Secuenciación y Microarreglos

Aplicaciones en Estudio del Cáncer

Orlando Gualdrón López

Bacteriólogo MSc.

Laboratorio Especializado – CUC

2015

GLOBOCAN 2012 (IARC) Estimated number of cancer cases (x1000), all ages

- Alrededor de 14 millones de nuevos casos en el mundo.

- 8.2 millones de muertes.

Datos del Cáncer:

La actual clasificación incluye más de 300 tipos de Ca.

Las biopsias aportan información limitada y se pierdenotros aspectos tumorales de importancia.

Necesidad de clasificar tipos y subtipos de tumor.

Ca. involucra interacción simultánea de muchos genes yproteínas.

Campbell B. et al. Physioterapy and Cancer Treatment . 2015

Estructura del ADN

Nucleótido

Estructura de la Cromatina:

“Dogma Central de la

Biología”

PCR:In 1989, Kary Banks Mullis received the Nobel

Prize for the PCR – Polymerase Chain Reaction

¿Qué es Secuenciar?

Conocer la conformación, orden y cantidad de

nucleótidos en el ADN.

Múltiples utilidades se han derivado a partir de la

secuencia del ADN.

Varias

Plataformas

de NGS:

GS Junior System - Roche:

Aplicaciones de la Secuenciación

Genotipificación de SNP: Determina las variaciones en

las secuencias genéticas.

Secuenciación de Genomas Completos (WGS):

Determina la secuencia completa del genoma de un

individuo.

Perfiles de Expresión de Genes/Transcriptoma: Analiza

genes y transcritos expresados en una muestra dada.

Epigenética: Estudio de cambios heredables en la

regulación de genes que ocurren sin alterar la secuencia

del DNA.

¿En el Laboratorio Especializado – Colsánitas S.A.?

Gastroenterology, Jun 11, 2015 [Epub ahead of print]

New Genetic and Genomic Approaches in the Post-GWAS Era –

Back to the FutureJoanne Ngew

Charis Eng

El concepto de microarreglo se propuso por primera vez afinales de los 80s por Augenlicht y sus colegas.

Un microarreglo es un patrón de sondas de ssDNAinmobilizadas sobre una superficie llamada chip o lámina.

Los microarreglos utilizan la hibridación para detectar un DNAo RNA específico en una muestra.

Los microarreglos de DNA utilizan millones de sondasdiferentes fijas sobre una superficie sólida.

¿Qué es un Microarreglo?

Historia:1953 Double helix, Watson & Crick

1961 DNA hybridisation and nature of the triplet code discovered

1970 Reverse transcriptase (Baltimore)

1975 Monoclonal antibodies (Kohler, Milstein)

1977 First DNA sequence of an organism (viral, Sanger)

1989 First microarray prototype using a microscope slide (Fodorand and cols.)

1993 Microarray containing over 1 million DNA seqences

1995 First microarray publication (Schena et al.): Arabidopsis thaliana

First prokaryotic genome sequenced: H. influenzae

1996 Commercialization of arrays (Affymetrix)

1997 Genome-wide expression analysis in S. cerevisiae (De Risi et al.)

1998 First multicellular eukaryotic genome sequenced: C. elegans

1999 First publication on microarrays for cancer classification (Golub et al.): Leukemia

2000 Portraits/signatures of cancer: First publications on molecular phenotyping in cancer

(Pat Brown et al.)

2001 Human Genome published (Nature)

2004 Whole human genome on one microarray (Affymetrix)

2005 First FDA approved microarray-based product

http://www.nature.com/milestones/geneexpression

Microarreglos ofrecen cantidad de información molecular a serextraída e integrada.

Clasificar tumores conocidos y nuevas categoríastaxonómicas.

Descubrir nuevos diagnósticos y marcadores terapéuticos.

Identificar nuevos subtipos que se correlacionan conrespuesta al tratamiento.

Utilidad de los Microarreglos:

Leukemia (2003) 17, 1324–1332

¿Cómo se

procesa un

microarreglo?

Cada microarreglo genera miles de datos puntuales.

Características compartidas entre un grupo de muestras.

Características diferenciales para etiquetar las muestras

tumorales a estudiar.

Volume 19, Issue 1, February 2008, Pages 36–40

¿En el Laboratorio Especializado – Colsánitas S.A.?

CytoScan® 750K Array Kit

Spectral Karyotyping aCGHSNPs Gene Expression

-LMC, LLC, SMD, LMA, LLA, MM.

Figure 2. Technical challenges using genomic arrays relevant to cancer samples. The gradual rise in difficulty

level is displayed from light gray (easy, left side of the arrow) to black (difficult, right side of the arrow) depending on

the size of the abnormality, number of abnormal copies, sample types, volume of material to investigate, mixed cell

population, and detection of tumor heterogeneity. FFPE, formalin fixed paraffin-embedded sample.

- Capacidad para detectar cambios genéticos pequeños en una

población celular mixta.

- Habilidad para detectar regiones de homocigocidad en el

genoma.HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 6, 941–948, 2012

Figure 4. Standardized workflow for array data

interpretation and decision making in a

hematooncogenetic diagnostic setting.

A: Present in: Database of Genomic Variants

(http://projects.tcag.ca/variation), db-Var

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar), In-house databases

of healthy persons.

B: Containing genes or regions denoted as recurrent and

annotated in cancer; present in: Atlas of Genetics and

Cytogenetics in Oncology and Hematology

(http://atlasgeneticsoncology.org), Mitelman Database of

Chromosome aberrations

(http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman), The

cancer gene list of the Sanger institute

(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census),

Progenetix genome copy-number aberrations in cancer

(http://www.progenetix.net/cgi-bin/pgHome.cgi), Other (in-

house) defined lists of relevant genes, for example,

specific cancer subtypes.

C: TCR (Tcell receptor) or IG (immunoglobulin) genes:

2p12(IGK), 7p14.1(TCRG), 7q34(TCRB), 14q11.2(TCRA

and TCRD), 14q32.3 (IGH), 22q11.2(IGL).

D: The CNA is filed as a potential aberration and not

reported in the final diagnostic result, unless it is

confirmed by another test. ∗The limit of 5 Mb may be set

differently.

HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 6, 941–948, 2012

Nat. Rev. Clin. Oncol. 9, 48–57 (2012)

Conclusiones:

•GEA no solo clasificó muestras con exactitud sino también permitió

identificar la verdadera individualidad de cada tumor.

•ASCO–CAP y NCCN: Soporte del uso de GEA en el manejo del Ca.

de Seno.

•Vendrán mejoras en los GEA con impacto clínico.

•Impacto en el diagnóstico clínico con nuevas tecnologías como NGS,

proteómica o aislamiento de células tumorales circulantes.

•El primer genoma completo de Ca. Seno reveló un sinnúmero de

mutaciones somáticas.

Conclusiones:

• Detección de SNPs y CNAs.

• Análisis de datos de mutaciones somáticas.

• Utiliza pequeñas cantidades de DNA - 75ng.

• Alto rendimiento de muestras tan degradadas como FFPE.

• Detección de LOH. (50-75% de LOH en Ca. son de CN)

• Probado en varios tipos de Ca:

– Colorectal. - Próstata.

– Leucemia. - Linfoma de Burkitt.

– Ovario. - Astrocitoma.

– Seno. - Sarcoma de Ewing.

– Melanoma.

Y. Wang et al. Cancer Genetics 205 (2012) 341-355

A Platform of

Comprehensive

Genomics

Solutions for

Analyzing

FFPE Archival

Tissues from

Whole-Genome to

Single Molecules

• ONCOMINE: A Cancer Microarray Database and IntegratedData-Mining Platform

- over 4700 microarray experiments

- 65 gene expression datasets

- 48 million gene expression measurements

- +1000 cancer cell lines from the (CCLE)

- over 20,000 samples from TCGA.

- 715 datasets and 86.7335 samples.

2004

2015

Neoplasia . Vol. 9, No. 2, February 2007, pp. 166 – 180

-Acceso a colecciones de db. de perfiles de Ca. y herramientas de

análisis.

-Explorar patrones de expresión de uno o múltiples genes a

través de varios tipos de Ca.

-Establecer relaciones causales entre expresión génica y Ca.

-Investigar en múltiples datasets simultáneamente y comparar

tipos de tejido.

-Versatilidad en las visualizaciones en el contexto de análisis de

resultados.

-Análisis de expresión diferencial y asociaciones con tratamientos

o blancos terapéuticos conocidos.

-Meta-análisis, Coexpresión, interactoma.

Confeccionar a la medida el riesgo al cancer, diagnóstico, pronóstico y

tratamiento de cada individuo y malignidad