Fibrosis Cística

Química Biológica Patológica

Dra. Silvia Varasqbpatologica.unsl@gmail.com

Tema:18 (3)

Técnicas Moleculares

de Diagnóstico

N

C

R-domain

out

in

ATPATP

1°- PK activada AMPc

CFTR para ser funcional debe recibir 2 señales reguladoras: 1- Fosforilación de su dominio R por una PK

2-La asociación e hidrolisis de 2 moleculas de ATP

2°

Familia Transportadores ABC: ABC C7

N

C

Cl- out

in

-O

OP

O

O

-O

OP

O

O-O

OP

O

O

O-

OP

O

OO-

OP

O

O

R-domain

ADP ADP

CFTR para ser funcional debe recibir 2 señales reguladoras: 1- Fosforilación de su dominio R por una PK

2-La asociación e hidrolisis de 2 moleculas de ATP

Se han identificado mas de 1300 mutaciones en el gen CFTR (www.genet.sickkids.on.ca/cftr):

Mutaciones con cambio de sentido: 40%

Mutaciones sin sentido: 18%

Mutaciones en los sitios de splicing: 18%

Mutación en el marco de lectura: 22%

Otras mutaciones: 2%

MUTACIONES

Mutaciones en CFTR: Frecuencia en USA

Se han descripto más de 1300

mutaciones

ΔF508 es cerca del 70% de los casos descriptos de FC.

F-508 - 57 %

G542X - 3,94%

W1282X - 3,07%

N1303K - 1,75%

1717 1GA - 0,87%

R553X - 0,43%

R1162X - 0,43%

Frecuencias en Argentina

Pesquisa Neonatal de FQ en la Argentina

Pesquisa Neonatal de FC desde 1994 (Ley Nacional 24.438-94 y 26.279-07) las estrategias mas usadas son: TIR/TIR y TIR/TIR/ADN.

Cobertura Nacional : 15-20% RN Incidencia 1:6.131

Frecuencia Mutaciones1º- F508 está presente en el 58-60%2º- G542X 5%3º- 16 mutaciones (N1303K, W1282X, 1717-1G>A, 3849+10KbC>T, R334W, G85E, DI507, 2183AA>G, 2789+5G>A, 1811+1.6Kb A>G, R1162X, R553X,R1066C, 621+1G-T, 3659delC y 1898+1G>A) en 1-2 %

Estrategias de Laboratorio Molecular I

PCR + Digestión con Enzima de Restricción

PCR con primer modificados + Digestión con Enzima de Restricción

PCR con primers alelo específicos (PCR alelo especifica): 1 Fragmento Multiplex alelo especifica (MAS): 2 o mas fragmentos

Estrategias de Laboratorio Molecular II

La estrategia para realizar un diagnóstico molecular se elabora en función de la heterogeneidad alélica de cada población Esta estrategia se inicia con el análisis de las mutaciones más frecuentes.

Si una o ambas mutaciones no se identifican es necesario realizar un rastreo del gen CFTR, mediante técnicas que permitan detectar cualquier cambio existente en la secuencia del DNA de la muestra. Las técnicas más comúnmente utilizadas en el análisis del gen CFTR son la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) y el análisis de la conformación de la cadena sencilla (SCCA) Las dos técnicas han mostrado una alta sensibilidad (>98%) para la detección de fragmentos anómalos.

F-508 - 57%

G542X - 3.94% Mut.med. por PCR

W1282X - 3.07% E.R

N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR

1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR

R553X - 0.43% E.R

G551D - 0.43% E.R

• Estrategias:

Estrategias para caracterización de mutaciones en FC:

1- PCR-RFLP (amplification + endonuclease restriction)

2- Mutagénesis Dirigida (Mutation mediated for PCR + Amplification + endonuclease restriction)

1- PCR-RFLP (amplification + endonuclease restriction)

PCR+RFLP (amplification+ endonuclease restriction)

Alelo Normal

Alelo Mutado

420pb300 pb

720 pb

M 1 2 3 -

Paciente 1 -/-Paciente 2 +/+Paciente 3 +/-

Detección F508

Método Mutagénesis mediada por PCR

5’

5’3’

3’

Nomenclatura Hebras de ADN !

Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+)

Secuencia publicada en Gene Bank!

Human cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t

Human cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t

g

Enzima restricción MboI:

5’- GATC -3’3’- CTAG -5’

Secuencia del exón 10 próxima al codón 508

Normal: 5' ACCATTAAAGAAAATATCATCTTTG

ΔF508: 5' ACCATTAAAGAAAATATCAT TG

Primer S: 5' ACCATTAAAGAAAATATGAT

Primer AS: 5' TGCAAGCTTCTTAAAGCATA

Productos de amplificación y corte con Mbo I

Normal (262 pb)

17 pb ▼ 201pb ▼ 44 pb 5’ACCATTAAAGAAAATATGATCTT................. AATGGATC........... GCA 3'

 

Mutado (259 pb)

215 pb ▼ 44 pb

5' ACCAATTAAAGAAAATATGATTG.................... AATGGATC............ GC 3'

 

MboI (-) MboI (-) MboI (-)

MboI (-) MboI (-) MboI (+)

FAMILIA 1

FAMILIA 2

Familia 3

M 100pb

Gel 12% de productos de PCR digeridos con MboI

Alelo N 201 pb

Alelo M 215 pb

G542X

F-508 - 57%

G542X - 3.94% Mut.med. por PCR

W1282X - 3.07% E.R

N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR

1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR

R553X - 0.43% E.R

G551D - 0.43% E.R

Estrategias:

Modelo de Informe Análisis de Mutaciones en el gen

CFTR

Metodología: Amplificación por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Mutagénesis dirigida mediada por PCR,Hibridización con sondas alelo especificas

PACIENTE MUTACIONES ANALIZADAS F-508 G542X W1282X N1303KInocente Gómez -/- -/- -/- -/-Culpable Gómez -/- -/- -/- -/+

Interpretación de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutación -/-: No presenta la mutación +/+: Homocigota para la mutación

PCR multiplex alelo especifica (MAS-PCR): es la amplificación en un único tubo de múltiples fragmentos de un determinado gen. Esta estrategia involucra la elección de los pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño y que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, -talasemia y screenning de 4 de las comunes mutaciones para fibrosis cística (F508, G542X, G551D y N1303K).

Primers Secuencia TipoCF-W1468-N 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ F1– 139 pbCF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ R1F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ F2—136 pb

5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3

G551D-N 5’-GAA ATT CTT GCT CGT TGA C-3’ R2--202 pbG551D-M 5’-GAA ATT CTT GCT CGT TGA T-3’ R3

G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R4--174 pbG542X-M 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R5

5’IVS-21 5’-AAG AAT GAT ACA AAG CAG ACA TG-3’ F4N1303K-N 5’-CAC TGT TCA TAG GGA TCC AAG-3’ R6—240 pbN1303K-M 5’-CAC TGT TCA TAG GGA TCC AAC-3’ R7

CF-W1468-NF-508

CF-508 RP

N:139 pb

M: 136 pb

5’IVS-11

G542X-M

N y M:174 pb

G542X-N

t

5’IVS-11

G551D-M

N y M:202 pb

a

G551D-N

5’IVS-11

R553X-M

N y M:207 pb

t

R553X-N

5’IVS-21

N1303K-NN1303K-M

g

N y M:240 pb

Constituyentes Master MixMaster 1 (Normal): F1 +R1 F3 + R2 F3 + R4 F4 + R6Total: 7primers

Master 2 (Mutadas): F2 + R1 F508 F3 + R3 G551D F3 + R5 G543X F4 + R7 N1303KTotal: 7primers

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N M N M N M N M N M

Los tamaños de los productos de amplificación son: N1303K (240pb), G551D (202pb), G542X (174pb) y F508 (136pb), WT (139).

En los extremos Marquer de Peso Molecular (X174 digerido con Hae III). En las líneas 2,4, 6, 8 y 10 se usan los primers con las secuencias normales.

Líneas 1 y 2: Paciente 1 con primers N y M Líneas 3 y 4: Paciente 2 con primers N y M Líneas 5 y 6: Paciente 3 con primers N y M Líneas 7 y 8: Paciente 4 con primers N y M Líneas 9 y 10: Paciente 5 con primers N y M Basado en los datos brindados por esta

publicación, realice el informe de las mutaciones analizadas de los pacientes 1 al 5.

TP: F508 y G542X

Primers Secuencia Tipo

CF-W1468-N

5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’

F1

CF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’

R1

F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’

F2

5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3

G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R3

G542X-M 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4

CF-W1468-NF-508

CF-508 RP

N:139 pb

M: 136 pb

5’IVS-11

G542X-M

N y M:174 pb

G542X-N

t

N M N M N M N M N M N M

Los tamaños de los productos de amplificación son: G542X N y M (174pb) y F508 (136pb), WT (139).

P1 P2 P3 P4 P5 P6

Modelo de Informe Análisis de Mutaciones en el gen

CFTR

Metodología: Amplificación por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Mutagénesis dirigida mediada por PCR,Hibridización con sondas alelo especificas

PACIENTE MUTACIONES ANALIZADAS F-508 G542X W1282X N1303KInocente Gómez -/- -/- -/- -/-Culpable Gómez -/- -/- -/- -/+

Interpretación de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutación -/-: No presenta la mutación +/+: Homocigota para la mutación