MicrobiologiaManual de Practicas De

8/10/2019 MicrobiologiaManual de Practicas De

1/123

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

manual de prcticas

laboratorioMICROBIOLOGA

GENERAL

Mara de los Angeles Aquiahuatl Ram

Mara de Lourdes Prez Chab

Casa abierta al tiempo UNIDAD IZTAPALAPA

HOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliome


2/123

Rector General

Dr. Luis Mie r y Tetn Casanueva

Secretario General

Dr. Ricardo Sols Rosales

UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa

Rector

Dr. Jos Lema Labadie

Secretario

Mtro . Luis Javier M elgo za Valdiv ia

Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

Director

Dr. J. Gerardo Saucedo Castaeda

Secretario Acadmico

M. en C. Arturo L. Preciado Lpez

Departamento de Biotecnologa

jefe del Departamento

Dr. J. Ma rian o Garca Garibay

ISBN 970-31-0141-0

Primera Edicin: 2004

Univers idad Autnom a Me tropol i tana, Unidad Iztapalapa

Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.

Del.

Iztapalapa, C.P. 09340 Mxico, D.F.

Impreso y hecho en Mxico



3/123HOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliome


5/123

. >< - ? . ' - ' " - '

w

delos Ange les AquiahuatlRamos

Mara

de

Lourdes PrezChabela

laboratorio

MICROBIOLOGA

GENERAL



6/123

Agradecemos al Director de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la

Salud Dr. Gerardo Saucedo Castaeda por todo el apoyo para la publica-

cin de este manual de prcticas del laboratorio de *: :: ^

GENERAL

Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo e n el procesado de las fotografas.

Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodrguez por su ayuda en el

diseo de las figuras.

A toda la gente que revis este manual, que con sus aportaciones

enri-

quecieron este trabajo.



7/123

ndice

7

9

12

14

15

15

16

20

22

22

23

24

28

30

31

31

32

36

38

38

39

40

46

48

49

49

49

54

56

57

57

PRESENTACIN

RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE

PRCTICA# 1

Preparacinyesterilizacindematerialesymediosdecultivo

Preparacin del material de vid rioymedios de cultivo

Esterilizacindem aterialesymedios de cultivo

Preparacin de las cajas de Petriytubos con medios de cultivo

Prueba de esterilidad de materiales

PRCTICA

# 2

Preparacin, fijacin

y

coloracin simple

de

frotis

Preparacin de frotis

Fijacin del frotis

Tincin simple

Observacin

al

microscopio

PRCTICA# 3

Tincin diferencialdeGramytincion es selectivas

Tincin diferencial de Gram

Tincin se lectiva de endosporas

Tincin negativa para observacin de cpsulas

Observaciones

al

microscopio

PRCTICA

# 4

Mtodos de cultivo

y

aislamiento de bacterias

Tcnica de estra cruzada

Siembra en tubos con caldoyagar nutritivo

Siembra de cajas de Petri con medios d iferencialesyselectivos

Condiciones de incubacin

PRCTICA# 5

Mtodos de cultivo

y

descripcin morfolgica de hongos

Siembra de hongos

Descripcin macroscpica de levadurasymohos

Descripcin microscpica de levaduras

Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva

PRCTICA

# 6

Pruebas de diferenciacin bioqumica

Tcnica de Inoculacin en cajas de Petri

Tcnicas de Inoculacin en tubos

Evaluacin de actividades metablicas

o

o

o

n

t

A

a

o

o

manual de prcticas del ? > l ~

'T ; rfX{ ,f *4

#%

*}

': '-,

;': ; \ f * , *' J-'


8/123

(O

a

64

66

67

68

74

76

77

82

84

84

90

92

92

97

101

PRCTICA # 7

Mtodos de cuantificacin de microorganismos

Tcnica turbidimtr ica

Tcnica de cuenta directa en cmara de N eubaue r

Tcnica de di luci n y siembra en placa

PRCTICA # 8

Efecto del pH y la temp eratura e n el crecimiento microbiano

Efecto de la Temperatura

Efecto del pH

PRCTICA # 9

Efecto de la actividad de ag ua en el crecimiento microbiano

Efecto de la presin osm tica y act iv idad d e agua (aw) en hon gos y bacterias

Efecto de la desecacin

PRCTICA # 10

Curva de crecimiento bacteriano

Inoculacin e incubacin del cult ivo

Tratamiento de las muestras

BIBLIOGRAFA GENERAL

Anexo 1

PREPARACIN DE SOLUCIONES Y COLORANTES

105

Anexo 2

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

115

Anexo 3

ATLAS DE PRUEBAS BIOQUMICAS



9/123


10/123

Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la

UAM en el curso de M icrobiologa General, est elaborado de acuerdo a la infraestructu-

ra de los laboratorios y a la programacin trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/

semana.

Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuat

Dra. Ma. de Lourdes Prez Chabela

i

a

o



11/123

RE COME NDACIONE S P ARA ELESTUDIA *

Reglas de laboratorio

1.

Durante las sesiones, siempre deber usar una bata

de

laboratorio bien a botonada , que deber quitarse

antes de abandonar el laboratorio.

2. No deber sacar del laboratorio ningn equipo , mediosocultivos microbianos.

3. Evitarlaacumulacin sobrelamesa de trabajo d e objetos no relacionados conlaprcticadeaboratorio.

Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.

4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimentoobebida dentro del laboratorio.

5. Se prohibe fum ar, aplicarse cosmticos

o

tocarse la cara con las m anos

o

algn otro objeto. Se deber lavar

meticulosam ente las manos con jab n y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves

periodos.

6. Por seguridadnodebe i pipetear oralmen te ningn tipodecultivos m icrobianos, esta actividad deber

realizarse con pipetas accionadasdeforma mecnicaoautomtica, tratandodeevitarlaformacinde

aerosoles.

7. No se adm itirn visitas personales que distraigan la atenc inypongan en riesgo la seguridad e n el trabajo

que se realiza.

Procedimientos de laboratorio

1.

Antesydespus de cada sesin pictica los alumnos debern limpiar las mesas d e trabajo coneldesinfec-

tante que seleproporcionar para es te fin .

2. Cuando se utiliceelmec hero, este deber colocarse alejado del microscopioyotros equipos as comode

sus cuadernos

o

prendas de vestir.

3. Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-

nados sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, q ue les indicar

el profesor.

4. Siempre deber dejar pe rfectame nte limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas,

autoclave, potencimetros, etc.)

y

reportar al maestro cualquier irregularidad en

el

funcionamiento.

5. En casodeproducirseunncendioouna herida personal,elalumn o deber notificarlodeinmediatoal

profesor. Enelcaso d e derrame de cultivosorotura de recipientes con cultivos activos, debe r conservarla

calmayadem s de informar al profesor, seguir inm ediatam ente el proced imiento:

a. Colocar toallas de papel sobreelmaterial derrama do para evitar su dispersin

b. Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas

manual de prcticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**

a

o



12/123

c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la

eliminacin de materiales contaminados.

M ateria les indispensables en cada sesin de laboratorio

1.

Bata de laboratorio limpia y con botones

2. El protocolo de la prctica y bitcora de laboratorio

3. Un peda zo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeas .



13/123

o

o

o

Preparacin y esterilizacin de materiales

y medios de cultivo



15/123

Objetivos introduccin

Qu e el alum no conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam -

generales de las tcnicas de estril - bios de condiciones am bientale s y en la me dida en que se han podido

zacin de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en u na gran diversidad de

dios de cultivo de uso comn en M i- hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo

fsi-

crobiologa. Observar el efecto de co y qumico . o

trol de la contaminacin microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y este-

en el laborato rio. rilizacin para limitar su presencia o eliminarlos . La esterilizacin es

un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo y que

asegura la ausencia absoluta de cualquier form a viviente, mientras

que la desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas

vegetativas de los microorganismos.

La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de

mayor utilizacin en Microbiologa. El calor seco desnaturaliza las

enzimas y destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejem -

plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno

a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principal-

mente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de

material d e vidrio y quirrgico.

Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cul-

tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el ms

recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a

presin para alcanzar temp eraturas de 121 C. El ma terial se d eja a

esta temperatura d urante 15 minutos para asegurarse de la destruc-

cin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resis-

tentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes m ateriales sensibles al calor como

las soluciones de vitaminas, aminocidos, etc. se esterilizan por

filtracin en mem branas estriles de 0,2 m ieras de dim etro y para

el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases

como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies

generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos

qumicos en forma l quida como: los fenoles, compuestos

cuaternarios de am onio (alquildimetil be ncilamonio), form aldehdo,

alcoholes, halgenos y detergen tes.

Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas d e uso,

los sistemas de filtracin son muy eficientes y rpidos para la este-

rilizacin pero slo se aplican en peque os vo lme nes. Los fenoles

y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la

desinfeccin de superficies pero son muy corrosivos. Los

detergentes y los alcoholes tien en actividad limitada contra espo-

ras bacterianas y algunos virus por lo que slo son desinfectantes.

1 3

m a n u a l d e p r c t i c a s d e l - * . . ' . ; . , - . * . , : ; . . . ? . ::* , < ; > < * . , - r - r . r - - "*

' \



16/123

(O

a 1 potencimetro

1 horno de calor seco

Materiales

7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapn de baquelita

3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapn de baquelita

9 cajas de Petri de vidr io

3 pipetas de 1 o 2 mL

3 pipetas de 10 mL

1 pipeta Pasteur

3 matraces Erlenmeyer de 250 mL

1 parrilla de calentamiento con agitacin

1 autoclave

1 mechero Fisher

1 ncubadora a 35C

1 hisopo estril, algodn y gasa

papel m anila o estraza para envolver

Caldo nutritivo (Anexo 2.1)

Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)

Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)

Medio mnimo de sales (Anexo 2.3 )

Soluciones am ortiguadoras pH 4 y 7

Procedimiento

El profesor explicar los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la

desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los med ios de cu ltivo y m ateriales necesarios

para el trabajo cotidiano con m icroorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que e l estudian-

te aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas.

Preparacin de l m aterial de vidrio y me dios de cultivo

1. Lavar perfectame nte las cajas de Petri y pipetas con escobilln y detergen te. Enjuagar con abundante agua

corriente.

2.

Escurrir el exceso de agua y enjuagar e l material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-

res.Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn

otro medio.

3. Una vez seco el ma terial, se proceder a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los

tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con h olgura, sobre los

que finalmente se les colocar un capuchn de papel.

4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar e l pH a 6.5-7.0 en un

potencimetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCI0.1M o solucin de NaOH

0.1M, en caso de q ue el pH sea ms alcalino o cido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo

con tapn de baquelita que debern cerrar sin llegar al tope.

1 4



17/123

I

a

o

o

5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN ), calentarlamezcla en una parrilla con agitacin constante hasta

ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte)yvaciar enseguida5mL de me dio en tres tubos

con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamentelapipeta para evitar que se s olidifiqueelagar. El resto se

esteriliza enelautoclave.

6. Preparar 120 mL de m edio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer d e 250 mL, ajustar

el pH del medio

a

5.0-5.6. Colocar un magn eto d e agitacin

y

calentar hasta ebullicin durante 1 minuto;

cuidando de que no se proyecteoderram e. Posteriormente vaciar7mL de m edio e n tres tubos q uese

taparn con tapn de algodnygasa. El resto se es teriliza en el au toclave.

7. Preparar 120 mL de med io de cultivo Mnimo de sales (M M ) en un matraz Erlenmeyer de 250 m L

Esterilizacin de materiales

y

m edios de cultivo

1. Las cajas de Petriypipetas envueltas se colocaran en hornoa150 C durante2horas. D espus de sacarlas,

dejarlas enfriaryabrir los paquetes nicame nte en rea asptica.

2.

Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo

a

las siguientes instrucciones:

a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario aadir agua

destilada.

b. C onectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia-

les en la canasta del autoclaveycolocarla den tro.

c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperaraque salga el vapor

de a gua por el orificio d e purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad.

d .D ejar qu e e l equ ipo se ca liente h asta alcanzar los 121 Co15 Ibs de presin revisando continua men tela

escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber bajarseelnivel de ca lentamiento mo-

viendo la perilla de control al nivel medioobajo.

e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos

f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de "0" . Quitar la vlvula d e se guridad y con la ayuda

de guantes de asbesto

o

una jerga hmeda abrir cuidadosamente

la

puerta, de adelan te hacia atrs para

evitar que madu ras por la salida del vapor.

Preparacin de las cajas de Petri

y

tubos con m edios de cultivo

1.

Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma qu e el

medio se solidifiqueauna distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2.

Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfrenauna temperatura

aproximada de 4 0-50 C, que coincide con la posibilidad de sostener el m atraz en la palma d e la ma no sin

sentir un calor excesivo.

3. Cerca del mech ero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con M M . Los medios de cultivo se vacan en las

cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona asptica cerca del mechero o en campan a de flujo laminar.

4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos)

y

posteriormente envolver las cajas cuidado-

samente con papel estrazaoacomodarlas en forma invertida e n bolsa de plstico limpias.

5. Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas.

115

manual de prcticas del LABORATORIO PE ICIlCIBiOLCIGJI SEIAL



18/123

Prueba de esterilidad de materiales

1.

Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una e stufa de incubacin

ajustada a 30 C durante 24-48 horas.

2.

Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contam inantes , por la aparicin d e turbidez ,

nata superficial y/o depsito de material en el fondo d e los tubos con medio lquido; as como la formacin

de colonias microbianas e n la superficie d e medios slidos.

3. Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de Petri de cada m edio du rante 1 m inuto

en el laboratorio o zonas accesorias al m ismo y se etiquetar com o"al aire".

(0

CQ

0

4. La otra caja de cada med io de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar "en

rea asptica".

5. La tercer caja se conservar sin abrir y se etiqu eta como "control".

Resultados

A. Hacer la descripcin morfolg ica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes m edios de cultivo

(AN, PDA y M M ) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control.

B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento

regular y (+++) crecimiento abundante.

C. Discuta los resultados y dete rmine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adec uada , as como el

manejo de los materiales.



19/123

Cuadro

1

Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.

M E D I O

DE CULTIVO

AGAR

NUTRIT IVO

M N I M O

DE SALES

PAPA DEXTROSA

AGAR

Abierta a l aire

Abierta en rea

asptica Control

a

t

A

a

1)

Cuestionario

Cules son los mtodos

de

esterilizacin ms utilizados

en

Microbiologa? En qu e tipo

de

materiales

se

aplica cada uno?

2) Explique cules son las diferencias entre los procesos

de

esterilizacin, desinfeccin

y

asep sia. Cmo

se

relacionan estos procedimientos conlapasteurizacin?

17

manual de prcticas del



21/123

o

o

Preparacin, f i jacin y

coloracin simple de frot is



23/123

Objetivos

Que

el

alumno aprend a las tcnicas

de preparacindefrotis,defijacin

y coloracin ms utilizadasen eles-

tud io microscpico

de

cultivos

bacterianos, obtenidosdemedios

slidosyquidos. Que identifique las

principales formas bacterianasy la

importancia de las tinciones simples

en

la

caracterizacin morfolgica

de

estos microorganismos.

Introduccin

Debidoal pequeo tamaode lamayo rade losm icroorganismos,se

requierede unmicroscopio ptico,yaseadecampo claroo decampo

oscuro para hacer

la

descripcin morfolg ica de stos. El microscopio

de

uso ms comn es

el

de campo claro, en

el

qu e

la

observacin de clulas

vivas es limitada d ebidoaque las clulas son incolorasypermitenelpaso

de una gran cantidaddeuz .

La observacin de frotis teidos es ms recom enda ble. El frotis se p repara

haciendo una extensin de los microorganismos sobre una supe rfi-

cie transparente,

en la

cul

se

fijan

y

tien

los

m icroorganismos.

De acuerdo al n mero de soluciones colorantesy alos objetivos de

estudio se puede n realizar diferentes tipos de tinciones como son:

simple, diferencial, negativayselectiva.

Los frotis de cultivos lquidos se deb ern fijar con alcohol para ev itar resi-

duos del me dio, que al quemarse darn interferencias en las obser-

vacionesylos de colonias de medios slidos se fijan gene ralmen te

con calor. Despus de

la

fijacin, los frotis son teidos con diferen-

tes colorantes sintticos derivados de anilina.

Los colorantes m s utilizados son sales formad as por ione s coloridos car-

gados conocidos como cromforos. Por ejemplo:

Cloruro

de

Azul

de

metileno Azuldemetileno*+

(Cromoforo)

ci-

Si

el

cromoforo es un ion positivo

el

colorante es de tipo bsico, pero si

a

carga es nega tiva ser de tipo cido . La mayora de las bacterias son

teidas por colorantes bsicos, que permean

la

pared celular

y se

adhieren por enlaces inicos dbilesamolculas con cargas neg a-

tivas de

la

clula bacte riana. La tincin

de

as bacterias con a zul

de

metileno,es unejemplodetincin simple que facilitalaobserva-

cin

de

forma, tamao

y

arreglo

de

las clulas.

o

o

o

I

a

o

o

2 1




24/123

Materiales

1 Probetade 100 mL

1 Vasod eprecipitadosde 100 mL

1 mechero

1asa desiembra

5 Portaobjetos

Picetaco nagua destilada

Microscopio compuestodecampo claro

Azuld emetileno alcalino (Anexo1.2)

Alcohol etlicoal70% (Anexo1.7)

Fenolal 2%(Anexo1.9)

(0

C Q Aceited einmersin

o

Procedimiento

El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de:Escherichla col, S treptococ cussp.,

Staphylococcussp.,

Badllus

subtilis, Klebsi'ellasp.y

Pseudom onas fluorescens.

Elestudiante preparar frotisde

cada cepa obtenidadecultivo slidoyotrosdecultivo lquido,loscuales fijaryteircon azuld emetileno.

El profesor explicarlosprincipiosd emanejodelmicroscopioy la formad eajustar lailuminacin.

Preparacin de frotis

1 . Lavar perfectamente losportaobjetos, secarlosco npapelyetiquetarlos (Figura1).

2.

Prenderelmecheroyesterilizarel asa en laflamad elmechero hastaque sepongaa lrojo vivo.

3. Dejar enfriar

el asa

para evitar

que al

tomar

la

muestra

los

microorganismos sean destruidos. Despus

acercara lmecheroe ltubod ecultivo, quitarlee ltapnyflamear rpidamente labocadelmismo. Introducir

el

asa en el

tubo

de

cultivo

y

tomar cuidadosamente

la

muestra.

4. Para

el

caso

de

cultivos lquidos, colocar

la

muestra

en el

centro

del

portaobjetos, extenderla suavemente

en

un rea circularde 2 cm. dedimetro aproximadamenteyesterilizar nuevamenteelasa. Dejar secare lfrotis

al aireyrepetir losprocedimientos3 y 4 por 2-3vecesms.

5. Si elcultivoes de medio slido, previamente secolocaren elcentrodelportaobjetos unagotadeagua

destilada

en la que se

mezcla

u na

pequea muestra

del

cultivo

que se

toma siguiendo

las

indicaciones

del

paso3 .Extenderla suavementey dejar secara laire.

Fijacin del frotis

1 . Fijar los frotis

de

cultivos lquidos con dos gotas

de

metanol

o

etanol absoluto

y

dejar secar

al

aire (hacer esto

en zonas alejadasa lmechero).

2 2



25/123

2. Los frotisdecultivos slidos, com pletam ente secos se fijarn con calor. Para estosepasaielfrotis rpida-

mente 2-3 vecesen elinteriorde laparte ama rillade laflama del m echero.

3. Palparlaparte inferior del portaobjetos coneldorso delamano izquierda para enfriarycomprobar queno

hubo sobrecalentamiento.

Tincin simple

1. Cubrirelfrotis con2gotasdeazuldemetileno durante 30 segundosa1 minuto.

2. Eliminarelexcesodecolorante con lavado suavealagua corrienteoconlaayudade lapiceta con agua

destilada.

3. Dejar sec aral aire

Marcarelrea por debajo del portaobjeto

CULTIVO SLIDO CULTIVO LIQUIDO

|

i

a

o

o

Coloque1 o 2gotasdeagua

Colocar

1 o 2

asadas

de

med io

de

cultivo con asa estril

Con asa estril tomar una

muestra

de la

co lonia

y

mezclarla conelagua

Distribuir enlazona marcada

Dejar secaralaire

Dejar secaralaire. R epetirlos

procedimientos anteriores dos veces

Pasar rpidamente sobrela

flama del mechero

Fijar con2gotasdealcohol,y

dejar secaralaire

Figura 1 . Preparacin

y

ijacin de frotis bacterianos a pa rtir de cultivos slidos y lquidos




26/123

Observacin al microscopio

1. Limpiar cuid ado sam ente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda .

2.

Ajustar el haz de luz en el centro del camp o de observacin, siguiend o las indicacion es del profesor.

3. Colocar los portaob jetos en la platina y em pezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-

me nte pasar al de 40X. Para la observacin con el objetivo d e 100X, colocar previam ente una p equ ea gota

de aceite de inmersin sobre la preparacin.

4. Al finalizar las obse rvac iones , limpiar cuidad osam ente el objetivo con papel sed a para eliminar el ex ce so d e

aceite y evitar incrustaciones que daan esto s sistemas.

Resultados

A. Reportar las obs erv acion es de forma, agrupacin y tama o relativo de cada uno de los microorganismos e n

el cuadro de resultados.

B. Comparar su s observ acio nes con las reportadas en la literatura.

2 4



27/123

Cuadro2

Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos

Cultivo: Lquido

Aumento total:

Forma: (cocos, bacilos, etc.)

Agolpamiento de las clulas

(solos, pares, cadenas , etc.)

Tamao:

Cultivo: Slido

Aumento total:

Forma: (cocos, bacilos, etc.

Agrupamiento de las clulas

(solos, pares, cadenas, etc.)

Tamao:

Escherichla col l

Streptoco ccus sp.

0 )

(0

(0

a

Cuestionario

1. Investigue cules son las estruauras celularesomolculas responsables de la tinci n simple realizada. De

ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.

2.

Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcoholyno con calor? Por qu se deben

poner varias veces muestras d el cultivo lquido

y

slo una muestra de cu ltivos slidos al preparar los frotis?

25




28/123

3. Cules son las principales precauciones de m anejo de l microscopio y por qu se deb e utilizar el aceite de

inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?

4. Cules son las desven tajas o limitaciones de la tincin simple?

a

o

5. Cules son las fuen tes de error ms frecuen tes en la preparacin de frotis?

6. Bibliografa consultada

Referencias bibliogrficas

Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.

johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3

a

- Ed. Cummings Publishing

Company, Inc. USA.

Practical Han dbo oko f Microbiology. William MO 'Leary , Cornell Medical College, Ne w York, New York, USA

CRC Press, 1989.

Holt, J. G., N.R. Krieg.P.H.A.Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.



29/123

z

-

s

, - -

Tincin diferencial de Gram y

tinciones selectivas



31/123

Objetivos

Queelestudiante clasifique algunas

especies bacterianas en Gram positi-

vas

o

Gram negativas d e acu erdo

a la

tincin de Gram. Que observe estruc-

turas bacterianas especiales, como las

endosporasycpsulas con tinciones

selectivas. Que comprendalaimpor-

tancia que tien en estas tinciones para

la caracterizacineidentificacinde

las bacterias.

introduccin

La tincin propuesta porelmd ico dan s C hristian Gramen1884, es una

de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifi-

caloscultivos bacterianosdemenosde 24horasenGram positivasy

Gram negativas. El mtodo se fundam enta en

el

hecho de que

el

coloran-

te primario (cristal violeta) tie

por

igual

a

todas

las

bacterias, pero

la

combinacin conelcolorante es ms pe rman ente en los gram positivos.

Para es tablecerladiferenciacinenestos dos grupos, se ap lica un disol-

vente del colorante primario que no tiene efecto sobre

el

grupo

de

microorganismos queloretienen firmem ente, peroloeliminade

aquellos quenoson capacesderetenerlo, quedandopor lotanto

comp letamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy di-

fcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con o tro colorante

llamado secundario, como

la

safranina . Este colorante

no

mod ifica

el color de los microorganismos que haban retenido el color prima-

rio,

pero tie

a

los microorganismos decolorados.

Estas diferencias d e tincin de las bacterias se explican por cambios enla

composicin qumica y estructura de las paredes ce lulares, que faci-

litan

la

retencin

o

eliminacin de l colorante primario despus del

proceso de decoloracin.

Otras tinciones que p ermiten obtener mayor informacin sonlanegativa

ylaselectiva.La tincin negativa facilitalasobservacionesde la

morfologa

y

tamao

de

las bacterias sin alterac in por e fecto

del

calor as com odeestructuras especiales, com olacpsula de algu-

nas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix

es

una estructura externa

a la

clula, formada

de

polisacridos

o

polipptidos, que confiere proteccinalas bacterias contraladese-

cacin

y la

fagocitosis.

La extensin sobre un portaobjetos en form a de c apa fina de una mezcla

de las bacterias con tinta china

o

nigrosina, pe rmite observar en

el

microscopio estructuras especiales com o son las cpsulas, que apa -

recen como una zona clara que rodea

la

clula bacteriana

en un

fondo obscuro.

Las tinciones selectivas perm iten observar estructuras especializadas como

las endosporasdeBacillusyClostridium ,bacteriasen lasquesu

presencia, forma

y

localizacin son importantes criterios

de

clasifi-

cacin taxonm ica.

Adems, debido

a la

resistencia a l calor de las endosporas

y a

que algunas

especies son microorganismos patgenosdegran toxicidad,su de-

teccin en m icrobiologa alimen taria y mdica adqu iere gran inters.


r iom:



32/123

Materiales

1 Probetade 100 mL

1 Vaso

d e

precipitados

de 100 mL

1 Parrillad ecalentamiento

1 Mechero

5 Portaobjetos

1 Piceta

con

agua destilada

Cristal violeta (Anexo1.3)

Safranina (Anexo

1.8)

Lugol (Anexo1.5)

Solucindealcohol-acetona (Anexo1.6)

e n

Verde

de

malaquita (Anexo

1.4)

Tinta china

Fenol 2%(Anexo1.9)

Aceitedeinmersin

Microscopio compuestodecampo claro

Procedimiento

El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichia

coll,

Streptococcussp.,

Staphylococcus

sp.,

Badllus subtills

y

Klebsiella

sp.

El estudiante preparar frotisd ecultivo slidoy d ecultivo lquidod ecada microorganismoyaplicar latincin

de Gram.

Tambin realizar la tincin seieaiva deendosporasen unfrotis fijado alcalor de

Badllus subtilis

y latincin

negativaencultivosd e

K /ebsfef/a sp.

Tincin diferencial de Gram

a) Cubrir

el

frotis

con 2

gotas

de

cristal violeta durante

30

segundos

a 1

minuto

b) Lavar cuidadosamente elfrotiscon aguad e lallaveo destilada para eliminar elexcesod ecolorante

c) Sacudirunpocoy sindejar secar cubrirelfrotiscon 2gotasd elugolpor 30segundos.

d) Lavar cuidadosamente elfrotiscon agua.

e) Inclinar elportaobjetosyaplicar gotaagotael decolorante dejando queescurra hastaque nofluyams

tintura.

f) Inmediatamente lavarconagua.

g) Aplicar

2

gotas

d e

safranina durante

30

segundos.

h) Lavar nuevamente conagua, eliminar cuidadosamente elexcesodeaguacon unatoalladepapelydejar

secar

a l

aire.



33/123

Tincin selectiva de endosporas

a) Colocar un pequ eo trozodepape l filtro sobreelfrotisde

Bacillus

subtilk(Figura2).

b) Agregar verdedemalaquita sobreelpapel filtro de tal man era q ue cubra todalapreparacin.

c) Colocarelportaobjetos sobre un vasodeprecipitados con ag ua en ebullicin.

d) Dejar durante

5

minutos evitando q ue se seque e l colorante (agregar un poco ms s es necesario)

y

eliminar

el colorante con agu a destilada.

e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.

f) Lavar nue vam enteydejar secaralaire.

t

a

"

a)

b)

e)

Figura 2 .

Tincin selectiva de endosporas bacterianas

Tincin negativa para obs ervacin

de

cpsulas

a) Colocar una peq ue a gotadetinta chinaen elextremode unportaobjetos; colocar junto una gotadel

cultivo lquidode

K lebsiella

sp. (Figura 3).Sise tratadeun cultivo slido, hacer una suspensin del m icro-

organismoenuna gota de a gua destiladaymezclar cuidadosame nte con la tinta china.

b) Distribuir

la

mezcla

a lo

ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular

en

ngulo

de

45 sobrelamuestra.


I

3



34/123

10

a

o

c) Desplazar poco

a

poco el segundo portaobjetos a lo largo del pr imero para hacer una capa f ina de la mezcla.

d) Dejar secar al aire .

a)

d)

Figura 3.Tcnica de tinc in negativa

Observaciones al microscopio

1.

Limpiar cuidad osam ente los objet ivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2. Colocar los portaob jetos en la platina y em peza r a localizar la prepa racin con el ob jetivo de 10X, posterior-

mente pasar al de 40X. Para observar con el objet ivo de 100X colocar previamente una pequea gota de

aceite de inmersin sobre la preparacin.

3. Al f inal izar las observaciones, l impiar cuidado same nte el objet ivo con pape l seda para el imina r el exceso

de ace ite y evitar incrustaciones qu e da an a estos sistemas.

Resultados

A. Reportar las observaciones de form a, agrup acin, color y tama o relat ivo tal com o se indica en el Cuadro 3

de resultados. Hacer los dibujos de la mo rfologa d e cada uno de los microorganismos y colorearlos.

B. Comp arar las obse rvacione s realizadas con las reportadas en la l iteratura .

3 2



35/123

Cuadro3

Descripcin microscpica

de

cultivos baaerianos

Descripcin del cultivo:(lquido

o slido, edad del cultivo, etc.)

Aumento total:

o

I

o

cu

t

ti

a

o

Forma:cocos, bacilos

Agolpamiento de las clulas

Tamao:

Reaccin de Gram

TINCIN DE ENDOSPORAS

Descripcin del cultivo:(lquido


Aumento total:

Badllus subtills

Streptoco ccus sp

Forma:cocos, bacilos

Agrupamiento de las clulas

Tamao:

TIN CI N DE CPSULA

Descripcin del cultivo:

(lquido


Aumento total:

Klebsiellasp.

Streptoco ccus sp

Cuestionario

1. Expliqueenforma completalateora que explicalatincindeGram. Investigue otros dos ejem plosde

tincin diferencial.

3 3




36/123

2. Cules son las fuen tes de error ms comu nes en la tincin de Gram?

3. Explique que reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la mism a impor

tancia que para las bacterias? Por qu?

4. Explique el fun dam en to de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Que dificul

tades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?

5. Explique el fundam ento de la tincin negativa realizada en la prctica.Qu tipo de informacin se obtiene?

Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.



Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3

a

- Ed. Cummings Publishin

Company, Inc. EEUUA.

Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana

Mxico.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs

Pouch Downes and Keith Ito, 2001.

Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York

USA. CRC Press, 1989.

j

Holt, J. G., N.R. Krieg.P.H.A.Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinativ

Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.



37/123

^

w'V

^

Mtodos de cultivo y

aislamiento de bacterias



39/123

Objetivos Introduccin

Queelalumn o conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en me diosdecultivodelaboratorio

tes tcnicasdeaislamientoenme - para caracterizar su crecim iento, hacer su identificacinydeterminar sus

dios de cultivo slido paralaobten- actividades metablicas. Un med io de cultivo es una solucin acuosa de

cin

de

cultivos puros

de

bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los eleme ntos indispensables

Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer,

cultivo de uso general, diferenciales

y selectivos paraelcultivodedife - Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos

rentes espec ies bacte rianas. (caldos)o solidificados con agar para su propagacin y/o conserva-

cin,as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es m-

portante recordar quelainoculacin de los microorganismos en los

medios de cultivo, siempre debe lan realizarse en zo na asptica (cerca

del mechero o en campana d e flujo laminar), condiciones que limitan

la presencia de microorganismos indeseablesocontaminantes.

Las tcnicas de aislamiento, perm iten la obtencin de microorganismosa

partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las

que hay una gran diversidad microbiana, as como para comprobar

la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros estn forma-

dos por un solo tipo de microorganismo;yson indispensables para

conocer las caractersticas morfolgicas, propiedadesde tincin,

actividad bioqumica, patogeniddad, sensibilidadaantibiticose

identificacin de las especies microbianas.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodosde

dilucin, en medios slidos por estra en placaoen medios lqui-

dos.

En el primer caso se considera que cada clula bacteriana que

se separa dai origenauna poblacin q ue formar una colonia ca-

racterstica, visible

a

simple vista.

La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin , es que no es prctica

para el aislamientoapartir de mezclas dond e e l microorganismo de

inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se

obtendrn las bacterias dom inantes.

Para favorecer e l aislamiento de cultivos de baja den sidad, se aplican m -

todos de cultivo especiales, en los que se u tilizan medios que con-

tiene n nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de

sales y/o condiciones de pH, luzo temperatura para favorecerel

crecimiento del m icroorganismo de inters

y

se conocen como se-

lectivos

o

de enriquecimiento.

En ocasiones se p uede n agregar

a

los me dios d e cultivo otros com ponen-

tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe-

cies bacterianas diferentes porlaformaenque metabolizanlos

sustratos que se m anifiesta por cambios en la aparienciaomod ifi-

cacin del pH del m edio de cultivo. Estos medios se conocen como

medios d iferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacine

identificacin d e especies b acterianas.

o

i

i

8 .

o

manual de prcticas del LABORATORIO MICROBIOLOGA GENERAL



40/123

Materiales

3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)

2 cajas de Petri con Agar de eosina a zul de me tileno EMB

(Anexo 2.3)

2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo

2.5)

2 cajas de Petri con Medio Mnimo de sales (Anexo 2.3)

1 tubo con agua destilada estril

2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)

4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)

1 Mechero

t

1

A s a

d e

i n o c u l a c i n

0

1 P a r r i l la d e a g i t a c i n

1 A u t o c l a v e

Procedimiento

El profesor proporcionar cultivos puros d eBacillussubtilis,Escherichia

col,

S taphyloco ccusaureus,

Pseudom o

fluorescens, K lebslella

sp. yStreptococcussp.

Tambin les proporcionar una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que

practicarn la tcnica de aislamiento por estra cruzada.

Tcnica de estra cruzada

a) En la parte pos terior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadran tes. Tomar una m uestra con el asa

previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado

sobre el primer c uadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).

b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nue vam ente la caja y

enfriar el asa de siemb ra tocando la superficie del m edio lejos de la zona de estras recin hechas.

c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras

en el segundo cuadrante como en el caso anterior.

d) Repetir el procedim iento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ltimo cu adrante, no se

deber flame ar el asa de siembra y se har una estra ms abierta (simple).

Siembra e n tubos con caldo y agar nutritivo

1 .

Sembrar un cultivo puro diferente e n cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar

nutritivo inclinado.

2 . Sembrar con el asa extend ida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en

forma recta (Figura 5).

.



41/123

Figura 4 .Aislamiento de bacterias por estra cruzada en placa

a)

b)

Figura5. Siembra de m edios con agar por estra simple (a) en tubos inclinadosypor picadura

(b) en tubos so lidificados en form a recta.

Siemb ra de cajas de Petri con medios diferen ciales

y

selectivos

1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110yuna de MM . Sembrar en cada parte

un cultivo puro diferente por estra simple.

2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra

problema.




42/123

Con diciones d e incubacin

1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas. De las cajas inoculad as por estra cruzada,

seleccion ar la colonia m s aislada gene ralm ente d el cuarto cuadrante). Transferir una peq ue a muestra de

esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.

2.

Incubar los tub os a 35C durante 24-48 horas. Observar la aparicin de colo nias y reportar la forma en qu e

se distribuyen a lo largo del tubo.

Resultados

A. Recopilar la informacin d e la caracterizacin colonial de cada cep a en los cuadros 4 y 5.

ce

0

B. De acuerdo a sus observaciones identifique las esp ecie s presentes en la muestra problema.

4 0



43/123

Cuadro

4

Morfologa colonialdecult ivos bacterianos

Aislamiento por Estra

cruzada

Forma:

Color:

Tamao (mm):

Borde-.

Superficie:

Aspecto:

Elevacin:

Luz transmitida:

Luz reflejada:

Consistencia:

Siembra en m edios

selectivosydiferenciales:

Microorganismo 1:

Forma:

Color:

Tamao (mm):

Elevacin:

Luz transmitida:

Luz reflejada:

Consistencia:

Esc herichla co l i

MEDKDEMB

Streptoco ccus sp

MED

(j

0 1 1 0

MUESTRA PROBLEMA

MEDIOfMNIMO

o

(0

a

o

Nota:La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios

Forma:

circular, irregular, filamentosaorizoide

Borde:entero , lobulado, aserrado

Superficie: lisaorugosa

Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa

Elevacin:

convexa, plana, hun dida

Luz transmitida: translcida, opaca

Luz reflejada: brillante, mate

Consistencia: dura, blanda, mucoide

4




44/123

Cuadro 5

Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo

Tubos inclinados d e

Agar Nutritivo

w

\y

w

w

Crecimiento:arborescente,

filiforme , rizoide, disperso,

puntiforme

Color:

ultivo en tub o de

Caldo Nutritivo

Crecimiento:su perficie

como pelcula, como

sedi-

mento, turbidez en todo

el tubo

Color:

Tubos rectos de

Agar Nutritivo

r~\

Crecimiento:en forma de

pelcula supe rficial, a lo

largo d e la picadura,

solo en el fondo

Color:



45/123

Cuestionario

1. Que es el agaryde don de se o btiene? Cules son los nutrimen tos q ue proporcionaalos m icroorganismos?

2.

Cul es la comp osicin qumica de los med ios EMB, 110yMM? Cules son los co mpon entesopropiedades

responsables de su funcin com o medios selectivos

o

diferencales?

O

|

o

3. Porque el agar nutritivo es un medio d e uso gen eral para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-

cias que seleagreg aran para hacerlo selectivo para bac terias Gram negativas?

4. Cul es

la

nformacin que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado

y en tubos con agar solidificado e n form a recta?

5. Bibliografa consu ltada

manual de prcticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL



46/123


Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francs

Pouch Downes and Keith Ito, 200.

Practical Handbook of Microbilogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New

York, New York, USA.

Bergey's Ma nua l of Determinative Barteriology. 9th ed ition, The Williams an d Wiikins Co., Baltimore, USA

Standard Meth ods for the Examination of W ater and Wastewater. American Public H ealth Associated (APHA)

American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of W ater and Wastewater

Ed. (1991).



47/123

Mtodos de cul t ivo y

descr ipcin morfolgica de hongos



49/123

5

(0

a

o

"O

Objetivos introduccin

Que el alumno aprend a las tcnicas Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tam ao q ue las bac-

de cultivo y manipulacin de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los anima les por ser inm-

tes tipos de hongos. Qu e el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de p igmentos fotosintticos.

te conozca las principales caracters-

ticas m orfolgicas (macroscpica y Son de nutricin hetertrofa, es decir dep end en de nutrientes orgnicos

microscpicas) de los hongo s. que son solubilizados por sistemas enzim ticos espec ficos y son

absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica.

Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-

lulares (fi lamentosos), sin embargo, tambin existen hongos

dimrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos

formas alternativamente, depen diendo de condiciones ambienta-

les como la temperatura.

Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, am pliam ente distribui-

das en la naturaleza; frecuentem ente se encuentran formando una

cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu -

cen asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una

protuberancia o yema de la clula madre que posteriormente se

separa como clula individual.

El cuerpo o estructura vege tativa caracterstica d e los hongos filamentoso s

(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas

ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos

presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los

Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce

como hifas cenocticas.

El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por

fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abun-

dantes esporas en conidiforos y esporangiforos forma dos e n hifas

areas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripcin

de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de

clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones

o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.

Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las

cules se han descrito ms de 250 000 y d e stas solo se conocen

150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y

animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios

que proporcionan al hom bre, ya que como se me ncion la mayora

son saprobios (utilizan m ateria orgnica mu erta), por lo que t iene n

una gran capacidad de reciclar materiales orgnicos de diferentes

tipos,

de tal forma que se pueden uti l izar como agentes de

biodegradacin de compuestos recalcitrantes en procesos de

biorremediacin.

4

m a n u a l d e p r c t i c a s d e l



50/123

Desde la antiged ad, estos microorganismos se ha n utilizado e n procesos de produccin de diferentes alimentos

como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. Tambin se ha reportado que en la naturaleza hay diversas

especies que funcionan como importantes agentes d e control biolgico de insectos (bioinsecticidas) y que

pued en mejorar la nutricin y perm anencia de la mayora de las plantas (micorrizas).

Materiales

4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )

4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo

2.8)

3 Tubos de cu ltivo inclinados con 7 mL de PDA

2 m atraces Erlenmeyer de 250 mL

m

1 Probeta de 100 mL

0

1 Vaso de precipitados de 100 mL

1 M echero Fisher

5 Portaobjetos y cubreobjetos

1 Agu ja de diseccin

1 Asa de siembra

Cinta adhesiva transparente

Microscopio ptico de campo claro

Aceite de inmersin

Autoclave

Incubadora a 30 C

Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )

Procedimiento

El profesor proporcionar a los alumno s tubos d e cultivo conAspergillusniger,PenicHHum

chrysogenum , Rhizo

oliQosp orus, Trlcho derma virideyde la levaduraSacc harom ycescerevis lae.

El estudiante inocular cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a

base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un med io c omp lejo.

Har la descripcin macroscpica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observacin microscpica la

realizar aplicando la tcnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.

Siembra de hongos

1.

Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de m icelio de los tubos de cultivo con

aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.

2.

Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma man era inocular la caja con medio

de Czapek-Dox.

3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en form a similar a la inocula

cin de bacterias.

4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora

28-30 C duran te 3-5 d as.

48



51/123

Descripcin macroscpica de levad uras y mohos

1 . Hacer la descripcin de la form a, tam ao , aspecto, textura y color de las colonias deSaccharomycescerevisiae.

2 . En los cultivos de mohos describir la form a, tam ao y el tipo de colonia, as com o las caractersticas del

micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de

esporas, cambios en el m edio de cultivo, etc.

Descripcin microscpica de levaduras

t

1 . De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de me tileno.

2 .

Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.

Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva

1 .

Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomnd ola nicame nte por los extremos.

2 . Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la

colonia.

3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el

centro de un portaobjetos. La cinta funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo mejor

posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.

4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y

40X.

5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos, conidias, esporangiforos,

esporangios y rizoides. Determ ine si las hifas presentan septos o n o.

Resultados

A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfolg icas de cada

uno de los microorganismos y colorearlos.

B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.

C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la prctica.

i

o

4


: -. ,-* : v

:

. ' > : ; -*Z

M ^ ; ; * * ? ; ; < ; * : y

^ v . ; , ? - - , v . : : ' - BIL0CI GENERAL



64/123


M cFad din, J.F., J Ma c Faddin. 200 0. Biochemical Tests for Identification of M edica l Bacteria, 3rd ed.,

Lippicont, Williams & Wilkins.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs

Pouch Downes and Keith Ito, 2001

Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,

1989.

Bergey's Manual of Determinative Bacterilogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA

Standard Me thod s for the Examination o f Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA)

Ame rican W ater Eorks Association (AWW A). Standard Methods for the Examination o f Water and Wastew ater.

Ed.

(1991).



65/123

Mtodos de cuantificacin

de microorganismos



67/123

a

o

introduccin

objetivos

Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero o peso (biomasa)

Que el alumno conozca algunas de de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e

las tcnicas de cuan tificacin direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determ inacin de

ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer.

ms utilizadas. Que compare las ven-

tajas y desventajas de cada una en La determinac in de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy

utili-

funcin de la informacin que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-

tiene,

del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se some ten a varios procesos (filtracin ,

recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar prdidas importan tes de biomasa

y errores en la cuantificacin.

El mtodo de cuenta d ireaa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y

econmico, aun que no se pueden d istinguir las clulas viables y no

viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una mues-

tra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra

que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la

observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 -

5/m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen

de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm

3

).

Entre los mtodo indirectos, uno de los ms utilizados es la medicin de

laturbide z de los cultivos en un e spectrofotmetro, que es relativa-

mente rpida y que se basa en la capacidad de las clulas

microbianas de dispersar la luz que incide sobre stas. Como el

tamao de las clulas en una poblacin es casi constante, el grado

de dispersin es proporcional a la concentracin de clulas pre-

sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por clulas

viables o no viables.

La forma de cuan tificar clulas viables ms utilizada en M icrobiolog a, es

la de hacer diluciones y cuenta en placa con m edios de cultivo es-

pecficos para la poblacin de inters. Esta tcnica se basa en la

suposicin de que cada bacteria incluida e n un med io de agar o en

su superficie se m ultiplicar y producir una colon ia visible, en con-

secuencia el nmero de colonias que se observarn a simple vista

ser igual al nmero de bacterias viables o unidades formadoras de

colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilucin.

Esta tcnica aplicada en muestras complejas, dar una estimac in aproxi-

mada del nmero total de microorganismos, depen diendo del me-

dio de cultivo utilizado, ya que no hay un med io y condiciones de

incubacin que favorezcan el crecimiento de todos los

microorganismos. Tambin pueden presentarse problemas relacio-

nados con falta de homoge neidad de las diluciones y en la inocula-

cin de las muestras, por lo que se pueden obtene r bajos valores si

es que las clulas no se separan b ien y valores elevados si la toma

de las muestras se hacen del fon do del tubo donde se han concen-

trado por gravedad los microorganismos.

6




68/123

Materiales

6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )

10 Pipetas de 1-2 ml_ estriles

10 Tubos con 9 mL de ssi (solucin salina isotnica= 0 .89%

NaCI)

1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi

Vasos de precipitados

1 Parrilla de agitacin

1 espectrofotmetro

w

1 cmara de Neubauer

g I pipeta Pasteur

Fenol al 2% (Anexo 1.9)

1 Varilla de vidrio doblada en L

1 M icroscopio compuesto

Safranina (Anexo 1.8)

Procedimiento

El profesor proporcionar un cultivo deSaccharomycescerevisiaey Escherichla colL

El alumno medir la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro (Spectronic 20); cuantificarn el nmero de

clulas totales, por cuenta dir ea a en cmara de Neu bauer y determinar el nme ro de un idades formadoras

de colonias (UFO por dilucin y siembra en placa.

Tcnica turbidimtrica

1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.

2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm)

3. Calibrar el instrum ento a 0% de transm itancia con el botn izquie rdo. Para leer en la escala, observar la

aguja a nivel de los ojos y tomar e l dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el esp ejo.

4. Colocar una celda con med io de cultivo estril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrum ento a 100% de

transmitancia.

5. Para medir la turbidez d e una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfec tamen te con papel suave y

medir el valor d e %T.

6. Calcule la absorbancia de la frmula A= -log (%T/100)

7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.).

6 6



69/123

I

Tcnica de cuenta directa en

cmara de Neubauer

1 . Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-

das (D.O > 1.5) ser necesario preparar diluciones de la misma con solucin salina isotnica. Agregar 0.5 mL

de solucin de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 m inutos.

2 . Lavar cuidadosamente la cmara de Neuba uer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar

con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,

donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.

3. Homoge neizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta

Pasteur de punta fina y depositar una g ota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar

que la mue stra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso q ue dificultar la evaluacin precisa de la

poblacin microbiana.

4. Dejar reposar duran te 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo

seco dbil (10X) la zon a cuadriculada que se muestra e n la Figura 7.

5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5

cuadros pequ eos (C2) limitados por triple lnea qu e m iden 0.2m m por lado. Estos cuadros pequ eos a su

vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.

6. Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el nmero de clulas que se

localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a

contar desde la parte sup erior de los cuadros C2 y se contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de

los cuadros C2; debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del

cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este mtodo reduce las

posibilidades de contar la misma clula dos veces.

7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por m L En el proceso de

contar se pue den presentar tres situaciones diferentes que a continuacin se explican:

a. Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 10

4

para reportar el

nmero de clulas por mL.

b- Con m enos de 200 clulas por cuadro grande (C1 ), ser necesario contar algunos de los cuadros de las

esquinas (mide n 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta m anera se cuantificarn ms d e 20 0 clulas.

Despus dividir el nm ero total de clulas entre el nm ero de cuadros emp leados y sacar el valor promedio

por cuadro grande. Despus multiplicar este valor por X 10

4

para reportar el nmero de clulas por mL.

c. En el caso de q ue se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se debern contar las clulas de

los cuadros de m enor tam ao (C2) hasta contar cerca de 200 clulas. Dividir este valor entre el nm ero de

cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio

por 25 para obtener el nm ero de clulas aproximado en un cuadro grande (C1) y despus m ultiplicar X10

4

para reportar el n me ro d e clulas por mL.

m a n u a l d e p r c t i c a s d e l ' ' - -.*;.:* " < < rr >


70/123


71/123

6. Si ainocu lacinfue por duplicadootriplicado ,secalculaelnmero promediodecolonias por diluciny

este nmero se multiplicar porelinverso deladilucin XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-

nerlanmero totaldeunidades formadoras de colonias (UFC)/mL enlamuestra original.

1mL

Cultivo bacteriano

1

mL

1mL 1 mL 1 mL 1 mL

1

3

io

4

io

5

io

6

io

7

O . l m L

X O . l m L

Figura 8 .Tcnica de dilucinycuenta en placa

Resultados

A. Reportar los resultados de cuan tificacin

de

os cultivos, aplicando las tcnicas descritas. Indicar los clcu-

los hechos para cada metodologa.

B. Recopilar sus resultados enelCuadro8ncluyendo los de los otros equipos , indicandolamuestra analizada

por cada equipo. Discutirencada caso cules fueron las ventajasydesventajasde asm etodologasde

cuantificacin.




72/123

Cuadro 8

Cuantificacin de microorganismos por tcnicas directas e indirectas

(0

a

o

MICROORGANISMO

Escherichia

col

Saccharomyces

cerevisiae

Turbidez (D.O.) Cuenta en cmara de Neubauer

(# clulas totales/mL)

Cuenta viable en placa

(# UFC/mL)

Cuestionario

1. Compare el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta dire aa en cmara de Neubauer para la

cuan tificacin de microorganism os. En que casos conviene usar cada uno?

2.

Explique cules son las ventajas y desventajas del mtodo turbidimtrico de cuantificacin de clulas.

70



73/123

3. Mencione dos aplicaciones concretasen lasqueseutilicen cada unade lascnicasdecuantificacin

realizadas.

1

(0

ti

a

o

4. Algunos autores sugierenlamedicin de actividad biolgicayla determ inacin de cons tituyentes celulares

para

la

cuantificacin

de

poblaciones microbianas. Comente sus ventajas

y

desventajas.


7




74/123

c


Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.

Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3

a

- Ed. Cummings Publ ishing

Company, Inc. USA.

Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava Edicin.

Prentice Hall. Espaa.

Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.

Mxico.

7 2



75/123

I " O

ai*

Efeao del pH y la temperatura en

el crecimiento microbiano



77/123

Objetivos

Queelestudiante conozcaelefecto

del pHya temperatura como parme-

tros de control del crecimiento micro-

biano. Queelalumno comprendaa

importancia

de

estos factores fsico-

qumicosen laseleccindepobla-

ciones microbianas en los diferentes

ambientesenqueseencuentrany

los mecanismosdeadaptacinani-

vel celulary metablicosque han

desarrollado.

introduccin

Los microorganismos estn continuam ente afectados por su amb iente, ya

que ste ejerce una influencia profundaen sudesarrolloaligualque

sobre las dems formas de v ida. Los factores del m edio se pueden clasi-

ficar en tres grupos:

a).- Fsicos.- tempe ratura, presiones externas, hum edad.

b).- Qumicos.- pH, dispon ibilidad de nutrimentos, presencia de produc-

tos txicos.

c).- Biolgicos.-lasinteracciones microbianas entre lasespecies

coexistentes.

Algunos microorganismos estn especialmente adaptadosa loshabitat

extremos, donde otrosnopueden sobreviviryque incluso tienen

propiedades fisiolgicas que restringensucrecimientoatalessi-

tios.

En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nu trimentos

y

las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia

enlaseleccindeas poblaciones que se encontrarn.

Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio

con mayor frecuencia, ademsde losnutrimentales son los

fisicoqumicos como:laemperaturaypH .

Todos los organismos tienen una temperatura ptima de crecimiento que

los caracteriza; enlacual muestran las tasas ms elevadas de creci-

miento. Tambin hay lmites de temperatura,latemperatura mni-

ma

en as

que son m etablicamen te inactivos

y

una temperatura

arriba delaculelcrecimiento yano esposible llamada tempera -

tura mxima.

De acuerdo a su temperatura ptima de crec imiento, los m icroorganismos

se dividen en psicrfilos (


78/123

Otros microorganismos se desarrollan e n los habitat naturalmente alcalinos com o lagos salados y desiertos don-

de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalfilos incluyen especies deRhizoblum, Bacillusyalgunas

bacterias en tricas y cianobacterias. En general los hongos son ms tolerantes a la acidez que las bacterias.

Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al

mod ificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de c recimiento y causar la mue rte de lo mismos,

por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.

Materiales

2 C a j a s d e P e t r i c o n m e d i o d e P a p a D e x t r o s a A g a r A n e x o

2 . 6 ) a j u s t a d o

a pH 7.0

fi 2 C a j a s d e P e t r i c o n m e d i o d e P a p a D e x t r o s a A g a r a j u s t a -

0

do a pH 5.0

2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-

do a pH 9.0

22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin (Bioxon) ajus-

tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)

4 Tubos con 7 mL de caldo m icroinoculacin ajustado a pH

5.0 sin amortiguar

4 Tubos con 7 mL de caldo m icroinoculacin ajustado a pH

9.0 sin amortiguador

4 Tu

MicrobiologiaManual de Practicas De

Documents

Transcript of MicrobiologiaManual de Practicas De