Manual de Practicas Laboratorio BQ

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA

GUIA DE PRACTICA LABORATORIO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS MDICAS

SECCION BIOQUIMICA

PROMOCION LII 2015

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DOCENTES DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA MDICA SECCION BIOQUIMICA MDICA

DR. JUAN MANUEL VALLADOLID ALZAMORA. (JMVA)

([email protected])

Prof. Principal Tiempo Completo. COORDINADOR DE CURSO

Ms. JORGE PLASENCIA ALVAREZ. (JPA) Prof. Auxiliar Tiempo Completo. Coordinador Adjunto del Curso.

Dra. MARIA ESTHER DAISY REYES BELTRAN. (MRB) Prof. Principal Dedicacin Exclusiva.

Ms. WALTER OBESO TERRONES.(WOT)

([email protected])

Prof. Principal Tiempo Completo.

Jefe del departamento de Ciencias

Bsicas Medicas.

Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA. (JHS) Prof. Principal Tiempo Completo.

Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO. (CAA) Prof. Asociado Tiempo Completo.

Ms. ANGEL ALFREDO LARIOS CANTO. (ALCA)

([email protected])

Prof. Auxiliar Tiempo Parcial.

DR. HCTOR RODRGUEZ BARBOZA. (HRB) Prof. Auxiliar Tiempo Parcial

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PRACTICA N 01

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

I. INTRODUCCION:

Las enzimas son protenas relativamente frgiles con tendencia a sufrir desnaturalizacin e inactivacin, es decir alteraciones en su conformacin, por efecto de diversos agentes fsicos y qumicos como: temperatura, cidos y lcalis fuertes, sales pesadas, pH ,etc. Las enzimas se encuentran en muy pequeas concentraciones en los materiales biolgicos. Resulta un trabajo arduo y complicado individualizarlas o purificarlas. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares a la naturaleza proteica que las caracterizan , desde el punto de vista experimental se pueden utilizar las propiedades de catalizadores especficos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir stas cuando son sometidas a la accin de diferentes agentes fsicos y qumicos . De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cmo afectan los agentes fsicos y qumicos la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. Se busca asi poner en evidencia la naturaleza proteica de las enzimas y sus propiedades comunes al ser expuestas a la accin de diversos agentes fsicos y qumicos que hacen variar su comportamiento y actividad cataltica.

II. REACTIVOS A UTILIZAR:

a. NaOH 1N b. Almidn soluble 1% c. Amilasa 1% d. Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6 e. CuSO4 20% f. Solucin Iodada g. Acido Tricloroactico 20% h. NaCl 0.15 M i. HCl 3 N j. HCl 0.05 N

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema (A):

TUBOS

COMPONENTES (en ml) I II III IV V VI

Amilasa al 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

NaOH 1N - 2.4 - - - -

HCl 3N - - 2.4 - - -

cido Tricloroactico 20% - - - 2.4 - -

CuSO4 al 20% - - - - 2.4 -

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 2.4 - - - - 2.4

a. Observar el aspecto y color producido e interpretar.

I UNIDAD

SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

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b. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo 10 minutos a temperatura ambiente. c. Colocar el tubo VI en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. d. Durante este lapso construir el siguiente sistema (B):

TUBOS


Almidn al 1.0% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

NaCl 0.15 M 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Agua Destilada 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

e. Preincubar por dos minutos a 37C. f. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su

correspondiente tubo del ltimo sistema (B). g. Dejar en incubacin a 37C. por 20 minutos. h. A continuacin armar el siguiente sistema:

TUBOS


HCl 0.05N 5 5 5 5 5 5

De los tubos de reaccin del

sistema (B), agregar:

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Solucin yodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

i. Observe el color producido e interprete los resultados.

IV. CUESTIONARIO:

1. Cul es el mecanismo de accin de las sales pesadas sobre la protena (enzima)? 2. Cmo actan los cidos y bases fuertes sobre la protena (enzima)? Ejemplos 3. Cmo acta la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima? 4. Cmo repercute la modificacin de la estructura proteica, producida por agentes fsicos y

qumicos, sobre la actividad enzimtica?

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PRACTICA N 02

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS

I. INTRODUCCION: El punto isoelctrico (PI) es la concentracin de iones hidrgeno en el cual la protena es elctricamente neutra, porque el nmero total de cargas positivas es igual al nmero total de cargas negativas contenidas en la protena. Cada protena posee un determinado punto isoelctrico. Cuando una protena se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores, iguales o mayores al PI, la protena sufre variaciones en la constitucin de sus grupos qumicos, producindose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su funcin biolgica A parte de otras propiedades que presentan las protenas, cuando se encuentran en una solucin que tienen pH igual al PI, algunas protenas son muy dficilmente solubles y precipitan. Aprovechando este comportamiento, se puede determinar el PI de una protena observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la protena se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. La presente prctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoelctrico de las protenas y por tanto de las enzimas es una caracterstica fsico qumica comn de estas molculas, que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mnimo.


- NaOH al 10%. - cido actico 1N - Papel Indicador de pH - Solucin de casena en Acetato de Sodio 0.1N


Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9

TUBOS

REACTIVOS (en ml.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

cido Actico 1N 3.2 - - - - - - - -

Agua Destilada 6.8 5 5 5 5 5 5 5 5

Mezclar el tubo N 1 Extraer 5ml. de solucin del tubo N 1 y agregarlo al tubo N 2. Mezclar Extraer 5ml. del tubo N 2 y transferir al tubo N 3. Completando del mismo modo hasta completar

la serie. En el tubo N 9 una vez efectuada la mezcla, se extrae 5 ml. de solucin y se elimina . Al contenido anterior del sistema agregar rpidamente 1 ml. de casena en acetato de sodio 0.1N en

cada tubo.

TUBOS

CONTENIDO ( ml.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Contenido Anterior 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Casena 0.1N (sal) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Mezclar al instante por inversin . Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la protena en los diferentes

tubos. Anotar en el cuadro que se da a continuacin Observar despus de 30 minutos de reposo y anotar tambin en el cuadro respectivo.

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TUBOS N.

EFECTO INMEDIATO

EFECTO DESPUS DE 30 MINUTOS

CLCULO DEL pH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Emplear los smbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia, x = precipitado

Determinar el tubo que presenta el mximo de precipitacin, lo cual se producir en el tubo que

tiene pH prximo a la solubilidad mnima de la protena. Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuacin de Henderson Hasselbach. Verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de papel. Anotar los resultados en la

columna respectiva del cuadro anterior. Ecuacin de Henderson Hasselbach

pK del cido Actico = 4.7

Ejemplo : Si la concentracin de la sal es de 1 ml. de acetato de sodio 0.1 N en todos los casos, la concentracin de cido actico vara. As en el tubo N 1 es de 1.6 ml. de cido 1 N (16 ml. 0.1N). En el tubo N2 la concentracin de cido actico es de 8 ml. al 0.1 N. En el tubo N 3 la concentracin de cido actico es de 4.0 ml. 0.1 N. Etc. Clculo de pH para el tubo N 3 : pH = pK + log. 1 = 4.7 0.6 = 4.1 TUBO N 3 : pH = 4.1

4 NOTA : Traer calculados los pH al laboratorio IV. CUESTIONARIO:

1. Qu es el punto isoelctrico?. 2. Conoce el punto isoelctrico de la casena? 3. Qu importancia tiene el punto isoelctrico de las protenas y de las enzimas? 4. Por qu razones precipita la protena cuando el pH del medio es igual al pH Isoelctrico de

la protena? 5. El pH neutro del medio es igual al pH Isoelctrico? De sus razones.

[ sal ]

pH = pK + log.

[ cido ]

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PRACTICA N 03

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

I. INTRODUCCION:

Los seres vivos obtienen y gastan la energa ms rpidamente debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamados enzimas. Tal como ocurre con los catalizadores inorgnicos, las enzimas modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final; y slo se requieren pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato. Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente fundamentalmente que la accin cataltica de las enzimas es de carcter especfico; o sea, cada reaccin qumica debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia qumica que reacciona para dar un producto en un sistema enzimtico se llama sustrato, habra entonces tantos sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo. Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reaccin dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada de dos maneras:

1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.

2. Verificando los productos liberados (PRODUCTOS FORMADOS) despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.

El presente trabajo experimental tiene como finalidad determinar la actividad enzimtica, utilizando a la enzima amilasa con capacidad de producir degradacin del almidn en maltosa (disacrido reductor) y algo de glucosa como ejemplo de un sistema enzimtico.


- Solucin de almidn pH 6.0 al 1%. - NaCl 0.1M - Enzima al 1% (amilasa salival). - HCl 0.05N - Solucin yodada. - Reactivo Folin Wu:

a. Solucin Cprica alcalina. b. Solucin fosfomolbdica.


Armar el siguiente sistema :

TUBOS

COMPONENTES I II

Solucin de almidn 1% pH 6.0 5 ml. 5 ml.

Solucin de NaCl 0.1M 1 ml. 1 ml.

Agua destilada 4 ml. 3 ml.

Colocar los tubos en bao maria a 37C por 5 minutos.

Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.

Volverlos a colocar en bao maria a 37C durante 10 minutos.

A. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. De cada uno de los tubos de incubacin transferir 0.5 ml. a su correspondiente del cuadro siguiente, inmediatamente de cumplidos los 10 minutos.

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TUBOS

COMPONENTES I II

HCl 0.05 N 5 ml. 5 ml.

De los tubos I y II: Etapa A 0.5 ml. 0.5 ml.

Solucin yodada 0.5 ml. 0.5 ml.

MEZCLAR: Observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.

B. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin Wu)

TUBOS

COMPONENTES I II

De los tubos I y II: etapa A 1ml. 1ml.

Solucin Cprica alcalina 1ml. 1ml.

Hervir 8 minutos

Enfriar

Solucin fosfomolbdica 1ml. 1ml.

Agua destilada 2ml. 2ml.

Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante

IV CUESTIONARIO:

1. Qu mtodos conoce para determinar la actividad enzimtica? 2. Cmo se puede objetivar la presencia del sustrato residual? 3. Cmo demostrar si se ha producido no reaccin enzimtica en un experimento realizado? 4. Cmo se pueden objetivar los productos de una reaccin enzimtica?

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PRACTICA N 04

ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

I. INTRODUCCION:

En la naturaleza existen sustancias cuya accin sobre una enzima dada se traduce en la disminucin de su actividad. Estas sustancias son conocidas como inhibidores enzimticos. No se considera en sta categora aquellos agentes como los cidos fuertes, alcoholes y calor que producen notables alteraciones en la estructura especial de la molcula proteica que conduce a la desnaturalizacin. Los inhibidores enzimticos se clasifican en dos grandes grupos reversibles e irreversibles, que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. Si despus de hacer actuar el inhidor sobre la enzima, eliminamos por algn mtodo, como podra ser la dilisis, el proceso de inhibicin, y la enzima recupera su actividad original, se dice que el inhibidor es reversible. A la inversa, si la enzima contina inhibida despus de la reaccin del exceso de inhibidor, se dice que el inhibidor es irreversible. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interaccin entre inhibidor y la enzima se traduce en varios tipos de inhibicin perfectamente diferenciales experimentalmente. Los dos tipos ms comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas, a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. En la inhibicin competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su accin inhibidora de revierte al aumentar la concentracin de sustrato. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debera unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formacin del complejo activo enzima-sustrato. De all el nombre de competitivo, por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazar se mutuamente de la enzima. La inhibicin no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentracin del sustrato ya que este ltimo no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Aqu el inhibidor se une a la enzima en otro sitio distinto al cual se une el sustrato. Por esta razn la unin de este ltimo con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor, pudindose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor, que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reaccin y complejo enzima-inhibidor. Desde el punto de vista cintico, el Km no vara, pero la Vm disminuye.

II. REACTIVOS A UTILIZAR

- Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 - Succinato de sodio 0.1 M - Succinato de sodio 0.5 M - 2 6 Diclorofenolindofenol - Malonato de sodio 0.1 M - Cloruro de mercurio - Homogenizado heptico 10 %

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA:

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Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color). Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.

IV. CUESTIONARIO:

1. Por qu el malonato es inhibidor competitivo? 2. Por qu el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3. Cmo podra usted demostrar que la inhibicin producida por el cloruro mercrico es o no

reversible? 4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibicin competitiva en el sistema

Deshidrogenasa succnica succinato, adems del malonato utilizado en el presente experimento. 5. Seale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibicin no competitiva

reversible, sin considerar el cloruro de mercurio. 6. Qu diferencias puede usted establecer entre la inhibicin competitiva y la inhibicin alostrica? 7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibicin no competitiva reversible e inhibicin alostrica.

TUBOS

COMPONENTES (ml) I II III IV V

Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 2.0 1.8 1.3 1.3 1.0

Succinato de sodio 0.1 M - 0.2 0.2 0.2 -

Succinato de sodio 0.5 M - - - - 0.5

Cloruro de mercurio 0.1 M - - - 0.5 -

Malonato de sodio 0.1 M - - 0.5 - 0.5

2 6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Homogenizado 10 % 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

COMPONENTES II III IV

Succinato de sodio 0.5 M - 0.5 0.5

Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 0.5 - -

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PRACTICA N 05

FACTORES FSICOS-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO TEMPERATURA, IONES INORGNICOS

I. INTRODUCCION:

En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reaccin que catalizan, presentan caractersticas comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reaccin enzimtica sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrn es posible tener una idea ms o menos clara de la influencia de los factores (tiempo, temperatura, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH, iones, etc,) sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrn general, como se comprender, varia en forma caracterstica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigacin del factor variable no se vea afectada por la variacin que pudieran sufrir los otros. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reaccin enzimtica, tomando como ejemplo la hidrlisis enzimtica del almidn y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reaccin enzimtica.


- Solucin de almidn al 1 % - Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 - Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - Buffer borato 0.1M pH 9.0 - Solucin de NaCl al 2 % - Amilasa dializada al 0.25 % - HCl 0.05N - Solucin yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) - Solucin cprico alcalina. - Solucin fosfomolbdica.


Armar el siguiente sistema:

- Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al bao de agua a 37C, por cinco minutos, para el equilibrio de

la temperatura. - El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0C y 4C durante cinco minutos.

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (en ml.) I II III IV V VI VII VII

Solucin de almidn al 1 % 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - - - 5.0 - - - -

Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 5.0 5.0 5.0 - 5.0 - 5.0 5.0

Buffer borato 0.1M pH 9.0 - - - - - 5.0 - -

Solucin de NaCl al 2 % 1.4 - 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Agua destilada 2.6 3.4 1.0 2.0 2.0 2.0 2.4 2.0

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- Agregar el preparado enzimtico a los tubos: del II al VIII, segn se indica y tomar el tiempo.

(Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimtico fue agregado a cada tubo)

Mezclar y continuar la incubacin. Los controles de la actividad enzimtica: - Por el sustrato residual, se realizar en toda la serie de tubos, del I al VIII, a los 20 minutos de

incubacin. - Por los productos formados, se realizar solamente en los tubos III y V, a los 20 minutos de incubacin. De acuerdo a los sistemas que a continuacin se presentan.

CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

El control del sustrato no transformado se realiza por la reaccin del yodo, de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubacin sacar los tubos del bao mara y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su correspondiente tubo.

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos; valorando los cambios de coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

El Control de los productos formados se har en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa) de la siguiente manera: Esta determinacin slo se har en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos. Armar el siguiente sistema :

COMPONENTES TUBOS

III V

Incubado correspondientemente a los tubos III y V 1.0 ml. 1.0 ml.

Solucin cprico alcalina 1.0 ml. 1.0 ml.

Mezclar y poner en bao mara hirviendo por 8 minutos. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y agregar:

COMPONENTES TUBOS

III V

Solucin fosfomolbdica 1.0 ml. 1.0 ml.

Agua destilada 5.0 ml. 5.0 ml.

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (ml.) I II III IV V VI VII VIII

Preparado enzimtico (ml) 0.0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.2 0.6

TUBOS DE ENSAYO

COMPONENTES (ml.) I II III IV V VI VII VIII

Incubado correspondiente de cada uno de los tubos

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

HCl 0.05N 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Solucin iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

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CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL:

(cambio de color) A los 20 minutos:

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color)

A los 20 minutos

IV. CUESTIONARIO:

1. Cules son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimticas? 2. Cmo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidn como

sustrato? 3. Cmo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones

enzimticas? 4. Cmo puede demostrar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la

reaccin enzimtica? 5. Cmo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas? 6. Cmo puede demostrar el efecto de la presencia de un in activador sobre la velocidad de las

reacciones enzimticas?

I II III IV V VI VII VIII

III V

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PRACTICA N 06

DISTRIBUCIN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE XIDO-REDUCCIN

I. INTRODUCCION:

Los carbohidratos, cidos grasos, aminocidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimticos simples o complejos. Estos sistemas estn constituidos por protenas, fosfolpidos, grupos prostticos y tomos metlicos. De acuerdo a su estructura y funcin, las enzimas que intervienen en estos procesos se encuentran clasificados en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimolgica. Las enzimas de xido - reduccin tienen una distribucin caracterstica intracelularmente, encontrndosele de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energa derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macrorgico ATP. La finalidad del presente trabajo es objetivar la distribucin intracelular de las enzimas de xido - reduccin usando los indicadores redox 2-6 diclorofenilindofenol y p-fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hgado de rata obtenidos por centrifugacin diferencial mediante el mtodo de Schreider y col.

II. REACTIVOS A UTILIZAR - Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4 - 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 % - Succinato 0.1M - pfenilendiamina 1% - Homogenizado total de hgado de rata en sucrosa 0.25 M - Fraccin nuclear del homogenizado. - Fraccin mitocondrial del homogenizado. - Fraccin microsomal soluble del homogenizado. - KCl 0.154 M


Fraccionamiento Celular - Sacrificar una rata albina, inmediatamente hacer un corte longitudinal en el abdomen

procediendo a extraer el hgado; el cual se coloca en una placa petri y se elimina la cpsula del hgado y otros tejidos perifricos

- Homogenizado al 10%: Pesar 10g. de hgado. Cortar en trozos pequeos ycolocar en el homogenizador potter, agregar solucin KCl 0.154 M. Hacer presin manualmente con el mbolo, girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4C.

- El homogenizado se centrifuga a 800 rpm. por 10 minutos en una centrfuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fraccin nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.

- El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 rpm. por 15 minutos en la centrfuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fraccin microsomal con el citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fraccin mitocondrial.

Armar el siguiente sistema, usando 2,6-diclorofenolindofenol:

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Mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

Armar el siguiente sistema, usando pfenilendiamina

Mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

IV. CUESTIONARIO:

1. Qu es el 2,6-diclorofenolindofenol y cmo acta en la cadena respiratoria? 2. Qu es el p-fenilendiamina y cmo acta en la cadena respiratoria? 3. Grafique usted en una cadena de xidoreduccin biolgica la accin de los indicadores rdox 2,6

diclorofenolindofenol y pfenilendiamina. 4. Qu es un homogenizado de hgado y cmo se obtienen las fracciones celulares por centrifugacin

diferencial? 5. En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de xidoreduccin? 6. Haga un esquema de la centrifugacin diferencial

COMPONENTES 1 2 3 4 5

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5

26 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Succinato de sodio 0.1M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Fraccin nuclear - 0.5 - - -

Fraccin mitocondrial - - 0.5 - -

Fraccin microsomal soluble - - - 0.5 -

Homogenizado total - - - - 0.5

COMPONENTES 1 2 3 4 5

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0

p-fenilendiamina 1% (sustrato + indicador)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Fraccin nuclear - 0.5 - - -

Fraccin mitocondrial - - 0.5 - -

Fraccin microsomal soluble -

-

-

0.5

-

Homogenizado total - - - - 0.5

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PRACTICA N 07

DEMOSTRACIN DE LA DIGESTIN Y ABSORCIN DE LOS CARBOHIDRATOS:

GLUCOSA PRE Y POST PRANDIAL

I. INTRODUCCION: Histricamente, la glucosa fue una de las primeras sustancias determinadas en sangre y, probablemente, la que ms mtodos se han sugerido para su determinacin en otros constituyentes. La glucosa en sangre, proviene de dos orgenes: de origen exgeno que proviene de los alimentos, y de origen endgeno, que proviene del hgado por glucogenlisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos perifricos (para su consumo) y por excrecin renal por la orina, por lo tanto la concentracin de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto. En el caso del hgado, el transporte de glucosa al interior de las clulas es por difusin pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los dems tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las clulas por simple difusin, sino que lo hace por un mecanismo de difusin controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazn y el msculo esqueltico. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a travs de las clulas de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que est ntimamente ligado al transporte de Na+. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentracin de sodio en fludo extracelular. En este caso la glucosa entra en la clula, posiblemente porque se une a la misma protena transportadora que lleva el Na+. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvera a salir de la clula. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energa. La entrada de la glucosa en estas clulas est supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentracin en el lquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a travs de la membrana favorecera a otro. El conocimiento de la glicemia es importante no slo porque nos permite tener una idea general del mecanismo de homeostasis existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patolgicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. El propsito de la siguiente prctica es demostrar la digestin y absorcin de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y post prandial en personas normales y/o patolgicas.


- Estndar : Solucin de glucosa 1 g./l - GOD/POD : Solucin de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Perxidasa (120 U/ml). - Reactivo 4- AF: Solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. - Reactivo Fenol : Solucin de Fenol 55 mmol/l.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES :

OBTENCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE : Se tomarn dos nuestras de sangre :

La primera:

La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.

La segunda:

Esta muestra se tomar despus de una hora, como mximo, despus de la ingesta alimenticia.

En esos momentos, se extraern 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodrmica de 10 ml. y con aguja N 20.

II UNIDAD

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

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Colocar las muestras en tubos de ensayo, dejar reposar 10minutos, luego centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos. Separar el suero.

La determinacin de la glicemia se realizar por el mtodo Enzimtico de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco), S (Standard), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost. (Desconocido post prandial).


COMPONENTES B S Dpre. Dpost.

Standard ----- 20 ul. ------ ---- Muestra (Suero pre.) ----- ----- 20 ul. ---- Muestra (Suero post.) ----- ----- ----- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C Leer en Espectrofotmetro a 505 nm. en fotocolormetro con filtro verde (490530 nm.) llevando el aparato a cero con el blanco. Clculo de los resultados :

Glucosa pre prandial (g/l) = Dpre.xf donde f = 1,00 g/l

S Glucosa post prandial (g/l) = Dpost. x f

A los tubos problema se les resta el blanco antes de multiplicar por el factor (f)

IV. CUESTIONARIO:

1. Qu valores de glicemia espera encontrar en las muestras pre y post prandial? 2. Qu variaciones fisiolgicas de la glicemia puede sealar? 3. Qu enzimas participan en la digestin de los carbohidratos? 4. Cmo se realiza la absorcin de los carbohidratos? 5. Cules son los valores normales de glicemia?

BIOQUIMICA MDICA

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PRACTICA N 08

REGULACIN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUNEA: EFECTO DE LA INSULINA

I. INTRODUCCION: La glucosa sangunea proviene de glucgeno heptico, aminocido, otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. En condiciones normales, en ayunas, la glicemia es muy constante y tiene en el hombre un valor entre 80 a 120 mg por 100 ml de sangre (segn el mtodo de Folin- Wu). Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. La glicemia se eleva despus de la ingestin de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas despus de la ingestin vuelve al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las clulas para producir energa y por algunas clulas para funciones ms especializadas por ejemplo glucognesis, lipognesis y otras semejantes. Los mecanismos reguladores de la concentracin de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glndulas de secrecin interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la produccin y la utilizacin de la glucosa sangunea; cuya sensibilidad est regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipfisis por el otro. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es producida por las clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. El efecto ms importante de una deficiencia insulnica es el de un nivel sanguneo de glucosa elevado (hiperglicemia), una excesiva excrecin de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucgeno en el hgado. La administracin de insulina va seguida de hipoglicemia cuya magnitud depende de la dosis administrada; el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formacin de glucgeno en el hgado y en el msculo, a la vez que acelera la oxidacin de glucosa en diferentes tejidos. La insulina tambin favorece la conversin de los hidratos de carbono en cidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeognesis a partir de los aminocidos. Se explica as que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. La secrecin de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, de manera que cada vez que se eleva la glicemia, se produce ms insulina que tiende a aminorarla. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de glicemia como consecuencia de administracin de insulina.


- Conejos adultos de ms de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. - Solucin de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. - Jeringas hipodrmicas de 2,5 cc. 5,0 cc. - Reactivo de glicemia enzimtica (GOD-PAP)

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

EFECTO DE LA INSULINA SOBRE LA GLICEMIA Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. Dosis de la solucin de insulina cristalina (Lilly) (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. Utilizar una jeringa hipodrmica de 2,5 ml. 5,0 ml. que facilita la medida de la dosis.

EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE INSULINA. Extraer una primera muestra de sangre por puncin cardaca y transferirla a un tubo de ensayo de

13x100 mm. Servir para establecer los valores basales de glicemia. Inyectar por va subcutnea la cantidad calculada de insulina. Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la insulina, lo

que hace un total de tres muestras en una hora.

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Centrifugar las muestras a 1500 rpm x 10 minutos; separar el suero. Con cada una de las citadas muestras de suero realizar la determinacin de glucosa segn el

mtodo de la glucosa oxidasa.

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON INSULINA.

Utilizar 5 tubos de ensayo: Bco. (Blanco), Basal (B), Prob 15 min., prob. 30, prob. 60 min. Armar el siguiente sistema:

COMPONENTES Bco Basal 15 min 30 min 60 min.

Muestra basal ----- 20 ul. ------ ----- ----- Muestra 15 min ----- ----- 20 ul ----- ----- Muestra 30 min ----- ----- ------ 20 ul ----- Muestra 60 min ----- ----- ------ ----- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C Leer en Espectrofotmetro a 505 nm. en fotocolormetro con filtro verde (490530 nm.) llevando el aparato a cero con el blanco. Clculo de los resultados:

Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f

A los tubos problema se les resta el blanco antes de multiplicar por el factor (f) Anotar los resultados en relacin al tiempo.

- Hacer una grfica de glicemia vs tiempo

IV. CUESTIONARIO:

1. Explique usted brevemente la regulacin de la glicemia, como resultado, en trminos generales, de la tasa de llegada e ndice de salida de la glucosa de la sangre.

2. Explique de manera suscinta el efecto de la insulina sobre la glicemia: con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.

3. Cul es el efecto metablico de la insulina sobre el hgado y sobre los msculos y qu efectos produce sobre la glicemia?

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REGULACIN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUNEA: EFECTO DE LA ADRENALINA

I. INTRODUCCION: La glucosa sangunea proviene directamente de diversas fuentes : glucgeno heptico, aminocido, otros carbohidratos y de glucosa absorbida por los intestinos. La glicemia se eleva despus de la ingestin de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas despus de la ingestin vuelve al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las clulas para producir energa y por algunas clulas para funciones ms especializadas por ejemplo glucognesis, lipognesis y otras semejantes. El organismo dispone de mecanismos reguladores que de diferentes maneras aceleran o retardan la entrega o el retiro de glucosa desde o hacia los tejidos. Los mecanismos reguladores son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glndulas de secrecin interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la utilizacin de la glucosa sangunea; cuya sensibilidad est regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipfisis por el otro. La adrenalina, hormona secretada por la mdula suprarrenal, tiene accin hiperglicemiante; ello se debe a que favorece la conversin del glucgeno en glucosa (glucogenlisis) en el hgado, adems de actuar en el msculo, por la ausencia en este de la glucosa 6- fosfatasa, la glucogenlisis se realiza con la formacin de lactato el que va ha contribuir directamente a la formacin de glucosa y glucgeno en la clula heptica por los mecanismos gluconeogenticos. El efecto glucogenoltico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. La secrecin de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, si aparece hipoglicemia se segrega ms adrenalina y glucagn que aceleran la regulacin que espontneamente debe realizar el hgado. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de glicemia como consecuencia de la administracin de adrenalina.

V. REACTIVOS A UTILIZAR

- Conejos adultos de ms de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. - Solucin de adrenalina: 0.1 mg/ml. - Jeringas hipodrmicas de 2,5 cc. 5,0 cc. - Reactivo de glicemia enzimtica (GOD-PAP)

VI. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.

Dosis de la solucin de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0,25 ml de la solucin a utilizar por kg de peso. Utilizar una jeringa hipodrmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis.

EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE ADRENALINA. Extraer una primera muestra de sangre por puncin cardaca y transferirla a un tubo de ensayo de

13x100 mm. Servir para establecer los valores basales de glicemia. Inyectar por va subcutnea la cantidad calculada de adrenalina. Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la adrenalina,

lo que hace un total de tres muestras en una hora. Centrifugar las muestras a 1500 rpm x 10 minutos; separar el suero. Con cada una de las citadas muestras de suero realizar la determinacin de glucosa segn el

mtodo de la glucosa oxidasa. DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON ADRENALINA.

Utilizar 4 tubos de ensayo: Bco. (Blanco), Prob 15 min, prob 30 min., prob 60 min.

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COMPONENTES Bco Basal 15 min 30 min 60 min.

Muestra basal ----- 20 ul. ------ ----- ----- Muestra 15 min ----- ----- 20 ul ----- ----- Muestra 30 min ----- ----- ------ 20 ul ----- Muestra 60 min ----- ----- ------ ----- 20 ul. Reactivo de trabajo. 2 ml 2 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml.

Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C Leer en Espectrofotmetro a 505 nm. en fotocolormetro con filtro verde (490530 nm.) llevando el aparato a cero con el blanco. Clculo de los resultados :

Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f

A los tubos problema se les resta el blanco antes de multiplicar por el factor (f) Anotar los resultados en relacin al tiempo.

- Hacer una grfica de glicemia vs tiempo

II. CUESTIONARIO:

1. Explique usted brevemente la regulacin de la glicemia, como resultado, en trminos generales, de la tasa de llegada e ndice de salida de glucosa de la sangre.

2. Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con especial referencia

al metabolismo de los carbohidratos. 3. Cul es el efecto metablico de la adrenalina sobre el hgado y sobre el tejido muscular y qu

efecto produce sobre la glicemia?

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PRACTICA N 09

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

I. INTRODUCCION: La prueba de Tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer la respuesta insulnica frente a un estmulo fisiolgico por glucosa. La rpida absorcin de glucosa desencadena la liberacin de insulina pre-formada en las clulas beta del pncreas, en cantidad suficiente para cubrir las necesidades se aumenta la captacin de la glucosa por los tejidos especialmente por el hgado en donde se utiliza y almacena como glucgeno. La ingesta de glucosa es seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia, debido a que la velocidad de absorcin intestinal excede a la capacidad del hgado y los tejidos para su utilizacin. En sujeto normal, el nivel mximo de glucosa despus de la absorcin rara vez pasa de 150 mg/100 ml. El organismo vuelve a ajustar el nivel de la glicemia, a los valores del estado de ayuno con un perodo de una hora y media o dos horas y media de iniciada la prueba. En condiciones normales de utilizacin de glucosa la elevacin y reajuste de la glicemia se aparta del patrn normal teniendo estas variaciones valor diagnstico y pronstico. A travs de la prueba, la orina de personas aparentemente sanas se presenta siempre libre de glucosa. La desventaja de esta prueba es que incluye un factor que no guarda relacin con la respuesta insulnica, la velocidad de absorcin a partir del tubo digestivo. La finalidad del trabajo experimental es establecer la capacidad del organismo para manejar una dosis fija de glucosa administrada por va oral en condiciones estndar.


- Reactivos para glicemia por el Mtodo Enzimtico. - Solucin de glucosa al 25 % - Reactivos de Benedict.

III. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES : Procedimiento

- El paciente debe ser preparado para esta prueba, indicndole una dieta diaria que contenga 300 g. de Hidratos de carbono, durante los tres das anteriores de la prueba.

- En nios el perodo de ayuno vara: as, en nios menores de cuatro meses basta un ayuno de 4 horas, entre cuatro y ocho meses hacen falta 6 horas de ayuno y entre ocho meses y dos aos , 8 horas.

- 0btener una muestra de sangre y por miccin voluntaria recoger una muestra de orina del paciente en ayunas (Basales).

- Administrar por va oral una solucin de glucosa al 25% (75 gr. en 300 ml), si se desea, puede mejorarse el sabor de la solucin con jugo de limn.

- Extraer muestras de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos. - Colectar muestras de orina a los 60 y 120 minutos. - Determinar la concentracin de glucosa en cada una de las muestras de sangre obtenidas,

conforme al mtodo Enzimtico. - Determinar cualitativamente la presencia de glucosa en las muestras de orina con el reactivo

cualitativo de Benedict. - En un papel milimtrado graficar los resultados obtenidos de glicemia en cada muestra, contra el

tiempo. - Durante la prueba, el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debe fumar. La prueba

de tolerancia puede ser modificada por el ejercicio, fiebre, enfermedades agudas y estados posttraumticos.

CIFRAS NORMALES

La tolerancia normal de la glucosa y sus posibles variaciones se muestran en el siguiente cuadro:

Determinacin Basal IC. IIC. IIIC. Tiempo Ayunas 30 min. 1 hr. 2 hrs.

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Glucosa sangre mg/dl 70- 110 < 200 < 200 < 140 Glucosa en orina no hay no hay no hay no hay

OBSERVACION: En caso de realizar esta prueba en nios, se recomienda la administracin de 1.75g por kilo de peso.

IV. CUESTIONARIO:

1. Describa y explique usted el comportamiento de la curva de tolerancia a la glucosa, a los

30, 60, 90 y 120 minutos. 2. Qu efecto producir en la curva de tolerancia a la glucosa, un estado de tirotoxicosis y

en el Sndrome de mala absorcin intestinal? 3. Si a los 30 min. en la prueba de tolerancia a la glucosa usted obtiene una glicemia de 185

mg % Cmo explicara este hecho? Existira o no glucosuria? 4. Qu recomendaciones, sobre dieta y actividad fsica, indicara usted a un paciente al que

se le va a aplicar una prueba de tolerancia a la glucosa? 5. Diga cmo influye sobre la curva de tolerancia a la glucosa: algunos desrdenes

endocrinos y algunas drogas farmacolgicas. Diga as mismo cmo influye el embarazo. 6. En que casos indicar al paciente realizar una Prueba de Tolerancia a la glucosa? 7. Qu es el dintel renal a la glucosa? 8. Explique las relaciones que puede establecer entre los resultados de la curva de tolerancia

a la glucosa y la determinacin de glucosa en orina.

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PRACTICA N 10

DETERMINACIN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA Y SU DIFERENCIACIN DE OTRAS SUSTANCIAS REDUCTORAS EN ORINA

I. INTRODUCCION:

En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azcares en orina. Sin embargo, es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0,5 y 1,5 g/l. Loa azcares forman ms o menos la dcima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad est constituda por glucosa.

La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales, y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina, pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del rin para reabsorverla (dintel renal). Cuando la capacidad de reabsorcin renal disminuye, la glucosa en orina aparece aunque sta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes inspida). Por el contrario, cuando existe insuficiencia renal (menor filtracin) no aparece glucosa en la orina aunque la concentracin de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. En la orina, adems de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos sealar: a) Otros azcares reductores: lactosa, fructosa, galactosa y pentosas. b) Otros compuestos orgnicos: cido homogentsico, creatinina, cido rico, cido glucurnico, cido

ascrbico. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato, cloral, formaldehdo, etc. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina, pero como anotamos ste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carcter inespecfico. La glucosa puede ser determinada de manera especfica utilizando como reactivo bsico la glucosa oxidasa (mtodo enzimtico), de uso generalizado en clnica. La prueba est basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxgeno, por accin de la glucosa oxidasa produce cido glucurnico ms perxido de hidrgeno. Este, en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) ms agua. La glucosa oxidasa, en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de ste 2 iones hidrgeno (2H+) formando gluconolactona), el cual es hidratado a cido glucnico. Los iones hidrgeno removidos se combinan con el oxgeno atmosfrico y forman perxido de hidrgeno (H2O2 ). El perxido de hidrgeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, utilizando un mtodo especfico a base de glucosa oxidasa y otro inespecfico en base al reactivo de Benedict.


- Reactivo de Benedict. - Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly).

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

Determinacin de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. 1. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. 2. Llevar al bao de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1

min.Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del lquido contenido en el tubo. 3. Agitar para evitar que el lquido se proyecte hacia fuera del tubo. 4. Agregar orina problema: 5 gotas. 5. Colocar en bao de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullicin por 1 min.

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6. Observar si hay cambio de color y precipitado. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo, la reaccin demuestra la presencia de sustancias reductoras.

Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente determinacin con la misma muestra de orina. Determinacin enzimtica de la glucosa en orina (Mtodo de la glucosa oxidasa). Procedimiento:

1. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recin emitida

contenida en un depsito de 5- 10 ml. 2. 0bservar si a los 60 segundos, despus de humedecida la cinta, adquiere o no color azul. 3. Compare la intensidad de la coloracin azulada con una escala adjunta que representa

aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.

IV. CUESTIONARIO:

1. Diga usted qu resultados posibles se dara al tratar una muestra problema de orina, primero

con el reactivo de Benedict y luego por el mtodo de la glucosa oxidasa. 2. Qu presunciones planteara usted si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de

Benedict da resultado positivo, y sin embargo al ser tratada con el mtodo de la glucosa oxidasa da negativo?

3. Explique usted por qu el reactivo de Benedict es inespecfico para determinar glucosa? 4. Ante una prueba positiva de glucosa en orina: Qu presunciones en relacin a la glicemia del

paciente podra usted plantear? 5. Diga usted el fundamento del reactivo de Benedict y de la glucosa oxidasa. 6. Diga Usted en que casos obtendra resultados falsos negativos utilizando la prueba de la glucosa

oxidasa?

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PRACTICA N 11

DEMOSTRACIN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIN DE LA LIPASA

PANCRETICA SOBRE LOS TRIGLICRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES

I. INTRODUCCION:

Los triglicridos son los principales lpidos de la dieta. En el estmago ocurre la accin de la lipasa gstrica y la licuefaccin de la masa de lpidos de los alimentos por contracciones peristlticas. La principal digestin ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lpido y su velocidad depende del rea de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristltico del intestino combinado con la accin emulsificante de los cidos biliares. Los cidos biliares son molculas amfipticas sintetizados por el hgado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancretica (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrlisis de los triglicridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con cidos grasos. La actividad enzimtica de la lipasa pancretica se incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-lquido, un fenmeno conocido como activacin interfacial. La unin a la interfase agua-lquido requiera la colipasa, una protena de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancretica (449 residuos), con cambios conformacionales que forma una superficie hidrofbica y deja libre el centro activo. La alteracin en la digestin o absorcin de las grasas produce esteatorrea

La finalidad de la prctica es demostrar la accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos y el efecto de las sales biliares.


- Cloroformo - Aceite vegetal, de olivo - Solucin de sales biliares - Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 - Emulsificacin de aceite vegetal - Solucin de fenolftaleina (Solucin alcohlica) - NaOH 0.1N

III. PROCEDIMIENTO

Accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm.


COMPONENTES Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Aceite de olivo(gotas) 3 3 3

Agua destilada (ml) 5 3 -

Cloroformo (ml) - - 2

Sales Biliares (ml) - 2 -

Agitar enrgicamente los tubos

Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos

III UNIDAD

METABOLISMO DE LIPIDOS

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Accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos y efecto de las sales biliares sobre la reaccin enzimtica utilizando tubos de 20 25 x 150 mm.

COMPONENTES (ml) TUBOS I II III IV

Emulsificacin de aceite vegetal - 3 3 3 Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 2 2 2 2 Solucin de sales biliares 1 % 2 2 - 2 Solucin de extracto pancretico 1 % 2 - 2 2 Agua destilada 3 2 2 - Mezclar los 4 tubos y llevar al bao mara a 37 C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubacin retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftalena. Mezclar bien y luego realizar la titulacin. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparicin de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretacin.

IV. CUESTIONARIO:

1. Haga un esquema de la estructura de las sales biliares 2. Explique Ud. el mecanismo de accin de las sales biliares 3. Explique la accin de la lipasa y la colipasa 4. Cules son los productos de la accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos? 5. Cul sera el efecto de la falta de sales biliares?

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PRACTICA N 12

IDENTIFICACIN Y DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA

I. INTRODUCCION:

La beta oxidacin de los cidos grasos en el hgado, a nivel mitocondrial, produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la sntesis de cuerpos cetnicos (cetognesis). Estos son el cido acetoactico, el cido beta hidroxibutrico y la acetona. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energa en los tejidos extrahepticos como el corazn y el msculo esqueltico, incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. Los cuerpos cetnicos son eliminados por la orina y la acetona tambin por la respiracin. Su concentracin normal en orina es de 125 mg/ 24 horas, y en sangre hasta 1mg/dl. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiolgicas como el ayuno prolongado, en 1a dieta pobre en carbohidratos.. En condiciones patolgicas como la Diabetes mellitus, el hiperinsulinismo, en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis, en los vmitos, en el sndrome de Fanconi, en toda hipercatabolia como la fiebre, hipertiroidismo. En la Diabetes mellitus, el aumento de la liplisis, de la beta oxidacin y de la cetognesis, al superar la capacidad de oxidacin de los tejidos extrahepticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetnicos. Dado que stos son cidos se produce acidosis metablica, la denominada cetoacidosis diabtica. El diagnstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinacin en sangre y/u orina.

II. REACTIVOS

- Sulfato de amonio, cristales. - Nitroprusiato de sodio, solucin al 10% en H2O - Cloruro Frrico, solucin al 5% en H2O.

III. PROCEDIMIENTO

INVESTIGACION DE ACETONA

Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetnicos, especialmente de acetona, rinde un color azul violeta. Procedimiento:


COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amonaco (agregar lentamente por las paredes del tubo, sin mezclar) 1ml

_________________________________________________________________________ Prueba de Rothera

Es otra variante, se hace utilizando nitroprusiato en polvo, de la siguiente manera: En una lmina de porcelana con excavaciones colocar 0.2 g de reactivo slido de nitroprusiato de sodio en cada excavacin. Diluir la orina al 1/10, 1/20, 1/30, etc. Agregar una gota de cada una de las diluciones en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. Observa la mxima dilucin de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar el denominador de la dilucin alcanzada por 10 y se tendr la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml.

Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reaccin positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentracin mnima de 10 mg% de acetona y por eso, para calcular la concentracin en orina diluida, se debe multiplicar por 10 el nmero de veces que se ha diluido sta.

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Este mtodo con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguneo, para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuanta.

Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Esperar 20 segundos, leer en

escala colorimtrico, estimando la concentracin como negativo, 5, 15, 50, 150 mg/dl.

INVESTIGACIN DE ACIDO ACETOACETICO

Prueba de Cloruro Frrico o de Gerhart. Se basa en que en presencia de cloruro frrico, el cido acetoactico rinde una coloracin rojo burdeos.

Procedimiento (Se utiliza orina filtrada):

COMPONENTES TUBO

Orina filtrada 5 ml Cloruro Frrico, solucin 5% en agua gota a gota hasta la aparicin del Color rojo burdeos si existe cido Acetoactico

IV. CUESTIONARIO:

1. Hacer un esquema de la sntesis y degradacin de los cuerpos cetnicos 2. Importancia energtica de los cuerpos cetnicos 3. Causas de aumento de los cuerpos cetnicos 4. Mtodos para la determinacin de los cuerpos cetnicos 5. Importancia de la cuantificacin de los cuerpos cetnicos

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PRACTICA N 14

DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO

I. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas, regulando su fluidez. A partir de l se forman los cidos biliares y las hormonas esteroideas. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterognica, y el resto en la VLDL y HDL. Los triglicridos an ayunas circulan unidas a las VLDL.y son fuente de energa para los tejidos., su incremento tambin es considerado factor de riesgo coronario. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol.de los tejidos hacia el hgado y es considerada antiaterognica .El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol, el HDL, y el LDL. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limtrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40, normal a 40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL colesterol, 5 niveles: ptimo < 100 mg/dl, En los triglicridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limtrofe de 150 a 199, Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499, severa 500 o ms La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las hipercolesterolemias primarias se sealan: La hipercolesterolemia familiar, la hipercolesterolemia polignica, la hiperlipidemia familiar combinada, la disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el lipoteroidismo, el sndrome nefrtico, ictericia obstructiva, cirrosis biliar.. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares, o secunadrias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias primarias, la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia, l ahipertrigliceridemia familiar. Son causas secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota, el alcoholismo, el uso de anticonceptivos orales, etc.. La hipertrigliceridemia se asocia a disminucin de HDL, obesidad central, resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensin, en el denominado sndrome metablico. En la presente prctica, se realizar la determinacin de colesterol sanguneo, por el mtodo enzimtico y la determinacin de HDL, previa precipitacin de las otras lipoprotenas.

II. REACTIVOS:

- Reactivo enzimtico para la determinacin de colesterol. - Reactivo precipitante de HDL. - Reactivo enzimtico pra la determinacin de triglicridos

III. PROCEDIMIENTO

DETERMINACIN DE COLESTEROL SANGUNEO

Armar el siguiente sistema: utilizando tubos de 15 x 125 mm.

Componente Blanco Problema Estndar

Suero 10 ul

Estndar 200 mg/dl 10 ul

Reactivo enzimtico 1 ml 1 ml 1 ml

Incubar a 37 por 10 min. Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolormetro. Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar. Luego calcular el Factor (F): 200 mg/dl

F = ------------------------------ Absorbancia del standar

Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)

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DETERMINACIN DE HDL-COLESTEROL (HUMAN)

En un tubo de prueba medir 0.50 ml de reactivo precipitante y agregar 0.25 ml de muestra de suero. Mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Usar el sobrenadante lmpido como muestra de la siguiente forma:

Sobrenadante 100 ul Reactivo de trabajo 1 ml Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Retirar del bao y enfriar. Leer en espectrofotmetro a 505 nm. CALCULOS:

HDL Colesterol (mg/dl) = Absorbancia Desconocido x 180

DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS Armar el siguiente sistema:

Componentes blanco problema Estndar

Suero 10ul

Estndar 10ul

Reactivo enzimtico 1ml 1ml 1ml

Incubar a 37 por 5 min. Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolormetro. Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar. Luego calcular el Factor (F): 200 mg/dl

F = -------------------------------- Absorbancia del standard

Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)

DETERMINACIN DEL LDL Aplicar la frmula de Friedwald:

LDL = Colesterol Total ( HDL + TG/5 )

IV. CUESTIONARIO:

1. Seale la importancia del colesterol. 2. Seale los valores de referencia del Colesterol, HDL-Colesterol y LDL-Colesterol. 3. Causas de hipercolesterolemia. 4. Importancia del HDL como antiaterognico. 5. Importancia de la LDL como aterognico. 6. Haga un esquema de la estructura de los triglicridos. 7. Causas de hipertrigliceridemia. 8. Explique por qu la hipertrigliceridemia es un factor de riesgo coronario

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PRACTICA N 15

DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA

I. INTRODUCCION:

La digestin de la protena, o degradacin hasta aminocidos en el tubo digestivo, es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteoltica Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gstrico: pepsina y renina; b) de origen pancretico: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Son endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es especifica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxlico de residuos de aminocidos bsicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es especfica para los enlaces peptidicos de los aminocidos sin carga como los aromticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos pequeos, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptdico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. La falta de enzimas proteolticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia congnita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activacin de quimotripsingeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento.

La presente prctica tiene como finalidad demostrar la accin hidroltica de las enzimas digestivas contenidas en el pncreas sobre la casena o protena de la leche, determinando los productos (aminocidos) con ninhidrina

II. REACTIVOS.

- Casena al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.0 - Buffer fosfato 0,1 M pH 8.0 - Solucin de extracto pancretico. - Solucin acuosa de ninhidrinan al 0,25% saturada con butanol. - Acido tricloroactico al 10%.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento


COMPONENTES (ml) I II III

Casena al 1% Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 Solucin de extracto pancretico Agua destilada

1 1 1 ---

1 1 --- 1

--- 1 1 1

Pasos:

* Mezclar y colocar al bao de agua a 37C por 30 minutos.

IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO

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* Despus del tiempo de incubado tomar alcuotas de 0,5 ml, de cada uno de los tubos de incubacin y trasladarlos a otro sistema numerado (I, II, III).

* A cada uno de los tubos del paso anterior agregar 1 ml de solucin de ninhidrina. * Mezclar y llevar a un bao de agua hirviendo (franca ebullicin), durante 3 a 5 minutos. * Observa los cambios de color de cada tubo. * A los tubos de incubacin agregue gota a gota 1 ml de cido tricloactico al 10% agitando

continuamente. * Observe las variaciones que se produce en cada tubo.

IV. CUESTIONARIO:

1. Seale las enzimas digestivas pancreticas y los sustratos sobre los cules acta. 2. Cmo se explica los cambios de color, despus de la reaccin con ninhidrina en un sistema donde

se produce digestin de las protenas? 3. Qu efecto tiene el cido tricloroactico sobre las protenas? Qu variaciones se obtienen en un

sistema de digestin de protenas, despus de agregar cido tricloroactico?

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PRACTICA N 16

CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS

I. INTRODUCCION: Las protenas plasmticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulacin, excrecin, conservacin del equilibrio cido bsico, regulacin del equilibrio hdrico, defensa contra las infecciones, transporte, regulacin del metabolismo, etc. El origen de las protenas plasmticas es heptico con excepcin de las globulinas gamma que se forman en las clulas plasmticas. Las protenas plasmticas por mtodos qumicos se clasifican en albmina, globulina y fibringeno. En el suero solo se encuentran albmina y globulina. Las fracciones globulnicas contienen varias protenas especficas: inmunoglobulinas, haptoglobina, la transferrina, ceruloplasmina, etc.; que se pueden determinar por electroforesis, inmunodifusin o inmunoelectroforesis. La concentracin srica de las protenas totales es de 6.1 a 7.9 g/dl de las cuales albmina es: 3.5 a 4.8 g/dl y globulinas: 2.6 a 3.1 g/dl. Las cifras de protenas plasmticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentracin; con inversin de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma mltiple, en la macroglobulinemia de Waldenstrm, en el kala-azar, en las colagenopatas, etc La disminucin de protenas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez estn acompaadas con pequeos cambios en las globulinas. Los bajos niveles de albmina pueden ser debidos a: incrementadas prdidas de albmina en la orina, disminucin de la formacin en el hgado como en la cirrosis, insuficiente ingestin de protena., en la gastroenteropata exudativa con prdidas fecales de protenas. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros.

La presente prctica tiene por finalidad determinar las concentraciones sricas de protenas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patolgicos, por el mtodo colorimtrico.

FUNDAMENTOS DEL METODO

Determinacin de Protenas Totales: Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con mximo de absorcin a 540nm., cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra. Determinacin de Albmina: La albmina reacciona especficamente sin separacin previa con la forma aninica de la bromocresolsulfon ftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm, respecto del Blanco del reactivo, es proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra.

II. REACTIVOS A UTILIZAR. (WIENER) - Reactivo EDTA/Cu - Reactivo Bromocresol verde.


Determinacin de Protenas Totales

CONDICIONES DE REACCIN - Longitud de onda: 540nm en espectrofotmetro

- Temperatura de reaccin: 37C. - Tiempo de reaccin: 15 minutos. - Volumen de muestra: 10 ul.

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- Volumen de Reactivo Biuret: 1.0ml. - Volumen final de reaccin: 1,1 ml.

En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D

Suero Patrn - 10 ul -

Muestra - - 10 ul.

Reactivo Biuret 1,0 ml. 1,0 ml. 1,0 ml.

Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm. En fotocolorimetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de Reactivo.

PROCEDIMIENTO II (Laboratorio Linear Chemicals)

En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D


Muestra - - 20 ul.

Reactivo Biuret 1,0 ml. 1,0 ml. 1,0 ml.

Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm. En fotocolorimetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de Reactivo.

CONDICIONES DE REACCIN: - Longitud de onda: 620 nm. en Espectrofotmetro

- Temperatura de reaccin: 15-28C. - Tiempo de reaccin: 5 minutos. - Volumen de muestra: 10 ul. - Volumen de Reactivo BCG: 3.5 ml. - Volumen final de reaccin: 3.51 ml.

En tres tubos de ensayo marcados B(Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D


Muestra - - 10 ul.

Reactivo BCG 3.5ml. 3.5 ml. 3.5 ml.

Mezclar, mantener los tubos entre 15 y 28C durante 5 minutos. Leer en espectrofotmetro a 620 nm llevando a cero con el blanco de reactivo. CALCULOS DE LOS RESULTADOS: Protenas Totales (g/dl) = (D - B) x F Albmina: (g/dl) = (D - B) x F Globulina: = Prot. Totales Albmina Relacin A/G = Albmina (g/dl) .

PROCEDIMIENTO I (Laboratorio Wiener) :

Determinacin de Albmina.

PROCEDIMIENTO (Laboratorio Wiener):

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PT (g/dl) Alb. (g/dl)

IV. CUESTIONARIO:

1. Qu importancia clnica tiene la determinacin de las protenas sricas totales y las fracciones albmina y globulinas?

2. Qu importancia tiene determinar la relacin albmina/ globulina, en clnica? 3. En qu se basa la determinacin de las protenas totales y fraccionadas en nuestro

experimento? 4. Qu importancia clnica tiene el diverso origen de las protenas sricas? 5. Qu presunciones diagnsticas de laboratorio planteara usted en base a sus resultados

obtenidos?

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PRACTICA N 17

DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LAS PROTEINAS EN ORINA

I. INTRODUCCION:

La orina normal contiene una pequea cantidad de protenas solubles (albminas, algunas enzimas, etc.); la cantidad es pequea alcanzando mximo de 150 mg en orina de 24 horas, es decir, menos de 10 mg/dl. Las protenas son casi completamente absorbidas en los tbulos. Cuando el glomrulo es injuriado por enfermedad, molculas proteicas de variado tamao incluyendo las ms largas, escapan en el filtrado de forma que los tbulos son incapaces de captar la gran cantidad de protenas y resulta una masiva proteinuria. Las protenas de peso molecular relativamente bajo y de pequeo tamao pasan primero a travs de los glomrulos injuriados, por ejemplo la protena de Bence Jones, hemoglobina, albmina; luego las globulinas. La proteinuria puede ser renal o extrarremal. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa, glomerulonefritis focales proliferativas, sndrome nefrtico, nefropata diabtica, nefropata lpica, nefropata txica, en la eclampsia, tuberculosis renal, rin poliqustico etc . Extrarrenal: proteinuria ortosttica, gravdica, febril, mieloma mltiple. La proteinuria fisiolgica (proteinuria ortstatica) se presenta despus de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posicin de pie, sin que exista evidencia de lesin renal. En el mieloma mltiple y macroglubinemia de Waldestrom, aparece la protena de Bence Jones. La protena de Bence Jones est constituda por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la protena Monoclonal. La presente prctica tiene por finalidad determinar la presencia de protenas en la orina y de cuantificarlas en caso que estn presentes en casos normales y en estados patolgicos.

II. REACTIVOS A UTILIZAR.

- Acido tricloroactico, 12,5% (en agua destilada) - Cloruro de sodio 0,85%. - Standard de protena: Pueden usarse suero claro normal de concentracin conocido o un suero

control adquirido comercialmente. Se diluye con cloruro de sodio 0,85% a una concentracin final de 25 mg/ml. Esta dilucin debe ser preparada el mismo da.

- Acido actico al 2%.


DETERMINACIN CUALITATIVA DE LAS PROTENAS EN ORINA:

Coagulacin por el calor.

COMPONENTE (ml) TUBO

Orina previamente a filtrada 5,0 Someter a ebullicin. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de protenas o fosfatos. Aadir: Solucin de cido actico al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez, se trata de fosfatos que se han disuelto en medio cido. Si la turbidez desaparece o se ha hecho ms intenso o se forma un precipitado, se trata de protenas.

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS EN LA ORINA:

Mtodo turbidimtrico de Heavy.

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En tres tubos marcados previamente agregar:

COMPONENTES (ml) /TUBOS I II III

Solucin standard de protena Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroactico 12,5%

4,0 4,0

- 1,0

- - -

1,0

-

4,0 1,0

Dejar reposar 5 a 10 min. y leer en fotocolormetroa 420 nm). Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).

NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina ------------------------------------ = protena total de orina de 24 H en mg.

mg/100 ml orina x 100

IV. CUESTIONARIO:

1. Cmo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no corresponde a protenas en orina?

2. Seale algunos tipos de protenas anormales que pueden ser encontradas en la orina. 3. En qu consiste el mtodo de Heavy para la determinacin de protenas 4. Seale algunas causas de proteinuria fisiolgica y patolgica.

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PRACTICA N 18

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA

I. INTRODUCCION:

La hemoglobina es una hemoprotena, tetramrica, con dos 2 subunidades alfa y 2 beta, cuya funcin es el transporte de oxgeno. Se sintetiza en la mdula sea por una va comn a la sntesis de porfirinas, que termina con la adicin del hierro por la ferroquelatasa. La concentracin normal es de 12 a 16 g/dl en mujeres y de 14 a 18 g/dl en varones en nuestro medio y al nivel del mar. El defecto enzimtico en algunas de las etapas de sntesis del grupo Hemo, da lugar a las diferentes tipos de porfirias. La disminucin de su sntesis de la hemoglobina, por diferentes causas, produce disminucin de su concentracin dando lugar a la anemia por menor produccin como en la anemia ferropnica, que tambin puede deberse a problemas en la maduracin de los glbulos rojos como la deficiencia de cido flico. Pero la hemoglobina puede tambin disminur por prdida de sangre como en las hemorragias o por hemlisis (anemias hemolticas). En este ltimo grupo, una causa pueden ser las hemoglobinopatas por defecto sea en la sntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminocido por otro como en la hemoglobina S. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su sntesis llevando a la policitemia, que puede tener tambin otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definicin de anemia en la concentracin de hemoglobina, de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones menor de 14 g/dl, en nios existe variacin con la edad. En la prctica mdica es por ello importante determinar la concentracin de la hemoglobina, que es sin duda uno de los exmenes ms solicitados

II. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS

- Cianometahemoglobina - tubos de vidrio - lancetas - pipetas

III. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES

Armar el sgte sistema

Componentes Tubo blanco Estndar Problema

Reactivo de Cianometahemoglobina

5 ml 5 ml 5ml

Estndar ------ 20 ul ---

Muestra ------- -------- 20 ul

Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm en espectrofotmetro contra el blanco Determinar el factor

F = concentracin del estndar / lectura del estndar

Determinar la concentracin de la muestra: Lectura problema x F

IV. CUESTIONARIO:

1. Haga un esquema de la sntesis de la hemoglobina sealando los defectos enzimticos y los tipos

de porfirias

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2. Cul es el criterio aceptado para la defincin de anemia? 3. Qu tipos de anemias conoce? 4. Cul es la anemia ms frecuente? 5. Seale algunas hemoglobinas anormales indicando el cambio de aminocido y la cadena en que se produce

PRACTICA N 19

DETERMINACION DE BILIRRUBINA

I. INTRODUCCION: Los hemates tienen una vida media de 120 das, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retculo endotelial. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem, ste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albmina. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albmina, despus de un proceso de captacin y conjugacin con dos molculas de cido glucurnico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa, se convierte en una forma soluble, denominada bilirrubina directa o conjugada, que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo; da color a las heces y ultrafiltra el glomrulo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. La concentracin sangunea de bilirrubina total es de 1 mg / dl, siendo en su mayora bilirrubina indirecta, que no se excreta por orina. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolticas o en los defectos congnitos de conjugacin, o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatas, donde el defecto limitante es la excrecin, o en las enfermedades extrahepticas obstructivas. La manifestacin clnica ms importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia, y el origen de esta alteracin obedece a causas de origen pre heptico, heptico y post heptico, que varan con la edad de presentacin y tambin en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reaccin inmediata con el diazorreactivo; la indirecta, slo reacciona despus de agregar alcohol a la mezcla. La finalidad de la presente prctica es determinar la concentracin total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia, por el mtodo de Malloy Evelyn, que utiliza el diazorreactivo de Erlich

II. REACTIVOS - Desarrollador o solvente - Reactivo sulfanlico - Nitrito de Sodio - Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanlico. Rotular y

fechar.

III. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el sgte sistema:

COMPONENTES Blanco Bilirrubina Directa Bilirrubina Total

Muestra de Suero 200 ul 200 ul 200 ul

Agua destilada 2,5 ml 2,5 ml

Desarrollador --- --- 2,5 ml

R. Sulfanlico 200 ul --- ---

Diazorreactivo --- 200 ul 200 ul

Mezclar de inmediato por inversin y leer a los 5 minutos a 540 nm en un espectrofotmetro

CALCULOS:

Bilirrubina total (mg/L) = (Abs. B. total - Abs. Bco) x F Bilirrubina Directa (mg/L) = Abs. B. Directa - Abs Bco.) x F

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Bilirrubina Libre (indirecta) = B. total - B. Directa

IV. CUESTIONARIO:

1. Haga un esquema del metabolismo de la bilirrubina 2. Cules son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3. Cules son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4. Por qu se denomina bilirrubina directa? 5. Cul es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recin nacido?

PRACTICA N 20

DETERMINACION DE CREATININA SERICA Y URINARIA

I. INTRODUCCION:

La creatina, precursora de la creatinina, aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por sntesis, aunque una pequea cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energa en la contraccin muscular. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente; la cantidad total depende de la masa muscular. La creatinina es fcilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. Es excretada fundamentalmente por el rin el cual clarifica el plasma de creatinina. La concentracin de creatinina en suero no es afectada por la dieta, catabolismo de protenas, edad, sexo o ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la funcin renal est muy alterada y aunque el mismo tipo de informacin acerca del diagnstico y pronstico se obtiene por la determinacin de nitrgeno ureico o creatinina, esta ltima determinacin se prefiere porque proporciona mayor informacin relacionada con el estado de la funcin renal, ya que los niveles de creatinina srica dependen del grado de excrecin, siendo la produccin endgena constante. El suero es depurado de creatinina en el rin por filtracin glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. La concentracin normal en suero vara de 0,5 a 1,4 mg /100 ml. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. La determinacin de creatinina tiene utilidad en la prctica mdica para la evaluacin de la funcin renal, la cual puede alterarse por diversas causas; las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardaca; renal, como las glomerulonefritis o la n

Manual de Practicas Laboratorio BQ

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