Praktikum Metabolisme Karbohidrat

r. Glikolisis pada Sel Ragi

Dasar

Dalam sel ragi, glukosa akan diubah menjadi etanor dan coz.Penambahan inhibitor menyebabkan sedikit glukosa yangdiubah menjadi etanol dan COz

Fermentation:A:raerobic organisms lack a respiratory chain,They must reoxidize NADH produced in Glycolysis through some other reaction.because NAD+ is needed for the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehyd.ogenasereaction.Usually NADH is reoxidized as pyruvate is converted to a more reducedcompound.The complete pathway, including Glycolysis and the reoxidation of NADH, iscalledfermentation.

E.g.., Lactate Dehydrogenase catalyzes reduction of the keto in pyruvate to ahydroxyl, yielding lactate, as NADH is oxidized to NAD+.Lactate, in addition to being an end-product of fermentation, serves as a mobileform of nutrient energy, & possibly as a signal molecule in mammalian organisms.Cell membranes contain carrier proteins that facilitate transpon of lactate.Skeletal muscles ferment glucose to lactate during exercise, when the exertion isbrief and intense.Lactate released to the blood may be taken up by other tissues, or by skeletalmuscle after exercise, and converted via Lactate oehydrogenase back to pyruvate,which may be oxidized in Krebs Cycle or (inrliver; convert'ea to back to glucose viagluconeogenesisLactate serves as a fuel source for cardiac muscle as well as brain neurons.Astrocltes, which surround and protect neurons in the brain, ferment glucose tolactate and release it.Lactate-taken up by adjacent neurons is converted to pyruvate that is oxidized viaKrebs Cycle.Some anaerobic organisms metabolize pyruvate to ethanol, which is excreted as awaste product.NADH is converted to NAD+ in the reaction catalyzedby Alcohol Dehydrogenase.Glycolysis, omitting H+:

glucose + 2 NAD++ 2 ADp + 2 pi )2pyruvate+2NADH+2ATp

Fermentation. from glucose to lactate:glucose + 2 ADP + 2 Pi ) 2 lactate + 2 ATp

Anaerobic catabolism of glucose yields only 2,,high energy,'bonds of ATp

l6

Tujuan

1. Mempelajari proses glikolisis di dalam sel ragi dengan

mengukur kadar glukosa yang tersisa dan kolom CO2 langdihasilkan.

2. Mempelajari pengaruh inhibitor terhadap proses glikolisis ser

ragi.

Bahan dan AIat

1. Tabung peragian \2. Suspensi ragi

3. Larutan glukosa 2%

4. Inhibitor proses glikolisis: larutan fluoride dan larutanarsenat

5. Spektrofotometer

Metode

l. Sediakan 4 tabung reaksi yang bersih dan kering.

Tabung I :kontrol positif

Tabung 2 :kontrol negatif

Tabung 3 :pengaruh inhibitor fluorida

Tabung 4 :pengaruh inhibitor arsenat

2. Pipetkan ke dalam tiap-tiap tabung larutan sebagai berikut:Larutan Kontrol (+) Kontrol (-) Fluorida (F) Arsenat (A)

Suspensi ragi 14 mL 13.5 mL 13.5 mLSuspensi ragi yang

telah dididihkan

14 mL

Larutan fluorida 0.5 mLLarutan arsenit

0.5 mLLarutan glukosa 2% 2mL 'l mL 2mL 2mL

t7

3" campurkan isi tabung dengan membolak-balikkannya 3-4 kalisehingga lengan tertutup tabung peragia, terisi penuh dengan

suspense ragi. Biarkan l5 menit dalam suhu kamar.

4. Setelah l5 menit, larukan pengukuran pada setiap tabung

tersebut:

a' Tinggi kolom co2 yang terbentuk pada lengan tertutup.

Tinggi kolom coz diukur dengan menggunakan penggaris.

b. Kadar glukosa. Kadar glukosa ditetapkan dengan meto*!Folin-Wu.

c. Pipetkan ke dalam tabung Folin-Wu:

Kadar glukosa ditentukan dengan :

Kadar glukosa : Au - Ab x 100 mG/dLAs-Ab

l8

Larutan BlangkoStandar Uji (duplo)

I 2 K(+) K(-) F Arl[ral Debas protein (mL) 2 2 2 2

Standar glukosa 0. t mg/dl 1mt-; 2 2

Akuades (mL) 2

Pereaksi CuzO (mL)

Campurkan dengan baik dengan npenangas air mendidih selama g

2 2 2 2 2 2 2

Ienggoyang-goyangkan tabung. Letakkan dalammenit, Kemudian dinginkan dalam es selama 3

menit.ASam rosromottbdat (mL) 2 2 2 2 2 ) 2

campurkan o.rg" uffia 3 menit untuk.#;k.ffio:Encerkan sampai 25 ml dengan akuades. Baca serapan (A) tiap tabung pada

spektrofotometer pada panjang gelomb ang 4i0 nm

2. Glikolisis pada Sel Darah MerahDasar

Dalam sel darah merah, glukosa akan diubah menjadi asam

laktat. Penambahan inhibitor menyebabkan sedikit glukosa yang

diubah menjadi laktat.

Tujuan

1. Mempelajari proses glikolisis di dalam sel darah merah

dengan mengukur kadar glukosa yang tersisa \2. Mempelajari pengaruh inhibitor terhadap proses glikolisi;al

darah merah.

Bahan dan Alat

1. Tabung reaksi

2. Sel darah merah 500/o

3. Dapar KRp (Krebs-Ringer phosphat e) pH7,4

4. Larutan glukosa 0,5 yo dalam dapar KRp5. Inhibitor proses glikolisis: larutan fluoride dan lanrtan

arsenat

Metode

l. sediakan 4 tabung reaksi yang bersih dan kering.

Tabungl :kontrol positif t

Tabung2 :kontrol negatif

Tabung3 :pengaruh inhibitor fluorida

Tabung4 :pengaruh inhibitor arsenat

2. Pipetkan ke dalam tiap-tiap tabung larutan sebagai berikut:Larutan Kontrol (+) Kontrol (-) Fluorida (F)

lJ mL

Arsenat (A)Sel darah merahl}%o 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mLDapar KRP pH 7.4 /mL 7mL 6.5 mL

Masukkan6.5 mL

l9

Larutan arsenit

Larutan glukosa 0.5%

3. Keram dalam inkubatorlpenangas air, 37" c selama tepat 30menit.

- ffi::*ro

.*it lakukan pemeriksaan kadar gtukosa

ry O.

sebelum melakukan penetapan kadar glukosa yangtersisa pada prosesglikolisis dalam sel darah merah, terlebih dahulu dilakukan pemisahanprotein dengan metoda Folin -Wu.

cara pembuatan filtrat darah bebas protein dengan metoda FolinWu

Bahan dan pereaksi:

1. Suspensi eritrosit

2. Akuades

3. Larutan natrium tungstat I 0%

4. Larutan asam sulfut (H2SO4) 2/3 N

Cara Kerja:

1. Pipetkan 7 mL akuades ke dalam iabu Erlenmeyer r25 mL yangkering.

2' Tambahkan I mL darah, goyang labu dengan perlahan-lahan agarterjadi hemolisis lengkap.

3' Tambahkan I mL larutan Na-tungstat r}oh, campur denganmenggoyang labu,

4. Tambahkan I mL larutan (Hzso+) 2/3 N secara tetes demi tetessambil terus menggoyang labu. Tidak boleh terbentuk gerembung-gelembung.

Ii^

=.'.g.FFr-f.-u

5. Tutup labu Erlenmeyer, goyangkan labu dan diamkan l0 menit.

Campuran akan berwarna coklat.

6. Saring melalui kertas saring yang kering dan filtrat jernih yang

keluar ditampung untuk pemeriksaan kadar glukosa.

7. Lakukan penetapan kadar glukosa dengan metoda Folin-Wu

Pengukuran kadar glukosa:

Bahan dan pereaksi: i

1. Filtrat bebas protein. \2. Larutan tembaga alkalis mengandung natrium karbonat, tembaga

sulfat dan asam tartrat.

3. Pereaksi asam fosfomolibdat mengandung asam molibdat dan

natrium tungstat.

A.Lanrtan standar glukosa 0.1 mg/ml.

Cara Kerja:

Pipetkan ke dalam tabung Folin-Wu:

Kadar glukosa ditentukan dengan :

Kadar glukosa: Au - Ab x 100 mG/dLAs-Ab

Larutan BlankoStandar glukosa 0.1 mg/dl Uji (duplo)

I 2 K(+) K(-) F A

iltrat bebas protein (mL 2 2 2 2

Standar glukosa (mL) 2 2

Akuades (mL) 2 t

Pereaksi CuzO (mL) 2 2 2 2 2 2 2

Campurkan dengan baik dengan menggoyang-goyangkan tabung. Letakkan dalampenangas airmendidih selama 8 menit. Kemudian dinginkan dalam es selama 3 menit.

\sam fosfomolibdat (mL 2 2 2 2 2 2 2

Campurkan dengan baik. Diamkan selama 3 menit untuk melarutkan CuzO.

Encerkan sampai 25 ml dengan akuades. Baca serapan (A) tiap tabung padaspektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm

2l