Secuenciación y análisis del genoma de dos cepas de...

Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 9(21): 57-73 2018

Memoria en extenso. XVII Congreso Internacional XXIII Congreso Nacional de Ciencias Ambientales

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Secuenciación y análisis del genoma de dos cepas de Stenotrophomonas sp.

degradadoras de xenobioticos.

Sequencing and genome analysis of two strains of Stenotrophomonas sp. xenobiotic

degraders.

1Temidayo Oluyomi Elufisan, 2Alejandro Sánchez Varela, 3Isabel Cristina Rodríguez Luna, y 4Xianwu Guo.

Laboratorio de Biotecnología Genómica, Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico

Nacional, Boulevard del Maestro, con Elías Piña, Col. Narciso Mendoza, s/n, CP. 88710, Tel:

924327, Ext: 87760, [email protected], Reynosa Tamaulipas, México.

RESUMEN. Stenotrophomonas son bacterias Gram negativas metabólicamente versátiles.

Esta capacidad de sobrevivir en varios ambientes se ha asociado con su potencial para

utilizar una amplia gama de sustancias para su crecimiento, incluidos los xenobióticos.

Estos potenciales que posee Stenotrophomonas spp han sido estudiados con diversos fines

aportando grandes beneficios para el hombre, tales como la promoción del crecimiento

vegetal de plantas y sus aplicaciones en biorremediación. En este estudio aislamos dos

nuevas cepas de Stenotrophomonas spp de pozos y suelos contaminados crudos en

Tabasco, México, y evaluamos su potencial para tolerar y crecer en Hidrocarburos

PoliAromáticos (HPA), que es uno de los componentes principales del petróleo crudo. La

cuantificación cuantitativa y cualitativa de los productos de degradación se llevó a cabo

mediante el uso de espectrometría FTIR y análisis UPLC-MS. La capacidad de los aislados

para usar HPA se probó con siete HPA diferentes (Bifenilo, Xileno, Antraceno,

Antraquinona, Naftaleno, Fenantreno, Fenantidina) en un medio mínimo con HPA como

única fuente de sustrato. El aislamiento creció eficazmente en seis HPA, excepto en el caso

del xileno, y el análisis espectrofotométrico mostró que los aislamientos crecieron de forma

constante en la HPA hasta el séptimo día, cuando el crecimiento comenzó a disminuir. El

resultado del análisis cuantitativo y cualitativo mostró que los aislamientos podrían estar

degradando la HPA evaluada a través de la vía de degradación del catecol. La

secuenciación completa del genoma de los aislados se realizó utilizando la técnica de

secuenciación de nueva generación y el análisis de secuenciación reveló que los aislados

poseen varios genes funcionales que pueden estar implicados en la degradación y la

mineralización completa de los HPA.



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Palabras claves: Hidrocarburos, Aromáticos, Genes, Funcionales, Biorremediación.

INTRODUCCIÓN

Los hidrocarburos poliaromáticos son contaminantes ambientales comunes derivados de las

actividades antropogénicas. La naturaleza recalcitrante y el efecto peligroso de los HPA

hacen que la remediación sea importante. El uso de microorganismos para la remediación

de los HPA y otros hidrocarburos ha recibido más reconocimiento debido a la facilidad de

manipulación de bajo costo y pocos o ningún efecto secundario. Existen reportes donde

muestran a Stenotrophomonas como uno de los microorganismos con la capacidad de

crecer y degradar hidrocarburos. Stenotrophomonas spp es una clase de bacteria con

habilidades metabólicas versátiles, que se han asociado con diversas capacidades para

utilizar muchas sustancias complejas para su crecimiento, entre las cuales se encuentran los

hidrocarburos, compuestos organofosforados para su crecimiento (Iyer and Damania,

2016). Se ha reportado que varias cepas de Stenotrophomonas están asociadas con la

degradación de HPA y otros hidrocarburos (Chen et al., 2014) (Mangwani et al., 2014) (Ni

et al., 2013) (Nowak et al., 2016). Sin embargo, la elucidación de todo el mecanismo

empleado por Stenotrophomonas spp para la degradación de hidrocarburos aún es

incipiente. El análisis de la secuenciación del genoma completo se ha utilizado para

explicar muchos fenómenos en bacterias, incluida su capacidad para degradar

hidrocarburos. Recientemente se utilizó la secuencia del genoma completo para explicar a

detalle la vía metabólica implicada en la degradación de los HPA por Mycobacterium

vanbaalenii (Kim et al., 2008). El análisis completo de la secuencia del genoma podría

usarse para explicar las características fenotípicas de las especies de Stenotrophomonas con

respecto a la degradación de los HPA. Con este objetivo, el estudio se centró en la

evaluación de los potenciales de biodegradación de las especies de Stenotrophomonas

aisladas de contaminantes crudos y el análisis de la secuencia del genoma completo de las

cepas.

Se aislaron dos nuevas especies de Stenotrophomonas de sitios contaminados en crudo en

Tabasco México y se evaluó su capacidad para crecer en diversos hidrocarburos aromáticos

policíclicos (HPA) como la única fuente de carbono en medio bushnell Hass y se

determinaron los potenciales de degradación en un estudio de degradación. La base

genética para la tolerancia y degradación de los hidrocarburos asociados se determinó

mediante la secuencia completa del genoma de los aislados.

Los aislamientos fueron capaces de utilizar HPA para su crecimiento según lo revelado por

el aumento en la densidad óptica (DO) después de siete días de crecimiento en un medio

mínimo con hidrocarburo como única fuente de energía. La DO continúa aumentando



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diariamente hasta el séptimo día cuando comienza a disminuir. La degradación de

hidrocarburos se examinó por espectrofotometría infrarroja de transmisión de Fourier

(FTIR). Las especies de Stenotrophomonas aisladas fueron capaces de degradar los HPA a

través de la vía de degradación de catecol. El análisis del genoma completo reveló que los

aislados contienen genes que son importantes para la degradación de los HPA, tales genes

incluyen lactoilglutatión liasa, esencial para la conversión de salicilato en catecol.

METODOLOGÍA

Las Stenotrophomonas spp utilizadas en este estudio fueron aisladas del suelo contaminado

con petróleo crudo recolectado en Tabasco México, inicialmente se tomó 1 g de la muestra

de suelo y se adiciono en 10 ml de caldo Luria-Bertani y fue incubada la mezcla a 37°C.

Enseguida se tomó 1 ml del cultivo de bacteria crecida durante la noche y se diluyó en

forma serial a la potencia de ocho en solución tampón de fosfato y luego se extendió en

placas de medio selectivo (agar StenoVIA) para el aislamiento de especies de

Stenotrophomonas spp. Las colonias que aparecieron en las placas se identificaron

bioquímicamente con base en el manual de Bergey de bacteriología determinativa e

identificación molecular.

En cuanto a los HPA utilizados para este estudio fueron obtenidos del Laboratorio de

Biotecnología Farmacéutica (Laboratorio de Biotecnología Farmacéutica) del Centro de

Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional de México.

Para la identificación molecular y análisis filogenético. Se extrajo ADN genómico a partir

de 5 mL de cultivo bacteriano cultivado en caldo de Luria usando el kit de purificación de

ADN genómico de Promega (Madison, EE UU) según las instrucciones del fabricante.

Los genes 16s rRNA fueron amplificados mediante PCR usando steno1 (21F) (5 'AGG

GAA ACT TAC GCT AAT ACC-3') y steno2 (1200R) (5 'CTC TGT CCC TAC CAT TGT

AG-3') de acuerdo a Pinnot et al., (2009). La mezcla de PCR contenía 2.5 μL de PCR

buffer, 0.75 μL (50mM) MgCl2, 0.5μL de 10mM d -NTP mix, 1 μL (0.5μM) de cada

primer, 0.5μL, 2.5 U Taq DNA polimerasa, 16.75 μL de agua destilada y 2 μL de ADN (10

ng / μL).

Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados en el Centro de Biotecnología

Genómica, Instituto Politécnico Nacional, México. La secuencia obtenida se analizó con el

software Seqman versión 13 y se sometió a búsquedas de similitudes contra las secuencias



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del gen 16S rDNA obtenidas de NCBI utilizando el programa Blastn.

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Los aislados de Stenotrophomonas spp. a partir de tierra cruda contaminada se les evaluó su

capacidad para tolerar concentraciones variables de seis diferentes HPA.

La prueba de tolerancia a hidrocarburos se llevó a cabo utilizando medio Bushnell Hass

(BH) suplementado con HPA 1% y 5% de 100 mg en el caso de naftaleno, fenantridina,

antraquinonas, bifenilo, fenantreno y 40 mg con respecto al antraceno.

Todos los hidrocarburos fueron disueltos en cloruro de dimetilo, dejando evaporar el

disolvente, antes de introducir los hidrocarburos en dosis experimentales.

El diseño experimental tubo tres configuraciones que incluyeron el experimento de prueba

y dos controles. Todos los experimentos fueron por duplicados. Se inocularon 100 μL de

cultivo de toda la noche de las cepas de Stenotrophomonas spp, lavadas en tampón de

fosfato en 100 mL de cada medio BH que contenía 1% y 5% de la HPA. Antes mencionada

a una concentración de 100 mg / mL en matraz Erlenmeyer de 250 mL mientras que cada

medio BH no inoculado con hidrocarburo y medio BH con Stenotrophomonas sirvieron

como controles.

Todas las concentraciones experimentales se incubaron a 30°C en una incubadora rotatoria

con revolución de 200 rpm durante 7 días después de la inoculación con bacterias de

prueba. La tolerancia de Stenotrophomonas se verificó cada dos días utilizando el método

de recuento de colonias. Se extendieron 100 μL de cada medio inoculado diluido en serie

(10-4) sobre placas de agar Luria Bertani y se incubaron a 30ºC durante 24 horas, después

de lo cual se contaron las colonias formadas. El análisis espectrofotométrico se llevó a cabo

en el cultivo de todas las concentraciones experimentales para corroborar las observaciones

del método de recuento de colonias.

Ensayo de bioemulsificación

Las propiedades emulsionantes de los aislamientos se probaron según la descripción de

Panjiar et al., (2015) y Peter and Singh (2014).

Actividad de biodegradación de Stenotrophomonas spp.

Se analizaron cepas de Stenotrophomonas para la biodegradación de Naphthalene debido a

su capacidad para tolerar y crecer en los diferentes hidrocarburos probados.



61

Se introdujeron 100 μL de inóculo de Stenotrophomonas (DO = 1) durante una noche en

medio Bushnell Hass líquido de 100 mL ya suplementado con Naftaleno v/v al 1% (100 mg

/ ml) y medio sin Naftaleno en un matraz Erlenmeyer de 250 mL mientras que el tercer

tubo contenía solamente Naftalina Medio de Bushnell Hass. Todas las concentraciones

fueron por triplicado y fueron incubados a 30°C en una incubadora rotatoria con una

revolución de 200 rpm. El valor OD de la concentración se verificó tres veces para

determinar la actividad de crecimiento de las bacterias. Esto se hizo el primer día del

experimento, el día 10 y el día 30, que es el último día del experimento.

Extracción de Hidrocarburos y análisis

El naftaleno se extrajo con el mismo volumen de hexano dos veces después de un período

de incubación. Cultivo líquido (100 mL) que contiene Stenotrophomonas spp. El inóculo de

Pemsol y el hidrocarburo se agitaron vigorosamente tres veces con el mismo volumen de

hexano. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora para la separación

adecuada de las emulsiones y luego se transfirieron a un embudo de separación para separar

la emulsión. La fase de hexano se recogió para el análisis del producto de HPA.

Para la identificación de intermedios de la degradación del naftaleno se utilizó UPLC-MS /

MS

Se optimizo con una solución estándar de 1.0 mg /L y una fase móvil (50% de H2O: 50%

de metano) en el espectrómetro de masas de forma continua en modo combinado. La

temperatura de la fuente se ajustó a 120 o C, para disolver la temperatura a 350 o C y el

flujo de gas fue a 50 L/ h. Se utilizó un flujo de gas disuelto de 500 L/ h y un flujo de gas

de colisión de 0.10 mL / min. El nitrógeno se usó como el cono y el gas de disolución,

mientras que el argón se usó como el gas de colisión y su presión en la celda de colisión se

mantuvo en 3.0 x 10 3 milibares. La separación por cromatografía se realizó con el sistema

Ultraperformance LC equipado con la columna BEHTM C18 (1.7 μm, 50 mm x 2.1 mm)

del naftaleno utilizando fases móviles de gradiente binario. Las fases móviles A y B se

fijaron como agua y metano respectivamente y los ácidos fórmicos se añadieron como

aditivo de fase móvil a una concentración de 0.001% (v / v). El flujo se ajustó a 0.4 mL/

min y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 ° C. La proporción de fase móvil

inicial del 50% (H2O) y el 50% (metano) se mantuvo durante 1 minuto. La fase móvil luego

se redujo al 10% en 4.5 minutos y después de eso la fase móvil se redujo drásticamente al

0% en 0.1 min y se mantuvo durante 1 minuto para limpiar la columna usando 100% de

fase móvil orgánica ACN. Al final, se hizo pasar agua al 85% inicial por 0.1 min y se

mantuvo durante 1 min para equilibrar la columna antes de la siguiente inyección y una

carrera total de 7.7 minutos.

Identificación del intermediario con espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier

(FTIR). Los productos obtenidos de la extracción del compuesto de hidrocarburo se dejaron



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secar al aire y se verificó aproximadamente 1 mg en el espectrómetro Bruker Alpha FT-IR

(AXS Inc., Madison, WI, EE. UU.) Para determinar los grupos funcionales constituyentes.

Secuenciación y análisis del genoma completo.

Una vez que se extrajo el ADN genómico usando el kit de extracción de Promega, este

DNA genómico bacteriano fue enviado para la secuenciación del genoma completo en

MyGenomics USA. Los genomas fueron secuenciados con una secuenciación de nueva

generación usando Illumina miseq. La calidad de las lecturas se verificó con fastqc y las

lecturas sin procesar se recortaron con la versión 4.10 en abundancia, que también filtró las

lecturas con mala calidad. El ensamblaje del genoma de novo se llevó a cabo con un

ensamblador autónomo del genoma Spades 3.1.1 (Centro de biotecnología algorítmica,

Universidad Estatal de San Petersburgo, Rusia) Bankevich, et al., (2012). La calidad del

ensamblaje se verificó con la herramienta autónoma QUAST y el genoma se anotó usando

un software de anotación Prokka (Seemann, 2014). Los contigs ensamblados se redujeron a

uno con el uso de un scaffolder en línea MedusaCombo (Bosi et al., 2015) Pan y Core

genoma análisis se realizó con Bacterial Pangenome herramienta de análisis (BPGA)

(Chaudhari et al., 2016). Las islas genómicas se predijeron con un visor Island en línea4

Bertelli et al., (2017). El software PHAST fue empleado para la predicción de la posible

presencia de un profago (Zhou et al., 2011). Para la presencia de dos componentes del

sistema fue predicha por la webtool en línea PS2P Barakat et al., (2013),

mientras que la anotación funcional de los genes se realizó con WebMGA (http://weizhong-

lab.ucsd.edu/metagenomic-analysis) (Wu et al., 2011). La anotación del contenido

funcional de los genes asociados con la isla genómica y el gen único predicho para

Stenotrophomonas sp. Pemsol se hizo con blast2go (Conesa et al., (2005). El análisis

genómico comparativo de Stenotrophomonas sp. Pemsol se realizó utilizando MAUVE

(Darling et al., 2004), J speciesWS (Richter et al., 2016) y GGDH (Auch et al., 2010)

(Markowitz, 2011).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fueron aisladas dos especies de Stenotrophomonas sp y designadas como ASS1 y SVIA2.

Las técnicas de identificación molecular y bioquímica confirmaron que los aislados son

miembros del género Stenotrophomonas sp (Figura 1 y Tabla 1).



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Figura 1 : Filogenia de las cepas y de otros cepas de Stenotrophomonas sp reportadas

Tabla 1. Características Bioquímicas de los Aislados.

Azucar/Sales SVIA2 ASS1

Manitol + +

Arabinosa + +

Glucosa + +

Sucrosa - -

Trehalosa + +

Lactosa - -

maltosa + +

Mannosa + +

S maltophilia strain KNUC360

Stenotrophomonas sp. RASOB4

Uncultured Steno sp. clone K2DN299

S pavanii LMG

ASS1

ASS2

StenoSVIA2

SVIA1

Pseudoxanthomonas japonensis 12-3

Xanthomonas campestris

Pseudoxanthomonas dokdonensis DS-16

Stenotrophomonas humi R-32729

Stenotrophomonas terrae R-32768

stenopemso

Lysobacter antibioticus

Lysobacter enzymogene DSM 2043T

Pseudomonas trivialis DSM 14937

Pseudomonas fluorescens CCM 2115



64

Fructosa + +

Galactosa + +

Dulcitol - -

Lysina - +

Gelatina - -

Tween80 + +

Ureasa - -

Almidón - -

Esculina - +

Fenilalanina + +

El análisis de búsqueda del rRNA 16S parcialmente secuenciado de cepas aisladas mostró

una identidad del 99% con las cepas secuenciadas previamente de Stenotrophomonas

maltophilia recuperadas de la base de datos del NCBI. El análisis filogenético mostró que

los aislados se agruparon estrechamente con los miembros del género Stenotrophomonas

sp. Los aislamientos crecieron eficazmente en un medio mínimo con los hidrocarburos

probados excepto el xilenol. Este crecimiento fue confirmado por el recuento de colonias y

el análisis espectrofotométrico (Figura 2).

a : Crecimiento de ASS1 en Antraceno b: Crecimiento de SVIA2 en fenantreno



65

c: Crecimiento de SVIA2 en mezcla de HPA

Figura 2: Crecimiento de cepas de los HPA seleccionados

Análisis de biodegradación

Se sabe que las Stenotrophomonas sp son un grupo muy versátil de bacterias Gram

negativas con diferentes potenciales metabólicos, entre las cuales está su potencial para

degradar xenobióticos, compuestos poli-aromáticos y organofosforados Ryan et al., (2009).

Varias cepas de Stenotrophomonas maltophilia con las capacidades mencionadas

anteriormente se han aislado de diferentes entornos que van desde entornos estables a

entornos extremos, como entornos altamente ácidos o básicos (Arulazhagan et al., (2017)

(Boonchan et al., 2000) (Gao et al., 2013) (Samanta et al., 2002) (Seemann, 2014)

(Tebyanian et al., 2013). Las especies de Stenotrophomonas sp que aislamos pudieron

tolerar 1% y 5% de 100mg / mL (≈ 1mg / mL y 5mg / mL) de cinco de los hidrocarburos

analizados ((bifenilo, fenantrenol, fenantridina, naftaleno y antraquinona) y 1% y 5 % de 40

mg / mL (geq 400 \ mu g / mL y 2 mg / mlL) de antraceno). Esto demostró que los aislados

tienen la tendencia a utilizar hidrocarburos como fuente de carbono a la concentración

evaluada.

El potencial de los aislados para degradar la HPA evaluada mediante el ensayo de emulsión

descrito por Peter and Singh, (2014) (Panjiar et al., 2015) reveló que poseen la capacidad

de utilizar la emulsificación como estrategia para atrapar los HPA de la superficie líquida

adherida. (Figura 3).



66

Figura 3: Bioemulsificación aislados de Stenotrophomonas sp.

Se ha dicho que la degradación de hidrocarburos puede mejorarse mediante la bioemulsión,

que hace que los hidrocarburos hidrofóbicos estén disponibles para el uso de bacterias [8].

Aunque los resultados obtenidos del ensayo de bioemulsificación mostraron que los

aislamientos podían emulsionar HPA, otros mecanismos están implicados en la absorción y

degradación de los HPA y otros hidrocarburos por bacterias [22]. El ensayo de

biodegradación y el análisis con GC-MS o LC-MS se han utilizado para explicar la vía de

biodegradación de las bacterias que degradan la HPA. Del mismo modo, la secuenciación

del genoma completo ofrece una enorme ventaja en la comprensión del mecanismo de

degradación de los HPA bacterianos.

La capacidad de los aislados para degradar los HPA se evaluó en un estudio de degradación

y el compuesto resultante formado después de la degradación se evaluó usando un enfoque

tanto cuantitativo como cualitativo. El análisis cuantitativo utilizando espectrometría FTIR

después de los días 15 y 30 de incubación mostró que las bacterias tienen el potencial de

degradar naftaleno. La degradación de naftaleno por especies de Stenotrophomonas sp

parece seguir la vía de la catecol dioxigenasa como lo indica la introducción del grupo

hidroxilo a la estructura de Naftaleno y la presencia de varios grupos carbonilo e hidroxilo

en la estructura de Naftaleno después de 30 días. Este análisis cuantitativo, por lo tanto,

mostró que las cepas aisladas podrían degradar naftaleno (Figura 4).



67

Figura 4: Análisis de la Biodegradación por FTIR

Cromatografía UPLC-MS

El análisis de los metabolitos intermedios formados después del análisis de biodegradación

reveló que la degradación de naftaleno siguió la ruta de degradación del catecol para

naftaleno como un pico correspondiente al peso molecular del catecol (figura 5).

Control

Muestra después de 15 días de tratamiento Muestra después de 30 días de tratamiento

Naftaleno



68

Figura 5: Análisis de la degradación de productos después de 22 días, por UPLC-MS.

Estudios previos han demostrado que las especies de Pseudomonas sp pueden degradar

naftaleno utilizando diferentes enzimas a través de la vía de degradación de naftaleno-

catecol (Eaton and Chapman, 1992).

Análisis de secuenciación del genoma completo.

Pudimos reducir los genomas de los aislamientos a solo un contig de los 69 andamios

iniciales y 400 andamios generados por el ensamblaje de novo para ASS1 y SVIA2,

respectivamente. El contenido de GC del genoma fue de 66.59 y 65.62 respectivamente

(Tabla 2).

Características Genoma

SVIA2 ASS1

DNA total numero de bases 4497327 4613196

DNA contenido G + C (%) 65.62 66.59

Protein coding gene 4028 4108



69

Pseudo genes 0 0

rRNA 5 7

5S rRNA 1 2

16S rRNA 2 4

23S rRNA 2 1

tRNA 76 75

Profagos 2 1

El genoma de la cepa ASS1 codifica para una proteína de 4108 (CDS) con una longitud de

secuencia de 4613196, 76 genes de ARNt y 7 genes de ARNr. La cepa SVIA2 en sí misma

tiene una longitud de secuencia total de 4497327 y codifica 4028 proteínas CDS. Tiene 77

tRNA y 5 rRNA. Ambos aislamientos mostraron mayor sintenia con Stenotrophomonas

maltophilia K279a en comparación con otros genomas de Stenotrophomonas sp.

El análisis funcional de los dos genomas reveló que ambos genomas contienen genes que se

han asociado con la degradación de hidrocarburos poliaromáticos. Los genes incluyen la

enzima COG0346 de la familia de lactoil-glutatión liasa, que se sabe que están asociados

con la biodegradación del Mesarca hidrocarbonado aromático

(Mesarch et al., 2000). Otros genes identificados en los genomas de las cepas aisladas

incluyen alcohol deshidrogenasa, alcano 1 monooxigenasa, haloalcano deshidrogenasa,

fosfolípido diacilglicerol acil transferasa, succinato deshidrogenasa y glutatión s

transferasa. Todos los cuales se ha informado que están involucrados en la degradación de

HPA y otros hidrocarburos. La presencia de estas enzimas en el genoma de los aislados

confirmó su capacidad potencial en la degradación de hidrocarburos.

CONCLUSIONES

Las cepas de Stenotrophomonas sp ASS1 y SVIA2 crecieron y degradaron los HPA

probados, además se encontró que codifica diversos genes asociados con la degradación de

los HPA, según se revelado en el análisis de secuenciación del genoma completo.



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La degradación de los Hidrocarburos Poli Aromáticos probados siguió la ruta de

degradación de los HPA que implica la producción de catecol y salicilatos.

Impacto del estudio

El estudio reveló la posibilidad de utilizar especies de Stenotrophomonas sp para la

degradación de los HPA, de ahí su uso como agente bioremediador para sitios

contaminados con HPA.

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional, a la Secretaria de Investigación y Posgrado del Instituto

Politécnico Nacional y a la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas,

así como por la Beca BEIFI otorgada.

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Secuenciación y análisis del genoma de dos cepas de...

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