Pollution atmosphérique

3- Données expérimentales

Pr Armelle BAEZA,

baeza@univ-paris-diderot.fr

Equipe des réponses moléculaires et cellulaires aux xénobiotiques

Cliché J.J. Poirault

1-Données épidémiologiques

2-Principaux polluants. Réseaux de surveillance

de la pollution atmosphérique

Cliché J.J. Poirault

Le SMOG londonien:le « great smog » de 1952

mortality

hospital

admissions

emergency room visits

physician office visits

reduced physical performance

medication use

symptoms

impaired pulmonary function

subclinical (subtle) effects

Proportion of population affected

severity

of effect

POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET

IMPACTS SANITAIRES

WHO, 2000

POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET SANTE HUMAINE

• Effets à court terme:

gène respiratoire, toux, maux de gorge

crises d’asthmes

diminution des capacités respiratoires chez l’enfant

apparition de maladies cardiovasculaires

• Effets à long terme: difficiles à déceler

» Cancers,

» pathologies inflammatoires chroniques: asthme,

BPCO

Capillaires avec

hématies

Pneumocytes

de Type I

Pneumocytes

de Type II

macrophage

interstitium

cellules

ciliées

Cellules

sécrétrices

cils

Pharynx

Larynx

Trachée

Bronche

Bronchiole

Alvéoles

Voies aériennes

Épithélium mucociliaire

L’appareil respiratoire:

Cible des polluants atmosphériques

L’épithélium alvéolaire

l’épithélium mucociliaire

épithélium

lame basale

glande sous-

muqueuse

Mouvement

unidirectionnel du mucus

épiphase

Hypophase:

Fluide périciliaire

MUCUSl’épithélium mucociliaire

MECANISMES DE PROTECTION

• Barrière physique

• Transport mucociliaire: épuration des particules inhalées

• Fluide extracellulaire aux propriétés anti-oxydantes:

protection contre :

– environnement riche en oxygène

– espèces oxydantes relarguées par les cellules inflammatoires

– polluants à action oxydante

O3: oxydant non radicalaire

NO2: radical stable

Particules

direct

oxydants secondaires (nitrites)

direct

produits secondaires (H2O2 et radicaux libres)

direct

indirect (processus inflammatoires)

Particules et stress oxydant

Equilibre rédox

Oxydants (EAO) anti-oxydants

O2.-, H2O2,

.OH,

ROOH….

GSH, CAT, SOD,

GPX……

Particules et stress oxydant

Déséquilibre rédox stress oxydant

oxydants

anti-oxydants

Anti-oxydants du RTLF: respiratory tract lining fluid

Nasal RTLFAscorbate 10-50 µMUrate 100-400µMGSH 5-10 µMa-tocopherol <5 nM

Distal RTLFAscorbate 10-35 µMUrate 150-330µMGSH 70-225 µMa-tocopherol 100-500nM

Proximal RTLFAscorbate 20-45 µMUrate 100-300µMGSH 50-200 µMa-tocopherol 50-450 nM

PlasmaAscorbate 20-65 µMUrate 100-500µMTotal-SH 0.45-0.8mMa-tocopherol 5-25 µM

+ anti-oxydants enzymatiques:GPXSODCAT

+ piégeurs de métauxCaeruloplasminetransferrine

PENETRATION DES POLLUANTS DANS

L ’APPAREIL RESPIRATOIRE

GAZ

Région naso-pharyngée

Vapeurs d'acides

Arbre trachéo-bronchique

Gaz solubles (SO2)

Alvéoles Gaz peu solubles (O3, NOx)

Action locale

Voie d’entrée

Con

cent

ration

en

gaz

Distance du centre des voies aériennes

mucus sang cellules

épithélialesconduit aérien

gaz inerte

gaz réactif

Gaz hydrosolublesGaz non hydrosolubles

Devenir des gaz(Medinsky et Bond, Toxicol, 2001)

Action systémique

Action locale

hydrosolubleréactif

non hydrosolubleréactif

Solubilité dans l’eau

réact

ivité

Formaldéhyde:Tumeurs nasales

ozone:Dommages des voies aériennes inférieures

(Medinsky et Bond, Toxicol, 2001)

non hydrosolublenon réactif

benzène:hématotoxique

hydrosolublenon réactif

méthanol:acidose

PENETRATION DES POLLUANTS DANS L ’APPAREIL RESPIRATOIRE

GAZ

PARTICULES

Région naso-pharyngée

Vapeurs d'acides 5 à 30 µm

Arbre trachéo-bronchique

Gaz solubles (SO2) 1 à 5 µm

Alvéoles Gaz peu solubles (O3, NOx)

1µm

Clairance mucociliaire

(heures)

Clairance alvéolaire

(jours)

gravité

impaction

interceptionsédimentation

diffusion

Dépôtélectrostatique

Différents modes de dépôt des particules

Changements directionnels Vitesse de l’air

Région naso-pharyngée5-30 µmimpaction

TrachéeBronches

bronchioles1-5 µm

sédimentation

alvéoles1 µm

diffusion

Facteurs conditionnant le dépôt des

particules dans les voies respiratoires

Très abrupts

moins abrupts

faibles

++++

+++

0

++

+

D’après Lauwerys

bronche

bronchiole

Bronchiolerespiratoire

Alvéole

bronche

bronchiole

Bronchiolerespiratoire

Alvéole

bronchiole

Bronchiolerespiratoire

Alvéole

L’appareil respiratoire: voie d’entrée des particules

Pharynx

Trachée

Larynx

Voies aériennes supérieures

(extra-thoraciques)

Voies aériennes inférieures

(intra-thoraciques)

Alvéoles

Fahmya et al, Environ Toxicol. Pharmacol, 2010, 29: 173-182

Inhalation (10 mn) par le rat de particules fluorescentes

Rouge: 1,6µm

Vert : 190 nm

Zones d’accumulation de particules

Évaluation expérimentale de la toxicité pulmonaire

• Expositions humaines contrôlées (O3, NO2, PM)

• Études in vivo chez l’animal exposé à des aérosols ou gaz en chambre d’inhalation (essentiellement rat, également souris, cobaye…) :

toxicité aiguë et chronique, cancérogenèse…

• Études in vitro sur cultures de cellules d’origine animale ouhumaine :

tests de cytotoxicité,

mutagenèse,

études mécanistiques de toxicité.

OZONE Polluant secondaire:

issu de la transformation photochimique

des NOx et les COV

Oxydant puissant,

peu soluble dans l’eau

Pénètre aisément jusqu’aux alvéoles pulmonaires

Etudes épidémiologiques : Effets aigus

Corrélation entre les admissions à l’hôpital et les concentrations de l’air en O3

Augmentation de la prévalence de l’asthme

Fréquence des appels reçus par SOS médecins à Paris est significativement plus élevée les jours

correspondant à des teneurs élevées en O3 et /ou en sulfate particulaire

Chez les enfants: corrélation entre les paramètres fonctionnels respiratoires et les maximum

horaires des concentrations en O3

Expositions humaines contrôlées

Populations étudiées:État de santé, âge, sexe

Tabagisme, activité sportive

Expositions: seuil d’alerte 360 ppb/h

Exposition de 500 à 200 ppb

Exposition de 120 à 80 ppb

Effets mesurés

Sphère respiratoire supérieureIrritation du nez, de la gorge, toux, expectoration

Atteinte des fonctions respiratoiresSpirométrie (mesure des volumes et débits respiratoires, vem (volume

expiratoire forcé)

Réactivité bronchique Comparaison entre vem et la mesure de la résistance des voies

aériennes

Lavage broncho-alvéolaire (LBA)

réduction de la fonction pulmonaireeffets aigus dose et temps dépendants

résorption en 12 à 24 hrs majorés par l’exercice physique (Chitano et coll., 1995).

augmentation de la réactivité bronchique non spécifiqueconséquences chez les patients déjà atteints par des maladies obstructives ou sensibilisés àdes allergènes.accentuer la réponse bronchique des asthmatiques et abaisser le seuil de réponse auxallergènes auxquels ils sont sensibilisés (Devalia et coll., 1996).

inflammation des voies aériennes ++ polynucléaires neutrophiles dans BAL dès 6 d’exposition (persiste au delà de

24 hrs). précédée par la synthèse de chimioattractants tel l’interleukine 8 (IL-8)

lésions tissulairesvoies aériennes: déciliation, nécrose des cellules ciliées, dégranulation des cellulessécrétricesbronchioles: nécrose des pneumocytes de type I, diminution de l’activitéphagocytaire des macrophages

Altération des jonctions serrées entre les cellules épithélialesatteinte de la perméabilité de l’épithélium, augmentation de protéines dans BAL oedèmes.

Grande variabilité selon les individus.

Radical peroxyl

Addition électrophile

GSH Ascorbate Acide urique

OZONE

a tocopherol

Exposition humaine à O,2 ppm

air

03

Mudway et al, 1999

2 h expo

UA: acide urique

Endothélium

Tissu conjonctif

Tissus musculaire

lisse

Epithélium

mucociliaire

Mucus

Fluide

périciliaire

OZONE

Anti-oxydants (GSH, Ac urique, Vit C…)

Neutrophiles

ERO

protéines lipides

Oxydants

secondaires

Cellule

ciliée

MastocytesMédiateurs

proinflammatoires

NFkB

Ligands

de EGFR

Macrophages

Cellule

à mucus

Lame

basale

Les particules atmosphériques

PM2,5

Valeur limite : niveau à atteindre dans un délai donné et à ne pas dépasser, et fixé sur la base des connaissances scientifiques

afin d'éviter, de prévenir ou de réduire les effets nocifs sur la santé humaine ou sur l'environnement dans son ensemble.

Caractéristiques des particules atmosphériques

forte hétérogénéité taille

proximité du trafic

UF

30%

F

40%

G

30%

fond urbain

UF

7%

F

55%G

38%

Distribution relative en masse

Ramgolam et al., 2009, Val et al., 2011

Générées

mécaniquement

Générées par combustion

ou transformation

atmosphérique

Diamètre des particules (µm)

Nucléation Accumulation Grossières

Vo

lum

e r

ela

tif

de

s p

art

icu

les

Particules ultrafines

particules

grossières

particules

fines

HC/SO4

métaux

organique

Anderson JO et al., 2012

Caractéristiques des particules atmosphériques

0,2 µm

MET

MEB1 µm

Baulig et al., 2004, Val et al., 2011

« suies »

« suies »

forte hétérogénéité forme

Pneu

Caractéristiques des particules atmosphériques

COMPOSITION

- composés carbonés (élémentaires, organiques)- composés minéraux et sels (poussières)- ions (sulfates, nitrates)- métaux- composés biogènes (bactéries, virus, pollens)

- Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)

- métaux - endotoxines

Principaux composés

chimiques des PM (Paris)

PM Grossières PM Fines

dusts

sea salt

ions

CE

CO

CO

Ramgolam et al., 2009

forte hétérogénéité composition

Association entre la mortalité et de la morbidité pour cause cardiorespiratoire et

augmentation de la pollution particulaire

(Katsouyanni 1997, Zanobetti 2000)

Pour une augmentation de 10 µg/m3

Mortalité pour cause respiratoire +3,4%

Mortalité pour cause cardiovasculaire +1,4% (Momas et coll., 1993)

Lien plus fort entre morbidité respiratoire à caractère allergique ou infectieux et

pollution :

+ 15% des manifestations allergiques (Medina et coll., 1997)

Relation significative

PM et BPCO chez les personnes âgées

PM et asthme chez l’enfant

APHEA

CAFE

Réduction de l’espérance de vie des européens de 9,6 mois

Impacts sanitaires de la pollution particulaire:

études épidémiologiques

INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013

39 millions d’habitants de 25 villes européennes:

19 000 décès prématurés dont 15 000 pour causes cardiovasculaires

PM2.5 : 25

µg/m3

INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013

15 à 30 % de nouveaux cas d’asthme

de pathologies chroniques respiratoires

et cardiovasculaires chez les adultes âgés

de 65 ans et plus

Asthme (0-17 ans)

Pathologies coronariennes (65 ans)

Bronchopneumopathies chroniques obstructives (65 ans)

Groupe 2a: probablement

cancérigène pour l’homme

Groupe 1: cancérigène

pour l’homme

Groupe 1: la pollution de

l’air extérieur est

cancérigène pour l’homme

Groupe 1: les particules,

composante majeure de la

pollution de l’air extérieur,

sont cancérigènes pour

l’homme

L’approche toxicologique à travers l’étude des particules atmosphériques

Exposition particulaire et pathologies respiratoires et cardiovasculaires:

relations directes?

Mécanismes d’action des particules sur les organes et cellules cibles

Fractions particulaires responsables et rôle des associations

Etudes expérimentales

Etudes in vivo: expositions contrôlées

volontaires sains ou asthmatiques

animaux de laboratoire: inhalation – instillation intratrachéale

Etudes in vitro:

tranches d’organe

cultures cellulaires - animales / humaines

- lignée / cultures primaires

Types de particules testées:

Particules Diesel, PM10, PM2.5, PM0.1 , CAP

noir de carbone

Expositions contrôlées de volontaires ou d’animaux à des

PM (Diesel ou des CAPs (concentrated ambient Particles)

de 100 à 300 µg/m3 de 1 à 2 h

inflammation pulmonaire

inflammation systémique

Troubles du rythme cardiaque

Modifications du tonus vasculaires

Effet prothrombotique….

Effets sanitaires des PM: à court terme

Lavage broncho-alvéolaireBiopsie

Salvi et al., 1999, 2000, Ghio et al, 2012

+ allergènes: Effet adjuvants….

Ghio Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. 162: 981-988

• 8 sujets exposés à l'air versus 30 sujets exposés à des CAP (Concentrated Ambient Particles)

• Exposition 2 heures, PM : 23.1-311.1 µg/m3

•Effets 18h post-exposition

Pas de modification de la cellularité inflammatoire sanguine à 18h

Pas d'altération de la fonction respiratoire (immédiatement en post-exposition et après 18h)

Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez le volontaire sain

Etudes chez l’animal

Inhalation nose only instillation

Healthy /compromised animals

Méthodes pour évaluer la toxicité respiratoire

Saber Part. Fiber Toxicol. 2006. 3: 1-8

• Souris exposées à 20 ou 80mg/m3 Particules Diesel par inhalation, 90 mn

• Sacrifice à 1h, 3h ou 24h post-exposition.

Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez l’animal

Effets dépendants de la dose

Effets dépendants du temps

Endothelium

fibroblasts

smooth muscle

cells

airway

epithelium

Macrophages

médiateurs

inflammatoires(GM-CSF, IL8…)

Implication de l’épithélium dans la réponse pro-inflammatoire et sécrétions muqueuses

Mécanismes impliqués

Rôle des composantes particulaires dans cette réponse

Particules et réponse inflammatoire :quels sont les mécanismes d'action?

50

0

100

150

fond trafic

GM

-CS

F s

écré

té (

pg

/mL

)

1 5 10 20 30 1 5 10 20 30 µg/cm²

Sécrétion de GM-CSF

16 HBE, 24h

Baulig et al., Environ Sci Technol, 2004

Les particules induisent la sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires

GM

-CS

F

(% p

ar

rap

po

rt a

u t

ém

oin

)

50

100

150

200

250

300

aa

a c

a c

a

c

fond trafic

Sécrétion de GM-CSF

Baulig et al., Toxicol 2009

16 HBE, 10µg/cm2, 24h

Rôle des composantes organiques et aqueuses?

Boland et al., Am. J. Physiol., 1999- 2000

0

20

40

60

80

100

120

140

Contrôle - cata + cata

GM

-CS

F p

g/m

l

nPDi EOr

*

**

*

nPDi EOr

PDi issues ou non d’un véhicule équipé d’un

catalyseur

Particules et réponse inflammatoire :

PM

signal transduction

(implication of ROS, protein kinases?)

cytokines mRNA

Cytokines(GM-CSF)

inflammatory cells

recruitment

Transcription

factor activation(NF-kB)

Signal transduction(Involvement of ROS ,

protein kinases?)

Cytokine gene transcription

phagocytosis

Particules et réponse inflammatoire :

quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires induits par les particules?

IkB

IkB degradation: western blot

a-tubulin

IkBa

30 min 4 h2 h

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

% o

f IkB

a d

eg

rad

ati

on

/ co

ntr

ol

Bonvallot et al., 2000, 2001

Les particules activent la voie NF-kB

IkB

NF-kB DNA-binding : EMSA

NF-kB

1 h 2 h 4 h

0

10

20

30

40

50

% o

f N

F-k

B D

NA

bin

din

g in

cre

as

e

/ c

on

tro

l

1 h 4 h2 h

Densitometric analysis

Detection of phosphorylated kinaseswestern blot

Erk-P

Erk

p38-P

30 min 4 h2 h

Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001)

GM-CSF release24 h of treatment

100

200

Without

inhibitor

+

PD98059(10µM)

+

SB203580(1µM)

*

* *°*

*°°

*: different from the control

°: different from treatment without inhibitor

Erk p38

Les particules activent les MAP kinases

Erk JNK p38

Pourazar et al., 2005

Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo

DEP: 300µg/m3

1h expo

Fixation 6h post-expo

immunohistochimie

Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo

P-p38 / IL-8 P-c-jun / IL-8

GM-CSF release

*: different from the control

*°

°: different from treatment without antioxidant

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control DMTU NAC

° °

*°

*°

*°*°

10 mM 10 mM

NF-kB

NF-kB DNA binding

Control DMTU10 mM

*

*

*

control

DEP 10 µg/cm2

OE-DEP (15µg/ml)

Carbon black

Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001

Implication du stress oxydant?

GM-CSF mRNA

GM-CSF

IkB Anti-oxydants

ROS?

Origine des EAO?

Cœur carboné: réactivité de surface?Composés organiques?Métaux ?

PM

signal transduction

(implication of ROS, protein kinases?)

cytokines mRNA

Cytokines(GM-CSF)

inflammatory cells

recruitment

Transcription

factor activation(NF-kB , AP-1)

Signal transduction(Involvement of ROS ,

protein kinases?)

Cytokine gene transcription

phagocytosis

IkB

PM2.5

Production d’EAO dans les cellules

épithéliales bronchiques humaines

ES

R s

ign

al

(a.u

.)

Baulig et al., Environ Sci Technol, 2004

Baulig et al., Toxicol 2009

Production d’.OH en

condition abiotique

0

2000

4000

6000

8000

Te DEP fond

218%

984%

trafic

1545%

10000

12000

100

150

200

250

300

350

fond trafic

DC

F f

luo

resc

en

ce

(% d

u t

ém

oin

resp

ecti

f)

10 µg/cm² - 4 h

=

Extrait organique

=

Extrait aqueux

PM2.5

PM et production d’espèces activées de l’oxygène

Oxidation of dichlorofluoresceinPotentiel oxydant intrinsèque

Test de l'oxydation de la sonde CM-DCFH2-DA en condition acellulaire

T VEO3 D E G H0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.00 µg/mL

10µg/mL

50 µg/mL

100 µg/mL

Particules

*

*

*

*

* p<0.001

Va

leu

r n

orm

alis

ée

de

la

flu

ore

sce

nce

pa

r

ra

pp

ort

au

té

mo

in

Lot PM « biomasse »Lot PM « trafic »

Oxidation of dichlorofluorescein

Stress oxydant intracellulaire

Test de l'oxydation de la sonde CM-DCFH2-DA en condition cellulaire

T

VEO3 D E G H

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

1 µg/cm2

5 µg/cm2

10 µg/cm2

Particules

** * p < 0.01

*

**

**

** p < 0.001

**

*

**

**

Va

leu

r n

orm

alis

ée

de

la

flu

ore

sce

nce

pa

r

ra

pp

ort

au

té

mo

in

Lot PM « biomasse »Lot PM « trafic »

HAP

HAP

activés

CYP 1A1

EpRE/ARE GST

NQO1

HO-1

Ah R

CYP 1A1XRE

HAP-

Ah-ARNt

ROS

quinones

quinones

radical

semiquinone

NADP O2

NADPHO2

.-

Devenir des composés organiques des PM

nrf2

XRE

ADN CYP 1A1

Cytochrome P450

CYP 1A1

ARNm

CYP 1A1

Métabolites

+ EAOR

ati

o q

PC

R

ARNm CYP 1A1

Baulig et al., Toxicol 2009

0

10

20

30

40

50

DEP fond trafic

HAP µg/g109 210286

16 HBE, 10µg/cm2

24h

Récepteur

Ah

HAP

Biodisponibilité des HAP?

C

DEP

0 1 2 3 4 5 6 7

urban

background

kerbside

a

a

a

Re

al ti

me

PC

R r

ati

o

0

10

20

30

40

50

DEP urban

background

kerbside

50

100

150

200

250

300

350

C

ER

OD

kin

eti

c s

lop

e

urban

background kerbside

XRE activity

PAH µg/g

109

210

286

CYP 1A1 expression CYP 1A1 activity

Biodisponibilité des HAP? (2)

ARE activity

0

1

2

3R

ea

l ti

me

PC

R r

ati

o

DEP urban

background

kerbside

NQO-1 expression

0 1 2 3 4 5

Arbitratry units (Luc)

C

DEP

urban

background

kerbside

CB a

a

a

a

EpRE/ARE GST

NQO1

HO-1

nrf2

Nrf2 nuclear translocation

control exDEP

Métabolisation des composés organiques

Noyau

FAIBLE

Défense antioxydante

- Enzymes du métabolisme des Xénobiotiques

- Enzymes antioxydantes

INTERMEDIAIRE

Inflammation

- Cytokines

- Chimiokines

Cellule épithéliale bronchique

FORT

Mort Cellulaire

- Apoptose

- Nécrose

5µm

Niveau de stress oxydant

métaux

surface

FT

Boland et coll., 2000

Baulig et coll., 2009

Bonvallot et coll., 2001

Ferecatu et coll., 2010

Voies de signalisation EGFR, MAPK,

NFκB

Voi

e N

rf2

Knol et al, Part Fibre Toxicol, 2009, 6:19

ConclusionThe overall medium to high likelihood rating of causality of health effects of UFP

exposure and

the high likelihood rating of at least one plausible causal mechanism explaining

associations between ultrafine particles and cardiac events (respiratory

inflammation and subsequent thrombotic effects),

supports the need to consider inclusion of ultrafine particles in future health impact

assessments of (transport-related) air pollution.

…. Et le rôle de la taille?

pollution urbaine de fond

7 campagnes (hiver/été)

0

0,1

0,20,3

0,4

0,5

0,6

0,70,8

0,9

1

0,01 0,1 1 10 100

d (µm)

dC

/d(l

og

D)

Impacteur Dekati

13 étages

Toit du LEPI (Paris 13)

10,5 µm

30 nm

PUFFIN1

Primequal 2

rôle de la taille dans la réponse pro-inflammatoire induite par les particules

stage D 50 %

12 ≈ 6,7 µm

11 ≈ 4 µm

10 ≈ 2,5 µm

9 ≈ 1,65 µm

8 ≈ 1 µm

7 ≈ 0,65 µm

6 ≈ 0,4 µm

5 ≈ 0,25 µm

13 ≈ 10,5 µm

4 ≈ 0,17 µm

3 ≈ 0,1 µm

2 ≈ 0,06 µm

1 ≈ 0,03 µm

PM [0.1-0.03]

PM [1-0.1]

PM [2.5-1]

PM [10-2.5]

Dekati Impactor

13 stages

12 filtres de polycarbonate (pore 0.2 µm)

divisés en 4 classes de taille

Récupération des particules

Chaque filtre : 3 sonications de 5 sec

Chaque classe de taille dans 600 µL

de milieu de culture

stage D 50 %

12 ≈ 6,7 µm

11 ≈ 4 µm

10 ≈ 2,5 µm

9 ≈ 1,65 µm

8 ≈ 1 µm

7 ≈ 0,65 µm

6 ≈ 0,4 µm

5 ≈ 0,25 µm

13 ≈ 10,5 µm

4 ≈ 0,17 µm

3 ≈ 0,1 µm

2 ≈ 0,06 µm

1 ≈ 0,03 µm

PM [0.03-0.1]

PM [0.1-1]

PM [1-2.5]

PM [2.5-10]

Dekati Impactor

13 stages

Stratégie de traitement des cultures cellulaires

0

0,1

0,20,3

0,4

0,5

0,6

0,70,8

0,9

1

0,01 0,1 1 10 100

d (µm)

dC

/d(l

og

D)

isovolume

isomasse

600 µL isovolume

Ramgolam et al, Chemosphere, 2008

0

100

200

300

400

500

isovol1 isovol10

UF F I CUF F I CCtl

*

*

*°

*°

≠

≠

8.11 4.2 9.4 8110 42 94

**

GM

-CS

F /

rela

tive

to

co

ntr

ol

isovolume

sécrétion de GM-CSF ultrafine PM [0,03-0,1µm]

fine PM [0,1-1µm]

intermodal PM [1-2,5µm]

coarse PM [2,5-10µm]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

UF F I C UF F I C

* * * * ° *° *° *

a

ab

cbc

a

bc

d

1 µg/cm2 10 µg/cm2

*

isomasse

Ramgolam, Favez et al., Particle Fibre Toxicol, 2009

Pas de différence selon les saisons

Nitrate (NO3-)

Ammonium (NH4+)

Sulphate (non-sea

-salt, nss-SO42-)

Unaccounted

mass

Sea Salt

Mineral Dust

Composition chimique:

Ultrafine PM 0,1

Fine PM [1-0,1]

Intermodal PM [2,5-1]

Coarse PM [10-2,5]

HIVER ETE

Black Carbon

Water Insoluble

Organic Carbon

Water Soluble

Organic Carbon

Données LSCE, H. Cachier, O. Favez

Ramgolam, Favez et al., Particle Fibre Toxicol, 2009

Cliché, L. Martinon

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Te 0,1 1 10 30

AR

(n

g/m

L)

PM2.5 (µg/cm²)

Sécrétion d’Amphiréguline:Facteur de croissance ligand du récepteur à l’EGF

Blanchet et coll., 2004, Rumelhard et al., 2007s

éc

réti

on

d’A

R

(% d

u t

ém

oin

)

PM2.5 Ex orga

0

200

400

600

800

0

200

400

600

800

Té

**

0

5

10

15

20

25

30

Té

NAC

PMn

g A

R /

mL

+ +

+ anti-oxydantTGFa

0

10

20

30

40

0 10 20 30 40 50

[TG

Fa

] (p

g/m

L)

time (h)time (h)

amphiréguline

0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 10 20 30 40 50

[am

ph

ireg

ulin

] (n

g/m

L)

Identification d’un nouveau gène induit par l’exposition aux particules

Endothelium

fibroblasts

smooth muscle

cells

airway

epithelium

Macrophages

Remodelage

Effets long terme

Effets court terme

Inflammationmediators

Inflammatory(GM-CSF, IL8…)

Amphiréguline(EGFR ligands)

EGFR autocrine

effect

paracrine

effect

Rôle des ligands de l’EGFR?

x 50

Coupes de parenchymes pulmonaires

x 50

remodelage des parois des

voies respiratoires

Vancouver

(PM10 : 14 µg/m3)

Mexico

(PM10 : 66 µg/m3)

x 200

Churg et coll, 2003

Rôle des ligands de l’EGFR dans le remodelage bronchique?

Sécrétion AR dans les crachats chez les

asthmatiques (surexpression d’EGFR)

Sécrétion muqueuse est EGFR dépendante

Blanchet et al., AJRCMB 2004

Rumelhard et al, Toxicol. Lett, 2007

Rumelhard et al, Eur respir J, 2007

GM-CSF

Anti-

EGFR

GM-CSF

Particules

EGFRP

AG1478

bronchial epithelial cell

MAPkinases

Blocage de la liaison EFGR-Ligand

GM

-CS

F (

ng

/m

L)

+ Ac anti-EGFR

0,25 µg/mL

GM

-CS

F (

ng

/ml)

+ AG1478 1µM

Inhibition de l’activité Tyr K de l’EGFR

0

0,1

0,2

té PM

*

° °

0,3

0

0,2

0,4

0,6

té PM

*

° °

La sécrétion de GM-CSF est dépendante de l’EGFR

Rôle des ligands de l’EGFR: implication dans réponse pro-inflammatoire?

Activation de la voie EGFR: confirmation in vivo

Pourazar et al., 2008

DEP: 300µg/m3

1h expo

Fixation 6h post-expoair DE

EGFR

P-Tyr1173

air DE

réponse

pro-inflammatoire

C PM C PM

siNeg siTACE

AR

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

pm

ol/

mL

GM-CSF

0

10

20

30

40

50

60

70

pm

ol/

mL

C PM C PM

siNeg siTACE

Stress oxydant

TACE

ADAM17

GM-CSF

EGFR ligands

Particules

EGFRP

Pro -EGFRligands

Rumelhard et al., 2007, Ramgolam et al., 2012

EGFR

P

GM-CSFLigands

EGFR

Ligands

EGFR

Effet autocrine des ligands de l’EGFR sur la réponse pro-inflammatoire

PM et sécrétion muqueuse (MUC5AC)

Ctrl 10 50

PM2,5 µg

Ind

uction

ARNm M

UC5AC Trachée de souris

Contrôle PM2,5

10µg/cm²

MUC5AC DAPI

Val et al., Arch Toxicol, 2012

NCI-H292

0

2

4

6

8

10

12

14

%

ce

llu

les

MU

C5

AC

(+

)Ctl 0.1 1 5 10

PM2.5 (µg.cm-2)

EGF

Cell MUC5AC (+)

Inhibition de TACE

0

2

4

6

8

10

12

14

Ctrl TAPI-2 PM2.5 PM2.5

TAPI-2

ind

uc

tio

n A

RN

m M

UC

5A

C

IAL 2 4 53semaines

1

4 traitements espacés de 48h

PM

IAL 6

?

différenciation pathologique

Différenciation normale

squamous epitheliumStratified epithelium

mucous epitheliumMucin hypersecretion

mucociliary epithelium

100µl?

Cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques humaines

20 µm

Cellules ciliées

Cellules à mucus

Effets à long terme d’une exposition répétée aux PM

5µm

Boublil et al., 2012

NHBE particules 10µg/cm² 6 semaines

4 traitements

IAL 2 4 53semaines

1IAL 6

Persistance de la réponse pro-inflammatoire

Effets d’une exposition répétée aux PM: sécrétion GM-CSF

MUC5AC expression

x40

control Fine PM UltraFine PM

mucus

43

10

day

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

4310

MU

C5AC m

RN

A e

xpre

ssio

n

ctlFineUF ctlFineUF

day day

Milieux conditionnés

Tau

x d

e cr

ois

san

ce

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T PMF

Co-cultures

*

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

T PMF

Tau

x d

e cr

ois

san

ce

traitement4 traitements

Effets paracrines: prolifération de fibroblastes

Particules et cancérogenèse

Juin 2012: Diesel classé cancérogène pour l’homme (cat 1)

Niveau de preuves suffisant d’une association entre

exposition et un risque augmenté de cancers du poumon

Particules et cancérogenèse: études chez l’homme

Études épidémiologiques: cohorte chez les mineurs, travailleurs du rail et de

l’industrie du camionnage

•Association positive entre exposition et cancer du poumon

•Analyses exposition-réponse montrent des tendances positives et

statistiquement significatives

Particules et cancérogenèse: études chez l’animal

Echappement de moteur Diesel (entier): inhalation

•Induction de tumeurs varie selon les espèces:

chez le rat

Chez souris, 1 étude (+) sur 4

Chez le hamster, 3 études (-)

Echappement de moteur Diesel (fraction gazeuse seulement): inhalation

(-) chez le rat, la souris, le hamster

Particules de moteur Diesel: instillation intratrachéale

•Induction de tumeurs varie selon les espèces:

chez le rat

chez souris (non significatif)

chez le hamster, 1 étude (-)

De Marini, 2013

Exposition:Sang: adduits protéiquesUrine: 1-hydroxypyrèneAir: HAP

Dommages à l’ADN

Lymphocytes périphériques

Effets cytogénétiques

Micronoyaux Aberrations chromosomiques

Particules et cancérogenèse: études chez l’animal

Chez le rat

Rôle de la surcharge pulmonaire

Études de mutagenèse

(+) avec des extraits organiques

Particules et cancérogenèse:

Mécanismes?

génétiqueHAP: adduits

EAO: lésions oxydatives

épigénétiqueRéponse inflammatoire

Prolifération épithéliale

Inhibition de l’apoptose

Comment expliquer les effets cardiovasculaires des PM?

G Nalbone, Médecine et longévité, 2010

Passage des particules ultrafines

vers la circulation systémique(Nemmar, 2001, 2002)

inflammation systémique

Témoin PM fines PM ultrafines

Oil red O(lipides neutres)

Moma-2(Monocytes, macrophages)

Araujo et al, 2008

Effets cardiovasculaires à long terme: action proathérogène

75h

438 µg/m3, 4.56x105/cm3

112 µg/m3, 5.59x105/cm3

representative aortic root sections

(5h/jr, 3 jrs/sem)

Particules et réponse allergique

Chez l’allergique:

Induction de cytokines pro Th2 par les P. Diesel(IL-4, IL-6…)

Amplification de la réponse à un allergène

Rôle d’adjuvant des particules

Induction de l’état allergique chez un sujet sain?

Diaz-Sanchez et al, 1997

Instillation nasale

Particules et effets allergiques

Intranasal instillation

0,5µg PM

j1 j2

0,5µg PM+ 10 µg OVA

j4 j7 j9

0,5µg PM+ 10 µg OVA

0,5µg PM+ 10 µg OVA

0,5µg PM+ 10 µg OVA

J21 et 22 j23

1% OVA

cytokine levels in the lung

Cytokine Saline OVA UF#1+OVA

TNF-α 1.63 ± 0.1 2.75 ± 0.2 5.40 ± 0.5*

IFN-γ 1.13 ± 0.0 1.13 ± 0.0 1.48 ± 0.2

IL-5 0.95 ± 0.6 1.98 ± 0.2 13.5 ± 3.1*

IL-4 0.00 ± 0.0 0.25 ± 0.3 0.82 ± 0.4

IL-13 1.25 ± 0.5 1.51 ± 0.6 4.19 ± 0.8*

KC 3.84 ± 0.3 8.17 ± 0.8 12.8 ± 0.6*

IL-6 0.56 ± 0.3 1.41 ± 0.1 2.43 ± 0.3*

MCP-1 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0 9.34 ± 3.2*

MIP1-α 1.09 ± 0.4 1.99 ± 0.1 4.25 ± 0.6*

Li et al, 2009

Li et al, 2009

Particules et réponse allergique

Histopathology and morphometry of the left lung lobe. Volume de mucus

Nb éosinophiles

PM amplifient l’inflammation allergique- inflammation éosinophile- hyperplasie muqueuse

CONCLUSIONS

- PM fines et ultrafines: réponse inflammatoire via un stress oxydant

- Importance des composés organiques et des métaux dans les mécanismes d’action

- Importance de la granulométrie

- Induction de nombreux gènes dont ceux de l’inflammation, de la prolifération, de la différenciation

- Rôle d’adjuvant dans la réaction allergique

- Effets systémiques: passage de la muqueuse respiratoire? Modifications des paramètres sanguins et cardiaques

- Effet cancérigène