Principios de Biotecnología Vegetal

Francisco Fuentes, Ph.D.frfuentesc@uc.cl

Tópicos Avanzados en Biotecnología de Alimentos

IIQ3783-1

Semestre I - 2020

Departamento de Ingeniería Química y Bioprocesos

(DIQB)

1

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES

2

¿Qué es el CIV de tejidos vegetales?

3

1904 First attempt to embryo culture of selected Crucifers. Hannig B., Bot.

Zeitung, 62: 45-80.

1944 First In vitro culture of tobacco used to study adventitious shoot

formation. Skoog F., Am. J. Bot., 31: 19-24.

1949 Culture of fruits In vitro. Nitsch J. P., Science, 110: 499.

1962 Development of MS medium. Murashige T. and Skoog F., Physiol.

Plant., 15: 473-497.

1967 Haploid plants from pollen grains of tobacco. Bourgin J. P. and Nitsch

J. P., Ann. Physiol. Veg., 9: 377-382 & 10: 69-81.

1977 Successful integration of T-DNA in plants. Chilton M. D. et al., Cell, 11:

263-271.

1985 Infection and transformation of leaf discs with Agrobacterium

tumefaciens and regeneration of transformed plants. Horsch R. B. et

al., Science, 227: 1229-1231.

Hitos importantes en la historia del campo del cultivo de tejidos y

células vegetales

4

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Plant_Biotechnology/Tissue_Culture_Protocols.html

5

6

Azúcares

SacarosaAlmidón

Maltosa

Fructosa

Glucosa

Manitol Sorbitol7

Hormonas vegetales

8

9

10

11

Técnicas de laboratorio

12

Selección de materiales13

Desinfección lugar de trabajo (cloro y detergente)Todos los materiales esterilizados

14

Preparación de los tejidosCortar tallo sobre y bajo del nudo con hoja

15

Desinfección de material vegetal en cloro y detergente por 10 min

16

Enjuague con agua destilada tres veces por 5 min cada uno

17

Esterilización de pinzas y bisturí usando alcohol 95% y flameo en fuego

18

Preparación del tejidoCorte de extremos del tallo y cuidadosamente del peciolo

19

Aplicaciones del cultivo in vitro de plantas

20

1. Organogénesis

21

Elongación de brotes Crecimiento de callo 22

Enraizamiento en IBA después de cuatro semanas

23

Raíces crecidas después de cuatro semanasLavado de explante con agua (hidratación)

24

Aclimatación de plantas en sustrato estéril y cubierto para mantención de humedad

25

26

27

28

Figure 1. Organogenesis and plantlet regeneration from cotyledon and hypocotyl explants of C. lanceolata. (a) Adventitious bud

formation via direct organogenesis from cotyledons. Bar= 4 mm. (b) Elongated shoots regenerated from cotyledon explants.

Bar=8 mm. (c) Hypocotyl explant segments. Bar= 4 mm. (d) Callus generated from hypocotyls cultured for 8 wk. Bar=4 mm. (e)

Adventitious buds formed via callus rom cultured hypocotyls after 6 wk. Bar=2 mm. ( f ) Elongated shoots regenerated via

hypocotylderived callus. Bar=8 mm. (g) Shoots with adventitious roots on rooting medium. Bar=10 mm. (h) Regenerated

plantlets (from hypocotyls) established in a mixture of peat, vermiculite, and perlite. Bar=50 mm.29

Figure 1. Organogenesis and plantlet regeneration from cotyledon and hypocotyl explants of C. lanceolata. (a) Adventitious bud

formation via direct organogenesis from cotyledons. Bar= 4 mm. (b) Elongated shoots regenerated from cotyledon explants.

Bar=8 mm. (c) Hypocotyl explant segments. Bar= 4 mm. (d) Callus generated from hypocotyls cultured for 8 wk. Bar=4 mm. (e)

Adventitious buds formed via callus rom cultured hypocotyls after 6 wk. Bar=2 mm. ( f ) Elongated shoots regenerated via

hypocotylderived callus. Bar=8 mm. (g) Shoots with adventitious roots on rooting medium. Bar=10 mm. (h) Regenerated

plantlets (from hypocotyls) established in a mixture of peat, vermiculite, and perlite. Bar=50 mm.30

Figure 1. Organogenesis and plantlet regeneration from cotyledon and hypocotyl explants of C. lanceolata. (a) Adventitious bud

formation via direct organogenesis from cotyledons. Bar= 4 mm. (b) Elongated shoots regenerated from cotyledon explants.

Bar=8 mm. (c) Hypocotyl explant segments. Bar= 4 mm. (d) Callus generated from hypocotyls cultured for 8 wk. Bar=4 mm. (e)

Adventitious buds formed via callus rom cultured hypocotyls after 6 wk. Bar=2 mm. ( f ) Elongated shoots regenerated via

hypocotylderived callus. Bar=8 mm. (g) Shoots with adventitious roots on rooting medium. Bar=10 mm. (h) Regenerated

plantlets (from hypocotyls) established in a mixture of peat, vermiculite, and perlite. Bar=50 mm.31

Figure 1. Organogenesis and plantlet regeneration from cotyledon and hypocotyl explants of C. lanceolata. (a) Adventitious bud

formation via direct organogenesis from cotyledons. Bar= 4 mm. (b) Elongated shoots regenerated from cotyledon explants.

Bar=8 mm. (c) Hypocotyl explant segments. Bar= 4 mm. (d) Callus generated from hypocotyls cultured for 8 wk. Bar=4 mm. (e)

Adventitious buds formed via callus rom cultured hypocotyls after 6 wk. Bar=2 mm. ( f ) Elongated shoots regenerated via

hypocotylderived callus. Bar=8 mm. (g) Shoots with adventitious roots on rooting medium. Bar=10 mm. (h) Regenerated

plantlets (from hypocotyls) established in a mixture of peat, vermiculite, and perlite. Bar=50 mm. 32

2. Embriogénesis somática

33

34

3. Cultivo de anteras (doble haploides)

35

4. Hibridación somática

36

5. Eliminación de virus

37

1 2

34

~0.5 mm

Cultivo de meristema para eliminación de virus

38

5

6 7

~0.5 mm

39

40

6. Biorreactores para producción de metabolitos secundarios

41

El metabolismo secundario (MS) regula mucha de las relaciones de las

plantas con el medio circundante

- La producción de MS está estrechamente relacionada con el

proceso de desarrollo de las plantas

- Depende de condiciones determinadas por control hormonal

- Es paralela al desarrollo de tejido especializados y órganos

(raíces, tallos, hojas y glándulas)

- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente

compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de

órganos

- Los MS se producen ante situaciones de estrés o enfermedad

- Factores bióticos

- Factores abióticos

Presentación adaptada de Alejandro Mentaberry, FCEN-UBA

42

Las plantas como fuente de metabolitos secundarios de interés comercial

- Potencial

- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de

las plantas

- Solo se tiene conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies

vegetales que se creen existentes en el planeta

- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de

origen vegetal

- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que

consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas

✓ Insecticidas

✓ Saborizantes

✓ Colorantes

✓ Fragancias

✓ Antimicrobianos

✓ Enzimas

✓ Medicinas

✓ Herbicidas

✓ Proteasas

43

Ejemplos de terpenoides producidos en plantas

- Se conocen unos 25.000 terpenoides presentes en plantas

Azadiractina(Insecticida)

Ecdisona(Insecticida)

Taxol(droga anticancerígena)

44

Ejemplos de alcaloides producidos en plantas

- Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

45

Ejemplos de fenoles derivados de fenilpropanoides

- Unos 8.000 fenoles se forman por las rutas del ácido shikímico o del malonato/acetato

Gingeroles(Jengibre)

Capsaicina(Pimiento)

Ac. Clorogénico(Café)

Cinamaldehído(Canela)

46

Ventajas del cultivo in vitro de tejidos vegetales

47

Desventajas del cultivo in vitro de tejidos vegetales