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VII CAIQ2013 y 2das JASP

AAIQ Asociación Argentina de Ingenieros Químicos - CSPQ

OPTIMIZACIÓN DE LAS VARIABLES RELEVANTES EN EL

TRATAMIENTO ÁCIDO DE ALPERUJO PARA INCREMENTAR

LA BIODISPONIBILIDAD DE AZÚCARES

M.L. Herrero1, L.M. Martín

2, C. Morandi

1, M.D. Vallejo

2, M.F. Sardella

1 y A.C.

Deiana1

1Instituto de Ingeniería Química – Facultad de Ingeniería – Univ. Nacional de San Juan

2Instituto de Biotecnología – Facultad de Ingeniería – Univ. Nacional de San Juan

Av. Libertador 1109 (oeste) – San Juan

E-mail: ([email protected])

Resumen. El alpeorujo es el residuo semisólido generado en el

procesamiento de aceitunas para obtención de aceite de oliva en sistemas de

extracción de dos fases. En San Juan se producen anualmente alrededor de

40.000 Tn de este residuo altamente contaminante (DQO: 230-240 g/Kg y

DBO: 90 g/kg, aproximadamente), cuyo tratamiento y disposición final

constituyen un serio problema. La fracción orgánica del alpeorujo incluye

compuestos que sirven como fuente de carbono y de otros nutrientes para

microorganismos, hecho que constituye una vía para su valorización a través

de la obtención de bioetanol. El contenido de carbohidratos en el alpeorujo

varía entre el 20 y 25 % de la materia seca y aproximadamente el 70 % se

encuentra en unidades de celulosa y hemicelulosa. Para incrementar la

biodisponibilidad de estos carbohidratos no solubles es necesaria la

aplicación de pretratamientos. Los pretratamientos químicos con álcalis o

ácidos, en particular con ácido sulfúrico diluído, presentan ventajas por su

fácil implementación, bajo costo y elevada eficacia. Este trabajo presenta la

optimización de las variables relevantes del tratamiento de alpeorujo con

ácido sulfúrico, con el objetivo de incrementar la biodisponibilidad de

azúcares. Para esto se recurrió en primer lugar a la selección de variables

A quien debe enviarse toda la correspondencia

VII CAIQ 2013 y 2das JASP

AAIQ, Asociación Argentina de Ingenieros Químicos - CSPQ

relevantes para el proceso, mediante el método de Plackett-Burman. Las

variables significativas o relevantes encontradas mediante este método

fueron temperatura, concentración de ácido y relación sólido-líquido.

Posteriormente, las variables relevantes fueron optimizadas para maximizar

el contenido de azúcares totales solubilizados, utilizando el método de Box-

Behnken, diseño experimental basado en los diseños factoriales

incompletos de tres niveles que permite construir las superficies de

respuesta. Los resultados indican que trabajando en las condiciones óptimas

se incrementa el contenido de azúcares en, aproximadamente, un 68 %.

Palabras clave: Alperujo, Pretratamiento, Ácido, Azúcares.

1. Introducción

La producción mundial de biocombustibles ha crecido rápidamente en la última

década, pero la sostenibilidad de muchos de los biocombustibles de primera generación,

que se producen principalmente a partir de cultivos alimenticios como cereales, caña de

azúcar y aceites vegetales, ha sido cada vez más cuestionada. Esto se debe a que se han

generado problemas debido al cambio de destino de cultivos de alimentos y a que los

efectos sobre el medio ambiente no han sido los que se esperaban. Esto ha aumentado la

atención puesta sobre la producción de los llamados biocombustibles de segunda

generación, que son aquellos obtenidos de materiales lignocelulósicos. Esta vía de

producción tienen numerosas ventajas, entre ellas la capacidad de utilizar materiales

residuales de otras actividades económicas, tales como la agroindustria (Eisentraut,

2010; Chiaramonti, 2012).

La biomasa de las especies vegetales está compuesta principalmente por celulosa,

hemicelulosa y lignina, con pequeñas cantidades de otros componentes como pectinas,

proteínas y cenizas. La proporción de estos componentes varía de una especie vegetal a

otra y también con la edad, etapa de crecimiento y otras condiciones de la planta

(Jorgensen et al., 2007).

La celulosa es el constituyente principal de las paredes celulares de las plantas y se

encuentra en forma de estructura fibrosa organizada. La hemicelulosa y lignina cubren a

las microfibrillas. La celulosa está presente, principalmente, en su forma cristalina, un



pequeño porcentaje se encuentra en forma desorganizada, celulosa amorfa, la que es

más susceptible a ser degradada enzimáticamente (Beguin, 1994; Laureano-Perez et al.

2005). La hemicelulosa es un carbohidrato de estructura compleja, cuyos monómeros

pueden ser pentosas (xilosa, arabinosa), hexosas (manosa, glucosa y galactosa) y

azúcares ácidos. La lignina es un heteropolímero amorfo que consiste en tres unidades

de fenilpropano diferentes (p-cumaril, coniferil y alcohol sinapil) vinculados entre sí por

distintos tipos de uniones. Otorga a la planta soporte, impermeabilidad y resistencia al

ataque microbiano, es insoluble en agua y ópticamente inactivo, lo que hace difícil su

degradación.

El proceso de conversión de biomasa a bioetanol comprende las etapas básicas de

hidrólisis de la celulosa para su transformación en azúcares y la posterior fermentación

de estos compuestos para la producción de etanol. Los tratamientos para producir esta

transformación son la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática (Ischizawa, 2007). La

presencia de lignina y hemicelulosa en los materiales lignocelulósicos dificultan la

accesibilidad de los ácidos o enzimas a la celulosa, reduciendo la eficiencia de la

hidrólisis (Hendriks and Zeeman, 2009). Por ello, se requiere la aplicación de

pretratamientos a estos materiales.

Los métodos de pretratamiento pueden ser divididos en: físicos (disminución de

tamaño), fisicoquímicos (pirólisis, tratamiento con vapor, hidrotermolisis, oxidación

húmeda), químicos (álcalis, ácidos, agentes oxidantes y solventes orgánicos),

biológicos, eléctricos o combinación de ellos. Los pretratamientos químicos con álcalis

o ácidos, en particular con ácido sulfúrico diluído, presentan ventajas por su fácil

implementación, bajo costo y elevada eficacia (Kumar et al., 2009). Numerosas

variables, tales como temperatura y concentración del ácido, tienen una marcada

influencia sobre los procesos involucrados en el pretratamiento y se hace necesario

buscar los valores óptimos de las mismas a fin de obtener los máximos rendimientos.

La optimización de las condiciones en que debe realizarse el pretratamiento es una de

las etapas más importantes en el desarrollo de un método eficiente y económicamente

viable. Los métodos de superficie de respuesta, entre los que se encuentra el método de

Box Behnken, son una efectiva herramienta de optimización cuando varios factores y

sus interacciones afectan la respuesta. Esta metodología ya ha sido aplicada con éxito al



pretratamiento de biomasa por otros autores (Karunanithy y Muthukumarappan, 2011;

Ferreira y col., 2009).

El alpeorujo es el residuo semisólido generado en el procesamiento de aceitunas para

la obtención de aceite de oliva. En San Juan se producen anualmente alrededor de

40.000 toneladas de este residuo altamente contaminante (DQO: 230-240 g/Kg y DBO:

90 g/kg, aproximadamente), cuyo tratamiento y disposición final constituyen un

problema ambiental. El contenido de carbohidratos en el alperujo está entre el 20-25%

(en base húmeda) y aproximadamente un 70% corresponde a celulosa y hemicelulosa

(Roig et al., 2006). Por ello, su aprovechamiento para generar productos de mayor valor

presenta beneficios económicos y ambientales.

Este trabajo presenta los resultados de la primera etapa de los estudios llevados a

cabo para evaluar la factibilidad de aprovechamiento de alperujo de oliva para producir

bioetanol. Se presenta la metodología aplicada para el pretratamiento ácido de este

residuo de la industria olivícola, con el objeto de mejorar las condiciones de hidrólisis

de la celulosa y la posterior fermentación de los azúcares a etanol, y los resultados de

los estudios estadísticos llevados a cabo para evaluar y optimizar las variables

relevantes en este proceso.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

Alpeorujo: se empleó alpeorujo fresco, provisto por la empresa SOLFRUT de la

provincia de San Juan. Fue conservado en frío a -15ºC, para mantener sus condiciones

iniciales. Para su caracterización inicial, fue secado en estufa a 105ºC.

Reactivos: las sustancias químicas utilizadas en el pretratamiento ácido fueron de

grado reactivo y en las determinaciones analíticas, de grado analítico.

2.2. Caracterización del Alperujo

Este material fue sometido a un conjunto de determinaciones. La humedad fue

analizada siguiendo la norma TAPPI T 412 om-06, que involucra el tratamiento del

material a 105ºC, en estufa, hasta peso constante.



El contenido de cenizas se obtuvo mediante la aplicación del procedimiento

establecido en la norma TAPPI T 211 om-07, mediante la calcinación de la materia

orgánica en horno mufla a 525± 25°C, hasta peso constante.

La materia volátil se determinó según la norma ASTM E 872-82, mediante la pérdida

de peso de la muestra al ser sometida a 950 ±20 °C en horno mufla durante 7 min.

La lignina se analizó bajo la norma ASTM D 1106-96, que establece un método

gravimétrico en el que la muestra es tratada con ácido para hidrolizar los carbohidratos,

haciéndolos solubles, dejando un residuo insoluble que corresponde al contenido de

lignina.

El contenido de azúcares totales fue obtenido aplicando el método de Dubois

(Dubois y col., 1956), que involucra la reacción de los azúcares con fenol y ácido

sulfúrico formando un compuesto de color, que es analizado por espectrofotometría, en

un equipo Hach DR-2010. Tal determinación se llevo a cabo sobre el extracto acuoso

del alperujo tratado obtenido luego de agregar un volumen de agua a una porción de

muestra, manteniéndolo en agitación durante media hora. El extracto fue filtrado y

centrifugado para obtener un líquido límpido.

2.3. Pretratamiento

El procedimiento seleccionado consistió en el tratamiento del residuo con ácido

sulfúrico en condiciones de operación fijadas. Para ello se puso en contacto el alperujo

con soluciones ácidas de diferentes concentraciones, a temperatura constante, en un

reactor Parr de 1 litro de capacidad.

Para identificar las variables relevantes en el proceso se utilizó un diseño de Plackett-

Burman. Este método permite establecer la relación entre las variables de estudio y la

variable respuesta reduciendo el número de experimentos (Bull, et al. 1990). Según

este diseño cada factor se coloca a 2 niveles, el número de experimentos N es múltiplo

de 4 y las variables pueden ser de tipo cualitativa o cuantitativa. Las variables

propuestas para este estudio fueron: concentración de ácido, temperatura, tiempo,

presión, relación líquido/sólido y agitación. El diseño estableció la ejecución de 8

experimentos. Los niveles menor (-) y mayor (+) de los factores se detallan en la Tabla



1. La Tabla 2 muestra la matriz del diseño experimental según el modelo de Plackett-

Burman, donde se observan los niveles de las variables correspondientes a cada ensayo.

Tabla 1. Variables y los niveles adoptados para el pretratamiento

Niveles

Variables - +

Conc. de H2SO4 (% p/p) 1 10

Temperatura (oC) Ambiente (20) 120

Tiempo (minutos) 10 90

Relación sólido/líquido (g/ml) 1/10 1/5

Tabla 2. Matriz de diseño experimental según el modelo de Plackett-Burman

Ensayo [H2SO4] Temp. Tiempo S/L Dummy Dummy Dummy

1 + - - + - + +

2 + + - - + - +

3 + + + - - + -

4 - + + + - - +

5 + - + + + - -

6 - + - + + + -

7 - - + - + + +

8 - - - - - - -

Las condiciones óptimas para el pretratamiento ácido de alpeorujo fueron

determinadas por medio de un diseño experimental de Box-Behnken de tres factores y

tres niveles. Se tomaron tres puntos centrales (Co=3), dando como resultado un total de

15 experimentos. Los rangos tomados para las variables así como los puntos centrales

son presentados en la Tabla 3. Los valores de las variables y sus combinaciones en cada

ensayo se presentan en la Tabla 7.

Tabla 3. Niveles de las variables tomado para Método de Box Behnken

Variables Rango Puntos centrales

Temperatura (oC) 20-200 110

Concentración de H2SO4 (%p/p) 5-20 12,50

Relación S/L (g/ml) 0,05-0,2 0,13



Tabla 4. Box- Behnken: diseño experimental de optimización

Ensayo [H2SO4] (% p/p)

Temperatura

(ºC) S/L

(g/ml)

1 - - 0

2 + - 0

3 - + 0

4 + + 0

5 - 0 -

6 + 0 -

7 - 0 +

8 + 0 +

9 0 - -

10 0 + -

11 0 - +

12 0 + +

13 0 0 0

14 0 0 0

15 0 0 0

El método de Superficie de Respuesta fue utilizado para describir la región

experimental y predecir las condiciones óptimas, basado en un polinomio de segundo

orden obtenido por regresión múltiple.

La variable respuesta seleccionada para evaluar el efecto del tratamiento ácido fue el

contenido de azúcares totales. Tal determinación se llevo a cabo sobre el extracto

acuoso del alperujo tratado. Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado.

Para analizar estadísticamente las respuestas, desarrollar un modelo por regresión

múltiple a partir de los datos experimentales, construir las superficies de respuesta y

predecir las condiciones que maximizan el contenido de azúcares totales solubilizados,

se empleó el programa Design-Expert 8.0.1 -Stat-EaseMR

.

3. Resultados y discusión

La aplicación de pretratamientos tiene como objetivo alterar el tamaño, la estructura

y composición de la biomasa, para que la hidrólisis de la fracción de carbohidratos a

azúcares monoméricos pueda lograrse rápidamente y con alta eficiencia. Esto involucra

básicamente la ruptura de las moléculas de lignina presentes en el residuo. En la Tabla 3



se presenta la caracterización del alperujo, realizada según las técnicas previamente

mencionadas. Este residuo, tal como es generado en el sistema de dos fases de

extracción de aceite de oliva, tiene consistencia de lodo, lo que justifica el elevado

contenido de humedad.

Tabla 5. Caracterización del alperujo

Determinación Valor

Humedad (%) 78,56

Cenizas (%) 4,8

Materia Volátil (%) 17

Lignina (mg/g de alperujo seco) 146,3

Azúcares Totales (mg/g de alperujo seco) 90,6

Los valores de azúcares totales encontrados como respuesta en los ensayos del

diseño de Plackett-Burman son expresados en mg/g de alperujo seco y se presentan en

la Tabla 6.

Tabla 6. Niveles de las variables en el diseño de Placket-Burman y valor de la

respuesta en cada ensayo (contenido de azúcares totales).

Ensayo [H2SO4]

(%p/p)

Temp.

(oC)

Tiempo

(min.)

S/L

(g/ml)

Azúcares

Totales

(mg/g)

1 10 20 10 1/5 85,22 2 10 120 10 1/10 192,36 3 10 120 90 1/10 177,85 4 1 120 90 1/5 73,46 5 10 20 90 1/5 69,67 6 1 120 10 1/5 86,36 7 1 20 90 1/10 70,11 8 1 20 10 1/10 61,68

La identificación de las variables relevantes se llevo a cabo mediante el cálculo del

efecto y, posteriormente, del valor t de cada una de ellas. Estos fueron comparados con

el valor t de Student (3,143) tabulado para un nivel de confianza de 99%. El efecto de

las variables se calculó como la media de las respuestas de las mismas en el nivel alto

(+) menos la media de las respuestas en el nivel bajo (-) y los valores t como la relación

efecto/error estándar. La Fig.1 muestra los valores t de los efectos adjudicados a cada



una de las variables y el valor de t de Student de tabla. Todas aquellas variables con un t

superior al valor de tabla se consideran significativas para el pretratamiento.

Fig. 1 Valores t de Student de los efectos de cada variable y valor de tabla indicado

con línea de puntos.

La temperatura, concentración de ácido sulfúrico y relación S/L mostraron efectos

significativos sobre la variable de respuesta. En particular, la temperatura y la

concentración mostraron un efecto positivo, lo que significa que un incremento de estas

variables conduce a un aumento de la variable de respuesta, mientras que la relación S/L

evidenció un efecto negativo.

A continuación se estudió el contenido de azúcares obtenido como función de la

temperatura, la concentración de ácido sulfúrico y la relación sólido líquido. La variable

tiempo (no relevante en el tratamiento) fue fijada en 30 minutos. La Tabla 7 presenta los

niveles de las variables para cada uno de los ensayos así como el contenido de azúcares

totales.

Aplicando análisis de regresión múltiple a los datos presentados en la Tabla 7 se llegó

al siguiente polinomio de 2° orden:

Y = -51,97189 + 1,67113 x1 + 2,63703 x2 + 1117,88704 x3 + 0,019222 x1 x2 +

18,72444 x1 x3 – 1,71259 x2 x3 – 0,32619 x12 – 0,013384 x2

2 – 3463,62963 x3

2 (1)

Donde Y es el valor predicho de contenido de azúcares totales en mg/g de alpeorujo

seco, x1 es la concentración de H2SO4 en % en masa, x2 es a temperatura en °C y x3 es



la relación sólido/líquido. El valor óptimo de las variables seleccionadas se obtuvo por

resolución de la ecuación (1).

Tabla 7. Box-Behnken: efecto de la concentración de ácido, temperatura y relación

sólido/líquido sobre el contenido de azúcares totales.

Ensayo [H2SO4] (% p/p)

Temperatura

(ºC) S/L

Azúcares totales

(mg/g alperujo

seco)

1 5 20 0,13 84,63

2 20 20 0,13 42,89

3 5 200 0,13 5,31

4 20 200 0,13 15,47

5 5 110 0,05 120,23

6 20 110 0,05 54,1

7 5 110 0,2 176,84

8 20 110 0,2 152,84

9 12,5 20 0,05 42,51

10 12,5 200 0,05 17,75

11 12,5 20 0,2 77,25

12 12,5 200 0,2 6,25

13 12,5 110 0,13 209

14 12,5 110 0,13 129,85

15 12,5 110 0,13 152,65

La Tabla 8 reporta valores estadísticos relevantes para el ajuste del modelo, como el

coeficiente de regresión R2. Un valor de R

2 = 0,9052 denota una buena correlación entre

los valores observados y los predichos por el modelo, es decir que más del 90,52 % de

la variabilidad en las respuestas puede ser explicado por el mismo. La adecuación de la

precisión (Adec. Precisión) mide la relación señal/ruido, la cual debería ser mayor que

4. En este caso un valor de 5,824 indica una señal adecuada.

Tabla 8. Indicadores de precisión del ajuste al modelo polinómico cuadrático para

solubilización de azúcares.

R2 0,9052

Media 85,84

R2 Ajustado 0.7347

Adec. Precisión 5.824



La relación entre la respuesta y las variables puede ser visualizada en las superficies

de respuesta, mostradas en la Figura 2.

(a)

(b)



Figura 2. Superficies de respuesta (concentración de azúcares totales, expresado en

mg/g de muestra seca) construidas variando en el rango dos variables independientes

((a)- temperatura (oC) y concentración de ácido (% p/p), (b)- concentración de ácido (%

p/p) y relación S/L (g/ml), (c)- temperatura (oC) y relación S/L (g/ml)), fijando la tercera

en su valor óptimo.

Las gráficas tridimensionales de las superficies de respuesta fueron construidas

mediante la ecuación (1) y muestran la influencia de las variables sobre el contenido de

azúcares totales, manteniendo una de ellas constante en su nivel óptimo, mientras se

hacen variar las otras dos dentro del rango experimental seleccionado (Varrone y col.,

2012). En la figura 2 se muestran la interacción entre temperatura y concentración de

ácido (a), concentración de ácido y relación sólido/líquido (b) y entre temperatura y

relación sólido/líquido (c) respectivamente.

Las condiciones óptimas para el pretratamiento de alpeorujo fueron determinadas a

partir de la ecuación (1) en los siguientes valores:

Temperatura: 95,2 ºC

Relación sólido/líquido: 0,17 g/ml

Concentración de H2SO4: 10,10 % en masa

Este resultado fue validado experimentalmente por triplicado y se obtuvo un

contenido de azúcares totales promedio de 151,53 mg azúcar/g alperujo seco, valor que

difirió en un 13% del predicho por el modelo (ecuación 1).

El contenido de azúcares totales del alpeorujo sin tratar es de 90,6 mg/g de material

seco. Es decir que aplicando un pretratamiento con ácido sulfúrico en las condiciones

(c)



óptimas se logró un aumento de alrededor del 68% del contenido de azúcares totales

disponibles, lo que se traduce en una mayor aptitud del material para ser posteriormente

sometido a un tratamiento biológico para la producción de bioetanol.

4. Conclusiones

Las condiciones operativas del pretratamiento de alpeorujo con ácido sulfúrico para

aumentar la biodisponibilidad de azúcares fueron optimizadas utilizando un método de

superficie de respuesta con diseño de Box-Behnken.

Mediante un diseño de Plackett-Burman se encontró que la temperatura,

concentración de ácido y relación S/L tienen influencia significativa sobre este proceso.

Las condiciones óptimas para el pretratamiento, determinadas mediante el método de

Box Behnken, fueron una temperatura de 95,2 ºC, una concentración de H2SO4 de 10,10

% en masa y una relación sólido/líquido de 0,17 g/ml. En estas condiciones el contenido

de azúcares totales fue de 151,53 mg azúcar/g alperujo seco.

Con la aplicación de este pretratamiento ácido se logró incrementar en un 68% el

contenido de azúcares totales del material respecto del mismo sin tratar.

Reconocimientos

Los autores agradecen a la Universidad Nacional de San Juan, por la infraestructura

puesta a disposición para la realización de este trabajo, y a CONICET, por la beca de

M.L. Herrero. También desean agradecer a la empresa SOLFRUT por el material usado

para este estudio.

Referencias

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