Soixante ans de recherche sur la lipolyse enzymatiquedes corps gras à Marseille

Frédéric CARRIÈRE

Laboratoire d’enzymologie interfacialeet de physiologie de la lipolyse, CNRS UPR 9025,31 chemin Joseph Aiguier,13402 Marseille cedex 20, France<carriere@ibsm.cnrs-mrs.fr>

Abstract: Lipolytic enzymes have been associated with the city of Marseille ever since the 1940s. Atthat time, the biochemists established tight links with the Marseille School of Chemistry for investiga-ting fat-splitting by enzymes, particularly the hydrolysis of triglycerides by lipases. Several importantmilestones on lipase research are associated with this long standing collaboration, from the molecularaspects of lipases to their physiological roles and their various medical and industrial applications. Thisstory will be reviewed here through several highlights on pancreatic and gastric lipase research.Pancreatic lipase, which was for long the only lipase available for biochemical studies, still remains anattractive enzyme with the development of lipase inhibitors for obesity treatment. It is also used forenzyme replacement therapy in case of exocrine pancreatic insufficiency. Novel pancreatic lipase-related proteins have been identified and their physiological roles now extend from fat digestion tolipoprotein metabolism, lipid signaling and innate immunity.

Key words: enzymology, enzymatic lipolysis, heterogeneous enzyme catalysis, lipase, pancreas, triglyceride

La médaille Chevreul récompense chaqueannée depuis 1963 une personnalité françaiseet une personnalité étrangère ayant contribuéde façon significative au développement desconnaissances ou des réalisations industriellesdans le domaine des corps gras. Elle rappelleque c’est en France, grâce aux travaux deMichel Eugène Chevreul (1786-1889), quesont nées la chimie des corps gras et la lipochi-mie. Je suis très heureux de la recevoir cetteannée pour mes travaux sur les lipases, cesenzymes qui permettent de digérer les corpsgras. Je voudrais à cette occasion rappeler queje suis le cinquième chimiste formé à Marseille àrecevoir cette distinction. Pierre Desnuelle(1965), Maurice Naudet (1971), BernardEntressangles (1983) et Jean Graille (1997)m’ont précédé. Nous avons tous en commund’avoir travaillé sur les lipases à un moment denotre carrière. Comme la fabrication du savon,l’étude des lipases est ainsi une longue traditionmarseillaise initiée il y a plus de 60 ans et recon-nue au niveau international.Lorsque le Professeur Pierre Desnuelle (figure 1)arriva à Marseille en 1943 pour y enseigner labiochimie et prendre la direction du Labora-toire national des matières grasses (futurITERG, localisé aujourd’hui à Bordeaux),l’industrie des huiles et corps gras était encoreimportante dans la région marseillaise et laChambre de commerce et d’industrie l’incita àdévelopper une recherche à l’interface entre lachimie des lipides et la biologie. Ingénieur chi-miste de formation, élève du Prix Nobel VictorGrignard à Lyon, Pierre Desnuelle comprit rapi-dement qu’une bonne connaissance de la

physico-chimie était essentielle pour appréhen-der le mode d’action des enzymes agissant surdes substrats insolubles tels que les huiles. Pourrecruter un grand nombre de ses futurs élèves,il se tourna donc naturellement vers l’Ecolesupérieure de Chimie de Marseille (figure 2)dirigée par le Professeur Margaillan et qui setrouvait à quelques pas de son laboratoire sur lesite de la faculté des sciences de St Charles. Celien avec les élèves de l’Ecole de Chimie (deve-nue aujourd’hui une composante de l’EcoleCentrale de Marseille) s’est perpétué depuiscette époque et plusieurs d’entre eux ontcontribué aux très nombreuses publications surles lipases issues de la cité phocéenne : PierreSavary (Promotion 1939), Maurice Naudet(Promotion 1940), Mireille Rovery (Promotion1945), Louis Sarda (Promotion 1954), OdetteGuy-Crotte (Promotion 1957), Gilbert Benzo-nana (Promotion 1960), Suzanne Maroux (Pro-motion 1960), Jean Graille (Promotion 1965),Jacques Baratti (Promotion 1966), Gérard Pié-roni (Promotion 1966), Robert Verger (Promo-tion 1966), Gérard Buono (Promotion 1968),Christian Triantaphylidès (Promotion 1969),Georges Langrand (Promotion 1981), FrédéricCarrière (Promotion 1986), Frédéric Fotiadu(Promotion 1987), Franck Marguet (Promotion1988), Jean-François Cavalier (Promotion1993), Sylvie Fernandez (Promotion 2005).Cette histoire commune est jalonnée d’étapesimportantes dans la description du moded’action des lipases, depuis leurs aspects molé-culaires jusqu’à leur rôle physiologique et àleurs nombreuses applications médicales etindustrielles.

Les travaux de pionnierde Pierre Desnuelle surla lipase pancréatique

Pierre Desnuelle s’intéresse aux aspects molé-culaires de la digestion, poursuivant ainsi letravail de Claude Bernard sur l’action des sucsdigestifs, notamment l’action du suc pancréa-tique sur les matières grasses et les protéines. Lepancréas est alors la principale source d’enzy-mes et l’étude des enzymes pancréatiques seraau centre de ses projets de recherche pendant40 ans. Contrairement à Jacques Monod, il neconsidère pas les enzymes de la digestioncomme plus « naïfs » que ceux impliqués dansles réactions intracellulaires mais comme desmodèles permettant de comprendre les pro-cessus enzymatiques dans leur ensemble. Il estcontemporain de grands noms de la biochimiecomme Hans Neurath, qui s’intéresse égale-ment aux protéases pancréatiques, et ChristianAnfinsen, William H. Stein et Standford Moorequi obtiendront tous trois le prix Nobel deChimie en 1972 pour leurs travaux sur la ribo-nucléase pancréatique. Pierre Desnuelle seraplus particulièrement reconnu pour ses travauxsur la lipase pancréatique et l’adaptation de lasécrétion des enzymes pancréatiques en fonc-tion du régime alimentaire.

Les lipases utilisées commeoutils pour étudierla structure des corps grasLa première période d’étude des lipases à Mar-seille sera consacrée à leur utilisation pour élu-

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doi:10.1684/ocl.2008.0189

Article disponible sur le site http://www.ocl-journal.org ou http://dx.doi.org/10.1051/ocl.2008.0189

cider, et par la suite modifier, la structure desprincipaux constituants des corps gras, les tri-glycérides. Maurice Naudet fut le premier élèvede Pierre Desnuelle à passer une thèse de doc-torat ès-Sciences physiques en 1947 sur lamigration des chaînes acyles entre triglycéri-des. À cette époque, on savait que les triglycé-rides étaient des triesters du glycérol et d’acidesgras mais on ne savait pas encore s’il existaitune distribution particulière des acides gras surle glycérol. Desnuelle et Naudet pensaient queles acides gras composants les triglycéridesn’étaient pas distribués de façon aléatoire sur lesquelette à trois carbones du glycérol. Si celaétait le cas, on pouvait espérer modifier ladistribution de ces acides gras et les propriétésphysico-chimiques des triglycérides par inter-estérification chimique ou enzymatique [1-3].

Suite à la découverte par Bengt Borgström(Lund, Suède) et F.H. Mattson (USA) de laspécificité de position de la lipase pancréatiquepour les fonctions ester externes du glycérol,Pierre Desnuelle et ses collaborateurs, PierreSavary et Bernard Entressangles, seront les pre-miers avec F.H. Mattson [4] à utiliser cettespécificité de la lipase pancréatique pour étu-dier la structure des triglycérides naturels [5-8].Ils montreront notamment que, dans les corpsgras d’origine végétale, les acides gras insatu-rés sont majoritaires en position interne sn-2alors que les acides gras saturés sont majoritai-rement retrouvés sur les positions externes sn-1et sn-3. Dès cette époque, Pierre Desnuelle etses collaborateurs s’intéresseront à d’autressources de lipases possédant diverses spécifici-tés [9-13]. Ils jetteront ainsi les bases des très

nombreux travaux réalisés à ce jour sur la spé-cificité de substrat des lipases et leurs diversesapplications dans le domaine de la biotransfor-mation des huiles et corps gras par transestéri-fication enzymatique.

Naissance de l’enzymologieen milieu hétérogène

L’enzymologie dite « interfaciale » estaujourd’hui un champ de recherche en pleinessor car de nombreux enzymes sont impliquésdans des réactions se déroulant aux interfaces,que ce soit dans le monde vivant (membranescellulaires, métabolisme des lipoprotéines) oudans des applications industrielles (lessives etlipolyse des taches de graisses sur les tissus,dégradation de la cellulose). Cette enzymolo-gie particulière est cependant largementabsente des traités d’enzymologie généralealors que le modèle classique de Michaelis-Menten-Henri n’est plus applicable en milieuhétérogène. Lorsqu’on étudie des enzymes,qui comme les lipases sont parfaitement solu-bles dans l’eau mais agissent à l’interface huile-eau, il faut tenir compte du partage del’enzyme entre la phase aqueuse et la surfacedes gouttelettes lipidiques. Il faut égalementtenir compte de tous les phénomènes pouvantêtre liées à cette transition et à la physico-chimie de l’interface : changements conforma-tionnels pouvant aller jusqu’à la dénaturationdes protéines lors de leur adsorption, effet de latension superficielle et organisation des lipidesà l’interface, accumulation à l’interface des pro-duits de la réaction ou d’autres moléculesamphiphiles pouvant agir comme inhibiteursou accélérateurs des réactions enzymatiques,etc. Sous l’impulsion de Pierre Desnuelle, lesbiochimistes marseillais ont très tôt considéréces paramètres et jeté les bases de l’enzymolo-gie en milieu hétérogène.Dans la lignée des travaux d’Holwerda et al.[14] et de Schonheyder et Volqvartz [15-17],Sarda (figure 3) et Desnuelle ont tout d’abordmontré en 1958 que la lipase pancréatique deporc possédait la particularité de « s’activer àl’interface » huile-eau [18]. Alors que l’enzymeest faiblement active sur un substrat soluble(triglycérides à courtes chaînes à faible concen-tration), elle multiplie son activité de 2 à 3ordres de grandeur lorsque le substrat s’agrègeet forme une émulsion au-delà de sa limite desolubilité. Les lipases (triacylglycerol hydrola-ses, EC 3.1.1.3) ont alors été définies commeune famille particulière d’estérases, actives surun substrat insoluble, les triglycérides, et pos-sédant la propriété cinétique d’activation inter-faciale [18]. Cette définition a depuis été revi-sitée, toutes les lipases ne possédant pasforcément cette propriété [19]. Parmi les diver-ses hypothèses formulées pour tenter d’expli-

Figure 1. Pierre Desnuelle.

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quer l’activation interfaciale, Desnuelle et al.ont proposé qu’un changement conformation-nel de l’enzyme se produise au contact del’interface huile-eau [20]. Nous verrons par lasuite que les travaux ultérieurs des cristallogra-phes ont soutenus cette hypothèse sansqu’aucun lien formel entre cette propriété ciné-tique et des changements conformationnelsobservés dans le cristal ne soit établi à ce jour.Quoi qu’il en soit le phénomène d’activationinterfaciale des lipases a été un élément extrê-mement stimulant pour la recherche et lestravaux sur les lipases qui ont suivis.

En étudiant la lipolyse d’émulsions de triglycé-rides de tailles variables, Benzonana et Des-nuelle montreront en 1965 que la vitesse de laréaction d’hydrolyse des triglycérides par lalipase pancréatique dépend, non pas de laquantité (masse) de substrat, mais de la surfacede l’émulsion disponible, et donc du degréd’émulsification du substrat [21]. Ce fut uneobservation essentielle pour la définition desparamètres importants en enzymologie interfa-ciale, tels que la concentration superficielle ensubstrat et la quantité de surface disponible parunité de volume, alors que la concentrationvolumique en substrat et les paramètres cinéti-ques de même grandeur comme la constantede Michaelis (Km) n’ont plus de sens lorsque lesubstrat est insoluble. Cette observation révélaégalement toute la difficulté à étudier de telssystèmes, une concentration superficielle étantbeaucoup plus difficile à mesurer et à contrôlerque la concentration volumique d’un substratsoluble.

C’est en cherchant à maîtriser ce paramètreque Robert Verger et Gérard De Haas (figure 3)développeront l’utilisation des films monomo-léculaires pour étudier les enzymes lipolytiques[22, 23] et élaboreront un premier modèlecinétique dans les années 1970 [24]. L’étale-ment à l’interface eau-air de films lipidiquespermit d’étudier la pénétration dans le film delipases et de phospholipases injectées dans lasous-phase aqueuse en mesurant l’augmenta-tion de la pression de surface, mais égalementla lipolyse intervenant à l’interface eau-air. Pourcela, ils inventèrent en particulier la cuve« d’ordre zéro » et le « barostat » permettantde réaliser des expériences de lipolyse à pres-sion de surface et à concentration superficielleen substrat constantes (figure 4), la pression desurface étant utilisée comme paramètre « aminima » pour contrôler la « qualité » del’interface. Le modèle cinétique Verger-DeHaas est la plus simple adaptation du modèlede Michaelis-Menten-Henri à l’hydrolyse inter-faciale de lipides à chaînes acyles moyennes,insolubles dans l’eau mais dont les produitssont solubles. La première étape décrit la fixa-tion à l’interface lipide-eau d’une enzyme (E)soluble dans l’eau, via un mécanisme

1

2

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Figure 2. La promotion 1966 de l’Ecole Supérieure de Chimie de Marseille. On peut reconnaître sur cette phototrois élèves qui s’illustreront dans le domaine des lipases : (1) Robert Verger, (2) Gérard Piéroni, (3) Jacques Baratti.

Figure 3. Les « lipasistes » marseillais réunis à Cassis en 1998 pour fêter les 40 ans de l’article sur l’activationinterfaciale de la lipase pancréatique [18]. Photo du haut : Gérard De Haas (à gauche), Robert Verger (au centre) etLouis Sarda (à droite) ; Photo du bas : de gauche à droite, Frédéric Carrière, Herman van Tilbeurgh, Mireille Rovery,Louis Sarda, Gérard De Haas, Alain De Caro, Liliane Dupuis, Catherine Wicker, Josiane De Caro, Claude Rivière,Margarita Ivanova, Francine Ferrato, Robert Verger.

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d’adsorption-désorption réversible (figure 5).Cette étape conduit l’enzyme à un état énergé-tique plus favorable (E*) et elle est suivie parune réaction de Michaelis-Menten dans unespace à deux dimensions. L’enzyme présent àl’interface interagit avec une molécule de subs-trat (S) pour former un complexe enzyme-substrat interfacial (E.S*), lequel se décomposeensuite pour libérer des produits (P*) qui vontse solubiliser dans la phase aqueuse. L’utilisa-tion de glycérides à chaînes moyennes commesubstrats (trioctanoïne, dicaprine, dilauroylphosphatidylcholine) a permis d’associer latechnique des films monomoléculaires et cemodèle cinétique dans des conditions aussisimples que possibles, alors que l’utilisation delipides naturels aux chaînes acyles longuesaurait conduit à une accumulation de produitsà l’interface et à l’absence de contrôle de cetteinterface. En utilisant cette approche expéri-mentale simple, de nombreuses études cinéti-ques des phospholipases A2 et des lipases dediverses origines ont été réalisées. Ces expé-riences ont notamment montré que les enzy-mes lipolytiques pouvaient être utilisés comme

« sondes » pour étudier la structure des mem-branes et déterminer quels paramètresphysico-chimiques pouvaient les rendre sus-ceptibles à l’action de ces enzymes [25]. Uneapplication fut par exemple la mise évidenced’une corrélation entre le pouvoir hémolytique

de certaines phospholipases A2 et leur capacitéà pénétrer dans un film de phospholipide à dehautes pressions de surface mimant celles desmembranes biologiques. Cette technique per-mit également de démontrer sans ambiguïté lerôle de la colipase dans l’ancrage de la lipasepancréatique aux interfaces lorsque la pressionde surface augmente et que la pénétration del’enzyme seul devient difficile [26]. La techni-que des films monomoléculaires et le modèlecinétique de base ont été par la suite régulière-ment adaptés pour pouvoir étudier l’inhibitiondes enzymes lipolytiques [27] ou utiliser deslipides à longues chaînes grâce à des accep-teurs de produits de lipolyse comme lab-cyclodextrine [28].

Purification de la lipasepancréatique de porcet de la colipaseBien que diverse préparations de lipase pan-créatique de porc aient été disponibles depuislongtemps, il fallut attendre les travaux dethèse de Robert Verger vers la fin des années1960 pour obtenir une préparation de lipasehautement purifiée. La principale difficulté étaitalors de séparer la lipase des lipides présentsdans les extraits pancréatiques, le pancréasétant un organe naturellement très gras. Pen-dant plusieurs années fut obtenue une lipasedite « rapide », nommée ainsi car elle étaitéluée très rapidement des colonnes de filtrationsur gel avec une masse moléculaire estiméetrès largement supérieure à sa masse réelle(50 kDa). Il s’agissait en fait d’agrégats lipidi-ques formés de façon artefactuelle lors dubroyage du tissu pancréatique et contenant lalipase pancréatique, son cofacteur la colipase,la phospholipase A2 pancréatique et la choles-térol estérase, toutes ces protéines ayant uneaffinité pour les lipides [29]. Robert Vergerintroduisit une étape de délipidation précoce

Tampon

Film mono moléculaireE*

E

Electro-Microbalance

(Pression de surface)

Cuve enTeflon®

Compartimentréactionnel Compartiment

réservoir

BarrièremobileCanaux de

connection

Lame deWilhelmyπ

Figure 4. Cuve d’ordre zéro et Barostat. L’injection d’une solution chloroformique de lipides à la surface de cettecuve de Langmuir à deux compartiments permet de former un film monomoléculaire de lipides s’étalant sur toute lasurface de la cuve grâce des canaux de surfaces. La diffusion de composés présents dans la phase aqueuse ducompartiment réactionnel vers le compartiment réservoir est par contre négligeable. Lorsqu’on injecte une lipase dansle compartiment réactionnel, elle peut se partager entre la phase aqueuse et le film monomoléculaire et hydrolyser lesmolécules de lipides substrats (par exemple la dicaprine) présent dans le film. Les produits de la réaction, monocaprineet acide caprique, étant solubles dans l’eau, ils sont évacués de l’interface, ce qui induit une diminution de la pressionde surface. Cette dernière est mesurée grâce à une lame de platine et une microbalance couplée à un système derégulation. Une barrière mobile en Teflon® présente à la surface de la cuve est alors actionnée pour comprimer le filmmonomoléculaire et restaurer la pression de surface de consigne. On peut ainsi travailler à pression de surfaceconstante (ou mode « barostat »). Il résulte de ce dispositif expérimental que la concentration superficielle en substratdans le compartiment réactionnel demeure constante pendant la réaction enzymatique, d’où le nom de cuve« d’ordre zéro ». La vitesse d’hydrolyse du substrat est, elle, déterminée par la mesure en fonction du temps de lasurface parcourue par la barrière mobile divisée par l’aire moléculaire connue des molécules de substrat.

E* + S

E

E* + P

Km* kcat*

E*.S

ComplexeEnzyme–Substrat

InterfacialEnzyme + Substrat Enzyme + Produit

Phase 1 (eau)

Phase 2 (lipide)

kp kd Adsorption

Figure 5. Modèle cinétique interfacial de Verger-De Haas.

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du tissu pancréatique utilisant des solvantsorganiques. La poudre délipidée ainsi obtenuefut ensuite utilisée pour purifier la lipase parchromatographie [30]. Un procédé analoguede délipidation est utilisé aujourd’hui pour pro-duire les extraits pancréatiques de porc desti-nés au traitement de l’insuffisance pancréati-que. L’interaction lipase-lipides endogènes lorsde la production et de la purification des enzy-mes lipolytiques est en fait un problèmed’ordre général que l’on retrouve par exempleaujourd’hui lors de la production de lipasesmicrobiennes [31, 32]. Ces interactions peu-vent modifier de façon non négligeable le com-portement cinétique des enzymes étudiés etconduire à des artefacts. On peut cependantles utiliser volontairement (Molecular Bio-Imprinting) pour induire des changementsconformationnels et moduler l’activité enzy-matique des lipases [33, 34].L’obtention d’une lipase pancréatique de plusgrande pureté eut pour conséquence indirectel’identification de son cofacteur spécifique, lacolipase, une petite proteine de 10 kDa nepossédant pas d’activité enzymatique intrinsè-que et sécrétée par le pancréas exocrinecomme la lipase. Même si l’existence d’unecolipase fut proposée dès 1910 [35], c’est en1971 que cette protéine sera purifiée simulta-nément à Marseille dans le laboratoire de PierreDesnuelle [36] et à Lund dans celui du Profes-seur Bengt Borgström [37]. En présence de selsbiliaires, l’activité catalytique de la lipase pan-créatique est très fortement réduite car elle nepeut plus s’adsorber à l’interface huile-eau[38]. La colipase est alors requise pour« ancrer » le complexe lipase-colipase à l’inter-face huile-eau et restaurer son activité. C’estainsi que fonctionne la lipase pancréatique invivo. Ce système très spécifique est pourtantpassé inaperçu pendant plusieurs années car lalipase pancréatique obtenue sous forme delipase « rapide » était soit contaminée par de lacolipase, soit étudiée dans des conditions nenécessitant pas ce cofacteur.

Première séquenceen acides aminés d’une lipase

Après l’obtention des premières séquences enacides aminés de la phospholipase A2 pancréa-tique [39] et de la colipase de porc [40], l’écolemarseillaise s’illustrera en 1981 par l’obtentionde la première structure primaire d’une lipase,celle de la lipase pancréatique de porc [41].Cette séquence en acides aminés sera obtenuepar l’équipe de Mireille Rovery (figure 3) aprèsplusieurs années d’un travail de bénédictinpour produire par protéolyse limitée et séquen-cer des peptides issus de la lipase pancréatique.L’obtention d’une séquence de 449 acides ami-nés constituait un exploit avant que les outils

de la biologie moléculaire permettant d’obte-nir la séquence d’une protéine à partir de cellede son gène soient disponibles puis largementrépandus à partir des années 1980.

Le projet européen BRIDGE-Tlipase et les premièresstructures 3D du complexelipase pancréatique-colipaseL’année 1990 fut un tournant dans la recher-che sur les lipases avec l’obtention des deuxpremières structures cristallographiques, cellesde la lipase pancréatique humaine [42] et de lalipase fongique de Rhizomucor miehei [43]. Cesrésultats furent publiés simultanément dans larevue Nature par deux laboratoires industriels.Chez Hoffmann-La Roche à Bâle, Fritz Winklers’intéressait à la structure de la lipase pancréa-tique en relation avec le développement del’inhibiteur de lipase Orlistat® pour le traite-ment de l’obésité. Chez Novo Nordisk auDanemark, l’équipe de Lars Thim s’intéressait àla lipase de Rhizomucor miehei (Lipozyme™)pour diverses applications industrielles et sastructure fut obtenue en collaboration avec lelaboratoire de cristallographie de Guy Dodsonà l’université de York. Ces résultats illustrèrentl’intérêt croissant de l’industrie pour les lipaseset leurs applications à partir de la fin des années1980. Le premier producteur mondial d’enzy-mes industrielles, Novo Nordisk, introduisit enparticulier la première lipase recombinante(Lipolase®) sur le marché des détergents en

1988. Au même moment fut lancé le projeteuropéen BRIDGE-T lipase (1990-1994) dont lebut était l’obtention d’une quinzaine de struc-tures de lipases d’intérêt industriel pour mieuxcomprendre le mode d’action de ces enzymes.Ce projet réunissant 25 laboratoires académi-ques et industriels (Novo Nordisk, Gist-Brocades, Unilever et Plant Genetic System)visait également à stimuler un domaine d’acti-vité dans lequel l’Europe était leader avec envi-ron 80 % de la production mondiale d’enzy-mes industriels. La coordination du projetBRIDGE-T Lipase fut confiée à Robert Verger quijoua un rôle essentiel dans sa préparation grâceaux collaborations qu’il avait nouées avec plu-sieurs laboratoires européens, en particuliercelui du Professeur Gérard De Haas à Utrecht.Grâce à lui, notre laboratoire marseillais joua unrôle important dans le projet BRIDGE-T Lipaseavec la caractérisation cinétique des lipasesproduites dans les différents laboratoires parte-naires. Il stimula également le développementde la cristallographie à Marseille en apportantau jeune laboratoire de Christian Cambillau(figure 6) ses premiers projets couronnés desuccès : la structure de la cutinase de Fusariumsolani pisi obtenue par Chrislaine Martinez [44],une première structure du complexe lipasepancréatique humaine-colipase obtenue parHerman van Tilbeurgh [45], puis une secondestructure du même complexe obtenue en pré-sence de phospholipides et de sels biliaires,dans laquelle la lipase pancréatique fut obser-vée pour la première fois dans sa conformation

Figure 6. Christian Cambillau et son équipe en 1994.

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« ouverte » et fonctionnelle [46]. Ces troisrésultats importants furent publiés dans larevue Nature et ils marquèrent le début d’uneproduction scientifique remarquable dans ledomaine de la cristallographie. Le laboratoiremarseillais Architecture et fonction des macro-molécules biologiques est aujourd’hui l’un desmeilleurs laboratoires de cristallographie auniveau mondial.Cette association locale avec des cristallogra-phes permit aux biochimistes marseillais derester à la pointe de la recherche sur les lipasesalors que la première structure de la lipasepancréatique, obtenue par les chercheursd’Hoffmann-La Roche, leur avait échappé. Lesstructures obtenues par Herman van Tilbeurgh(figure 3) apportèrent des informations essen-tielles sur les relations structure-fonction ducomplexe lipase-colipase (figure 7).

La lipase gastrique

Dans les années 1980, l’équipe de Robert Ver-ger s’intéressa également à une autre lipaseimportante pour la digestion des lipidesalimentaires, la lipase préduodénale. L’originelinguale de cette lipase chez l’homme a étépostulée pendant de nombreuses années,principalement par le groupe de MargitHamosh (Georgetown University, USA). L’exis-tence de cette lipase linguale ne reposait en faitque sur de faibles arguments expérimentaux[47] et sur l’extrapolation de résultats obtenuschez le rat, où la lipase préduodénale, la pre-mière à avoir été purifiée et caractérisée, estexclusivement linguale [48-50]. Dans notrelaboratoire, nous n’avons jamais pu mettre enévidence, chez l’homme, une activité lipolyti-que significative dans la salive ou à partir debiopsies prélevées dans la partie postérieure dela langue, au niveau des glandes de von Ebneroù la lipase aurait dû être localisée. Lors duclonage de la lipase préduodénale humaine encollaboration avec la société CellTech (UK)[51], les essais pour détecter l’ARN messagercodant pour cette lipase au niveau lingual sesont avérés infructueux. Cet ARN messager n’apu être trouvé qu’au niveau de l’estomac. C’estHervé Moreau qui réalisa un prélèvement sys-tématique de biopsies tout au long du tractusdigestif humain à partir de dons d’organes etdémontra que l’activité lipolytique correspon-dant à la lipase préduodénale était localiséeexclusivement au niveau de la muqueuse fun-dique de l’estomac [52]. Par une étuded’immunocytolocalisation, il montra ensuiteque la lipase gastrique était présente dans lescellules principales des glandes fundiques,colocalisée avec le pepsinogène [53].Au-delà des difficultés à reconnaître l’origine dela lipase préduodénale, il était aussi considéréque celle-ci était spécifique des acides gras à

chaînes courtes et moyennes [54] et que, parconséquent, son rôle physiologique ne devaitêtre important que chez le nouveau-né pour ladigestion des triglycérides du lait [47]. YoussefGargouri et Robert Verger montrèrent définiti-vement en 1986 que la lipase gastriquehumaine pouvait hydrolyser de façon compara-ble les triglycérides à chaînes courtes et ceux àchaînes longues [55]. Ewa Rogalska montra parla suite que la spécificité apparente de la lipasegastrique pour les acides gras à chaînes courtesrésulte en fait de la stéréosélectivité de cetteenzyme pour la position sn-3 des triglycéridesoù les acides gras à chaînes courtes et moyen-

nes du lait sont localisés préférentiellement[56].Il restait à déterminer la contribution de lalipase gastrique à la lipolyse des triglycéridesalimentaires chez l’homme. J’ai obtenu en1988 un contrat CIFRE avec les LaboratoiresJouveinal pour préparer ma thèse sur ce sujetdans le laboratoire de Robert Verger. On sou-haitait déjà à cette époque utiliser la lipasegastrique, stable et active en milieu acide, pouraméliorer la digestion des graisses chez lesinsuffisants pancréatiques. Le rôle physiologi-que exact de la lipase gastrique chez le sujetsain était cependant inconnu et l’on ne dispo-

A

B

Volet fermé

Volet ouvert

Colipase

DomaineN-terminal

DomaineC-terminal

Inhibiteurdans le site actif

Figure 7. Structure 3D du complexe lipase pancréatique-colipase. A) Lipase pancréatique humaine seule avec levolet contrôlant l’accès au site actif dans sa conformation fermée. B) Complexe lipase pancréatique humaine-procolipase de porc, avec le volet dans sa conformation ouverte et un inhibiteur (C11 alkylphosphonate) lié de façoncovalente à la sérine du site actif. La colipase interagit avec le domaine C-terminal de la lipase et avec le volet danssa conformation ouverte [45, 46, 94]. Le domaine C-terminal de la HPL (structure b-sandwich) possède unehomologie structurale avec les domaines C2 (ou calcium-dependent lipid binding domain) que l’on retrouve dans ungrand nombre de protéines interagissant avec les lipides et impliquées dans la signalisation cellulaire. Ce domainepossède une boucle hydrophobe, la boucle b5’, qui joue un rôle important dans l’adsorption de la lipase à l’interfacehuile-eau [95-97].

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sait pas de données quantitatives sur les sécré-tions des lipases digestives en général et sur lesniveaux de lipolyse respectifs dans l’estomac etl’intestin grêle. Seuls des débits ou concentra-tions estimés en unités enzymatiques étaientdisponibles dans la littérature pour la lipasepancréatique mais la disparité des résultatsobtenus dans divers laboratoires était trèsgrande. Nous nous sommes alors associés àd’autres spécialistes marseillais, ceux du pan-créas issus de l’école du Professeur Henri Sarles,pour réaliser des études in vivo, tout d’abordchez le chien [57, 58], puis chez l’homme [59].Grâce au Professeur René Laugier à l’Hôpital StMarguerite à Marseille, nous avons pu associerles techniques d’investigation des fonctionsdigestives in vivo (figure 8) aux tests enzymati-ques spécifiques permettant de discriminer lesactivités des lipases gastrique et pancréatiqueet à l’analyse quantitative des produits de lipo-lyse présents dans les échantillons recueillisdans l’estomac et l’intestin grêle. Nous avonspu ainsi établir les contributions respectives deslipases gastrique et pancréatique à la lipolysegastro-intestinale d’un repas test. La lipase gas-trique permet la libération d’une chaîne acylesur les quatre qui sont libérées lors de la conver-sion de 2 molécules de triglycérides en acidesgras et 2 molécules de monoglycérides, lesproduits de lipolyse absorbés au niveau intesti-nal [59]. Grâce à ces travaux et aux nombreu-ses études cliniques qui ont suivies, noussavons que la sécrétion de la lipase pancréati-que humaine (80 à 400 mg par repas) estpondéralement bien plus importante que cellede la lipase gastrique (10 à 25 mg par repas)chez le sujet sain. La lipolyse dans l’estomacdue à la seule lipase gastrique est cependantsignificative : de 10 % avec un repas mixtesolide-liquide jusqu’à 25 % avec un repas testliquide contenant des triglycérides finementémulsifiés [60, 61].

Plus récemment, nous avons montré que lasécrétion de la lipase gastrique est augmentéede 3-4 fois chez l’insuffisant pancréatiquesévère ne sécrétant pratiquement plus de lipasepancréatique. Cette compensation n’est quepartielle mais elle permet la digestion d’environ30 % des triglycérides ingérés, ce qui démon-tre une fois de plus que la contribution de lalipase gastrique n’est pas négligeable [62].Parallèlement à ces études physiologiques, lacaractérisation structurale de la lipase gastriques’est poursuivie avec l’obtention des structures3D des lipases gastriques humaine et canine[63, 64]. Ces structures ont montré l’existenced’un volet contrôlant l’accès au site actifcomme dans la lipase pancréatique (figure 9).

Applications médicalesdes lipaseset de leurs inhibiteurs

Cette association unique entre des biochimis-tes et des médecins gastroentérologues a ététrès rapidement reconnue par l’industrie phar-maceutique (contrats avec les sociétés Roche,Solvay Pharmaceuticals, Sanofi-Aventis, NovoNordisk, Meristem Therapeutics, LaboratoiresJouveinal, Takeda, Mayoly Spindler). Elle a per-mis de développer des outils d’investigation dela lipolyse in vivo et d’appliquer ces outils àl’étude d’inhibiteurs de lipases pour le traite-ment de l’obésité et à l’enzymothérapie desubstitution pour le traitement de l’insuffisancepancréatique.

Nous avons contribué en particulier à l’étudede la tétrahydrolipstatine (THL ou Orlistat®), leseul inhibiteur de lipase aujourd’hui disponiblesur le marché (Xenical®). En inhibant les lipasesdigestives humaines (HGL et HPL), on peutdiminuer l’absorption intestinale des produitsde lipolyse des graisses alimentaires, et doncl’apport calorique. Les propriétés physico-chimiques et inhibitrices de l’Orlistat® (figure10) ont été largement étudiées à Marseille[65-72]. Nous avons également réalisé la pre-mière étude clinique permettant de décrirequantitativement l’inhibition in vivo des lipasesgastrique et pancréatique par l’Orlistat® aucours de repas tests chez des volontaires sains[73]. L’Orlistat® est aujourd’hui le premiermédicament anti-obésité avec un marchéannuel de 350 millions de dollars US.

HGL (volet fermé)DGL (vole ouvert)

212

250

Figure 9. Structures 3D superposées de la lipase gastrique humaine (HGL) et de la lipase gastrique de chien (DGL).

Echantillonsgastrique

Sonde gastriqueInjection repas testAspiration gastrique

Aspiration duodénale

Echantillons duodénaux

Ballonnet occlusif

Ballonnetocclusif

Repas test+ PEG

Anglede Treitz

Pylore

Sonde duodénale

Figure 8. Etude clinique de la lipolyse gastro-intestinale. Mise en place de sondes gastrique et duodénale par leProfesseur René Laugier et le Dr Christophe Renou à l’Hôpital de la Timone à Marseille. Dispositif expérimental pourprélever des échantillons gastriques et intestinaux au cours de la digestion d’un repas test.

202 DOSSIER

L’inhibition de la lipase hormono-sensible(HSL), qui est également une nouvelle appro-che thérapeutique potentielle, mais cette foisdans le domaine du diabète de type II noninsulino-dépendant. En diminuant l’activité dela HSL par des inhibiteurs spécifiques, il estpossible de réduire le taux d’acides gras librescirculant et agir alors indirectement sur lemétabolisme du glucose. Des inhibiteurs spéci-fiques de la famille de la HSL ont été synthétiséspar Aventis et étudiées dans notre laboratoire[74, 75].Le domaine de l’enzymothérapie de substitu-tion vise au contraire à restaurer une activitélipolytique dans le tractus digestif pour le trai-tement de l’insuffisance pancréatique, particu-

lièrement sévère chez des patients atteints depancréatite chronique et de mucoviscidose. Lespremières études réalisées chez le chien pourdéterminer la contribution de la lipase gastri-que [57, 58] nous avaient permis de purifier etde caractériser la DGL native. Il s’est avéré quecette enzyme était, de toutes les lipasesconnues, la plus active à pH acide sur les trigly-cérides naturels [76] et elle semblait donc bienadaptée à une action dans les conditions acidesdu tractus digestif des insuffisants pancréati-ques [77]. Le projet de produire une lipasegastrique de chien recombinante (rDGL) est néde ces études et la société Meristem Therapeu-tics a utilisé son savoir-faire dans le domainedes plantes transgénique pour introduire son

gène dans le maïs [78]. En 2003, la rDGLproduite dans le maïs transgénique a obtenu lestatut de médicament orphelin de l’Agenceeuropéenne du médicament (EMEA) pour letraitement de la mucoviscidose.

La recherche actuellesur les lipases à Marseille

L’étude des enzymes lipolytiques a permis ledéveloppement d’une enzymologie « interfa-ciale » qui, loin d’être une curiosité, concernede très nombreux enzymes à l’intérieur commeà l’extérieur de la cellule vivante. À Marseille,nous poursuivons le développement de techni-ques expérimentales et de modèles cinétiquespour étudier l’adsorption de ces enzymes surleur substrat insoluble, les changementsconformationnels associés à cette adsorptionou la précédant, et les facteurs influençant lastabilité et l’activité des enzymes aux interfa-ces. L’utilisation de la technique des filmsmonomoléculaires reste d’actualité mais nousutilisons également diverses techniques spec-troscopiques qui viennent compléter les don-nées structurales obtenues par diffraction desrayons X. Parmi les résultats marquants obte-nus ces dernières années, il y a la compréhen-sion de l’activité catalytique optimale de lalipase gastrique à pH acide [79], et l’utilisationdu marquage de spin dirigé, couplé à la spectros-copie de résonance paramagnétique électroni-que (RPE) pour étudier les changements confor-mationnels de la lipase pancréatique [80].La lipase gastrique est stable à pH acide et larDGL possède une activité optimale à pH 4 surles triglycérides à chaînes longues [76]. Pen-dant plusieurs années, nous avons essayé decomprendre cette activité au niveau molécu-laire, notamment par l’obtention des structures3D des lipases gastriques humaine et canine,respectivement dans leurs conformationsouverte et fermée [63, 64]. Ces structures ontmontré la présence d’une triade catalytiqueSer-His-Asp comparable à celle observée dansd’autres lipases agissant de façon optimale àpH neutre ou plus alcalin, et aucun élémentstructural n’a permis d’expliquer un éventueldéplacement du pKa apparent de l’histidinevers des valeurs inférieures à 6. Ces observa-tions structurales ont été confirmées par le faitque la rDGL pouvait agir sur une solution debutyrate de vinyle avec une activité optimale àpH 7. Dans certaines conditions (substrat etenzyme soluble), la lipase gastrique peut donchydrolyser les liaisons esters comme d’autreshydrolases à serine classiques. Le butyrate devinyle étant partiellement soluble dans l’eau,nous avons également réalisé des expériencesd’hydrolyse par la rDGL au-delà de sa limite desolubilité. Un déplacement de l’activité opti-male vers les pH acides a alors été observé,

Figure 10. Hans Lengsfeld à Marseille en 1994. Il est le découvreur de la lipstatin [98], le précurseur naturel de latétrahydrolipstatine ou Orlistat®. Les molécules insérées dans la photographie montrent comment un intermédiaireréactionnel covalent stable est formé lors de l’attaque nucléophile de la sérine catalytique de la lipase sur la fonctionb-lactone cyclique de l’Orlistat®.

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suggérant que l’interaction de la lipase avec unsubstrat insoluble était elle aussi dépendantedu pH. Des expériences réalisées avec uneémulsion de triglycérides à longues chaînes ontalors montré que la rDGL se fixe préférentielle-ment à l’interface huile-eau à pH acide. Pourétudier l’effet du pH sur l’étape d’adsorption dela rDGL à l’interface indépendamment del’hydrolyse du substrat, nous avons utilisé dessurfaces solides hydrophobes comme interfa-ces modèles et nous avons mesuré l’adsorptionde la rDGL par spectroscopie de fluorescencede surface (total internal reflection fluorescence ;TIRF) ou à l’aide d’une microbalance à quartz(QCM). Les deux approches ont montré uneadsorption réversible et pH-dépendante de larDGL en présence de sels biliaires, avec unoptimum à pH 5 (Kd = 6,5 nM). Ces résultatsont suggéré que l’activité optimale de la lipasegastrique à pH acide était seulement « appa-rente » et résultait du fait que l’étape d’adsorp-tion pH-dépendante de la lipase à l’interfacehuile-eau est l’étape limitante dans le processusglobal d’hydrolyse d’un substrat insoluble [79].Cette particularité cinétique associée à l’actiond’un enzyme soluble sur un substrat insolubledevra désormais être prise en considérationlorsqu’il s’agira d’étudier l’effet du pH surd’autres enzymes agissant aux interfaces.

La spectroscopie RPE a été utilisée pour étudierles changements conformationnels de la lipasepancréatique humaine (HPL) [80]. Les confor-mations fermées (site actif inaccessible) etouverte (site actif accessible) du volet de la HPLont été associées à l’état initial et à l’état final duprocessus d’activation de la lipase (supposé seproduire à l’interface), mais aucune relationdirecte entre ces observations structurales et lecomportement cinétique de la HPL n’a pu êtreétablie jusqu’à présent. De plus, plusieurs étu-des ont suggéré que la lipase pouvait être déjà« activée » (ouverture du volet) en solution enprésence de détergents et de colipase [81, 82].Les données structurales sur les différentesconformations du volet ayant été obtenuesavec des lipases cristallisées, il n’était en fait pasévident d’associer ces données structuralesavec des données cinétiques obtenues enphase liquide. La spectroscopie RPE nous apermis d’étudier le changement conformation-nel du volet de la HPL en solution et les contri-butions respectives des partenaires physiologi-ques de la lipase que sont la colipase et les selsbiliaires. Une sonde paramagnétique (MTSL) aété introduite au niveau du volet grâce à lamutation D249C permettant le greffage cova-lent de la sonde et de la cystéine libre. Deuxcomposants distincts du spectre RPE de lasonde ont pu être identifiés et attribués sansambiguïté aux conformations fermée (mouve-ment rapide du radical) et ouverte (mouve-ment lent du radical) du volet de la HPL,

notamment grâce à des expériences réaliséesavec l’inhibiteur E600. Nous avons montré quela conformation ouverte du volet peut êtreinduite en solution en présence d’une concen-tration supramicellaire en sels biliaires, et quece phénomène est réversible. La colipase seulen’induit pas l’ouverture du volet, mais en pré-sence de sels biliaires, elle permet d’obtenir uneproportion de forme ouverte plus importantequ’en présence des sels biliaires seulement.Nous poursuivons actuellement ces études enintroduisant d’autres facteurs dans le systèmeexpérimental : présence de lipides, variation dupH... Grâce à cette technique, nous avonsaujourd’hui des informations structurales surl’activation de la lipase obtenues dans desconditions proches de celles mises en œuvrelors des études cinétiques de cet enzyme. Nousespérons établir des relations structure-fonction plus précises de la lipase pancréatiqueet des lipases en général.

Parallèlement à ces travaux sur la lipase pan-créatique dite « classique », nous nous intéres-sons depuis plusieurs années à de nouvellesprotéines apparentées à la lipase pancréatique,les PLRP (pancreatic lipase-related proteins).Trois gènes distincts codant pour des lipasespancréatiques ou protéines apparentées sonten fait exprimés dans le pancréas exocrinehumain. L’un de ces gènes code pour la lipasepancréatique classique (HPL), qui possède uneactivité très sélective vis-à-vis des triglycérideset joue un rôle prépondérant dans la digestiondes lipides alimentaires. Nous avons montré laprésence des deux autres protéines (HPLRP1 etHPLRP2) dans la sécrétion pancréatique exo-crine [83, 84]. Jusqu’à présent, aucune activitéenzymatique n’a pu être décelée chez laHPLRP1 ainsi que chez les PLRP1 de diversesespèces et leur rôle physiologique est encoreinconnu. Nous avons obtenu la structure 3D dela PLRP1 du chien et montré que son absenced’activité était due à un encombrement stéri-que au niveau du site actif [85].

Les lipases pancréatiques apparentées de type2 peuvent hydrolyser in vitro les triglycérides,les phospholipides avec une activité phospho-lipase A1 et les galactolipides [86, 87]. Nousavons d’abord caractérisé les PLRP2 du cobayeet du ragondin, deux espèces chez qui iln’existe pas de phospholipase A2 pancréatiquemais où le pancréas produit la PLRP2 en grandequantité et à des niveaux équivalents à ceux dela lipase pancréatique classique. Chez ces deuxespèces, et chez les herbivores en général [88],il semble que les phospholipides et les galacto-lipides alimentaires soient les substrats physio-logiques de la PLRP2. Chez d’autres espèces, lasituation est beaucoup plus confuse et il estdifficile de proposer un rôle physiologique uni-que pour les PLRP2. Contrairement à la lipasepancréatique classique, les PLRP2 peuvent être

exprimées dans divers tissus ou types cellulai-res : entérocytes et cellules acineuses du pan-créas chez le rat, lymphocytes T chez la souris,production par la glande bulbo-urétrale etsécrétion dans le plasma séminal chez le bouc.Chez la souris en particulier, la PLRP2 contribueà la cytotoxicité des lymphocytes T et sembledonc impliquée dans la réponse immunitaire[89]. La PLRP2 humaine est présente dans lasécrétion du pancréas exocrine où elle estmajoritairement responsable de l’activitégalactolipase [84]. Son activité lipasique étantinhibée par les sels biliaires et faiblement res-taurée par la colipase, et son activité phospho-lipase A1 étant faible, la PLRP2 humaine ne joueprobablement pas un rôle crucial dans la diges-tion des triglycérides et des phospholipidesalimentaires. Son principal rôle physiologiquesemble donc être l’hydrolyse des galactolipi-des, les principaux lipides présents dans leslégumes et les fruits que nous consommonschaque jour [90]. La découverte chez l’hommed’un enzyme permettant la digestion desgalactolipides a remis en cause certaines idéesreçues sur la digestion. Les galactolipides étantles principaux lipides membranaires chez lesplantes, ce sont aussi les lipides les plus abon-dants sur la terre. Les galactolipases pourraientse révéler intéressantes pour transformer etvaloriser ces lipides.

Un nouvel axe de recherche concerne les lipa-ses microbiennes et l’association de ces enzy-mes avec des micro-organismes pathogènes.La jeune équipe Lipolyse et pathogénie bacté-rienne dirigée par Stéphane Canaan étudie leslipases de Mycobacterium tuberculosis par uneapproche de génomique structurale et fonc-tionnelle [91, 92]. Les enzymes lipolytiqueschez les mycobactéries ont été peu étudiésbien que les lipides représentent 30 à 40 % dupoids sec des mycobactéries et que 6 % de leurgénome code pour des protéines impliquéesdans le métabolisme des lipides. Les enzymeslipolytiques jouent probablement un rôle dansla mobilisation énergétique en permettantl’utilisation des acides gras comme source decarbone, mais également dans la virulence(hydrolyse des phospholipides des celluleshôtes). Ces enzymes sont donc potentielle-ment des cibles thérapeutiques pour le déve-loppement de nouveaux agents anti-tuberculeux. L’expérience acquise à Marseilledans le domaine des inhibiteurs de lipase seracertainement un atout pour relever ce défi, letraitement de la tuberculose étant toujours unepriorité internationale avec la recrudescence dela maladie associée à l’épidémie de sida dans lemonde.

Enfin, un dernier axe de recherche concernel’action des enzymes lipolytiques du tractusdigestif humain sur les « véhicules lipidiques »(excipients) utilisés dans les formes galéniques

204 DOSSIER

permettant l’administration par voie orale decertains médicaments hydrophobes (cyclospo-rine, inhibiteur DMP 323 de la protéase du HIV,a-tocophérol, nifédipine, 17-b estradiol, ontazo-last, propranolol, piroxicam, fénofibrate, ibupro-fène). Ces véhicules lipidiques se présentent sousdiverses formes (micro-émulsions, micelles, par-ticules solides) et contiennent divers composésamphiphiles (acylglycérols, esters de PEG) pou-vant être des substrats pour les lipases [93]. Cettelipolyse a été peu étudiée jusqu’à présent maiselle intéresse de plus en plus l’industrie pharma-ceutique car la lipolyse gastro-intestinale et ladigestion des lipides alimentaires influencentcertainement la biodisponibilité des moléculeshydrophobes administrées par voie orale à l’aided’excipients lipidiques. Jusqu’à présent, seuleune approche empirique était utilisée pourconcevoir ces formes galéniques. Aujourd’hui,l’industrie pharmaceutique recherche uneapproche plus rationnelle basée sur des testspréliminaires in vitro et une bonne corrélationin vitro-in vivo. Il faut savoir qu’une grande majo-rité (environ 70 %) des nouvelles molécules issuesde la recherche pharmaceutique sont hydropho-bes et nécessitent l’emploi de tels « véhicules »pour être solubilisées ou dispersées. L’administra-tion par voie orale étant une cible prioritaire pourl’industrie pharmaceutique, la galénique desmolécules hydrophobes revêt une importancestratégique et conduira certainement à de nom-breuses recherches fondamentales dans les annéesà venir. Les lipases ont encore une place ce choixdans cette recherche future.

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