Triutami, Adrian Rachmantyo dan Fauzan Lanang, Nurul Yaqin, Indarto serta pihak lain yang membantu penyusunan buku ini.

Penulis menyadari buku ini masih jauh dari sempurna. Buku ini mungkin masih memiliki banyak kelemahan dan kekurangan baik dari segi bahasa, pengolahan materi, maupun penyusunannya. Saran, kritik dan koreksi yang membangun dari pembaca sangat diharapkan demi penyempurnaan buku dimasa mendatang. Semoga buku ini bermanfaat bagi semua pihak.

Semarang, Juli 2016

Penulis

iv

DAFTAR ISI KATA PENGANTAR.........................................................................iiiDAFTAR ISI.......................................................................................ivDAFTAR TABEL...............................................................................viPENGAMBILAN ENZIM LAKTOPEROKSIDASE DARI SUSU....1Peroksidase...........................................................................................1

Reaksisistemperoksidase................................................................2TeknikpengambilanLPOdarisusu...................................................4AnalisisAktivitasEnzimatikLPO.......................................................5DaftarPustaka..................................................................................8

PENGAMBILAN ENZIM PEROKSIDASE DARI DAUN TOMAT17Peroksidase....................................................................................17MetodePengambilanPeroksidase.................................................18Daftarpustaka................................................................................24

PENGAMBILAN ENZIM PEROKSIDASE DARI DAUN KUBIS.26DaftarPustaka................................................................................32

PENGAMBILAN OVOTRANSFERIN DARI INNER EGG SHELL MEMBRANE TELUR AYAM RAS...................................................35

Ovotransferin.................................................................................35PengambilandanPemurnianOvotransferin..................................36PenyimpananOvotransferrin.........................................................46DaftarPustaka................................................................................48

INDEKS ISTILAH.............................................................................50

Halaman

v

DAFTAR ILUSTRASI Ilustrasi 1. Mekanisme aktivasi LPO yang melibatkan substrat H2O2

dan SCN–..................................................................................3Ilustrasi 2. . Data absorbansi yang didapat dari seluruh fraksi dari hasil

elusi 0,2 M NaCl dalam PB......................................................6Ilustrasi 3. Hasil analisis profil protein dengan menggunakan SDS

PAGE dari berbagai fraksi.......................................................7Ilustrasi 4. Kolom Proses Purifikasi Peroksidase Daun Tomat........20Ilustrasi 5. Nilai Aktivitas Enzim Peroksidase Daun Tomat Fraksi

6,7,8,9,10,36,37,38,39,dan 40................................................21Ilustrasi 6. Gel Hasil SDS-PAGE pada Tomato Peroxidase.............22Ilustrasi 7. Macam macam mekanisme inhibisi reversible enzim....29Ilustrasi 8. Hasil Pengukuran spektrofotometri aktivitas enzimatis dan

kandungan protein pada crude exctract..................................31Ilustrasi 9. Gel hasil SDS-PAGE pada cabbage peroxidase.............32Ilustrasi 10. Diagram Alir Pengambilan dan Pemurnian Ovotransferin

...............................................................................................39Ilustrasi 11. Nilai Absorbansi pada Panjang Gelombang 280 nm pada

Fraksi yang Didapat dari Proses Purifikasi Ovotransferin dari inner egg shell membrane Telur Ayam Ras...........................42

Ilustrasi 12. Elektroforesis Profil Protein Inner Egg Shell Membrane Ayam Ras...............................................................................43

Ilustrasi 13. Kadar Protein Fraksi 1 sampai 4 pada Hasil Elusi Larutan inner egg shell membrane dari Telur Ayam Ras yang Ditentukan dengan Metode Bradford.....................................45

vi

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Karakteristik Fisiko-kimia laktoperoksidase sapi..............1Tabel 2. Laktoperoksidase dan Konsentrasi Tiosianat dalam Berbagai

Jenis Susu.......................................................................... 2 Tabel 3. Karakteristik Jenis-jenis Transferin..................................37Tabel 4. Parameter Visual pada Larutan Inner Egg Shell Membrane

dari Proses Kromatografi Pertukaran Ion untuk Mengambil Ovotransferin dari Inner Egg Shell Membrane Ras............40

1

PENGAMBILAN ENZIM LAKTOPEROKSIDASE DARI SUSU

Peroksidase

Laktoperoksidase (LPO) adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam protein susu. Konsentrasi LPO dalam susu sapi adalah sekitar 30 mg / l merupakan sekitar 1% dari protein whey. LPO memiliki berat molekul sekitar 78 kDa dengan 612 residu asam amino dan nilai pI sekitar 9,6. Struktur sekunder dari LPO terdiri dari 65% β-struktur, 23% α-helix dan 12% struktur yang tidak terkoordinasi. Karakteristik detail dari LPO digambarkan pada Tabel 1. Tabel 1. Karakteristik Fisiko-kimia laktoperoksidase sapi (Kussendrager & Hooijdonk, 2000) Karakteristik Data Nilai berat molekul 78,431 Da Asam amino residu 612 sistin residu setengah 15 kandungan karbohidrat 10% kandungan besi 0,07% kelompok prostetik hem protoporfirin IX Iso-listrik titik 9,6 Struktur sekunder 23% α, 65% β, 12%

unordered Absorptivitas ε412 nm 112.3 mM-1 cm-1 Absorptivitas 280 nm 14,9-15,0

LPO ditemukan di susu, saliva, dan kelenjar air mata mamalia dan juga sekresi kelenjar kecil seperti susu, air liur, dan air mata. LPO memiliki resistensi yang tinggi tidak hanya di pH rendah, tetapi juga stres panas. Jumlah LPO baik dalam susu dan manusia susu sapi telah dipelajari dengan baik. Susu

2

sapi dan susu manusia mengandung 1,2-19,4 dan 0,06-0,97 satuan per ml.

Tabel 2. Laktoperoksidase dan Konsentrasi Tiosianat dalam Bernagai Jenis Susu (Kussendrager & Hooijdonk, 2000)

Tipe susu LPO Tiosianat (Unit/ml) (ppm) Sapi 1.4 3.2 – 4.6 Domba 0.14 – 2.38 10.3 – 20.6 Kambing 1.55 4.03

4.45 10.29 Kerbau 0.9 5.4 Babi 22 N/A Manusia 0.06 – 0.97 2.6

Reaksi sistem peroksidase

LPO mengkatalisis oksidasi ion tiosianat (SCN-) oleh hidrogen peroksida (H2O2) dan menghasilkan sifat antibakteri hypothiocyanite (OSCN-), yang membunuh atau menghambat pertumbuhan berbagai bakteri, virus, jamur, jamur dan protozoa. Mekanisme sistem ini memiliki nama sebagai sistem laktoperoksidase (LPOS). LPOS telah digunakan untuk menjaga kualitas baku susu selama transportasi dari petani tempat ke pabrik susu di daerah yang pendinginan sulit dilakukan atau tidak tersedia.

Mekanisme LPOS sebagai agen antimikroba telah dipelajari dengan baik. LPOS dapat memainkan peran dalam menjaga kualitas susu karena adanya senyawa SCN- dalam susu (yang juga ditemukan dalam jaringan, sekresi dan sel tubuh tertentu) dan banyak H2O2 yang berasal dari indegenous bakteri. Mekanisme dasar LPOS digambarkan pada Ilustrasi 1.

3

Ilustrasi 1. Mekanisme aktivasi LPO yang melibatkan substrat H2O2 dan SCN– (Kussendrager & Hooijdonk, 2000).

Barret et al. (1998) melaporkan bahwa LPOS menjaga kualitas susu pasteurisasi. Mereka menunjukkan bahwa susu pasteurisasi dengan perlakuan 15 detik pada 72ºC dan 80º C plus LPOS memiliki masa simpan 1 hari lebih lama dari pada yang tidak dengan perlakuan LPOS (Tabel 2). Susu mentah dengan perlakuan LPOS dapat menjaga masa simpan 3-4 hari lebih lama dalam menjaga kualitas daripada tanpa LPOS. Tabel tersebut dihitung dengan mengambil rata-rata dari parameter kualitas susu diantaranya aroma, keasaman, dan stabilitas alkohol.

LPO mengkatalisis oksidasi tiosianat untuk menghasilkan produk yang membunuh atau menghambat pertumbuhan banyak spesies mikroorganisme. Mekanisme

4

reaksi yang kompleks. Langkah pertama dalam mekanisme enzimatik adalah reaksi inisiasi LPO, menggunakan H2O2, dan diikuti oleh reaksi propagasi, seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1. Reaksi propagasi dari keadaan dasar atau initial state dimulai dengan dengan interaksi dengan H2O2. Pada keadaan konsentrasi SCN– rendah (0,3 mM), akan membentuk senyawa LPO pada state II, yang terus berkurang kualitasnya menuju kepada keadaan dasar pada tingkat yang lebih rendah. Pada suatu kondisi jika kelebihan H2O2 (misalnya 0,5 mM), senyawa LPO II ini dapat membentuk senyawa LPO III, yang mengarah ke ferrylperoxidase dan akan terinaktivasi dan dalam posisi enzim yang mati. Hypothiocyanite (OSCN-) merupakan sebuah produk LPOS dan berada dalam kesetimbangan dengan HOSCN (asam hypothiocyanous). Kedua bentuk mengerahkan aktivitas antibakteri.

Pengaruh LPOS dalam metabolisme bakteri adalah dengan mengurangi penyerapan oksigen dan produksi laktat oleh organisme fermentasi, menghambat penyerapan glukosa dan sintesis protein, merusak membran sitoplasma. OSCN- dapat merusak bakteri seperti membran luar, membran sel, dinding sel, membran sitoplasma, asam nukleat, dan mengganggu sistem transportasi dan enzim glikolitik.

Teknik pengambilan LPO dari susu

Dua liter susu sapi segar dihilangkan lemaknya dengan cara sentrifugasi pada 8000 rpm pada suhu 10˚C selama 30 menit. Setelah lemak dihilangkan maka susu sapi tersebut menjadi susu skim. Proses berikutnya adalah penggumpalan susu skim dengan enzim renet. Susu skim akan menggumpal jika ditambah 0,02% (b/v) rennet dan 2 ml asam laktat per liter susu dan dihangatkan pada suhu 30˚C selama 30 menit. Setelah menggumpal, maka gumpalan tersebut diiris membentuk dadu agar cairan whey dapat keluar dari sela-sela potongan

5

gumpalan susu. Pemotongan hendakya dilakukan secara perlahan dan hati-hati untuk menjaga agar gumpalan tidak terpotong menjadi bagian yang kecil. Setelah itu, gumpalan dan cairan whey disaring dengan kertas saring. Whey yang telah didapat, didialisis dengan menggunakan 10 mM fosfat bufer (PB), pH 6,8, sebanyak 10 liter selama semalam. Dialisis ini dilakukan untuk mengurangi laktosa dan vitamin serta mineral yang masih terkandung dalam whey.

Whey kemudian dialirkan ke kolom yang berisi resin SP Sepharose Fast Flow. Sebelumnya resin harus dipersiapkan terlebih dahulu dengan dilakukan pencucian dengan 500 ml 10 mM PB (pH 6,8) yang mengandung 0,1 M NaCl. Setelah dilakukan pengaliran whey ke dalam kolom, maka enzim LPO dapat dikeluarkan dari dalam kolom dengan dengan mengalirkan 500 ml 10 mM PB (pH 6,8) yang mengandung 0,2 M NaCl. Hasil elusi ini (yang berupa fraksi) kemudian dikumpulkan sebanyak 5 ml per tabung dan konsentrasi protein dari masing-masing fraksi ditentukan dengan mengukur pada 280 nm. Perkiraan jumlah protein di dalam fraksi dapat dilakukan dengan melakukan perkalian absorbansi yang didapat dari 280 nm dengan 1,5. Kemurnian LPO diperiksa oleh Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Solusi enzim dipekatkan dengan ultrafiltrasi menggunakan membran cutoff 10.000 MW, dan retentat tersebut kemudian disaring melalui filter dengan pori sebesar 0,22 µm. Hasil LPO melalui prosedur ini dapat menghasilkan aktivitas sebesar 76-103 U/ml dan dapat disimpan hingga 6 bulan pada -20˚C.

Analisis Aktivitas Enzimatik LPO

Aktivitas LPO ditentukan dengan menggunakan ABTS sebagai substrat. Larutan reaksi dibuat dengan mencampur 100

6

ml LPO (0,2 U/ml), 450 ml 1 mM ABTS di dalam larutan 0,1 M buffer asetat ( pH 4.4), dan 450 ml 0,55 mM H2O2. Absorbansi dari larutan tersebut dimonitor pada 412 nm selama tepat 20 detik pada suhu 25˚C. Satu unit LPO dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mengoksidasi 1 umol ABTS per menit. Koefisien molar ABTS pada 412 nm adalah 32.400 M-1 cm-1.

Ilustrasi 2. . Data absorbansi yang didapat dari seluruh fraksi dari hasil elusi 0,2 M NaCl dalam PB. Garis dengan tanda

kotak adalah absorbansi yang diukut pada panjang gelombang 280 nm yang merepresentasikan kadar protein dari masing-

masing fraksi, dan garis dengan tanda lingkaran adalah absorbansi dari aktivitas LPO yang diukur melalui panjang

gelombang 412 nm.

00.20.40.60.8

11.21.41.6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Ab

sorb

ansi

Nomor Fraksi

412 nm

280 nm

7

Ilustrasi 3. Hasil analisis profil protein dengan menggunakan SDS PAGE dari berbagai fraksi. Nampak lane nomor 7 sampai dengan 11 hanya satu band saja yang terlihat dan menunjukkan

adanya LPO yang murni. Lane nomor 7 adalah didapat dari fraksi nomor 70 dan lane nomor 91 adalah didapat dari fraksi

nomor 91.

Setelah melihat hasil dari SDS PAGE tersebut, maka LPO yang murni dapat diambil dari fraksi nomor 70 sampai dengan nomor 91. Guna mendapatkan jumlah LPO yang banyak, maka fraksi nomor 70 sampai 91 dapat dicampur dan dihomogenkan dengan cara divortex lalu disimpan dalam tube 1,5 µL dalam freezer agar dapat disimpan lama. Penyimpanan yang optimal hendaknya tidak lebih dari 6 bulan.

8

Daftar Pustaka

Al-Baarri, A. N., Hayashi, M., Ogawa, M., & Hayakawa, S. (2010). Effects of mono- and di-saccharides on the antimicrobial activity of bovine lactoperoxidase system. Journal of Food Protection, (In Press).

Al-Baarri, A. N., Ogawa, M., & Hayakawa, S. (2010).

Application of an immobilized lactoperoxidase to contiuous hypothiocyanite production. Under submission.

Althaus, R. L., Molina, M. P., & Rodrìguez, M. (2001).

Analysis time and lactation stage influence on lactoperoxidase system components in dairy ewe milk. Journal of Dairy Science, 84, 1829-1835.

Altun, G. D., & Cetinus, S. A. (2007). Immobilization of

pepsin on chitosan beads. Food Chemistry, 100(3), 964–971.

Aune, T. M., & Thomas, E. L. (1977). Accumulation of

hypothiocyanite ion during peroxidase-catalyzed oxidation od thiocyanate ion. European Journal of Biochemistry, 80, 209-214.

Azevedo, A. M., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S., &

Fonseca, L. P. (2001). Stability of free and immobilised peroxidase in aqueous-organic solvents mixtures. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 15, 147-153.

Bandyopadhyay, U., Adak, S., & Banerjee, R. K. (1999). Role

of Active Site Residues in Peroxidase Catalysis: Studies

9

on Horseradish Peroxidase. Proceedings of the Indian National Science Academy B., 65(5), 315-330.

Barrett, N. E., Grandison, A. S., & Lewis, M. J. (1999).

Contribution of the lactoperoxidase system to keeping quality of pasteurized milk. Journal of Dairy Research, 66, 73-80.

Bjoerck, L., & Claesson, O. (1980). Correlation between

concentration of hypothiocyanite and antibacterial effect of the lactoperoxidase system against Escherichia coli. Journal of Dairy Science, 63, 919-922.

Björk, L., Rosén, C.-G., Marshall, V., & Reiter, B. (1975).

Antibacterial activity of the lactoperoxidase system in milk against pseudomonads and other gram-negative bacteria. Applied Microbiology, 30(2), 199–204.

\ Borch, E., Wallentin, C., Rosén, M., & Björck, L. (1989).

Antibacterial effect of the lactoperoxidase/thiocyanate/hydrogen peroxide system against strains of Campylobacter isolated from poultry. Journal of Food Protection, 52, 638–641.

Breena, B. M., & Batista-Viera, F. (2006). Immobilization of

enzymes: A literature survey (2nd ed.): Humana Press. Bury, D., Jelen, P., & Kimura, K. (1998). Whey protein

concentrate as a nutrient supplement for lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 8, 149–151.Cao, L., Langen, L. M. v., Rantwijk, F. v., & Sheldon, R. A. (2001). Cross-linked aggregates of penicillin acylase: robust catalysts for the synthesis of b-lactam antibiotics.

10

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11, 665–670.

Clausen, M. R., Skibsted, L. H., & Stagsted, J. (2008).

Inhibition of lactoperoxidase-catalyzed 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) and tyrosine oxidation by tyrosine-containing random amino acid copolymers. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 56, 8692–8698.

Dionysius, D. A., Grieve, P. A., & Vos, A. C. (1992). Studies

on the lactoperoxidase system : reaction kinetics and antibacterial activity using two methods for hydrogen peroxide generation. Journal of Applied Bacteriology, 72, 146-153.

Drgalić, I., Tratnik, L., & Božanić, R. (2005). Growth and

survival of probiotic bacteria in reconstituted whey. Lait, 85, 171–179.

Earnshaw, R. G., Banks, J. G., Defrise, D., & Francotte, C.

(1989). The preservation of cottage cheese by an activated lactoperoxidase system. Food Microbiology, 6, 285–288.

Elliot, R. M., McLay, J. C., Kennedy, M. J., & Simmonds, R.

S. (2004). Inhibition of foodborne bacteria by lactoperoxidase system in a beef cube system. International Journal of Food Microbiology, 91, 73-81.

Fonteh, F. A., Grandison, A. S., & Lewis, M. J. (2005). Factor

affecting lactoperoxidase activity. International Journal of Dairy Technology, 58(4), 233-236.

11

Gurtler, J. B., & Beuchat, L. R. (2007). Inhibition of growth of Enterobacter sakazakii in reconstituted infant formula by the lactoperoxidase system. Journal of Food Protection, 70(9), 2104-2110.

Hadadin, M. S., Ibrahim, S. A., & Robinson, R. K. (1996).

Preservation of raw milk by activation of the natural lactoperoxidase systems. Food Control, 7, 149–152.

Hirano, R., Hirano, M., Oooka, M., Dosako, S., Nakajima, I.,

& Igoshi, K. (1998). Lactoperoxidase effects on rheological properties of yogurt. Journal of Food Science, 63, 35–38.

Hiroyuki Wakabayashi, H. M., Kouichirou Shin, Koji

Yamauchi, Ichiro Matsumoto, Keiko Abe and Mitsunori Takase. (2007). Orally Administered Lactoperoxidase Increases Expression of the FK506 Binding Protein 5 Gene in Epithelial Cells of the Small Intestine of Mice: A DNA Microarray Study. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71(9), 2274-2282.

Ji, T., & Hauque, Z. (2003). Cheddar whey processing and

source. I. Effect on composition and functional properties of whey protein concentrates. International Journal of Food Science and Technology, 38, 453–461.

Kussendrager, K. D., & Hooijdonk, A. C. M. v. (2000).

Lactoperoxidase: physico-chemical properties, occurence mechanism of action and application. British Journal of Nutrition, 84(Suppl. 1), S19-S25.

12

Miroliaei, M., Nayeri, H., Samsam-Shariat, S. Z., & Atar, A. M. (2007). Biospesific immobilization of lactoperoxidase on COn A-Sepharose 4B. Scientia Iranica, 14(4), 303–307.

Nguyen, D. D. L., Ducamp, M.-N., Dornier, M., Montet, D., &

Loiseau, G. (2005). Effect of the Lactoperoxidase System against Three Major Causal Agents of Disease in Mangoes. Journal of Food Protection, 68(7), 1497–1500(1494).

Nino, G. D., Turacchio, M., 'Archivio, A. A. D., Lora, S.,

Corain, B., & Antonini, G. (2004). Catalytic activity of bovine lactoperoxidase supported on macroporous poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate). Reactive & Functional Polymers, 61, 411–419.

O’Brien, P. J. (2000). Peroxidases. Chemico-Biological

Interactions, 129, 113–139. Østdal, H., Bjerrum, M. J., Pedersen, J. A., & Andersen, H. J.

(2000). Lactoperoxidase-induced protein oxidation in milk. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48, 3939 - 3944.

Pescuma, M., Hébert, E. M., Mozzi, F., & Valdez, G. F. d.

(2008). Whey fermentation by thermophilic lactic acid bacteria: Evolution of carbohydrates and protein content. Food Microbiology 25, 442–451.

Pruitt, K. M., Kamau, D. N., Miller, K., Mansson-Rahemtulla,

B., & Rahemtulla, F. (1990). Quantitative, standardized assays for determining the concentrations of bovine

13

lactoperoxide, human salivary peroxidase, and human myeloperoxidase. Analytical Biochemistry, 191, 278-286.

Reiter, B., & Harnulv, B. G. (1984). Lactoperoxidase

antibacterial system: natural occurrence, biological functions and practical applications. Journal of Food Protection, 47, 724–732.

Reszka, K. J., & Britigan, B. E. (2007). Doxorubicin inhibits

oxidation of 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) by a lactoperoxidase/H2O2 system by reacting with ABTS-derived radical. Archives of Biochemistry and Biophysics, 466, 164–171.

Saad, A. H. (2008). Activation of milk lactoperoxidase system

for controlling pseudomonas in cow's milk. International Journal of Dairy Science, 3, 131–136.

Seifu, E., Buys, E. M., & Donkin, E. F. (2004). Quality aspects

of Gouda cheese made from goat milk preserved by the lactoperoxidase system. International Dairy Journal, 14, 581–589.

Seifu, E., Buys, E. M., & Donkin, E. F. (2005). Significance of

the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: a review. Trends in Food Science & Technology, 16, 137-154.

Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F., & Petzer, I.-M. (2004).

Antibacterial activity of the lactoperoxidase system against food-borne pathogens in Saanen and South African Indigenous goat milk. Food Control, 15, 447–452.

14

Shah, N. P. (2000). Effects of milk-derived bioactives: an overview. British Journal of Nutrition, 84(Suppl. 1), S3–S10.

Shakeel-ur, R., Farkye, N. Y., & Hubert, R. (2002). Enzymes

indigenous to milk - lactoperoxidase. Encyclopedia of Dairy Sciences. Oxford: Elsevier., 938–941.

Sheikh, I. A., Singh, A. K., Singh, N., Sinha, M., Singh, S. B.,

& Bhushan, A. (2009). Structural evidence of substrate specifitiy in mammalian peroxidases. Journal of Biological Chemistry, 284(22), 14849-14856.

Shindler, J. S., Childs, R. E., & Bardsley, W. G. (1976).

Peroxidase from human cervical mucus. The isolation and characterisation. Journal of Applied Microbiology, 90, 489-493.

Singh, A. K., Kumar, R. P., Pandey, N., Singh, N., Sinha, M.,

Bhushan, A., et al. (2009). Mode of binding of the tuberculosis prodrug isoniazid to heme peroxidases. Binding studies and crystal structure of bovine lactoperoxidase with isoniazid at 2.7 Å resolution. Journal of Biological Chemistry, 285(2), 1569–1576.

Singh, A. K., Singh, N., Sharma, S., Shin, K., Takase, M.,

Kaur, P., et al. (2009). Inhibition of lactoperoxidase by its own catalytic product: crystal structure of the hypothiocyanate-inhibited bovine lactoperoxidase at 2.3-Å resolution. Biophysical Journal, 96, 646-654.

Singh, A. K., Singh, N., Sinha, M., Bhushan, A., Kaur, P.,

Srinivasan, A., et al. (2009). Binding Modes of Aromatic Ligands to Mammalian Heme Peroxidases

15

with Associated Functional Implications. Crystal structures of lactoperoxidase complexes with acetylsalicylic acid, salicylhydroxamic acid, and benzylhydroxamic acid. The Journal of Biological Chemistry, 242(30), 20311–20318.

Şişecioğlu, M., Çankaya, M., Gülçin, İ., & Özdemir, H. (2009).

The inhibitory effect of propofol on bovine lactoperoxidase. Protein & Peptide Letters, 16(2009), 46-49.

Tenovuo, J. (2002). Clinical applications of antimicrobial host

protein, lactoperoxidase, lysozyme, and lactoferrin in xerostomia: eficacy and safety. Oral Diseases, 8, 23-29.

Touch, V., Hayakawa, S., Yamada, S., & Kaneko, S. (2004).

Effect of lactoperoxidase-thiocyanate-hydrogen peroxide system on Salmonella enteritidis in animal or vegetable foods. International Journal of Food Microbiology, 93, 175-183.

Uceda, R., Guillen, A. M., Gaya, P., Medina, M., & Núñez, M.

(1994). Chemical and rheological characteristics of Manchego cheese manufactured from ewe raw

milk preserved by activation of the lactoperoxidase system. Milchwissenschaft, 49, 494–498.

Wever, R., Kast, W. M., Kasinoedin, J. H., & Boelens, R.

(1982). The peroxidation of thiocyanate catalyzed by myeloperoxidase and lactoperoxidase. Biochimica et Biophysica Acta, 709, 212–219.

Wit, J. N. d., & Hooydonk, A. C. M. v. (1996). Structure,

functions, and application of lactoperoxidase in natural

16

antimicrobial system. Netherland Milk and Dairy Journal, 50(227-244).

Wolfson, L. M., & Sumner, S. S. (1993). Antibacterial activity

of the lactoperoxidase system: A Review Journal of Food Protection, 56(10), 887-892.

Zhou, Y., & Lim, L.-T. (2009). Activation of Lactoperoxidase

System in Milk by Glucose Oxidase Immobilized in Electrospun Polylactide Microfibers. Journal of Food Science, 74(2), C170–C176.

17

PENGAMBILAN ENZIM PEROKSIDASE DARI DAUN TOMAT

Enzim merupakan molekul pada makhluk hidup yang

dapat mengkatalisis reaksi kimia tanpa ikut bereaksi. Enzim dapat bekerja dengan cara bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan suatu senyawa intermediat dan hanya membutuhkan energi aktivasi yang lebih rendah sehingga percepatan reaksi kimia dapat terjadi. Salah satu enzim yang berperan pada bidang pangan adalah enzim peroksidase.

Peroksidase

Peroksidase adalah enzim yang mampu mengkatalisis proses oksidasi dari berbagai substrat organik menggunakan hidrogen peroksida (H2O2) sebagai oksidan. Enzim ini biasa didapatkan dari pangan hewani maupun nabati. Enzim peroksidase dari pangan hewani salah satunya berasal dari susu atau biasa disebut Laktoperoksidase. Sedangkan peroksidase dari sumber nabati dapat di ekstrak dari lobak (Horseradish), water spinach, bonggol jagung, brokoli dan berbagai tanaman lainnya.

Peroksidase pada bidang pangan dapat berfungsi sebagai antimikroba yang secara tidak langsung dapat menjadi bahan pengawet makanan, selain itu peroksidase dapat meningkatkan aktivitas antioksidan pada teh. Enzim Peroksida jika dikombinasikan dengan H2O2 dan SCN- akan menghasilkan Hypothiocyanite (OSCN-). Senyawa ini mengakibatkan kerusakan oksidatif sekelompok protein dalam membran sitoplasma mikroba. Kerusakan oksidatif membran protein diduga menginduksi gangguan fungsional dari protein, yang mengakibatkan kematian mikroba.

Peroksidase dari tanaman sudah banyak diteliti, salah satu contohnya adalah lignin peroksidase yang dari limbah

18

bonggol jagung dan horseradish peroxidase (HRP) yang ditemukan dari tanaman lobak (horseradish). Tanaman tomat adalah golongan tanaman Solanaceae yang dapat dijadikan salah satu sumber peroksidase yang berasal dari tanaman. Pada buah tomat mengandung peroksidase dengan jumlah banyak. Namun, pemanfaatan buah tomat sebagai sayuran maupun buah untuk konsumsi meningkatkan kompetisi untuk mendapatkan buah tomat sebagai salah satu sumber peroksidase. Oleh sebab itu diperlukan sumber lain yang dapat digunakan sebagai alternatif sumber peroksidase dari tanaman tomat. Salah satu organ dari tanaman tomat yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber peroksidase adalah daun tomat. Hal ini merupakan potensi besar pemanfaatan daun tomat sebagai sumber peroksida yang nantinya akan dijadikan agen antimikroba. Senyawa yang dihasilkan diharapkan akan dapat diaplikasikan secara luas sebagai salah satu metode pengawetan makanan. Penggunaan senyawa ini akan bekerja dengan komponen bahan utama lain seperti lemak dan gula. Interaksi positif senyawa peroksidase dengan bahan lain akan memperpanjang masa simpan produk.

Metode Pengambilan Peroksidase

Langkah-langkah metode pengambilan peroksidase dari daun tomat menggunakan resin DEAE terdiri dari proses ekstraksi dan proses purifikasi. Proses ekstraksi daun tomat dilakukan berdasarkan penelitian Kokkinakis dan Brooks (1979) dimulai dengan ekstraksi daun tomat 400 g dengan ditambahkan amonium sulfat 0,1 M sebanyak 400 ml menggunakan hand mixer. Proses ekstraksi dilakukan dengan kondisi suhu rendah. Proses ini bertujuan untuk mendapatkan sampel yang homogen dan mengambil enzim yang ada pada daun tomat. Hasil yang didapatkan disaring menggunakan kain

19

saring dan disentrifugasi 6000 rpm selama 20 menit. Diambil bagian supernatan untuk dilanjutkan ke proses purifikasi.

Proses purifikasi bertujuan untuk menghilangkan senyawa lain yang tidak diinginkan sehingga menggunakan metode Ion Excange Chromatography. Sebelumnya dilakukan persiapan kolom yang akan digunakan. Kolom yang akan digunakan mempunyai diameter 2,5 cm berbahan gelas dengan panjang 40 cm dengan kapasitas larutan ± 600 ml. Setelah kolom disiapkan, dilakukan percobaan pada unit statik dan pemasangan katup bawah serta filternya. Percobaan dilakukan bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kebocoran pada alat. Setelah dipastikan tidak adanya kebocoran, kolom siap digunakan untuk proses purifikasi.

Proses purifikasi peroksidase dimulai dengan melakukan pengelusian (pengaliran) supernatan melalui kolom yang telah diisi dengan resin (DEAE-Sepharose) sebanyak 60 g. Phosphat buffer aquades 100 mM pH 7 dialirkan sebanyak 300 ml. Phosphat buffer NaCl pH 6,5 dialirkan dengan tiga konsentrasi, masing-masing 0,5 M, 1,0 M dan 1,5 M sebanyak 300 ml kemudian ditampung per 10 ml pada setiap konsentrasi. Hasil tiap fraksi dilanjutkan dengan pengukuran jumlah protein.

Pengukuran jumlah protein pada setiap fraksi dilakukan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Hasil pengukuran tersebut kemudian dicatat, untuk menganalisis fraksi yang mempunyai kandungan protein tertinggi. Fraksi dengan nilai kandungan protein tertinggi yang akan digunakan untuk metode selanjutnya (profil protein SDS PAGE).

20

Ilustrasi 4. Kolom Proses Purifikasi Peroksidase Daun Tomat

Berdasarkan proses ekstraksi daun tomat oleh amonium sulfat yang telah dilakukan diperoleh larutan campuran sebanyak 400 ml dari 400 g daun tomat yang digunakan. Proses pengendapan menggunakan amonium sulfat merupakan tahap purifikasi untuk memisahkan peroksidase yang kemudian dipisahkan per fraksi. Kemudian amonium sulfat tersebut dievaporasi sehingga didapatkan enzim murni. Campuran tersebut dilakukan proses sentrifugasi pada 6000 rpm selama 20 menit untuk memisahkan padatan dan supernatan. Bagian supernatan mengandung enzim dan zat-zat terlarut lainnya. Proses ekstraksi dilanjutkan dengan proses purifikasi dengan tujuan untuk mengisolasi enzim dari zat-zat terlarut lain yang tidak dibutuhkan. Supernatan yang didapatkan sebanyak 400 ml dielusikan ke dalam kolom dan menghasilkan 83 fraksi. Berdasarkan fraksi yang diperoleh, 19 tube fraksi enzim yang berwarna hijau pekat, 9 tube fraksi enzim yang berwarna hijau dan 55 fraksi enzim yang berwarna jernih. Masing-masing tube

21

mewakili nomor fraksi yang dihasilkan. Keseluruhan fraksi tersebut dibedakan berdasarkan konsentrasi pelarut phospat buffer NaCl (0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M ). Fungsi dari phosphat buffer NaCl adalah untuk memisahkan enzim yang telah terikat secara ionik pada resin, sehingga dihasilkan enzim murni per tube fraksi. Fraksi yang telah didapatkan dilakukan uji aktivitas enzim untuk mengetahui fraksi enzim yang mempunyai aktivitas enzim terbaik. Fraksi enzim terbaik memiliki nilai aktivitas enzim yang tertinggi ketika dilakukan pengujian dengan spektofotometer pada panjang gelombang 412 nm. Uji aktivitas enzim dilakukan menggunakan alat spektofotometer UV-VIS dengan panjang gelombang 280 nm. Uji aktivitas enzim menggunakan H2O2 sebagai substrat, ABTS sebagai indikator dan SDS sebagai penghenti reaksi enzimatis.

Ilustrasi 5. Nilai Aktivitas Enzim Peroksidase Daun Tomat

Fraksi 6,7,8,9,10,36,37,38,39,dan 40

0

1

2

3

4

5

6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Akt

ivita

s Enz

im (U

)

Nomor Fraksi

22

Berdasarkan penelitian yang telah lakukan beberapa fraksi dengan nilai absorbansi tertinggi dan memiliki kecenderungan peningkatan dipilih dan diubah menjadi satuan unit enzim. Berdasarkan nilai aktivitas enzim yang didapatkan, diperoleh bahwa fraksi dengan enzim tergolong tinggi terdapat pada fraksi-fraksi: 6, 7, 8, 9, 10, 37, 38, 39 dan 40. Fraksi-fraksi ini digunakan dalam proses uji profil protein dengan metode elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Deodesil Sulfat (SDS PAGE).

Ilustrasi 6. Gel Hasil SDS-PAGE pada Tomato Peroxidase Keterangan : Lane A= Standar Marker Lane B= Fraksi 6, Lane C= Fraksi 7 Lane D= Fraksi 8 Lane E= Fraksi 9 Lane F= Fraksi 10 Lane G= Fraksi 36 Lane F= Fraksi 37 Lane H= Fraksi 38 Lane I= Fraksi 39 Lane J= Fraksi 40.

JA B C D E F G H IkDa200116

665545

36

29

14,2

23

Berdasarkan hasil elektroforesis gel peroksidase daun tomat dapat diketahui letak band enzim peroksidase pada berat molekul sekitar 66 kDa. Hal ini dapat diartikan bahwa dalam fraksi-fraksi yang ada pada sampel daun tomat terkandung enzim peroksidase. Kemurnian enzim peroksidase dapat terlihat dengan jumlah band yang mengalami penurunan seiring dengan penambahan konsentrasi NaCl pada proses elusi. Lane B, C, D, E dan F merupakan hasil elusi dengan NaCl 0,5 mM. Sedangkan pada Lane, G, H, I dan J merupakan hasil elusi dengan NaCl 1,0 mM. Semakin tinggi konsentrasi NaCl yang digunakan, kemurnian peroksidase yang diperoleh akan semakin tinggi. Pada Lane B, C, D, E dan F jumlah band yang terlihat sekitar 7 band dengan berat molekul yang berbeda-beda. Hal ini menandakan bahwa enzim peroksidase yang didapatkan tidak murni karena campuran berbagai macam protein lain yang merupakan impuritas yang tidak diinginkan. Sebaliknya, pada Lane G, H, I, dan J jumlah band yang dihasilkan lebih sedikit dengan Lane sebelumnya dan menandakan bahwa kemurnian enzim yang didapatkan lebih tinggi.

24

Daftar pustaka

Al-Baarri, A. N., M. Hayashi, M. Ogawa, and S. Hayakawa. 2011. Effects of Mono- and Disaccharides on the Antimicrobial Activity of Bovine Lactoperoxidase System. Journal of Food Protection, 74(1): 134-139.

Al-Baarri, A. N., A.M. Legowo, S. Hayakawa, and M. Ogawa.

2015. Enhancement Antimicrobial Activity of Hyphothiocyanite using Carrot Against Staphyloccus aureus and Escherichia coli. Procedia Food Science 3: 473-478.

M. Hayashi, S. Naknukool, S. Hayakawa, M. Ogawa, and A.

N. Al-Baarri. 2012. Enhancement of Antimcrobial Activity of Lactoperoxidase System by Carrot Extract and β-carotene. Food Chemistry, 13(2012): 541-546.

Kokkinakis, D. M. and J. L. Brooks. 1979. Tomato Peroxidase.

Plant Physol, 63(1979): 93-99. Marquez, O., Waliszewki, K. N., Oliart, R. M. and V. T.

Pardio. 2008. Purification and Characterization of Cell Wall-Bound Peroxidase from Vanilla Bean. LWT – Food Science and Technology, 41(8): 1372-1379.

Mizobuchi, K. and H. Nishihara. 2009. Effect of Rare Sugar on

Physiology of Yeast. Mem. Fac. Educ., Kagawa Univ. II, 58(2009): 11-19

Purich, D.L. 2010. Enzyme Kinetics Catalysis Control: A

Reference of Theory and Best-Practice Methods. Elseiver Inc., United Kingdom.

25

Suprihana, M.S. 2013. Fraksinasi Enzim Lipase dari Endosperm Kelapa dengan Metode Salting Out. Agritech, 4(33) : 377-383.

26

PENGAMBILAN ENZIM PEROKSIDASE DARI DAUN KUBIS

Enzim adalah protein alami yang diproduksi dalam jumlah kecil oleh makhluk hidup (bakteri, tanaman, dan hewan) dan berfungsi sebagai katalis biokimia yang sangat selektif untuk mengkonversi satu molekul ke bentuk molekul lainnya. Enzim sangat penting untuk kehidupan karena enzim dapat mempercepat reaksi metabolisme dan tidak mengubah struktur pada enzim tersebut saat reaksi berlangsung. Enzim diketahui sangat sensitive terhadap perubahan kondisi lingkungan dan berfungsi pada rentang suhu tertentu dan pH.

Peroksidase adalah salah satu kelas enzim dalam hewan, tanaman, dan jaringan mikroorganisme yang mengkatalisasi proses oksireduktasi antara H2O2 dan berbagai macam reduktan. Peroksidase umumnya merupakan heme peroksidase yang menggunakan hydrogen peroksida sebagai akseptor electron untuk mengkatalisis sejumlah reaksi oksidatif. Sebagian besar heme peroksidase melalui reaksi sebagai berikut.

Fe3+ + H2O2 [Fe4+=O]R' + H2O [Fe4+=O]R' + substrat à [Fe4+=O]R + substrat teroksidasi [Fe4+=O]R + substrat àFe3++ H2O + substrat teroksidasi

Dalam mekanisme ini, enzim bereaksi dengan ekuivalen

satu dari hydrogen peroksida untuk membentuk kompleks [Fe4+=O]R' (Komponen I). Ini adalah reaksi oksidasi reduksi dari dua elektron dimana h202 terekuksi menjadi air dan enzim teroksidasi. Satu ekuivalen yang teroksidasi berada dalam inti heme, membentuk oksiferil intermediate, ketika dalam kebanyakan peroksidase forforin (R) teroksidasi menjadi radikal forforin pi-kation (R’). Komponen I kemudian

27

dioksidasi menjadi substrat organik untuk menjadikan radikal substrat.

Heme peroksidase terdiri dari dua superfamili, satu ditemukan di bakteri, jamur, tanaman, dan di hewan. Superfamili ini dapat dibagi kembali terdiri menjadi 3 kelas besar. Kelas I, atau peroksidase intraselullar termasuk peroksidase sitokrom c ragi (CCP), protein terlarut yang ditemukan dalam rantai transfer elektron dalam mitokondria dan melindungi terhadap racun peroksidase; askorbat peroksidase (AP), salah satu enzim utama yang bertanggung jawab terhadap penghilangan hydrogen peroksida dalam kloroplast dan sitosol pada tanaman yang kompleks dan katalase perosidase pada bakteri yang memiliki fungsi peroksidase dan katalase. Enzim tersebut diiketahui memberikan proteksi terhadap sel dari proses oksidasi.

Kelas II terdiri dari peroksidase yang diproduksi sekretif oleh jamur yaitu ligninase atau lignin peroksidase (LiPs) dan peroksidase yang bergantung pada Mangan (MnPs). Glikoprotein monomerik tersebut melibatkan degredasi dari lignin. Dalam MnP, ion mangan perfungsi sebagai substrat pereduksi. Protein kelas II memiliki 4 disulphide brigdes dan dua sisi aktif dengan ion kalsium.

Kelas III terdiri dari peroksidase yang dihasilkan sekretif oleh tanaman, yang memiliki berbagai macam fungsi khusus pada jaringan tanaman seperti penghilangan hydrogen peroksida dari kloroplas dan sitosol; oksidasi dari komponen toksik, biosintesis dari dinding sell, respon pertahanan terhadap luka; katabolisme indole-3-acetic acid (IAA), biosintesis etilen, dan lain lain. Protein kelas III juga merupakan glikoprotein monomeric yang memiliki empat jembatan disulfide dan dua ion kalsium, walaupun penempatan dari disulfide nya berbeda dari enzim peroksidase kelas II.

Kerja enzim pun tidak terlepas dari adanya pengaruh inhibitor, yaitu molekul yang menempel pada enzim dan

28

menurunkan aktifitasnya. Karena penghambatan aktifitas anzim dapat membunuh pathogen atau mengkoreksi ketidakseimbangan pada metabolisme, banyak obat obatan adalah inhibitor enzim. Inhibitor juga digunakan dalam pestisida. Tidak semua molekul yang berikatan pada enzim adalah inhibitor; enzim activator berikatan pada enzim dan dapat meningkatkan aktivitas enzimais, ketika substrat berikatan dan dikonversi menjadi produk dalam siklus katalitik normal pada enzim.

Ikatan inhibitor dapet menghentikan substrat dalam memasuki sisi aktif enzim dan atau menghalangi enzim dari mengkatalisis suatu reaksi. Sifat ikatan inhibitor dapat berupa reversible atau irreversible. Inhibitor irreversible biasanya bereaksi dengan enzim dan mengubah struktur kimia enzim (dengan pembentukan formasi ikatan kovalen). Inhibitor tersebut memodifikasi residu asam amino kunci yang dibutuhkan untuk aktiitas enzimatis. Disisi lain, inhibitor reversible berikatan non kovalen dan berbagai macam tipe dari inhibisi dapat diproduksi tergantung dari bagaimana inhibitor tersebut berikatan dengan enzim, kompleks enzim-substrat, atau dua hal tersebut.

Inhibitor enzim juga terdapat secara alami dan melibatkan regulasi metabolisme. Sebagai contoh, enzim dalam jalur metabolism dapat menginhibisi pembentukan produk. Ini adalah tipe inhibitor yang memiliki feedback negative yang memperlambat produksi ketika produk mulai terbentuk dan salah satu jalur penting untuk memelihara homeostasis dalam sel. Adapun inhibitor dalam sel yang lain memiliki fungsi penting dalam mengikat secara spesifik pada enzim tertentu. Ini dapat membantu enim yang mungkin dapat merusak sel seperti, protease atau nuclease, sebagai contohnya adalah inhibitor ribonuklease yang dapat berikatan pada ribonuklease salah satu dari interaksi protein-protein. Enzim alami juga

29

dapat menjadi racun dan berfungsi untuk pertahanan terhadap predator atau salah satu untuk membunuh mangsa.

Empat jenis inhibisi reversible yaitu kompetitif, nonkompetitif, unkompetitif, dan mixed.

Ilustrasi 7. Macam macam mekanisme inhibisi reversible enzim

Proses pemurnian cabbage peroxidase dapat dilakukan dengan purifikasi oleh kolom dengan menggunakan metode weak anion exchanger dengan resin DEAE Sepharose. Ion exchange chromatography melingkupi pemisahan ion dan molekul yang polar berdasarkan pada afinitas terhadap ion exchanger. Purifikasi enzim ini memisahkan peroksidase yang bermuatan negatif.

30

Metode purifikasi ini telah dilakukan unutk pengambilan enzim peroksidase yang berasal dari kubis. Mekanisme yang dilakukan yaitu ekstraksi daun kubis, purifikasi crude extract dari daun kubis, menganalisis jumlah protein pada masing masing fraksi dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 280 dan menganalisis kemurnian cabbage peroxidase melalui profil protein SDS-PAGE.

Pengambilan crude extract pada kubis dilakukan dengan cara mencuci terlebih dahulu 300 gram daun kubis dan memotong motongnya menjadi potongan kecil sebelum mencampurkannya dengan 50 mM sodium phosphate buffer dingin pada pH 7.3 dan diproses dengan hand mixer. Homongenat yang telah didapatkan dipisahkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit dalam kondisi dingin untuk menghindari kerusakan protein pada sampel. Aktivitas peroksidase dalam supernatant dihitung dan dikumpulkan untuk purifikasi.

Crude exctract dari peroksidase kubis dipersiapkan dan dialirkan pada kolom purifikasi yang telah dipersiapkan sebelumn dari peroksidase kubis dipersiapkan dan dialirkan pada kolom purifikasi yang telah dipersiapkan sebelumnya dan terisi oleh bed DEAE-Sepharose. Setelah itu 100 mM phosphate buffer aquadest sebanyak 300 ml dialirkan dalam kolom diikuti dengan phosphate buffer NaCl pada pH 6.5 dialirkan dengan tiga konsentrasi masing masing 0,5 M; 1,0 M; 1,5 M sebanyak 300 ml dan fraksi ditampung per 10 ml pada setiap konsentrasi. Fraksi fraksi yang telah didapatkan dari hasil purifikasi kemudian diukur jumlah protein dan aktivitas enzimatis dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 280 nm dan 412 nm

31

Keterangan :

Ilustrasi 8. Hasil Pengukuran spektrofotometri aktivitas enzimatis dan kandungan protein pada crude exctract.

Hasil pengukuran tersebut dicatat untuk menganalisis fraksi yang memiliki protein dengan kandungan yang tertinggi. Hasil protein yang memiliki kandungan yang tertinggi kemudian digunakan untuk profil protein dengan SDS-PAGE.

Penentuan dari derajat pemurnian dan berat molekul dari enzim yang telah diambil dari kubis, metode SDS-PAGE digunakan. Demikian juga, protein standar juga digunakan pada media elektroforesis. Protein dengan kemurnian tinggi dengan jarak 14.4 – 200 kDA digunakan untuk SDS-PAGE. Saat elektroforesis selesai, band protein diberikan warna biru dengan Coomasie Brilliant Blue (CBB)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58

Enzymeactivity

Proteincontent

32

Ilustrasi 9. Gel hasil SDS-PAGE pada cabbage peroxidase

Daftar Pustaka

Cleland WW. 1963. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. II. Inhibition: nomenclature and theory. Biochim. Biophys. Acta

Karthikeyan M, Jayakumar V, Radhika K, Bhaskaran R,

Velazhahan R, Alice D (Dec 2005). "Induction of resistance in host against the infection of leaf blight pathogen (Alternaria palandui) in onion (Allium cepa var aggregatum)". Indian Journal of Biochemistry & Biophysics 42 (6): 371–7

33

Kharatmol P.P., Pandit A.B.(2012). Extraction, partial purification and characterization of acidic peroxidase from cabbage leaves (Brasicca olearacea var. capitata). J Biochem Tech (2012) 4(1): 531-540

Nelson RE, Fessler LI, Takagi Y, Blumberg B, Keene DR,

Olson PF, Parker CG, Fessler JH (1994). "Peroxidasin: a novel enzyme-matrix protein of Drosophila development". EMBO J. 13 (15): 3438–3447

Reddy CA, D Souza TM (1994). "Physiology and molecular

biology of the lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium". FEMS Microbiol. Rev. 13 (2): 137–152.

Segel, Irwin H. (1993) Enzyme Kinetics : Behavior and

Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. Wiley-Interscience; New edition , ISBN 0-471-30309-7.

Shapiro, R; Vallee, BL (1991). "Interaction of human placental

ribonuclease with placental ribonuclease inhibitor". Biochemistry 30 (8): 2246–55.

Somturk B, Kahn R, Ozdemir N. Purification of Peroxidase from Red Cabbage (Brassicaoleracea var. capitata f. rubra) by Affinity Chromatography. Appl Biochem Biotechnol (2014) 173:1815–1828

Song F, Song G, Dong A, Kong K. Regulatory mechanisms of

host plant defense responses to arbuscular mycorrhiza. Acta Ecologica Sinica 2011;31(6):322–7.

Theorell, H. (1951) In The Enzymes. Chemistry and

Mechanism of Action. Edited by Sumner, J.B. and Myrbäck, K. pp. 397–427. Academic Press, NY.

34

Welinder KG (1992). "Superfamily of plant, fungal and

bacterial peroxidases". Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (3): 388–393.

35

PENGAMBILAN OVOTRANSFERIN DARI INNER EGG SHELL MEMBRANE TELUR AYAM RAS

Protein merupakan kumpulan suatu senyawa organik yang terdiri dari hidrogen, fosfor nitrogen, oksigen dan asam amino. Protein memiliki peran yang sangat penting bagi pertumbuhan, pembentukan enzim, pembentukan antibodi dan antibakteri. Keanekaragaman protein sangat banyak, salah satunya yaitu jenis protein yang berdasarkan fungsinya, yang terdiri dari hemoglobin, immunoglobulin dan transferrin. Hemoglobin merupakan jenis protein yang memiliki rantai polipeptida berlipat rapat menjadi bentuk globular yang memiliki fungsi gerak. Immunoglobulin merupakan protein yang dapat melindungi organisme terhadap serangan penyakit dan transferin merupakan kelompok glikoprotein yang dapat mengikat besi yang berfungsi sebagau antibakteri. Transferin dibagi menjadi empat jenis yaitu serum transferrin, laktoferin, melanotransferin dan ovotransferin yang terdapat pada Tabel 3.

Ovotransferin

Ovotransferin merupakan protein kedua yang utama pada putih telur yaitu 12% dari putih telur. Ovotransferin memiliki berat molekul sebesar 78 kDa. Ovotransferin dapat dijumpai pada bagian putih telur dan membran kerabang telur. Ovotransferin memiliki banyak fungsi, salah satunya yaitu sebagai agen antibakteri. Hal ini dikarenakan ovotransferin memiliki glikoprotein yang mengikat besi dan mengakut Fe (III) pada telur. Ovotransferin berperan sebagai agen antimikroba terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis.

Mekanisme ovotransferin sebagai agen antibakteri yaitu ovotransferin bersifat reversibel yaitu dapat mengikat dua Fe2+ ion per molekul dengan adanya bikarbonat. Penggunaan ovotransferin sebagai agen antimikroba harus dalam apo,

36

bentuk besi bebas yang menghambat pertumbuhan bakteri dengan membatasi ketersediaan besi melalui khelasi membentuk besi jenuh ovotransferin (yaitu holo ovotransferin).

Penggunaan ovotransferin sebagai antibakteri pada bahan pangan sudah dinyatakan aman untuk dikonsumsi karena semua komponen ovotranferin termasuk dalam Generally Recognized As Safe (GRAS) sehingga tergolong aman digunakan untuk keperluan pengawetan pangan. Penelitian mengenai antibakteri dari ovotransferin telah banyak dilakukan oleh peneliti pangan Ko et al. (2008) telah membuktikan bahwa ovotransferin berhasil untuk menekan dengan sangat baik pertumbuhan Listeria monocytogenes. Hal ini menandakan bahwa potensi ovotransferin layak untuk mendapat perhatian untuk keperluan pengawetan bahan pangan yang bersumber dari bahan alami

Pengambilan dan Pemurnian Ovotransferin

Proses pemurnian ovotransferin dapat dilakukan dengan purfikasi dengan kolom terbuka dengan menggunakan metode kromatografi pertukaran ion dengan resin SP - Sepharose.

Metode purifikasi kromatografi pertukaran ion anion telah dilakukan pada pengambilan ovotransferin pada inner egg shell membrane telur ayam ras. Mekanisme yang dilakukan adalah (a), Pengambilan inner egg shell membrane (b), Purifikasi inner egg shell membrane (c), Memprediksi protein yang terdapat pada fraksi dengan A280 (d), Menganalisis protein dengan uji Bradeford (e), Menguji kemurnian ovotransferin melalui profil protein dapat dilihat pada Ilustrasi 10.

37

Tabel 3. Karakteristik Jenis-jenis Transferin

Sumber: Mason dan Macgillivray, 2002; Wu, J dan A. Acero - lopez. 2012.

Pengambilan inner eggshell membrane pada telur ayam ras dilakukan dengan cara manual yaitu membran dipisahkan secara perlahan dari kerabang telur dalam keadaan basah tanpa dilakukan pengeringan untuk menjaga kualitas enzim. Proses pemisahaan inner egg shell membrane dilakukan dengan terlebih dahulu membersihkan kerabang luar dengan aquades sebelum dilakukan pemecahan yang bertujuan untuk menghindari kontaminasi akibat kotoran yang masih menempel pada kerabang telur. Setelah dilakukan pemecahaan dan pemisahan isi dengan kerabang maka kerabang bagian dalam dibersihkan dengan tissu kering untuk menghilangkan putih

Karakteristik

Serum transferrin Laktoferin Melanotransferi

n Ovotransferin

Sumber Serum darah ASI, air mata,

air liur, sperma

Sel melanoma, jaringan

manusia, hati dan sel epitel

usus

Albumen

Residu asam amino 678 641 719 686

Berat

molekul 80 kDa 80 kDa 80 kDa 78 kDa

Titik

isoelektrik 7,4 8,8 6,8 - 7,1 6,00

Sifat biologis

- Melinisasi - Untuk

mengirimkan DNA ke sel

- Aktifitas antimikroba

- Syarat pertumbuhan sel

- Aktifitas antivirus

- Aktivitas jamur

Untuk khondrogenesis

dan proses angiogenesis

- Aktifitas antimikroba

- Aktifitas antivirus

- Efek imunomodlator

38

telur yang tersisa dan kemudian dilakukan pengambilan inner egg shell membrane secara manual.

Inner egg shell membrane yang didapat dipotong menjadi bagian kecil kurang lebih berukuran 0,5 x 0,5 cm2 yang selanjutnya direndam di dalam 0,05 mM sodium phosphate buffer (PB) dengan pH 7,5. Campuran tersebut kemudian diaduk dengan Ultra Turax Homogenizer yang berkecepatan 6000 rpm. Bersamaan dengan proses homogenisasi ini, nilai pH campuran diturunkan menjadi 6,0 dengan bantuan penambahan 0,01 mM HCl secara bertahap.

Selanjutnya, campuran tersebut disaring untuk mendapatkan cairan yang lebih jernih. melakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan yang diperoleh dipisahkan dan disimpan pada suhu 4˚C untuk proses selanjutnya. Proses ini dilakukan tidak lebih dari 6 jam untuk menghindari protein rusak karena penyimpanan yang terlalu lama.

Sebanyak 300 ml bagian supernatan yang diperoleh dari proses sebelumnya lalu dialirkan melalui kolom vertikal terbuka yang telah terisi dengan 10 gram resin SP - Sepharose Fast Flow. Resin ini terlebih dahulu dibersihkan dari sisa komponen yang tidak diinginkan dengan cara dialiri 10 mM PB pH 7,0 sebanyak 300 ml. Setelah semua bagian supernatan dialirkan ke dalam kolom secara perlahan, kolom kemudian dialiri dengan 50 ml 10 mM PB pH 7,0. Selanjutnya, secara berurutan, kolom dialiri 10 mM PB pH 7,0 yang masing-masing mengandung NaCl 0,1 mM; 0,3 mM; dan 0,5 mM. Volume setiap konsentrasi yang dialirkan adalah sebanyak 30 ml. Hasil elusi kemudian ditampung kedalam tabung microcentrifuge tube dan tiap tabung berisi 10 ml. Larutan yang telah ditampung kemudian disimpan di dalam refrigerator dengan suhu 4˚C.

39

Ilustrasi 10. Diagram Alir Pengambilan dan Pemurnian

Ovotransferin

Pengambilan ovotransferin dengan menggunakan kromotografi metode pertukaran ion anion maka didapatkan hasil visual seperti Tabel 4. Enzim dapat larut dengan baik dalam larutan buffer, sehingga dilakukan homogenisasi yang berfungsi untuk memperkecil ukuran inner egg shell membrane supaya kelarutan enzim dapat lebih tinggi. Proses ini sangat penting untuk mendapatkan enzim dengan kadar yang semaksimal mungkin. Nilai pH pada buffer yang digunakan untuk melarutkan inner egg shell membrane adalah 7,5 karena nilai pH sudah merupakan nilai pH optimum untuk

Pengambilan Inner Egg Shell Membrane dari Kerabang

Memprediksi Protein

Menganalisis Protein

Menguji kemurnian ovotransferin

Purifikasi Inner Egg Shell Membrane dengan SP - Sepharose Fast Flow

Kerabang Telur

40

ovotransferin. Ovotransferin adalah termasuk golongan glikoprotein yang mudah larut, oleh karena itu pada saat purifikasi dapat menggunakan pelarut jenis pospat yang secara umum digunakan untuk melarutkan berbagai jenis enzim.

Tabel 4. Parameter Visual pada Larutan Inner Egg Shell Membrane dari Proses Kromatografi Pertukaran Ion untuk Mengambil Ovotransferin dari Inner Egg Shell Membrane Ras. Parameter Inner egg shell membrane Kecepatan alir (ml/menit) 0,65 Jumlah fraksi berwarna kuning emas (tube) 3

Jumlah fraksi yang agak berwarna kuning (tube) 4

Jumlah fraksi yang jernih (tube) 3 Kejernihan larutan pra dilusi ke dalam kolom Agak jernih

Bau yang ditimbulkan pada elusi Tidak berbau Proses pengaliran ini berlangsung agak lambat dengan

kecepatan aliran rata-rata mencapai 0,6 ± 0,05 ml/ menit (Tabel 1). Hal ini dimungkinkan karena banyaknya padatan yang masih tersisa sehingga memperlambat laju alir di dalam kolom. Guna mengalirkan protein lain yang masih berada di dalam kolom, maka dialirkan aquades dan selanjutnya dilakukan pembilasan secara gradual dengan menggunakan PB pH 7 yang mengandung 0,1; 0,3; dan 0,5 mM NaCl. Cairan yang didapat dari proses pembilasan ini disebut dengan elusi. Elusi kemudian dikumpulkan ke dalam microcentrifuge tube berukuran 10 ml dan yang kemudian disebut dengan nama “fraksi”. Secara visual, fraksi - fraksi ini mempunyai tingkat penampakan agak keruh dengan warna kekuning - kuningan. Namun beberapa fraksi terlihat berwarna jernih, tidak ada penampakan warna kuning di dalamnya.

41

Secara visual, tidak ada perbedaan warna yang mencolok antara fraksi kelompok sampel ayam ras. Berdasarkan pada hasil pengamatan sebagaimana yang tercantum dalam Tabel 1, jenis telur ras menghasilkan fraksi dengan warna kuning keemasan pada tube 3. Hal ini dimungkinkan adanya komponen protein dengan presentasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan fraksi - fraksi lain. Secara visual, fraksi - fraksi lain mempunyai warna yang lebih jernih.

Pengukuran prediksi kadar protein pada setiap fraksi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm.

Panjang gelombang 280 nm lazim digunakan untuk mengetahui jumlah protein pada hasil sampel purifikasi protein karena protein yang terlarut, dapat menyerap sinar UV dengan baik. Semakin banyak sinar yang diserap sampel maka konsentrasi protein telarut semakin besar.

Pada Tabel 2, dapat dilihat bahwa nilai absorbansi tertinggi terdapat pada fraksi 1 dengan nilai absorbansi mencapai 0,535, artinya bahwa fraksi 1 ini mempunyai konsentrasi protein yang tertinggi dibanding dengan fraksi lainnya. Nilai absorbansi yang tertinggi ini belum tentu memiliki tingkat kemurnian protein yang tinggi oleh karena itu, pada tahap penelitian berikutnya dilakukan analisis profil protein dengan SDS - PAGE guna mengetahui tingkat kemurnian protein.

Berdasarkan penilaian puncak nilai absorbansi, absorban tertinggi dicapai pada fraksi 1 yang merupakan hasil elusi dari 0,1 mM NaCl. Tinggi rendahnya absorbansi sangat tergantung pada zat yang dipurifikasi. Semakin tinggi kandungan protein zat tersebut maka akan semakin tinggi nilai absorbansi puncaknya.

42

Ilustrasi 11. Nilai Absorbansi pada Panjang Gelombang 280

nm pada Fraksi yang Didapat dari Proses Purifikasi Ovotransferin dari inner egg shell membrane Telur Ayam Ras.

Profil protein membran kerabang telur dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Profil protein inner egg shell membrane ayam ras ditampilkan pada Ilustrasi 12. Ilustrasi 12 menunjukkan hasil dari analisis elektroforesis dari sampel inner egg shell membrane ayam ras yang belum dan yang telah melalui proses purifikasi dengan menggunakan kolom SP - Sepharose Fast Flow. Profil protein pada larutan inner egg shell membrane dalam larutan buffer sebelum proses purifikasi dilakukan, tampil pada lane A dan tampak terdapat dua protein dominan dengan berat sekitar 78 dan 45 kDa. Dua protein ini diduga adalah protein ovotransferrin dan ovalbumin. Lane B sampai dengan H adalah tampilan protein hasil dari fraksi yang telah mengalami proses purifikasi.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abs

orba

nsi

Fraksi

43

Ilustrasi 12. Elektroforesis Profil Protein Inner Egg Shell Membrane Ayam Ras.

Lane A = Membran Kerabang Telur Dalam Larutan Buffer; Lane B - D = Fraksi yang Diperoleh dari Elusi 0,1 mM NaCl; Lane E - G = Fraksi yang Diperoleh dari Elusi 0,3 mM NaCl; Lane H Fraksi yang Diperoleh dari Elusi 0,5 mM NaCl.

Setelah mengalami tahap purifikasi, tampak terdapat pengurangan jumlah band, dari dua band menjadi hanya satu band, yaitu band dengan berat molekul sekitar 78 kDa. Hasil profil SDS - PAGE ini dapat digunakan untuk menarik kesimpulan bahwa proses purifikasi dapat berhasil dengan baik dan hanya menyisakan satu protein saja, yaitu ovotransferrin dalam fraksi yang diperoleh pasca purifikasi. Berdasarkan hasil dari SDS - PAGE ini, dapat disimpulkan bahwa elusi protein dengan larutan 0,1 mM NaCl adalah larutan yang tepat untuk dapat memisahkan protein ovotransferin dari inner egg shell membrane dan penggunaan NaCl yang lebih dari 0,1 mM

44

dinilai tidak dapat digunakan untuk mengambil protein apapun, termasuk protein ovotransferin.

Ovalbumin dapat terdeteksi pada SDS - PAGE ini karena dalam membran telur, terdapat kandungan ovalbumin dalam jumlah yang besar, yaitu dapat mencapai 54 % dalam putih telur. Kandungan protein ovalbumin yang besar, nampak jelas dari band yang muncul pada Ilustrasi 4 lane A yang menunjukkan tingkat intensitas warna yang jelas dan tebal pada band dengan kisaran berat molekul 46 KDa.

Intensitas band dapat diartikan sebagai indikator banyak tidaknya kandungan protein dalam sampel. Berdasarkan hal ini dapat disimpulkan bahwa protein dengan berat 46 KDa dalam sampel, lebih banyak jumlahnya dibandingkan dengan protein dengan berat molekul 76 KDa.

Kadar protein dianalisis dengan metode Bradford yang merupakan suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein dengan secara kolorimetri dalam suatu larutan. Pada uji Bradford sampel yang diujikan, akan bereaksi dengan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) dalam suatu larutan yang bersifat asam, sehingga sampel menjadi berwarna kebiruan. Tingkat warna biru ini dapat diukur intensitasnya dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 465 nm dan kemudian mencocokan hasil yang didapat dengan standar kurva. Penelitian ini menggunakan standar kurva larutan ovalbumin dengan konsentrasi 0,5 sampai 5% dengan interval 0,5. Hasil analisis Bradford fraksi 1 - 4 hasil elusi melalui kolom kromatografi yang berisi resin dapat dilihat pada Tabel 3. Fraksi 1 sampai 4 dipilih untuk dianalisis kadar protein karena hasil nilai absorban 280 nm untuk fraksi 1 - 4 menunjukkan adanya nilai absorbansi yang berada pada kisaran 0,2 - 05 pada peak pertama dan hasil analisis profil protein yang menunjukkan adanya band pada 78 kDa dan tidak terdapatnya band yang jelas pada fraksi - fraksi setelah fraksi

45

ke tiga. Fraksi keempat dan kelima diikutsertakan dalam analisis kadar protein ini dimaksud untuk melakukan cek ada atau tidaknya protein dalam sampel. Berdasarkan Tabel 3 didapat hasil bahwa kadar protein dapat terdekteksi pada fraksi 1 - 3 di kedua jenis sampe. Protein pada fraksi nomor 4 ini diduga adalah protein bukan ovotransferrin karena fraksi nomor 4 ini band tidak muncul sama sekali setelah dilakukan analisis profil protein dengan menggunakan SDS - PAGE (data tidak ditampilkan).

Ilustrasi 13. Kadar Protein Fraksi 1 sampai 4 pada Hasil Elusi Larutan inner egg shell membrane dari Telur Ayam Ras yang

Ditentukan dengan Metode Bradford Berdasarkan hasil penjumlahan seluruh fraksi dari 1 - 3

pada telur ayam ras, didapat hasil sebesar 15% yang menunjukkan bahwa dari seluruh larutan inner egg shell membrane (200 g inner egg shell membrane dalam 300 ml) terdapat 30 g ovotransferrin dalam 300 ml. Guna mendapatkan 200 g inner egg shell membrane, diperlukan 40 butir telur, sehingga dapat dihitung bahwa tiap telur terkandung 0,75 g

0123456789

1 2 3 4 5

KadarP

rotein(%

)

Fraksi

46

ovotransferrin. Perhitungan pada telur ayam ras, dihasilkan angka sebesar 4% dari hasil penjumlahan fraksi 1 - 3.

Penyimpanan Ovotransferrin

Proses kromatografi dalam pengambilan ovotransferrin dinilai masih sulit untuk dilakukan. Padahal penggunaan ovotransferrin sebagai antibakteri hanya dibutuhkan sedikit sekitar 20 mg/ mL, sedangkan pada proses purifikasi didapatkan ovotransferrin dalam jumlah banyak. Sehingga ovotransferrin yang tidak digunakan dapat disimpan dalam freezer dengan tujuan untuk mempertahankan kualitas ovotransferrin. Peyimpanan juga bermanfaat dalam pendistribusi ovotransferrin dalam jangka waktu yang lama. Proses penyimpanan dapat berdampak penurunan kualitas protein. Penelitian yang telah dilakukan pada uji kuantitas ovotransferrin dari egg shell membrane pada penyimpanan didapatkan hasil bahwa hanya terjadi sedikit penurunan ovotransferrin selama 4 minggu. Efek penyimpanan selama 4 minggu dalam suhu 4˚C terhadap tingkat denaturasi protein ovotransferrin dapat dilihat pada Ilustrasi 14.

Ilustrasi 14. Jumlah persen protein ovotransferrin yang masih tersisa selama penyimpanan 0, 2, dan 4 minggu.

47

Analisis jumlah protein pada penyimpanan 2 dan 4 minggu masing-masing menunjukkan adanya penurunan persentase protein menjadi 96,3±1,1 dan 98,0±0,4. Penurunan ini relatif masih dapat dikatakan kecil namun jika penyimpanan dilakukan lebih dari 4 minggu, kemungkinan akan terjadi penurunan yang lebih besar. Oleh karena itu, perlu dilakukan upaya untuk mempertahankan penurunan jumlah protein ini. Dampak penyimpan protein selama 4 minggu pada analisis protein Bradford menunjukkan bahwa penurunan protein yang terjadi sebesar 0,15%. Penurunan ini sangat berbeda hasilnya ketika dibandingkan dengan metode penyimpanan di dalam freezer, sebagaimana telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya yang menyimpan protein selama 6 bulan di dalam suhu -20˚C (Al-Baarri et al., 2011). Penelitian tersebut menyimpulkan bahwa protein tunggal yang disimpan dalam suhu tersebut, tidak merubah jumlah maupun aktivitasnya. Namun jika disimpan dalam suhu 10˚C, protein akan hancur dalam waktu 7 hari penyimpanan. Hasil profil protein pada penyimpanan ovotransferrin menunjukkan hasil yang tidak nampak berbeda pada masing-masing lane. Hal ini dapat diartikan bahwa secara visual, belum nampak adanya penurunan kualitas protein ovotransferrin selama masa penyimpanan 4 minggu. Band yang nampak pada hasil profil protein digunakan sebagai representasi dari jumlah dan macam kandungan protein yang ada didalam sampel, namun tidak dapat dijadikan dasar untuk menghitung aktivitas atau kualitas protein dalam sampel. Sehingga penurunan yang terjadi pada protein, secara visual kurang begitu nampak pada profil proteinnya namun dapat nampak ketika ada perubahan yang ekstrim pada jumlah proteinnya (Ribotta et al., 2012).

48

Daftar Pustaka

Al–Baarri A. N., Ogawa, M and Hayakawa, S. 2011. Application of lactoperoxidase system using bovine whey and the effect of storage condition on lactoperoxidase activity. International Journal of Dairy Science. 6:72–78.

Baron, F., M. Gautier, and G Brule. 1997. Factors involved in

the inhibition of growth of Salmonella enteritidis in liquid egg white. J. Food Protection 60: 1318 – 1323.

Deleu, L. J., E. Wilderjans., I. V. Haesendonck, C. M. Courtin.,

K. Brijs., J. A. Delcour. 2015. Storage induced conversion of ovalbumin into S - ovalbumin in eggs impacts the properties of pound cake and its batter. Food Hydrocolloids 49: 208 - 215.

Mahasri, G., U. Fajriah, dan S. Subekti. 2010. Karakteristik

protein Lernaea cyprinacea dengan metode elektroforesis SDS - PAGE. J. Ilmiah Perikanan dan Kelautan 2 (1): 61 - 66.

Mann, K and M. Mann. 2011. In - depth analysis of the chicken

egg white proteome using an LTQ orbitrap velos. Proteome Science 9: 1 - 7.

Mason, A. B., and Macgillivray, R. T. A. (2002). Transferrins.

In D. Templeton (Ed.), Molecular and cellular iron transport. New York: Marcel Dekker, INC.

Ko, K. Y, and D. U. Ahn. 2008. An economic and simple

purification procedure for the large scale production of

49

ovotransferrin from egg white. Poultri Science 87: 1441 - 1450.

Purwanto, M. G. M. 2014. Perbandingan analisa kadar protein

terlarut dengan berbagai metode spektroskopi UV - Visible. Jurnal Ilmiah Sains dan Teknologi 7 (2): 64 - 71.

Ribotta Pablo D, Andrés Colombo and Cristina M. Rosell.

2012. Enzymatic modifications of pea protein and its application in proteinecassava and corn starch gels. Food Hydrocolloids 27: 185-190

Varon, O., K. J. Allen., D. C. Bennett., L. R. Mesak, and C. H.

Scaman. 2013. Purification and characterization of tinamou egg white ovotransferrin as an antimicrobial agent against foodbone pathogenic bacteria. Food Research International 54 (2):1836-1842.

Wu, J and A. Acero - lopez. 2012. Ovotransferrin: structure, bioactivities, and preparation. Food Research International 46 (2):480-487.

50

INDEKS ISTILAH

Absorbansi = 5, 6, 7, 23, 42, 43, 46, ABTS = 6, 22 Akseptor electron = 27 Askorbat peroksidase = 28 Antibakteri = 2, 4, 36, 37 Antioksidan = 18 Bakteri = 2, 4, 27, 28, 36, 37, Band = 7, 24, 32, 44, 45, 46, Bradford = 45, 46, 47 Coomasie Brilliant Blue (CBB) = 32, 45 Enzim = 1, 4, 5, 6, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 27, 28, 29, 31, 32, 36,

39, 41 Enzimatik = 4, 6 Enzim glikolitik = 4 Fermentasi = 4 Ferrylperoxidase = 4 Fosfat buffer= 5 Fraksi = 5, 6, 7, 20, 21, 22, 23, 24, 31, 32, 39, 41, 42, 43, 44,

45, 46, 47, Generally Recognized As Safe (GRAS) = 37 Glikoprotein = 28, 36, 41 Heme peroksidase = 27, 28 Hidrogen peroksida = 2, 18 Horseradish peroxidase = 18, 19 Hypothiocyanite = 18 Inhibitor = 28, 29 Initial state = 4 Inner egg shell membrane = 36, 38, 39,40, 41, 44, 45, 46, 47 Intraselullar = 28 Ion Excange Chromatography = 30 Jamur = 2, 28, 38

51

Katalisis = 2, 4, 18, 27, 29 Laktoperoksidase = 1, 2, 18 Lane = 7, 23, 24, 44, 45,47 Membran sitoplasma = 18, 4 Mikroorganisme = 4, 27 Mitokondria = 28 Oksidasi = 2, 4, 6, 18, 27, 28 Tiosianat = 2, 4 Ovotransferin =36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45,46,47,48 Ovalbumin = 44, 45 Pasteurisasi = 3 Purifikasi = 19, 20, 21, 30, 31, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45 Protozoa = 2 Radikal substrat = 28 Reaksi propagasi = 4 Retentat = 5 Resin DEAE = 19, 20, 30, 31 Resin SP – Sepharose = 5, 38, 40 Resistensi = 2 Peroksidase = 1, 2, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 28, 30, 31 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(SDS-PAGE) = 23, 43 Spesies = 4 Supernatan = 19, 20, 21, 31, 39, 40, Virus = 2, 38 Whey = 1, 5

52

Ahmad Ni’matullah Al-Baarri, lahir di

Purwokerto, 1 Juni 1974. Penulis telah

menyelesaikan studi dari program S-1 Ilmu

dan Teknologi Susu, Universitas Gajah

Mada, Yogyakarta pada tahun 1998, S2 Ilmu

dan Teknologi Susu, Universitas Gajah

Mada, Yogyakarta pada tahun 2001 dan S3

Ilmu dan Teknologi Enzim, Ehime Univerisity, Jepang pada tahun

2010.

Pada tahun 2012 hingga sekarang, beliau menjabat sebagai ketua

Laboratorium Kimia dan Gizi Pangan Fakultas Peternakan dan

Pertanian Undip dan Ketua Bidang Promosi International Office.

Beliau menjabat sebagai ketua laboratorium Food Technology pada

UPT Laboratorium Terpadu Undip dan Ketua Indonesian Food

Technologists pada tahun 2013-sekarang. Beliau juga aktif sebagai

Ketua Dewan Redaksi Journal of Applied Food Technology mulai

tahun 2014.

Penulis juga aktif dalam berbagai seminar nasional dan internasional

bidang teknologi pangan sebagai pemakalah. Dalam komunitas

internasional, penulis tercatat sebagai anggota aktir Japanese

Society for Food Science semenjak tahun 2015.

Indonesian Food Technologists Penerbit buku bidang ilmu dan teknologi pangan Gedung Laboratorium Terpadu Lantai 3 Jl. Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang Telp. (024) 40123123, (024) 40040080 E-mail : redaksi@ift.or.id

View publication statsView publication stats