Marcadores moleculares

Raul Blas, 2010Facultad de agronomia

Dpto. Fitotecnia

rblas@lamolina.edu.pe

Marker (Cambridge, 2002)

a sign wich shows where something is.

an action which is understood to represent or show a characteristic of a person or thing or feeling.

Marcador

Que marca (señal que se pone a una persona o cosa para reconocerla), marca registrada …

Qué es un marcador?Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede definirse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico o molecular.

Se asocian marcadores con caracteres, para esclarecer la probabilidad de relación entre un locus genéticos y un carácter determinado

Marcadores moleculares

Desde el punto de vista de un análisis de relación genética los marcadores moleculares son:

Puntos específicos fijados a un cromosoma

La herencia es completamente Mendeliana

Genética

Primera ley de Mendel?

En un diploide los dos

Alelos de un gen segregan en los

gametos con igual frecuencia

individuo: Aa gametos: A 50%, a 50%

Primera ley de Mendel y frecuencias F2?F1 F1: Aa Aa

F2:

1/4AA 2/4Aa 1/4aa (codominante)

3/4A- 1/4aa (A dominante)

1/2A 1/2a1/2A 1/4AA 1/4Aa1/2a 1/4Aa 1/4aa

gametos f1 macho

gam

eto

s f1

h

emb

ra

F2: AA 1/4 Aa 2/4 aa 1/4 (codominante)

A- 3/4 aa 1/4 (A dominante)

Aa aaAA

Co-dominanteDominante

Aa aaAA

No se puede distinguir AA o Aa

Como se interpreta esto con marcadores moleculares:

Tipos de marcadores genéticos

1. Marcadores morfológicos (Efecto combinado de muchos genes y el ambiente).

Caracteres morfológicos son los más antiguos y ampliamente usados. Son profundamente afectados por fluctuaciones ambientales y por las etapas de desarrollo de la planta, así como por el vasto número de individuos a analizar.

Marcador morfológico

Visualización de los Fragmentos Amplificados

Polimorfismo

1 2 M 1 2 M

AFLP RAPD SSR

Marcadores molecularesMarcadores moleculares

Cualquier señal o traza molecular que nos permite estudiar un caracter (Fenotipo) o gen (Genotipo) asociado a este, y de herencia mendeliana (Marcador Genético) y detectada como secuencias de ADN o proteínas

Detección de variabilidad a nivel de secuencias de ADN. Fuentes de origen de MM

1. ADN cromosómico (genómico)ADN codificanteADN no codificanteADN altamente repetido

2. ADN extracromosómicoADN mitocondrialADN de cloroplastos

Procedimientos Generales en el uso de MM:

1. Extracción de DNA2. Generación de polimorfismoEnzimas de restricciónReacción PCRCombinación de los 2 anteriores (enzimas de restricción y PCR)

3. Electroforesis (horizontal, y/o vertical)4. Detección de los fragmentos Sondas marcadasBromuro de etidio, UVQuimioluminiscenciatincion en plata

5. Autoradiografía y/o fotografia6. Evaluación de los fragmentos7. Análisis estadístico

Aislamiento de DNA

‘CTAB’

Proteina/polisacaridos

DNA

+

+ cloroformoTransferir sobrenadanteMoler hojas

Eliminar isopropanol,Disolver en H20, TE

Marcos Malosetti, 2007 Wageningen University

Conceptos

Enzimas de restricción (Endonucleasas): Son proteínas que reconocen secuencias cortas de nucleótidos específicas y cortan ADN en esas zonas.

ADN

Pst I

Iniciadores (“Primers”): Es una secuencia corta de ácido desoxirribonucleótido (ADN) que se ancla a una hebra del ADN molde. El cual se requiere para la síntesis de ADN in vitro (reacción de polimerización), ya que la ADN polimerasa solo no es capaz de iniciar la polimerización de ADN .

RAPD 10-mer Set A RAPD 10-mer Set BTube A-01 5'-CAGGCCCTTC-3' Tube B-01 5'-GTTTCGCTCC-3'Tube A-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Tube B-02 5'-TGATCCCTGG-3'Tube A-03 5'-AGTCAGCCAC-3' Tube B-03 5'-CATCCCCCTG-3'Tube A-04 5'-AATCGGGCTG-3' Tube B-04 5'-GGACTGGAGT-3'Tube A-05 5'-AGGGGTCTTG-3' Tube B-05 5'-TGCGCCCTTC-3'Tube A-06 5'-GGTCCCTGAC-3' Tube B-06 5'-TGCTCTGCCC-3'Tube A-07 5'-GAAACGGGTG-3' Tube B-07 5'-GGTGACGCAG-3'Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube B-08 5'-GTCCACACGG-3'Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube B-09 5'-TGGGGGACTC-3'Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube B-10 5'-CTGCTGGGAC-3'Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube B-11 5'-GTAGACCCGT-3'Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube B-12 5'-CCTTGACGCA-3'Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube B-13 5'-TTCCCCCGCT-3'Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube B-14 5'-TCCGCTCTGG-3'Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube B-15 5'-GGAGGGTGTT-3'Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube B-16 5'-TTTGCCCGGA-3'Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube B-17 5'-AGGGAACGAG-3'Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' Tube B-18 5'-CCACAGCAGT-3'Tube A-19 5'-CAAACGTCGG-3' Tube B-19 5'-ACCCCCGAAG-3'Tube A-20 5'-GTTGCGATCC-3' Tube B-20 5'-GGACCCTTAC-3'

La reacción en cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction - PCR): Es una técnica in vitro de amplificación enzimática del ADN. Mediante el cual se obtiene millones de copias de secuencias específicas del genoma de un organismo.

ciclos, consta de 3 pasos:1. Denaturación: es una denaturación termal de la

muestra de ADN, a 94- 95°C.2. Anclaje de iniciadores (Renaturación): la

temperatura de la mezcla es enfriada hasta los 35-60°C.

3. Síntesis (polimerización): La temperatura es elevada a 70 - 85 °C, la temperatura óptima (72°C)

Los componentes de amplificación para la reacción PCR son:

•primers sintéticos, que son regiones complementarias a las cadenas opuestas que flanquean a la región de ADN blanco que se desea amplificar.• Una secuencia blanco en una muestra de ADN •Una enzima, la ADN Polimerasa termoestable que pueda resistir altas temperaturas de calentamiento (95° C a más).• Los cuatro deoxiribonucleótidos (dNTPs).• Un buffer para darle las condiciones adecuadas al sistema en conjunto.

2x-2x, x= número ciclos

Preparación de gel para electroforesis

Electroforesis: Es el movimiento de una partícula cargada (ion) en un campo eléctrico. El movimiento se realiza en medio líquido que está sostenida por sustancia sólida inerte, como papel o gel semisólido.

Sistema de marcadores DNA

DNA*******

probe

Basados en hibridaciónBasados en hibridaciónRFLP, VNTR,

oligonucleotide fingerprinting

RFLP, VNTR,oligonucleotide fingerprinting

Basados en amplificaciónBasados en amplificación DNA

RAPD, DAF, AFLP, SSR,MP-PCR, ISSR, IRAP, REMAP,

STS, SCAR, CAPS

RAPD, DAF, AFLP, SSR,MP-PCR, ISSR, IRAP, REMAP,

STS, SCAR, CAPS

Basados en secuenciamientoBasados en secuenciamientoATTAGTCTTACCTAGGAATCGATTTAATCAGAATGGATCCTTAGCTAA

EST, SNP,DNA microarray

EST, SNP,DNA microarray

Gupta et al., 1999

Tipo de polimorfismo

Alta resolucion:

Al nivel de par de bases

Baja resolucion:

Al nivel de fragmentos de restriccion o fragmentos amplificadosRFLP RFLP RAPDRAPD AFLP AFLP SCARSCARCAPSCAPSSSR SSR i-SSR i-SSR

+ Enzimas de restricción = digestión

Electroforesis en geles de agarosa

DNA genómico

Southern Blot

Esponja

Gel

Membrana

Papel toalla

Membrana con DNA transferido

Hibridación con sonda

Perfil de polimorfismo obtenido

RFLP

Esta técnica se vale de la capacidad que tienen las enzimas de restricción para poder reconocer secuencias especificas a lo largo del genoma, de modo que una mutación puntual dentro del sitio de restricción resultará en la pérdida o ganancia de una secuencia de reconocimiento, dando origen a un fragmento de restricción de diferente longitud a la del original.

Las mutaciones causadas por una inserción, deleción o inversiones en el DNA también llevan a variación en la longitud de los fragmentos de restricción.

Los fragmentos del genoma generados por las enzimas de restricción son separados en un gel de agarosa para luego ser transferidos a un soporte sólido que puede ser una membrana de nylon o nitrocelulosa.

La transferencia de los fragmentos de DNA desde la matriz de agarosa hasta la membrana se realiza por capilaridad.

Una vez que se encuentran en el soporte sólido, el DNA digerido y separado, puede ser hibridizado con una sonda (DNA de una sola hebra) que debe estar marcada para su fácil detección.

La sonda se hibridará en el lugar donde encuentre la zona complementaria a su secuencia. Para hacer visible el lugar donde se ha hibridado la sonda, ésta debe tener algún tipo de señal (marcaje)

RFLP

Obtención de marcadores RFLP.

Random Amplified Polymorphic DNA

RAPDRAPD

Amplificación de ADN anónimo con cebadores de secuencia arbitraria

Temperatura de Hibridizacion: 36-42C

RAPD: iniciaodores unicos , cortos y aleaoritos

Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria

Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud

RAPD:AMPLIFICA MULTIPLES REGIONES (MULTILOCI)

Correspondencia entre fragmentos amplificados y bandas en un gel

_

+

Los RAPDs son marcadores dominantesLos RAPDs son marcadores dominantes

1

3

2

1 2 3AAAA

aaAA

aaaa

AAAA AaAa aaaa

L2

Individuo 1 Individuo 2 Individuo 3

L6 L2

L1L5

L3

L4

L6

L1

L5 L4

L6 L2

L1L4

Electroforesis

L1

L2

L3

L4

L5

L6

1 2 3

Perfil de amplificación

Reacción

PCR

L2

Individuo 1 Individuo 2 Individuo 3

L6 L2

L1L5

L3

L4

L6

L1

L5 L4

L6 L2

L1L4

Electroforesis

L1

L2

L3

L4

L5

L6

1 2 3

Perfil de amplificación

Reacción

PCR

Desventajas

Problemas de reproducibilidad Presencia de homoplasia en las bandas Nivel de información limitada debido a su

naturaleza dominante (no se puede diferenciar un heterocigoto de un homocigoto, el locus se reduce a un solo alelo)

Ventajas Requiere baja cantidad de DNA Facil de obtener Aplicabilidad a cualquier genoma Bajo costo

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Reaccion PCR

Primers deben encontrar secuencias complementarias entre 200 – 2500 pb

Tincion (bromuro de etidium)

RAPDReaccion PCR

Electroforesis

Tinción y visualización de los fragmentos de amplificación

Polimorfismo con la técnica RAPD

Amplified Fragment Amplified Fragment Length PolymorphismLength Polymorphism

AFLPsAFLPs

ADN Genómico

Digestión

Ligación

PCR1:Preamplificación

Pcr2:Amplificación selectiva

Electroforesis

AutoradiografíaTinción Nitrato de plata

Mse adapterEco adapter

Mse primer

N

NEco primer

Eco RI Mse I

Mse primerNNN

NNNEco primer

MetodologíaMetodología de obtención de Marcadores AFLPde obtención de Marcadores AFLP

GAATTC TTAA

CTTAAG AATT

Principios de la técnica AFLP

1. Digestión del ADN Genómico

Eco RI Mse I

AATTC T

G AAT

Liberación de fragmentos con terminales Eco RI y Mse I

TTAA TA

Adaptador Eco RI Adaptador Mse I

2. Ligación con adaptadores de secuencia conocida

AATTCN NTTA TTAAGN NAAT

Adaptador EcoRI: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5’

Adaptador Msel: 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’

AATTCN NTTA TTAAGN NAAT

3. Amplificación preselectiva5 T

G 5

AATTCTNN NNCTTA TTAAGANN NNGAAT

AATTCTNN NNCTTA TTAAGANN NNGAAT

5’ TTG

AGG 5’

AATTCTTG TCCTTA TTAAGAAC AGGAAT

4. Amplificación selectiva

Electroforesis en geles de poliacrylamida

Primer EcoRI+1(E+1): 5’-GACTGCGTACCAATTCN Primer Msel+1 (M+1): 5’-GATGAGTCCTGAGTAAN’

Obtención de marcadores AFLP

Polimorfismo en Arracacha, según la combianción de los iniciadres E-AAC/M-CTT.

Desventajas

Presencia de homoplasia en las bandas Nivel de información limitada debido a su

naturaleza dominante

Ventajas Reproducibles Elevado número de bandas obtenidas por gel No se necesita información previa para su

desarrollo (sondas o iniciadores específicos)

Raul Blas

Simple Sequence RepeatSimple Sequence Repeat

SSRSSR

Sinónimos

MicrosatélitesSTR - Short Tandem Repeat STMS - Sequence Tagged Microsatelite SiteSSLP - Simple Sequence Length Polymorphism

Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivas Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivas de secuencia simple.de secuencia simple.

Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 pares Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 pares de bases y su grado de repetición es relativamente bajo.de bases y su grado de repetición es relativamente bajo.

Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para su Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para su amplificaciónamplificación

¿Que son microsatélites?¿Que son microsatélites?

TTTTTTTTTT = T10

AGAGAGAGAGAG = AG6

CATCATCATCATCATCAT = CAT6

TAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGT = TAGT6

MononucleotidoDinuclotidoTrinucleotidoTetranucleotido

ADNgenómico

......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT......

......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA......

Microsatélite

(TC)14

http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm

OBTENCION DE MICROSATELITESOBTENCION DE MICROSATELITES

Tipos de SSR

Perfectos: (CA)n

Imperfectos: (CA)n – CCA – (CA)m

Compuestas: (CA)n (TG)m

Compuesta interrumpido: (CA)n –TG-(TG)m

Compleja: (CA)n –TG-(TG)m (TA)r

n, m y r = número de repeticiones del motivo

GTn los mas extendidos en genoma de mamíferos

Atn la mas extendida en genoma de vegetales

GAn mas abundante en cebada y arroz

I

II

III

PCR en P1, 3 y 6

I

II

III

PCR en P2, 2 y 5

IBT

Gene Amp

F1 F2 F31

47

5 680 ce

9enter

stop 2 3F4 F5

III

III

PCR en 1 y 4

100 pb

1000 pb

M P1 P

2 1 2 3 4 5 6

Marcadores microsatéliteEtapas de la técnica SSR incluyen:

Huamani, 2008

1. Reacción PCR, con dos iniciadores especificos para un locus SSR

2. Electroforesis en geles Poliacrilamida o agarosa (casos muy limitados)

ATATATATATATATATATATATAT

ATATATATATATATATAT

AT12

AT9

DNA individuo 1

DNA individuo 2

Región Conservada

Iniciador 2

Región conservada

Iniciador 1

ATATATATATATATATATATATAT

ATATATATATATATATAT

AT12

AT9

DNA individuo 1

DNA individuo 2

Región Conservada

Iniciador 2

Región conservada

Iniciador 1

Los SSR son marcadores Los SSR son marcadores codominantescodominantes

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5

Extrategias de desarrollo de iniciadores SSR

1. Clonamiento, secuenciamiento y diseño de iniciadores

2. Identificación de primers microsatélite a partir de marcadores ISSR

3. Búsqueda de marcadores SSR en la base de datos del Genbank.

4. Transferibilidad de otras especies afines (empleo de iniciadores disponibles)

Poseen alta variabilidad en sus loci, apropiado Poseen alta variabilidad en sus loci, apropiado para los análisis de diversidad genética.para los análisis de diversidad genética.

Se encuentran distribuidos por todo el genoma Se encuentran distribuidos por todo el genoma permitiendo hacer un buen muestreo genético permitiendo hacer un buen muestreo genético del material en estudio. del material en estudio.

Ventajas

DesventajasSu caractierizacion es especifica por especieSu caractierizacion es especifica por especie

Su identificacion(descubrimiento) y hacerlo Su identificacion(descubrimiento) y hacerlo usable es costoso. Requiere secuenciamiento de usable es costoso. Requiere secuenciamiento de librerias de DNAlibrerias de DNA

Aplicacion de marcadores molecularesAnalisis de la diversidad genetica

Herencia y mapeo

Genes candidatos

Herramienta de seleccion: Seleccion asisitida por marcadores moleculares (MAS)

Raul Blas, 2010

Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad

1. Gestion de recursos

2. Cambios en los genotipos

3. Selección (selección estabilizadora),

4. Multiplicación del genotipo mejorado

Poblaciones naturales, variedades nativas, …

Idiotipo

Contexto:AgronomicoIndustrialAlimenticiosocial

Objetivos

BiologiaTecnologiaTiempoMaterialesPresupuesto

Ganancia genética

Métodos de mejoramiento

Mejoramiento genetico de plantas

Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad

1. Gestion de recursos genéticos

2. Cambios en los genotipos

3. Selección (selección estabilizadora),

4. Multiplicación del genotipo mejorado

Es la selección indirecta por la presencia o ausencia de un fenotipo o componente fenotípico deseado, basado en la secuencia o patrones de banda de los marcadores moleculares ubicadas dentro o cerca de genes que controlan el fenotipo.

La secuencia polimorfico o patron de banda del marcador molecular es indicativo de la presencia o ausencia de un gen específico o segmento cromosomal que es conocido y que lleva un alelo deseado.

Selección asistida por marcadores moleculares – Molecular assisted selection (MAS)

Capel et al. (2000)

Es la posibilidad de disponer de marcadores ligadas a los genes implicados en la variacion de los caracteres seleccionados.

MAS tiene los siguientes objetivos:

•Dirigir las recombinaciones para acumular en un mismo genotipo los genes o segmentos cromosomicos favorables

•Facilitar la selección (selección eficaz)

… Molecular assisted selection (MAS)

Aspectos a considerar en MAS 

•Distancia genética (Mapas de ligamiento)

Marcadores asociados con caracteres de interes (< 5cM) (Kelly, 1995)

En algunos cultivos existen mapas bien definidos y densos : Arroz, maiz, trigo, tomate, papa

•Modo de herencia (Calidad marcador)

Codominantes (capacidad de identificar los genotipos)

•Tipo de marcador

•Material genético

Generación de un mapa genético

Mapa genético: Representacion de marcadores/ genes en los cromosomas (orden + distancias)

Requisitos:– poblaciones segregantes

– Determinación de los genotipos de los marcadores

– Estimación de las frecuencias de recombinación entre todos los pares de marcadores

– Determinación de grupos asociados

– Determinación el orden por grupo de asociación

Tamaño de la población

Determinado por el numero de semillas y de marcadores disponibles, es importante establecer el numero minimo de individuos a utilizar para conocer la precision del calculo de las frecuencias de recombinacion que permitan construir un mapa fiable.

Usualmente la progenie a evaluar se cosntitule de >100 individuos a fin de reducir el error estandar

Otros autores consideran suficiente un numero de 50 individuos

Poblacion de mapeo

Los descendientes mas usados tienen como punto de partida dos parentales homocigotas, esto por cruzmiento produce f1 todos identicos y heterocigotas para todo los locus que han sido fijados alelos diferentes en los parentales

Se debe buscar parentales geneticamente bien alejadas para que el numero de locus polimorficas no sean limitantes

Tres tipos principales de poblacion de cartografia pueden ser derivados de estos cruzamientos

AA BBx

F1

BC1F1 F2 RIL DH

AB

AB, BB AA, BBAA, AB? BBAA, AB, BB

duplicacionF1xBB X

XX

XX

X

Retrocruza: BC1F1

Poblacion segregante filial 2: F2

Lineas endogamicas recombinantes: RILs

Lineas de haploides duplicados: DH

Tipos de poblaciones para mapeo

Determinación del orden

Ejemplo: Par Frecuencia de Recombinación

---- ------------- A-B 0.1 B-C 0.1

A-C 0.2 A B C +----------+----------+ <- 0.1 -> <- 0.1 -> <- 0.2 ->

No es posible otro orden!!!

Ejemplo con tres marcadores

• Tabla de conteo de recombinaciones• Marcador 1 <–> Marcador 2 = 30

• Marcador 1 <–> Marcador 3 = 15

• Marcador 2 <–> Marcador 3 = 20

– Cuáles son las posibilidades?

M1 M2 M3 M1 M3 M2 M2 M1 M3

30 20

15 30 20

15 20 30 15

Marcador 10

Marcador 314

Marcador 233

Tres marcadores

Gebhart (2004)

Determinacion de sexo en plantas

Phoenix dactylifera L

Ubicacion taxonomica:Family:Palmaceae

Sub-family: Coryphyoideae

Tribe:Phoeniceae

Genus: PhoenixEl genero Phoenix, presenta ~ 12 especies, incluida

CONVERTIR LOS MARCADORES AFLP A SCAR

Secuenciar el fragmento y elaborar iniciadores especificos

SCARSCAR““Sequence-characterized amplified regions”Sequence-characterized amplified regions”

AplicacionesAplicaciones

Búsqueda de co-dominanciaBúsqueda de co-dominancia• Selección asistidaSelección asistida• Análisis de asociaciónAnálisis de asociación

Aplicabilidad de marcadores PVY-LB para mejoramiento

Objectivos:

Identificación de clones con el gen Ry adg y Rysto para

inmunidad a PVY.

Identificación de clones con genes R dem o R blb o QTLs (que

gobiernen un alto porcentaje de la resistencia observada) para resistencia rancha (tizón).

Material vegetal

Se analizó en total 61 clones, mas 5 controles:

36 clones avanzados resistentes y/o tolerantes a TT y PVY:

población B3población LTVR hibridos somaticos

25 cultivares nativos (Huanuco) de adg, gon y phu:

14 clones resistentes a LB

11 clones susceptibles a LB

Métodos:

Se utilizaron marcadores alelo-específicos (iniciadores-SCARs, CAPs) seleccionados en CIP and Max Plant Institute:

Identificación de clones con resistencia a PVY

Se han identificado y validado 4 iniciadores:

•Adg: RYSC3

•stolon (M5, M6 y M17) 

Marker Ry-linked polymorphism

Primer name

Sequence

RYSC3 3.3.3S 5’-ATA CAC TCA TCT AAA TTT GAT GG-3’ Adg23R 5’-AGG ATA TAC GGC ATC ATT TTT CCG A-3’ M5 MseI, Tru M5-m GCT GTT CAC AAT GGG AAC ATG G M5-p CAT ACA AAC TAC TTC TAC CAC G M6 Rsa I M6Rsa TCC GAA ATG TTT GGG CTG ACA TC M6Taq AAG GGA TCC AAA AAG GTG GTT CA M17 Pst I M17-m GAC TGC TTT CTC TCC ACG TGG C M17-1 GAT CAC AGA TGT TTT ACC TTC GAT G

Primers and its sequences used in genotipes screening

Resultados

M= marcador de peso molecular (cada 100pb), la flecha indica el marcador con un peso molecular de 400bp

M M M

Tamizado para PVY

Perfil de amplificación para 14 clones (primer M5)

... Tamizado para PVY

Perfil de amplificación para 18 clones (primer M17)

Identificacion de genes para resistencia a la rancha

S. phurejaClon 618

S. circaeifoliumCIP-761030

(6b.25; 6b.39)

F1

plantulas (~300)

Analisis fenotipico Analisis molecular

invernadero campo

Analisis de datos, mapeo

AFLP SSR

selected clones

Estrategia de trabajo para mapeo genetico

x

92

•Extraccion de DNA

•PCR (amplificacion del marcador de interes)

•Electroforesis

•Visualizacion de DNA

•Evaluacion de polimorfismo (lectura de geles)

•Descarte de individuos sin alelo de interes

•Plantas seleccionadas

Procedimiento para la aplicacion de MM en la seleccion: MAS

Identificación de progenies hibridas

MM como herramienta en Mejoramiento

Confiabilidad y repetibilidad

Marcadores con estrecho ligamiento a genes de caracteristicas importantes

Muy importante para caracteristicas dificiles (aquellas que no pueden ser facil o confiablemente medidos usando metodologias tradicionales (e.g. resistencia a nematodes…)

Otros pueden no ser visibles o solo detectados en plantas maduras

Otros son muy dificiles o costosas para el tamizado

La posibilidad de manejar poblaciones de mejoramiento de gran tamaño (en espacio reducido)

Limitaciones de la Tecnica MAS

Mapa genetico denso para el cultivo

Marcador ligado al gen (<5 cM)

Equipamiento

Tecnicos calificados para lab.

Producción de semillas y uso de marcadores moleculares

Caracterización de cultivares

Pureza genética de cultivares

Dos cultivares de soya

Identificación de variedades

Pureza genética

Conclusion:

Marcadores moleculares pueden tener numerosas aplicaciones en los diferentes fases de la seleccion:

Optimizacion de la conservacion de recursos geneticos

Seleccion de los parentales

Identificacion de alelos interesantes

Construccion de genotipos acumulando alelos interesantes

Finalmente, los MM dispone al mejorador para gestionar y valorizar la variabilidad genética

La selección asistida por marcadores y la selección fenotípica tradicional no son estrategias excluyentes y los programas de mejoramiento genético de mayor eficiencia se logran mediante una combinación de ambas estrategias.

Consideración