UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE MEDICINA

VETERINARIA

BIOTECNOLOGÍA VETERINARIA

(MV-540)

)(9

“SUPEROVULACION MANIPULACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES ”

DOCENTE : Dr. ARTURO RODRIGUEZ ZAMORA

INTEGRANTES : MENDOZA HUAMANI, Abner

MENDOZA CHAUCA, Mario

PALOMINO POZO, Miguel

SIMBRON PANCORBO, Henry

GRUPO : MIERCOLES 2 – 5pm

Ayacucho – Perú

2015

SUPEROVULACION MANIPULACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES

I. INTRODUCCIÓN:

El desarrollo embrionario en mamíferos se inicia en el momento en que el gameto masculino y el

gameto femenino se fusionan. Durante este proceso, llamado fecundación, el espermatozoide

penetra progresivamente en el ovoplasma y forma el pronúcleo masculino, que posteriormente se

unirá al pronúcleo femenino para reconstruir la dotación diploide. La fecundación es seguida por

una serie de mitosis en las que el zigoto se segmenta en blastómeros cada vez más pequeños, a

medida que se suceden las divisiones (Figura 1). Entre los estadios de 16 y 32 células los

blastómeros se ordenan y se redistribuyen, dando lugar al fenómeno de la compactación. De esta

manera, se establecen ciertas uniones entre las células que generan una estructura compacta que

recibe el nombre de mórula. Aún en estos estadios se conserva la capacidad de desarrollar

cualquiera de las células embrionarias (trofoblasto o embrioblasto), pero no la capacidad de

desarrollar un embrión completo. La formación del blastocisto se produce cuando las células de la

mórula se reordenan en torno a una cavidad central, denominada blastocele. En el blastocisto se

distinguen dos grupos de células que difieren entre sí tanto morfológicamente como

funcionalmente. El tipo celular interno, denominado masa celular interna o embrioblastema,

conserva su carácter pluripotente para poder generar cualquier tejido del embrión, mientras que el

otro tipo celular situado en la capa externa, el trofoblastema, perderá su pluripotencialidad para

adherirse al endometrio materno. Esta divergencia entre células del trofoblasto y células de la

masa celular interna constituye el primer evento de diferenciación del desarrollo de los mamíferos.

II.- OBJETIVOS:

Adiestrar en el manejo del protocolo de sincronización y superovulación ovárica

Adiestrar en la recuperación de embriones post mortem

Determinar el desarrollo y transporte embrionario en el tracto reproductivo de la coneja

Reconocer partes del embrión de coneja y estado de desarrollo

Adiestrar en la evaluación y clasificación de embriones según calidad y estado de desarrollo

III.- REVISION BIBLIOGRAFICA

SUPEROVULACION MANIPULACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES

DINÁMICA DE LA ONDA FOLICULAR DEL OVARIOAdams (1999) afirma que en 95% de las vacas presenta 2 a 3 ondas foliculares en cada ciclo estral.

Ciclos de una sola onda son reportadas en vaquillas antes de la pubertad y vacas durante el primer

intervalo enterovulatorio después del parto. Ciclo con 4 ondas ocasionalmente observados en vacas

Bos indicus.

La característica de una onda folicular viene dada por tres etapas reclutamiento, selección y

dominancia. El reclutamiento se define como la iniciación del crecimiento de folículos gonadotrofina

dependientes (2 mm de diámetro) en ovejas y primates, pero el número de folículos en crecimiento

es muy variable entre especies como es el caso de 50 en cerdas, 5 a 10 en vacas y 1 a 4 en yeguas.

Todos los folículos que inician son reclutados son potencialmente capaz de ovular. La selección es

un proceso muy complejo que comprende parámetros de tamaño y madurez. En todas las especies

la selección se da aparentemente por el desarrollo de LH receptores por las células de la granulosa,

lo cual se da cuando el folículo alcanza 4, 5 a 6, 8 y 25 mm de diámetro en ovejas, cerdas, vacas y

yeguas respectivamente (Driancourt, 2001).

1. FACTORES QUE AFECTAN A LA SUPEROVULACIÓN Los factores asociados con la administración de gonadotrofinas exógenos que afectan la

respuesta superovulatoria son; fuente, lote, actividad biológica de la hormona (Murphy et al.,

1984)

Según Kanitz et al., (2002) la transferencia de embriones en vacunos ha sido realizado en

programas de reproducción en todo el mundo por más de 20 años. La eficiencia de esta

tecnología, progresos y costos dependen en gran medida de las respuestas de tratamientos

superovulatorios y la inseminación artificial. Indudablemente las hormonas aplicadas y el

esquema de inseminación, son los factores principales, por ende, se centra en los aspectos

siguientes del tratamiento superovulatorio con FSH: relaciones de la dosis-respuesta,

bioactividad de la glicoproteína, FSH/Cociente de la LH, tiempo de la ovulación e inseminación,

frecuencia de la administración de la gonadotrofina y de la población folicular a la hora del uso

de la gonadotrofina.

2. DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO

El ovocito es ovulado en la segunda metafase y no completa la meiosis hasta la interacción con

el espermatozoide. En el bovino la ovulación se da aproximadamente a 24 de iniciado el estro y

la primera división se lleva a cabo a 48 h., después del estro . Este ovocito fecundado o no, es

una célula de 150190 µm de diámetro, incluyendo la zona pelúcida ó membrana pelúcida (una

capa glicoproteica) que tiene un grosor de 12 a 15 µm (Lindner and Wright, 1983).

Las primeras tres divisiones del embrión se denomina desarrollo (cleavaje), tal es así que hasta

8 células se les denomina estados de desarrollo (cleavage), durante estas etapas el embrión

decrece en peso (Seidel, 1991).

Durante el estado de mórula, las células embrionarias cambian de formas esféricas a

poligonales (este fenómeno se denomina compactación). Durante la compactación, uniones

especializadas hacen que las células se pueden comunicar con otras. La compactación es un

excelente signo de que los embriones están desarrollando normalmente; la perdida de

compactación a 6 días después del estro en vacunos indica desarrollo retardado (Seidel, 1991).

La mórula en desarrollo, internamente forma una cavidad (blastocele) por gasto de energía a la

bombera liquido entre las células, La formación del blastocisto, también es indicativo de

continuidad de desarrollo normal del embrión. La no formación de blastocele a 7-8 días después

del estro, significa retardado desarrollo (Seidel, 1991). En el ratón y probablemente en el

hombre la cavidad del blastocisto se inicia a formar cuando están presentes más de 20 a 30

células y el momento de la implantación se inicia cuando el blastocisto contiene más de 100

células. En coneja la formación de blastocisto se inicia cerca de tres divisiones más tarde que

en el ratón, mientras que el blastocisto maduro contiene varios cientos de células y mide 3 a 4

mm de diámetro. El momento en el que la cavidad aparece no está relacionada con el tamaño

del embrión (Austin and Short, 1982).

3. ERRORES EN LA FECUNDACIÓN

Polispermia

Varios espermatozoides penetran en ovocito y la formación de múltiples pronúcleos

masculinos y un pronúcleo femenino

En invertebrados el exceso de espermatozoides es eliminado porque el centriolo

espermático contribuye para la primera división del embrionaria

En mamíferos, el centríolo del espermatozoide no es esencial y el desarrollo puede

continuar si dos espermatozoides penetran, el cigoto triploide puede desarrollarse hasta

que ocurre una falla en el desarrollo temprano

Puede ocurrir en los ovocitos envejecidos debido a la falla o retardo del bloqueo a

polispermia.

Poliginia

Varios pronúcleos femeninos y un pronúcleo masculino

No ocurre normalmente en la naturaleza

Se puede producir por supresión de la eliminación del segundo corpúsculo polar

Androgenote

La unión de dos pronúcleos masculinos para formar el embrión

No ocurre en la naturaleza, pudiera ser el resultado del intercambio pronuclear

(manipulación del embrión in vitro)

Ginogenote

La unión de dos pronúcleos femeninos para formar el embrión

No ocurre en la naturaleza, pero puede ser resultado de una activación artificial del

ovocito (partenogénesis) y supresión de la eliminación del segundo corpúsculo polar

Partenogénesis

Activación del ovocito y el desarrollo sin participación del

espermatozoide

4. ESTADOS DE DESARROLLO EN BOVINO (Tiempo relativo del inicio de estro, estro = 0 h o día 0)

Fecundación (30 hr)

Cigoto (34 hr) definido cuando el pronúcleo está presente

División

2 cell (62 h, día 2)

4 cell (75 h, día 3)

8 cell (90 h, día 3)

16 cell (120 h, día 4)

Mórula (día 5-7) Cuando ocurre la compactación

Blastocisto (día 7-10) tiene la cavidad llena de líquido, tiene la masa interna de células y

el trofodermo

Eclosión (día 9-11)

Figura 4: Desarrollo embrionario temprano del embrión de bovino y transporte en el tracto

reproductivo

IV.- METODOLOGIA:

Las conejas serán superestimuladas con eCG (Folligon ®), con el siguiente protocolo

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Programa de sincronización y supe estimulación ovárica de conejas:

Coneja 1 Coneja 2 Coneja 3 Coneja 4 Aplic. eCG 50 UI (i.m.) 23/04 pm 22/04 pm 01/05 pm 30/04 pm Monta natural (2 serv) + Aplic. 0.2 ml GnRH (Conceptal)

26/04 (am) 25/04 (am) 04/05 (am) 03/05 (am)

Recuperación de embriones

28/04 (am) 28/04 (am) 7/05 (pm) 7/05 (pm9

Los embriones serán recuperados por lavado del oviducto y útero de hembras sacrificadas con

estro sincronizado a 72 horas post inseminación. Se utilizará como medio de lavado 40 ml de

solución Ringer suplementada con 5% suero bovino que será vertida por el infundíbulo con una

jeringa de 20 cc y aguja punta roma 18G de 1 ½”. Una placa petri en la parte baja de la unión

útero-cervix será el depósito utilizado para recuperar el colectado, siguiendo al procedimiento

realizado por Adams (1982) (ver Figura 1a).

de embriones h. Recuperación 72

GnRH+Servicio (68 h)

eCGInyec.

Figura 1: a) Método de lavado uterino para recuperar embriones (Adams, 1982) y b) Morfología

de blastocisto de coneja.

El líquido recuperado será revisado bajo un estereoscopio a 20X en búsqueda de embriones y luego

evaluados morfológicamente a 40X. Los embriones serán clasificados de acuerdo a criterios

establecidos por Lindner y Wrigth (1983) quienes consideran.

Estado de desarrollo: mórula, blastocisto temprano y blastocisto tardío; Calidad del embrión:

excelente, bueno, regular y pobre.

El alumno deberá completar la información siguiente y entregar junto con el cuestionario.

Tabla 1: Recuperación de embriones de conejas:

Coneja 1 Coneja 2 Coneja 3 Coneja 4

Raza CRIOLLOEdad 9 meses# partos 3 partosPeso vivo (kg) 4.5 kgFecha de monta Nro de servicios 2 serviciosFecha de recuperación 28/10/15Cuerpos lúteos OD y OI Folículos hemorrágicos OD y OI Ovas recuperadas

Estado de desarrollo ovas 2 células 4 células 8 células

Mórula Blastocisto temprano

Blastocisto Bastocisto tardio

Blastocisto protuido

……… ………. ……… …….. ……… ……. ……..

………. ………

……… ………. ……… …….. ……… ……. ……..

………. ………

……… ………. ……… …….. ……… ……. ……..

………. ………

9 3

2 ……… …….

1 1

……2

Calidad de embriones Excelente

Bueno Regular

……. …… ……

……. …… ……

……. …… ……

……. ……

3

Pobre …… …… …… …… Parámetros

Tasa de recuperación Tasa de fecundación

Embriones transferibles

……… ……. ……..

……… ……. ……..

……… ……. ……..

……… ……. ……..

Recomendaciones

V.- MATERIALES:

4 conejas adultas, 1 macho; serán sincronizadas y superestimuladas el ovario con la aplicación de

50UI de PMSG e inducidas ovulación con 0.2 ml de GnRH.

Folligon 1000 UI, Conceptal (1 frasco) y alimento de conejas

Bisturí (04 unid), Bandeja (01 unid), Pinzas (02 unid), aguja 18G, solución Ringer (1 lt), Placas de

100 mm (3 unid), jeringa de 10ml (2 unid)

Guantes quirúrgicos (1 par / alumno)

Papel Toalla (3 rollo / grupo)

VI. PROCEDIMIENTO:

1. Se tenía que sincronizar el celo del conejo para hacer la recuperación de embriones, la hormona que

se aplicó en el caso o el primer método de recuperación de embrión. Se aplica la hormona GnRH, la

dosis de 0.2 m.l. se le ase dos montas a la coneja hembra uno en la mañana y otro en la tarde.

Pasado las 48 horas se le tiene que sacrificar a la coneja para recuperar los embriones.

2. Luego sacrificar la coneja, por el método de asfixia con ayuda del éter, luego se tiene que desnucar a

la coneja.

3. Una vez muerto la coneja se tiene que desangrar, una vez desangrado se tiene que hacer un corte

en la línea alba para obtener el ovario y los úteros, luego se tiene que cortar los úteros.

4. Con la ayuda de la placa petri y el suero fisiológico de tiene que lavar los cuernos para recuperar los

embriones de la coneja, los cuernos se tienes que lavar por separado los dos cuernos tanto derecho

como izquierdo por separado cada uno.

5. Una vez lavada los cuernos del útero en la placa petri se lleva al microscopio para observar los

embriones de la coneja, cuando lo localizas o hallado ya lo has observado tienes que ver de cuantos

tiene o cuantas células tiene el embrión de la coneja para apuntar o contar las formas de los

embriones de la coneja.

VII. RESULTADOS:

1 2 3

4 5 6

7

VIII.- CONCLUSIÓN:

En esta práctica nos basamos en usar ovarios de vaca del camal para obtener óvulos asi

mi

IX.- CUESTIONARIO:

1. ¿COMPLETAR EL CUADRO DEL INFORME Y CONCLUIR?

Coneja 4Raza criolloEdad 9 meses de edadPartos ningunoPeso vivo kg 4.5KgFecha de nacimiento abrilNumero de servicios 2 veces de servicio Fecha de recuperación 28/10/15Cuerpo lúteos OD Y OIFolículos hemorrágicos OD Y OI

Ovas recuperadas Estado de desarrollo ovas 2 células 4 células 8 células Mórula Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto tardío Blastocisto protuido

932

…………………………

11

…………2

Calidad de embrión Excelente Bueno Regular pobre

………………

3…roto de embrión

Parámetros Tasa de recuperación Tasa de fecundación Embriones transferibles

…………………………………………………….…………………….

Recomendaciones

2. ¿CUÁL ES LA TEORÍA DE LA FORMACIÓN DEL BLASTOCELE?

El blastocele se forma durante la embriogénesis cuando el cigoto sufre el proceso de segmentación,

mediante el cual se divide repetidamente por mitosis en pequeñas células y origina una esfera

maciza llamada mórula; ésta se ahueca y origina la blástula con la mencionada cavidad central. En

los animales triblásticos, el mesodermo invade el blastocele que virtualmente desaparece, pero en

los pseudocelomados, el mesodermo es relativamente escaso, de manera que el blastocele persiste

como cavidad general del adulto y recibe el nombre de pseudoceloma; por ese motivo, algunos

autores, como Brusca y Brusca, prefieren llamar a estos animales blastocelomados. Según algunos

autores, en algunos grupos zoológicos, el blastocele da lugar al sistema vascular sanguíneo.

3. ¿CUÁL ES EL TIEMPO DEL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO EN OVINO CONEJO, MARRANA, HUMANO, RATÓN Y ALPACA?

4. ¿CÓMO ES EL MÉTODO DE RECUPERACIÓN DE EMBRIÓN EN CABRAS?

Si bien existen en la literatura trabajos de recuperación de embriones en cabras por lavaje

uterino transcervical (Pereira et al., 1998), la mayoría de los grupos alrededor del mundo

realiza la colecta y transferencia de embriones en forma quirúrgica (con o sin asistencia

laparoscópica). En combinación con las limitaciones previamente descriptas, la naturaleza

quirúrgica de los procedimientos agrega riesgo operatorio y repetibilidad limitada a la lista de

factores negativos para la utilización de esta tecnología en gran escala.

5. ¿ENUMERE EL DESARROLLO HISTÓRICO DEL ÉXITO DE LA TRANSFERENCIA DE

EMBRIONES EN MAMÍFEROS?

IX.- REVISIÓN BIBLIOGRAFICA:

http://www.institutomarques.com/fiv_transferencia_embriones.html

MARTA MUÑOZ LLAMOSAS. Área de Genética y Reproducción. Centro de

Biotecnología Animal. SERIDA. mmunoz@serida.org

http://www.serida.org/publicacionesdetalle.php?id=4578

https://www.google.com.pe/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UTF-

8#q=+recuperacion+de+embrion .