Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu ... · Od vzorca do antibiograma...

Diplomsko delo

Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s

standardnim postopkom

September, 2016 Mateja Zver

Mateja Zver


standardnim postopkom

Diplomsko delo

Maribor, 2016


standardnim postopkom Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Mateja Zver

Študijski program: visokošolski strokovni študijski program I. stopnje

Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani/a inženir/ka kemijske tehnologije (VS)

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Somentor: mag. Iztok Štrumbelj, dr.med

Maribor, leto 2016

Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu

I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III Zahvala ................................................................................................................................... IV

Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX 1 Uvod .................................................................................................................................. 1

1.1 Opredelitev problema ................................................................................................. 1

1.2 Cilji in teze diplomskega dela .................................................................................... 4 2 Teoretični del ..................................................................................................................... 6

2.1 Okužbe sečil ............................................................................................................... 6 2.1.1 Povzročitelji okužb sečil ..................................................................................... 6

2.1.2 Enterobakterije .................................................................................................... 9 2.2 Mikrobiološki postopki preiskave urina na patogene bakterije in glive .................... 9

2.2.1 Osamitev in identifikacija bakterij.................................................................... 10

2.2.2 Določitev koncentracije bakterij v urinu s semikvantitativno urinokulturo ..... 10

2.2.3 Določanje občutljivosti bakterij za antibiotike ................................................. 11 2.2.4 Mednarodne smernice za antibiogram .............................................................. 12

3 Pregled literature ............................................................................................................. 14

3.1 Direktni antibiogram ................................................................................................ 14 3.2 Vpliv poročanja mikrobioloških rezultatov ............................................................. 16

3.3 Evropske smernice za antibiogram – EUCAST ....................................................... 17 3.4 Antibiotik v urinu ..................................................................................................... 18

4 Materiali in metode dela .................................................................................................. 19

4.1 Primerjava antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim

inokulomom ........................................................................................................................ 19

4.1.1 Kultiviranje urina v navadnem bujonu ............................................................. 23

4.1.2 Barvanje po Gramu ........................................................................................... 27

4.1.3 Izdelava antibiograma ....................................................................................... 28 4.1.4 Pregled plošč po inkubaciji, merjenje con inhibicije in interpretacija

antibiogramov .................................................................................................................. 31 4.1.5 Metodologija primerjave rezulatov antibiogramov po standardni metodi in hitri

metodi s standardnim inokulomom ................................................................................. 33

4.2 Uspešnost dodatka vankomicina pri zaviranju rasti po Gramu pozitivnih bakterij . 34 4.2.1 Priprava laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL in priprava bujona

z vankomicinom .............................................................................................................. 35 4.2.2 Način primerjave rezultatov cepljenja urina v navadno vialo in vialo z

vankomicinom ................................................................................................................. 35

4.3 Določitev trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL ................... 35 4.4 Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu.............................................................. 36

5 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 38 5.1 Primerjava rezultatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s

standardnim inokulumom ................................................................................................... 38 5.1.1 Rezultati kultiviranja ........................................................................................ 38


II

5.1.2 Pozitivne viale - barvanje po Gramu in mikroskopski pregled preparata ......... 39 5.1.3 Pregled antibiogramov in odčitovanje con inhibicij ......................................... 39

5.1.4 Primerjava rezultatov hitrega in standardnega antibiograma ............................ 40 5.2 Vzporedna kultivacija v viali z vankomicinom ........................................................ 48 5.3 Določitev roka stabilnosti vankomicina v vodni raztopini za pripravo bujona z

vankomicinom ..................................................................................................................... 50 5.4 Dokaz antibiotika v urinu ......................................................................................... 51

6 Zaključek ......................................................................................................................... 52 7 Literatura.......................................................................................................................... 53 8 Priloge .............................................................................................................................. 57

8.1 Priloga 1. Šestdeset vzorcev, kjer je bila rast zaznana vsaj v navadnem bujonu -

podrobnosti posameznih vzorcev: izolati iz vzorca, ali so bili v preparatu po Gramu v viali

z navadnim ali vankomicinskim bujonom vidni le po Gramu negativni bacili, ali bi bil hitri

antibiogram smiselen, ali bi bil ob uporabi različnih strategij hitri antibiogram izdelan ali

ne. 9 Življenjepis ...................................................................................................................... 60


III

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledal/a sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)

Gesla: Število referenc

EUCAST IN disk diffusion 69

urinary tract infection IN direct antimicrobial testing 49

Vir: Google Scholar (https://scholar.google.si/)


detection of antibiotic activity IN urine 12

Alifax IN urine IN HB&L 14

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)


mikrobiologija IN mikrobi 105

infekcije IN urin 18

Skupno število pregledanih člankov: 65

Skupno število pregledanih knjig: 12

Maribor, september 2016 Mateja Zver


IV

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb, da je

sprejela mentorstvo pri diplomski nalogi in njeno strokovno

pomoč.

Iskrena hvala somentorju mag. Iztoku Štrumblju dr.med., ki mi

je omogočil opravljanje diplomskega dela v našem laboratoriju

in je kljub številnim nalogam našel čas za usmeritve in pomoč

pri nalogi.

Hvala moji družini, da nikoli niso nehali verjeti vame.


V

Naslov diplomskega dela Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim

kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s standardnim postopkom

Povzetek

Okužbe sečil z enterobakterijami so pogoste, za usmerjeno zdravljenje je pomemben kratek

čas do antibiograma.

Namen diplomskega dela je bil ugotoviti, ali je mogoče standardnemu enakovreden

antibiogram enterobakterij izdelati v enem dnevu od sprejetja vzorca.

Metode. Vzporedno s standardnim postopkom, ki traja 2 dni (en dan za kultivacijo urina, en

dan za standardni antibiogram (SAT), smo vzorce urinov cepili v viale z bujonom (NBJ) in

jih inkubirali v analizatorju HB&L (Alifax): če smo zaznali rast gostote McFarland 0,5, smo

naredili razmaz in če so bile vidne samo po Gramu negativne bakterije (NB), smo izdelali

hitri antibiogram (HAT). Razlika: pri HAT smo inokulum gostote McFarland 0,5 pripravili

iz NBJ, pri SAT iz kolonij urinokulture. Primerjali smo rezultate HAT in SAT.

Pripravili smo tudi vankomicinski reagent. Pri delu vzorcev smo preučili 4 možne strategije

uporabe vial z vankomicinom ali brez, z ali brez razmaza po Gramu.

Rezultati. Cepili smo 230 urinov, pri 52 vzorcih smo v standardnem in hitrem postopku

osamili eno vrsto enterobakterij – pri teh smo primerjali rezultate HAT in SAT. Skupno smo

testirali 1030 kombinacij izolat/antibiotik in ugotovili 99,7 % skladnost. Velikih neskladnosti

in zelo velikih neskladnosti ni bilo, ugotovili smo 0,3 % majhnih neskladnosti. Kriteriji za

uspešno validacijo metode so izpolnjeni: več kot 90 % skladnosti in manj kot 3 % velikih ali

zelo velikih neskladnosti.

Poleg NBJ smo 150 vzorcev cepili tudi v vankomicinski bujon - VBJ. Najbolj učinkovita

strategija je nacepitev urina v VBJ, razmaz po Gramu in izdelava HAT, če so v preparatu

vidne le NB.

Ključne besede: direktni antibiogram, EUCAST, urin, inokulum

UDK: 612.461:616-088.846.1(043.2)


VI

Naslov diplomskega dela v angleškem jeziku From the sample to the antibiogram of Enterobacteria in a day – evaluation of the method of

the parallel cultivation of the urine in broth in comparison with the standard procedure

Abstract

Enterobacteriaceae are common cause of urinary tract infections. Short time to results of

antimicrobial susceptibility testing (AST) is important.

Purpose of the thesis was to find out whether it is possible to do reliable AST of

Enterobacteriaceae from urine sample in one day.

Method. In parallel with the standard procedure, which lasts 2 days (one day for cultivating

urine and one day for standard AST (SAT), we inoculated samples in vials with broth (NBJ)

and incubate them in HB&L Analyzer (Alifax). If we detected growth with density at least

McFarland 0.5, Gram stain was used and if only Gram negative bacteria (NB) were visible,

we made fast AST (HAT). The difference: in HAT, inoculum was prepared from NBJ, in

SAT from colonies of urine culture. We compared the results of HAT and SAT.

We prepared vancomycin reagent and examined use of 4 possible strategies: use of vials

with or without vancomycin, with or without a Gram stain.

Results. We inoculated 230 samples and in 52 only one species of Enterobacteriaceae was

isolated with both standard and expedited procedure. In these samples, results of HAT and

SAT were compared: a total of 1030 antibiotic/isolate combinations were tested with 99.7%

agreement and 0.3% of minor discrepancies were found. No major or very major

discrepancies were found. Criteria for successful validation of the methods were fulfilled:

more than 90% agreement and less than 3% of major or very major discrepancies.

In addition, we inoculated 150 samples in vancomycin broth - VBJ. The most effective

strategy is use of VBJ, Gram stain of suspension and use of HAT, if only NB were visible in

Gram stain.

Key words: direct antimicrobial susceptibility testing, EUCAST, urine, inoculum

UDK: 612.461:616-088.846.1(043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 1-1. Časovni potek posameznih metod od vzorcev urina do rezultata antibiograma ... 4

Tabela 2-1. Delež izolatov različnih bakterijskih vrst v dveh starostnih skupinah pacientk v

raziskavi ECO-SENS, 2003. ............................................................................................. 7

Tabela 2-2. Razvrstitev povzročiteljev okužb sečil po patogenosti in pogostosti povzročenih

okužb po smernicah European Urinalysis Guidelines. ..................................................... 8

Tabela 4-1. Opredelitev pravilnosti ali nepravilnosti rezultata strategije pri posameznem

vzorcu glede izdelave in smiselnost hitrega antibiograma ............................................. 27

Tabela 4-2. Seznam testiranih antibiotikov, okrajšave na diskih in količine antibiotika v

diskih, uporabljenih pri testitanju izoliranih enterobakterij iz urina............................... 31

Tabela 4-3. Razvrstitev neskladnosti v odvisnosti od rezultatov standardnega in hitrega

antibiograma. .................................................................................................................. 33

Tabela 5-1. Pregled rezultatov standardne semikvantitativne urinokulture 230 vzorcev urina

........................................................................................................................................ 38

Tabela 5-2. Pregled izolatov 76 vzorcev, kjer so enterobakterije v semikvantitativni

urinokulturi zrasle kot edini izolat iz vzorca. ................................................................. 40

Tabela 5-3. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega

izolata za antibiotike - 52 hitrih antibiogramov. Podatki iz raziskave. .......................... 43

Tabela 5-4. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega

izolata za antibiotike -52 standardnih antibiogramov iz standardne urinokulture. Podatki

iz programa MBL. .......................................................................................................... 44

Tabela 5-5. Seznam in razvrstitev neskladnosti pri testiranih 52 izolatih enterobakterij (vsak

testiran z 20 antibiotiki ) ................................................................................................. 46

Tabela 5-6. Deleži skladnosti in neskladnosti rezultatov direktnega antibiograma v

primerjavi s hitrim antibiogramom (izraženo v odstotkih) ............................................. 47

Tabela 5-7. Število vzorcev v različnih kategorijah pravilnosti / nepravilnosti postopkov,

seštevek in delež pravilnih postopkov v različnih strategijah med 60 vzorci, pri katerih

smo zaznali rast v viali z navadnim bujonom ................................................................. 49

Tabela 5-8. Izmerjene cone inhibicije reagenta vankomicin za določitev roka stabilnosti .... 50


VIII

Seznam slik

Slika 4-1: Shema postopka primerjave antibiogramov po standardni metodi in HMSI – hitri

metodi s standardnim antibiogramom ............................................................................. 19

Slika 4-2: Shema standardnega postopka................................................................................ 20

Slika 4-3: Shema postopka hitre metoda s standardnim inokulumom .................................... 22

Slika 4-4: HB&L Uroquattro .................................................................................................. 24

Slika 4-5: Merilni prostor za viale v HB&L ........................................................................... 25

Slika 4-6. Sporočilo na ekranu HB&L, leva slika: sporočilo o viali, kjer je rast ≥ 0,5 McF,

desna slika: krivulja rasti mikroorganizmov v navedenem času..................................... 26

Slika 4-7: Dva primera antibiograma: konfluentna rast čiste kulture in mešana rast različnih

vrst. .................................................................................................................................. 32

Slika 4-8: Slika testiranja trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin ............................. 36

Slika 5-1: Diagram stabilnosti reagenta vankomicin .............................................................. 50

Slika 5-2: Primer dokaza antibiotika v urinu .......................................................................... 51


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Kratice AST testiranje občutljivosti za antibiotike (angl. antimicrobial susceptibility

testing)

ATCC ameriška zbirka tipskih kultur (angl. American Type Culture Collection)

CLSI Inštitut za klinične in laboratorijske standarde (angl. Clinical and Laboratory

Standards Institute)

CFB/L število poraslih bakterij/liter (angl. colony-forming bacteria/litre)

CFU/mL število poraslih kolonij/mililiter (angl. colony-forming units/mililitre)

EB enterobakterije

ECDC Evropski center za preprečevanje in obvladovanje bolezni(angl. European

Centre for Disease Prevention and Control)

ECLM Evropska zveza za laboratorijsko medicino (angl. European Council of Legal

Medicine)

ESCMID Evropsko združenje za klinično mikrobiologijo in infekcijske bolezni (angl.

European Society for Clinical Microbiology and Infection Disease Prevention

and Control)

ESBL betalaktamaze z razširjenim spektrom delovanja (angl. extended-spektrum

β-lactamase)

EMA evropska agencija za zdravila (European Medicines Agency)

EUCAST Evropski odbor za testiranje protimikrobne občutljivosti (angl. European

Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing)

HAT hitri antibiogram

HMSI hitra metoda s standardnim inokulumom

I zmerno občutljiv ali intermediaren (angl. intermediate)

KA krvni agar

MBL računalniški program

McF McFarland

MIK minimalna inhibitorna koncentracija

MHA Mueller Hinton agar

MRSA proti meticilinu rezistentna bakterija Staphylococcus aureus (angl.

methicillin-resistant Staphylococcus aureus)

NB negativne bakterije

NBJ viala z navadnim bujonom

NLZOH Nacionalni laboratorij za zdravje okolje in hrano

R odporen (angl. resistant)

SAB standardni antibiogram

SAT smiselni antibiogram

SKOUPZ Slovenska komisija za ugotavljanje občutljivosti za protimikrobna zdravila


X

SKUK semikvantitativna urinokultura

S občutljiv (angl.sensitive)

SP standardni postopek

URI kromogeni URI agar

VBJ viala z bujonom z vankomicinom

VRE vankomicin rezistentni enterokoki (angl. vancomycin-resistant enterococci)


1

1 Uvod

1.1 Opredelitev problema

Širjenje odpornosti mikroorganizmov proti antibiotikom se povečuje, kar predstavlja resen

zdravstveni problem tako pri nas kot drugod v Evropi in svetu.

Delovna skupina, ki jo je ustanovila britanska vlada, je nedavno proučila sedanje stanje v

svetu in izračunala posledice v prihodnosti. Ocenili so, da je zdaj število smrti zaradi

odpornosti proti protimikrobnim zdravilom v svetu 700.000 letno, če se trendi ne

spremenijo, pa bo do leta 2050 naraslo na 10.000.000 letno. S tem bi število smrti zaradi

odpornosti proti protimikrobnim zdravilom do leta 2050 preseglo skupno letno število smrti

zaradi raka (8.200.000) in prometnih nesreč (1.200.000). Bruto domači proizvod bi do leta

2050 zaradi tega lahko padel za 2 do 3,5 % 1.

Do nastanka bakterijske odpornosti pride zaradi pravilne kot neustrezne rabe antibiotikov.

Neustrezna raba antibiotikov je lahko:

- uporaba previsokih ali prenizkih koncentracij antibiotikov v veterini in humani medicini,

- neustrezen časovni interval zdravljenja (predolg ali prekratek čas),

- nepotrebna uporaba antibiotika širokega spektra,

- neusklajenost zdravljenja glede na podatke pridobljene z mikrobiološkimi raziskavami.

Okužbe sečil so za okužbami zgornjih dihal druga najpogostejša skupina infekcijskih

bolezni. Zaradi te pogostosti se v praksi za vnetja sečil predpiše kar 15% vseh predpisanih

antibiotikov.

Zaradi navedenih dejstev, ki povečujejo tveganje za odpornost bakterij in deleža porabe

antibiotikov za zdravljenja vnetij sečil, je veliko raziskav usmerjenih v čim hitrejšo

mikrobiološko diagnostiko.

Mikrobiološka diagnostika preiskave urina, s katero se določi povzročitelja okužbe in

občutljivost izolata za antibiotike ali njegovo odpornost proti antibiotikom, je osnova

usmerjenega zdravljenja pri okužbi sečil.

Večino antibiotikov se predpiše izkustveno, saj je čas od odvzema vzorca do rezultata

antibiograma praviloma približno 48 ur, kar je predolg čas, da bi z uvedbo zdravljenja lahko

čakali na izvid.

Čim hitrejši izvid je koristen za usmerjeno zdravljenje (zoženje spektra zdravila ali

zamenjava neučinkovitega antibiotika z učinkovitim, če je proti izkustveno uporabljenem

antibiotiku povzročitelj okužbe odporen).

V Centru za medicinskom mikrobiologijo Nacionalnega laboratorija za zdravje okolje in

hrano, v Oddelku za medicinsko mikrobiologijo Murska Sobota uporabljamo


2

semikvantitativno kultiviranje urina – iz poraslih kolonij naredimo antibiogram. Z navedeno

preiskavo, s katero določimo število in vrsto bakterij, sledi protimikrobno testiranje

občutljivosti izolirane bakterije, je potreben za končni rezultat čas približno 48 ur od

nacepitve vzorca. V nalogi nas zanima celotni čas od vzorca do antibiograma.

Antibiogram (določanje občutljivosti za antibiotike) enako kot večina evropskih

laboratorijev izvajamo s standardno metodo po smernicah organizacije European Committee

on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Uporabljamo disk-difuzijsko metodo,

čas inkubacije je 16 – 20 ur. Na te smernice je Slovenija prešla aprila leta 2014, prej smo

uporabljali ameriške smernice organizacije Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI).

Da bi rezultat dobili čimprej, so poskušali antibiogram pri okužbah, kjer je povzročitelj

praviloma ena bakterija (okužbe krvi in seča), narediti direktno iz vzorca – »direktni

antibiogram« – v našem primeru torej iz seča.

Obstaja več objavljenih raziskav z direktnim antibiogramom iz urina, večinoma so narejene

po smernicah CLSI (po metodi, ki je v Sloveniji ne uporabljamo več), tako da so rezultati teh

študij za nas le delno uporabni. Našli smo le eno študijo, kjer so direktni antibiogram iz urina

naredili po smernicah EUCAST 2.

Postopki za antibiogram so podrobno standardizirani, eden od bistvenih dejavnikov je

začetni inokulum, ki mora biti gostote 0,5 po McFarlandu.

Direktni antibiogram ima dve težavi – 1.) inokulum ni standardiziran, saj ne poznamo

koncentracije bakterij v vzorcu seča; 2.) v vzorcu je lahko več kot ena vrsta bakterij. V

švedski raziskavi so direktni antibiogram odčitali pri 188 od 233 vzorcev, saj je bil inokulum

pri ostalih preredek in zato rezultatov niso odčitali (inokulum po disk-difuzijki metodi

EUCAST mora imeti konfluentno rast bakterij na plošči).

Problemu mešanih bakterij v direktnem antibiogramu se lahko delno izognemo, če vzorec

seča pobarvamo po Gramu in ugotovimo, da gre za po Gramu pozitivne in po Gramu

negativne bakterije (direktnega antibograma v tem primeru ne naredimo). Ne moremo

razlikovati dveh ali več po Gramu negativnih bakterij.

Da bi odpravili problem z nestandardiziranim inokulumom, so v slovenski raziskavi

uporabili naslednji pristop: vzorec urina so nekaj ur kultivirali v bujonu, nato bujon redčili

do predpisane gostote McFarland 0,5 in še isti dan naredili antibiogram. Rezultati so bili

dobri, vendar narejeni po smernica CLSI, ki se v Sloveniji ne uporabljajo več; poleg tega so

v raziskavi uporabili posebno nestandardno gojišče – kromogeni agar Mueller Hinton.

Metoda združuje hitrost direktnega antibiograma in standardiziranost inokuluma

standardnega antibiograma, v nadaljevanju jo bomo imenovali hitra metoda s standardnim

inokulumom – HMSI 3.


3

V povzetku navajamo časovni potek posameznih metod preiskave urina:

STANDARDNA METODA: od nacepitve urina do končnega rezultata preteče čas 48

ur, kar je za začetek zdravljenja neugodno.

DIREKTNI ANTIBIOGRAM: potreben čas od nacepitve urina do orientacijskega

antibiograma preteče 24 ur, vrednosti odčitkov občutljivosti bakterije za antibiotike

so le orientacijske, ker antibiogram ni izveden iz standardnega inokuloma.

HMSI: od nacepitve urina do končnega rezultata je potrebnih 24 ur, metoda je

omejena le na vzorce urina, kjer je povzročitelj okužbe ena bakterija.

Med povzročitelji okužb sečil so daleč najpogostejše enterobakterije (Enterobacteriaceae),

pri katerih je v zadnjem času prišlo do velikega porasta odpornosti, zato je hiter antibiogram

pri njih zelo pomemben. V raziskavi se bomo omejili nanje.

Praviloma okužbo sečil povzroča ena sama bakterijska vrsta, najpogosteje enterobakterije.

Po Gramu pozitivne bakterije redkeje povzročajo okužbe sečil; če so povzročitelj, so

praviloma prisotne v veliki koncentraciji – tovrstni vzorci niso del raziskave.

Za našo raziskavo so težava po Gramu pozitivne bakterije, ki so kontaminanti, del normalne

mikrobiote, ki v majhni količini pridejo v seč ob odvzemu urina, v bujonu pa se nato

razmnožijo in kot redke majhne kolonije včasih motijo odčitavanje antibiograma HMSI. V

navedeni slovenski raziskavi so bili ti kontaminanti vidni kot majhne modro obarvane

kolonije na kromogenem agarju, na standardnem Mueller Hinton agarju pa niso obarvane in

je zaradi njih antibiogram enterobakterije lahko težje odčitljiv.

Problemu se je verjetno mogoče izogniti z dodatkom vankomicina (zavre po Gramu

pozitivne bakterije) v bujon. Bujon z vankomicinom v laboratorijih NLZOH uporabljamo za

kultiviranje nadzornih kužnin (brisov rektuma); ali deluje tudi z vzorci urina, ni znano.


4

1.2 Cilji in teze diplomskega dela

HMSI skrajša čas od vzorca do rezultata antibiograma za polovico, niso pa objavljene lastnosti HMSI

v primerjavi s standardno metodo.

Cilj naloge je primerjati rezultate antibiograma, narejenega s HMSI, v primerjavi s standardnim

antibiogramom standardne metode. Osnovni postopek prikazuje tabela 1-1.

Tabela 1-1. Časovni potek posameznih metod od vzorcev urina do rezultata antibiograma

METODA

TRAJANJE

STANDARDNA METODA HITRA METODA S STANDARDNIM

INOKULOMOM (HMSI)

1. dan

(čas=0)

urin cepimo na URI agar

(URISELECT 4 agar) in KA (krvni

agar),

inkubiramo 18 – 24 ur

1. urin cepimo v HB&L vialo z »eugonic«

bujonom

2. če je rast po nekaj urah do

gostote ≥ 0,5 McF

3.preparat po Gramu

4.če le po Gramu neg. bakt.

5. izvedba standardnega antibiograma iz

inokuluma McF 0,5

16 do 20 ur

2. dan

(čas=24 ur od

nacepitve vzorca)

izvedba standardnega antibiograma

iz kolonij

16 do 20 ur

odčitamo antibiogram HMSI

3. dan

(čas=48 ur od

nacepitve vzorca)

odčitamo standardni antibiogram

»Eugonic« bujon: gre za sterilni bujon za kultiviranje urina v vialah z vloženim magnetnim

mešalčkom, ki se po nacepitvi vloži v HB&L aparaturo, ki z vrtenjem mešalčka pospeši rast

v bujonu.

Za ugotovitev, ali so rezultati antibiogramov izolatov, pridobljeni s hitro metodo primerljivi

s klasično, je potrebno opraviti primerjalno študijo med obema metodama. Primerjalne

študije antibiogramov za bakterije, ki so bile izolirane po hitri metodi z bujonom in po

standardni metodi, so bile že opravljene, vendar po smernicah CLSI. Od leta 2014 veljajo v

Sloveniji sprejete EUCAST smernice, zato je potrebno, da se izvede vzporedna primerjava

protimikrobnega testiranja občutljivosti po veljavnih evropskih smernicah.

Poleg standardne metode bomo vzporedno izvajali metodo HMSI; kot bujon HMSI bomo

vsaj v začetku vzporedno nacepili vialo bujona z vankomicinom in originalno vialo brez

vankomicina.


5

Glavni cilj diplomske naloge:

1. Evaluacija HMSI metode v primerjavi s standardnim postopkom obdelave vzorcev

urina in antibiogramom iz čiste kulture kolonij.

Bistveni rezultat bo za veliko število antibiotikov (za vsak antibiotik posebej) ugotovljeno

število ujemanja rezultatov obeh metod (občutljivost, intermediarnost, odpornost) ter

majhnih, velikih in zelo velikih napak HMSI antibiograma v primerjavi s standardnim

antibiogramom.

Teza, ki temelji na objavljeni študiji s CLSI postopkom in neobjavljeni raziskavi je, da je

metoda vsaj dobra orientacijska metoda, raziskava pa bo vsaj pilotno pokazala, ali je tudi

enakovredna standardni metodi. Od rezultatov bo odvisna uporabnost metode v praksi.

Analiza je zanimiva za mikrobiološke laboratorije znotraj Nacionalnega laboratorija za

zdravje, okolje in hrano, katerega del je tudi Oddelek za medicinsko mikrobiologijo Murska

Sobota, zato se bo izvajala kot del dejavnosti NLZOH. Ob potrditvi ustreznosti hitre metode,

bi v prihodnosti bila dana možnost nudenja višje kakovosti storitev našim naročnikom.

Podrejena cilja diplomskega dela sta:

2. Ugotoviti, kako uspešno zavira rast po Gramu pozitivnih bakterij dodatek

vankomicina v bujonu.

3. Ugotoviti trajnost vankomicina v raztopini, ki jo bomo dodajali v viale HB&L.

Vsakodnevno tehtanje bi bilo namreč za prakso prezahtevno. Raztopino bomo kapnili

na prazen disk, ki ga bomo uporabili za kontrolni antibiogram s standardnim sevom:

izmerjena inhibicijska cona bo pokazala aktivnost vankomicina v raztopini.


6

2 Teoretični del

2.1 Okužbe sečil

Okužba sečil pomeni vdor mikroorganizmov v sečila, kjer se v sečniku, votlem sistemu ali

ledvičnem parenhimu razmožijo in povzročijo vnetje. Običajni povzročitelji so bakterije,

redkeje glive, virusi ali paraziti 4.

Bakterijske okužbe sečil najpogosteje povzročajo bakterije, ki so del črevesne in nožnične

flore in prodrejo v sečila ascendentno, po sečnici navzgor, se prilepijo na epitel sečil in se

razmnožijo, lahko pa se razširijo tudi v zgornje dele sečil (sečevod, ledvice).

Bakterije lahko vnesemo v sečila tudi pri endoskopskih preiskavah ali vstavljanju urinskega

katetra.

Okužbe sečil razdelimo glede na anatomsko umeščenost okužbe:

Okužbe spodnjih sečil: uretritis (okužbe sečnice), cistitis (okužbe sečnega mehurja),

pri moških pa še epididimitis in prostatitis.

Okužbe zgornjih sečil: pielonefritis (vnetje ledvičnih čašic) in ledvični absces.

Sečila so pri zdravem človeku brez mikroorganizmov v večjem delu urinskega trakta, le v

spodnjem delu sečnice je mikrobna flora, ki je naravna zaščita pred okužbo sečil. Obrambo

pred okužbo predstavljajo tudi beljakovine v seču, ki vežejo mikrobe in preprečujejo njihovo

adheranco na sluznico. Ob spontanem mokrenju je zelo verjetno, da zaradi turbulence toka

seča in refluksa seča, v sečni mehur pride majhno število bakterij, ki pa v večini primerov ne

povzročajo okužbe, kajti te bakterije odstranimo ob naslednjem praznjenju sečnega mehurja.

Na morebitni razvoj okužbe vplivajo: število bakterij, lastnosti bakterij ter lokalni in

sistemski obrambni mehanizmi. Pojav simptomatske okužbe sečil je odvisen od razmerja

med sposobnostjo bakterij, da vdrejo v sečila, in sposobnostjo organizma, da bakterije

odstrani 5.

2.1.1 Povzročitelji okužb sečil

Več kot 95% nezapletenih okužb sečnega mehurja povzroča ena sama vrsta bakterij in

večinoma je povzročitelj Escherichia coli (80-90%), pri mladih ženskah pa po pogostosti

sledi Staphylococcus saprophyticus. Zapletene okužbe sečil in okužbe sečil pri bolnikih s

funkcijskimi in anatomskimi nepravilnostmi sečil, pacientih po operacijah ali pacientih s

presnovno boleznijo in bolnikih v negovalnih ustanovah, so kar 30 % polimikrobne 5.

V študiji ECO·SENS, ki je bila izvedena leta 2003 (Kahlmeter) in je bila prva mednarodna

raziskava o protimikrobni odpornosti patogenov iz nezapletenih okužb sečil, je bilo

vključenih 252 zdravstvenih ustanov iz 17 držav. Preiskovanih je bilo 4734 vzorcev

srednjega curka urina pacient s simptomi nezapletenih okužb sečil. Bakterije so bile prisotne

pri 3278 ( 69,2%) pacientkah. V tabeli 2-1 prikazujemo podrobnosti izolatov, podatki kažejo,

da E. coli predstavlja več kot 75 % izolatov 6.


7

Tabela 2-1. Delež izolatov različnih bakterijskih vrst v dveh starostnih skupinah pacientk v

raziskavi ECO-SENS, 2003.

Starostna skupina (v letih)

18-50 (n=3445) 51-65 (n=1289)

Vsi izolati 2344 (68) 934 (72,5)

E. coli 1822 (77,7) 703 (75,3)

P. mirabilis 122 (5,2) 86 (9,2)

Klebsiella spp. 65 (2,8) 37 (4,0)

druge Enterobacteriaceaea 91 (3,9) 37 (4,0)

S. saprophyticus 108 (4,6) 11 (1,2)

drugi izolatib 136 (5,8) 60 (6,4)

a Acinetobacter spp, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella morganii

b ostali Staphylococcus spp, Enterococcus spp.


8

Povzročitelje okužb sečil so strokovnjaki Evropske zveze za laboratorijsko medicino ( ECLM, 2000)

razvrstili v 16 kategorij, na osnovi štririh stopenj patogenosti (I-IV) in pogostosti povzročenih okužb

(A-D), kar prikazuje tabela 2-2. Podatki v tabeli so pridobljeni po večletnem zbiranju podatkov

kliničnih mikrobiologov 7.

Tabela 2-2. Razvrstitev povzročiteljev okužb sečil po patogenosti in pogostosti povzročenih

okužb po smernicah European Urinalysis Guidelines.

Patogenost v

sečilih

Pogostost

povzročenih

okužb (%)

A. Običajen

(> 10%)

B. Redkejši (1-

10%)

C. Neobičajen

(0,1 – 1%)

D. Redek

(<0,1%)

I. Primarni

patogen

Escherichia coli Staphylococcus

saprophyticus

E. coli – CO2

odvisna

Salmonella spp.

II. Sekundarni

patogen

Enterobacter

spp.

Enterococcus

spp.

Klebsiella spp.

Proteus mirabilis

Pseudomonas

aueruginosa

Citrobacter spp.

Morganella

morganii

Proteus vulgaris

Serratia spp.

Staph. aureus

Corynebacterium

urealyticum

Haemphilus spp.

pnevmokoki

III. Vprašljiv

patogen

Streptococcus

agalactiae

Kvasovke

Koagulaza neg.

stafilokok

Acinetobacter spp.

Pseudomonas spp.

Stenotrophomonas

maltophilia

Številni mikrobi

IV. Običajna

uretro-genitalna

flora

Alfa hemolitični

(viridans)

streptokoki

Gardnerella spp.

laktobacili

Bifidobacterium

spp.

difteroidi

I. Primarni patogen: vrsta povzročiteljev, ki povzroči nezapletene okužbe sečil. V to

skupino spadata E. coli in S. saprophyticus.

II. Sekundarno patogeni povzročitelji: vrste, ki redko povzročijo nezapleteno okužbo sečil,

vendar se pogosto pojavljajo v bolnišnično pridobljenih okužbah sečil. Enterobacter

spp., Enterococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp. in Staph. aureus so pogosti

sekundarni povzročitelji.

III. Vprašljiv patogen: bakterije, ki so del bakterijske flore kože in druge vrste. Koagulaza

negativni stafilokoki (razen S. saprophyticus) so včasih povzročitelji bolnišnično

pridobljenih okužb sečil.

IV. Običajna uretro-genitalna flora: vrste, ki so del običajne urogenitalne flore. To so

pogosto kontaminanti urinskih vzorcev.


9

2.1.2 Enterobakterije

Družina Enterobacteriaceae je velika, heterogena skupina bakterijskih vrst, med katere

poleg E. coli spadajo še salmonele, šigele, jersinije, klebsiele, proteusi, providencije,

morganele, citrobaktri, enterobaktri in seracije. Enterobakterije, za večino katerih je naravni

habitat prebavni trakt človeka in živali, so del normalne flore (npr. E. coli), lahko pa so

povzročitelji bolezni; salmonele in šigele pa so patogeni za človeka.

Enterobakterije so aerobni in fakultativno anaerobni po Gramu negativni bacili. Biokemično

je za njih značilno, da reducirajo nitrate v nitrite, fermentirajo glukozo, imajo encim

katalazo, nimajo oksidaze. Številne enterobakterije, razen Klebsiella spp., Shigella spp. in

Yersinia spp., so gibljive 8.

Kolonije E. coli in večine enterobakterij so na krvnem agarju v obliki vlažnih, sivih kolonij,

njihova oblika je okrogla, so dvignjene in lahko imajo ozek pas beta hemolize. Po videzu na

neselektivnih gojiščih ni mogoče ločiti posameznih enterobakterij, do vrst jih identificiramo

z biokemičnimi testi.

2.2 Mikrobiološki postopki preiskave urina na patogene bakterije in glive

Smernice ECML navajajo, da so cilji mikrobiološke preiskave:

ugotoviti etiološke povzročitelje okužbe sečil, kar pomeni patogene bakterije, pa tudi

porast mešane flore, kot znak kontaminacije,

določiti koncentracijo bakterij,

ponuditi testiranje občutljivosti bakterij za protimikrobno zdravljenje,

spremljanje učinkov protimikrobnega zdravljenja med potekom okužbe 9.

V klinični praksi pa ni nujno, da za vsakega pacienta, pri katerem je sum na okužbo sečil,

izvedemo vse preiskave, taka izjema so mlade, zdrave ženske z nezapleteno okužbo sečnega

mehurja 5.

Vzorec seča bolnika z okužbo sečil pošljemo v mikrobiološki laboratorij na kvantitativno

urinokulturo z identifikacijo povzročitelja in test občutljivosti bakterije za antibiotike v

primerih, ki jih navaja literatura:

- bolnikov s simptomi kot so akutno vnetje ledvičnih čašic ali vnetje sečil, ki ga

spremlja vročina bolnika,

- bolnišnično pridobljene okužbe sečil (bakterije z mehanizmi odpornosti, kot so

ESBL),

- pri pacientih z preddispozicijo za okužbe, kot so sladkorni bolniki in bolniki z

anomalijami sečil, po napadih ledvičnih kamnov in osebe z oslabljenim imunskim

stanjem,

- pri pacietnih po prvem neuspešnem zdravljenju z antibiotiki,

- pri bolnikih z vročino, ki imajo vstavljen urinski kateter,

- zapletene okužbe sečil pri moških,

- simpomatske okužbe zgornjih sečil nosečnic,

- sum na okužbo sečil pri otrocih in mladostnikih.


10

2.2.1 Osamitev in identifikacija bakterij

Domnevne povzročiteljice okužbe moramo iz kužnine najprej osamiti, če hočemo spoznati

morfološke, biokemijske in antigenske značilnosti bakterij 8.

Večina bakterij potrebuje 24 ur, da se na trdnih gojiščih razmnožijo do velikosti kolonij, ki

jih vidimo s prostim očesom. Nekatere bakterije pa zrastejo šele v nekaj dneh ali tednih do

vidne velikosti.

Bakterijske kolonije, ki so zrasle na bakterioloških gojiščih, identificiramo, kar pomeni, da

bakterijam določimo rod in vrsto. Bakterije identificiramo na osnovi mikroskopske slike v

razmazu čiste kulture obarvanem po Gramu, z biokemičnimi testi in analizatorji za

identifikacijo bakterij (kot VITEK®2, bioMerieux).

2.2.2 Določitev koncentracije bakterij v urinu s semikvantitativno urinokulturo

Število ugotovljenih bakterij v urinu navajamo kot: število poraslih kolonij / mililiter:

CFU/mL (angl. Colony-forming units/mililitre). Na predlog strokovnjakov Evropske zveze

za laboratorijsko medicino (ECLM) bi enoto (unit) zamenjala bakterije (bacteria), kajti pri

preštevanju gre za štetje vidnih bakterij, mililiter pa bi zamenjal liter, ki je osnovna enota za

merjenje volumna 7.

Priporočena nova enota za izražanje koncentracij mikroorganizmov v urinu je CFB/L

(angl.Colony-forming bacteria/L), vendar se ni uveljavila, zato v besedilu uporabljamo enoto

CFU / mL (1 CFU / mL je enak 1000 CFB / L).

Vrednotenje rezultatov kvantitativne urinokulture

Kassov kriterij

Diagnoza okužbe sečil je bila zadnja štiri desetletja definirana na osnovi Kassovih

meril, kar pomeni, da odkritje 105

ali več poraslih bakterijskih kolonij (CFU) v 1 mL

seča, ob kliničnih znakih okužbe, le to potrjuje.

Kass je v študiji dokazal, da ima 95 % žensk z vnetjem sečil vsaj 105

bakterij ene

vrste v 1 mL seča, v vzorcu srednjega curka urina 10.

Nizko število bakterij v urinu

Nizko število bakterij v mililitru urinu (102 – 10

4) je dolgo časa veljalo kot

kontaminacija. Novejše raziskave pa kažejo, da tudi bistveno nižje število

bakterijskih kolonij lahko kaže na vnetje sečil, je pa potrebno odgovoriti na vprašanje

kako in kdaj je pomembno manj kot 105 CFU/mL 11.

Mešana kultura

Večino nezapletenih okužb sečil povzroča ena bakterijska vrsta. V primeru več kot

enem izoliranem organizmu iz enega samega vzorca urina, se rezultat interpretira ob

upoštevanju a) ali kateri mikrob prevladuje, b) način odvzema vzorca, c) rezultati

prejšnjih preiskav, d) drugi podatki o pacientu (spol, starost, nosečnost, imunsko

stanje, bolezni) in simpomih ali znakih bolezni.


11

Zaradi kontaminacije, ki je posledica neustreznosti odvzema vzorca seča, je lahko

preseženo število 105 CFU/mL in pri pacientu ne gre za okužbo sečil.

Vrednotenje rezultatov semikvantitativne urinokulture

V praksi se namesto kvantitativne urinokulture uporablja semikvantitativna urinokultura –

SKUK. Interpretacijo za SKUK metodo so strokovnjaki NLZOH objavili na internetni strani

12.

Za interpretacijo urinokulture najpomembnejši dejavniki:

- število poraslih bakterij v urinu (CFU/mL), število in vrsta izoliranih bakterij/gliv,

- način odvzema vzorca urina (primeri: srednji curek urina, urin iz trajnega katetra,

urin iz stome, urin, odvzet s punkcijo),

- drugi podatki o bolniku (spol, starost, nosečnost, imunsko stanje, ostale bolezni),

- drugi podatki o bolezenskih znakih in simptomih,

- zdravljenje z antibiotikom.

2.2.3 Določanje občutljivosti bakterij za antibiotike

Antibiotike in kemoterapevtike uporabljamo za zdravljenje bolezni, ki jih povzročajo

bakterije. Pri izbiri ustreznega antibiotika uporabljamo dve metodi: izkustveno in racionalno

(po določitvi antibiograma) 13. V praksi se antibiotiki pogosto predpisujejo empirično

(izkustveno) in laboratorijske preiskave služijo za pojasnitev neuspešnih zdravljenj in

določitev primernega antimikrobnega sredstva 14. Kljub temu da je racionalna odločitev za

dajanje določenega antibiotika dolgotrajnejša in dražja, se ob zapletih izkaže kot edina

uspešna. Po racionalni metodi zdravljenja zdravnik pred uvedbo antibiotika odvzame z

značilnega mesta vzorec kužnine in ga pošlje v mikrobiološki laboratorij za določitev

povzročitelja in ugotovitev občutljivosti (ali odpornosti ) bakterij za antibiotike. Tak rezultat

je dobra opora za nadaljnje zdravljenje, saj zdravniku pove, kateri antibiotik je

najučinkovitejši in vitro 13.Usmerjeno zdravljenje z antibiotiki je pri bakterijskih okužbah

eden temeljnih razlogov za izvajanje mikrobiološkega diagnosticiranja in ena

najpomembnejših nalog kliničnega mikrobiološkega laboratorija 5. Namen testiranja

občutljivosti je zanesljivo odkrivanje klinično pomembne odpornosti izolatov proti

antibiotiku, kar večinoma lahko dosežemo le s pravilno uporabo standardizirane metode

15. Testiranje občutljivosti bakterij za antibiotike je pomembno tudi iz epidemioloških

razlogov in s stališča službe za bolnišnično higieno, ki mora spremljati pojav in morebitno

širjenje odpornih sevov bakterij, kot so MRSA, VRE, enterobakterije, ki izdelujejo ESBL in

karbapenemaze, in večkratno odporni po Gramu negativni nefermentativni bacili (npr.

psevdomonas, acinetobakter) 5. Podatki o občutljivosti za antibiotike so pomembni za

načrtovanje izkustvenega zdravljenja, za ugotavljanje pojavljanja odpornih bakterij, kakor

tudi za spremljanje njihovega širjenja 15. Rezultati redne mikrobiološke diagnostike v

Sloveniji, so zbrani v letnem pregledu Slovenske komisije za ugotavljanje občutljivosti za

protimikrobna zdravila (SKUOPZ). Namen je predstaviti podatke o občutljivosti in


12

odpornosti izolatov izbranih bakterijskih vrst in skupin v Sloveniji; le ti nam služijo v boju

proti zmanjševanju občutljivosti bakterij na antibiotike.

Določanje občutljivosti bakterijskega izolata za protibakterijsko učinkovino in vitro se

običajno izvede z antibiogramom. Antibiogram naredimo iz čiste bakterijske kulture. Če iz

vzorca izoliramo več klinično pomembnih bakterijskih vrst, vsako najprej osamimo v čisti

kulturi in ji določimo občutljivost.

Metode, ki jih uporabljamo za določanje občutljivosti za antibiotik lahko v grobem

razdelimo v dve skupini: (1) kvalitativne – npr. Kirby-Bauerjeva difuzijska metoda in (2)

kvantitativne metode – agardilucijski, makrodilucijski in mikrodilucijski antibiogram , Etest.

Difuzijski antibiogram je preprosta in hitra metoda, pri katerem določimo za katera

protimikrobna sredstva je bakterijski izolat občutljiv.

Pri kvantitativnih metodah pa določimo minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK)

antibiotika v µg/mL, iz tega podatka lahko izračunamo dozo antibiotika, ki jo mora dobiti

bolnik, da bo zdravljenje uspešno. MIK je najmanjša koncentracija antibiotika, ki ustavi

razmnoževanje bakterij 8.

V svetu pa so že na voljo hitre avtomatske metode za določanje občutljivosti za antibiotik,

npr. Vitek®2 (bioMerieux). Prednost te metode pred klasičnimi je v dobri ponovljivosti, zelo

enostavni in hitri izvedbi ter nezahtvenost in lažje spremljanje kontrolnih postopkov; slabosti

pa zelo draga oprema, drag potrošni material in malo možnosti za izbor različnega nabora

antibiotikov 15.

2.2.4 Mednarodne smernice za antibiogram

Bakterijsko občutljivost za antibiotike moramo testirati in tolmačiti v skladu z izbranimi

mednarodnimi merili oz. standardi. Vsi medicinski mikrobiološki laboratoriji v Sloveniji so

v preteklosti uporabljali merila ameriškega Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI) 5.

Po sklepu Slovenske komisije za ugotavljanje občutljivosti za protimikrobna zdravila,

SKUOPZ, so skoraj vsi medicinski mikrobiološki laboratoriji aprila 2014 prešli na evropske

smernice za antibiogram, ki jih pripravlja EUCAST, European Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing. Te smernice v Evropi močno prevladujejo, temeljijo na rezultatih

raziskav farmakokinetike in farmakodimanike, posameznega zdravila, mehanizmov

odpornosti mikrobov, »in vitro« raziskav, kliničnih raziskav glede učinkovitosti in na

izkušnjah z uspešnostjo zdravljenja okužb v klinični praksi 16.

S podporo Evropskega združenja za klinično mikrobiologijo in infekcijske bolezni

(ESCMID) in evropskih držav, je EUCAST (stalni odbor pri ESCMID) določil mejne

vrednosti za disk difuzijski antibiogram v korelaciji z kliničnimi mejnimi vrednostmi MIK

17.

Disk difuzijska metoda za določanje občutljivosti klinično pomembnih bakterij za antibiotike

je standardiziran postopek po EUCAST:

Ustrezno gosto suspenzijo čiste kulture zasejemo na površino trdnega gojišča (Mueller-

Hinton agar) v petrijevki. Na zasejano gojišče položimo standardizirane antibiotične diske.

Antibiotiki s papirnih diskov difundirajo v gojišče in v krogu okrog diskov zavirajo

razmnoževanje občutljivih bakterij. Antibiogram odčitamo po 16-20 urah pri 35±1 °C tako,


13

da izmerimo premer zaviralnega pasu v milimetrih. Petrijevko držimo nad temno površino in

ob odbiti svetlobi izmerimo premer cone inhibicije s kljunastim merilom za posamezni

antibiotik. Upoštevamo rob inhibicije, kjer je popolna zavrtost rasti. Stopnjo občutljivosti

bakterijskega seva določimo tako, da izmerjene vrednosti primerjamo s podatki za

posamezne antibiotike v tabelah, oblikovanih po mednarodnih standardih. Rezultat izrazimo

kot občutljivost (S), zmerna občutljivost (I) ali odpornost (R) 18.


14

3 Pregled literature

3.1 Direktni antibiogram

Zanesljivo in hitro določanje občutljivosti bakterij za antibiotike, je ključnega pomena za

ustrezno zdravljenje okužb. Za ugotovitev učinkovitosti protimikrobnega sredstva, moramo

testirati sposobnost rasti bakterije v prisotnosti antibiotika, kar naredimo z izdelavo

antibiograma 19. Večina mikrobioloških laboratorijev v Sloveniji uporablja disk difuzijsko

metodo po evropskih standardih, ki jih določi EUCAST. Metoda je standardizirana, ni

zahtevna in omogoča širok izbor testiranih antibiotikov. Rezultati testiranja so na voljo

naslednji dan, kar je slabost metode.

V nuji po hitrem in ciljanem zdravljenju z antibiotikom, je trend razvoja v hitrih avtomatskih

metodah in skrajšanih postopkih. V svetu so razvili kar nekaj takšnih sistemov, npr. Vitek®

2 (bioMerieux), Phoenix (Becton Dickinson), Walkawaj (Baxter Microscan). Z njihovo

uporabo je rezultat identifikacije in testiranje občutljivosti znan že v nekaj urah namesto

naslednji dan. Za omenjene metode še vedno potrebujemo čisto bakterijsko kulturo, tako da

so rezultati znani najhitreje en dan po odvzemu vzorca 15.

Več je različnih pristopov, s katerimi znanstveniki želijo skrajšati čas do končnega

antibiograma in ujemanja rezultatov hitrih metod s standardnimi.

Navodila EUCAST za izdelavo standardnega antibiograma navajajo poleg ostalih zahtev še,

da mora biti pripravljen inokulum gostote 0,5 McF iz čiste kulture bakterij, rast pa

konfluentna 18.

Zaradi pogostosti okužb sečil in praviloma enega povzročitelja okužbe, je bilo izdelanih več

študij z direktnim antibiogramom 2,20-26. Vsem tem raziskavam je skupno, da nimajo

standardiziranega inokuluma za izdelavo antibiograma in ni zagotovila, da bo rast

konfluentna.

Sundqvist s sod. je izvajal primerjavo med poraslim številom CFU/mL po semikvantitativni

metodi in rastjo bakterij na direktnem antibiogramu. V primerjavo je bilo vkjučenih 233

urinov, pri katerih je bila izolirana ene po Gramu negativna enterobakterija. Konfluentna rast

je bila pri 188 od 233 vzorcih. Noben od 26 vzorcev urina, kjer je po semikvantitativni

metodi poraslo med 104 in 10

5 CFU/mL ni imel konfluentne rasti na direktnem

antibiogramu. Tudi pri 19 vzorcih s številom CFU/mL ≥ 105 ni bilo neprekinjenega sloja

rasti bakterij. Zaključuje, da je zanesljivo rezulate direktnega antibiograma uporabljati pri

konfluentni rasti E. coli in K. pneumoniae. Opozarja pa na težavo pri vrsti P. mirabilis zaradi

rojenja in interpretacije antibiotika trimetoprim in predlaga, da se ne uporablja podatek iz

direktnega antibiograma za to kombinacijo 2.

Breteler s sod. je v študiji direktne antibiograme izvajal le iz urinov, kjer so bili v direktnem

preparatu vidne le po Gramu negativne bakterije. Rezultate direktnega antibiograma je

primerjal z rezultati rutinskega testiranja na protimikrobno občutljivost po avtomatiziranem

sistemu Phoenix (AST). Napake so ocenili kot »zelo velike napake«, če so občutljivi v

direktnem antibiogramu, vendar odporni pri standardnem antibiogramu, »velike napake«, če

je odporen pri direktnem in občutljivi pri standradnem. Vse druge razlike so bile opredeljene

kot »manjše napake«. Etest metoda je bila referenčna metoda. Če je bil z direktnim

antibiogramom in rutinsko metodo najden le en izolat, je ujemanje za direktni in standardni


15

antibiogram bilo doseženo v 96% primerov. Nižje 88% ujemanje je bilo v primeru, ko je na

rutinski kulturi bil najden več kot en izolat, v direktnem antibiogramu pa eden. V primeru, da

je po obeh metodah najden več kot en izolat je bilo ujemanje tudi 88%. Na osnovi tega avtor

zaključuje, da je direktni antibiogram na urinu zanesljiv pri okužbi z eno enterobakterijo

21.

Nekateri avtorji raziskav pa so uporabili ciljne vzorce, kjer so s hitrimi avtomatiziranimi

metodami (kot so: MicroflexTM

, MALDI-TOF) identificirali povzročitelje in se tako izognili

mešani rasti na direktnem antibiogramu 2,24-26.

Okužba krvi predstavlja življenjsko nevarno infekcijo, ki zahteva takojšnje zdravljenje. Zato

je v laboratorijski praksi, da se iz pozitivnega vzorca krvi – hemokulture izvede direktni

antibiogram za hiter, preliminaren izvid občutljivosti povzročitelja sepse 27-29.

Coorevits s sod. je pri različnih kliničnih vzorcih (respiratorni vzorci, urini abscesi in

punktati ) primerjal direktne antibiograme s standardnimi. Vzorci so bili izbrani po različnih

kriterijih, kot so zahteva zdravnika po direktnem antibiogramu, nova infekcija pri hudo

bolnem pacientu, ali v mikroskopskem preparatu kužnine prevladujoči stafilokoki ali po

Gramu negativne bakterije 30.

Sistem HB&L za določevanje mikroorganizmov v urinu, omogoča določevanje prisotnosti

mikroorganizmov v primarno sterilnih tekočinah v nekaj urah (Instruction for use, Alifax).

Po vrednotenju aparata Alfred 60/AST, Lahanas s sod. zaključuje, da je aparat bolj natačnen

pri presejalni metodi za negativne urinske vzorce, kot za pozitivne. To utemeljuje z

ugotovitvijo, da je naparava nepravilno odčitala 9 od 80 vzorcev. Nizko občutljivost za glive

bi bilo potrebno še raziskati 31.

Spezzotti pa zavrača navedene trditve. Navaja, da so nekateri pomembni tehnični aspekti

aparata bili neupoštevani, kar je doprineslo k podcenjevanju zmogljivosti karakteristik

naprave 32.

Nas v naši raziskavi ni zanimalo število poraslih kolonij CFU/mL, ampak gostota rasti do 0,5

McF.

Raziskovalci so težavo z nestandardnim inokulumom odpravili z nacepitvijo urina v bujon,

nekaj urno inkubacijo v aparatu HB&L in izdelavo antibiograma pri pozitivnih vzorcih.

Tako so dobili rezultat direktnega antibiograma s standardnim inokulumom naslednji dan

3,33

Štrumbelj je iz pozitivnih izbral za izdelavo direktnega antibiograma tiste, kjer so v

preparatu iz bujona bile samo po Gramu negativne bakterije. Študija je zajemala dvesto

izolatov enterobakterij, ki so bile testirane s petnajstimi antibiotiki. Cone direktnega

antibiograma so bile primerjane s standardnim antibiogramom po smernicah CLSI. Rezultati

direktnega antibiograma in standardne metode za 3000 testiranih antibiotikov se v 2900

primerih (96,7%) popolnoma ujemajo. Stopnja malih napak (2,8%), velikih napak (0,4%) in

zelo velikih napak (0,2%); stopnja zelo velikih in velikih napak je nizka za vse preiskovane

antibiotike. Popolnoma ujemanje za rezultat S-občutljiv je pri osmih antibiotikih, stopnja pri

direktnem antibiogramu za vse testirane antibiotike je visoka (minimalno 96,3%) 3.

S centrifugiranjem pozitivnih vial iz HB&L in uporabo sedimenta so Ilke in sod. določali z

odpornost različnih izolatov. Sediment so uporabili za identifikacijo in antibiogram z

aparatom VITEK®2 (bioMerieux). Raziskava je potekala v dveh stopnjah. V prvem koraku

so iz vseh urinov (1480) naredili mikroskopske preparate, ter vzorce obdelali po klasični

metodi nacepitve na trda gojišča in v HB&L bujon. Primerjava rasti po klasični metodi in v

bujonu HB&L napoveduje 93% občutljivost in 96,9% specifičnost pri uporabi bujona.


16

V drugem koraku so vse izolate dobljene po klasični metodi, kot del rutinskega postopka in

sedimente bujonov testirali z HB&L in VITEK2 aparatom, sedimentov je bilo 102.

Identifikacija je bila pri 81,3% izolatih iz HB&L bujona pravilna. Skladnost je bila najvišja

(94,7%) za izolate Klebsiella spp., za 13,6% pa identifikacija ni bila uspešna.

Ujemanje antibiograma iz sedimenta s standardnim po smernicah CLSI je nad 90%, kar pa je

nižje kot pri študiji, ki je bila izvedena s standardnim inokulumom iz bujona HB&L. 33

Sandqvist s sod.je prvi, ki je primerjal direktni antibiogram iz urina po smernicah EUCAST.

Direktni antibiogram je bil izvedel po dveh postopkih in sicer: a) direktni antibiogram iz

urina tako, da je bil bombažni bris pomočen v urin in narejen razmaz na Mueller Hinton

agarju in b) izolat pripravljen s centrifugiranjem urina in pripravo pelet za MALDI-TOF,

kjer je bila izvedena identifikacija in antibiogram. Obe metodi sta bili primerjani s

standardnim disk difuzijskim antibiogramom po EUCAST. V raziskavo je bilo zajetih 196

vzorcev urinov z samo eno vrsto po Gramu negativnih bakterij. Za obe metodi sta stopnji

napak nizki, večina napak je pri ostalih vrstah, razen E.coli, največ za Proteus mirabilis. Pri

855 testiranih antibiotikih pri obeh metodah, je bilo 15 napak, od tega 3 zelo velike napake,

5 velikih napak in 7 manjših napak. V zaključku avtor navaja, da sta obe metodi z

interpretacijo z EUCAST mejnimi vrednostmi, varni za uporabo podatkov v klinične namene

2.

V znanstvenem prispevku Zboromyrska s sod. za izdelavo direktnega antibiograma iz urina

izbere tiste, pri katerih je bila identifikacija na MALDI-TOF-MS zanesljiva. Direktna

identifikacija je bila možna na 108 (86,4%) od vseh 125 pozitivnih urinov. Direktni

antibiogram je bil izveden na 102 identificiranih vzorcih. Rezultat je bil popolnoma skladen

z rutinsko metodo v 83 primerih enomikrobne infekcije. Po opisanem protokolu je čas za

mikrobiološko identifikacijo povzročitelja uroinfekta 1 uro, za antibiogram pa 24 ur 20.

Ker je sepsa življensko nevarna, zahteva hitro antibiotično zdravljenje z namenom, da se

posledično zmanjša smrtnost. Stokkou s sod. je izvedel direktni antibiogram iz hemokulture

in ga primerjal s standardnim antibiogramom iz Vitek 2 sistema z EUCAST mejnimi

vrednostmi. Cilj te študije je bil raziskati zanesljivost direktnega antibiograma iz pozitivne

hemokulture enobakterijske rasti. V primerjavi je bilo zajetih 428 izolatov iz hemokulture in

110 različnih bakterijskih vrst. V primerjavi za 2803 kombinacij bakterija – antibiotik je

ujemanje 95,4% z 1,28 % zelo velikih napak, 3,42% velikih in majhnih napak. Na ravni

bakterijske vrste so opazili zelo velike napake v kombinaciji Enterococcus spp.– gentamicin-

high level (10,87%) in Staphylococcus spp. – rifampicin (5%). Do zelo velikih napak ni

prišlo v primerih enterobakterij in Pseudomonas spp. Ob tem avtor zaključuje, da se v večini

kombinacij, vrsta bakterij – antibiotična učinkovina, rezutlat direktnega antibiograma z

mejnimi vrednostmi po smernicah EUCAST, lahko uporablja za optimiziranje empirične

antibiotične terapije, dokler niso na razpolago dokončni rezulatati 27.

3.2 Vpliv poročanja mikrobioloških rezultatov

Neprimerno predpisovanje antibiotikov je povezano s povečanjem stroškov za zdravstevmo

oskrbo in zmanjšanje kakovosti oskrbe.

V raziskavi, katere cilj je bil izmeriti klinični in gospodarski vpliv hitrega poročanja

mikrobioloških rezultatov, ki jo je opravil Galar s sod., so dokazali pomembno vlogo hitrih

metod. Avtomatiziran sistem VITEK®2 (bioMerieux) so uporabili za idenifikacijo in

testiranje odpornosti. Vključeni so bili le hospitalizirani bolniki z bakterijskimi okužbami,

razdeljeni so bili v dve skupini in sicer v skupino, kjer so rezultati bili na vojlo naslednji dan


17

in intervencijsko skupino, pri katerih je bil rezulatat isti dan. S skrajšanjem časa poročanja

pri urinih z 23,4 ur na 9,3 ure, pri ranah in abscesih z 23,5 ur na 9,5 ur so izračuni pokazali

pomembno krajši čas hospitalizacije in manjše skupne stroške. Vendar pa interventno

poročanje rezultatov izolatov krvnih kultur niso povzročili večjih kliničnih in finančnih

koristi 34

Daley s sod. pa v retrogradni študiji preučuje koliko zdravnikov bi se odločilo drugače, če bi

imeli podatek za direktni antibiogram. Kar v 52,8 % bi bila po študiji potrebna zamenjava

terapije iz širokospektralne v ciljano, pa se zdravniki ne bi odločili za spremembo. Na

odločitev glede izbire terapije vplivajo ne samo laboratorijski izvidi, ampak tudi težavnost

obolenja, vir bakterijske okužbe, alergije in druge sekundarne bolezni 28

3.3 Evropske smernice za antibiogram – EUCAST

EUCAST je organizacija, ki je nastala leta 1997 in deluje v okviru ESCMID, ECDC in

različnih nacionalnih ustanov za spremljanje in interpretacijo občutljivosti ter sodeluje z

evropsko agencijo za zdravila (EMA). Njen namen je, da vpelje standardizirane in vitro

metode testiranja občutljivosti, ter postavi merila za interpretiranje rezultatov 5.

EUCAST je razvil disk difuzijsko testiranje občutljivosti za antibiotike, ki je skupaj z novimi

evropskimi menjimi vrednostmi impelmentirana znotraj in zunaj Evrope. Do uvedbe

EUCAST smernic, so se uporabljale ameriške smernice CLSI. Sodelovanje CLSI in

EUCAST se nadaljuje po skupni odločitvi ustanovitve komiteja za »Določitev metod in

mejnih vrednosti za polimiksin/kolistin«, z namenom pridobitve mednarodne mejne

vrednosti za kolistin 35.

CLSI je v zadnjih letih naredil nekaj velikih odločitev. Eno od teh je bilo, da glede mejnih

vrednosti odločajo ljudje iz industrije. Ampak to ni dovolj, EUCAST je formiran od

ESCMID, po drugi strani pa je CLSI financiran od prodaje dokumentov in industrije 35

V članku Uvajanje testiranja občutljivosti za protimikrobna zdravila po smernicah EUCAST

v Sloveniji Štrumbelj s sod. navaja, da je prva stopnja določitev minimalnih inhibitornih

koncentracij (MIK-ov) posameznega antibiotika za posamezne vrste bakterij z ustrezno

standardizirano dilucijsko metodo. MIK je najmanjša koncentracija antibiotika, ki in vitro

zaustavi razmnoževanje bakterij. Ko so znane MIK, je potrebno določiti »mejno vrednost«,

to je MIK, ki ima določen pomen. Za usmerjanje zdravljenja pri bolniku uporabimo klinične

mejne vrednosti MIK, ki jih praviloma izražamo v znanih kategorijah občutljivost (S),

intermediarna občutljivost (I) in odpornost (R) 36.

Smith in Kronvall sta v svoji študiji analizirala 163 podatkovnih nizov disk difuzije, od tega

115 za bakterijske vrste in 48 za tipe sevov. Rezultati so uporabljeni pri EUCAST smernicah

za optimiziranje nastavitvenih parametrov standardnega postopka za interpretacijo

normiranja podatkov o odpornosti 37.

Implementacija EUCAST disk difuzijske metode v klinične laboratorije ni težavna, je pa

potrebno planiranje postopkov za vpeljavo. Izbira in priprava Mueller Hinton agarja,

izdelava in inkubiranje antibiogramov, merjenje con inhibicij, ter izvajanje kontrole kvalitete

navaja Matuschek s sod. kot nekaj pomembnejših aspektov 17.


18

Pod okriljem SKOUPZ so slovenski strokovnjaki Štrumbelj, Ribič in Pirš izdali kratka

pojasnila za uporabo evropskih smernic 16.

Disk difuzijski antibogram je v Evropi evidentirano harmoniziran, čeprav bo trajalo še nekaj

časa, da bodo vsi laboratoriji šli skozi harmonizacijo. Drugo vprašanje pa je, če je možna

globalna harmonizacija. Lahko bi se to zgodilo, ker se vedno več držav poslužuje enostavnih

in dostopnih EUCAST priporočil in ker se lahko vsak udeleži odprte diskusije, ki je

nekajkrat letno objavljena na internetni strani EUCAST 38.

3.4 Antibiotik v urinu

Zaradi aktivnosti antimikrobnih ostankov v urinu, ki motijo rast bakterij in vitro, so lahko

rezultati urinokulture lažno negativni 39.

V literaturi navajajo avtorji različne metode, ki se razlikujejo po indikatorskem bakterijskem

sevu, vrsti in količini preiskovanega vzorca, princip testa je enak pri vseh izvedenih študijah.

Z enostavnim laboratorijskim poizkusom z disk difuzijo, se oceni nedavno antibiotično

zdravljenje.

Cardozo s sod. je preverjal pojav lažno negativnih urinskih kultur, ki se pojavljajo zaradi

prisotnosti protimikrobnih ostankov v vzorcih bolnikov, ki so bili sprejeti na bolnišnično

obravnavo.

Negativne vzorce urinov so preverjali z analizatorjem Alfred 60 (Alifax) in z metodo diska

tako, da so na dva prazna celulozna diska nanesli vzorec urina, disk so položili na dva

Mueller Hinton agarja. Enega so inokulirali s standardnim sevom E. coli ATCC 25922 ,

drugega pa z E. faecalis ATCC 29212. V originalni viali za test antibiotika v urinu je

raztopina bujona s suspenzijo S. epidermidis. Študija je pokazala boljše rezultate z

avtomatizirano metodo. Avtor navaja, da je razlog v nizki občutljivosti za disk metodo v

majhnem volumnu vzorca urina na disk (10µL) 39.

Z uporabo večkratno odpornih sevov ESBL E.coli za indikatorski sev, pa Emary s sod.

ugotavlja uporabo antibiotikov karbapenemov za zdravljenje. Študija je bila del regionalnega

nadzora nad uporabo antibiotikov 40.


19

4 Materiali in metode dela

4.1 Primerjava antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulomom

Načrt primerjave

Za primerjavo antibiograma po standardni metodi in antibiograma po hitri metodi s

standardnim inokulumom, je vsak vzorec urina bil preiskan po:

Metodi A: semikvantitativna urinokulturo, kot predpisan postopek preiskave seča

v mikrobiološkem laboratoriju

Metodi B: kultiviranje seča v bujonu in inkubacijo v aparatu HB&L

Primerjani bodo rezultati le tistih antibiogramov, kjer bo izolat le ena enterobakterija.

Na spodnji sliki je prikazana shema primerjave antibiogramov.

Slika 4-1: Shema postopka primerjave antibiogramov po standardni metodi in HMSI – hitri metodi s

standardnim antibiogramom

DOLOČANJE OBČUTLJIVOSTI BAKTERIJSKEGA IZOLATA ZA ANTIBIOTIKE

Metoda A:

Standardni postopek

Metoda B:

HMSI

PREMER INHIBICIJSKE

CONE (mm)

S/I/R

PREMER INHIBICIJSKE

CONE (mm)

S/I/R

PRIMERJAVA REZULTATOV ZA POSAMEZNE ANTIBIOTIKE

- Primerjava stopenj občutljivosti standardnega antibiograma in antibiograma HMSI

za posamezne testirane antibiotike

- Izračun deleža skladnosti / neskladnosti za vsak posamezen antibiotik

- Izračun deleža skladnosti za vse antibiotike

- Izračun deleža zelo velikih, velikih in majhnih odstopanj za vsak posamezen

antibiotik


20

Metoda A: standardni postopek

Materiali:

gojišča v petrijevkah: URI agar (URISELECT 4, BioRad)

KA (Columbia agar, Biomerieux z dodatkom ovčje krvi)

MHA (Mueller Hinton agar, Becton Dickinson)

0,85% NaCl, sterilna fiziološka raztopina

gojišča in testi za identifikacijo bakterij

testni diski s standardnimi koncentracijami antibiotikov (Becton Dickinson)

drugi materiali: kalibrirane cepilne zanke 10 µL, sterilni suhi brisi, plastične sterilne

kapalke, plastične epruvete

Oprema:

inkubator, 35 °C z aerobno atmosfero

stresalnik

nefelometer

digitalno pomično (kljunasto) merilo

računalniški program MBL, ki interpretira cone v skladu z EUCAST standardi

Kužnina: Nacepimo:

URIN 10 µL URI agar, KA

inkubiramo 24 ur, 35 °C

rast kolonij podatek: CFU/mL

razni testi suspenzija bakterij z gostoto 0,5 McF

antibiogram

identifikacija

MHA + diski z antibiotiki

podatek: povzročitelj okužbe inkubiramo 16 do 20 ur, 35 °C

odčitovanje con inhibicije

podatek: STANDARDNI ANTIBIOGRAM - SAT

Slika 4-2: Shema standardnega postopka


21

Metoda B: HMSI – hitra metoda s standardnim inokulumom

Materiali:

viale z bujonom URO-QUICK SCREENING KIT (SI 390.900, ALIFAX S.P.A.)

gojišča v petrijevkah: URI agar (URISELECT 4, BioRad)

MHA (Mueller Hinton agar, BBL-Becton Dickinson)

0,85% NaCl, sterilna fiziološka raztopina

gojišča in testi za identifikacijo bakterij

testni diski s standardnimi koncentracijami antibiotikov (Becton Dickinson)

raztopina vankomicina s koncentracijo 100 µg / 10 µL

drugi materiali: kalibrirane cepilne zanke 10 µL, sterilni suhi brisi, plastične sterilne

kapalke, plastične epruvete

Oprema:

pipete

inkubator, 35 °C z aerobno atmosfero

stresalnik

nefelometer

aparat HB&L

digitalno pomično (kljunasto) merilo

računalniški program MBL, ki interpretira cone v skladu z EUCAST standardi


22

Kužnina: Cepimo:

URIN 500 µL viala z » eugonic« bujonom

vstavimo v HB&L do 4 ure, 35 °C (poglavje 4.1.1)

rast po nekaj urah do gostote ≥ 0,5 McF

iz viale naredimo preparat po Gramu (poglavje 4.1.2)

mikroskopski

pregled razmaza

niso po Gramu neg. bakt. po Gramu neg. bakt.

konec preiskave, cepimo redčimo do 0,5 McF

ne gre za enterobakterije antibiogram

URI agar MHA + diski z antibiotiki

inkubiramo 24 ur, 35 °C inkubiramo 16 do 20 ur, 35 °C

primerjava rasti odčitovanje con inhibicije

z rastjo na primarnem

URI agarju iz SKUK

podatek: HITRI ANTIBIOGRAM - HAT

Slika 4-3: Shema postopka hitre metoda s standardnim inokulumom


23

Izvedba

Za pripravo gojišč, uporabo materialov in izvajanje postopkov smo upoštevali navodila za

delo Oddelka za medicinsko mikrobiologijo Murska Sobota in predpise sistemskega

postopka (SP) Nacionalnega laboratorija za zdravje, okolje in hrano.

V raziskavo smo vključili 230 vzorcev urina, ki so bili poslani iz različnih oddelkov Splošne

bolnišnice Murska Sobota, regionalnih zdravstvenih domov in zasebnih ambulant, v obdobju

od maja do junija 2016.

Vzorci glede na način odvzema so bili: srednji curek urina, urin, odvzet iz trajnega katera in

urin, odvzet z enkratno kateterizacijo.

Vzorci urina, ki so prispeli v laboratorij so bili obdelani po standardnem postopku – metodi

A in hitri metodi s standardnim inokulumom – metoda B.

Standardna metoda z nacepitvijo urina po semikvantitativni urinokulturi je rutinska

preiskava seča v mikrobiološkem laboratoriju. V eksperimentalnem delu preiskava po

standardnem postopku ni posebej opisana, ker ni predmet raziskave, potekala je neodvisno in

izvajali so jo drugi zaposleni v laboratoriju.

Rezultat antibiograma po standardni metodi pa je referenčna vrednost za primerjavo

antibiograma po hitri metodi s standardnim inokulumom (HMSI).

Omejili se bomo na metodo HMSI. Faze dela: barvanje po Gramu, izdelava in odčitovanje

antibiogramov pa je pri obeh metodah enako.

V nadaljevanju so podrobneje opisani instrumenti in raziskovalne metode, ki so bile

uporabljene pri metodi HMSI.

4.1.1 Kultiviranje urina v navadnem bujonu

Kužnino urina smo nacepili v vialo z navadnim bujonom (NBJ) in inkubirali v analizatorju

HB&L. Analizator spremlja rast bakterij v vzorcu urina in daje informacijo o številu bakterij

CFU/mL in gostoto po McFarlandu.

Pri standardni metodi poteka primarna inkubacija do izolata čez noč.

Z nacepitvijo urina v bujon in inkubiranjem v HB&L, smo skrajšali čas inkubacije vzorca do

največ 4 ure.

Analizator HB&L UROQUATTRO

OPIS ANALIZATORJA

naziv aparata: HB&L UROQUATTRO (v nadaljevanju HBL)

koda: SI 190.300

proizvajalec: ALIFAX S.p.A., Italija


24

Slika 4-4: HB&L Uroquattro

HB&L je prvi analizator na trgu za določevanje prisotnosti mikroorganizmov in testiranje

protimikrobne občutljivosti v primarno sterilnih tekočinah, kot so urin, kri, likvor, plevralne

in bronhialne tekočine, na osnovi monitoringa bakterijske rasti.

Z uporabo patentirane tehnologije, ki temelji na sipanju svetlobe, je možno odkriti prisotnost

bakterij in njihove odpornosti na antibiotike že v nekaj urah, z visoko občutljivostjo in

specifičnostjo.

PRINCIP HITRE METODE ZA DOLOČITEV OKUŽBE URINARNEGA TRAKTA

Vzorec urina cepimo v stekleno vialo z URO-QUICK reagentom (kat.št.: SI 390.900,

proizvajalec: ALIFAX S.p.A., Italija). Reagent v viali je »eugonic« bujon, ki omogoča rast

večine mikroorganizmov, ki jih najdemo v patoloških vzorcih urina.

V vsaki viali je magnetno mešalo, ki tekom analize zagotavlja, de je suspenzija homogena.

Z metodo laserske nefelometrije poteka kinetična detekcija na dveh detektorjih. Z laserskim

sipanjem svetlobe pri 650 nm sta meritvi vzorca izvedeni pod kotom 30° in 90°. Vzorec je v

mediju tekoče kulture, ki je mešan in inkubiran pri 37 °C.

HB&L spremlja faze rasti bakterij v preiskovanem vzorcu vse od začetne nacepitve v bujon,

s podporo dvosmernega vmesnika podatkov vsakokratne merilne rezultate obdela s

programsko opremo in tako zagotavlja podatke za rastno krivuljo v realnem času in podatek

o številu bakterij v CFU/mL. Občutljivost je odvisna od izbranega časa analize in za rutinsko

obdelavo vzorcev proizvajalec aparata priporoča triurno inkubacijo, kjer bodo zaznani kot

pozitivni, vzorci z ≥ 30.000 CFU/mL.

Vse vzorce inkubiramo pri 37 °C in prvi odčitek aparata je v ničelni fazi, kar pomeni, da

bodo v poteku inkubacije zaznane samo žive bakterije. Motnje, kot so eritrociti, levkociti,

mrtve celice in soli v vzorcu, se tako izločijo v ničelni fazi.

Stopnja zamotnitve bujona dosežene med preizkusom, se izpisuje na monitorju kot

McFarland Monitor in ko vzorec doseže 0,5 McF nam aparat da vizualni in zvočni signal.

Tak vzorec se lahko testira na občutljivost bakterije na antibiotik z antibiogramom, brez

potrebe po redčenje in koncu čakanja analize.

Programska oprema HB&L aparata omogoča različne teste, ki bi potekali istočasno, vsak

čitalnik položaja je neodvisen od drugih mest in se lahko nastavi glede na tip vzorca,

inkubacijski čas, analitični protokol in referenčno vrednost.


25

OMEJITVE PRI UPORABI

Rast mikroorganizmov je odvisna od pogojev za rast in razmnoževanje (prehranske potrebe

mikroorganizmov in pogoji inkubacije), pa tudi od specifičnih dejavnikov kot so npr.

prisotnost antibiotika v vzorcu, oslabljenost mikroorganizma in inkubacijska doba.

Aparat HB&L ima za določene primere vzorcev omejitve testiranj, proizvajalec predlaga

rešitve za takšne situacije:

- visoko stopnjo motnosti vzorca urina HB&L zazna in na ekranu se izpiše TURBID;

priporoča se dilucija vzorca,

- prisotnost velike koncentracije antibiotika v vzorcu lahko zavira rast bakterij in ima

vpliv na končni rezultat; priporoča se uporaba viale URO-QUICK RAA KIT za

testiranje,

- zaradi nezmožnosti zagotavljanja hladne verige pri pošiljanju, je vzorec urina odvzet

v zbiralniku z borno kislino ali drugimi stabilizatorji za stabilizacijo številčne

koncentracije bakterij v urinu; priporoča se minimalni štiriurni čas inkubacije v

HB&L.

4.1.1.1 Izvedba

V raziskavo smo vključili 230 kliničnih vzorcev urina. Populacijski vzorec za obdelavo je bil

naključen in obdelani so bili zaporedni vzorci tistega dne, ko je to dopuščal delovni

postopek.

Vzorce, poslane na preiskavo seča na patogene bakterije, smo nacepili v vialo z »eugonic«

bujonom - v nadaljevanju viala z navadnim bujonom, NBJ. V vialo smo odpipetirali z

avtomatsko pipeto 500 µL urina. Viale damo v prazno pozicijo v merilnem prostoru, kot

kaže slika 4-5 , in vnesemo podatke o vzorcu v aparat.

Slika 4-5: Merilni prostor za viale v HB&L

Inkubacija vzorca in odčitovanje rezultatov, ki so izpisani na ekranu aparata in izpisu s

tiskalnika, poteka do 4 ure. Če je rast po nekaj urah do gostote ≥0,5 McF, lahko prekinemo

inkubacijo za vzorec ali počakamo do konca inkubacije in naredimo preparat po Gramu iz

viale. Spodnji sliki nam prikazujeta: leva slika, sporočilo o gostoti McF, desna pa krivuljo

rasti mikroorganizmov.


26

Slika 4-6. Sporočilo na ekranu HB&L, leva slika: sporočilo o viali, kjer je rast ≥ 0,5 McF, desna

slika: krivulja rasti mikroorganizmov v navedenem času

Spremljali smo rast in jo enako interpretirali pri vseh vialah. Rast v viali je v celotni nalogi

opredeljena takole:

- Rast pomeni rast, pri kateri gostota mikroorganizmov v vzorcu doseže ali preseže

gostoto McFarland 0,5

- Če rast mikroorganizmov v 4 urah ne doseže gostote McFarland 0,5 ali več, smo to

interpretirali kot »ni rasti«. Zanimala nas je namreč le rast, iz katere je mogoče

narediti antibiogram, za kar je potreben standardni inokulum gostote McFarland 0,5.

Če v vialah ni bilo rasti, je bil postopek končan.

Postopek in interpretacija rasti v vialah, v katerih je bila dosežena »rast«

Cilj metod v nalogi je, da bi HAT naredili iz vseh vial z rastjo, kjer iz vzorca SKUK čista

kultura ene EB in ne bi izdelali HAT iz vial, kjer v vzorcu ni čiste kultura ene EB.

Cilj naloge so bile namreč le EB, ker smo uporabili zanje ustrezen antibiogram in ker so

ostale NB v SKUK preredke in bi bilo premalo rezultatov za analizo.

Opredelitev »smiselnega« in »uporabnega« HAT, ki velja v celotni nalogi

Izdelava HAT iz vzorca je »smiselna«, če v SKUK osamimo eno samo vrsto enterobakterije.

V vseh ostalih primerih je izdelava HAT »nesmiselna«.

»Smiselnost« je torej opredeljena na osnovi rasti v SKUK, podatek, ki ga izvemo naknadno.

Izdelava HAT je lahko smiselna, ni pa izvedljiva, če v viali ne zaznamo rasti.

Izdelava HAT iz vzorca je »uporabna«, če v SKUK osamimo eno samo vrsto enterobakterije

in v HAT dobimo čisto rast istega izolata. Če v SKUK ali v HAT dobimo dve vrsti bakterij,

SAT ali HAT ni mogoče odčitati in primerjati.

Pri vzorcu je lahko HAT smiseln, izdelan, a ni uporaben, če dobimo mešano kulturo v HAT.


27

Le pri »uporabnih« HAT smo lahko primerjati rezultate HAT s SAT (to je bil osnovni cilj

naloge), ker gre v tem primeru za isti izolat, z antibiogramom, pridobljenem po standardnem

in na hitri način.

Pristop k vialam z rastjo je lahko različen, poimenovali smo 4 različne pristope, strategije A,

B, C in D – ob katerih pogojih iz viale z rastjo naredimo HAT:

- Strategija A - cepimo vialo z NBJ, HAT izdelamo iz vseh vial z rastjo, preparata po

Gramu iz vial ne delamo.

- Strategija B - cepimo vialo z VBJ (viala z bujonom z vankomicinom), HAT

izdelamo iz vseh vial z rastjo, preparata po Gramu iz vial ne delamo.

- Strategija C - cepimo vialo z NBJ, iz vseh vial z rastjo naredimo razmaz kužnine po

Gramu in HAT izdelamo le, če v razmazu vidimo le NB.

- Strategija D - cepimo vialo z VBJ, iz vseh vial z rastjo naredimo razmaz kužnine po

Gramu in HAT izdelamo le, če v razmazu vidimo le NB.

Rezultat strategije pri posameznem vzorcu je lahko »izdelava« HAT ali »ni izdelave«, oboje

je lahko pravilno ali nepravilno. Pri preučevanju strategij smo opredelili, kdaj je izdelava

HAT pravilna in kdaj nepravilna, kar je pregledno prikazano v tabeli 4-1.

»Pravilno« je, če:

- je HAT izdelan, če je »smiselen«

- da HAT ni izdelan, ko je »nesmiselen«

»Nepravilno« je, če:

- je HAT izdelan, pa ni »smiselen«

- HAT ni izdelan, če je »smiselen«.

Tabela 4-1. Opredelitev pravilnosti ali nepravilnosti rezultata strategije pri posameznem

vzorcu glede izdelave in smiselnost hitrega antibiograma

HAT je izdelan HAT je smiselen Opredelitev izdelave in pravilnosti

DA DA izdelan, pravilno

DA NE izdelan, nepravilno

NE DA ni izdelan, nepravilno

NE NE ni izdelan, pravilno

Legenda: HAT je hitri antibiogram

4.1.2 Barvanje po Gramu

Barvanje smo izvedli po standardnem postopku za bakterije 41.

Razmaz iz bujona v viali:


28

Kapljico smo kanili na objektno steklo in počakali, da se na zraku posuši.

Fiksacija (pritrdi strukture na stekelce):

S stekelcem, na katerem je preparat,smo trikrat zaokrožili skozi plamen gorilnika (razmaz

mora biti na zgornji ploskvi stekelca). Uporabili smo vodoravne navpične (od zgoraj

navzdol) gibe: pomembno je, da je preparat razumno, ne prekratek, ne predolg čas v

plamenu, da se stekelce segreje na približno 60 °C.

Barvanje po Gramu:

1. Na fiksiran preparat smo nakapljali KRISTAL-VIOLET REAGENT. Pustili

smo 30 sekund.

2. Sprali smo pod tekočo vodo.

3. Na preparat smo nakapljali LUGOL REAGENT (jodova raztopina). Pustili

smo 30 sekund.

4. Odlili smo LUGOL s stekelca in obilno nanesli 96% ETANOL za

razbarvanje: Pustili smo 30 sekund: če je preparat gost, smo vmes odlivali

vijoličasti alkohol in dolivali sveži alkohol.

5. Ponovno smo sprali pod tekočo vodo.

6. Na preparat smo nakapljali FUKSIN REAGENT. Pustili smo 30 sekund.

7. Sprali smo pod tekočo vodo.

8. Preparat smo popivnali z mehkim papirjem, pustili smo, da se je posušil na

zraku do konca.

4.1.2.1 Izvedba

Pri 92 vzorcih od 230 testiranih vzorcev je bila rast mikroorganizmov v vzorcu do gostote

≥0,5 McF. Za teh 92 vzorecv smo naredili preparat po Gramu in ga pregledali.

Mikroskopirali smo pri 1000 x povečavi z imerzijo (mikroskop: model Standard 20, Carl

Zeiss).

V preparatih vzrocev, kjer so bili vidni samo po Gramu negativni bacili, se je postopek

raziskave nadaljeval po shemi Metode B - izdelava antibiograma.

Za vzorce, kjer so v preparatu bile prisotne še druge oblike mikroorganizmov, je bila

preiskava zaključena, ker so naša ciljna populacija enterobakterije.

4.1.3 Izdelava antibiograma

Splošno:

Izdelavo antibiograma izvedemo po standardnem EUCAST postopku, metodo izvajamo

brez modifikacij, da zagotovimo zanesljive rezultate 18.

Disk difuzija je eden izmed najstarejših pristopov za testiranje občutljivosti za antibiotike.

Priprava in hranjenje gojišč


29

Za disk difuzijsko testiranje občutljivosti bakterij za protimikrobna zdravila po metodi

EUCAST-a uporabimo gojišče Mueller-Hinton agar (MHA). Gojišče pripravimo v

laboratoriju po navodilih proizvajalca.

Gojišče za testiranje občutljivosti mora biti debeline 4 mm ± 0,5 mm (približno 25 mL

gojišča nalijemo v plošče s premerom 90 mm).

Pred uporabo se prepričamo, da je površina gojišča suha, vendar pazimo, da gojišča ne

presušimo.

Pogoji skladiščenja, sušenja in roki uporabnosti v laboratoriju pripravljenih gojišč so

opredeljeni v sistemu nadzora kakovosti v laboratoriju.

Priprava inokuluma

Za izvedbo disk difuzijskega antibiograma po metodi EUCAST potrebujemo inokulum

gostote McFarland 0,5. Pregost inokulum povzroči premajhne, preredek inokulum pa

prevelike cone. Inokulum umerimo z uporabo nefelometra.

a. Po standardnem postopku za neposredno pripravo inokuluma uporabimo kolonije,

ki so porasle po inkubaciji čez noč na neselektivnem gojišču. S sterilno

bakteriološko zanko ali bombažnim brisom izberemo nekaj po obliki podobnih

kolonij in jih suspendiramo v fiziološki raztopini. Inokulum umerimo na gostoto

McFarland 0,5. Želeno gostoto dosežemo tako, da v suspenzijo dodajamo

fiziološko raztopino ali dodatni odmerek bakterijske rasti. Izvedba tega

antibiograma ni del raziskave, je pa opisan, da se prikaže razlika v pripravi

inokuluma.

b. Po HMSI postopku bujonu po potrebi dodajamo po kapljicah fiziološko raztopino

do gostote 0,5 McFarland.

Pripravljena suspenzija je uporabna še 60 minut po pripravi, priporočeno pa jo je

uporabiti v roku 15 minut po pripravi.

Nacepitev plošč

S pripravljenim inokulumom smo v roku 15 minut nacepili gojišča za testiranje

občutljivosti.

V pripravljeno bakterijsko suspenzijo namočimo sterilen bris. Odvečno tekočino iz brisa

odstranimo tako, da bris pritiskamo ob steno epruvete nad nivojem suspenzije.

Inokulum enakomerno premažemo z brisom po celotni površini gojišča ročno tako, da

gojišče premažemo v treh smereh po celotni površini.

V roku 15 minut po tem, ko smo premazali plošče položimo diske.

Če čakamo predolgo, bi se na sobni temperaturi začela rast in bi dobili premajhne cone.

Polaganje antibiotičnih diskov

Diske smo položili na gojišče z dispenzorjem, tako, da se disk gojišča dotika enakomerno

s celotno površino. Ko smo diske enkrat položili, jih ne smemo več premikati, ker se

difuzija antibiotika v agar začne v trenutku, ko se disk dotakne gojišča.

Število diskov na posamičnem gojišču mora biti omejeno tako, da ne prihaja do

prekrivanja zaviralnih con in jih lahko zanesljivo izmerimo.

Praviloma na ploščo 90 mm položimo največ 6 diskov.

Da preprečimo izgubo učinkovitosti protimikrobne snovi v diskih, kar povzroči

zmanjšane cone, smo jih hranili pri ustreznih pogojih. Diske smo hranili v zaprtih

posodah z izsuševalcem in zaščitene pred svetlobo.


30

Zaloge in delovne zaloge diskov hranimo v zaprtih posodah v hladilniku pri temperaturi

pod 8 °C.

Ko posodo vzamemo iz hladilnika, jo nekaj časa pustimo na sobni temperaturi, da se

ogreje, šele nato jo odpremo. Tako preprečimo kondenzacijo vodnih par.

Inkubacija plošč

Najkasneje 15 minut po tem, ko smo položili diske, plošče obrnemo in inkubiramo pri

35±1 °C v aerobni atmosferi, 16 do 20 ur.

Za kontrolo rasti iz bujona smo cepili URI agar, ga inkubirali čez noč pri 35±1 °C v aerobni

atmosferi. URI agar je kromogeno gojišče, ki lažje odkriva mešane rasti. Pri metodi HMSI

identifikacije nismo izvajali posebej, ampak smo samo primerjali barvo kolonij s končno

identifikacijo po standardnem postopku.

4.1.3.1 Izvedba

Občutljivost bakterij 66 vzorcev iz vial za antibiotike, kjer so bili vidni samo po Gramu

negativni bacili, smo določali z disk difuzijsko metodo v skladu z navodili evropskih

smernic za antibiogram, ki jih pripravlja EUCAST, European Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing.

Suspenzijo v viali smo redčili z dodajanjem po kapljiacah s sterilno 0,85% fiziološko

raztopino, da smo pripravili bakterijsko suspenzijo gostote 0,5 McF. Ob vsakem dodatku

fiziološke raztopine suspenziji, smo suspenzijo premešali s stresalnikom (vortex), da smo

zmes homogenizirali in ji izmerili gostoto (motnost) bakterijskih suspenzij z nefelometrom.

Tako pripravljen inokulum vsebuje približno 1-2 x 108 CFU/mL (angl. Colony forming

units).

Pripravljen inokulum z gostoto 0,5 McF smo s sterilnim brisom zasejali na petrijevke

Mueller Hinton agarja. Omočen bris v suspenzijo, smo narahlo oželi ob steno epruvete in z

enakomernim nanosom premazali površino treh Mueller Hinton agarjev. Razmaz suspenzije

se mora absorbirati v gojišče, zato smo nekaj minut počakali (ne več kot 15 minut) in nato

položili antibiotične diske.

Celulozne diske premera 6 mm, ki vsebujejo standardno koncentracijo antibiotika, smo z

dispenzorji položili na inokulirane plošče. Skupno smo pri vsakem vzorcu testirali 18

antibiotikov, na vsaki petrijevki po šest antibiotičnih diskov. Seznam testiranih antibiotokov

je naveden v tabeli 4-2.


31

Tabela 4-2. Seznam testiranih antibiotikov, okrajšave na diskih in količine antibiotika v diskih,

uporabljenih pri testitanju izoliranih enterobakterij iz urina

Antibiotik Okrajšava Količina na disk (µg)

Ampicilin AM-10 10

Amoksicilin s klavaulansko kislino AMC-30 30

Amikacin AN-30 30

Ceftazidim CAZ-30 30

Cefiksim CFM-5 5

Cefadroksil CFR-30 30

Ciprofloksacin CIP-5 5

Ceftriakson CRO-30 30

Cefuroksim CXM-30 30

Ertapenem ETP-10 10

Cefepim FEP-30 30

Nitrofurantoin FM-100 100

Gentamicin GM-10 10

Imipenem IPM-10 10

Levofloksacin LVX-5 5

Meropenem MEM-10 10

Trimetoprim-sulfametoksazol SXT-25 25

Piperacilin s tazobaktamom TZP-36 36

Antibiograme smo inkubirali aerobno, 16-20 ur pri temperaturi 35±1 °C.

Iz vsake viale smo cepili še s sterilno ezo kapljico na kromogeno gojišče URI agar. Naslednji

dan preverimo rast kolonij na agarju za potrditev števila vrst bakterij.

4.1.4 Pregled plošč po inkubaciji, merjenje con inhibicije in interpretacija antibiogramov

Z nanosom ustreznega inokuluma in pravilno nacepitvijo gojišč, dobimo enakomerno

konfluentno bakterijsko rast.

Rast mora biti enakomerno zasejana po plošči in konfluentna tako, da so zaviralne cone

enakomerne in okrogle (niso nazobčane).

Na sliki 4-7 je primer antibiograma s konfluentno rastjo, cone inhibicij z okroglimi oblikami

in jasnimi robovi in primer antibiograma z mešano rastjo dveh bakterijskih vrst.


32

Slika 4-7: Dva primera antibiograma: konfluentna rast čiste kulture in mešana rast različnih vrst.

Velikost zaviralnih con odčitamo s prostim očesom na meji popolnega zaviranja rasti tako,

da ploščo držimo približno 30 cm od očes.

Plošče odčitavamo z zadnje strani, pri poševno padajoči svetlobi tako, da plošče držimo pod

kotom nad temno podlago.

Premer zaviralne cone natančno izmerimo z digitalnim kljunastim merilom.

Izmerjene premere con interpretiramo na podlagi sprejetih EUCAST smernic.

Pregledali smo rast in barvo kolonij na URI agar in jo primerjamo z rastjo na URI agarju, ki

je bil nacepljen po SKUK metodi. Na URI agarju rastejo vse enterobakterije, a različno

obarvano. Če so kolonije na obeh URI agarjih enake po obliki in velikosti in so enake barve,

smo prevzeli identifikacijo iz standardnega postopka. Posebej pri metodi B identifikacije

tako nismo izvajali.

4.1.4.1 Izvedba

Po inkubaciji mora biti bakterijska rast na agarskih ploščah z antibiogrami konfluentna, cone

inhibicije ob položenem antibiotičnem disku pa enakomerno okrogle oblike. Antibiogrami,

kjer sta porasli dve ali več bakterijski vrsti, niso bili vključeni v primerjavo antibiogramov.

Pri 52 antibiogramih od narejenih 66 smo dobili rast v čisti kulturi ene enterobakterije in

odčitali cone inhibicij.

Premere con inhibicij (mm) smo izmerili z digitalnim kljunastin merilom in s prenosom

podatkov v računalniški program MBL (mikrobiološki laboratorij ga uporablja za vnos

podatkov o pacientu in vzorcu, vnosu in tiskanju izvida, interpretaciji rezultatov,

povezovanju v mreži in ostale aplikacije) dobili kategorijo občutljivosti bakterijskega izolata

in jo izrazili kot občutljiv (S, angl. sensitive), intermediaren ali zmerno občutljiv (I, angl.

intermediate) in odporen ali neobčutljiv (R, angl. resistant) v skladu z navodili EUCAST.

Rezultat smo natisnili in izbrisali iz programa MBL. Ročno smo jih prepisali v EXCEL

tabelo za nadaljnjo primerjavo.

Pregledamo rast in barvo kolonij na URI agar. Rezultate primerjamo s končno identifikacijo

po standardni metodi.


33

4.1.5 Metodologija primerjave rezulatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulomom

Rezultate, stopnje občutljivosti 52 bakterijskih izolatov, ki smo jih dobili po HMSI metodi,

smo primerjali z rezultati, dobljenimi po standardni metodi, ki so referenčna vrednost.

Rezultate standardnega antibiograma so odčitali drugi zaposleni v laboratoriju, zaradi

izključitve vpliva avtorja raziskave na rezultate.

Natančnost določanja občutljivosti po HMSI za antibiotike je bila primerjana z rezultati

določanja občutljivosti po standardni metodi. Nabor testiranih antibiotikov je enak pri obeh

metodah in gre za antibiotike, ki so v rednem rutinskem testiranju pri izolatih enterobakterij

iz urina.

Izračunali smo deleže skladnosti med metodama za posamezne antibiotike in skupni delež

skladnosti po formuli:

Napake smo opredelili kot neskladnost med rezultatom HAT in SAT (referenčna metoda).

Kriteriji za interpretacije napak glede na kategorije občutljivosti, določene z dvema

metodama navaja Bengtsson s sod. 42.

Opredelitve velikosti neskladnosti:

MAJHNA NESKLADNOST – če je rezultat ene metode zmerna občutljivost (I), druge

metode pa občutljivost (S) ali odpornost (R)

VELIKA NESKLADNOST – kadar je rezultat referenčne metode občutljivost, rezulat

primerjalne metode pa odpornost – gre za lažno odporen test antibiotika po HMSI

ZELO VELIKA NESKLADNOST – kadar je rezultat referenčne metode definiran kot

odporen, primerjalna metoda pa da za organizem občutljivost – gre za lažno občutljiv test

antibiotika po HMSI

V tabeli 4-3. so opredeljene različne možnosti rezultatov.

Tabela 4-3. Razvrstitev neskladnosti v odvisnosti od rezultatov standardnega in hitrega

antibiograma.

MAJHNA NESKLADNOST

VELIKA

NESKLADNOST

ZELO VELIKA

NESKLADNOST

Referenčna metoda: STANDARDNI ANTIBIOGRAM

S I I R S R

Primerjalna metoda: HITRI ANTIBIOGRAM

I S R I R S

Legenda: občutljivost (S), zmerna občutljivost (I) in odpornost (R)


34

Izračunali smo deleže majhnih, velikih in zelo velikih neskladnosti za vsak posamezni

antibiotik in skupni delež vseh majhnih, velikih, in zelo velikih neskladnosti po formulah:

Rezultati so sprejemljivi, če je delež skladnosti pri primerjavi dveh metod ≥ 90 %, delež

velikih neskladnosti in delež zelo velikih neskladnosti pa ≤ 3%. Ta kriterij je ocena za

primerljivost ujemanja dveh metod.

Enake kriterije za ustreznost metode navaja Bengtsson s sod. primerjavi mejnih vrednosti po

EUCAST za disk difuzijsko metodo in referenčno standardno mikrodilucijo 42.

4.2 Uspešnost dodatka vankomicina pri zaviranju rasti po Gramu pozitivnih bakterij

Pri našem vsakdanjem delu ne uporabljamo kromogenega Mueller Hinton agarja, zato je bil

naš namen, da po Gramu pozitivne bakterije, ki so ponavadi kontaminanti v urinu, zavremo z

dodatkom vankomicina.

Začetnih 150 vzorcev urina od 230 smo vzporedno cepili v vialo NBJ in vialo, ki smo ji v

laboratoriju dodali vankomicin VBJ. Naša cilja sta bila preveriti:

ali dodatek vankomicina v vialo z bujonom in nacepljenim vzorcem urina, zavira

eventuelno prisotne po Gramu pozitivne bakterije v urinu, ki v urin v majhnih količinah

pridejo ob odvzemu in se v bujonu razmnožijo, kar predstavlja motnjo pri odčitovanju

antibiograma po HMSI.

določiti časovno stabilnost raztopine vankomicina. Raztopino smo kapnili na prazen

disk, ki ga bomo uporabili za kontrolni antibiogram s standardnim sevom: izmerjena

inhibicijska cona bo pokazala aktivnost vankomicina v raztopini. Prva dva tedna smo

preverjali z antibiogramom cono inhibicije z vankomicinom prepojenega diska vsakih

nekaj dni, od tretjega pa do dvanajstega tedna pa enkrat tedensko. Izmerjene cone bomo

podali v tabeli in grafično.


35

4.2.1 Priprava laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL in priprava bujona

z vankomicinom

Priprava raztopine vankomicina iz praška vankomicina v viali

Sestavina viale: viala z 1g vankomicina (sterilen prašek, ampula z vankomicinom).

Priprava: V vialo z 1 g vankomicina vbrizgamo 10 mL sterilne vode, dobro premešamo in

počakamo, da se prašek raztopi: dobimo osnovno raztopino v viali s koncentacijo 100

mg/mL. To je stock solution VA: 100 mg / mL.

1 mL stock solution VA smo dodali 9 mL sterilne vode, premešali in tako smo dobili

delovno raztopino vankomicina s koncentracijo »100 µg/10µL« (enako 10 mg / mL),

razpipetiramo v viale po 1 mL. Tako pripravljena raztopina je dobila oznako: VA 100 µg /10

µL 17.05.2016, kar je pomenilo serijo raztopine.

Eno vialo hranimo do porabe reagenta v hladilniku, ostale pa do prve uporabe v

zamrzovalniku. Testirali smo le vialo, ki smo jo hranili v hladilniku.

Priprava viale z dodajanjem vankomicina, rezultat je bujon v viali z vankomicinom

Pred cepljenjem urina smo 20 µL reagenta VA 10 mg / mL smo odpipetirali v originalno

vialo z NBJ (vsebuje 2 mL bujona, ki ga proizvajalec imenuje »eugonic broth«) in premešali,

s čimer smo dobili bujon z vankomicinom, s končno koncentracijo vankomicina v bujonu

100 µg / mL.

4.2.2 Način primerjave rezultatov cepljenja urina v navadno vialo in vialo z

vankomicinom

Za primerjavo smiselnosti rabe viale z vankomicinom, smo vzporedno nacepili prvih 150

vzorcev urina od preiskovanih 230 vzorcev v vialo z NBJ in z VBJ. Obe viali smo vnesli v

analizator in spremljali krivuljo rasti. Čas inkubacije: do dosežene gostote McFarland 0,5

(takrat se inkubacija lahko prekine) ali največ 4 ure.

4.3 Določitev trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL

Raztopino vankomicina v laboratoriju pripravljamo kot laboratorijski reagent, ki se uporablja

kot dodatek pri pripravi selektivnih agarjev in bujonov.

Vsakodnevno tehtanje in priprava, ter kontrola kvalitete reagenta vankomicina predstavlja v

delovnem procesu obremenitev z vsakodnevnimi kontrolami. Z določitvijo roka stabilnosti

pripravljenega reagenta se izognemo tem preverjanjem.

Za določitev roka stabilnosti smo v začetku testiranja na dva do tri dni kontrolirali

učinkovitost vankomicina z izvedbo standardnega antibiograma s standardnim sevom

S.auereu ATCC 29213. Na razmaz bakterijskega inokuluma smo položili disk, na katerega

smo nanesli 10 µL raztopine vankomicina s koncentracijo 100 µg/10µL. Antibiogram smo

inkubirali 35 °C in po inkubaciji 16-20 ur, odčitali cono inhibicije.


36

Slika 4-8: Slika testiranja trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin

Kriterij za stabilnost vankomicinskega reagenta: reagent je stabilen, če ni upada cone za več

kot 3 mm od začetne izmerjene cone.

Časovno stabilnost vankomicinskega reagenta bomo prikazali v tabeli in grafu.

4.4 Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu

V času trajanja študije smo opazili, da je nezanemarljiv delež vzorcev, ki ni dosegel praga

pozitivnosti gostote ≥ 0,5 McF v analizatorju HB&L, po semikvantitativni metodi pa je bila

urinokultura pozitivna.

Proizvajalec navaja možen vzrok »nerasti« tudi prisotnost antibiotika v urinu. Odločili smo

se, da urine dodatno testiramo na prisotnost antibiotika v urinu, če je po SKUK bila rast

(≥103

CFU/mL) v čisti kulturi enterobakterije. Ta dodatni test ni zajel vseh urinov, ker smo

ga začeli izvajati v sredini raziskave.

Urine, ki so bili po rutinskem postopku v laboratoriju pozitivni, rezultat rasti do motnosti

≥ 0,5 McF v aparatu pa ni bil dosežen, smo testirali na prisotnost antibiotika v urinu.

Gre za metodo z disk difuzijo: na Mueller Hinton agar pripravimo standardni inokulum

standardnega bakterijskega seva, na prazen disk nanesemo kužnino in agar inkubiramo.

Zanimalo nas je ali antibiotik v urinu inhibira rast nacepljenega bakterijskega seva. Večina

objavljenih metod interpretira vsako cono inhibicije okrog diska kot dokaz za prisotnost

antibiotika v urinu.

Ker nas je zanimalo ali antibiotik v urinu inhibira enterobakterije, smo za izvedbo testa

uporabili metodo, ki jo navaja Driscoll s sod., pri kateri je indikatorski sev za antibiotike v

urinu E.coli ATCC 25922, na disk pa nanesemo 20 µL kužnine 43.

Izvedba

S standardnim sevom bakterije E.coli ATCC 25922 smo pripravili inokulum v 2 mL sterilne

0,85 % fiziološke raztopine z gostoto 0,5 McF. Suspenzijo smo s sterilnim brisom aseptično

zasejali na Mueller Hinton agar. Na prazni celulozni disk, premera 6 mm smo s pipeto

nanesli 20 µL urina, in počakali približno minuto, da se je urin absorbiral. Disk smo položili

na gojišče inokulirani s standardnim sevom E.coli ATCC 25922. Naslednji dan pregledamo


37

ali se je pojavila cona zavrtosti rasti standardnega seva, kar kaže na prisotnost antibiotika v

urinu.


38

5 Rezultati in diskusija

Raziskovalne metode so bile v poglavju Materiali in metode opisane v več podpoglavjih in v

skladu s tem bodo podani tudi rezultati z interpretacijo oz. diskusijo.

5.1 Primerjava rezultatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulumom

5.1.1 Rezultati kultiviranja

V raziskavo smo vključili 230 kliničnih vzorcev urina.

Ugotovili smo, da je bilo od 230 vzorcev v semikvantitativni urinokulturi pozitivnih 133

vzorcev, kjer smo osamili različne mikroorganizme: kvasnice, po Gramu pozitivne ali po

Gramu negativne bakterije.

Rast v viali z gostoto ≥ 0,5 McF smo v HB&L aparatu ugotovili v 92 primerih vzorcev od

230 nacepljenih, v 41 primerih pa ne.

Od 41 vzorcev, kjer v viali ni bilo rasti gostote ≥ 0,5 McF, je bilo 16 vzorcev, pri katerih

smo v SKUK osamili eno samo vrsto enterobakterij, a te niso dosegle praga rasti do gostote

0,5 McF v HB&L analizatorju. Razprava o možnih vzrokih, zakaj tu ni bilo rasti, je v točki

5.1.4

Tabela 5-1. Pregled rezultatov standardne semikvantitativne urinokulture 230 vzorcev urina

Rezultat urinokulture Število

rezultatov

Najpogostejši izolati (število)

En izolat po Gramu negativne

bakterije

79 Enterobakterije (76), Pseudomonas aeruginosa (3)

En izolat po Gramu pozitivne

bakterije

15 Enterococcus faecalis (7), Streptococcus agalactiae

(4), Staphylococcus aureus (2), Staphylococcus

epidermidis (1), Staphylococcus warneri (1)

Dva različna izolata bakterij 29 Različne kombinacije dveh bakterij (29)

En izolat gliv 8 Candida albicans (4), C. glabrata (3), Trichosporon

asahii (1)

Več vrst bakterij (mešana

flora)

10

Negativna urinokultura 43

Na zasejanih gojiščih ni bilo

rasti

46

SKUPAJ 230


39

5.1.2 Pozitivne viale - barvanje po Gramu in mikroskopski pregled preparata

Za 92 pozitivnih vzorcev iz HB&L analizatorja smo izvedli postopek barvanja po Gramu in

pregledali mikroskopske preparate.

V 66 vzorcih urinov so bili vidni samo po Gramu negativni bacili.

Samo kvasovke so bile vidne v treh preparatih urinov, v enajstih preparatih samo po Gramu

pozitivne bakterije – rezulat barvanja je bil v teh primerih skladen z izolati v SKUK.

V 8 preparatih urinov so bile vidne po Gramu pozitivne in negativne bakterije. Pri teh

vzorcih smo v SKUK osamili le eno bakterijsko vrsto po Gramu negativnih bakterij. Po

pregledu primarno nacepljenega URI agarja v SKUK smo ugotovili, da je v vseh teh

primerih porasla zelo majhna populacija raznih bakterij, katerih rast na URI agarju je bila

opisana kot: bele, turkizne, drobne (opis kolonij ustrezen za po Gramu pozitivne bakterije).

Sklepamo, da se je populacija, ki jo po SKUK označujemo kot verjetno kontaminacijo

vzorca s sluznic (malo po Gramu pozitivnih bakterij) v viali z NBJ namnožila, da je bilo v

preparatu po Gramu bilo teh bakterij nezanemarljivo veliko.

5.1.3 Pregled antibiogramov in odčitovanje con inhibicij

Iz 66 vzorcev urinov iz vial, pri katerih so bili v preparatu vidne po Gramu negativne

bakterije, smo izdelali antibiogram. V besedilu navajamo, da gre za hitri antibiogram – HAT.

Hitrost ni v času inkubacije samega antibiograma, ampak v času razmnoževanju bakterij do

rasti, ko je gostota mikroorganizmov vzorcu ≥ 0,5 McF. Ta opazovani čas je do 4 ure, v

primeru zgodnejše dosežene gostote, lahko inkubacijo prekinemo.

Nismo uporabili izraza direktni antibiogram, ker se ta v literaturi uporablja za antibiogram

direktno izveden iz kužnine (brez vmesne rasti v bujonu).

Pri 52 antibiogramih od narejenih 66, smo dobili rast v čisti kulturi ene enterobakterije.

Čista kultura poraslih enterobakterij bakterij in konfuentna rast na Mueller Hinton agarju sta

predpogoja za odčitovanje antibiograma in upoštevanje rezultatov v primerjalni študiji.

Pri ostalih 14 narejenih antibiogramih od 66, je bila pri 11 ugotovljena mešana dveh ali več

enterobakterij, pri 3 antibiogramih pa rast bakterije Pseudomonas aeruginosa, ki je

nefermentativen po Gramu negativen bacil in ni zajet v raziskavo.

Ko smo izdelali hitri antibiogram, smo hkrati cepili še URI agar. Pred odčitovanjem HAT

smo preverili na URI agarju skladnost barve poraslih kolonij z barvo kolonij na URI agarju,

ki je bil narejen po SKUK metodi. Če je bila barva in oblika kolonij na obeh agarjih enaka,

smo za identifikacijo pri hitri metodi upoštevali izolat SKUK metode.

V primeru, da še identifikacija po SKUK ni bila končana, HAT pa je bilo potrebno odčitati,

smo v program MBL vnesli kot izolat koliformne bakterije.

S pomočjo digitalnega kljunastega merila smo po inkubaciji in pregledu gojišč izmerili

premere zaviralnih con. S prenosom podatkov v računalniški program MBL

mikrobiološkega laboratorija, se izpiše kategorija občutljivosti bakterijskega izolata, ki se

izrazi kot občutljiv (S, angl. sensitive), zmerno občutljiv ali intermediaren (I, angl.


40

intermediate) in odporen (R, angl.resistant) za testiran antibiotik. Za interpretacijo con

inhibicije, je predloga v programu MBL usklajena z veljavnimi mejami posameznih

kategorij – »breakpoints« po EUCAST.

Podatki HAT odčitanih občutljivosti bakterij za antibiotike so zbrani v tabeli 5-3 Kategorije

občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata za antibiotike za - 52

hitrih antibiogramov.

5.1.4 Primerjava rezultatov hitrega in standardnega antibiograma

V 76 vzorcih od 230 so v SKUK enterobakterije zrasle kot edini izolat iz vzorca. V tabeli 5-2

so navedene bakterijske vrste, ki smo jih osamili. Posebej so navedeni izolati, pri katerih

smo iz vzorca naredili HAT in tisti, kjer HAT nismo naredili.

Tabela 5-2. Pregled izolatov 76 vzorcev, kjer so enterobakterije v semikvantitativni

urinokulturi zrasle kot edini izolat iz vzorca.

Bakterijska vrsta Izolati s

HAT*

Izolati brez

HAT*

Vsi izolati Delež izolatov s HAT

(%)

Escherichia coli 40 16 56 71,4

Proteus mirabilis 4 2 6 66,7

Klebsiella pneumoniae 4 1 5 80

Enterobacter cloacae 2 2 4 50

Morganella morganii 0 2 2 0

Providencia stuartii 0 1 1 0

Klebsiella oxytoca 1 0 1 100

Citrobacter koseri 1 0 1 100

SKUPAJ 52 24 76 68,4

Legenda: HAT je hitri antibiogram.

Pri teh vzorcih bi bil zaradi čiste kulture enterobakterij v SKUK HAT »smiseln«; če ni bil

izdelan, je to neželen izhod uporabljenega pristopa.

Pri 24 (31,4 % od 76 izolatov) vzorcih z eno samo vrsto enterobakterij v SKUK HAT nismo

naredili. Vzroka, da po opredelitvah raziskave »smiselni« HAT niso bil izdelani, sta bila v

osnovi dva:

- pri 8 izolatih HAT nismo naredili, ker smo v preparatu kužnine po Gramu videli

poleg NB tudi PB: pri teh izolatih HAT nismo delali in smo te vzorce izključili iz

izdelave HAT, saj smo pričakovali mešano rast različnih bakterij.

- pri 16 izolatih HAT nismo naredili, ker v viali z NBJ ni bilo rasti, zato HAT ni bil

izvedljiv.

Zakaj v 16 vialah z NBJ ni bilo ni bilo rasti, lahko domnevamo.


41

Prva domneva je, da do rasti v viali ni prišlo, ker je bil čas inkubacije pri majhnem

inokulumu bakterij v urinu viale prekratek, da bi se inokulum razmnožil do gostote

McFarland 0,5.

Pri 6 vzorcih je bilo število CFU/mL v SKUK majhno (enako ali manjše od 104 CFU/mL) -

morda ti vzorci v maksimalno 4 urah inkubacije, kot je v protokolu določeno, niso imeli

dovolj časa, da bi se razmnožili do potrebne gostote McFarland 0,5.

Druga domneva je, da je bil v nekaterih vialah antibiotik, ki ga je bolnik dobival in izločal v

urin - antibiotik v urinu je zaviral rast bakterij. Pri inokulaciji v 2 mL HBL vialo z NBJ

inokuliramo 0,5 mL urina: gre torej za redčenje urina v razmerju 1 : 4, kar ni veliko, če je

antibiotik v urinu prisoten v veliki koncentraciji.

V SKUK na agar cepimo majhno količino urina (1 µL ali 10 µL), ki jo redčimo po celotnem

agarju, s čimer morebitni antibiotik iz urina na površini agarja močno razredčimo – s tem se

možnost rasti bakterije poveča. Pri vsakodnevnem delu pri bolnikih včasih opazimo

naslednji pojav: na mestu in v bližini inokulacije kapljice urina na agar ni rasti, periferno,

kamor kapljico z bakteriološko zanko redčimo, pa se rast pojavi.

Pri 10 vzorcih, kjer je v SKUK poraslo veliko število CFU/mL (≥105 CFU/mL), v viali pa ni

bilo rasti, bi bil vzrok za odsotnost rasti lahko antibiotik v v urinu bolnika. Znano je, da se

večina antibiotikov v urinu koncentrira in lahko povzročijo začasno negativno urinokulturo,

čeprav so viabilne bakterije prisotne, ampak zavrte 39.

Prisotnosti antibiotikov v urinu smo preverjali in pri manjšem število urinov v drugem delu

raziskovalnega dela. Obstajajo številne modifikacije iste osnovne metode, s katero lahko

enostavno dokaj zanesljivo ugotavljamo, ali bolnik dobiva antibiotike 39-40. V osnovi je

metoda naslednja: na prazen disk kapnemo kapljico urina in disk uporabimo kot potencialni

»antibiotični disk« - analogno antibiogramu: na Mueller Hinton agar inokuliramo dobro

občutljiv indikatorski sev (npr. E. coli ATCC 25922) enako kot za standardni antibiogram, z

urinom omočeni disk položimo na agar. Inkubiramo preko noči in interpretiramo: inhibicija

rasti okrog diska z urinom pomeni prisotnost antibiotika v urinu, odsotnost cone inhibicije

okrog diska z urinom pomeni odsotnost antibiotika v urinu 44.

Menimo, da bi bilo v prihodnjih raziskavah HAT iz urina smiselno ugotavljati, ali urini

vsebujejo antibiotik, čeprav vedenje o tem ne spremeni dejstva, da precejšen del

enterobakterij, ki so v SKUK zrasle, v NBJ ne raste – pri teh vzorcih HAT torej ni mogoč,

čeprav je po opredelitvi naše naloge smiselen.

Na osnovi navedenega lahko domenvamo, da je HAT izvedljiv:

- pri velikem deležu bolnikov, ki imajo hudo okužbo sečil z velikim številom bakterij v urinu

in ki pred odvzemom urina niso dobili antibiotika

- pri majhnem deležu bolnikov, ki imajo okužbo sečil z majhnim številom bakterij v urinu ali

so pred odvezemom urina dobili antibiotik.

Pregled izdelave HAT v 154 vzorcih, kjer v SKUK enterobakterije niso zrasle kot edini

izolat iz vzorca:

pri 140 vzorcih HAT pravilno ni bil izdelan

pri 14 vzorcih pa je bil HATpo nepotrebnem narejen, čeprav je bil nesmiselen.


42

V 13 primerih je bil HAT nesmiselen, ker sta iz vzorca porasli dve vrsti bakterij, od tega 12-

krat le po Gramu negativne bakterije. V enem primeru je bil HAT nesmiselen, ker je zarasla

neciljna bakterija (Pseudomonas aeruginosa).

HAT smo po protokolu študije praviloma izdelali, če smo v razmazu iz viale videli le po

Gramu negativne bakterije. Ker razlikovanje dveh vrst enterobakterij na osnovi morfologije

bacilov v razmazu ni možno, je razumljivo, da smo iz teh vzorcev HAT izdelali, saj na

osnovi razmaza nismo mogli vedeti, da gre za več vrst bakterij.

Skupaj smo izdelali 66 HAT:

Smiselnih HAT je bilo 52 (78,8 % od vseh izdelanih). Vsi smiselni HAT so bili

uporabni za analizo, saj so pri njih enterobakterije zrasle v čisti kulturi kot

konfluentna rast na MHA.

Nesmiselnih HAT je bilo 14 (21,2 % od vseh izdelanih), bili so neuporabni za analizo

v naši raziskavi.

V klinični praksi ti HAT ne bi bili popolnoma neuporabni, saj bi na osnovi rasti in

identifikacije izolatov lahko orientacijsko ocenili, za katere antibiotike sta oba izolata

verjetno občutljiva in proti katerim antibiotikom je vsaj en izolat verjetno odporen.

Rezultate antibiogramov – v nadaljevanju HAT, ki smo jih dobili po HMSI in so zbrani

tabeli 5-3, smo primerjali z rezultati, dobljenimi po standardni metodi.

Za referenčno vrednost za primerjavo smo izbrali izdelane standardizirane antibiograme

izolatov končnih izvidov – v nadaljevanju SAB, ki so v tabeli 5-4 Kategorija občutljivosti

(občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata za antibiotike - 52 standardnih

antibiogramov iz standardne urinokulture.

Odčitane zaviralne cone izolatov za posamezni antibiotik so v tabeli kategorizirane kot

stopnje občutljivosti S (občutljiv), I (zmerno občutljiv) in R (odporen).


43

Tabela 5-3. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata

za antibiotike - 52 hitrih antibiogramov. Podatki iz raziskave. Zap.št. vzorca ESBL Izolat AM AMC AMCu AN CAZ CFM CFR CIP CRO CXM CXMp ETP FEP FM GM IPM LVX MEM SXT TZP

5 K. oxytoca R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S

12 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

22 P. mirabilis R R R S S S S R S S S S S R S S I S R S



34 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S

35 C. diversus R S S S S S S S S S NI S S NI S S S S S S

37 E. coli R S S S S S S R S S S S S S S S R S R S






57 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S


69 ESBL E. cloacae R R R S S R R R R R NI I I NI S S R S R R



77 E. coli R R S S S S S R S S S S S S S S R S S S


83 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S

85 ESBL E. coli R R R I R R R R R R R S S S S S R S R R



100 P. mirabilis R S S S S S S S S S S S S R S S S S S S

107 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

112 ESBL K. pneumoniae R R S S R R R R R R R S R R R S S S I S


117 ESBL E. coli R R R S R R R R R R R S R S R S R S R S

130 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S R S

134 E. coli R R S S S S S R S S S S S S R S R S S S

139 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S S I

150 E. coli R R R S S S S S S S S S S S S S S S S S


158 P. mirabilis S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S


162 E. coli R R R S S S R R S R R S S R S S R S R R




170 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S R I




182 ESBL E. cloacae R R R S R R R I R R NI S R NI R S S S S I



195 ESBL E. coli R R R S S R R R R R R S S S S S R S R I




229 E. coli S S S S S S S R S S S S S S S S R S S S

Legenda: S - občutljiv ( angl. sensitive); I – zmerno občutljiv (angl. intermediate); R – odporen (angl. resistant), NI – ni interpretacije.

AM – ampicilin, AMC – amoksicilin s klavulansko kislino, sistemska okužba, AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino, rezultat za nezpletene okužbe sečil, AN – amikacin, CAZ –

ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR – cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, rezultat za nezpletene okužbe sečil, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP

– ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin, IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP –

piperacilin z tazobaktamom

ESBL – izolat izloča betalaktamaze razširjenega spektra


44

Tabela 5-4. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata

za antibiotike -52 standardnih antibiogramov iz standardne urinokulture. Podatki iz programa

MBL. Zap.št. vzorca ESBL Izolat AM AMC AMCu AN CAZ CFM CFR CIP CRO CXM CXMp ETP FEP FM GM IPM LVX MEM SXT TZP

5 K. oxytoca R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S


22 P. mirabilis R R R S S S S R S S S S S R S S I S R S




35 C. diversus R S S S S S S S S S NI S S NI S S S S S S

37 E. coli R S S S S S S R S S S S S S S S R S R S








69 ESBL E. cloacae R R R S S R R R R R NI I I NI S S R S R R






85 ESBL E. coli R R R I I R R R R R R S S S S S R S R R



100 P. mirabilis R S S S S S S S S S S S S R S S S S S S

107 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

112 ESBL K. pneumoniae R R S S R R R R R R R S R R R S S S I S


117 ESBL E. coli R R R S I R R R R R R S I S R S R S R S

130 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S R S

134 E. coli R R S S S S S R S S S S S S R S R S S S


150 E. coli R R R S S S S S S S S S S S S S S S S S




162 E. coli R R R S S S R R S R R S S R S S R S R R




170 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S R I




182 ESBL E. cloacae R R R S R R R I R R NI S R NI R S S S S I



195 ESBL E. coli R R R S S R R R R R R S S S S S R S R I




229 E. coli S S S S S S S R S S S S S S S S R S S S

Legenda: S - občutljiv ( angl. sensitive); I – zmerno občutljiv (angl. intermediate); R – odporen (angl. resistant), NI – ni interpretacije.

AM – ampicilin, AMC – amoksicilin s klavulansko kislino, sistemska okužba, AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino, rezultat za nezpletene okužbe sečil, AN – amikacin, CAZ –

ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR – cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, rezultat za nezpletene okužbe sečil, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP

– ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin, IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP –

piperacilin z tazobaktamom

ESBL – izolat izloča betalaktamaze razširjenega spektra


45

EVALUACIJA HAT

Primerjali smo rezultate HAT (hitri antibiogram) in SAB pri 52 HAT, ki so bili uporabni za

analizo.

Rezultati kategorij občutljivosti izolatov so v tabeli 5-3 In 5-4.

Testirali smo 18 antibiotičnih snovi, rezultati pa so navedeni za 20 »antibiotikov«.

Gre za to, da imata antibiotika cefuroksim in amoksicilin s klavulansko kislino vsak dva

rezultata – eden velja za sistemske okužbe, drugi pa le za nezapletene okužbe sečil. To je

posebnost pri interpretaciji glede na mesto okužbe in vrsto bakterije.

Pri izolatih enterobakterij iz sečil sta za amoksicilin s klavulansko kislino dva rezultata:

- Za zapletene okužbe sečil in sistemske okužbe – rezultat za ta namen ima okrajšavo

AMC – amoksicilin s klavulansko kislino.

- Posebna interpretacija je za zdravljenje nezapletenih okužb sečil. S tem se možnost

uporabe antibiotika pri teh okužbah poveča – rezultat za ta namen ima okrajšavo

antibiotika AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino - cistitis.

Pri izolatih iz sečil sta za cefuroksim dva rezulata:

- Rezultat za i.v. cefuroksim velja za zapletene okužbe sečil in za sistemske okužbe z

vrstama E.coli in P. mirabilis ter vsemi vrstami rodu Klebsiella.

- Rezultat za peroralno obliko cefuroksim aksetil velja le pri nezapletenih okužbah

sečil.

Pri nekaterih izolatih ni rezultatov za vse antibiotike, ker nekatere vrste enterobakterij za

nekatere antibiotike nimajo interpretacije npr.:

- Pri enterobakterijah rezultati za nitrofurantoin veljajo le za E. coli in le pri

nezapletenih okužbah sečil.

E. coli predstavlja z 40 izolati (76,9 %) največji delež med izolati HAT, sledita P. mirabilis

in K. pneumoniae s po 7,7 % pogostostjo. Izolirana sta bila še dva primera vrste E. cloacae

in po en primer izolata C. koseri in K. oxytoca.

Od 52 izolatov HAT je bilo v populaciji 11,5 % izolatov bakterij, ki izločajo ESBL.


46

V tabeli 5-5. so prikazane razlike med antibiotiki in skladnost / neskladnost obeh metod za

vsak antibiotik posebej.

Tabela 5-5. Seznam in razvrstitev neskladnosti pri testiranih 52 izolatih enterobakterij (vsak

testiran z 20 antibiotiki )

Antibiotik Št. izolata Vrsta Rezultat standardnega antibiograma

Rezultat direktnega antibiograma

Neskladnost

Ceftazidim 22 Escherichia coli*

zmerna občutljivost odpornost majhna

Ceftazidim 29 Escherichia coli*


Cefepim 29 Escherichia coli*


* vse tri neskladnosti so se pojavile pri dveh izolatih, ki sta izločala ESBL

Neskladnosti, ki jih ugotavljamo, so se pojavile pri dveh izolatih E. coli, ki sta izločala

ESBL.

Verjetnost za pojav napake pri poročanju testiranja antibiotikov je občutno višja pri

bakterijskih populacijah, ki imajo posebne mehanizme odpornosti, kot pri populaciji divjega

tipa - to je ugotovil raziskovalec Maurer s sod. v študiji z disk difuzijsko metodo za 7.148

kliničnih izolatov. Poročanje napak za amoksicilin s klavulansko kislino in piperacilin z

tazobaktamom v primerih okužb z E. coli, so bili skoraj izključno zaradi prisotnosti

betalaktamaz (ESBL) 45.

Coorevits in sod. pri testiranju kliničnih vzorcev direktnega antibiograma podobno

ugotavljajo, da je več neskladnosti kot posledica bolj odpornih mutantov ali pa dodatnih

izolatov z večjo odpornostjo 30.

Bakterije z ESBL imajo najpogosteje CTX encime, ki najhitreje razgrajujejo cefotaksim,

cefepim in ceftazidim pa prizadenejo manj, tako da Valsesia in sod. ugotavljajo, da so cone

inhibicije teh izolatov za cefepim in ceftazidim na meji med intermediarnimi in odpornimi

izolati 46.

Novais s sod. je ugotovil, da imajo izolati z ESBL lahko zelo pogoste mutacije, ki povečajo

odpornost proti ceftazidimu 47.

Vzrok, zakaj je do teh neskladnosti prišlo ravno pri ESBL izolatih je verjetno posledica

zgoraj opisanih pojavov.


47

Primerjali smo stopnje občutljivosti, določene z omenjenima metodama. Izračunali smo

deleže skladnosti in neskladnosti za vsak posamezni antibiotik in za vse antibiotike in

podatki so zbrani v tabeli 5-6.

Tabela 5-6. Deleži skladnosti in neskladnosti rezultatov direktnega antibiograma v primerjavi s

hitrim antibiogramom (izraženo v odstotkih)

Antibiotik Število z antibiotiko

m testiranih izolatov

Delež skladnosti

(%)

Delež majhnih

neskladnosti (%)

Delež velikih

neskladnosti (%)

Delež zelo velikih

neskladnosti (%)

Delež skladnosti

≥ 90 %

Delež velikih

neskladnosti <3 %

Delež zelo velikih

neskladnosti <3 %

AM 52 100 100 0 0 DA DA DA

AMC 52 100 100 0 0 DA DA DA

AMCu 52 100 100 0 0 DA DA DA

AN 52 100 100 0 0 DA DA DA

CAZ 52 96,2 3,8 0 0 DA DA DA

CFM 52 100 100 0 0 DA DA DA

CFR 52 100 100 0 0 DA DA DA

CIP 52 100 100 0 0 DA DA DA

CRO 52 100 100 0 0 DA DA DA

CXM 52 100 100 0 0 DA DA DA

CXMp 49* 100 100 0 0 DA DA DA

ETP 52 100 100 0 0 DA DA DA

FEP 52 98,1 1,9 0 0 DA DA DA

FM 45* 100 100 0 0 DA DA DA

GM 52 100 100 0 0 DA DA DA

IPM 52 100 100 0 0 DA DA DA

LVX 52 100 100 0 0 DA DA DA

MEM 52 100 100 0 0 DA DA DA

SXT 52 100 100 0 0 DA DA DA

TZP 52 100 100 0 0 DA DA DA

Vsi antibiotiki

1030 99,7 0,3 0 0 DA DA DA

*Pri nekaterih bakterijskih vrstah za antibiotiki ni interpretacije.

Legenda: AM – ampicilin, AMC – amoksicilinsklavulanska kislina, AMCu –URIN amoksicilin s klavulanska kislina, AN – amikacin, CAZ – ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR –

cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP – ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin,

IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP – piperacilin s tazobaktam

Skupno smo testirali 1030 kombinacij izolat / antibiotik. Skladnost smo ugotovili pri 1027

testih ali pri 99,7 % odstotkih.

Velikih ali zelo velikih neskladnosti ni bilo, ugotovili smo 3 MAJHNE NESKLADNOSTI

kar predstavlja 0,3 % majhnih neskladnosti.

Pregled pri posameznih antibiotokih:

Za 18 antibiotikov od 20: ampicilin, amoksicilin s klavulansko kislino, URIN amoksicilin s

klavulansko kislino, amikacin, cefiksim, cefadroksil, ciprofloksacin, ceftriakson, cefuroksim,

cefuroksim parenteralni, ertapenem, nitrofurantoin, gentamicin, imipenem, levofloksacin,

meropenem, trimetoprim s sulfametoksazolom in piperacilin s tazobaktamom je bil delež

skladnosti 100 %, za ceftazidim 96,2 % in za cefepim 98,1 %.


48

Za vseh dvajset testiranih antibiotikov je delež skladnosti ujemanja med rezultati SAB in

HAT višji od 90 %, kar potrjuje dobro primerljivost teh dveh metod.

Ugotovili smo visok delež skladnosti vseh antibiotikov (99,7 %) in odsotnost velikih in zelo

velikih napak - deleža obeh sta namreč 0 %.

Zaključek: rezultati ne kažejo na bistvena odstopanja med primerjanima metodama za

testirane antibiotike, enakovredna je standardni metodi. Metoda HAT izpolnjuje pogoje za

uspešno validacijo metode, ki jih je EUCAST postavil za validacijo standardnega disk-

difuzijskega antibiograma [42].

Ker smo validacijo naredili na relativno majhnem številu izolatov bi bilo smiselno

nadaljevati s primerjavo na večjem številu pozitivnih vzorcev urinov.

5.2 Vzporedna kultivacija v viali z vankomicinom

Prvih 150 vzorcih smo cepili v NBJ in VBJ (2 viali) in preučevali učinke različnih strategij.

Pri teh smo za analizo uporabili navedene opredelitve.

REZULTATI

Od 150 inkubiranih vzorcev, ki smo jih vzporedno cepili v vialo z NBJ in VBJ, je bilo:

- 90 takih, pri katerih v obeh vialah ni bilo rasti – HAT iz njih ni izvedljiv

- 60 takih, pri katerih je bila rast vsaj v viali z NBJ (od tega je bilo 6 vzorcev takih, da v viali

z VBJ ni bilo rasti, 54 vzorcev pa takih, kjer je bila rast v obeh vialah, z NJB in VJB).

Pri teh 60 vzorcih smo preučili posledice uporabe različnih pristopov do izdelave HAT.

Pristope smo imenovali strategija A, B, C in D, opredeljeni so v poglavju o metodah.

Podrobnosti eksperimenta za 60 vzorcev, pri katerih je bila rast vsaj v viali z NBJ, pa so v

prilogi 1.

Med 60 vzorci z rastjo v NBJ je bilo 39 vzorcev s čisto kulturo ene EB v SKUK; pri teh je

HAT opredeljen kot smiselen, ker iz bujona pričakujemo uporaben HAT (čisto kulturo EB).

V vseh ostalih primerih je izdelava HAT opredeljena kot nesmiselna, ker ne pričakujemo

uporabnega antibiograma NB.

Vse NB, ki so zrasle v NBJ, so zrasle tudi v VBJ: pričakovano vankomicin ni zavrl rasti NB.

V tabeli 5-7 so izračuni za vse štiri strategije.


49

Tabela 5-7. Število vzorcev v različnih kategorijah pravilnosti / nepravilnosti postopkov,

seštevek in delež pravilnih postopkov v različnih strategijah med 60 vzorci, pri katerih smo

zaznali rast v viali z navadnim bujonom

Kategorija pravilnosti postopka Strategija A Strategija B Strategija C Strategija D

HAT izdelan, pravilno 39 39 31 35

HAT izdelan, nepravilno 21 15 4 8

HAT ni izdelan, nepravilno 0 0 8 4

HAT ni izdelan, pravilno 0 6 17 13

Seštevek pravilnih postopkov 39 45 48 48

Delež pravilnih postopkov 65% 75% 80% 80%

Med 60 vzorci je bilo 39 vzorcev, pri katerih je bil HAT smiseln in 21, pri katerih je bil

nesmiseln.

V strategiji A in B bi zajeli vse vzorce, kjer je HAT smiseln, vendar bi naredili veliko

nesmiselnih HAT, delež pravilnih postopkov je najmanjši pri uporabi strategije A.

Delež pravilnih postopkov je v strategijah C in D enak (80 %), vendar strategija D zajame

večji del smiselnih HAT kot strategija C: s strategijo C bi naredili HAT pri 35 od 39

smiselnih HAT (90 %), pri strategiji C pa le pri 31 od 39 HAT (79 %).

Ocenjujemo, da bi bila strategija D najprimernejša za vsakdanje delo. Če bi uporabili

strategijo D (kultivacija urina v VBJ, pri rasti v viali bi naredili razmaz po Gramu in izdelali

HAT, če bi videli le NB) pri 150 vzorcih, ki smo jih cepili v VBJ, bi bilo število postopkov

naslednje:

- urin bi cepili v 150 vial, ki bi jim pred tem dodali vankomicin

- rast bi zaznali v 54 vialah

- naredili bi 54 razmazov po Gramu (pri 6 vzorcih od 60, kjer so bile v NBJ prisotne le

PB, v VBJ ni bilo rasti, ker jim je vankomicin preprečil rast).

- naredili bi 43 HAT, od katerih bi bilo smiselnih HAT 35, 8 pa nesmiselnih

- pri štirih vzorcih od skupno 150 vzorcev HAT ne bi naredili, čeprav bi bil smiseln.

Pri teh 150 vzorcih gre za izračune na osnovi v poglavju o metodah opredeljenih pojmov,

kdaj je HAT »smiseln«, kdaj je pravilno izdelan in kdaj ne: iz vial z VBJ nismo naredili

nobenega HAT.

Za pristop k vzorcem v celotni nalogi z 230 vzorci smo uporabljali modificirano strategijo C

(HAT smo naredili iz NBJ, če smo ga naredili): razlika med strategijo C in strategijo v

nalogi je v tem, da smo v nalogi HAT izjemoma naredili, četudi smo v preparatu po Gramu

videli poleg NB tudi PB, če »je bilo zelo malo PB v primerjavi z NB« (subjektivna ocena

razmerja PB in NB). HAT smo vedno naredili iz NBJ. Pokazalo se je, da je subjektivna

ocena nezanesljiva – HAT smo izdelali v 6 primerih, ko »je bilo zelo malo PB v primerjavi z

NB«: v 4 primerih tako izdelanih HAT smo v SKUK ugotovili dve vrsti bakterij (nesmiseln

HAT) in v 2 smiseln HAT (v SKUK ena vrsta NB).

Ker je strategija D z uporabo viale z VBJ pokazala dobre rezultate, bi bilo smiselno narediti

še raziskavo z izdelavo HAT z uporabo strategije D.


50

5.3 Določitev roka stabilnosti vankomicina v vodni raztopini za pripravo bujona z vankomicinom

Viale z VBJ niso komercialno dostopne; če bi tehtali vankomicin in sproti pripravljali

raztopino, bi bilo to prezapleteno in časovno potratno (varnostna oprema, čas). Dodajanje že

pripravljene raztopine vankomicina pa je enostavno in hitro. Zanimalo nas je, koliko časa po

pripravi je vodna raztopina vankomicina učinkovita. Rezultati so v naslednjem delu naloge.

Testiranje se je izvajalo z reagenton vankomicin oznaka: VA 100 µg/10µL 17.05.2016,

trajalo je dvanajst tednov in rezultati odčitanih con inhibicij so zbrani v tabeli 5-8 in grafično

prikazani na sliki 5-1.

Tabela 5-8. Izmerjene cone inhibicije reagenta vankomicin za določitev roka stabilnosti

Datum: 18.05.2016 20.05.2016 23.05.2016 25.05.2016 28.05.2016 31.05.2016 07.06.2016

Cona (mm): 21 21 22 22 22 22 22

Datum: 14.06.2016 21.06.2016 28.06.2016 05.07.2016 12.07.2016 20.07.2016 27.07.2016

Cona (mm): 22 22 22 22 21 21 21

Datum: 03.08.2016

Cona (mm): 22

Slika 5-1: Diagram stabilnosti reagenta vankomicin

Zaključek: V obdobju dvanajstih tednov smo testirali laboratorijsko pripravljen reagent

vankomicin z oznako VA 100 µg/10µL 17.05.2016. Območja premerov odčitanih con

inhibicij so bile pri vseh meritvah med 21 in 22 mm in se v času testiranja niso zmanjšale za

3 mm in so ostale znotraj kriterija za stabilnost.

18

19

20

21

22

23

24

25

con

a (m

m)

datum odčitovanja

STABILNOST REAGENTA VANKOMICIN


51

S testiranjem smo potrdili, da je laboratorijsko pripravljen reagent vankomicin hranjenj v

hladilniku, stabilen najmanj 12 tednov.

5.4 Dokaz antibiotika v urinu

Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu nismo izvajali v celotni študiji. Potreba po tem

testu se je pokazala v času raziskave in primerjave rezultatov po standardni semikvantitativni

metodi in metodi obdelave vzorcev urinov v HB&L analizatorju, ko smo opazili, da v več

vialah ni bilo rasti, po SKUK metodi pa je poraslo veliko število bakterij (≥105 CFU/mL).

Preverjali smo 13 urinov, kjer v NBJ viali ni bilo rasti, po SKUK pa so bakterije porasle.

V 5 primerih od 13, kar je 38,5 %, smo dokazali prisotnost antibiotika v urinu.

Slika 5-2: Primer dokaza antibiotika v urinu

Zaključek: Izsledki naših testiranj dokaza antibiotika v urinu, kažejo na potrebo po

nadaljnjih študij po izvedbi tega testa.

Tudi Cardozo s sod. v zaključku svoje študije predlaga, da se vključi preverjanje prisotnosti

antibiotika v urinu v rutinsko obdelavo kužnine urina pri sumu na urioinfekt 39.

V prispevku Driscoll s sod. navaja, da je metoda z diskom za ugotavljanje prisotnosti

antibiotika v telesnih tekočinah kljub nekaterim omejitvam (npr. ali serum ali plazma) še

vedno uporabna. Metoda je prvič opisana pred več kot 60 leti in je še vedno zanimiva zaradi

nizkih stroškov, preproste izvedbe in detekcije predhodnega zdravljenja z antibiotiki 43.


52

6 Zaključek

Okužbe sečil so za okužbami zgornjih dihal druga najpomembnejša skupina infekcijskih

bolezni, kar predstavlja resen problem tako v svetu kot tudi pri nas. Zaradi razširjenosti tega

pojava se v praksi predpiše velik delež antibiotikov, s čimer se povečuje tveganje za

odpornost bakterij pri zdravljenju vnetja sečil.

Cilj mikrobiološke diagnostike preiskave urina je določiti povzročitelja okužbe in

občutljivost izolata za antibiotike ali njegovo odpornost proti antibiotikom v čim krajšem

času.

V raziskavi smo pokazali, da je mogoče standardnemu enakovreden antibiogram

enterobakterij izdelati v enem dnevu od sprejetja vzorca urina. Kriteriji za uspešno

validacijo metode HAT so bili izpolnjeni: ugotovili smo mnogo več kot potrebnih 90 %

skladnosti in mnogo manj kot 3 % velikih ali zelo velikih neskladnosti.

Smiselno bi bilo ponoviti preiskavo še na večjem vzorcu urinov, vendar tudi teoretični

argumenti govore o tem, da je HAT ekvivalenten SAT in ni le orientacijska metoda: celoten

postopek je enak, le inokulum je pripravljen na drugačen način, a je standardiziran na

gostoto McFarland 0,5 – to je bistvena prednost v primerjavi z direktnim antibiogramom iz

vzorca.

Le tveganje za mešano kulturo je večje, precej narejenih antibiogramov z mešano rastjo

večih izolatov je potrebno zavreči. Skupaj z dodatno vialo gojišča in delom (inokulacija vial,

spremljanje rasti v aparatu in preparati po Gramu) mešani antibiogrami povečajo stroške

preiskave, vendar je krajši čas do izvida pomembna prednost.

V katerih okoliščinah je dodatek HMSI metode k standardni urinokulturi upravičen, bi bilo

smiselno raziskati – gotovo pri bolnikih s hudo obliko okužb (pielonefritis, sepsa), zagotovo

ne pri preučevanju asimptomatske bakteriurije.

Preučili smo tudi strategijo uporabe viale z vankomicinom in barvanje po Gramu iz vial z

rastjo: to je bila teoretično najboljša strategija za HAT enterobakterij. Dodatek vankomicina

vialam je enostaven, trajnost reagenta dolga, tako da ne prinaša velikega dodatnega dela; se

pa na ta način ne da ugotavljati rasti PB.

Prikazani rezultati potrjujejo, da je HMSI metoda koristna – čas bo pokazal njeno uporabnost

v vsakodnevnem delu - zdi se, da je uporaben drobec znanja za upočasnitev razvoja

odpornosti bakterij z bolj usmerjenim antibiotičnim zdravljenjem.


53

7 Literatura

[1] The Review on Antimicrobial Resistance. Antimicrobial Resistance: Tackling a crisis

for the health and wealth of nations. The Review on Antimicrobial Resistance, chaired

by Jim O’Neill. December 2014. Dosegljivo s spletne strani 21. 10. 2015: http://amr-

review.org/Publications.

[2] Sundqvist M, Olafsson J, Matuschek. EUCAST breakpoints can be used to interpret

direct susceptibility testing of Enterobacteriaceae from urine samples.APMIS. 2015

Feb;123(2):152-5.

[3] Štrumbelj I. New broth – chromogenic Mueller Hinton agar procedure samples – next

– day – results of Enterobacteriaceae antimicrobial susceptibility testing Dosegljivo

18.05.2016 s spletne strani :

https://www.escmid.org/escmid_publications/escmid_elibrary/?q=%C5%A1trumbelj+

&id=2173&L=0&x=0&y=0

[4] Lindič J. Okužbe sečil. Krka Med Farm 2003; 24: Suppl.1: 11-62.Dosegljivo s spletne

strani:06.07.2016http://www.mf.unilj.si/dokumenti/957b02a34d28fa7653072943b75d

b265.pdf

[5] Tomažič J, Strle F. Infekcijske bolezni. 1. izd. Ljubljana: Združenje za infektologijo,

Slovensko zdravniško društvo ; 2014/2015.

[6] Kahlmeter G; ECO.SENS. An international survey of the antimicrobial susceptibility

of pathogens from uncomplicated urinary tract infections: the ECO.SENS Project. J

Antimicrob Chemother. 2003 Jan;51(1):69-76.

[7] European Confederation of Laboratory Medicine. European urinalysis guidelines.

Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2000;231:1-86.

[8] Kotnik V, s sod. Praktikum iz mikrobiologije in imunologije za študente medicine.

Ljubljana : medicinska fakulteta , Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Katedra za

mikrobiologijo in imunologijo ; 2011.

[9] Aspevall O, Hallander H, Gant V, Kouri T. European guidelines for urinalysis: a

collaborative document produced by European clinical microbiologists and clinical

chemists under ECLM in collaboration with ESCMID. Clin Microbiol Infect. 2001

Apr;7(4):173-8.

[10] Nicolle LE, Bradley S, Colgan R, Rice JC, Schaeffer A, Hooton TM; Infectious

Diseases Society of America; American Society of Nephrology; American Geriatric

Society. Infectious Diseases Society of America guidelines for the diagnosis and

treatment of asymptomatic bacteriuria in adults. Clin Infect Dis. 2005 Mar

1;40(5):643-54. Epub 2005 Feb 4. Erratum in: Clin Infect Dis. 2005 May

15;40(10):1556.

[11] Kubik JM, McCarter YS. Controversies in the Diagnosis of Urinary Tract

Infections.Clinical Microbiology Newsletter; 2012 December 1; Vol. 34, No. 23.

Dosegljivo 10.06.2016 s spletne strani : http://ac.els-cdn.com/S0196439912000505/1-

s2.0-S0196439912000505-main.pdf?_tid=cffa9532-643f-11e6-b302-

00000aab0f6b&acdnat=1471413771_f2f839d96054538ceed87fbff314cb40.

[12] Delovna skupina Centra za medicinsko mikrobiologijo NLZOH. Novosti pri

interpretaciji rezultatov preiskave vzorcev seča na bakterije in glive (urinokulture).

Dosegljivo 01.05.2016 s spletne strani: http://www.nlzoh.si/index.php/navodila-za-

uporabnike/center-za-medicinsko-mikrobiologijo/vsi-oddelki.

http://amr-review.org/Publications

http://amr-review.org/Publications

http://www.nlzoh.si/index.php/navodila-za-uporabnike/center-za-medicinsko-mikrobiologijo/vsi-oddelki

http://www.nlzoh.si/index.php/navodila-za-uporabnike/center-za-medicinsko-mikrobiologijo/vsi-oddelki


54

[13] Gubina M,Ihan A. Medicinska mikrobiologija z imunologjo in mikologijo. Ljubljana :

Medicinski razgledi;2002.

[14] Collins CH, s sod. Microbiological Methods. 7th Edition. Great Britain: Butterworth

Heinemann Ltd.; 1995.

[15] Štorman A, Čretnik ŽT. Prispevek mikrobiološkega laboratorija k racionalni uporabi

antibiotikov. In : Müller PM,Gubina M,ed Mikrobi in antibiotiki 2001. Mikrobiološki

simpozij z mednarodno udeležbo ; 2001 junij 22 – 23 ; Ljubljana : Sekcija za klinično

mikrobiologijo in bolnišnične okužbe.

[16] Štrumbelj I, Ribič H, Pirš M. Kratka pojasnila – uporaba evropskih smernic za

antibiogram – EUCAST 2015. Slovenska komisija za ugotavljanje občutljivosti za

protimikrobna zdravila (SKUOPZ). 2015 junij. Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani :

http://www.imi.si/strokovna-zdruzenja/skuopz.

[17] Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion

antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine

microbiology laboratories Clin Microbiol Infect 2014;20:O255–O26610.1111/1469-

0691.12373 Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani http://www.eucast.org.

[18] EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing -Version

5.0 (January 2015). Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani:

http://www.eucast.org.

[19] Greenwood D, Slack R, Peutherer J, Barer M. Medical microbiology: a guide to

microbial infections: pathogenesis, immunity, laboratory investigation and control.

Edinburgh : Churchill Livingstone / Elsevier; 2012.

[20] Zboromyrska Y, Rubio E, Alejo I, Vergara A, Mons A, Campo I, Bosch J, Marco F,

Vila J. Development of a new protocol for rapid bacterial identification and

susceptibility testing directly from urine samples. Clin Microbiol Infect. 2016

Jun;22(6):561.e1-6 Dosegljivo 05.08.2016 s spletne strani: http://www.eucast.org.

[21] Breteler KB, Rentenaar RJ, Verkaart G, Sturm PD. Performance and clinical

significance of direct antimicrobial susceptibility testing on urine from hospitalized

patients. Scand J Infect Dis. 2011 Oct;43(10):771-6

[22] Johnson JR, Tiu FS, Stamm WE. Direct antimicrobial susceptibility testing for acute

urinary tract infections in women. J Clin Microbiol. 1995 Sep;33(9):2316-23.

[23] Brönnestam R. Direct antimicrobial susceptibility testing in bacteriuria. APMIS. 1999

Apr;107(4):437-44.

[24] Olafsson J. Antimicrobial Susceptibility Testing Directly from Urine Samples - a

Comparison between Standardised and Direct Disk Diffusion Testing together with

Direct Species Identification using Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time

of Flight. Kalmar Växjö: Linnæus University; 2013.

[25] Hansen DS, Butt R, Christiansen T, Pedersen MS, Leerbeck L. Primary susceptibility

testing of urine specimen, why not reduce time to laboratory report and cost?. 22nd

ECCMID London 2012. Poster P1492.Dosegljivo 05.08.2016 s spletne strani

[26] Vickius N, Ekelund O. Direct antimicrobial susceptibility testing on urine samples – is

it achievable in Enterobacteriaceae other than Escherichia coli and Klebsiella

pneumoniae. 25th

ECCMID Cpenhagen 2015. Poster P0804.

[27] Stokkou S, Geginat G, Schlüter D, Tammer I. Direct disk diffusion test using European

Clinical Antimicrobial Susceptibility Testing breakpoints provides reliable results

http://www.imi.si/strokovna-zdruzenja/skuopz

http://www.eucast.org/




55

compared with the standard method. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2015

Mar;5(1):103-11.

[28] Daley P, Comerford A, Umali J, Penney C. The Performance of Direct Disk Diffusion

for Community Acquired Bacteremia due to Gram-Negative Bacilli and Its Impact on

Physician Treatment Decisions. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2016;2016:5493675.

[29] Coyle MB, McGonagle LA, Plorde JJ, Clausen CR, Schoenknecht FD. Rapid

antimicrobial susceptibility testing of isolates from blood cultures by direct inoculation

and early reading of disk diffusion tests. J Clin Microbiol. 1984 Sep;20(3):473-7.

[30] Coorevits L, Boelens J, Claeys G. Direct susceptibility testing by disk diffusion on

clinical samples: a rapid and accurate tool for antibiotic stewardship. Eur J Clin

Microbiol Infect Dis. 2015 Jun;34(6):1207-12.

[31] Lahanas S, Stathopoulos G, Chan RC, van Hal SJ. Evaluation of the Alfred 60/AST

device as a screening test for urinary tract infections. J Clin Microbiol.2013

Oct;51(10):3406-8.

[32] Spezzotti G. Technical notes on the correct configuration of the Alfred 60/AST device

for the detection of urinary tract infections. J Clin Microbiol. 2014 May;52(5):1805-6.

[33] Ilki A, Bekdemir P, Ulger N, Soyletir G. Rapid reporting of urine culture results:

impact of the uro-quick screening system. New Microbiol. 2010 Apr;33(2):147-53.

[34] Galar A, Yuste JR, Espinosa M, Guillén-Grima F, Hernáez-Crespo S, Leiva J. Clinical

and economic impact of rapid reporting of bacterial identification and antimicrobial

susceptibility results of the most frequently processed specimen types. Eur J Clin

Microbiol Infect Dis. 2012 Sep;31(9):2445-52

[35] Kahlmeter G. Defining antibiotic resistance-towards international harmonization. Ups

J Med Sci. 2014 May;119(2):78-86.

[36] Štrumbelj I, Golle A, Petrovec M, Pirš M, Poljak M, Seme K. Uvajanje testiranja

občutljivosti za protimikrobna zdravila po smernicah EUCAST v Sloveniji. Revija

ISIS: 2013 junij; 62-63.

[37] Smith P, Kronvall G. Estimating the precision of disc diffusion antibiotic susceptibility

data published by the European committee on antimicrobial susceptibility testing.

APMIS. 2014 Nov;122(11):1096-101.

[38] Kahlmeter G. Defining antibiotic resistance-towards international harmonization. Ups

J Med Sci. 2014 May;119(2):78-86

[39] Cardozo D, Kussen GMB, Cogo LL. Research on antimicrobial residues activity in

urine samples of hospitalized patients. J. Bras. Patol. Med. Lab., Rio de Janeiro , v. 50,

n. 6, p. 417-420,2004 Dec. Dosegljivo 18.07.2016 s spletne

strani:http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v50n6/1676-2444-jbpml-50-06-0417.pdf.

[40] Emary KR, Carter MJ, Pol S, Sona S, Kumar V, Day NP, Parry CM, Moore CE.

Urinary antibiotic activity in paediatric patients attending an outpatient department in

north-western Cambodia. Trop Med Int Health. 2015 Jan;20(1):24-8.

[41] Isenberg HD. Clinical microbiology procedures handbook. Vol 1. Washington:

American Soceity for Microbiology, 1992: 1.5.1 - 18

[42] Bengtsson S, Bjelkenbrant C, Kahlmeter G. Validation of EUCAST zone diameter

breakpoints against reference broth microdilution. Clin Microbiol Infect. 2014

Jun;20(6):O353-60.

[43] Driscoll AJ, Bhat N, Karron RA, O'Brien KL, Murdoch DR. Disk diffusion bioassays

for the detection of antibiotic activity in body fluids: applications for the Pneumonia


56

Etiology Research for Child Health project. Clin Infect Dis.2012 Apr;54 Suppl

2:S159-64.

[44] Khennavong M, Davone V, Vongsouvath M, Phetsouvanh R, Silisouk J, Rattana O,

Mayxay M, Castonguay-Vanier J, Moore CE, Strobel M, Newton PN. Urine antibiotic

activity in patients presenting to hospitals in Laos: implications for worsening

antibiotic resistance. Am J Trop Med Hyg. 2011 Aug;85(2):295-302.

[45] Maurer FP, Courvalin P, Böttger EC, Hombach M. Integrating forecast probabilities in

antibiograms: a way to guide antimicrobial prescriptions more reliably? J Clin

Microbiol. 2014 Oct;52(10):3674-84.

[46] Valsesia G, Roos M, Böttger EC, Hombach M. A statistical approach for

determination of disk diffusion-based cutoff values for systematic characterization of

wild-type and non-wild-type bacterial populations in antimicrobial susceptibility

testing. J Clin Microbiol. 2015 Jun;53(6):1812-22.

[47] Novais A, Cantón R, Coque TM, Moya A, Baquero F, Galán JC. Mutational events in

cefotaximase extended-spectrum beta-lactamases of the CTX-M-1 cluster involved in

ceftazidime resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2008 Jul;52(7):2377-82.


57

8 Priloge

8.1 Priloga 1. Šestdeset vzorcev, kjer je bila rast zaznana vsaj v navadnem bujonu - podrobnosti posameznih vzorcev: izolati iz vzorca, ali so bili v preparatu po Gramu v viali z navadnim ali vankomicinskim bujonom vidni le po Gramu negativni bacili, ali bi bil hitri antibiogram smiselen, ali bi bil ob uporabi različnih strategij hitri antibiogram izdelan ali ne.

Zap.št. vzorca Izolat 1 Izolat 2

GRAM IZ NBJ

(različne možnosti)

GRAM IZ VBJ


GRAM IZ NBJ (NB ali

drugo)

GRAM IZ VBJ (NB ali

drugo) RAST V

NBJ RAST V

VBJ

Ali je hitri antibiogram

smiselen

Ali bi bil hitri antibiogram

izdelan? Strategija A


izdelan? Strategija B


izdelan? Strategija C


izdelan? Strategija D

69 Enterobacter cloacae NB NB NB NB DA DA DA da da da da

24 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da




















58

Nadaljevanje priloge 1.


GRAM IZ NBJ


GRAM IZ VBJ


GRAM IZ NBJ (NB ali

drugo)

GRAM IZ VBJ (NB ali

drugo) RAST V

NBJ RAST V

VBJ


smiselen













34 Klebsiella pneumoniae NB NB NB NB DA DA DA da da da da




22 Proteus mirabilis NB NB NB NB DA DA DA da da da da

100 Proteus mirabilis NB NB NB NB DA DA DA da da da da

5 Klebsiella oxytoca NB NB NB NB DA DA DA da da da da

35 Citrobacter koseri PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da

62 Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da

78 Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da

74 Proteus mirabilis PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da

146 Enterobacter cloacae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE

12 Escherichia coli PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE

89 Escherichia coli PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE

88 Klebsiella pneumoniae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE

87 Escherichia coli Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da

7 Klebsiella oxytoca Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da

136 Proteus mirabilis Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da

90 Pseudomonas aeruginosa NB NB NB NB DA DA NE da da da da

63 Escherichia coli Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da

45 Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da


59

Nadaljevanje priloge 1.


GRAM IZ NBJ


GRAM IZ VBJ


GRAM IZ NBJ (NB ali

drugo)

GRAM IZ VBJ (NB ali

drugo) RAST V

NBJ RAST V

VBJ


smiselen









81 Ena od treh vrst v vzorcu. Ena od treh vrst v vzorcu. PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da

123 Pseudomonas aeruginosa PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da

16 Candida albicans KVAS KVAS drugo drugo DA DA NE da da NE NE

64 Candida albicans KVAS KVAS drugo drugo DA DA NE da da NE NE

19 Enterococcus faecalis PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE

38 Enterococcus faecalis PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE

67 Staphylococcus aureus PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE

53 Escherichia coli Enterobacter cloacae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA NE da da NE NE

48 Providencia stuartii Enterococcus faecalis PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA NE da da NE NE

82 Corynebacterium spp. Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

6 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus

epidermidis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

1 Ena od treh vrst v vzorcu. Ena od treh vrst v vzorcu. PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

9 Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

92 Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

141 Streptococcus agalactiae PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE

Legenda: NBJ - viala z navadnim bujonom, VBJ - viala z bujonom z vankomicinom, NB - po Gramu negativne bakterije, PB - po Gramu

pozitivne bakterije, nt - ni testirano


60

9 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Zver Mateja

Jugovska ulica 16, 9233 Odranci (Slovenija)

051 215 084

[email protected]

DELOVNE IZKUŠNJE

IZOBRAŽEVANJE IN

USPOSABLJANJE

KOMPETENCE

1.1. 2014–v teku Vodja VI

Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano, Maribor (Slovenija)

15.11. 1991–31.12. 2013 Vodja enote za oskrbo oddelka za mikrobiologijo

Zavod za zdravstveno varstvo Murska Sobota, Murska Sobota (Slovenija)

1.9. 1985–23.6. 1989 Kemijski tehnik

Srednja kemijska šola "Jože Knific - Iks", Ruše (Slovenija)

Materni jezik slovenščina

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

nemščina B2 B2 B2 B2 B2

angleščina B2 B2 B2 B2 B2

Stopnja: A1 in A2: Osnovni uporabnik - B1 in B2: Samostojni uporabnik - C1 in C2: Usposobljeni uporabnik

Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence - sposobnosti delovanja v timu in komunikacije s strankami

- sposobnost hitrega razumevanja bistva problema

- sposobnost komuniciranja s poslovnimi partnerji

Pridobljeno tekom zaposlitve.

Organizacijske/vodstvene

kompetence - sposobnost vodenja skupine

- pogajanja s ponudniki materialov

- sposobnost sodelovanja

- sposobnost planiranja potrebnih obdobnih pregledov opreme

http://europass.cedefop.europa.eu/sl/resources/european-language-levels-cefr


61

Strokovne kompetence - pravilna in varna uporaba sterilizatorjev in avtoklavov (pridobljeno znanje na seminarju za varno delo

s sterilizatorji)

- dobro poznavanje mikrobiološke analize tekočih vzorcev (udeležba na usposabljanju)

- poznavanje in uporaba orodja za elektronsko poslovanje (praktično usposabljanje na seminarju)

Digitalna

pismenost SAMOVREDNOTENJE

Obdelava informacij

Komunikacija Ustvarjanje

vsebin Varnost Reševanje problemov

Samostojni uporabnik Samostojni uporabnik Samostojni

uporabnik

Samostojni

uporabnik Samostojni uporabnik

Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu ... · Od vzorca do antibiograma...

Documents

Transcript of Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu ... · Od vzorca do antibiograma...