SYNTHÈSE ÉNANTIOSÉLECTIVE PAR CATALYSE ENZYMATIQUE …

DANIEL GOUPIL

SYNTHÈSE ÉNANTIOSÉLECTIVE PAR CATALYSE ENZYMATIQUE DE DERIVES DE LA WARFARINE. DE L'ACIDE

CITRIQUE ET DE TROPANES

Mémoire

présenté à la faculté des études supérieures

de l'Université Laval

pour t'obtention

du grade de maître 6s sciences (M.Sc.)

Département de chimie

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE

UNIVERSITÉ LAVAL

O Daniel Goupil. 1999.

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A mes parents et mon frère.

Résume

La demande croissante de composés énantioménquement p u s a nécessité la mise

au point de diverses techniques. tant chimiques que biochimiques. Au cours des dernières

ruinées. l'utilisation d'enzymes et de micro-organismes dans la synthèse de composés

organiques est devenue de plus en plus populaire.

Le premier projet porte sur la résolution enzymatique de la wdarine. La

warfarine est un anticoagulant prothrombopénique utilisée sous forme racémique. mais

dont I'énantiomère (S)-(+) est cinq fois plus actif que le (R)-(-). On recherche une

methode simple de séparer les énantiomères.

Le deuxième projet repose sur l'acide citrique. dont on retrouve la structure dans

de nombreux composés naturels et synthétiques. Une désymétnsation de dérivés citrates a

été réalisée avec succès. permettant ainsi la synthèse asymétrique d'analogues. Ce projet a

doailleurs été publié en 1998 dans la revue Tetrahedron : Asyrnetry. volume 9. à la page

4335.

Enfin. le dernier projet consiste à faire la synthèse de dérivés d'esters de deux

alcaloïdes de type tropane, la pseudopelletierine et la tropinone. puis d'en accomplir la

résolution enzymatique. Les énantiomères ainsi obtenus pourront ensuite servir à la

préparation d'autres composés ayant des propriétés physiologiques intéressantes.

Remerciements

Je remercie mon directeur de maîtrise, le professeur Robert Chênevert, pour son

support, sa disponibilité et ses conseils tout au long de ces deux années de recherche.

Je remercie également tous mes collègues de laboratoire : Manon. Dave.

Mohammed, Marie-Pascale. Ghodsi. Yannick, Gabriel. ainsi que tous les autres que je

n'ai pas eu l'occasion de bien comaitre.

Je tiens à souligner le soutien financier du Conseil de recherches en sciences

naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

Finalement. un merci chaleureux à mes chers parents et à tous mes amis, pour leur

aide et leur encouragement.

Table des matières

... Résumé .............................................................................................................................. iii Remerciements ........................................................................................................m........ iv

. . ............................................................................................................. Table des matieres v

.4 bréviations .................................................................................................................... 1 . . ................................................................................ . 1 Abréviations des composés: 1

. ......................................................*...*........................ 2 .Abréviations des enzymes I

2.1 Les estérases ....................................................................................... 1 3 7.7 Les lipases ............................................................................................. - 3 .................................................................................................... 2.3 Autres -

Introduction .......... ... ..................................................................................................... 3

................................................................................................ Concepts de biocatalyse 3

1 . Biocatalyse .......................................................................................................... 3 ......................................................................................... . 2 Les micro-organismes 3

......................................................... 2.1. Définition d'un micro-organisme 3 ........................................................ 2.2. L'utilisation de micro-organismes 4

2.2.1 . Avantages .............................................................................. 4 ......................................................................... 2.32. Inconvénients 5

........................................................................................................ 3 . Les enzymes 5 ....................................................................... . 3.1 Définition d'une enzyme 5

............................................................................. 3 .2 . Les types d'enzymes 6 ......................................................................... . 3 .3 L'utilisation d'enzymes 7

? - .............................................................................. . . J 3. 1 Avantages 7 7 C1 ....................................................................... . 3 . 2 .2 inconvénients 10

.......................................................................................... 3.4. Les lipases 12 ................................................................................ . 4 Mécanisme des hydrolases 13

5 . Approches ......................................................................................................... 13 ............................................................................................ 5.1 Résolution 14

................................................................................... 5 -2 Désymétrisation 14

PARTIE THEORIQUE .................................m.......................................m...m.................... 16

................................................ . A Essai de résolution enzymatique de la warfarine 17

1 . La warfarine ...................................................................................................... 17 ........................................................................................... 1.1 Généralités 17

.............................................................................. 1 . 2 Activité biologique 18 ........................... ........................... 1 . 3. Approches de la littérature .... 19

........................................................... 2 . Résolution enzymatique de la warfanne 19 ..................................................................................... 3 . Estérification chimique 20

................ 3 . 1 Estérification de la warfarine à partir de l'acide de Mosher 21 ................................................... 3.7 Estérification a partir de l'anhydride 71

33 3.3 Esterification de la warfarine a partir du chlomre d'acide .................. -- 33 .......................................................................................... 4 . Hydrolyse chimique --

............................ 6 . Hydrolyse enzymatique d'esters racémiques de la warfarine 23 6.1 Hydrolyse enzymatique de l'acétate de warfarine . dans un solvant

................................................................................................... organique 24 6.2 Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine . dans un tampon

.......................................................................................... phosphate pH 7 25 7 . Acétylation enzymatique de la warfarine avec l'acétate de vinyle . dans un

.................................................................................................. solvant organique 16 .......................................... .................................. . 8 La cholestérol estérase (CE) .. 27

....................................................................................................... . 9 Conclusions 30

................................................ B . Désymétrisition en ymatique de l'acide citrique 31

................................................................................................. . I L'acide citrique 31 ........................................................................................... 1.1 Généralités 31

1.2 Utilisations biologiques ..................................................................... 32 .......................................................................... 1 -3 Utilisations humaines 34

1.3.1 Domaine alimentaire ............................................................ 34 1.3 .2 Domaine industriel ............................................................. 34

* 9 .................................................................. 1.3.3 Domaine médical 34 ............................................................. . 2 Résolution chimique dans la littérature 35

.......................................................................... 2.1 Méthode de Bergeron 35 ............................................................................. 2.2 Méthode de Ancliff 36 ........................................................................... . 3 Désymétrisation enzymatique 37

3.1 Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle dans un tampon pH 7 ........................................................................................................... 37

................................ 3 2 Désymétrisation enzymatique du citrate protégé 38 3 2 . 1 Préparation des diesters protégés a ..................................... 38

vii

....... 3 - 2 2 Hydrolyse enzymatique des diesters (tampon pH 7) 39 3.2.3. Hydrolyse enzymatique des diesters 42. dans un solvant organique saturé en tampon pH 7 ................................................ 40

3.2.4 Estérification enzymatique du diacide protégé 4J dans le DIPE ....................................................................................... 41

......................................... . 3 .3 Détermination des excès énantiornériques II 4 . Détermination des configurations absolues .................................................... 43 . ....................................................................................... 5 Activité enzymatique 44

.................................................. 5.1 Lipase de Candida anrorcfica (CAL) 44

.............................................................. 5 2 La protéase u-chymotrypsine 45 5.3 L'estérase de foie de porc (PLE) ......................................................... 46

6 . Conclusions ....................................................................................................... 48 7 . Perspectives ...................................................................................................... 49

7.1 Topostine B ......................................................................................... 49 7.1 La malyngolide ................................................................................... 50

C . Résolution et désymétrisation enzymatique de tropanes .................................... 52

.................................................................................................... I . Les aicriloides 53 ........................................................................ 1.1 Pipéndines (et dérivés) 52

.......................................................................... 1 2 Tropanes (et dérivés) 52 ............................................................................. 1 2 . 1 La cocai'ne 53

......................................................................... 1 2.1 L'épibatidine 53 - " 1.2.;. La ferruginine ...................................................................... 33

1.2.4 La tropinone e t la pseudopelletierine ................................. 58 .............................. 2 . Résolution chimique de la pseudopelletierine et tropinone 58

3 . Résolution enzymatique de la pseudopelletierine et de la tropinone ................ 59 ................................... 3.1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone 59

3.2 Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés de la pseudopelletierine et de la tropinone ................................................................................................ 60

......... 3.3 Approches de résolution enzymatique de la pseudopelletierine 62 3 -3.1 Hydrolyse enzymatique des composés 84a-b, dans un tampon

............................................................................................... pH 7 63 3 . 3 2 Hydrolyse enzymatique du composé 84b , dans le benzène

................................................................... saturé en tampon pH 7 64 3.3.3 Acçtylation enzymatique du composé 84b, dans un solvant

..................................... organique anhydre ... ................................. 65 ..................... 3.3.4 Acétylation chimique de la pseudopelleiierine 66

3.3.5 Hydrolyse enqrnatique du composé 85. dans un tampon pH 7 ...................................................................................................... 66

4 . Synthèse formelle de la femginine ............................................................... 67

....................................................................................................... 6 . Conclusions 68 7 . Perspectives ................................................................................................. 69

. . . 7.1 Synthèse de denves tropanes ............................................................. 69 7.2 Modification de la réaction de Robinson ............................................ 69 7.3 Désymétnsation enzymatique de la pseudopelletienne ...................... 70

........................................................... 7.4. Ozonolyse de dérivés tropanes 71 ...................................................... 7.5 Synthèse de dérivés d'oxatropanes 72

D-Conclusion générale ............ .. ............................................................................. 74

PARTIE EXPERIMENTALE ................... .. ...... ..... .................................................. 75

....................................................................................................... Remarques gthérales 76 .............................................................................................................. 1 . Analyse 76

2 . Réactions ........................................................................................................... 77 . . 3 . Réactifs .............................................................................................................. 77

............................................................................................................ . 4 Enzymes 78 A . Essai de résolution enzymatique de la warfarine ................................................ 79

............................................................ . 1 Estérification chimique de la warfarine 79

1.1 Estérification de la warfarinr à l'aide de l'acide de Mosher ................ 79 1.2 Estérification de la warfarine à partir des anhydrides ......................... 80 1.3 Estérification de la warfiuine à partir du chlorure d'acide .................. 82

............................................ . 2 Hydrolyse chimique de l'acétate de warfarine 1 84 3 . Résolution enzymatique ................................................................................. 84

........................ 3.1 Hydrolyse enzymatique des esters de la warfarine 84 ....................................... 3.2 Acétylation enzymatique de la warfarine 85

................................................ B . Désymétrisatioo enzymatique de l'acide citrique 86

.............. 1 . Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle .................. .... 86 ............................ . 2 Préparation des diesters protégés 42a-b .. ................... 87

....................................................... 2.1 Préparation du diacide protégé a 87 .............................................. 2.2 Préparation des diesters protégés 42a-b 88

3 . Désymétrisation enzymatique des citrates protégés .......................................... 90

........................... 3.1 Hydrolyse enzymatique des diesters protégés 42a-b 90 3.7 Estérification enzymatique du diacide protégé fi .............................. 91

........................................................ 4 . Détermination des excès énantiomériques 92 4 . l .4 vec le citrate de diéthyle ........................................................... 92 4.7 Avec les esters protégés 37a-b ......................................................... 93

. . ......................................................................................... 5 . Corrélation chimique 95 . 5 l Ouverture de cycle des esters protégés 37a-b ..................................... 95

2.1 Ouverture de cycle du méthylester protégé j7a et transestérification . 96

C . Résolution et désymétrisation enzymatique de tropanes .................................... 97

. ..........................................*...... 1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone 97 ............................................... . 1 Synth2se des dérivés méthoxycarbonylés 84a-L) 98

........................................................... 3 . Acétylation chimique du composé 84b 100 ....................................................... 4 . Résolution enzymatique du composé 84b 101

4.1 Hydrolyse enzymatique du composé 84b .......................................... 101 4.2 Acétylation enzymatique du composé 84b ....................................... 1 02

............................................ 4.3 Hydrolyse enzymatique du composé a 103 ............................................................................... . 5 Synthèse de la ferruginine 103

..................................................................... 5.1 S ynthese du tnflate & 103

5.2 Synthèse du composé 87a ............................................................... 104

.................................................................................................... BIBLIOGRAPHIE 106

Abréviations

Voici les listes d'abréviations utilisées dans ce mémoire. pour les composés et les

enzymes.

1. Abréviations des composés:

AczO 1 Anhydride acétique

DIPE

1

DME: 1 2.1-diméthortyéthane

diisopropy lester

DMAP: 4-diméthylaminopyridine

DMF: N.N-diméth ylformamide

DMP:

I

EDC: 1 1 -(3 -diméthy laminopropy 1)-3-éthylcarbodiimide c hlorhy drate

2.2-diméthoxypropane

DMSO:

MBA /

diméthy lsulfoxyde

(S)-(-)-a-méthy lbenzy lamine i

NEA 1 (S)-(-)-( 1 -naphty 1)éthylamine

2. Abréviations des enzymes

2.1 Les esterases

pyr.:

THF:

1 AE 1 Acéty 1 estérase (pelure d'orange)

p y ridine

tétrahydro fume

CE Cholestérol estérase

PLE I

1

Estérase de foie de porc

2.2 Les lipases

La mention "species" signifie que la lipase provient de souches indéterminées du

micro-organisme.

1 '4NL 1 Aspergillus niger 1 CAL

I

1

C'crndida anrarctica

I CCL Candida cylindracea

CSL Candida (species) 1 l

!

P C L 1 Psettdomonas cepacia

GCL

MSL

Geotriczrrn candidztrn ! iWucor (species)

I i

, PPL pancréas de porc i

I PEL l

PFL

C 1

RNL I R hizop us Nive us 1 I

Penicilium (sprcies)

Psetrdomonus flurescens

1

WGL 1 germe de blé

RSL

2.3 Autres

Rhizopus (species)

1 a-chym i a-c hy motrypsine

S-C subtilisine carlsberg

S-BPN'

1

BY 1 levure du boulanger (micro-organisme) 1

subtilisine BPN'

Pan pancreatine

Introduction

Concepts de biocatalyse

1 . Biocatalyse

Pour répondre au besoin de composés énantiomériquernent purs. la recherche en

chimie organique s'est orientée vers diverses solutions. On utilise par exemple des

catalyseurs asymétriques ou des produits naturels chiraux peu dispendieux (des acides

aminés ou des terpènes). Un autre domaine a également été mis a contribution : celui de

la biocatalyse. On utilise le terme biocatalyse (ou biotransfonnation) pour décrire toute

réaction chimique aidée par un micro-organisme ou une enzyme.

2. Les micro-organismes

2.1. Définition d'un micro-organisme

Comme son nom l'indique. un micro-organisme est un organisme microscopique,

végétal ou animal. Dans certains cas, ils peuvent être pathogènes. causant des maladies

dans les organismes envahis. Mais dans d'autres. il peut s'établir une symbiose entre

l'hôte et le parasite, dont la présence mutuelle peut être bénéfique pour les deux. comme

dans le cas de la tlore intestinale.

L'utilisation de micro-organisme par I'être humain est très ancienne, précédant la

compréhension même des phénomènes impliqués. Le rôle de la levure de boulanger dans

la fabrication du pain n'est qu'un exemple p m i tant d'autres.

Les avantages et inconvénients de la biocatalyse par micro-organisme dans la

synthèse asymétrique fera l'objet de la section suivante.

2.2. L'utilisation de micro-organismes

2.2.1. Avantages

Les micro-organismes partagent certains avantages reliés à la présence d'enzymes

(qui seront traitées à la section 3.3). Ajoutons a ceux-ci la simplicité de leur utilisation.

On peut les reproduire. à partir d'un petit échantillon. Leur isolation est plus simple que

dans le cas d'une enzyme spécifique. Ceci contribue à diminuer grandement le coût relié à

leur utilisation. Favorisant ainsi leur implication dans des procédés industriels. tel que la

synthèse de la vitamine C '(schéma I ) :

CHO C02H C02H C02H I

oxydation (fermentation) - Ho s téréosélectiw

OH Acetobacter f" OH Me2NHBH3 otf

acide L- ascorbique 6 -

acide 0- 2Sdiaceb gluconique

g

CH~OH CH20H i 8 : 9 2 ) L-& PB

acide cetoglucontque

destruction Reudomonas de i'isomére D fluorescens

Schéma 1

Cette synthèse fait appel à deux types différents de micro-organismes. Le produit

de départ est un sucre très peu dispendieux, le D-glucose (-). Celui-ci est oxyde en acide

D-2.5-diacétogluconique (2 par l'Acetobacterfragrum, qui est réduit sélectivement par le

Me2NHBH3 en composés & et &. Ensuite, on élimine (par digestion de Pseudomonas

flrrorescens) l'énantiomère D (-), puis après conversion en ester 4 et énolate on

obtient finalement l'acide L -ascorbique (6).

2 2.2. Inconvénients

Le principal inconvénient provient d'une mutation possible chez le micro-

organisme. C'est-à-dire que deux échantillons de Pseirdomonas fltrorescens d'origine

diffirente pourraient donner des résultats variables. s'iis ne proviennent pas de ia mSme

souche. En effet. une mutation poumit modifier un aspect du micro-organisme. L'effet

peut se traduire par une baisse de rendement. d'excès énantiomériques (ex.), voire même

une perte de I'eRet catalytique.

Il est plus compliqué d'extraire le composé désiré. à cause de la présence des

micro-organismes mêmes. mais aussi de produits secondaires qui peuvent être formés.

Finalement. comme le micro-organisme se nourrit du substrat, le rendement peut Stre

moins élevé.

3. Les enzymes

3.1. Définition d'une enzyme

Une enzyme est une protéine constituée d'acides aminés reliés entre eux par des

liens peptidiques. Cette structure se replie pour former un ensemble tridimensionnel. qui

renferme un site actif à l'intérieur duquel le substrat doit pénétrer. Selon la situation. la

réaction catalysée peut être chimio-. régio- ou stéréosélective.

Certaines enzymes requièrent un cofacteur (par exemple le NADH pour une

réduction) qui doit être régénéré Ni situ. D'autres contiennent un atome (fer, zinc, etc.) au

site actif, essentiel à ia catalyse.

3.2. Les types d'enzymes

En ce moment. près de 3 000 enzymes ont été reconnues par l'International Union

of ~ i o c h e m i s f ~ y , et si on se base sur la spéculation qu'il y aurait environ 25 000 enzymes

dans la nature3. il y a la un vaste potentiel. inutilisé à près de 90%. Mentionnons toutefois

que de ces 3 000 enzymes répertoriées. seulement -15% (soit a peu près 300) sont

disponibles ~omrnercialernent.~' On en a identifié six catégories, selon le type de rkaction

Les nombres entre parenthèse font référence. respectivement. au nombre d'enzymes

répertoriées dans cette catégorie, au nombre qui sont disponibles sur le marché et à leur

utilisation approximative. pour la période 1987-88.j

1.

. . Il .

. . . 111.

iv.

v.

vi.

oxydo-rédiictase: elle catalyse les réactions d'oxydoréductions. comme

l'oxygénation de liens C-H. C-C et C=C. ainsi que I'addition ou l'élimination

d'atomes d'hydrogènes équivalents. (650 / 90 1 25%)

transfbrasr: cette classe assure le transfert de groupements tels que les aldéhydes,

cétones. acyles. sucres. phosphoryles ou rnkthyles d'une molécule vers une autre.

(720 / 90 / 4%)

hylroiuse: celle-ci est impliquée dans l'hydrolyse ou la formation d'esters. amides.

lactones. lactames. ipoxides. nitriles. anhydrides et glycosides. (636 1 125 1 65%)

[yase: elle catalyse I'addition ou l'élimination de petites molécules sur des liens

C=C. C=N ou C=O. (255 / 32 / 5%)

isomérase: elle est impliquée dans les isomérisations. telles la racémisation et

epirnénsation. (120 / 6 1 4%)

iigase: cette classe catalyse la formation ou le bris de liaisons C-O. C-S, C-N et C-

3.3. L'utilisation d'enzymes

L'utilisation d'enzymes en synthèse organique a progressé à pas de géant au cours

des 10 dernières années. Des centaines de publications (pour une proportion de 8% des

publications en chimie organique en 1991 ") de même que des livres spécialisés ont fait

leur apparition. De plus en plus de chercheurs utilisent les enzymes pour rksoudre un

large éventail de problèmes.

3.3.1. Avantages

Tels que mentionnés. les avantages sont nombre~x."~ Par exemple:

1.

. . I l .

. . . 111.

les enzymes sont d'excellents catalysews: elles accélèrent généralement la vitesse de

réaction d'un facteur de 10'- 10" et requiert une quantité de produit plus faible qu'un

catalyseur chimique pour produire le même effet.

elles peuvent opr'rer dans des conditions cfoirces: elles opèrent dans un milieu de pH

d'environ 7. à des températures de 20 à 40°C. ce qui permet de diminuer les

réactions secondaires (décomposition. racémisation. etc.). Dans le schéma ci-

dessous. on constate qu'on peut éviter la décomposition que l'on obtiendrait lors de

l'hydrolyse chimique de l'ester du çyclopentadiene (schéma 2)':

7 - Schéma 2

il existe une enzyme pour à peu près toutes Zes réactions: les exceptions comportent

les réactions de Diels-Alder et le réarrangement de Cope. Notons également qu'une

enzyme peut catalyser une réaction sur un composé très différent de son substrat

naturel. Ceci est dû à la grande flexibilité du biocatalyseur, lui permettant ainsi

d'accommoder un produit d'une taille variable. tant que certains critères sont

respectés. Malheureusement, cet aspect est encore assez méconnu.

iv. elles démontrent trois types de sélectivité:

(a) la chimiosélectivité: la capacité de catalyser un type de fonction particulier.

(b) la rigioselectivité et diastéréosdectivire': la capacité de distinguer des types de

fonctions identiques. mais situés dans des régions différentes de la même

molécule. L'hydrolyse régiosélective d'un sucre 5 par la lipase de pancréas du

porc (PPL) ' est rapportée au schéma 3:

Y 0 - Y 0 tampon

+ HO

* " - 90% OH 5.10 Oy

Y = COR, R = alkyle

Schéma 3

(c) l 'inuntirnilecriviré: la capacité de distinguer entre deux énantiomères ou entre

les groupements énantiotopiques d'un composé méso ou prochiral.

C'est ce dernier avantage qui intéresse le plus les chercheurs des domaines

agrochimiques et pharmaceutiques. En effet. les isomères des composés biologiquement

actih ont parfois des effets différents.

Dans le cas ou un énantiomère est plus actif que l'autre. le plus actif est appelé

eutomcre et le moins actif, le distomère. Le dexchlorpheniramine (9). un antagoniste

chiral du récepteur H i de l'histamine. est hautement stéréosélectif: l'isomère (S)-(+) est

environ 200 fois plus réactif que l'isomère (R)-(-).8

Les énantiomères peuvent avoir des effets complémentaires. L'indacrinone (o)

est un diurétique (augmente l'excrétion de l'eau) possédant un effet secondaire de

rétention de l'acide urique. Malheureusement, l'énantiomère (+) possède l'activité

diurétique et l'effet secondaire. Par contre. l'énantiomère (-) est un agent réduisant le

niveau d'acide urique.'

OOH

Les énantiomères peuvent avoir des effets thérapeutiques différents. Darvon $0. le

(2s. 3R)-(+)-dextropropoxyphene ((+)-II). est un analgésique et son énantiomère

Novrad (Bi. (-)-II. est un antitussif. l0 Ces deux activités n'Çtant pas complémentaires. ces

énantiomères sont vendus séparément.

I l est aussi possible que les inantiornères aient des effets opposés. comme

l'isomère (-) du picenadol (-) qui présente une activité de calmant (antagoniste). tandis

que le ( + ) - entraîne un effet convulsif (agoniste). Le mélange racémique est quant à lui.

un agoniste prtiei.' '

II y a également nombre de molécules qui démontrent des affinités pour plusieurs

ricepteurs différents. comme le labetalol (5, un antagoniste des récepteurs a- et P- adrénergiques. Dans cet exemple. les affinités varient selon i'isomere impliqué. L'isomère

(RR) bloque le récepteur P- de façon prédominante. tandis que le (SR) bloque

principalement le récepteur a-. Les deux autres isomères. (SS) et (RS). sont presque

inactifs.

Dans le cas des bloqueurs P-adrénergiques. antiépilrptiques et anticoagulants

oraux. 90% des médicaments sur le marché sur des racémiques. Cette proportion diminue

à 50% pour les antihistarnines. anticholinergiques et anesthésiques locaux. En général.

environ 25% de tous les médicaments sont vendus en racémique."

La situation est amenée à changer. à cause des pressions ~é~is ia t ives '~ . notamment

par la FDA (Food and Drugs Administration). aux États-unis.

3.3.2. Inconvénients

I l y a évidemment des inconvénients à l'utilisation des enzymes. Entre autres. elles

ne sont disponibles que sous une seule configuration (contrairement aux catalyseun

chimiques) et démontrent un mavimum d'activité dans l'eau (un solvant très dificile à

éliminer).

Notons cependant que les enzymes peuvent dans certains cas opérer tout aussi

bien (parfois mieux) dans un solvant organique peu polaire (par exemple hesane.

dichlorométhane? benzène ou éther diisopropylique. mais pas le méthanoi qui dénature

les enzymes!). Un solvant organique offre plusieurs possibilités. Saturé en eau. il permet

une hydrolyse. Strictement anhydre, on peut accomplir une acétylation.

De récents travaux ont démontré qu'un abaissement de la température sous O°C

(ex. de 99% à 40°C) peut favoriser une augmentation de l'excès Cnantiomère et du

rendement.'" Certaines enzymes (de micro-organismes dits "extrêmophiles") peuvent

igalemrnt être chauffées jusqu'à des températures de 80°C. On a également accompli des

résolutions de composés en les chauffant périodiquement. durant de courtes périodes.

dans un four micro-onde'' .

Bien qu'une enzyme ne soit effectivement disponible que sous une seule

configuration. notons que deux enzymes de types différents peuvent se compléter. II est

igalement possible que deus voies différentes permettent d'obtenir un énantiomére ou

l'autre, comme dans cette dt%ymitrisation

antarcticn (CAL) (SC héma 4) '' : de tetrahydropyranes par la lipase de Candida

R = TBS, MOM

pyridine

OR 1

Schéma 4

Ainsi qu'on peut le constater. l'utilisation des enzymes ne doit pas être considérée

ni comme une solution miracle, ni comme une intrusion indésirable de la biochimie en

synthèse organique. Les avantages qu'elles ofient doivent être envisagés comme une

alternative a des voies de synthèse plus conventio~elles. De même. on doit tenir compte

des coûts associés et des problèmes qui risquent de survenir. Quoiqufil en soit. elles ont

su se tailler une place dans plusieurs procédés industriels.

3.4. Les lipases

Les lipases constituent une sous-catégorie des hydrolases. Bien que leur rôle

naturel consiste à la formation et a l'hydrolyse des lipides (autrement dit. la

transformation des triglycérides en acides gras et glycérol et vice-versa)''. les chercheurs

ont démontré leur capacité à hydrolyser d'autres types d'esters. et même certains

thioesters l x .

Les lipases sont également stables dans de nombreux solvants organiques et

résistent à des températures élevées1'. Elles ne nécessitent ni coenzyme. ni cofacteur. ce

qui contribue à diminuer leur coüt et la facilité de leur utilisation.

Autre particularité de ce type d'enzymes. elles démontrent souvent une activité

supérieure lors de réaction à l'interface de milieux hydrophobes et hydrophiles. tel l'eau et

un alcane20. Ainsi un produit pourra parfois réagir. malgré une faible solubilité dans le

solvant utilisé. Finalement. mentionnons que l'utilisation d'un Cmulsifiant (tel que le

Triton-X) permet dans certains cas d'augmenter le rendement etlou 1'e.e.

Tout ceci permet d'expliquer l'énorme succès des lipases. La plus utilisée est

isolée de Candida anfarctico (CAL). Cette enzyme est particulièrement efficace. robuste

et catalyse une grande variété de réactions. Anderson et ses collaborateurs ont publié en

1998 un article de fond sur la CAL."'

4. Mécanisme des hydrolases

Les hydrolases dites à senne reposent sur une triade catalytique dans le site actif

de l'enzyme pour modifier un substrat. Cette triade est composée de I'acide aspartique

(ASP). de l'histidine (HIS) et de la serine (SER) (schéma 5). Les deux acides aminés

(ASP et HIS) contribuent à diminuer le pKa du proton du groupement hydroxyle de la

sérine. par le processus d'échange qui est indiqué sur le schéma 5.

ASP

\ -

dro L'oxygène de I'h!

SER

RCOOH

RCOOR"

J R"'NH2 * RC(=O)NHW1

Schéma S

xyle de la SER peut alors attaquer le substrat (et dans cet

exemple. libérer une molécule d'alcool). Dans ce complexe enzyme-substrat. I'knergie

nécessaire pour atteindre l'état de rransition est diminuée. ce qui permet a un nucléophile

d'attaquer plus rapidement et facilement le substrat. Le produit est ensuite libéré,

l'enzyme est régénérée et le cycle catalytique peut se poursuivre.

Bien que l'hydrolyse (Nu = H20), soit le cas le plus fréquent. il est également

possible d'accomplir une transestérification. de former un amide, etc.

5. Approches

Les approches utilisées en biocatalyse pour obtenir des molécules chirales peuvent

se résumer en deux principaux types : résolution et désymétrisation.

5.1 Résolution

Une résolution consiste à séparer les énantiomères d'un mélange rackmique

(schéma 6). On utilise un biocatalyseur qui permet une réaction énantiosélective. Ainsi

l'un des énantiomères est modifié. ce qui permet ensuite d'en faire la séparation selon un

procédé usuel. L'inconvénient de cette approche est que le rendement sera de 50%. dans

le meilleur des cas. Comme exemple. on retrouve la résolution d '~~ox~-es ters '~ .

racémique rendement < 50%

exemple:

R' = H, Me, Et, n-Pr

Schéma 6

5.2 Désymétrisation

Une disymétnsation consiste à retirer le plan de symétrie retrouvé dans une

molécule dite prochirale (schéma 7). comme dans un misa-diacétateZ3:

exemple:

Schéma 7

C e mémoire décrit des projets reposant sur la biocatalyse lors de l'étape-clé. Ces

projets sont la résolution de la wdarine. la désymétrisation de dérivés de l'acide citrique

et la résolution de tropanes. Les qualités recherchées sont la simplicité et l'efficacité

(rendement élevé et e.e. 2 90%).

PARTIE THÉORIQUE

A. Essai de résolution enzymatique de la warferine

1. La warfarine

1.1 Généralités

La warfarine (u) est un composé dérivé du dicournarol (i5) (famille des

coumarines) possédant des propriétés anticoagulantes. Elle est préparée par une

condensation de Michael de ia benzalacétone et du 4-hydroxycoumarin.2"

Le composé est très soluble dans l'alcool et l'eau. En solution. la warfarine est en

tiquilibre sous 2 formes (deux hémicétals cycliques et une forme ouverte). comme on peut

le constater dans le schéma 8 :

16a - 16b - Schéma 8

Dans le chloroforme. les proportions sont de 45% pour i'hémiacétal cyclique

majeur. 40% pour l'hémiacétal cyclique mineur et seulement 15% de warfarine ouverte.

Dans le DMSO, le pourcentage est de 70:30:0 pour chaque forme, re~~ectivernent.'~

1.2 Activité biologique

La warfarine est un anticoagulant prothrombopénique. Elle agit en inhibant

compétitivement la vitamine K. nécessaire à la production de prothrombine. responsable

de la coagulation naturelle du sang. Son action est lente. parce que la prothrombine

possède une demi-vie plutôt longue (soit environ 60 heures). "a

Des 1948, la warfarine fut utilisée comme raticide. Les animaux meurent

d'épuisement causé par de multiples hémorragies.26b Elle est unique du fait qu'die doit

Stre consommée à plusieurs reprises avant de causer la mort (3 à I O jours chez les rats) et

qu'il n'en faut qu'une dose infime pour être efficace (0.025% à 0.05% dans la noumture et

0.005% dans l'eau). Ceci contribue à en faire un des raticides les plus sécuritaires et les

plus utilisés.

Depuis 1952. la warfarine de sodium ou potassium est utilisée comme

médicament. Elle est prescrite (sous plusieurs noms commerciaux. tels cournadin et

warfilone) pour prévenir la formation de caillots. lors de risques d'embolie pulmonaire.

de fibrillation auriculaire. chez les porteurs de valvules artificielles et tous les cas du

Ses effets ne sr faisant pas sentir avant 2 ou 3 jours, un autre anticoagulant

d'action rapide lui est habituellement associé. comme l'héparine (l'anticoagulant naturel

du corps humain). En cas de surdoses. elle provoque des hémorragies excessives (d'où sa

première vocation. comme poison).

Grâce à son efficacité par voie oraie. elle rivalise le dicoumarol. Elle peut aussi

être administrée par voie intraveineuse. puisqu'elle est soluble dans l'eau.

Elle est utilisée sous forme racémique. pour des raisons économiques. Cependant.

l'énantiomère (S)- ( - ) est cinq fois plus actif que le (R)-(+). et il est éliminé plus

Il est donc important de les séparer avant de procéder à des études

cliniques. d'autant plus que l'interaction de certains médicaments avec chaque

énantiomère est différente. Par exemple, administrée avec la phénylbutazone,

l'élimination du (S)-(-) est ralentie, tandis que celle du (R)-(+) est accélérée."

1.3. Approches de la littérature

La méthode usuelle est estérification de la warfarine avec un composé chiral.

tel la carbobenzyloxy-L-proline ( ) (schéma 9))'. puis la séparation des

diastéréoisomères ainsi formés, par chromatographie liquide haute performance.

EDC ou pyr. CH2Q I

mouo séparation des diastéréoisorneres

Schéma 9

2. Résolution enzymatique de la warfarine

L'approche retenue dans ce mémoire est une risolitrion, selon les deux possibilités

illustrées dans le schéma 10. La première est une acétylation enzymatique dans un

solvant organique. La deuxième est une hydrolyse enzymatique d'un ester racémique de

la warfarine (obtenu par voie chimique). Rappelons que ces deux méthodes sont souvent

complémentaires (c'est-à-dire qu'elles permettent d'obtenir chacune un énantiomère

différent). comme nous l'avons mentionné dans l'introduction. Évidemment, pour réussir

la résolution, il faudra trouver une enzyme capable de faire la réaction avec un e.e. d'au

moins 90%.

acetyîation enzymatique t

OH CH2C(=O)CH3

estérification hydrolyse R(O=)CO CH2C(=O)CH3 emymatique * chimique [R = alkyie]

Schéma 10

Cet approche est retenu. à cause de sa simplicité. En effet. la warfarine est

disponible commercialement (sous forme racémique).

3. Estérification chimique

Quatre esters de la warfarine ont été préparés, dont trois pour la résolution

(acétate. octanoate et hexadecanoatej et un quatrième pour la détermination des excès

énantiomériques (ester de I'acide de Mosher).

Trois méthodes différentes ont été utilisées pour obtenir les esters désirés: la

réaction avec l'acide approprié. avec l'anhydride et enfin avec le chlorure d'acide

correspondant. La méthode retenue pour chaque ester a été dictée par la simplicité de la

réaction et la disponibilité des composés.

L'acétate a été obtenu à partir du chlorure d'acétyle et de l'anhydride acétique,

I'octanoate, à partir du chlorure d'octanoyle, I'hexadécanoate, à partir de l'anhydride

palmitique, et enfin, l'ester de Mosher, par réaction directe avec l'acide.

Bien que la warfarine ouverte ne compte que pour environ 15% des formes en

équilibre en solution, l'ester de la forme cyclique de la warZ-aine (16a-b) n'a pas été

observé. Le fort encombrement stérique de l'hydroxyle (carbone quaternaire) en est

probablement responsable. L'équilibre est déplacé afm de favoriser la formation des

esters non-cycliques.

3.1 Estérification de la warfarine à partir de l'acide de Mosher

La première méthode consiste à faire réagir un des énantiomères de l'acide de

Mosher (a avec la warfarine. en présence dEDC et DMAP (schéma 11).

EDC, DMAP

W C b )&=Fi k 0

OCH

21 -

Schéma 11

En RMN proton. on observe un dédoublement des pics associés aux 2 centres

chiraux. soient à 2.16 / 2.14 ppm (CH) et 3.74 / 3.71 ppm (OCH3). Les diastéréoisomères

2 1. prkparés à partir de la warfarine racémique. révèlent des pics d'intégration semblables --

pour les deux isomères. Cette technique pourra donc Stre utilisée afin de déterminer les

ex . des produits des essais enzymatiques.

3.2 Estérification à partir de l'anhydride

La seconde méthode est une réaction de l'anhydride acétique ou palmitique avec

la warfarine racémique, en milieu basique (schéma 12). La réaction se fait avec

l'anhydride palmitique, malgré l'encombrement stérique important. Ces esters serviront

aux essais d'hydrolyse enzymatique.

K A +

R O R

Schéma 12

3.3 Estérification de la warfarine à partir du chlorure d'acide

La dernière méthode consiste à faire réagir la warfixine racémique (-1 avec le

chlorure d'acétyle ou d'octanoyle. La réaction avec le chlorure d'acétyle servait

uniquement à confirmer la structure de l'acétate de warfxine et n'a pas été optimisée.

C'est plutôt la deuxième mithode qui a kté utilisée pour produire cet ester en grande

quantité. L'octanoate de warfarine (m) servira dans les essais d'hydrolyse enzymatique.

+ / /' 0 / \ DMAP R

OH CH, THF ) R(O=)CO CH2C(=O)CH 3

Schéma 13

4. Hydrolyse chimique

Les esters sont tous stables en milieu aqueux neutre. En milieu basique (par

exemple, avec l'hydroxyde de sodium). l'acétate est hydrolysé et on récupère la

warfarine (schéma 14). La grande solubilité de celle-ci dans l'eau explique le rendement

un peu plus faible.

La détermination des e.e. des esters nécessite d'abord l'hydrolyse, puis une

estérification de la warfarine ainsi obtenue avec l'acide de Mosher.

19a - 14 -

Schéma 14

6. Hydrolyse enzymatique d'esters racémiques de la warfarine

Dans les essais d'hydrolyse enzymatique sur esters (principalement l'acétate).

deux méthodes ont été utilisées: hydrolyse dans un milieu aqueux (tampon phosphate) et

hydrolyse dans un solvant organique saturé en tampon phosphate.

6.1 Hydrolyse enzymatique de I'acétate de warfarine, dans un solvant

organique

Les données des premiers essais enzymatiques se retrouvent au tableau 1.

Tableau 1: Hydrolyse enzymatique de I'acétate de warfarine, à la température

de la pièce, dans un solvant organique saturé en tampon pH 7

enzyme m / \ soitant *

HICKO CH2C(=O)CH3 OH CH2C(=O)CH3

0 - 14

Solvant Enzyme Durée Composé

CHClj PPL J j décomposition

PSL. 4 j 19a

DIPE CCL 7 j 19a

CE décomposition

ANL 19a

PSL 19a

PCL 19a

GCL 19a

PEL 19a

RNL 19a

RSL 19a

MSL 19a

Dans les cas de PPL et CE, aucun composé spécifique n'a pu être identifié, étant

donné l'impossibilité de les isoler. Il semblerait que le substrat ait été décomposé. Pour

tenter d'empêcher la décomposition du substrat et d'augmenter l'activité enzymatique, le

solvant organique est remplacé par un tampon phosphate (pH 7).

6.2 Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine, dans un tampon

phosphate pH 7.

Le tableau 2 résume les essais d'hydrolyse enzymatique dans le tampon pH 7.

Tableau 2: Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine,

à II température de la pièce, dans un tampon pH 7

enzyme tampon

RKO CH2C(=O)CHi OH CH2C(=O)CH3

0 R=CH3 - 19a - 14

(CH211 4CH3 (CH2)6CH3

Substrat Enzyme Durée Composé

19a PPL 6 j t9a

CCL 6 j 19a

CE 24 h 19d14

PSL 6 j 19a

RNL 6.i 19a

WGL 6.i 19a

PLE 6.Î 19a

AE 61 19a

PCL 6.i 19a

PFL 6 j 19a

PEL 6 j 19a

a-c h y n 6 j 19a

Dans l'essai d'hydrolyse de l'acétate par la cholestérol estérase (CE), après une

conversion d'environ 50% du produit de départ (déterminée par chromatographie sur

couche mince). on récupère près de 50% de l'acétate. mais qu'une petite quantité de

warfarine. L'acétate lui-même (ou hydrolysé chimiquement en warfarine) démontre un

pouvoir rotatoire nul. On conclut alors que cette réaction n'est malheureusement pas

stéréosélective. Dans la littérature3'. on retrouve [ a ] " ~ = + l 5 3 et - 15.5 pour (+)-M et ( -

)-M. respectivement. dans l'acétonitrile.

Puisqu'une chaîne plus longue donne parfois une meilleure sélectivité en catalyse

enzvmatique. l'octanoate et l'hexadécanoate de warfarine ont été testés dans les mêmes

conditions. Malheureusement. aucun des deux esters n'a été hy dro 1 y si .

7. Acétylation enzymatique de la warfarine avec l'acétate de vinyle, dans un

solvant organique.

Le tableau 3 présente les acétylations enzymatiques qui ont été tentées.

Tableau 3 : Acétylrtion enzymatique de la warfarine avec l'acétate

de vinyle, à la température de la pièce, dans un solvant organique

mzym + a / / *

* solvant Y C Y O CH2C(=O)CH3 OH CH2C(=O)CH3 eOAc

h

14 u

- - 19a Solvant Enzyme Durée Résultat

CHîC12 PPL 9 j décomposition

CE 9 j décomposition

CCL 8j 14

PSL 8 j 14

THF CE 8 j décomposition

benzène CE décomposition

hexane CE 8 j décomposition

Les acétylations n'ont pas permis d'accomplir une résolution. La cholestérol

estérase n'a que décomposé le substrat. Il est possible que la réaction soit défavorisée par

la forme cyclique sous laquelle on retrouve majoritairement la warfiuine. lorsqu'elle est

en solution. En effet. sous forme cyclique. l'hydroxyle est quaternaire. ce qui rend

I'acétylation plus difficile que pour la forme ouverte.

8. La cholestérol estérase (CE)

La cholestérol estérase catalyse l'hydrolyse et la formation d'esters du cholestérol

(=a), d'acétate à stéarate.'? Certains autres stérols sont également hydrolysés. comme le

p-sitostérol (a) et l'ergostérol (23). alors que d'autres sont inactifs, tels l'épicholestérol

(24). I'estradiol (25) et le diéthylstilbestrol (a. Les nombres entre parenthèses

correspondent à la vitesse relative d'hydrolyse par la CE. la référence étant l'hydrolyse de

l'acétate de cholestérol. Un "x" indique que l'ester de ce composé n'est pas hydrolysé.

On remarquera qu'une modification de I'environnement du groupement hydroxyle

du cholestérol se traduit par une perte complète de l'activité catalytique de la CE (cas de

2 4 , z et 26). Un changement dans la chaîne latérale entraîne quant B elle une baisse de la

vitesse de réaction (a et 23).

Des molécules. telles le binaphtol (m et spirobiindanol (-), peuvent Ztre

hydrolysées sélectivement par la CE (schéma 16). '~ L'enzyme permet de faire la

résolution d'un mélange racémique du pentanoate de binaphtol et d'obtenir les deux

énantiomères (e.e. > 98%). De mèrne. l'hexanoate du spirobiindanol peut Sue Rsolu avec

des e.e. d'environ 90%.

Pour expliquer ces résultats. deux règles empiriques ont été proposées par

Kazlauskas et ses collaborateurs (schéma 15). Le premier modèle (a) indique pour un

ester d'alcool secondaire donné. quel énantiomère réagira le plus rapidement avec la CE. 34 Le deuxième modèle (,b) a 6 é adapté pour des esters d'aryles chiraux.35 La lettre "M"

représente un substituant de taille moyenne. comme un méthyle et le "Lu. un substituant

de taille plus large. tel un phényle. Dans le deuxième modèle (b). la CE favorise

I'Çnantiornère où le substituant plus large "L" est situé en bas à droite et demère le plan

de cette feuille.

O*< 9 c 90' vue de face vue de côté

schéma 15

Les résultats obtenus peuvent être expliqués à l'aide du schéma 16. Le composé

29 est d'abord donné en exemple (a). L'énantiomère ( S ) - présente son substituant Ic - plus large "L" demère le plan. tandis que dans l'autre énantiomère, (R)-29, "L" se trouve

au devant. Le ( S ) - se comporte comme le modèle présenté au schéma 15 et sera alors

hydrolysé plus rapidement que le (R)-29. C'est ce qui a permis d'accomplir la résolution

du binaphtol (27).

Dans le cas de l'acétate de warfarine &i (b), les deux énantiomères présentent un

substituant "L" dans une position à peu près similaire. La CE hydrolyse alors les deus

énantiomères avec la même vitesse. ce qui se traduit (tel qu'observe au tableau 7) par une

absence d'énantiosélectivité.

schéma 16

Ces analyses sont évidemment très sommaires et il serait souhaitable de recourir à

la modélisation moléculaire pour déterminer le rotamere le plus stable de l'acétate de

warf'arine et ensuite appliquer le modèle.

9. Conclusions

La résolution enzymatique de la warfarine racémique commerciale a été tentée.

par hydrolyse d'esters (milieux aqueux et organiques) et acétylation de la ~ ~ a r i n e . mais

sans succès.

Une seule enzyme. la cholestérol estérase. a permis I'hydrolyse de l'acétate de

warfarine (m) dans un délai raisonnable. mais sans énantiosélectivité. Les autres esters

de la wadarine (19b-c) n'ont par contre pas été hydrolysés. Il semble que la taille des

substiruants soit trop élevée pour leur permettre l'accès au site actif de l'enzyme.

La décomposition des substrats a été observée dans quelques essais. lors de

l'utilisation de CE ou PPL dans un solvant organique. II est possible que cette

dkcomposition observée soit celle de l'enzyme utilisée ou que le solvant modifie l'action

de l'enzyme sur le substrat.

Dans les essais d'acétylation. il est vraisemblable que la forme cyclique de la

warfarine nuise à l'action de l'enzyme. Étant donné que I'acétylation chimique a pu Stre

effectuée malgré cela. l'absence de réactivité enzymatique peut être attribuée a une

mauvaise interaction entre le site actif et la warfarine sous forme cyclique.

B. Désymétrisation enzymatique de l'acide citrique

1 . L'acide citrique

1 -1 Généralités

L'acide citrique (30) est un composé naturel et un métabolite commun des plantes

et des animaux. 11 est l'acide le plus versarile et le plus utilisé dans les domaines

alimentaires et pharmaceutiques.

I l a été isolé du jus de citron pour la première fois en 1784 par Scheele. En 1834.

Liebig le reconnaît comme un hydroxy-triacide et en 1893. Wehmer découvrait que

certaines moisissures produisent de I'acide citrique lorsqu'elles poussent sur du sucre.

C'est d'ailleurs cette méthode qui est toujours utilisée de nos jours. quoiqu'elle ait

été raffinée et aseptisée avec le temps. On introduit un micro-organisme, Aspergillus

niger. dans un sirop sucré (canne à sucre et sucre de betterave). La conversion en acide

citrique peut prendre jusqu'à 1 5 jours.

En 1990. on en estimait la production mondiale à plus de 550 000 tonnes (dont

4 1% pour l'Europe de l'Ouest et 28% pour l'Amérique du ~ o r d ) . - ' ~ L'utilisation de l'acide

citrique aux États-unis est présentée au tableau 4. répartie selon les secteurs, pour les

152 000 tomes produites en 1990.

Tableau 4 : Distritution de I'acide citrique

par secteur, aux Etats-Unis, en 1990

Produits YO

Breuvages 45

Nourritures 2 1

Pharmaceutiques et cosmétiques 8

Détergents et produits de nettoyage 19

Autres 7

L'acide citrique est très soluble dans l'eau (59.2 g par 100 g d'eau). A 20°C. ses

trois pK, sont de 3.14. 4.77 et 6.39. En tant qu'acide. il peut servir à abaisser le pH.

Neutralisé en partie par une base (telle que l'hydroxyde de sodium). i l peur servir de

tampon.

Ses trois fonctions acides et son groupement hydroxyle en font un excellent

ligand. Ses propriétés de chéiation seront détaillées dans la section 1.3.

1.2 Utilisations biologiques

Bien qu'on retrouve l'acide citrique principalement dans les fmits tels le citron. il

se trouve. sous forme d'acide. dans une grande variété de plantes et de fleurs. Sous forme

d'ion citrate. on le retrouve pratiquement dans toutes les plantes et animaux. Le sérum

humain en contiendrait environ 1 rng/kg du poids corporel. Le tableau 5 fournit quelques

exemples de teneur naturelle en acide citrique:"

Tableau 5 : Teneur naturelle en acide citrique de plantes et fluides humains

Plantes Acide citrique Fluides humains Acide citrique (% P/P) ( P P ~ )

citron 4.0-8.0 sang entier 15 orange 0.6- 1 .O lait maternel 500- 1250

f r m boise 1 .O-1 -3 urine 100-750 pomme 0.008 OS 7500 patate 0.3-0.5 salive 1 -2 laitue 0.0 16 Iarme 5-7

L'acide citrique est impliqué dans le cycle de Krebs. le processus qui convertit les

elucides. les graisses et les protéines en dioxyde de carbone et en eau. Ce cycle se b

retrouve dans virtuellement tous les organismes vivants. car il permet de libérer l'énergie

nécessaire à toutes les activités.

I l n'est donc pas étonnant que l'on retrouve une foule de composés naturels dérivés

de ['acide citrique. comme par exemple. rhizobactin 1021" (z), un sidérophore chiral

isolé d'un champignon. Les sidérophores sont des biomolécules qui permettent de

chilater (et donc de rendre accessible) les ions ferriques essentiels à la survie des plantes.

Les ~iridiofun~ines '~ - (32). membres d'une famille d'inhibiteurs de !a squalènr

synthétase (SS) et produits naturels antifongiques incorporent le noyau citrate. La SS est

une enzyme impliquée dans la biosynthèse du cholestéroi. On espère que ses inhibiteurs

pourront Cventuel lement conduire a un médicament efficace contre la cholestérolémie.

On a récemment utilisé uii citrate de méthyle dans des nucléosides anti-VIH,

pour remplacer le triphosphate (34). Ce dernier est trop facilement hydrolysé in vivo, ce

qui entraîne la perte d'activité des rnédi~aments."~ La modélisation moléculaire a

dimontré que ce noyau constituerait un bon substitut. tout en résistant a l'hydrolyse dans

l'organisme.

OH O O O O II II II

Me. ,P. ,P. .P 0 10 1 0 1.0-

coi G o - @

1.3 Utilisations humaines

L'acide citrique est l'acide le plus versatile et le plus utilisé dans les domaines

alimentaires et pharmaceutiques. Ces utilisations font appel à l'une (ou plusieurs) des

propriétés suivantes: goiit agréable. ajustement de pH. tampon (pour maintenir ou

contrôler le pH), chélation d'ions métalliques et agent dispersant.

1.3.1 Domaine alimentaire

11 est ajouté dans de nombreux breuvages pour son goût agréable. sa capaciti de

tamponner les solutions et pour augmenter l'efficacité des préservatifs. 11 désactive des

enzymes naturelles qui causent la détérioration du goût et de l'apparence des fruits en

conserve et des aliments surgelés. II prévient l'oxydation des graisses et huiles en

chélatant les ions métalliques traces qui catalysent cette réaction. Enfin. il est utilisé dans

la pasteurisation du fromage poiir permettre la stabilisation de l'émulsion eau-huile.

1.3.2 Domaine industriel

L'acide citrique est principalement utilisé dans les détergents. à cause de sa grande

solubilité dans l'eau a toutes les températures et dans une large étendue du pH et de sa

capacité de chélûter les ions responsables de la dureté de l'eau. Il est considéré comme un

substitut acceptable des phosphates.

1.3.3 Domaine médical

L'acide citrique et les sels du citrate sont utilisés comme tel pour tamponner

différentes solutions. pour optimiser leur stabilité et efficacité. Une solution de

citrate/phosphate peut conserver le sang pendant environ 21 jours (35 jours en ajoutant de

l'adénosine. mais le sang n'est alors plus propre a la transfusion). L'ion citrate chélate I'ion

de calcium. nécessaire au processus naturel de coagulation du sang. Une fois le sang

réintroduit dans l'organisme, les ions calcium sont libérés et le citrate est diminé.

La structure du citrate a déjà fait ses preuves dans de nombreux composés naturels

bioactifs. II est donc utilisé aussi dans la recherche de nouveaux composés synthétiques.

C'est justement sur ceci que portera la suite de cette partie.

2. Résolution chimique dans la littérature

De nombreux composés-cibles peuvent Ctre préparés à l'aide de l'acide citrique.

Dans la plupart des cas. ceci requiert cependant la synthèse de dérivCs citrates chiraux.

Ce n'est que récemment que deux méthodes permettant d'accomplir ceci ont été

publiées. Elles sont prksentées ci-dessous. Ce sont des résolutions par cristallisation

fractionnée. Elles sont longues à accomplir et le rendement est plutôt faible.

2.1 Méthode de Bergeron

Cette méthode. publike par Bergeron et ses collaborateurs en 1997.'" est présentée

au schéma 17:

CH300C OH NaOH CH300C OH CH,O&&COICH, MeOH ) CH~O~C&CO,H

1. (-)-brucine 2. crist. fract. 3. HCI

Le citrate de triméthyle (m, préparé selon une méthode connue.J2 est converti

en 1.2-diméthylcitrate (36) par une saponification contrôlée. On forme ensuite les sels de

(-)-brucine. suivi d'une cristallisation fractionnée. La configuration a été déterminée par

rayon-X. L'excès énantiomérique est de 99%. mesuré par spectroscopie RMN d'un dérivé

formé par acy lation avec le (S)-(-)-sec-phenylethy 1 alcohol.

La pureté énantiomérique est excellente. mais le rendement globai est très faible

(moins de 10%).

2.2 Méthode de Ancliff

La méthode d 'hc i i f f et ses collaborateurs. publiée en 1997.'~ est présentée au

schéma 18 :

1. (R)/(S)cr-MBA O 7 2. crist. fract.

3. HCI w 046 OU (SI-(-)-= HO& C02Me 20% H02C C02Me

(*)-rn (R) - (+ ) - rn

Schéma 18

Le dérivé rnéthylester racémique (m) est préparé à partir de l'acide citrique. Ce

mélange est dissous dans I'éthanol et traité avec la (S)-a-méthylbenzy lamine (MB A).

Après une seconde recristallisation dans l'éthanol et un lavage avec une solution aqueuse

faiblement acide. le (R)-(+)-37a est récupéré. Les eaux-mères sont traitées en milieu

acide. puis on répète le même processus avec le (R)-MBA pour obtenir le (S)-(-)-m.

Cette méthode fournit un dérivé citrate chiral avec un rendement global de I l %

en 4 étapes (la quatrième étape incluant le long processus de résolution) à partir de l'acide

citrique et avec un e.e. de 90%.

3. Désymétrisation enzymatique

Les deux méthodes de désymétrisation enzymatique suivantes ont été mises au

point comme alternative aux résolutions chimiques présentées ci-dessus. La première. à

partir du citrate de triéthyle (38) et la deuxième. à partir des esters d'acétal J2' font l'objet

de ce mémoire. Ces résultats ont d'ailleurs déja été publiés.""

3.1 Désymétrisation

PH 7

Le citrate de triéthyle

méthode est rapide. puisqu'on

enzymatique du citrate de triéthyle dans un tampon

(38) est un composé disponible commercialement. Cette

en fait directement l'hydrolyse en milieu aqueux (tampon

phosphate). Deux diesters ont ité obtenus. selon l'enzyme utilisee (tableau 6): l'un est

chiral (39) et de configuration absolue R. tandis que l'autre est symétrique (m.

Tableau 6: Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle,

h la température de la pièce, dans un tampon pH 7

m e H"fico2Et evou tampon

Et20C C02Et H02C C02Et H°Ko2H

Et02C C02Et

38 - - 39 40 - Enzyme Durée Rendement Régiosélec tivité e. e.

(jours) (%) rapport 39/40 (y4

u-chym 8 85 - 40 seulement - S-C 0.5 80 t 1 -

S-BPN' 4 80 I I - CAL 3 82 - 39 seulement 90

ANL 38 85 19/ 1 90

PLE (7 h) 85 4 / 1 90

L'hydrolyse en présence d'une des trois protéases a serine (a-chymotrypsine.

subtilisine carlsberg et subtilisine BPN') est très régiosélective. donnant exclusivement le

diester symétrique a. Ceci est intéressant du fait que seulement Ir groupement acide le

plus encombré est affecté.

La lipase de Candida nntarctica (CAL) produit exclusivement le diester chiral

( R ) - o avec un excellent rendement (90%) et e.e (90%). Celle de I'.lspergiIlus niger

(ANL) produit majoritairement le diester chiral ( R ) - 2 (avec une faible proportion du

diester symétrique 40). avec un rendement et un exces énantiomérique comparables. mais

dans des délais trop longs.

Finalement. l'estkrrise de foie de porc produir aussi majoritairement le diester

chirai (R)-39: mais dans une proportion plus faible qu'avec ANL (4:l). Le temps de

réaction est par contre relativement court.

Dans tous les cas. les diesters chiraux obtenus étaient dextrogyres (+).

3.2 Désymétrisation enzymatique du citrate protégé

3.2.1 Préparation des diesters protégés a

La deuxième désymétrisation utilise le diacide protégé de la méthode de

Ancliff. L'acide citrique (30) est protégé par fusion dans le paraformaldéhyde. Le diacide

;11 est ensuite estérifié par retlux dans le méthanol ou l'éthanol. en milieu acide. Ces deux

diesters et $2J ont été utilisés dans les essais enzymatiques.

HofiCo 2" (CH ROH, H*, (CH3)2C(OW 2.

DMSO, A reflux, 85% R02C C02R

H02C C02H 6710 H02C C02H

R=Me, 42a Et,

Schéma 19

3.2.2 Hydrolyse enzymatique des diesters 42, dans un tampon pH=7.

La majorité des essais, présentés au tableau 7. ont été effectués dans un tampon

phosphate. d'abord avec 10?6 d'acétonitrile. puis sans ce CO-solvant (avec de meilleurs

résultats).

Tableau 7 : Hydrolyse enzymatique des diesters 42,

à la température de la pièce, dans un tampon pH 7

R = Me, 4 2 R = W , 37a - 36 Et, 42b Et, gJ

Enzyme Substrat Solvant Durée Résultat emem (CO-solvant) (rendement) (%)

CAL J2a tampon i l j 42a - PPL 42a ( 1 O?/, MeCN) 1 1 j 42a - ANL 43a

CCL 42a

Ps sp 4% i l j 4% - PLE J3a 2 h 37a (60 %) 85

PLE 42 b 2 h 37b (50 %) 8 1

PLE 42a tampon 2 h 37a (75 %) 90

PLE "' 42b 3 h 37b (82 %) 90 -

PLE '!' 42a 2 h 37n (85 %) 92

a-chym. 42a 24 j 42a (2%). 36 (7%) -

3 : PLE d'une source differente (Aldrich)

L'ajout d'acétonitrile. même s'il facilite la solubilisation du substrat et accélère

légèrement la vitesse de réaction. diminue le rendement et la stéréosélectivité de

l'hydrolyse. Ces résultats seront discutés plus en détail a la section 5.

3.2.3. Hydrolyse enzymatique des diesten 42, dans un solvant

organique saturé en tampon pH 7.

L'hydrolyse a été tentée sur les diesters d'éthyle J2b et de méthyle m. en milieus

organique, mais avec la seule enzyme ayant démontré de l'activité en milieux aqueux.

PLE. Les résultats se retrouvent au tableau 8.

Tableau 8 : Hydrolyse enzymatique des diesters 42, à la

température de la pièce, dans un solvant organique saturé en tampon pH 7

R=Me, 42a R = M e , 37a Et, 42b Et, 37b

Enzyme Substrat Solvant Durée Résultat

PLE 42b DIPE 1 5 j 42b

42a 15 j 42a

4Sa benzène 7 j 42a

42a CHICI? 7.i 4Sa

II semble que l'utilisation d'un solvant organique nuise a l'activité catalytique de

l'enzyme. peut-être parce qu'il la dénature ou qu'il modifie l'arrangement spatial de son

site actif.

3.2.4 Estérification enzymatique du diacide protégé fi dans le DIPE.

Pour compléter ce projet, deuv estérifications enzymatiques ont été tentées sur le

diacide protégé à l'aide de la PLE. avec le méthanol ou l'éthanol dans le

diisopropyléther. mais sans succès. comme le démontre le tableau 9.

Tableau 9 : Estérification en y matique du diacide &i

dans le DIPE anhydre, à In température de la pièce

enzyme ROH

R = & , 37a Et, 37b

Enzyme Alcool Durée Résultat

PLE MeOH 7 j 4 I

E ~ O H 7 j 4 1

3.3. Détermination des excès énantiomériques

Tous les excès ont été dkterminés en faisant réagir les produits obtenus avec EDC.

DMAP et la (S-)-(-)-(1-naphty1)éthylamine (NEA). Une réaction avec un mélange

racimique a démontré une intégration similaire pour les deux diastéréoisorneres.

La réaction avec le diester 3<) (obtenu de la première désymétrisation. tableau 6)

s'est déroulée normalement, avec la formation d'un lien amide sur le groupement acide

libre (schéma 20) pour donner le composé a. On observe une séparation des pics des

diastéréoisomères en RMN 'H, ce qui permet de déterminer les e.e. Les doublets dus au

proton de l'azote sont dédoublés en 6.39 et 6.48 ppm (NH).

'OzH EDC, DMAP

Schéma 20

Dans le cas de la réaction avec les diesters 37a-b de la deuxième dtisymetrisation

(tableau 7). il y a d'abord formation d'un lien amide avec le groupe acide libre résultant au

composé Ma-b. puis une seconde attaque sur le groupement acide protégé par un ester

d'acital. pour former une imide cyclique I - b (schéma ? 1 ).

L'ester d'acétal est relativement stable en milieu Faiblement acide (estérification au

schéma 19). mais non en milieu basique (présence d'amines). On peut croire que ce

carbonyle est activé et donc vulnérable à une attaque de l'azote. ce qui permet la

cyclisation observée. La structure a été confirmée par analyse RMN. C r phinomène a

déjà ité obsrnC entre le composé j7a et un dérivé de base et un dérivé de base azotie."'

Les imides cycliques sont Ctudiés comme des tranquilisants et neuroleptiques.'" mais

aussi comme agent anti-cancer et a n t i - ~ ~ ~ . ' ' ~

On peut déterminer les ex. grâce à la séparation des pics des diastéréoisomères en

RMN 'H. Dans le cas de l'imide a. on peut utiliser le doublet de 3.57 ppm (CH2) ou le

singulet de 3.49 ppm (COICH3). Par contre. pour l'imide Jjb. on ne peut recourir qu'au

doublet de 2.55 ppm (CH?).

R = M e . 37a Et, 37b

EDC. DMAP

R=Me, Et, 44J

R - M e , !l5iJ Et, @

Schéma 21

4. Détermination des configurations absolues

Cetie détemination des configurations absolues s'est faite par corrélation avec des

composés de configuration déjà connue. Bergeron a déterminé que son diméthylester

possédait une configuration R et était dextrogyre (+).'"

I l faut donc que les produits des hydrolyses enzymatiques soient convertis en ce

compos~. selon le schéma 22. S'ils sont toujours dextrogyres. on pourra conclure qu'ils

sont Çgalernent de contiguration absolue R.

OMe OEt

EtOH, EtjN, reflux. 60% t

Schéma 23

Le méthylester protégé z. transformé en diméthylester par retlux dans le

méthanol (et triéthylamine). est dextrogyre et donc de configuration R. Converti en

diéthylester j9 par transestérification dans I'éthoxyde de sodium. il demeure R-(+).

Le diéthylester 39' obtenu par hydrolyse enzymatique du citrate de triéthyle (38)

ou par ouverture de I'éthylester protégé 37b. reste dextrogyre. Ce composé est donc

kgalement de configuration R.

5. Activité enzymatique

Toutes ces hypothèses pourraient être éventuellement étudiées plus profondément

dans un projet de modélisation moléculaire.

5.1 Lipase de Candida antarctica (CAL) *'

La CAL. contrairement h la majorité des lipases. ne nécessite pas une interface

eau-huile pour être activée. On la considère souvent comme un intermédiairs entre les

lipases et les estérases.

L'enzyme est robuste. Elle est stable dans un milieu aqueux de pH 3.5 a 9.5. On

peut la chauffer jusqu'à 50-60°C sans la dénaturer. Elle réagit bien avec plusieurs

solvants organiques et endure la plupart des agents acylants (même ceux libérant de

l'acétaldéhyde. comme les esters vinyliques).

Le site actif de la CAL est plus petit que celui de la majorité des autres lipases. ce

qui est un des facteurs expliquant sa sélectivité. L'intérieur du site est couvert d'acides

aminés hydrophobes. à l'exception de trois résidus hydrophiles (serine. acide aspartique et

histidine: revoir le schéma 5 pour les hydrolases à serine). Ce site est composé de deux

"canaux". un pour le groupement acyle et I'autre pour l'hydroxyle du substrat. le premier

étant plus spacieux que le deuxième. Le schéma 4 présentait un exemple de

désymétrisation de tétrahydropyranes par la CAL.

Cette lipase convertit le citrate de triéthyle (18) en citrate de diéthyle chiral

(R)-(+)- avec un excellent recdement (82%) et c.e. (90%). Par contre, dans le cas des

diesters protégés 423-b, elle n'est pas efficace. La différence entre les composés est

l'absence d'un hydroxyle libre dans les molécules 42a-b. Ce groupement OH, devant

occuper le "canal hydroxyle" du site actif. semble donc nécessaire pour que le substrat

soit reconnu et transformé par la CAL.

5.2 La protéase a-chymotrypsine

De la famille des chymotrypsines. la a-chymotrypsine est la mieux connue. Elle

consiste en 241 acides aminés. répartis en 3 polypeptides séparés mais reliés par 5 ponts

disulfures. ln vivo. c'est une "protéine endopeptidase" et elle catalyse l'hydrolyse

spécifique des liens peptidiques adjacents à une phénylalanine. tyrosine ou iryptophane.

La u-ciiyrno~psint: est moins robuste que la CAL. Dans un pH de 6 ii 9. i l a

Cventuellement un phénomène d'auto-destruction autolytique. Le pH optimum est de 7.8.

.i pH faible. l'enzyme peut Ztre conservé pendant 1-2 jours. Plusieurs solvants organiques

agissent comme inhibiteurs forts de l'enzyme (comme le diCthyl Çther) même d faible

concentration.

Le schéma 23 présente le modèle de ohe en'" du site actif de l'enzyme. En (a) on

retrouve un substrat connu de l'enzyme. le méthylester de la IV-acétyl-L-phénylalanine et

en (b). le citrate de triméthyle (38).

I I y a quatre sites. Le premier. fi. est l'endroit ou un ester ou une amide subit une

attaque par un nucliophile (par exemple. l'eau). Le site - est hydrophobe et

suffisamment large pour accommoder un groupement aromatique. Le site est l'endroit

où l'amide se lie avec l'enzyme. Finalement. le site h ne peut quand à lui contenir qu'un

petit groupement. comme H. OH ou Cl (mais pas CH3).

- Schéma 23

L'action de cette protéase convertit le citrate de triéthyle (-1 en diéthyle

symétrique a. L'hydroxyle va nécessairement dans le site h. Les deux chaînes. plus

longues. L seront plus facilement accommodées dans les sites - et m. Finalement. l'ester

le plus court (tel dans le schéma 23-a) pénétrera dans la section a. ou il sera hydrolysé.

Étant donné que le composé n'a pas été observé. il semblerait que l'enzyme ait une

préférence dans la répartition des groupements dans le site actif.

Par contre. dans le cas du citrate protégé m, après presque un mois. on obtient

une faible quantité de citrate de diméthyle (ouverture du cycle) et de produit de dépan.

La partie cyclique du composé J2a semble rendre l'accès au site actif plus ardu. La

réaction n'a pas kté énantiosélective. ce qui signifie probablement qu'il pourrait y avoir

ru une transestérification entre deux molécules du composé pour donner le composé

36. -

5.3 L'estérase de foie d e porc (PLE)

Seulement quelques vraies estérases. comme I'estérase de foie de porc (PLE) et de

cheval (HLE). ont été utilisées en synthèse organique (et sont disponibles sur le marché).

L'ac~tylcholine estérase (ACE). isolée de l'anguille Clectrique. a démontré une sélectivité

exceptionnelle dans plusieurs cas. mais de par son origine. son utilisation s'avère plutôt

coûteuse.

Le rôle biologique de la PLE est l'hydrolyse des différents esters retrouvés

dans la diète du porc. ce qui pourrait expliquer son exceptionnelle versatilité. Cette

enzyme est très complexe. consistant en au moins 5 iso-enzymes. associées en trimères

de trois protéines individuelles.'l%r contre. du point de vue d'un chimiste organicien. ce

mélange peut être considéré comme une seule enzyme. Ctmt donné que les iso-enzymes

possèdent habituellement la même stéréosélectivité. On a cependant rapporté récemment

quelques exceptions."9 Par conséquent. la sélectivité de PLE peut varier selon la source et

le pr6-traitement qu'elle a subi. Ce phénomène a été observé au tableau 7. dans

l'hydrolyse des diesters 42a-b.

Une adaptation d'un des plus récents modèles du site actif de la PLE, publié en

1993 par Provencher et ses collaborate~rs,~~ est présentée au schéma 24. Il y a quatre

"poches" dans ce site. Dew sont hydrophobes (HL étant plus grande que Hs). tandis que

les deux autres sont plus polaires (PF étant celle de devant et PB, celle à l'arrière).

En (a) on retrouve le citrate de triéthyle (38) avec les deuv esters plus

hydrophobes dans les poches latérales (HL et Hs), l'hydroxyle dans la poche polaire du

devant et le troisième ester lié à la serine (et donc celui qui sera hydrolysé). Cette

disposition des substituants donnera le diester symétrique a. En (b). l'ester le moins

hydrophobe est placé dans la poche Hs. tandis qu'un des deux autres esters entre en

présence de la serine. Cette configuration donnera le diester (R)-(+)-B.

Étant d o ~ e son volume plus petit, la poche Hs accommodera plus facilement

l'ester le plus court (b). Ceci est en accord avec les résultats du tableau 6, qui mentionnait

un rapport de 4 : 1 pour les composés j 9 l a.

Schéma 24

Au schéma 25. le même modèle est appliqué aux diestcrs 42a-b. Dans ces cas. il

semble qu'un des esters se loge dans la poche HL, tandis que l'autre se lie à la serine.

L'ester d'acétal occuperait vraisemblablement une partie des poches Hs, PF et PB. Les

composés (R)-(+)-37a-b pourrait alors être obtenu.

schéma 25

6. Conclusions

Deux techniques de désymétrisation permettant d'obtenir des dérivés de l'acide

citrique. avec d'excellents rendements et excès énantiomériques, ont été exposées dans

cette partie. Le tableau 10 permet de comparer celles-ci avec les deux résolutions

chimiques présentées dans la section 2.

Tableau 10 : méthodes de préparation de citrates chiraux

Méthode # étapes Rendement e.e. configuration (%) ("/.)

Bergeron 3* < 10 99 (Rb(+)

section 3.1 1 82-85 90 (RI-(+)

section 3.2 3 48 00 (RH+)

* : en incluant dans une seule étape la formation des sels, les recristallisations et l'hydrolyse

Les méthodes des sections 3.1 et 3.2, respectivement à partir du citrate de aiéthyle

(38) et du diacide a sont plus simples et plus rapides que les approches précédentes,

tout en étant plus efficaces. Par contre, contrairement a celle d'hcliff, elles ne permettent

pas d'obtenir directement les deux énantiomères des dérivés citrates.

7. Perspectives

Cette section propose quelques composés qui pourraient être synthétisés à partir

des dérivés citrates exposés dans ce mémoire. dans des projets futurs.

7.1 Topostine 6

Les ADN topoisomCrases sont des enzymes catalysant le bris et le rattachement

concerté de l'ADN. permettant ainsi l'accès au code génétique qui serait autrement

inaccessible. On étudie plusieurs inhibiteurs de ces enzymes, dans l'espoir de mettre au

point un agent anti-cancer efficace.

Une famille de tels inhibiteurs est nommée topostine B (46). Elle a été isolée de

Flexibacter iopostinus en 1990 par Andoh et ses collaborate~rs.~~ En fait, c'est un

mélange qui a été analysé. On a découvert deux types de topostine B très semblables l'un

de l'autre. que l'on a appelé simplement B-1 (-1 et B-2 (46b). La structure exacte de la

topostine n'a pas encore Cté déterminée, tout comme la stéréochimie de la liaison double

et la configuration du centre chiral. II semblerait que les topostines possédant des chaînes

dont les indices m+n sont de 25 ou 26 se révèlent meilleurs inhibiteurs. On peut

également la retrouver sous forme cyclique (lactone).

R2-(cH'm 4 (cH?),-R'

HO

Topostine 8-1 : R' = CONU, R~ = Me ,

Topostine 6-2: R' = Me, R~ = CONH2. 46q

m + n = 25,26 (E) ou (Z), (S) ou (R)

Une approche de synthèse de ces composés a éti réalisée. mais elle ne contrôlait

pas le centre chiral." En utilisant les dérivés chiraux de ce mémoire. il serait possible

d'accomplir la synthèse Cnantiosélectivement. tel que le présente le schéma 76.

Schéma 26

L'acide citrique (a). transformé en dérivé chiral. est convertit en di01 fl dont un

des groupements est protégé. Le groupement alcool libre est oxydé en aldéhyde fi puis

transfomi en composé fi par une réaction de Wittig. suivie d'une hydrogénation.

L'alcool est ensuite déprotégé puis oxpdi en aldéhyde 3. Une deuxième réaction de

Whig donne le composé protégé a. que l'on hydrolyse en topostine 46a-b.

7.2 La malyngolide

La (-)-malyngolide (52) est un antibiotique isolé de l'algue marine bleu-vert,

Lyngbya rnajicscda et dont la structure est présentée ci-dessous. Quelques synthèses ont

été proposées. dont une à partir de l'acide (-)-quinique (53).j3

La synthèse proposée au schéma 27 est très semblable à celle des topostines

(schéma 16) . À partir de l'acide citrique 3l, convertit en dérive chiral g. on réalise a

deus reprises une série de déprotection. oxydation de l'alcool. réaction de Wittig et

hydrogénation pour obtenir le composé 2, qui après hydrolyse basique (KOH) et acide

(HCl). donnera la (-)-malyngolide (2).

31 - 47 54 C02Et -

Schéma 27

C. Résolution et désymétrisatjon enzymatique de tropanes

1. Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des composes azotés naturels que l'on isole particulièrement

des plantes. Plusieurs de ces composés ont des propriétés pharmacologiques très

marquées. '"

1 .1 Pipéridines (et dérivés)

La stmcture de base d'un alcaloïde de type pipéridine est un cycle à 6 atomes.

dont un d'azote. ce qui lui confere la propriété d'une base faib1e.15 Parmi les composés

connus. il y a l'alcaloïde l J l D (55). un des composants majeurs du poison de la

grenouille Dencirobates speciosid6. 1'histrionicoto.uine (56). d'origine similaire et

l'épimyrtine (57). On s'intéresse à ces produits dans l'espoir de développer des analogues

ayant des propriétés pharmaceutiques.

1.2 Tropanes (et dérivés)

Les propriétés chimiques et pharmaceutiques des tropanes leur procurent une

place parmi les plus importants alcaloïdes. Le squelette de base des tropanes est le

nortropane. soit l'azabicyclo[3.2.1]octane.57 On présente la cocaïne (-), l'épibatidine

(3) et la femginine (60) en exemple.

1.2.1 la cocaïne

La cocaïne. un alcaloïde extrait des feuilles de 1'Eryrhro.xyZan coca. est une des

drogues créant le plus la dépendance chez les consommateurs. Elle constitue un grave

fléau au niveau de la santé publique.58 II faut mentionner que l'énantiomère naturel. le

(R)-(-)-cocaïne. est environ 200 fois plus puissant que l'autre. la (S)-(+)-cocaïne.

1.2.2 L'épibatidine

L'épibatidine a Cté isole de la grenouille vénéneuse Epipedobares rricolor en

1997.j9 Ceci a nécessité l'extraction cutanée de 750 spécimens pour accumuler

suffisamment de produit (500 pç) pour Clucider sa structure. I l semble en effet que la

grenouille puise dans son alimentation les éléments essentiels a la biosynthèse de

I'épibatidine.

On a démontré que I'épibatidine posside un effet analgésique 200 fois supérieur à

celui de la morphine. et par la suite les recherches ont indiqué un effet sédatif de longue

durée (3-4 heures) et la mort pour des doses trop élevées. Par contre, il ne semble pas y

rivoir de dépendance au composé. C'est pourquoi il a servi de modkle à de nombreux

analogues, toujours dans l'espoir de mimer ses propriétés analgésiques. mais de réduire sa

toxicité.

II a fait l'objet de nombreuses synthèses. la plupart étant racémique. Une des

stratégies adoptées, présentée au schéma 28, est la formation du squelette bicyclique a par cycloaddition d'un pyrrole N-protégé fl avec un sulfone déthynyle On

additionne le dérivé méthoxy-pyndine 64, puis on réalise une désulfonation avec un

amalgame, pour obtenir le composé a. Une réaction sous les conditions de Vilsmeier.

puis une hydrolyse en milieu acide permettent d'obtenir l'épibatidine (2).

1) POCS ( 2) 2M HCI, L\

Schéma 28

Une autre approche est d'utiliser la tropinone et de contracter le cycle à l'aide

d'un réarrangement de Favorskii (schéma 29)". La tropinone &3 est transformée. par du

chloroformate d'éthyle. puis bromure de cuivre. en dérivé a. Le méthoxyde de sodium

permet d'accomplir le réarrangement en composé a. Une a-sélénation. suivi de

l'élimination de sélénoxyde, introduisent une double liaison et donnent le composé B. On lui couple le dérivé de pyridine (70) par catalyse au palladium, pour obtenir le

composé 71. L'hydrolyse. suivie d'une décarboxylation radicalaire de Barton fournit le

composé 2. Une déprotection a l'aide du MeiSiI donne enfin I'épibatidine (m.

COzEt CQ2Et \

Jk I).."",""OL

&y3; 2) CuBr2 C02Me

66 - 67 - 1) LDA

2 ) PhSeBr

3) H202

OS ONa 1

Schéma 29

1 -2.3. La ferruginine

La (+)-ferruginine (60). une puissante neurotoxine. a été isolée des plantes

Duriingianrr ferrzrgineah7 et LI. darlingionah3. Elle a fait 1'0 bjet de plusieurs synthèses

Le schéma 30 donne un exemple. La réaction du vinylcarbenoïde a avec des N-

(alkoxycarbony I) pyrroles 74,@ catalysée par de l'octanoate de Rhodium (II), suivie d'une

hydrogénation avec le cataiyseur de Wilkinson donne la structure 75. Une déprotection

avec le fluorure de tétrabutylammonium (TBAF), suivie d'une méthylation réductive avec

formaldéhyde aqueux et cyanoborohydrure de sodium foumit enfin la femginine (60)

racémique.

COMe

PR + :> 2 ) 1 ) Rh2(00C-çH15)4, (PPh3)3RhCI,

- - "2 aCoMe

Schéma 30

Rapoport et ses collaborateurs ont mis au point une mithode permettant d'obtenir

I'un ou l'autre des énantiomères. par cyclisation intramoléculaire d'un ion iminium dérivé

de l'acide pyroglutamique.h5 mais elle est longue et le rendement en est faible.

La méthode de l'équipe du Dr ~ o ~ e r . ' ~ permettant de synthétiser I'énantiomère

(+)-a en 7 Ctapes (une huitième. pour la préparation du composé de départ. l'oxazolo-

pyrrolidine "1. est présentée au schéma 3 1.

La pyrrolidine est alkylée en dérivé 77: puis le groupement cyano est éliminé

dans un mélange de lithium et d'ammoniaque pour donner le composé B. Après

déprotection en milieu acide. il est converti en dérivé 3 à l'aide d'un phosphonate. Celui-

ci subit un réarrangement. lors de conditions acides, en composé bicyclique 80, qui est

converti en dérivé N-méthyle fi. L'élimination de méthanol par catalyse acide résulte

enfin en (+)-ferruginine (a).

Ph,, Ph., Ph,, A LDA

___C)

n N C ~ ' R-Br

78 - 1) HCI

Ph,, n

Schéma 31

La (-)-ferruginine. non-naturelle. est un bon agoniste du récepteur acétylcholine et

peut étre obtenue rapidement à partir de la (-)-cocaïne 3 (schéma 32)". À partir de (-)-

58. après une hydrolyse acide. puis basique. on obtient le sel de lithium u. qui est - converti en (-)-ferruginine (60) par réaction avec du MeLi.

Schéma 32

1.2.4 La tropinone et la pseudopelletierine

Ces deux dérivés des tropanes interfèrent en plusieurs points du système nerveux

central (SNC). Leurs analogues sont considérés, entre autres. comme agents potentiels

neuroleptiques et anti-parkinsoniens. d'oh l'intérêt pour des dérivés chiraux de ia

tropinone (m) et de la pseudopelletierine (8jb). Les approches conventionnelles sont

des résolutions chimiques. -N

\ N

2. Résolution chimique de la pseudopelletierine et tropinone

Carroll et ses collaborateurs ont mis au point une méthode permettant d'accomplir

la résolution chimique de la pseudopelletierine et de la tropinone (schirna 33)." A partir

d'un dérivé méthoxycarbonylé 8- (dont la synthèse sera présentée à la section 3.1). on

forme des bitartrates avec l'acide L-(+)-tartrique. puis l'acide D-(-)-tartrique. pour obtenir

après cristallisation Fractionnée. le R-(+)-8J énantiomérique a Cté évalué à plus de 90%.

acide tartrique (30%) (

1 : 2-(methoxycarbonyl) tropinone, 84a

et le S-(-)-fl respectivement. L'excès

2 : 2-(methoxycarbonyl)pseudopeIletierine, 84b

Schéma 33

La faiblesse de cette méthode, comme dans le cas des autres résolutions

chimiques, est un faible rendement (30%) et de longues manipulations. La partie suivante

porte sur les essais de résolution enzymatique de ces deux dérivés tropanes.

3. Résolution enzymatique de la pseudopelletierine et de la tropinone

Les efforts de résolution se sont portés uniquement sur la pseudopelletierine. Étant

donné la similitude entre les deux structures. il est raisonnable de croire qu'une enzyme

permettant la résolution de la pseudopelletierine donnera des résultats comparables avec

la tropinone. bien qu'il puisse évidemment y avoir des différences dans le rendement et

l'excès énantiomérique.

Lorsqu'une enzyme aura démontrée une certaine activité avec la

pseudopelletierine. elle sera ainsi testée également sur la tropinone. Ceci évitera la

multiplication inutile des essais enzymatiques.

3.1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone

On peut obtenir la pseudopelletierine et la tropinone gràce à une réaction

"one-pot". dite de Robinson (schéma 34). bien que la tropinone soit disponible

commercialement.

Schéma 34

On mélange un dialdéhyde avec de la méthylamine et de l'acide acétonedicar-

boxylique dans un tampon phosphate. Après 24h. on ajoute de l'acide chlorhydrique afin

de permettre la décarboxylation et d'obtenir ainsi le composé désiré.

Cette réaction est en fait une double réaction de Mannich. Son mécanisme est

présenté au schéma 35.

Schéma 35

I l y a d'abord une première condensation de la rnéthylamine sur l'aldéhyde. suivi

de la formation d'un lien avec l'acide acétonedicarboxylique (qui est en Cquilibre avec sa

forme énolique). II y a ensuite une deuxième condensation de l'amine sur le groupement

aldéhyde libre. puis formation d'un nouveau lien. Après environ ?4h. on obtiendra le

dicarboxylate. qui est décarboxylé par reflux en milieu acide.

3.2 Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés de la pseudopelletierine et

de la tropinone

tropinone (m) sont préparés à partir des composés 8jb et 8)a. respectivement. par la

même méthode (schéma 36). Une base permet d'arracher un proton en position a de la

cétone. Il y a ensuite addition du méthoxycarbonyle. Les produits 84a.b obtenus sont

racémiques. -N

NaH, (CH 30)2C=0,

( lHF,3,80% * (

n = 1 :tp, && 2 : pp, 83b

Schéma 36

Les composés carbony lés 84a. b présentent certaines particularités. Le 84b se

retrouve presque exclusivement sous forme énolique (schéma 37). La forme cétonique

n'est pas observée en RMN 'H. Ce composé présente une certaine instabilité (par

exemple. en milieu aqueux).

cétonique enolique

Schéma 37

En solution. le composé se retrouve quant à lui. en équilibre de trois formes:

deux cétoniques (endo et exo) et une énolique (schéma 38). Ces trois formes. observables

en RMN 'H. compliquent l'analyse spectrale. Ce dérivé est encore plus instable que le

composé 84b (et se décompose éventuellement. même s'il est conservé sous 0°C).

exo-cét~n iq ue enolique endo-cétonique

Schéma 38

À cause de l'équilibre des formes cétonique et énolique des composés 84ab, on ne

saunit déterminer I'approche de l'introduction du groupement COOMe (exo ou endo).

3.3 Approches de résolution enzymatique de la pseudopelletierine

Comme il est mentionné ci-dessus. les essais enzymatiques ont été effectués sur la

pseudopelletierine. Le schéma 39 présente les différentes approches tentées et qui seront

abordées plus en détail dans les sections suivantes.

(*)-W

agent acy lant

enzyme Hz0 - OAc

Schéma 39

L'approche la plus simple consiste à faire des essais d'hydrolyse enzymatique sur

le composé 8Jb (sections 3.3.1 et 3.32). Dans un cas idéal. un seul des deux

énantiomères serait hydrolysé (et se décarboxylerait spontanément pour redonner la

pseudopelletierine).

Les deux autres approches sont normalement complémentaires (c'est-à-dire qu'une

même enzyme pourrait donner les deux énantiomères, selon la voie utilisée). La première

consiste en une acétylation enzymatique de 8Jb (qui est presque exclusivement sous

forme énolique), idéalement sur un seul énantiomère (section 3.3.3). La seconde requiert

d'abord l'acétylation chimique du composé 8Jb. Cet acétate racémique 85 sera ensuite

soumis à des hydrolyses enzymatiques (section 3.3 5).

3.3.1 Hydrolyse enzymatique des composés 84a-b, dans un

tampon pH 7

Les premiers essais d'hydrolyse enzymatique sont présentés au tableau 1 1.

Tableau 11 : Hydrolyse enzymatique des composés 8Ja-b,

à la température de la pièce, dans un tampon pH 7

( tampon 84a-b

n = 1 : 84a I-COÎ 2: && 83a-b

Substrat Enzyme Durée Résultat

(*)-84b PLE 3 j 83b t t PPL 10 j (+-)-84b

CAL

ANL t I CCL t l I l

I l Pen sp II II

CRL

Can sp

GCL 11

I l PCL t l II

9 1 WGL II l t

(+84a PLE 3 j 83a

Dans les essais avec la PLE des composés 8Ja-b. l'hydrolyse est complète. après

environ 3 jours. Elle ne semble pas stéréosélective. Dans un essai avec la même enzyme

et le con~posé 8Jb, mais en additionnant quelques gouttes d'un émulsifiant (triton-X). la

réaction semble s'arrêter d'elle-même après l'hydrolyse d'environ 50% du substrat

(déterminée par c m ) . Par contre jusqu'h maintenant. seule la pseudopelletierine (8jb) a

pu être isolde. ce qui ne permet pas de déterminer 1'r.e.

Étant donné la similarité entre les composés 84a-b, il n'a pas été jugé nécessaire

de hire tous les essais en double.

On a observé d'infime trace d'hydrolyse dans tous les essais. mais elles sont

attribuées à une hydrolyse chimique. due à une certaine instabilité des composés Ma-b

dans un milieu aqueux. Un blanc (c'est-à-dire un essai sans enzyme) a permis de

confirmer ceci.

3.3.2 Hydrolyse enzymatique du composé 84b, dans le benzène saturé en

tampon pH 7

Seulement quelques enzymes ont été choisies pour ces tests. en se basant sur les

hydrolyses en milieu aqueux. Les résultats se retrouvent au tableau 12.

Tableau 12: Hydrolyse enzymatique du composé 84b,

à la température de la pièce, dans le benzène

kzMe OH benzène - 84b

(i)-84b

pseudopelletierine

Enzyme Durée Résultat

PLE 10 j (&)-84b

CAL Pt (cl-84b

PPL 91 (*)-84b

On note que la PLE a perdu toute son activité en milieu organique. tandis que les

autres se révèlent toujours aussi inefficaces.

3.3.3 Acétylation enzymatique du composé 84b, dans un solvant

organique anhydre

Les acétylations enzymatiques sur le composé && ont été réalisées dans divers

solvants et m e c deux agents acylants différents. l'acétate de vinyle (AV) et

dlisopropényle (-41). Les résultats sont présentés au tableau 13. Aucune acétylation n'a Bté

observée.

Tableau 13: Acétylrtion enzymatique du composé m, à In température de la pièce, dans un solvant organique anhydre

\ \

erIym=, + &zMe AV ou Al OAc

C02Me

Enzyme solvant agent Durée Résultat acy lant

PLE benzène AV 10 j (2)-84b

CAL I I

PPL II

PLE CHIC12 AI 17 j I i

CAL I I

PPL Il

CAL cyclohexane AV 15 j t l

3.3.4 Acétylation chimique de la pseudopelletierine

L'acétylation du dérivé &J est accomplie avec le chlorure d'acétyle en milieu

basique. tel que présenté au schéma 40. Ce composé. l'acétate a, doit servir de référence

lors des acétylations enzymatiques du composé 8Jb. Il sera également utilisé dans des

essais d'hydrolyse enzymatique (section suivante).

Schéma 40

3.3.5 Hydrolyse enzymatique du composé û5, dans un tampon pH 7

Faute de temps. un seul essai a éti tenté avec l'acétyle estérase (AE), mais i l s'est

révéiti un échec (tableau 14).

Tableau 14 : Hydrolyse enzymatique du composé û5,

h la température de la pièce, dans un tampon pH 7

\ \

enzyme #

eau OH OAc OAc +- C02Me + a.M=

(*)-85 (+) ou (-)-M (-) ou (+)*

Enzyme Durée Résultat

AE 12j (+85

4. Synthèse formelle de la ferruginine

Le schéma JI présente la synthèse formelle de la femginine (a) qui a été

accomplie au cours de ces travaux

'OzMe (CF 3S02)20. pyr. C02Me

CH2C12, 0°C - ~ .P .w& On -

Schéma 41

Le composé & est transformé en triflate de vinyle &, puis converti en alcéne

87a." Ce composé est ensuite hydrolysé en sel lithien de l'anhydroecgonidine 8& puis - l'action du MeLi donnera la ferruginine & (comme présenté au schéma 32Lbn

Les composés 84a. 85a et ont été isolés et caractérisés. Les deux dernières

étapes ont déjà été réalisées par Campbell et ses collaborateurs (1977).

Lorsqu'une méthode de résolution enzymatique aura été mise au point, il sera

alors possible de synthétiser l'un ou l'autre des énantiomères de la ferruginine.

5. Activité enzymatique

Une seule enzyme. la PLE. a démontré une activité catalytique. lors de l'hydrolyse

des dérivés 84a-b (revoir tableau I I ) . Par contre. elle n'était pas stéréosélective. Cette

enzyme a déjà été discutée à la section 5.3 de la partie B. lors de la désyrnétrisation des

citrates js et 42a-b (revoir les schémas 24 et 25).

.4u schéma 43. le modèle du site actif est présenté avec les composés 84a-b.

L'ester se lie avec la serine pour ensuite subir l'hydrolyse et ['hydroxyle ira peut-être dans

une des deus poches polaires (PF OU PB). Le reste de la molécule pourrait se loger dans

une des poches hydrophobes (probablement la plus large. HL). Mais quoiqu'il en soit.

étant donné l'absence de sélectivité. les substituants de la molécule ne doivent pas se lier

fortement et spécifiquement dans les différentes poches du site actif.

Schéma 42

6. Conclusions

Une résolution enzymatique a été tentée sur deux dérivés tropanes, la 2-

(rnéthoxycarbonyl)-tropinone (m) et la 2-(méthoxycarbony1)-pseudopelletierine (84b),

mais sans succès. L'estérase de foie de porc (PLE) a réalisée une hydrolyse complète,

mais non-stéréosélective de ces deux composés (donnant respectivement les composés

83a et m). -

Il a été démontré que la tropinone (83a) permet d'accomplir la synthèse formelle

de la ferruginine (a, en 6 étapes.

7. Perspectives

Cette section propose quelques projets Futurs pouvant ètre réalisés à partir des

dérivés tropanes synthétisés dans ce mémoire.

7.1 Synthèse de dérivés tropanes

Le triflate de vinyle 86a ou 86b permet le couplage par catalyse au palladium

avec de nombreux groupements aryles et alkyles (schéma 43). Les composés 8%-b ainsi

obtenus pourraient ensuite Stre convertis en de nombreux analogues utilisés dans des

Ctudes sur les effets de dépendance de la cocaïne.

. - - - - - * ( ------* analogues

n OTf n R'

2, 89b

Schéma 43

7.2 Modification de la réaction de Robinson

En exécutant d'abord une mono-estérification sur l'acide acétonedicarboxylique,

on pourrait obtenir directement les composés 84a-b par la réaction de Robinson. comme

on le présente au schéma 44.

Selon Chen et Meltzer (1997),11 on doit d'abord convertir l'acide

acétonedicarboxylique en anhydride 90, puis en mono-ester a. Ce composé est mélangé

avec le diaidéhyde approprié et de la méthylamine, pour obtenir directement les

composés ou m.

Schéma 44

Cependant. les travaux préliminaires n'ont pas permis d'obtenir le mono-ester o. sans doute à cause d'une dkarboxylation de l'acide acétonedicarboxylique. dès la

première Ctape. La présence de traces d'acide dans I'anhydride acétique en est

probablement responsable.

7.3 Désymétrisation enzymatique de la pseudopelletierine

Comme il a déjà été mentionné précédemment. une désymétrisation est plus

avantageuse qu'une résolution. entres autres au point de vue du rendement.

La synthèse de ces composés (93a-b) peut se faire encore une fois en modifiant la

réaction de Robinson. On utiliserait le dimethy lester de l'acide acétonedicarbo~y lique

(92). disponible sur le marché et on remplacerait le tampon phosphate par du méthanol.

Ceci est illustré au schéma 45.

Dans la littérature des années 1950.

(diméthoxycarbony1)-tropinone (93a) par une

on retrouve déjà Ia préparation de la 2.4-

méthode semblable."

92 - n = l , 93a 2, 93b

Schéma 45

Les composés 93a-b pourraient ensuite être testés dans des hydrolyses

enzymatiques. selon le schéma 46.

enzyme) ( (

C02Me

Schéma 46

7.4. Ozonolyse de dérivés tropanes

Au schéma 47. on présente une ozonolyse qui a été tentée sur la 2-

(méthoxycarbony1)-tropinone (m ( n = 1 et R = OH). mais sans succès. Le produit a été

décomposé. Une explication p!ausible est que ce composé. n'étant présent sous forme

Cnolique qu'en faible proportion (revoir le schéma 38), est moins susceptible à une

oxydation d'une liaison double.

Schéma 47

L'ozonolyse de la 2-(rnéthoxycarbony1)-pseudopelletierine (m) (n = 2 et R =

OHj. composé qui se retrouve presque exclusivement sous forme énolique. n'a pas été

tentée. Elle permettrait d'obtenir un pipéridine cis-2.6-disubstitué (m). que l'on pourrait

convertir en d'autres analogues potentiellement bioactifs. Ceci constituerait une nouvelle

voie de synthèse pour de tels composés.

Le succès de I'ozonolyse des alcènes 873-b (R = H) fait peu de doute. Ceci

pourrait également être tenté. comme voie alternative.

7.5 Synthèse d e dérivés d'oxatropanes

On a récemment découvert que les oxatropanes (tropanes contenant un oxygène à

la place de l'azote) constituaient des inhibiteurs de la DAT (un neurotransmetteur.

responsable du transport de la dopamine). un systkme particulièrement touché par la

cocaïne. Cette dicouverte fournit de nouveaux outils permettant d'étudier et d'espérer

mieux comprendre la DAT."

La préparation d'oxatropanes. mise au point par Chan et Brownbridge, est

présentée au schéma 48 : 74

OMe Me3Si0 OMe TiCb- & 2 ~ e

( n ( OH

n OMe 97a-b

* I

96 n = l , I

- 2, kV0

résolution analogues

Schéma 48

Le composé réagit avec le I -3-bis(trirnéthylsi10~y)- 1 -méthoxybuta- 1 Sdiène

96 en présence de tétrachlorure de titane pour domer l'oxatropane o. Les rendements - sont de 79% (m) et 74% (m).

Étant donné la flexibilité des biocatalyseurs. on peut raisonnablement penser

qu'une enzyme. permettant la résolution ou la désymétrisation d'un dérivé de ia tropinone

et de la pseudopelletierine. sera tout aussi active avec les oxatropanes correspondants.

Les travaux de Chënevert et ses collaborateurs sur les tétrahydropyranesi6 et les

pipéridineç75 démontre une telle possibilité.

À partir du composé 97, on pourra synthétiser différents dérivés. tel le tritlate de

vinyle (suivi d'un couplage au palladium).

D-Conclusion générale

La résolution enzymatique de la warfkine a été tentée. mais elle n'a pas donné de

bons résultats. La cholestérol estérase (CE) a toutefois permis I'hydrolyse non-

stéréosélective de l'acétate de wdarine.

La lipase de Cundida antarcricu (CAL)permet de réaliser la désymétrisation du

citrate de triéthyle (38). On obtient alors le composé (R)- (+)-o (e.e. 90%). Les diesters

Qa-b peuvent être hydrolysés énantiosélectivement par I'estérase de foie de porc. pour

donner dans ce cas les esters (R)-(+)-37a-b (e.e. 90%).

La résolution de deux tropmes n'a pas été réussie. La PLE a tout de même permis

l'hydrolyse complète (mais non-stéréosélective) des dérivés esters 8Ja-b. Une synthèse

t'ormelle de la ferruginine en 6 étapes. à partir de la tropinone. a également été accomplie.

Remarques générales

1. Analyse

Les spectres de résonance magnétique nucléaire de proton (RMN 'H) et du

carbone (FWN '-'c) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker modèle AC-300.

Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm. Les constantes de couplage

( J j sont exprimées en Hertz (Hz). Les solvants deutérés sont utilisés comme référence

interne pour la RMN ' H et 13c.

Les abréviations suivantes sont utilisées dans les pages suivantes. pour la

description des spectres RMN : s (singulet). d (doublet). dd (doublet de doublet). t

(triplet). q (quadruplet). qt (quintupler). rn (multiplet).

Les spectres infrarouges (IR) ont été enregistrés sur un spectromètre Bechan

modèle IR-4-50. Les fréquences sont rxprimies en cm-'. Pour les composés solides. une

faible quantité de solide (soit environ 2 mg) est mélangée a du bromure de potassium

( KBr) (environ 75 mg). puis mis sous pression. afin de former une pastille. Les liquides et

les huiles sont deposés comme un film. en faible quantité. entre deux pastilles de NaCl,

puis analysés.

L'activité optique a été mesurée grâce à un polarimetre digital Jasco modèle DIP-

360. La valeur de la raie D du sodium (589 nm) est la longueur d'onde utilisée. Les

solvants utilisés sont de haute pureté (spectroscopique). La concentration (c) est donnée

en gramme de composé par 100 mL de solvant.

Les points de fusion des composés solides ont été déterminés à l'aide d'un appareil

électrotherrnal Thomas Hoover, modèle 642744 1 O.

2. Réactions

L'avancement des réactions enzymatiques en milieux aqueux est suivi par des

mesures régulières à l'aide d'un pH-mètre Fisher, de modèle 8 15. avec une électrode

Fisher modèle 1 3-620-97.

La purification des produits par chromatographie-éclair est effectuée avec du gel

de silice (40-60 prn). Le degr6 d'avancement d'une réaction est suivi par chromatographie

sur couche mince (ccm) a l'aide de plaques (Mrrck) en gel de silice (250 prn d'épaisseur)

sur du verre. Le révélateur utilisé pour les ccrn. CAM (cérium ammonium molybdate).

est priparé de la façon suivante:

NH-tMoO4 (21 g) et H4Ce(S04) 4 ( 1 g) dans H2S04 10% (v/v) (500 mL).

3. Réactifs

Les solvants et réactifs courants sont séchés et purifiés de la manière suivante:

Éthanol et méthanol: distillés sur Mg + I2

Benzène: distillé sur Na + benzophénone

Dichlorométhane: distillé sur CaHr

Hexane et cyclohrxane: distillés sur CaHz

Pyidine et triéthylamine: distillées et conservées sur KOH

THF: distillé sur Na + benzophénone

DMSO et DMF: séchés sur Na2S04. distillés sous vide, puis conservés sur tamis

moléculaire 4 A.

4. Enzymes

Les protéases sont obtenues de Sigma. Les lipases sont achetées d'Aman0

Intemationai Enzyme Co.. à l'exception de la PPL (Sigma) et de la lipase de

Pse~~domonusj7uorescens (Fluka). L'estérase de foie de porc (PLE) provient de Sigma ou

d'hm.no. La lipase de Candida a~rrarc~ico ( n o v o q n 435) est achetée chez Novo

Nordisk.

A. Essai de résolution enzymatique de la warfarine

1. Estérification chimique de la warfarine

Trois méthodes ont été utilisées pour obtenir les esters désirés: la réaction avec

l'acide. avec l'anhydride et enfin avec le chlorure d'acide correspondant.

1.1 Estérification de la warfarine à l'aide de l'acide de Mosher

w ; O 2 H OCH

;\ la warfarine 3 (55.7 mg. I éq..

EDC, DMAP

(70% ) " cH2c12 *$CF3

0CH3 O

0.181 mrnol), dissous dans 3 mL de

dichlorométhane anhydre. on ajoute l'acide de Mosher (50.8 mg. 1 .I éq., 0.2 17 mmol),

de I'EDC (45.0 mg. 1.3 éq.. 0.235 mmol) et du DMAP ( I O mg). On laisse agiter pendant

environ 24 heures.

On dilue dans 50 mL d'AcOEt et lave avec une solution de HCl i M ( 2 x 10 mL),

une solution aqueuse saturée en NaHC03 (2 x 10mL) et de la saumure (2 x 10 mL). On

sèche (Na$30r), filtre et évapore sous vide.

On chromatographie sur gel de silice (éiuant: 30% AcOEt. 70% hexane). pour

obtenir l'ester de Mosher 3 en une huile jaunâtre (70% de rendement).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

IR (NaCl):

RMN I3c (CDC13):

21 - J-(2-méthoxy-2-phény1-2-trifluorométhy 1acétoxy)-3-(3 -oxo- 1 - phény lbuty1)-2H- 1 -benzopyran-?-one

C19Hu FjOb

524.50 @mol

huile

3080-3030 (CH). 7980-2900 (CH). 2253, 1779 et 1722 (C=O).

1630. 1460. 1 170.9 1 O, 730.650.

2.14 et 2.16* (S. 3H. CH3C=O). 3.5 (m. 2H. CH2). 3.77 et 3.74* (S.

3H.0CH3). J.6(t. IH.CH). 7.2 (m. 8H.Ar). 7.5 (m. 4H.Ar). 7.8

(m. 7H. Ar).

205.9 (CH3C=O). 153.2 (CO2), 1139.5. 139.3. 132.0. 130.3. 128.9,

128.8. 128.3. 127.8. 127.6. 126.8. 124.3, 132.7. 131.8. 121.1.

116.5. 115.2 (Ar)]. 55.8. 55.7 (OCH3). 44.9 (CH?). 44.5 (CHz),

36.6 (CH). 36.5 (CH). 30.0 (CH3C=O).

Les pics en 2 .142 16 et 3.72l3.74 peuvent ètre utilisés pour evalurr l'ex. d'un

échantillon.

1.2 Estérification de la warfarine à partir des anhydrides

On place la warfarine (lOOrng, 0.324 m o l ) dans un ballon. On ajoute l'anhydride

acétique (2 mL) ou palmitique (481 mg, 0.973 m o l ) . 3 rnL de pyridine et 10 mg de

DMAP. On laisse agiter jusqu'au lendemain.

Puis on ajoute 100 mL de EtO2 et on lave avec une solution aqueuse de HCl 1 M.

afin de neutraliser la pyridine. On lave ensuite avec de l'eau distillée (2 x 70 mL), une

solution aqueuse saturée en NaHC03 (2 x 75 mi,) et de la saumure (2 x 25 mL). On sèche

la phase organique avec du MgSOj. la filtre et évapore sous vide.

On chromatographie ensuite sur gel de silice (éluant: AcOEthexane 30/70). On

obtient un solide blanc (98 mg. 86%) dans le cas de l'acétate et une huile dans le cas

de I'hexadécanoate ( 115 mg, 7 1 %).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

pF:

IR (NaCi):

O 19a - 4-acétoxy-3-(3-0x0- 1 -phény 1butyl)-2 H- 1 -benzopyran-Zone

C ~ I H I R 05

350.39 grno1

solide (blanc)

156-8 O C

3080-3020 (CH). 2980-2900 (CH). 1760 et 1720 (C=O), 1630,

1380, 1 100,930,760,700.

1.95 (S. 3H. CH3C=O). 2.05 (m, 3H. CH3C02). 2.2 (m. 1 H. CH?),

3.1 (m. 1 H, CHt). 4.0 (m. 1 H. CH), 7.2 (m. 7H. Ar). 7.5 (m. 1 H.

Ar), 7.9 (m. 1H. Ar).

168.5 (CH3C=O), 160.7 (CH3C&), 157.9 ( G O ) , 152.9 (=C-O),

142.2 (=C-O). 1132.0, 128.6, 128.2, 126.8, 123.8, 122.8, 116.4,

115.1, 104.7, 102.7 (Ar)l, 11.3 (CH2), 35.1 (CH), 24.2 (CH3C=O),

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

IR (NaCl):

huile

7920 (CH). 2840 (CH). 1710 (C=O). 1630. 1370. 1070. 900. 710.

640.

0.88 (m. 3H. CHiCH2). 1.24 (m. 76H. CH2CH2CH2). 1.56 (m. 2H.

CH2CH2COr), 1.99 (S. 3H. CH3C=O). 2.04 (m. 1 H. CH2C=OCH3).

2.79 (t. 5=7. ZH. CH2CH2C02), 3.00 (m. 1H. CHzC=OCHj). 3.97

(m. 1H. CH). 7.23 (m. 7H. Ar). 7.53 (m. IH. Ar). 7.90 (m. IH.

Ar).

RMN "C (CDCli): 17 1.4 (CHiC=O). 160.6 (CH2COI), 157.9 (C=O). 152.9 (=C-O).

147.2 (=C-O). 1131.8, 128.6. 126.9. 113.8. 122.8. 116.4. 115.1.

104.7. 102.6 (Ar)). 41.3 (CH2C=OCH3), 35.1 (CH). 134.9. 31.8.

~9.6.29.5.29.4.39.3.29.1.29.1. - 28.8.27.6. 24.9. 24.7.22.6. 19.0

(CH2CH2CH2)I. 19.5 (CH3C=O). 14.0 (CHJCH~).

1.3 Estérification de la warfarine a partir du chlorure d'acide

+ 0 0 \ R

CH3 THF ) R(O=)CO CHZC(=O)CH

À la warfitrine (100 mg, 0.324 mrnol). on ajoute du chlorure d'acétyle (18 PL. 1.1

éq.. 0.389 mmol) ou d'octanoyle (66 PL. 1.2 éq.. 0.398 mmol), du triéthylamine (60 PL.

1.3 éq.. 0.472 mrnol) et du DMAP (IO mg) dans 3.0 mL de THF.

On laisse agiter sous azote jusqu'au lendemain. On exécute les extractions et la

chromatographie. telle que décrits ci-dessus.

Dans le cas de l'acétate m, le rendement est faible (30%). La cause semblerait

etre une hydrolyse partielle du chlorure. particulièrement sensible à l'humidité. Le

composé Stant en tout point semblable à celui préparé par l'autre méthode. l'optimisation

de la réaction n'a pas été tentée.

Dans le cas de I'octanoate m, on obtient une huile claire (86 mg. 6 1%').

O O 19c -

Nom formel: 4-octanoxy-3-(3-0x0- 1 -phénylbutyI)-IH- 1 -benzopyran-2-one

Formule brute: C17HjoOc

Masse molaire: 434.57 &/mol

Aspect: huile

IR (NaCi): 3070-3050 (CH). 1930 (CH). 2860 (CH). 1770 (C=O). 1720

(C=O). 1630. 1575. 1490. 1360. 1000.910.755,700.

RMN 'H (CDCI;): 0.90 (m. 3 H. CHICH?). 1.2-1.4 (m. 8H. CH2CH2CH2). 1-83 (qt,

2H. CH2CH2C02). 2.17 (s, 3H. CHE=O), 2.77 (t, 1=7, 2H.

CH2CHF02), 3.47 (2 x dd, k 7 , 2H. CH2C=OCH3), 4.79 (t, 5 ~ 7 .

IH, CH), 7.1-7.5 (m. 9H. Ar).

Rh3N I3c (CDClj): 169.9 (CH3C=O), 16 1.0 (CH2C02), 155.4 (C=O), 152.3 (=C-O),

140.2 (=C-0): 1131.8. 128.6, 127.7, 126.8, 124.1, 123.0. 121.2,

1 16.5. 1 16.0 (Ar)], 45.0 (CHtC=OCH3), 36.4 (CH), [35.2, 34.9,

33.9, O . 29.0. 28.9. 28.8, 24.6, 22.5 (CH2CH2CH2)J, 31.5

2. Hydrolyse chimique de l'acétate de warfarine 19a

A de l'acétate de warfanne (38 mg. 1 éq.. 0.108 mrnol), on ajoute 1 mL dune

solution aqueuse de NaOH 0.1 M. 1 mL de MeOH et 4 mL de THF. On fait agiter pendant

environ 1 heure dans un bain de glace (OaC).

On neutralise le NaOH avec 1 mL de solution HCI O. IN. puis on ajoute 50 mL de

Et20. On lave la phase organique avec de l'eau ( 2 x 30 mL) et de la saumure ( 2 x 20 mL).

On sèche (MgS04). tiltre et évapore. On chromatographie sur gel de silice (éluant:

AcOEtIhexane 30/70). On récupère la warfarine sous la forme d'un solide blanc (23 mg.

70% de rendement).

Cette warfarine est comparable a celle disponible commercialement.

3. Résolution enzymatique

3.1 Hydrolyse enzymatique des esters d e la warfarine a

Dans un essai typique, l'ester de warfarine (30 mg) et l'enzyme (30-40 mg) dans le

solvant (3 mL), a la température de la pièce. L'avancement de la réaction enzymatique est

indiqué par une baisse du pH, qui est maintenue à sa valeur initiale par addition d'une

solution de NaOH (0.1 M). Ceci est suivi par la consommation de base et elle est

terminée lorsqu'un équivalent d'ester a été hydrolysé.

Alors, on filtre pour retirer l'enzyme, puis on extrait avec de I'AcOEt (3 x 50 mL).

On lave la phase organique avec de la saumure (2 x 70 mL), puis on sèche (MgSQ) et

kvapore la solution. Le résidu est chromatographié sur gel de silice (iluant AcOEthexane

20/80) au besoin.

Les composés sont décrits dans les sections précédentes.

3.2 Acétylation enzymatique de la warfarine

La procédure est la même que celle décrite à la section 3.1. sauf que les solvants

sont anhydres et qu'on ajoute également de ['acétate de vinyle (28 PL. 0.291 mrnol).

B. Désymétrisation enzymatique de l'acide citrique

1. Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle

HofiCo enzymet HofiCofit euou HOfiCo2H tampon

Et20C C02Et H02C C02Et Et02C C02Et

38 - 39 40

Dans un essai typique. une suspension de citrate de triéthyle 3 ( 1 50 mg. 1.84

mmol) est hydrolysie avec PLE (50 mg) dans un tampon phosphate (pH 7) B la

température de la pièce. La réaction e e m a t i q u e est indiquée par une baisse du pH. qui

est maintenue à sa valeur initiale par addition d'une solution de NaOH (0.1 M).

L'avancement de la réaction est suivi par la consommation de base. La réaction est

considérie comme terminée lorsqu'un ciquivalent d'ester a été hydrolysé. La solution

aqueuse est alors extraite avec de l'éther (pour retirer tout reste du produit de départ). puis

acidifiée (HCl 3 N) jusqu'à pH 2. Les produits de l'hydrolyse sont extraits avec de

l'acétate d'éthyle. Les d e u isomères (3 et 40) sont séparés par chromatographie sur gel

de silice. en employant comme éluant une solution d'hexane/AcOEt (4.5 / 5.5).

Nom formel: Acide 3 -éthoxycarbony 1-3 -hydroxy-4-éthoxycarbonylbutyrique

Formule brute: C 1oHi60:

Masse molaire: 248.23 dm01

Aspect: huile

[alo'': +3.8 (c 1.84. MeOH)

IR (NaCI): 3600-3040 (OH), 7980-2860 (OH), 1750 (C=O). 1370.1 120, 1020,830.

RMN1~(CDC13) : 1.25(t. J=9.1,6H,CH3),2.86(m,4H,CHtC02),4.12(q, J=9.1,

2H, CH2CH3), 4.28 (q, J=9,2H, CH2CH3).

RMN ''(2 (CDC13): 174.76 (C=O). 174.03 ( G O ) , 169.64 (CZ0). 73.12 (C-OH). 62.39

(CH2CH3). 60.86 (CH2CH3). 42.88 (CH2C02). 13.89 (CH3).

Nom formel: Acide 2-hydroxy-2-(éthoxycarbonyl)méthyl-3 -~thoxycarbonylpropanoïque

Formule brute: C l o H 1 6 0 7

masse molaire: 248.33 iJrno1

Aspect : huile

IR (NaCl): 3600-3040 (OH). 1980-2860 (OH). 1750 (C=O). 1370. 1 190. 1020.

850, 780.

RMN 'H (CDCI,): 1 .Zj (t. 5=7.1. 6H. CHs). 1.91 (m. W. CH2C02). 4.15 (q. J=7.1.

4H. CH2CH3).

RMN "C (CDCl,): 1 77.13 (C=O). 1 70.09 (C=O), 73.1 6(C-OH). 6 1.36 (CH2CHs),

2. Préparation des diesters protégés 42a-b

2.1 Préparation du diacide protégé a

R=Me, 42a Et, 42b

De I'acide citrique 3 (8.0 g, 4 1.7 mmol), de la parafonnaldéhyde (3.76 g, 125.23

mmol) et du DMSO (2.1 mL) sont chauffés dans un ballon, a 156OC pendant environ 6

heures.

On laisse revenir à la température de la pièce. puis on filtre sur buchner. Le résidu

est recristallisé dans l'eau. pour donner un solide blanc. le diacide a (4.78 g, 56%: 67%

dans la littérature).

41 Nom formel: Acide 7-[4-(carboxyméthy 1)-5-0x0- 1.3-dioxolan-4-y llacétique

Formule brute: C:HsO7

Masse molaire: 204.13 @mol

Aspect: solide blanc

Point de fusion: 213-5 O C

[R (KBr): 2940 (COOH). 1800 (C=O). 1730 (C=O), 1440. 1260. 1200. 1 170.

RiMN ' H (CD30D): 5.52 (S. 2H. O-CH2-O). 7.88 (S. 4H. CH2C02).

RblN "C (CD30D): 175.57 (C=O). 172.22 (C=O). 96.30 (O-CH2-O), 77.29 (C).

42.05 (CH2CO7).

2.2 Préparation des diesters protégés 42a-b

Le diacide fl ( 1 .O g, 4.90 mmol) est dissous dans l'alcool (méthanol ou éthanol.

?O mL), puis l'acétal correspondant (diméthoxypropane ou diéthoxypropane, 4 mL) et

une résine acide d'échange ionique (Dowex 5OWX4. 0.5 g) sont ajoutés. Le mélange est

chauffé à reflux pendant 24 h.

Le mélange réactionnel est refroidi. filtré pour retirer la résine et évaporé. Le

produit brut est dissous dans ltAcOEt (100 mL) et lave avec Na2C03 aq. (2 x 20 mL) et

de la saumure (2 x 20 mL). La phase organique est séchée (MgS04), puis évaporée. Le

produit est ensuite chrornatographié (gel de silice; éluant AcOEt 1 Hexane 3 / 10) pour

fournir le diester correspondant (rendements: 86% et 42b. 85%).

Nom formel: 5-5-di[(méthoxycarbonyl)méthyl]- 1.3-dioxolan--!-one

Fornule brute: C9Hi207

Masse molaire: 231.19 grno1

Aspect : solide blanc

Point de fusion: 60-63 "C

IR (KBr): 3000 (CH). 2960 (CH). 1800 (C=O). 1740 ( G O ) . 1-1-10. 1370.

1240. 1 180. 1060,990.

RMPJ ' H (acetone-d,): 2.97 (S. 4H. CH2C02), 3.66 ( S . 6H. CH3). 5-50 (S. 2H. O-CH2-O).

RMN I3c (acerone-d6): 174.9 (GO) . 17 1 .O (C=0). 96.3(0-CHrO). 77.1 (C). 51.3 (CH3),

41.8 (CH2C02) .

Nom formel: 5.5-di[(éthoxycarbonyl)mCthyl]- 1.3 -dioxolan-4-one

Formule brute: CI lH1607

Masse molaire: 160.74 g/mol

Aspect: huile

IR (NaCl): 1980 (CH), 2930 (CH). 1800 (C=O), 1740 (GO) . 1375, 1 180,

1060, 1020.

RMN ' H (acetone-d6): 1.21 (t, J=7.0, 6H. CH3), 2.94 (s, 4H. CH1C02), 4.1 1 (q, J=7.0,4H,

CH2CH3), 5.5 1 (S. 2H, O-CH2-O).

RMN 13c (ûcetone-d,): 173.3 (C=O), 169.4 (C=O), 95.4 (O-C&-O), 76.3 (C), 61.4

(CHiCH3). 4 1.6 (CH2C02), 14.2 (CH3).

3. Désymétrisation enzymatique des citrates protégés

3.1 Hydrolyse enzymatique des diesters protégés 42a-b

R=Me, 42a R = M e , 3ta Et, 42b Et* 37b

La procédure est semblûble à celle décrite pour le citrate de triéthyle (38). à la

section 1 ci-dessus. On mélange le diester protégé J1 (50 mg. 2 (0.43 mmol). b (0.38

rnmol)) et 50 mg d'enzyme dans le solvant approprié.

Nom formel: 5-carboxyméthy 1-5-(rnéthoxycarbony 1)méthyl- 1.3-dioxolan-4one

Formule brute: CsH1007

Masse molaire: 218.16 glmol

.4spec t: huile

-4.4 (c 2.46. MeOH): [litt. +0.28. c 10. MeOH] '' IR (NaCl): 3500-2500 (COOI-I). 1790 (C=O). 1720 (C=O), 1 180. 1 145. 1000.

RMN ' H ( C D C I ~ ) : 2.90 et 2.95 (2s. JH. C H F 0 2 ) , 3.71 (S. 3H. CH3). 5.55 (S. 2H. 0-

CHI-O). 7.97. (S. 1 H. OH).

RMN I3c (CDC13): 173.4 ( G O ) . 172.8 (C=O), 168.9 (C=O). 95.0 (O-CH2-O). 75.3

(C), 52.2 (CH3), 40.8 (CH2C02).

Russell et Ancliff ont admis leur erreur dans la mesure de l'activité optique de ce

composé. Après vérification, ils ont trouvé une valeur semblable à celle de ces travaux.

Nom formel: 5-carboxyméthyl-5-(éthoxycarbonyl)méthyl- 1.3-dioxolan-4-one

Formule brute: CsH1i07

Masse molaire: 232.19 @mol

Aspect : huile

IR (NaCl): 3500-2500 (COOH). 1790 (C=O). 1720 (C=O). 1 180, 1 145. 1000.

RbfN 'H (CDCI,): 1.20 (t. .J=7.0. 3H. CH3). 2.83 et 2.89 (2s. 4H. CH2C02). 4.10 (q.

J=7.0. 2H. CH2CH3). 5.49 (S. 2H. O-CH2-O). 8.97, (S . 1 H. OH).

RMN "C (CDC13): 173.6 (C=O), 171.8 ( G O ) . 168.4 ( G O ) , 75.3 (C). 61.3

(CH2CH3). 4 1 . 1 (CHzC02). 40.8 (CH2C02). 13.9 (CHs).

3.2 Estérification enzymatique du diacide protégé a

enzyme ROH

R = M e , 37a Et, 37J

La procédure est sernblabie à celle décrite à la section 3.1. sauf qu'on ajoute

également 5 éq. d'alcool (g-méthanol. 300 PL; b-éthanol, 285 PL). On mesure

l'avancement de la réaction par ccm. Aucun essai n'a permis d'obtenir les composés 37a-

4. Détermination des excès énantiomériques

Dans les deux cas. les excès ont ét i déterminés en faisant réagir le citrate (1 éq.)

avec EDC (1.2 éq.). DMAP (cat.) et le (S-)-(-)-(1-naphty1)éthylarnine (NEA. 1.2 éq.).

dans du dichlorométhane anhydre à O O C . On laisse agiter toute la nuit. La température

revient progressivement à environ 20°C.

On dissout le mélange dans 150-100 mL de AcOEt et on lave succrssivement

avec WC1 IN (2 x 20 mL). eau ( 2 x 10 mL). NaHC03 aq. (3 x 20 mL) et saumure (2 x 30

mL). On seche la phase organique (MgSOd). puis on évapore le solvant. Au besoin. on

purifie par chromatographie (gel de silice: éluant AcOEthexane 25/75).

4.1 Avec le citrate de diéthyle 39

Selon la procédure décrite ci-dessus. on mélange le composé 3 (86 mg. 0.36

mmol), NEA (67 PL. 0.42 mmol). EDC (80 mg. 0.42 mmol) et DMAP (cat.) dans 5 mL

de CHZC12.

Formule brute: C73H27N06

Masse molaire: 40 1.45 g/mol

Aspect: huile

IR ('NaCl):

RMN 'H (CDC13):

RMN "C (CDC13):

3300 (NH), 2980-2860 (CH), 1730 (C=O). 1635 et 1550 (NH).

1450, 1370, 1250, 1 160, I W O , 780.

1.23 (t. 5=8, 6H. CH2CH3). 1.67 et 1-62 (2d, J=8. 3H, NCH-CH3).

2.80 (m. 4H, CH5C02), 4.10 et 4.2 1 (q. J=8. 4H. CH2CH3), 5.90

(qt. J=8. 1H. NCH). 6.39 et 6.48 (2d. 1=8. 1H. NH).

173.3 (C=O). 169.9 (GO), 167.9 ( G O ) , [138.1. 13 .8 . 130.7.

128.6. 128.1. 178.0. 126.3. 125.6. 123.1. Ar]. 73.5 (C). 62.1 1 et

62.05 (CH2CH3), 44.5 (MX), 42.62 et 42.59 (CH2C02). 30.8

(NCH-CH3). 13-81 et 13.77 (CH2CH3) .

Pour la détermination des e.e.. on utilise les doublets dus à I'azote (6.39 et 6.48 ppm).

4.2 Avec les esters protégés 37a-b

R=Me, 37a Et, 31b

R = Me, 45a Et, $J

Selon la procédure décrite ci-dessus. on mélange le compose a (118 mg. 0.59

rnmol). NEA ( 1 14 PL. 0.70 mmol). EDC ( 135 mg, 0.70 rnmol) et DMAP (cat.) dans 5

mL de CH2Cl2.

o$tB OH

C02CH3 45a -

Formule brute: CI!JHI~NOS

Masse molaire: 341 -36 g/mol

Aspect: huile

IR (KBr): 3420 (OH). 1780 (C=O), 1700 (C=O). 1380. 1330, 1200. 1 170.8 10

(Ar), 780 (Ar).

RMN 'H (acetone-d6): 1.89 (d, J=7, 3H. NCH-CHi), 2.57* (d, 5 4 8 . 1 H. CHr), 3.10 (m.

3H. CH2). 3.49* (s.3H. Co2CHJ), 6.10 (q, J=7. 1H. NCH). 7.48

(m. 3H. Ar). 7.88 (m. 3H. Ar). 8.10 (m. 1H. Ar).

RMN "C (acetone-d6): 178.7 (C=O). 175.0 (C=O), 170.9 (C=O). [ 5 . 5 134.6. 132.1.

179.5. 129.0, 127.1. 126.8. 126.2. 125.8. 113.8. Ar]. 72.5 (C). 51.9

(C02CH3). 47.1 (NCH). 42.4 (CH?). 4 1.2 (CHt). 1 7.2 (NCH-CH3)

Les spectres sont donnés pour un seul diastéréoisomère. Les pics de 2.57 et 3-49

sont utilisés pour évaluer 1'e.e. d'un échantillon.

Formule brute: CloHllN05

ii4asse molaire: 355.38 glmol

Aspect: huile

IR (NaCl): 3500-3200 (OH). 3020 (CH). 2940 (CH), 1680(C=0). 1600

(NC=O). 1560. 1360. 1240.760 (Ar).

RMN 'H (acetone-d,): 1.1 1 (t. 5=7. 3H. CH2CHi), 1.90 (d. J=7. 3 H. NCH-CHa). 2 . S 4 (d,

J=18. 1 H. CH?), 2.93 (m. W. CH2). 3.97 (q, J=7. 2H. CH2CH3),

6.12 (q, J=7. 1H. NCH), 7.50 (m. 3H. Ar). 7.87 (m. 3H. Ar), 8.13

(m. 1 H. Ar).

RMN ')c (xetone-d,): 178.8 (C=O). 175.0 (C=O). 170.4 (C=O), (135.5, 134.6. 132.1,

119.6, 129.0. 127.1. 126.8. 126.2. 125.7, 123.8, Ar1 72.4 (C), 61.1

(CH2CH3). 46.8 (NCH), 42.4 (CH2), 41.4 (CH2), 17.1 (NCH-

CH3), 14.2 (CH2CH3).

Les spectres sont donnés pour un seul diastéréoisomère. Le pic de 2.55 est utilisé

pour évaluer 1'e.e. d'un échantillon.

5. Corrélation chimique

5.1 Ouverture de cycle des esters protégés 37a-b

R = Me, (RI-(+)-= R = Me, (R)-(+)-36 Et, (R)-(+)-3fb Et, (R) - (+) -a

Le compose a (0.85 rnrnol) est dissous dans l'éthanol ou le méthanol anhydre (20

mL). On ajoute de la triéthylamine (236 PL. 1.70 mmol) et chauffe la solution à reflux

pendant 24 h. On laisse ensuite revenir à la température de la pièce. puis on évapore à

sec. L'excès d'amine est neutralisé avec du HCI IN (20 mL) La solution aqueuse est

estraite avec de ItAcOEt (4 x 15 mL). puis on lave la phase organique avec de la saumure

(2 s 20 mL). On la sèche (MgS04) et l'évapore pour obtenir ou o.

Le composé obtenu par cette méthode est identique en tout point à celui obtenu

précidemment.

OMe

Nom formcl: Acide (R)-(+)-3-méthoxycarbonyl-3-hydroxy-4-méthoxyc~que

Formule brute: CsH1207

Masse molaire: 220.18 g/mol

Aspect: huile

[a] 13.9 ( c 1, MeOH); [litt. +4.0, c 1.00, MeOHJ "

ER (NaCl): 3400 (COOH), 3020 (OH), 1740 (C=O).

RMN 'H (acetone-&): 2.86 (m, 4H. CH2C02). 3.61 (S. 3H. CHi), 3.71. (S. 3H. CH3).

RMN ''c (acetone-4): 174.3 (GO). 1 71.5 (C=O). 170.7 ( G O ) . 74.0 (Cl. 57.8 (CHJ).

5 1.8 (CH3). 43.7 (CH2C02). 43.3 (CH2C02).

5.2 Ouverture de cycle du méthylester protégé 37a et transestérification

Du sodium (47 mg. 7.06 rnrnol) est introduit dans un ballon d'éthanol anhydre

refroidi à O O C . Une solution de j7a ( 1 80 mg. 0.835 mmol) dans de l'éthanol anhydre est

ajouté et le mélange revient à la température de la pièce pendant une nuit. La solution est

Cvaporée à sec et le résidu est dissous dans de I'AcOEt. La phase organique est

neutralisée avec du HCl 1N et lavé avec de la saumure ( 2 x 20 mL). Puis elle est séchée

(MgS04) et évaporé pour récupérer le composé 2 (50 %).

Le composé 3 obtenu par cette méthode est identique en tout point 3 celui obtenu

précédemment.

C. Résolution et désymetrisation enzymatique de tropanes

1. Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone

COzH > 1) Na2HP04, NaOH, eau + CH3NH2 + O 2)HCI.A

COzH 80%

La tropinone utilisée provient de chez Aldrich. La pseudopelletierine est préparée

par la réaction de Robinson.

Dans un ballon on introduit le glutaraldéhyde (19 rnL de solution 25% p/p dans

l'eau. 50 mrnol. 1 éq.). de la méthylamine hydrochlorée (5.0 g. 70 mrnol. 1.5 éq.) dissous

dans 50 mL d'eau. de l'acide acétonedicarboxylique (8.3 g. 60 mmol. 1.2 éq.) dissous

dans 83 mL d'eau. ainsi qu'une solution de Na2HP04'H20 (8.8 g. 25 mmol) et NaOH

(0.73 g. 18 mmol).

On laisse agiter à la tempirature de la pièce. sous azote. pendant 24 h. Ensuite. on

ajoute 3.3 mL de HC1 concentre et on Fait chauffer la solution sur bain-marie pendant une

heure. pour permettre la décarboxylation.

Lorsque la solution est refroidie. on ajoute 7.5 g de NaOH dissous dans 10 mL

d'eau. puis le mélange est extrait avec du dichlorométhane (8 x 25 mL). On séche la

phase organique (MgS04), puis on évapore le solvant.

La purification du produit par chromatographie-éclair s'est révélée peu efficace. 11

est plus efficace de sublimer le produit (40aC. 0.3 mm Hg). On obtient un solide blanc-

jaunâtre. Les rendements de cette réaction ont varie de 50060% (lin 80% 69).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

pF:

IR (NaCl):

CqH 1 sNO

1 3 - 2 2 g'moi

solide

5 1-54 O C (lin. 48-52 O C ) 69

2890 (CH). 2810 (N), 1700 (C=O),

9 1 0. 730.

1.27-1.49 (m. 4H. 7 6 er 8 endo). 1.80-1.91 (m. 2H. 6 et 8 exo).

2.17 (S. 1H. 3'4 a..). 7.17 ( S . IH. Y 4 a.). 2.52 (S . 3H. 9). 1.67 (dd.

J=17 et 7. ZI-1.2 er 4 Pq.). 3.21 (s large. 2H. 1 ef j).

210.4 (3). 55.5 ( 1 er 5). 41.7 (2 et 4. 41.0 (9). 29.4 (6 et 8). 15.8

2. Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés 84a-b

NaH, (CH 30)2C=0.

( M F , A. 80% (

n = l : t p . 83a 2 : pp, g3J

Une solution de tropinone 83a ( 1 .O0 g. 7.1 8 m o l . 1 éq.) dans 5 mL de THF

anhydre est ajoutée goutte-à-goutte dans un mélange de NaH (0.3638, 14.37 mrnol, 2 éq.)

et carbonate de diméthyle (1.33 mL, 15.80 mrnol. 2.2 éq.) dans 5 mL de THF anhydre

chauffé à reflux doux.

Une solution de pseudopelletierine 83b (0.963g. 6.29 mmol, 1 éq.) dans 5 mL de

THF anhydre est ajoutée goutte-à-goutte dans un mélange de NaH (0.3 18g, 12.58 mmol.

2 éq.) et carbonate de diméthyle (1.2 mL. 13.84 mmol. 2.3 eq.) dans 5 mL de Tm

anhydre chauffée à reflux doux.

Le reste des manipulations est semblable dans les deux cas. Après une heure. on

ajoute 30 uL de MeOH et laisse encore agiter pendant une heure de plus. Puis on laisse

revenir à la température de la pièce. On ajoute 25-30 mL d'eau distillée. que l'on extrait

avec du CH2C12 (8 x 25 mL). On sèche la phase organique (MgS04). filtre et ivapore

sous pression réduite. On place au congélateur jusqu'au lendemain. Après subiimation. on

obtient un solide blanc (parfois Iégérement jaunâtre) (0.800 g. 61-6900. lin. 80% 75) .

L'analyse du composé 8Ja s'avère compliquée. à cause de l'équilibre de trois

formes (revoir le schéma 38 de la partie théorique). Ci-dessous. on retrouve les données

pour la forme dominante (énolique).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

pF:

IR (KBr):

RMN 'H (CDC13):

5 4 3

84a -

2-(méthoxycarbony 1)-8-méthy 1-8-azabicyclo[3.3.1]-oct-2-én-3-ol

Ci0Hl5N03

197.13 grno1

solide

40 "C

3500-3300 (OH), 2940 (CH). 2780 (N). 1650 (C=O). 1520. 1260,

1220,800 (=CH), 770 (=CH).

1.48-2.23 (m. jH, 6, 7 et 4 a), 2.34 (s, 3H. a), 2.74 (dd, J=19 et 5,

IH, 4 kq.). 3.32 (m. IH, j), 3.75 (s, 3H, 10), 3.79 (s, IH, l), 11.75

(s, 1 H, OH: pas toujours visible).

RMN I3c (CDCI,): 171.2 (9). 169.5 (3). 102.0 (2). 60.5 (9, 57.0 (Z), 47.3 (10). 38.1

(4). 34.2 (6), 29.1 (3.27.7 (8).

Nom Formel: 7-(méthoxycarbony 1)-9-méthy 1-9-awbicyclo[. 1 1-non-2-en-3-01

Formule brute: C I I H ! ~ ~ ~

Masse molaire: 2 1 1 2 6 g h o l

Aspect: solide

pF: 97- 10 1 'C (lin. 126-7OC) "

IR (KBr): 3500-5200 (OH). 3080 (CH). 2940 (CH). 2880 (N). 27/10, 1660

(C=O). 15 IO, 1250. 1720. lO5j.830 (=CH). 775 (=CH).

RMN 'H (CDCi3): 1.36-1.90 (m. 7H. 6. 7, Y rr 4 m). 2.29 (S. 3H. 9). 2.64 (dd. J=19 et

7. IH. 4L;rl.). 5.05 (s large. 1H.J), 3.59(s large. iH. 1). 3.71. (S.

3H. 11). 12.1 (S. 1 H. OH: pas toujours visible).

RMN1'~(CDC13): 171.7(!0, 3).96,8(2).53.0(j),52~4(1).51.1 (11).41.6(4).32.4

(9). 19.0 (6). 27.8 (8). 14.7 (7 .

3. Acétylation chimique du composé 84b

\ \ a:."' &-CI, DMAP,

CH2C12 83 %

a';: (I)-84b (*)dB

On mélange le composé 84J avec du chlorure d'acétyle (38 PL, 0.538 mmol, 1.2

éq.) et du DMAP (71 mg, 0.582 mmol, 1.3 éq.) dans du dichiorométhane anhydre (2 mL).

On laisse agiter sous azote pendant 24 h.

On ajoute un peu d'eau (20 rnL) et on extrait avec du dichiorométhane (4 x 50

mL). On sèche la phase organique (MgSO4) et évapore le solvant. Au besoin. on

chromatographie sur gel de silice (éluant AcOEthexane 20/80). On obtient un solide

blanc. le composé (95 mg, 83%).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

pF:

IR (KBr): ???

85 - 2-(méthoxycarbony 1)-3-acétoxy-9-méthy1-9-biccl[ 3.1 ]-non-

2-en-3 -01

Ci3Hi9NO.t

253.29 g/mol

solide

54-6°C

3080 (CH). 7940 (CH). 2880 (N). 2740, 1660 (C=O). 1510. 1230.

1230. 1055.830 (=CH). 775 (=CH).

RMN'H(CDCI~): 1.36-1.90(m.7H.6, ~ ,8et . (m.) ,2 .20(s .3H.13) .2 .35(~,3H.9) ,

2.59 (dd. J=19 et 7. 1H. 4 Iq.). 3.69 (s large. 1H. 1), 3.77 (s, 3H.

II).

RMN I3c (CDC13): 175.7 (17). 170.2 (10). 96.1 (1), 52.9 (3, 52.3 ( I ) , 5 1.4 (1 i), 40.7

(9). 31.5 (4). 28.3 (6), 28.2 (8). 22.2 (13), 14.2 (7).

4. Résolution enzymatique du composé 84b

4.1 Hydrolyse enzymatique du composé 84b

Dans un essai typique, on mélange le composé &J (70 mg. 0.33 rnmol) et

l'enzyme (70 mg) dans le solvant indiqué (3 mL). L'avancement de Ia réaction est suivie

par ccm. On utilise comme éluant de I'AcOEt avec 510% de triéthplamine. La

pseudopelletierine semble plus polaire que le composé && (Rf de 0.2 par rapport à 0.33).

Lorsque la réaction semble terminée, on ajoute du NaCl pour saturer la phase

aqueuse. puis on extrait avec du dichlorométhane (4 x 75 mL). On sèche la phase

organique (MgS04) et évapore le solvant. Les composés obtenus sont identiques à ceux

obtenus ci-dessus.

4.2 Acétylation enzymatique du composé 84b

La procidure est la même que celle décrite à la section 4.1. sauf qu'on ajoute de

l'acétate de vinyle (1 O? PL. 1.66 rnmol. 5 éq.) ou d'isopropényle (1 82 PL. 1.66 rnmol. 5

éq.) et qu'on utilise des solvants organiques anhydres.

4.3 Hydrolyse enzymatique du composé @

\

enzyme eau

+ &fzMe OAc

C02Me

Même procédure qu'à la section 4.1

5. Synthèse de la ferruginine

5.1 Synthèse du triflate 86a

Co2Me (CF3S02)20, pyr.

A une solution de & ( 1 93 mg. .979 mmol. 1 éq.) et pyridine (1 19 PL. 1-47

mmol. 1.5 éq.) dans du dichlorornéthane anhydre (2 mL) à 0°C. on ajoute de I'anhydride

trifluorométhanesulfonique (206 PL. 1.72 mmol. 1.25 éq.). On laisse la solution revenir a

la température de la pièce.

Après 12 h. on Cvapore le solvant. puis chromatographie directement le résidu sur

gel de silice (çluant: AcOEt/Hexane/Et3N 49/49/3). On obtient une huile jaunâtre (347

mg. 75%: lin. 80% 'O).

Nom formel:

Formule brute:

Masse molaire:

Aspect:

IR (NaCl):

RMN 'H (CDC13):

86a - 7-(méthoxycarbony l)-8-méthy1-8-azabicyclo[ 2.11-oct-%ne

3-triméthylsulfonate

C i i H i4NOjS

329.29 g h o l

huile

3054 (CH). 2985 (CH). 1720 (C=O), 1590. 1420,1340,740 (=CH).

1.45-2.12 (m. jH, 6, 7 et 4 ar.), 2.32 (s, 3H, a), 2.77 (dd, 5=18 et 4.

lH, 4 éq.), 3.36 (m, lH, Li), 3.74 (s, 3H, IO), 3.85 (m, lH, 1).

5.2 Synthèse du composé 87a

Et3N, P ~ ( O A C ) ~ . HC02H, DMF, W C , lh,

45%

On agite sous azote une solution de Ka (350 mg, 0.759 mmol. 1 éq.).

triithylamine (3 17 PL. 1.28 mmol. 3 éq.). acétate de palladium (3.4 mg. 0.0 15 m o l .

0.07 Cq.) et triphénylphosphine (8 mg, 0.030 rnrnol. 0.04 éq.) dans du DMF (4 mL). On

ajoute lentement de l'acide formique (57 PL. 1.52 mrnol. 2 éq.). puis on chauffe le

mélange à 60°C pendant 1 h.

On laisse refroidir. puis ajoute de l'eau (20 mL). On extrait avec du

dichlorométhane ( 5 x JO mL) et on sèche la phase organique (MgS04). On

chromatographie sur gel de silice (éluant: éther de pétrole/EtzOIEt3N 495015) pour

obtenir une huile claire (65 mg, 45%; lin. 80% 'O: la réaction n'a pas été optimisée).

Nom formel: méthanoate d'anhydroecgonidine

Formule brute: C IOHISNO~

Masse molaire: 18 1.37 glmol

Aspect: huile

IR (NaCl): 3000 (CH). 1600 (C=O). 1420, 1 120,700.

RiMN 'H (CDC13): 1.38-2.10 (m. jH. 6. 7 e t 4 ar.). 2.29 (S. 3H, 8). 2-57 (m. 1H. 4 e'y.).

3.19(m. lH, j ) .3 .69(~ .3H. 10),3.72 (m. IH. 2).6.76(m. 1H.3).

I3c (CDCh): 166.3 (9). 135.6 (31, 133.9 (2) , 58.3 (9, 56.7 (1). 51 -4 (10). 36.1

(fi). 34.2 (8). 31.5 (4. 29.9 (7).

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SYNTHÈSE ÉNANTIOSÉLECTIVE PAR CATALYSE ENZYMATIQUE …

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