Técnicas Moleculares A
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Cell lysis
Protein removal
DNA precipitation
Process Common procedure
SDS, sarcosyl CTAB
Proteinase K Lysozyme
Freezing Sonication Grinding
Chemical
Enzymatic
Mechanic
Alcohol Ethanol Iso-propanol
Phenol chloroform
Sodium chloride Sodium acetate
Membrane Beads
Organic solvents
Salt
DNA binding
Obteno e manipulao de cidos nuclicos
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FERRAMENTA IMPORTANTE: Endonucleases de
restrio
Bacterifagos - > vrus infectam bactrias
1950s - fagos infectam cepas especficas
certos fagos restritos a certas cepas (Luria)
1962 - endonuclease clivam DNA no protegido
DNA no protegido degradado por endonuclease restringindo infeco
1968 - purificao 1a endonuclease de restrio
1970 - purificao e caracterizao Hin dII
corte mesmo stios - mapa de restrio
Obteno e manipulao de cidos nuclicos
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Clonagem molecular o processo de construo de molculas de DNA recombinante e da sua propagao em hospedeiros
apropriados que possibilitam a seleco do DNA recombinante.
Obteno e manipulao de cidos nuclicos
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SOUTHERN BLOT
Restriction enzymes
molecular scissors
Southern blot steps
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-processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra .
SEQUENCIAMENTO
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Marcadores moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction
-sntese enzimtica in vitro de milhes de
cpias de um segmento especfico de DNA
na presena da enzima DNA polimerase.
-sua reao baseia-se no anelamento e
extenso enzimtica de um par de
oligonucleotdeos (pequenas molculas de
DNA de fita simples) utilizados como
indicadores (primers) que delimitam a
sequncia de DNA de fita dupla alvo da
amplificao.
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Marcadores moleculares
- Isoenzimas
-RFLP
baseados em PCR
- RAPD
- AFLP
-Microsatlites
-SNPs
- Genes nucleares e mitocondriais
Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular
oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um
segmento especfico de DNA (expresso ou no).
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Marcadores moleculares
Eletroforese em gel - uma tcnica de separao de macromolculas que envolve a migrao das mesmas em um
determinado gel durante a aplicao de uma corrente eltrica. As
molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, as menores iro
migrar mais rapidamente que as de maior tamanho.
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Marcadores moleculares
Genotipagem automtica anlise do produto amplificado em sequenciador. O equipamento determinar o tamanho do fragmento
detectando a fluorescncia acoplada ao iniciador.
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Marcadores moleculares
Isoenzimas variao allica de protenas.
- Eletroforese em gel de amido e visualizao do produto enzimtico por
mtodos histoqumicos;
-Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico so
resultantes de diferenas ao nvel de sequncias de DNA que codificam tais
enzimas;
-Fentipo molecular - co-dominante.
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Marcadores moleculares
Homozigoto Heterozigoto
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Marcadores moleculares
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
-polimorfismo no comprimento de
fragmentos obtidos por corte (com
enzimas de restrio) da fita dupla
de DNA ;
-co-dominantes.
PCR RFLP
- Amplificao de um dado gene e
posterior corte com enzimas de
restrio.
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Marcadores moleculares
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
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Anemia falciforme
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PCR (Reao em Cadeia da Polimerase)
Desnaturao: 95C
Anelamento: 55C
Extenso: 72C
25 a 40 ciclos
Amplificao in vitro de cidos nuclicos: aumento da possibilidade de visualizar estas molculas
DNA molde (alvo)
Iniciadores
Nucleotdeos (dNTPs)
DNA polimerase
ons Magnsio (cofator da enzima)
Tampo (manuteno do pH timo)
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Marcadores moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction
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Marcadores moleculares
RAPD - Randomly Amplified
Polymorphic DNA
-variao do protocolo de PCR, com
duas caractersticas distintas:
a) utiliza um primer nico ao
invs de um par de primers;
b) primer nico tem sequncia
arbitrria, e portanto sua
sequncia alvo desconhecida.
-dominantes
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Marcadores moleculares
Homozigoto ?
Heterozigoto ?
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Marcadores moleculares
AFLP -Amplified Fragment Length Polymorphism
- DNA total clivado com enzimas
de restrio;
-uma frao dos fragmentos
gerados amplificada
seletivamente via PCR;
-rene a vantagem da PCR
especfica com a vantagem da
RAPD em se explorar sequncias
arbitrrias;
-dominante
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Marcadores moleculares
MICROSSATLITES
-cada ilha microssatlite, (CA, TG, ATG, etc.)constitui um loco
gentico altamente varivel,
multiallico, de grande contedo
informativo.
-cada segmento amplificado de
tamanho diferente representa um
alelo diferente do mesmo loco.
TTCGATTCTAAGGCCTTGCTAGCAGAAGC
CGGCGAATATCAGTTACACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACACA
ACACTGTCTGCTAGGCTTCTGCTAGCAAG
GCCTTAGAATCACTAGTGAATTCGCGGCC
GCCT
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Marcadores moleculares
Homozigoto
Heterozigoto
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SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS
(SNPS)
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Marcadores moleculares
SEQUENCIAMENTO