Manual de Practicas de Termobacteriologi(1)

8/17/2019 Manual de Practicas de Termobacteriologi(1)

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PRÁCTICAS DE TERMOBACTERIOLOGÍA

Queda prohibida su reproducción total o parcial por

cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor

ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERAPh.D., D.E.A. Ciencia y Tecnología de alimentos

Especialista en Protección de AlimentosMicrobiólogo

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICASDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍAPAMPLONA – NORTE DE SANTANDER

COLOMBIA2011

©


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Guías Unificadas de Laboratorio de Termobacteriología

Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D

Código FLA-23 v.00

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Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2011

INTRODUCCION

La Termobacteriología surge como una disciplina alternativa a la microbiología de los alimentoscon el fin de entender los fundamentos que el uso del calor acaece sobre los microorganismos ylos propios alimentos, así mismo busca desarrollar y aplicar nuevas metodologías que permitanelaborar y asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. La determinación de la vida útil deun alimento puede establecerse de diversas maneras, algunas de ellas resultan ser un tantoortodoxas por cuanto no aplican una metodología científica y los resultados obtenidos son frutode la experiencia y la cotidianeidad, en otros casos la vida útil suele establecerse sobre la basede datos teóricos o sobre referencias bien sean a partir de fuentes bibliográficas o por

observación de los tiempos de vida útil de productos similares que se encuentran en elmercado.A través de este manual se explicaran las diferentes herramientas que pueden usarse de formaexperimental para obtener resultados confiables en cuanto a la determinación de los diferentesbaremos de termodestrucción, así como al cálculo de los tratamientos térmicos sin que afectenen gran medida los valores nutricionales y cualitativos de los alimentos. Se pretende que laspersonas que consulten esta obra adquieran los conocimientos fundamentales que les permitadesempeñarse de la mejor forma en esta área del que hacer científico aplicado a laagroindustria.


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NORMAS DE SEGURIDAD

La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la saluddel personal frente a riesgos por agentes, biológicos, químicos y/o físicos en las áreas detrabajo del laboratorio, así corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalacionesdonde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO YORDENADO que permita alcanzar la productividad óptima.

Reglas básicas de seguridad:

• Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso

de cofia y tapabocas).• No permitir el acceso a las áreas de trabajo sin la debida precaución. Respetar las áreas de

acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamenteesterilizados con radiación ultravioleta.

• Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón• Flamee el asa antes y después de usarla.• El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica

es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales paraeste propósito son la lejía y el alcohol (etanol 96º), o una solución de hipoclorito a 15 - 20

ppm.• Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los

desplazamientos innecesarios con el asa bacteriológica cargada con algún microorganismopor el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoleso producir accidentes.

• Durante las prácticas está prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle.• Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz,

ojos, etc.• No portar maquillaje o aplicarse cosméticos en el laboratorio.• Emplear pipeteadores para la transferencia de volúmenes y colocar algodón, está prohibidopipetear soluciones con la boca (reactivos, sueros y soluciones en general).• Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la

práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.• Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados. Estos

recipientes serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero oa la basura común.

• Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.• El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas

instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas lasllaves de paso de gas al finalizar la práctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y


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revisar periódicamente las conducciones.• En las prácticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la

exposición a este tipo de radiación es peligrosa, ya que tiene poder mutagénico. Por tanto,nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquierzona de la piel expuesta a la radiación (gafas, guantes, máscaras, etc.).

• En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) secomunicará inmediatamente al instructor.

• Trabaje solamente en su puesto.• Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen.

Incube en el lugar asignado por el instructor.• Al terminar cada sesión de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que

no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregándolos al instructor y/omonitor.

• Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorización delinstructor.

• No se toque la cara con las manos ya que los dedos y las uñas se contaminan fácilmente,llevando gérmenes patógenos.

• Los cultivos microbianos empleados para las prácticas solo se deben abrir durante elmomento de ser usados.

• Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por

fuera de la blusa).• Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminación de

desechos sólidos, incluyendo agujas hipodérmicas, que deben colocarse en envasessellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de sueroque se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, debenautoclavarse antes de su eliminación final.

• Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones.• Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparación, concentración y personal

que elaboró. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que

indique claramente el contenido y las fechas de preparación y vencimiento. Los tubos,medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma talque incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo.

• Almacenar las sustancias volátiles en envases adecuados, ventilados y fríos.• Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores• Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, así

como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias cáusticas.• Todas las sustancias corrosivas o cáusticas deben designarse con una etiqueta de color

brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que

se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminaciónreal y después de ella.


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• Todo el equipo eléctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse lapreocupación de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos húmedas o sinconocer adecuadamente su funcionamiento.

• En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones eléctricas y artefactosdomésticos, como cafeteras o calentadores eléctricos.

• El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque eléctrico conel uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparación mientras el dispositivo estaconectado con el circuito eléctrico.

• Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de sucontenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.

Recomendaciones antes y durante la práctica:• Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la práctica que va a

realizar.• Llegue a tiempo para la práctica, evite interrupciones.• Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda.• Marque todos sus cultivos y especímenes del estudio siguiendo las indicaciones del

instructor. Dicha marcación debe contener por lo menos:⇒ Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos al

experimento como temperatura, medio de cultivo, tiempo de incubación y otros que

considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura• Para estos rótulos usar marcador de vidrio, rótulos adhesivos o escriba en cinta de

enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio.• No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla,

jabón, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, deDriglasky y todo lo demás que considere necesario.


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NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prácticas el nivelde riesgo, sin embargo de forma genérica para las actividades escritas en este manual se hadefinido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismosconsiderados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio puedenconllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docenteque oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deberá usar los siguientesequipamientos:

• Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantalón Largo

Nota 1: el docente será el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritosanteriormente.Nota 2: cada estudiante deberá portar un kit de trabajo conteniendo mínimo los siguienteselementos:

• Pipeteador, Tijeras, Cinta de enmascarar, Marcador para vidrio, Jabón líquido, en polvoo en barra antibacterial, Toalla absorbente, Porta y Cubre objetos, Guantesdesechables de látex, Gasa, Algodón, Asas de platino redonda, recta y de Driglasky

(hockey), encendedor o fósforos.


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ACTIVIDAD 1. ESCALDADO DE VEGETALES: TUBÉRCULOS, FRUTAS,

HORTALIZAS

1.1. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de: Observar el efecto de un tratamiento térmico suave, ideado para inactivar enzimas,

sobre la flora banal pero deteriorante, presente en los tejidos vegetales tanto de frutascomo de hortalizas.

Comparar y analizar el efecto de diferentes tratamientos térmicos, manejando variablesde tiempo y temperatura, sobre el mismo vegetal, para llegar a una conclusión acercadel tratamiento más indicado para dicho vegetal.

1.2. MARCO TEÓRICO

Cuando se cortan ciertas frutas o verduras y la superficie entra en contacto con el aire, enunos minutos adoptan un color oscuro. Es lo que se conoce como pardeamiento enzimático,una alteración que se manifiesta con la formación de colores oscuros y la pérdida de sabor,e incluso, de contenido nutricional. Por este motivo, se convierte en un problema paraproductos como frutas y hortalizas, así como para la industria del vino, ya que produce

alteraciones en el color que reducen su valor comercial o lo hacen inaceptable para elconsumidor.

Los colores característicos del pardeamiento son muy variados, desde marrones, hastarojizos, dorados o negros, en función del alimento y de las condiciones del proceso deproducción. Además de la alteración del color, los productos secundarios que se formanpueden reaccionar con las proteínas, que insolubilizan, lo que contribuye a una pérdidanutricional de vitamina C, entre otras.

1.2.1. Pardeamiento enzimático: es una reacción de oxidación que produce un determinadogrupo de enzimas y que afecta a casi todos los seres vivos. En los alimentos, estefenómeno se da al cortar algunas frutas como las manzanas, duraznos, banano, pera uotros vegetales como los espárragos o la papa. Al cabo de pocos minutos, la superficiecortada se vuelve más oscura. Esto se debe a la acción de enzimas denominadaspolifenoloxidasas que, en condiciones de humedad, producen una oxidación de loscompuestos que dan color a los alimentos. En las frutas, oxidan ciertos fenoles e introducenátomos de oxígeno en su composición. Esto provoca que los fenoles se conviertan enquinonas, que causan los pigmentos marrones, rojos y negros que se aprecian.

1.2.2. Pardeamiento no enzimático: es el resultado de reacciones originadas por loscompuestos que contienen azúcares reductores y los compuestos proteicos. Éstas


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conducen a la formación de polímeros oscuros, en algunos casos deseables, como losdestinados a los aromas de los cárnicos sintéticos o del café tostado. Sin embargo, en lamayoría de los casos, estas reacciones conllevan alteraciones organolépticas y pérdidas delvalor nutritivo. Las rutas para lograr el efecto del pardeamiento son varias, aunque la másconocida es la acción del calor. La química de todas ellas está relacionada con la Reacciónde Maillard , que es el resultado de la unión de los azúcares con las proteínas. Estacombinación provoca cambios irreversibles en las propiedades, tanto químicas comofisiológicas, de las proteínas.

La acumulación de pigmentos de un color marrón indica que la reacción se ha producido enalimentos que contienen hidratos de carbono y proteínas. Uno de los usos más extendidos

de este tipo de reacción se encuentra en la industria láctea, en la que se emplea comoindicador de un excesivo procesado térmico. Cuando la reacción de Maillard avanza, puedeseguir diferentes rutas que variarán en función de las condiciones ambientales, del pH y dela temperatura. Una de las posibilidades es que aparezca la caramelización, llamadatambién pirolisis, una reacción de oscurecimiento que tiene lugar cuando los azúcares secalientan por encima de su punto de fusión. Su utilización más importante se da en laproducción de caramelos comerciales. Esta reacción se ve favorecida por condicionesalcalinas o ácidas y puede ser conveniente o perjudicial para la calidad de un productoalimentario. Prevenir que se desarrolle pasa por aplicar en el proceso una elevadatemperatura, además de almacenar los alimentos a bajas temperaturas.

1.2.3. El escaldado: es en resumidas cuentas, una breve cocción en agua o vapor de agua,que se suele aplicar como un tratamiento previo a cualquier procedimiento industrial detransformación y/o conservación de vegetales.Este proceso tiene como finalidad básica la inactivación térmica de las enzimas autolíticasnaturales del vegetal, para que no intervengan en el deterioro del mismo y así evitarcomplicaciones en etapas posteriores en una línea de producción. Sin embargo, ademáscontribuye con una serie de efectos benéficos para el producto, tales como:• Eliminación del oxígeno y otros gases de los espacios intercelulares del tejido, para

reducir las reacciones de oxidación (corrosión de envases, alteraciones sensoriales,etc.) y la presión interna de los botes en la esterilización.

• Ayuda a fijar el color natural del vegetal.• Completar el lavado del producto, reduciendo de la misma manera la contaminación

química, así como también reduce la carga microbiana banal. Esto último comoconsecuencia del tiempo y la temperatura empleados.

• Ablandar el tejido vegetal de modo que pueda soportar sin fracturas ni daños,posteriores manipulaciones (por ejemplo habichuelas y espárragos) y reducir suvolumen aparente (por ejemplo espinacas, lechugas y otras hojas) para hacer posible

su acondicionamiento y embalaje.• En los casos de frutas que van a ser congeladas o deshidratadas y así serán


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comercializadas; este proceso aumenta la permeabilidad de las paredes celulares loque incrementa la velocidad de deshidratación y facilita la posterior rehidratación.

• Limpiar los sabores acres (como en la col) y eliminar algunos pigmentos indeseables.

1.2.3.1. Coadyuvantes del escaldado: El efecto del calor puede ser acentuado por medio desustancias químicas, para mejorar su efecto sobre el vegetal. El tratamiento térmicodebe ser lo suficientemente elevado para inactivar enzimas y lo suficientemente suavecomo para no alterar el tejido vegetal. En algunos casos éstas sustancias protegen alvegetal. Las siguientes son algunos ejemplos de estas sustancias denominadas“coadyuvantes del escaldado”:• Sal: eleva la presión osmótica del medio sensibilizando las bacterias.

• Ácido ascórbico: fuerte antioxidante que regulas las reacciones oxidativas dedeterioro.

• Ácido cítrico: acidulante fuerte, reduce el pH lo que sensibiliza a las enzimas y depaso a los microorganismos.

• Sal soluble de calcio: endurece el tejido de algunos vegetales (trozos de manzana,tomate, etc.) por su reacción con las pectinas.

• Carbonato de sodio: protege a la clorofila, pero afecta la tiamina y la vitamina C.• Fosfatos: reducen la oxidación de los carotenos.• Sulfitos: evita el pardeamiento enzimático durante la deshidratación.

1.2.4. Enzimas alterantes de los alimentos: como hemos mencionado, el principal papel delescaldado es la inactivación de enzimas que alteran el producto, sin interesar su origen.Estas enzimas alterantes puede ser tanto endocelulares como exocelulares y puedenprovenir del tejido vegetal o enzimas microbianas, las cuales pueden actuar a pesar de quelos microorganismos se hallen destruidos. Las enzimas dañinas se pueden clasificar en tresgrupos, así:

• OXIDATIVAS: Son poco específicas y alteran, generalmente, al mismo tiempo elcolor, aroma y otros caracteres del producto. Son las más termorresistentes.

Ejemplos:• Catalasa: H2O2 → H2O + 1/2O2 • Peroxidasa: H2O + 2AH → 2H2O + 2A

Deshidrogenación directa

• HIDROLÍTICAS: Originan la formación específica de olores o sabores indeseables.Como ejemplos encontramos:

• Lipasas: que generan ácidos grasos libres.• Proteasas: péptidos amargos, malos olores.• Amilasas: sabores azucarados.• Pectinohidrolasas: modifican la textura del producto.


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• Enzimas metabólicas naturales: producen etanol a partir de los azúcares.

• ALTERADORAS DEL COLOR: Específicamente contribuyen con modificar el colorde los productos.

• Polifenoloxidasas: pardeamiento enzimático.• Clorofilasas: degradan la clorofila.• Lipoxidasas: oxidan los beta carotenos.

1.2.5. Control del escaldado: Se efectúa teniendo en cuenta el grupo de enzimas mástermorresistentes. Se realiza básicamente para evitar inconvenientes como:

• Ablandamiento excesivo.• Sabores a cocido y olores extraños.• Pérdidas de nutrientes, por su difusión en el agua.• Transformación de la clorofila en feofitina.• Pérdida del aroma típico.

Este control se hace mediante la verificación de la subsistencia de enzimas tales como lacatalasa y la peroxidasa que son las más termorresistentes. La más termorresistente deestas enzimas es la peroxidasa, pero esta es la menos dañina. Por lo general, estosprocesos aseguran la inactivación total de la catalasa; pero solo la inactivación parcial de la

peroxidasa, ya que para inactivar ésta última el tratamiento sería tan drástico para el vegetalque acarrearía sobre cocción y algunos daños físicos. Como la mayoría de las enzimas, laperoxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisan mayortemperatura y más tiempo para su inactivación. Posee, además, la propiedad peculiar de laregeneración enzimática. Este fenómeno consiste en que al inactivarla por medio del calorrecupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo (Schmidt y Pennacchiotti,2001b). Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima sufre unadesnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica untiempo muy corto, produciéndose luego una reversión de la proteína a su estado normal por

recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhidrílicos.

1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

• 3 Bolsas de cierre fácil (tipo Ziploc)• 400 ml de Agar estándar para recuento en placa SPC• 20 Cajas de petri estériles• 3 baños serológicos ajustados a 75ºC, 80ºC y 85ºC.• 14 pipetas de 1 ml estériles.•

4 pipetas de 0,1 ml estériles.• 3 termómetros de 0 ºC – 100 ºC.


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• 6 tubos de ensayo grandes y estériles.• 1 mortero con pistilo.• 1 espectrofotómetro (opcional si se desea cuantificar la actividad peroxidasa).• Celdas plásticas o de cuarzo para espectrofotometría (opcional si se desea

cuantificar la actividad peroxidasa).

1.4. REACTIVOS

• 5 Tubos con 9 mL de agua peptona 0,1% estéril.• 1 vaso de precipitado con 200 ml de solución acuosa de sal al 1,5% estéril.• 1 vaso de precipitado con 200 ml de solución de ácido cítrico al 0,8% estéril.• 1 vaso de precipitado con 200 ml de solución de ácido ascórbico al 0,5% estéril.• 1 ml de solución de Guayacol al 1% en solución de alcohol al 50%.• 10 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 3%.• 4 fiolas con 225 ml de agua peptona 0,1% estéril.

1.5. PROCEDIMIENTO

• Pesar aproximadamente 450 g de un vegetal debidamente troceado en cubos de 1cm3.

• Dividir en tres grupos de 125 g cada uno, con otros 25 g hacer recuento de aerobiosmesófilos de la dilución 10-1, 10-2 y 10-3.

• Preparar en tres vasos de precipitado, una solución acuosa de sal al 1,5%, ácidocítrico al 0,8% y ácido ascórbico al 0,5%.

• Calentar cada solución hasta conseguir en cada vaso de precipitado las siguientestemperaturas: 75, 80 y 85ºC, respectivamente.

• Adicionar en cada vaso de precipitado los correspondientes 125 g de vegetal alalcanzar la temperatura propuesta. Dejar el vegetal, según la temperatura, lossiguientes tiempos*: 10 min (75ºC), 6 min (80ºC), 3 min (85ºC).

• Realizar a cada vaso de precipitado un recuento de aerobios mesófilos de la dilución10-1, 10-2 y 10-3.

• Escurrir y empacar 75 g en frasco o en bolsa transparente estéril.• Almacenar a temperatura de refrigeración (4ºC) durante 2 o 3 semanas. Observar

cada 48 horas los cambios ocurridos en color, olor, textura, apariencia, etc.• Determinar la actividad de las enzimas peroxidasa (método cualitativo descrito por

Avallone et al., 2001) y catalasa (ver anexo 4) como control del escaldado, segúnlos métodos descritos en el anexo 4.

1.6. NIVEL DE RIESGO


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Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato CerradoBajo, Pantalón Largo).

1.7. BIBLIOGRAFÍA

Arias, B.P., González, M.C., Llanes, L.Y. (2003). Actividad peroxidasa, polifenoloxidasa,fenilalanina amonio liasa y Glucanasa en somaclones y mutantes de arroz. Rev.Protección Veg., vol. 18, No. 3: 183 – 188.

Avallone, C.M., Cravzov, A.L., Montenegro, S.B., Pellizzari, E.E. (2001). Estudio de laactividad peroxidasa, pectinesterasa y polifeniloxidasa en extracto enzimático de sandía(Citrullus vulgaris Schard ). Resúmen T-074. Ciencia y Técnica, comunicaciones científicasy tecnológicas 2001. Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. Disponible en:http://www.unne.ed.ar/Web/cyt/cyt/2001/cyt.htm, vínculo Tecnológicas.

Braverman, J.B.S. (1963). Introduction to the biochemistry of foods. Elsevier.

Pennacchiotti, M. (1998). Capítulo 2: Las Enzimas, apartado 3, aplicaciones de lasenzimas. En: Las Proteínas: generalidades y su importancia en nutrición y en la industriade alimentos. Edición Digital, Universidad de Chile. Disponible en internet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/penacchiottii01/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.

Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001a). Capítulo 3: Determinación de Catalasa enVegetales. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la química y la tecnologíade los alimentos. Edición digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile. Disponible eninternet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008

Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001b). Capítulo 2: Determinación de Actividad Peroxisaday de su Regeneración. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la química y latecnología de los alimentos. Edición digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile.Disponible en internet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.


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ACTIVIDAD 2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO FRÍO EN PRODUCTOS FLUIDOS

Y SEMIFLUIDOS

2.1. OBJETIVOS

Los objetivos que se buscan con esta práctica son: Diseñar modelos para el estudio de la penetración de calor en productos líquidos,

semisólidos y sólidos. Diseñar protocolos para el estudio y determinación de puntos fríos en cualquier

producto. Comprender como están constituidos los termopares y como se usan para la

determinación de puntos fríos y estudios de penetración de calor.

2.2. MARCO TEÓRICO

La temperatura es de lejos la variable más frecuentemente medida en la ingeniería de procesos.En la producción de alimentos, el registro y control de la temperatura es un factor importantepara asegurar la calidad y seguridad del producto final. Aunque existen muchas aplicacionespara la medición de la temperatura en el procesado de alimentos, las condiciones de procesoque va a encontrar no son particularmente hostiles. De este modo, las temperaturas se

encuentran en el intervalo desde – 50°C en el almacenamiento en frío a + 150°C en lasaplicaciones de esterilización en continuo. Solamente en la generación de vapor se encontrarántemperaturas más altas (Berrie, P.G., 2001).

2.2.1. Medición de la temperatura: En el momento en que se comenzó a estudiar lapenetración de calor en alimentos, el único instrumento de medida de temperatura queexistía era el termómetro, aunque este daba unos resultados no muy precisos debido a queel bulbo del termómetro es ligeramente largo (aproximadamente 1 cm) y por tanto, lamedición de la temperatura se hace a lo largo de dicho bulbo. Con la necesidad de tener

resultados verdaderamente satisfactorios se tuvo la urgencia de crear unos instrumentosque dieran resultados más precisos, generándose una amplia gama de instrumentos comolos termopares, detectores de resistencia de temperatura (RTDs), reóstatos, etc. Engeneral, los dispositivos de medición de la temperatura los podemos clasificar en dosgrupos a saber: dispositivos de fuerza de temperatura (FTDs) y dispositivos eléctricos detemperatura (ETDs).

2.2.1.1. Dispositivos de fuerza de temperatura: Los dispositivos FTDs se pueden dividir en FTDsbimetálicos y sistemas FTD llenados térmicamente, destacándose la cinta o termómetrobimetálico y los termómetros líquidos, respectivamente. Estos dispositivos hacen uso del

hecho de que la longitud o el volumen de una masa determinada de materia cambia amedida que aumenta la temperatura. El cambio de longitud o volumen con la


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temperatura depende del material y viene caracterizado por el denominado coeficientede expansión. Los termómetros BIMETALICOS se definen como un material compuestoque consta de tiras de dos o más metales unidos entre sí, por ejemplo remachados ounidos en espiral. Cuando la temperatura aumenta, cada metal se expande en unacantidad diferente provocando que la cinta entera se curve debido a los diferentesíndices de expansión de sus componentes. La cantidad de curvatura es una indicaciónde la temperatura. Este principio se emplea para la fabricación de termómetros ytermostatos, los cuales se forman con un resorte espiralado que en el centro está unidoa una aguja. Al calentarse, el espiral se deforma provocando la deflexión de la aguja.El bimetal termoestático se cuando se mantiene fijo un extremo de la franja recta, y elotro sufre una deflexión proporcional al cambio de temperatura y el cuadrado de la

longitud, y en sentido inverso al espesor, a lo largo de la porción lineal de la curvacaracterística de deflexión.

Figura 2.1. Dispositivos de fuerza de temperatura. a: Cinta bimetálica; b: Sistematérmico llenado (Termómetro).

2.2.1.2. Dispositivos eléctricos de temperatura: en esta categoría se incluye los denominados“Termopares”. El termopar es un dispositivo para la medición de temperatura, basado enefectos termoeléctricos (Medrano, 2002). Es un circuito formado por un conjunto de dosalambres de diferentes metales conductores o aleaciones de metales (Constantan: aleacióncobre y niquel; Cromel: niquel y cromo; Nicrosil: niquel, cromo y silicio; Alumel: níquel yaluminio; Misil: niquel y silicio) unidos en sus extremos y conectados a un voltímetro

(potenciómetro), el cual registra el diferencial del potencial eléctrico que se genera cuandoeste conjunto de alambres son sometidos a calentamiento. Como explica Medrano (2002) la

a b


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fuerza electromotriz generada por el termopar está en función de la diferencia entre la uniónfría y caliente, pero más específicamente, esta es generada como resultado de losgradientes de temperatura los cuales existen a lo largo de la longitud de los conductores.

El termopar (Figura 2.2) fue inventado por el físico y médico alemán Thomas JohannSeebeck entre los años 1821–1822. Él descubrió que una corriente eléctrica fluía a travésde un circuito cerrado formado por dos metales distintos cuando cada una de sus unionesson calentadas a distintas temperaturas, este se constituye como el fundamento de lostermopares y a este evento se le denomina el efecto o tensión de Seebeck o FuerzaElectromotríz (FEM) (Figura 2.3, a y b).

Figura 2.2. Representación de un termopar

La magnitud y dirección de la corriente son función de la diferencia de temperatura de lasuniones y de las propiedades térmicas de los metales usados en el circuito. A estefenómeno se le conoce como efecto Seebeck.

Figura 2.3. Diseño básico del circuito de Seebeck.

Si abrimos este circuito, obtenemos una diferencia de potencial pequeña (milivolts), la cuales directamente proporcional a la temperatura de la unión y a la composición de los dos

metales (Figura 2.4)

a

b


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Figura 2.4. Representación del circuito abierto de un termopar.

Funcionamiento de un Termopar (Medición): La diferencia de potencial (ddp) no puede

ser medida directamente con un voltímetro debido a que la unión del termopar con el

voltímetro crea un nuevo circuito termoeléctrico.

Figura 2.5. Representación de un Termopar J aislado isotérmicamente en sus uniones U2 y U3.

Si el termistor o Pt100 determinan la temperatura de referencia de U2 y U3, se puede determinarentonces la tensión eléctrica de referencia de esas uniones (Vref), por lo tanto V1 será ladiferencia de V menos la Vref. A este procedimiento se le conoce como de Compensación por

software, esto es debido a que el cálculo de la tensión de referencia y a su vez el cálculo de ladiferencia de tensiones es realizado por un microprocesador alojado en el instrumento demedición. Éste es sin duda el procedimiento de medición de termopares más común en laindustria. En la tabla 2.1 puede verse los tipos de termopares más comunes empleados en laindustria.


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Tabla 2.1. Tipos de termopares (Denominación, composición, rango de temperatura y color basepara identificación).

* El color del polo negativo del termopar es Rojo.

Otra forma de clasificación de termopares de acuerdo al revestimiento de los mismos nospermite diferenciar dos clases: aquellos cuyos vástagos van protegidos por fundas metálicas ylos que poseen fundas o cubiertas de materiales no conductores como la cerámica o el polímerode baquelita.

2.2.2. Medición de la penetración del calor dentro de los alimentos enlatados: Aunquepueden usarse termómetros para seguir ciertas características en el calentamiento delos alimentos, el método más satisfactorio involucra el uso de termopares. Cuando eltermopar es introducido en el recipiente y este se calienta en un autoclave o en otrodispositivo de calentamiento, se genera un diferencial de energía la cual es medida porun potenciómetro y transformada en una gráfica mediante la cual puede seguirse loscambios de temperatura dentro de la lata con respecto al tiempo, allí podremos apreciarel punto más difícil de esterilización de un alimento al cual llamaremos “Punto Frío”.Este punto varía en los alimentos según la forma de calentamiento que estos reciban,siendo estas formas de calentamiento por convección y por conducción. Como hemoscomentado anteriormente, existen diversos tipos de termopares comerciales para seguirla velocidad de penetración del calor en botes de alimentos. Uno de los más corrientes

es el que descubrió ECKLUND en 1949 (Termocupla tipo T: cobre-constantan), demuelle a presión cuyo vástago se fija a la pared del cuerpo del bote. Una vez fijo e,


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vástago, la lata puede cerrarse fácilmente en todos los tipos de máquinas cerradoras.Son pocos los partidarios de usar termopares cuyos vástagos van protegidos por fundasmetálicas, por lo que prefieren los que poseen fundas o cubiertas de material noconductor, lo que evita el riesgo de conducción del calor desde el centro del bote a lolargo de la cubierta del termopar. En el calentamiento por conducción de los botespueden originarse errores al transmitirse el calor por los alambres del propio termopar.Para evitarlo ECKLUDED ha elaborado una tabla de factores de corrección que debenaplicarse a los valores J, señalando además que los errores se originan en su mayorproporción en las fases iniciales de calentamiento y enfriamiento, para trabajar conprecisión se necesitan termopares construidos con alambres finos, aplicando cuando seaconveniente factores de corrección de temperatura.

La posición en que debe situarse el par caliente depende de las propiedades físicas delalimento y para comprenderlo es necesario conocer a su través. Como se ha explicadoen la práctica anterior, en los alimentos sólidos el calor se transmite por conducción y elproceso es relativamente lento, mientras que en los líquidos el calor se transmiteprincipalmente por convección y la elevación térmica es más rápida, puesto que existeun movimiento continuo del material, de tal modo que las diferencias térmicas dentro delbote son mínimas en cualquier instante del proceso. En contenidos sólidos los alambrestermopares, usualmente requieren soportes no especiales, pero en contenidos líquidos,

es necesario soportar los alambres sobre una fibra de vidrio o pasando ellos a través desellos sobre los lados opuestos a la lata. Los alambres deben ser dejados algo flojospara permitir la expansión de la lata y abultamiento de las terminaciones durante elcalentamiento. Estos métodos por ajustamiento de termopares dentro de las lataspermiten que las medidas sean hechas desde cualquier tamaño y forma, con un mínimode equipo y costo.

2.2.3. Medición del punto frío en los alimentos enlatados: No todos los puntos de unrecipiente que está siendo calentado se encuentra a la misma temperatura. La zona decalentamiento más lenta es llamada el punto frío de un recipiente y es esta zona la más

difícil de esterilizar, debido al retraso en el calentamiento. En los productos calentadosprincipalmente por convección el punto frío está sobre el eje vertical cerca del fondo delrecipiente. Los productos calentados por conducción tienen el punto de calentamientomás lento aproximándose al centro del recipiente sobre el eje principal. Para determinardonde se encuentra el punto frío de un alimento puede seguirse la siguientemetodología:

Una abertura de 1,8 pulgadas (4,57 cm) de diámetro es perforada en la paredcilíndrica de la lata opuesta al punto propuesto de medida. Un tubo de cobre de 3,4

pulgadas (8,64 cm) de longitud y 1,4 pulgadas (3,56 cm) de diámetro es soldado a lapared de la lata circundante a la abertura, los alambres termopares son pasados a través


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del tubo y la abertura hacia el interior de la lata. Los alambres son entonces selladosdentro del tubo de cobre con una resina basada en epoxi que coloca la temperatura en elespacio cuando un endurecedor es agregado. Cuando alambres finos son usados, un sello hermético al vacio puede serobtenido sin el tubo de cobre simplemente con perforar la lata y colocando el alambredentro de esta abertura con la resina. Las latas ajustadas con termopares por el segundométodo pueden ser pasadas a través de muchos tipos de equipos exhaustivos ycerrados si los alambres son enrollados alrededor de la lata y mantenidos en esaposición con cinta adhesiva. Las latas sometidas a experimentos pueden ser entoncesincluidas en una extensa producción de latas para reproducir condiciones comercialestan cuidadosamente como sea posible.

Las cajas de empaquetadoras son soldadas a la lata comenzando a ½ pulgada(1,27 cm) del fondo de la primera lata, ¾ de pulgadas (1,91 cm) del fondo de la segundalata, 1 pulgada (2,54 cm) del fondo de la tercera lata, 1¼ de pulgadas (3,18 cm) delfondo de la cuarta lata, y así sucesivamente cada ¼ de pulgada (0,635 cm) superior a ladel termopar de la lata anterior. El producto se prepara y se mantiene un llenado uniforme en todos losrecipientes, dejando un espacio de cabeza mínimo del 6% y máximo un 10% de lacapacidad de la lata (medido en términos de volumen). Las latas se sellan, y lostermopares quedan fijados en cada recipiente, quedando disponibles con termopares

localizados cada ¼ de pulgada del fondo de las latas comenzando con la primera a ½pulgada del fondo de la misma (Figura 2.6). Las latas son colocadas luego en una retorta (Autoclave), la cual es llevada a latemperatura deseada, con la debida precaución para eliminar el aire. Las temperaturasson registradas cada minuto manualmente o de forma automática si se dispone de algúnsoftware adecuado (por ejemplo irMOTIOM premium) o si se usa un potenciómetro -voltímetro registrador, los valores tiempo-temperatura serán graficados en papelsemilogarítmico, lo que da una línea recta con desviaciones menores para la relaciónentre el tiempo y la temperatura. Finalmente, una vez localizado el punto frio del alimento, todos los estudios

subsecuentes de penetración de calor, valores de esterilización o pasteurización, etc., seharán ubicando siempre los empalmes de los termopares en la distancia calculada comodicho punto.


Para esta práctica no se utilizaran termopares sino 6 termómetros de 10 – 100ºC. 6 frascos de vidrio resistentes al calor con sus respectivas tapas. 1 baño serológico ajustado a una temperatura de 70ºC, 80ºC o la indicada por el

profesor. Papel milimetrado.


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Figura 2.6. Forma de inserción de los termopares para estudios de penetración de calor.

2.4. REACTIVOSNo requiere

2.5. PROCEDIMIENTO

Se toman las tapas y se perforan justo en el centro de las mismas. Se adiciona un volumen conocido de agua o el producto que indique el profesor en los

recipientes, dependiendo de la capacidad de los mismos. Se debe procurar dejar unespacio de cabeza que no sea menor al 6% del volumen del recipiente, ni mayor al 10%.En todos los botes deberá adicionarse la misma cantidad.

Se tapan los botes, se introducen los termómetros a distintas profundidadescomenzando por ubicar el bulbo a 1,25 cm del fondo del primer bote. El segundotermómetro se ubica a 1,9 cm del fondo, el tercero a 2,5 cm, el cuarto termómetro a 3,13

cm, el quinto a 3,75 cm y el sexto termómetro a 4,38 cm del fondo. En la medida que sedisponga de más termómetros y botes, se ubicaran cada ¼ de altura a lainmediatamente anterior.

Se introducen todos los botes en el baño serológico y se toman los datos de temperaturaen intervalos de 1 minuto hasta alcanzar la temperatura de proceso establecida.

Construir la gráfica Temperatura vs tiempo para cada bote en papel milimetrado ydeterminar la curva de más lento calentamiento.

En este punto se ubicara el “ punto frio” del producto.



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Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2. Portanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la mismadeberá usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantalón Largo.

2.7. BIBLIOGRAFÍA

Medrano, S. 2002. Termopares. En: La Guía MetAs, Año 02, No 7. Julio, 2002. Board, R.G. 1988. Introducción a la microbiología moderna de los alimentos. Editorial

Acribia S.A., Zaragoza, España.

Heldman, S. 1998. Introducción a la ingeniería de los alimentos. Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, España.

Ress, G.A., Bettison, J. 1994. Procesado térmico y envasado de los alimentos. EditorialAcribia S.A., Zaragoza, España.

Berrie, P.G. 2001. Capítulo 4: Medición de la presión y temperatura en el control deprocesos alimentarios. En: Tecnologías térmicas para el procesado de los alimentos.Philip Richardson Editor. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, España. Págs. 55 – 79. ISBN:84-200-1042-1.

http://www.termocamara.com/software.htm

http://www.thermoteknix.com/brochures/visir/VisIR_Spanish.pdf http://www.simca.com.mx/calif.htm


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ACTIVIDAD 3. ESTUDIO DE LA PENETRACIÓN DEL CALOR EN PRODUCTOS

FLUIDOS

3.1. OBJETIVO

Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de: Construir gráficas de penetración de calor para diversos productos e interpretar su

comportamiento. Comparar las velocidades de penetración de calor en los diferentes productos

alimenticios. Determinar el grado de destrucción bacteriana durante el estudio y comparar la carga

microbiana en diferentes momentos de la curva de penetración de calor

3.2. MARCO TEÓRICO

Existen diferentes modos de transmisión del calor. Pero teóricamente se habla del caso idealen el que la temperatura del tratamiento térmico alcance instantáneamente a todos lospuntos del producto, manteniéndose por un lapso de tiempo y luego descender otro tanto.Sin embargo, lo más frecuente es que la temperatura de tratamiento no se logreinstantáneamente y no resulte homogénea en toda la masa del producto. Por otro lado el

mismo medio de calentamiento (como agua o vapor de agua en el autoclave) necesita uncierto tiempo para conseguir la temperatura deseada. Como se sabe el método clásico (deNicolas Appert) presupone:

• Introducción del producto convenientemente preparado en un recipiente.• Cierre herméticamente del envase.• Tratamiento térmico del recipiente con su contenido.• Enfriamiento.

Evidentemente, lo que interesa para establecer un cálculo de esterilización adecuado, esconocer la evolución de la temperatura en la parte del producto, que dentro del proceso total,es decir, comprendiendo también la fase de enfriamiento; tuviese la menor velocidad depenetración de calor, se habla a éste propósito del “punto frío” que dependiendo de laforma como se transmita el calor puede ubicarse en el centro geométrico de la masa delproducto o bien sobre el eje central aproximándose a ¼ de la parte inferior del envase.

La medida de las variaciones de la temperatura en diferentes puntos del producto y másespecialmente en el punto frío, en función del tiempo y de otros factores se realiza por mediode pares termoeléctricos especiales, fijos en el recipiente y unidos a un potenciómetroregistrador, que detecta los cambios térmicos en el punto frío del producto (Figura 3.1).


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Figura 3.1. Mecanismos básicos de la transmisión de calor en alimentos. a). Conducciónpara alimentos sólidos. b). Convección para alimentos líquidos.

En la figura 3.2 puede verse diversos ejemplos de las curvas típicas de penetración de calordependiendo de la naturaleza de la matriz alimentaria, destacándo tres ejemplos:

• a. Producto muy móvil de viscosidad bastante baja, agitado enérgicamente (porejemplo, un zumo de frutas calentado en capas finas y en circulación rápida en un

intercambiador de calor). la transmisión del calor ocurre por convección y latemperatura de tratamiento se consigue casi instantáneamente, es decir, en untiempo despreciable.

• b. Producto móvil poro no agitado (por ejemplo, frutas en almíbar ligero o una cremade verduras). La trasferencia de calor tiene lugar especialmente por convección; enéste caso las corrientes de convección se deben a diferencias en la temperatura y,como consecuencia de esto, de densidad entre las capas del producto próximas alas paredes del recipiente y de las proporciones que están más alejadas.

• c. El producto está constituido por una masa sólida compacta (ej.: paté de hígado) opor un líquido de muy alta viscosidad (ej.: solución de almidón o soluciones pécticaspor encima de determinadas concentraciones), aquí la propagación del calor sehace por conducción, es decir, por transmisión gradual de vibraciones térmicas demolécula a molécula en la masa del producto, desde las paredes del recipientehasta el punto frío.

a b

Termopares

Punto frío


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Figura 3. 2. Curvas típicas de penetración de calor. a. Transmisión de calor por conveccióncon agitación; b. Transmisión de calor por convección sin agitación; c. Transmisión de calorpor conducción.

Los cálculos de esterilización deben tener en cuenta las fases de calentamiento y deenfriamiento, ya que su contribución a la esterilización es apreciable. Durante el ciclo:calentamiento – mantenimiento – enfriamiento, el punto frío adopta una sucesión detemperaturas de las cuales cada una posee un determinado valor letal, el efecto esterilizadordel conjunto del ciclo es la suma de los efectos esterilizantes de cada temperatura sucesiva.

3.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por grupo de trabajo)

400 ml de un producto fluido (sin leche). El instructor asignara a cada grupo un productodiferente, p.ej. Bebida de malta, jugo de fruta en agua, sopas, bebida gaseada, etc.

1 Fiola estéril de 500 ml de capacidad. 1 Termómetro de 10 – 250 ºC. 1 Baño serológico. Mínimo 10 pipetas estériles de 1 mL de capacidad. 12 Cajas de petri estériles.

3.4. REACTIVOS

7 tubos con 9 ml de agua peptonada 0,1%.

a

b c

10 20 30

100

110

120

40

Tiempo (min)

T e m p e r a

t u r a ( º C )

Temperatura delmedio calefactor


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240 ml de agar estándar para recuento en placa (SPC). Cultivo madre de E. coli o S. aureus en fase logarítmica (mantenido en caldo BHI).

3.5. PROCEDIMIENTO

Tomar aproximadamente 300 ml de producto en una fiola estéril de 500 ml decapacidad. Realizar recuento de aerobios mésofilos de las diluciones 10-2 y 10-3.. Si suproducto se trata de una muestra comercial realizar recuento de las diluciones 10-1 y 10-2.

Tomar la temperatura inicial e iniciar el calentamiento. Verificar la temperatura del producto en el punto frio, a intervalos de 2 minutos, según

sea la velocidad de transmisión de calor (puede ser más amplio o más reducido), hastallegar a una temperatura constante que se repita 3 o 4 veces.

En este punto se toma de la muestra 1 ml para realizar otro recuento de aerobiosmesófilos a partir de las diluciones 10-1 y 10-2.

Se siguen con el enfriamiento rápido en agitación y ayudados con un chorro de aguafrían, hasta llevar el producto a una temperatura aproximada de 35ºC, siempre haciendoseguimiento de la temperatura cada 2 minutos (o según el intervalo establecido paracada producto).

En este punto se hace un último recuento de aerobios mesófilos de las diluciones 10-1 y

10-2

. Construir la gráfica de penetración de calor para el producto, y comparar las cargas encada uno de los tres puntos.

Determine la velocidad de penetración de calor para cada producto y discuta el porquede los resultados.


Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, yaque se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por

malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberáusar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantalón Largo.

3.7. BIBLIOGRAFÍA

Board, R.G. (1998). Introducción a la microbiología moderna de los alimentos. Editorial

Acribia S.A., Zaragoza, España.


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Heldman, S. (1998). Introducción a la ingeniería de los alimentos. Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, España.

Ress, G.A., Bettison, J. (1994). Procesado térmico y envasado de los alimentos. EditorialAcribia S.A., Zaragoza, España.

Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en losalimentos, la temperatura. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectosmicrobiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,España. Pps. 7 – 50.

ICMSF. (2000). Temperatura, Capítulo 1. En: Ecología microbiana de los alimentos 1.Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos.Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 1 – 38.


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ACTIVIDAD 4. DETERMINACIÓN DEL VALOR D PARA CULTIVOS

ASPORÓGENOS

4.1. OBJETIVO

Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de: Comprender el efecto de la temperatura en función del tiempo sobre la supervivencia

microbiana. Construir gráficas TDT (tiempo de destrucción térmica), para diversos microorganismos,

las cuales describen el comportamiento de los mismos frente a una temperatura

determinada. Calcular los respectivos valores “D” para cada microorganismo, según la gráfica TDT

construida para ellos.

4.2. MARCO TEÓRICO

La mayor parte de las bacterias patógenas tienen una tolerancia limitada a las variacionesextremas en su medio ambiente físico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismovivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones físicas

deletéreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado desupervivencia.

En el vocabulario común se emplea la palabra esterilización como un absoluto que implica lainactivación total de todas las formas de vida microbiana en términos de la capacidad delmicroorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusión a una acciónletal, en tanto que stasis se añade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o lamultiplicación del microorganismo.

4.2.1. Índice de letalidad de los microorganismos: la información referida a la cinética de ladestrucción de una población bacteriana es esencial para comprender las bases de laesterilización por agentes letales. Para los microorganismos el único criterio válido de muerte esla pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general está determinado portécnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el número desobrevivientes.

Cuando se expone una población bacteriana a un agente letal con el tiempo tiene lugar unareducción progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes. La cinética de ladestrucción de una población microbiana suele ser exponencial: el número de sobrevivientes

disminuye en función del tiempo. Si el logaritmo del número de sobrevivientes se representacomo una función del tiempo de exposición se obtiene una línea recta (figura 4.1) cuya pendiente


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negativa define la velocidad de destrucción. Sin embargo, el índice germicida solo nos dice quefracción de la población inicial sobrevive a un periodo determinado de exposición al agenteantimicrobiano. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer eltamaño inicial de la población. Esta relación se expresa de forma matemática por la fórmula:

1 ∗

Donde,N0 = número inicial de microorganismosNf = número final de supervivientes después del tiempo t.

Teóricamente se ha descrito que la destrucción de una población bacteriana sigue un ordenmatemático progresivo, que obedece a un descenso exponencial (o logarítmico, si se desealinealizar). Esto es común para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en suvelocidad de destrucción, la cual se halla reflejada en la pendiente de la gráfica. Esta velocidadserá la que determine el grado de resistencia del microorganismo a las altas temperaturas, por lotanto ésta será diferente para cada especie bacteriana; constituyéndose en una importanteherramienta para la medida de la termorresistencia bacteriana.

Como puede observarse en la figura 4.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja latasa de destrucción a esa temperatura en especial; pero dicha tasa es independiente del númeroinicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnúmero de factores.

Figura 4.1. Gráfica de la velocidad de muerte bacteriana o TDT (Thermal Destruction Time).

El calor es el método de esterilización más confiable y el de empleo más difundido a nivel

mundial; siempre que sea posible debe ser el método de elección. Como ocurre con otros tiposde desinfección, la esterilización de una población bacteriana por calor es un proceso gradual y

L o g

N o

d e

s o b r e v

i v i e n t e s

0

1

10 20 30 40

2

Tiempo (min)


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la cinética de la acción germicida es exponencial. La inactivación de primer orden por calorsignifica que una fracción constante de los microorganismos sufre un cambio químico inactivantepor cada unidad de tiempo y que cada una de esas alteraciones es suficiente para inactivar unmicroorganismo.

El tiempo necesario para la esterilización es inversamente proporcional a la temperatura deexposición. Esta relación se puede expresar por el término de tiempo de muerte térmica o valorD de inactivación térmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik y col., 1997; Brennan et al ., 1990), quese refiere al tiempo mínimo necesario para destruir una suspensión de microorganismos a unatemperatura predeterminada en un medio ambiente especificado (el concepto del valor D sedefine como el tiempo mínimo necesario a una temperatura constante para reducir el 90% de la

población (Harrigan, 1998), lo cual equivale a reducir la población en una unidad logarítmica.Este valor D, como veremos más adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente dela curva TDT). Debido a los elevados coeficientes de temperatura implicados en la esterilizaciónpor calor, un cambio mínimo en la temperatura altera de manera significativa el tiempo de muertetérmica. De acuerdo con la ley de acción de masas, el tiempo de esterilización se relaciona deforma directa con el número de microorganismos en la suspensión.

4.2.2. Mecanismo de la lesión térmica: la inactivación de las bacterias por calor no puede serdefinida en términos bioquímicos simples. Aunque el efecto letal del calor húmedo por encima de

una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalización y coagulación de lasproteínas, el patrón del daño térmico es bastante complejo y la coagulación sin duda enmascaraotros cambios más sutiles inducidos en la célula antes de que se evidencie la coagulación.

La producción de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La pérdidade viabilidad de las células expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con laintroducción de estas rupturas. El daño al DNA parece ser de naturaleza enzimática y es unaconsecuencia de la inactivación de las nucleasas. La capacidad de la célula para reparar estedaño y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiológico del microorganismo y de suconformación genética. El calor también ocasiona una pérdida de la integridad funcional de la

membrana y la filtración de pequeñas moléculas y de material absorbente a 260 nm. Estematerial es de origen ribosómico y aparentemente proviene de la degradación de los ribosomaspor ribonucleasas activadas por el tratamiento térmico. Parece existir una correlación entre ladegradación del RNA ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas atemperaturas elevadas.

El mecanismo por el cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferenteal del calor húmedo. Los efectos letales del calor seco, o la desecación en general,habitualmente se atribuyen a la desnaturalización proteica, al daño por oxidación y a los efectos

tóxicos de elevadas concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el número de grupospolares sobre las cadenas peptídicas disminuye y se requiere más energía para abrir las


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moléculas; de ahí el aumento aparente de la estabilidad del microorganismo.

En la tabla 4.1 se ilustran los tiempos mínimos necesarios para lograr una adecuadaesterilización a distintas temperaturas y formas de calor, tanto húmedo como seco.

Tabla 4.1. Tiempos mínimos requeridos para la esterilización por calor húmedo y calor seco adiferentes temperaturas.

Temperatura

(ºC)

Calor húmedo Calor seco

Tiempo (min) Presión (lb) Tiempo (min)

121 15 15 -

126 10 20 -

134 3 30 -

140 - - 180

150 - - 150

160 - - 120

170 - - 60

Fuente: Joklik y col., 1997.

Cuando se habla de termorresistencia, el arma principal con que se cuenta para inferir que tansusceptible es un microorganismo a un tratamiento térmico, es la gráfica TDT o curva del tiempode destrucción térmica; en la cual se verifica la población de bacterias en función del tiempo deduración de un proceso térmico, que se hace necesario se realice a una temperatura constante.

La pendiente de la curva obtenida refleja la tasa de destrucción a esa temperatura en especial;pero dicha tasa es independiente del número inicial de bacterias y se ve influenciada por unsinnúmero de factores. A partir de ésta gráfica surge un concepto que servirá de parámetro paramedir la termorresistencia de microorganismos, y es el “tiempo de reducción decimal” o valor D,definido como el tiempo necesario para destruir el 90% de la población total de bacterias(Rahman et al., 2004); lo cual equivale a reducir la población en una unidad logarítmica. Estevalor D, como veremos más adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de lacurva TDT.

Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperaturaconstante; ésta temperatura debe indicarse como un subíndice, así por ejemplo, valor D215ºF = 5minutos, lo que quiere decir que el valor corresponde a 215ºF. Para hallar este valor, trabajamoscon la ecuación de la recta, específicamente con su pendiente, porque en estos términos D,

equivale al inverso de la pendiente de la gráfica obtenida, así:


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m D

1−= ;

Dm

1−=

Nótese el signo negativo como una compensación ya que la pendiente en todos los casos seránegativa, y por tanto el tiempo de reducción positivo.

La gráfica TDT clásica, que se obtiene al realizar un estudio de termorresistencia a unmicroorganismo cualquiera, es la siguiente (Figura 4.2):

Figura 4.2. Gráfica TDT.

De la figura 4.2 se infiere que: y

m∆

∆=

xab

ya ybm

−

−=

Donde m es la pendiente de la gráfica TDT, la cual equivale a la razón existente entre undiferencial de valores en el eje “y” y el mismo diferencial en el eje “x”, los cuales estándelimitados por los puntos (xa;ya) y (xb;yb). Esta pendiente se puede, también, expresar de lasiguiente forma:

tatb

abm

−

−=

loglog (4.1)

Ahora, como tenemos que la pendiente (que siempre será negativa, en estos casos) es igual alinverso del valor D, podemos reemplazar así:

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

L o g # m . o

log a

ta

log b

tb

∆x

∆y

(xa; ya)

(xb; yb)

Y = mx + b y = -x/D + b

b (punto de corte con el eje y)


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Dm

1−= (4.2)

Entonces,tatb

ab

D −

−=

− loglog1 (4.3)

Despejando D, obtenemos:

ab

tatb D

loglog

)(*)1(

−

−−= (4.4)

Donde (tb – ta), es considerado como el tiempo en que la población inicial que tenía unaconcentración de log a, se redujo a una población final con una carga de log b; ésta diferenciade tiempo, es decir, el tiempo en que disminuirá el número de microorganismos desde unapoblación conocida hasta una población final estipulada y debido a que siempre será unadiferencia así esté como un producto se conoce como ∆t . Este ∆t , se puede hallar si se conoceel valor D del microorganismo en estudio, así (debemos recordar que ∆t es negativo en laecuación del valor D, ya que se trata de un diferencial: tb – ta):

)log(log ab

t D

−

∆= (4.5)

O lo que es lo mismo:)log(log* ba Dt −=∆ (4.6)

Nótese que en la anterior ecuación el diferencial de la población se ha invertido, de tal forma queel diferencial de tiempo es positivo. Si la diferencia de poblaciones log a – log b es igual a uno,entonces el valor D será igual a la duración del tratamiento térmico ∆t , así:

1

t D

∆= ; es decri: t D ∆= (4.7)

En una gráfica TDT, la recta teóricamente, se puede prolongar por debajo del eje x , hasta la

zona de los negativos en el eje y , así por ejemplo, luego de a minutos de proceso la curva seubicará en el punto -2. Si lo anterior llega a suceder, debe interpretarse estadísticamente entérminos de probabilidad; es decir:

Antilog de – 2: log –1 2 = 0,01

Esto no indica que una centésima parte de una bacteria o endospora por gramo o mililitro hasobrevivido en la muestra, como sería de suponer matemáticamente; lo que esta cifra quieredecir, es que a esa temperatura y durante ese tiempo, existe la posibilidad de que en 100 g de

producto, sobreviva una bacteria o endospora. De tal manera que cuando la gráfica llega en eleje y hasta –3, una bacteria sobrevivirá en 1000 g del producto.


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Por lo anterior es evidente que la población no puede nunca quedar reducida a cero, de lo quese infiere que si se somete cierto número de recipientes conteniendo una población conocida, aun determinado tratamiento térmico, siempre existirá la probabilidad de supervivencia de almenos un microorganismo en alguna lata. Estos hechos son muy útiles en la elaboración de loscálculos del diseño de un tratamiento térmico, para un producto en especial que va a sersometido a una appertización.

Si bien el tiempo de reducción decimal (valor D) resulta útil como parámetro para evaluar latermorresistencia microbiana, presenta una serie de limitaciones, y entre ellas la más importantees que restringe ver la supervivencia de los microorganismos frente a una sola temperatura, que

es la que permanece constante durante el ensayo. Esta limitante conduce a la formulación de unnuevo parámetro de termorresistencia denominado valor z, el cual permite realizar unseguimiento más global del comportamiento microbiano durante diferentes temperaturas. Así, sise conocen por lo menos dos valores de termorresistencia es posible determinar este nuevovalor como veremos en la siguiente actividad.

4.2.3. Determinación del valor D para cultivos asporógenos por el método de los tubosmúltiples o de Bigelow: Este método desarrollado por Bigelow en 1923 es denominado el

método de los tubos TDT consiste en la determinación del número de supervivientes para cadaintervalo de tiempo de exposición a la temperatura de proceso, obteniendo así un recuento finalpara cada tiempo, y posteriormente graficando dichos recuentos en términos de log10 versustiempo. Se calcula la pendiente y el inverso de la misma corresponde al valor D del cultivo.• Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli ), para obtener un

recuento total alrededor de 3x108 células por ml. (Esto puede ser determinado por conteomicroscópico, o por nefelometría o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sidocalibrados usando conteos microscópicos.

• Colocar 10 ml de esta dilución en 90 ml de diluyente estéril (por ejemplo agua peptonada al0,1%) contenido en un recipiente de vidrio. Agitar bien para mezclar y romper los posiblesagregados. Distribuir cantidades de 5 ml en 5 tubos de ensayo estériles de 150 x 16 mm(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno).

• Colocar simultáneamente los tubos preparados anteriormente en un baño de agua a 58°Ccon un tubo control de temperatura conteniendo un termómetro y 5 ml de diluyente. Cuandola temperatura del contenido del tubo control alcance 1°C por debajo de la temperatura delbaño, remueva uno de los tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo desde estemomento.

• Rápidamente enfriar el tubo removido en agua refrigerada. Preparar seis diluciones decimalesy realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones.

• Retirar otro tubo y repetir el paso 4 después de cada una de los siguientes tiempos: 2 ½minutos, 5 minutos, 7 ½ minutos y 10 minutos.


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• Incubar las placas a 35°C ± 2°C durante 24 – 48 horas y determinar el número desupervivientes después de varios periodos de calentamiento. Dibujar un gráfico del log10 (número de supervivientes) contra el tiempo. A partir de este determine el D58°C (en minutos)como el inverso de la pendiente de la mejor línea de ajuste (Coeficientes de regresión R2 y decorrelación R) (Ver ejemplo en tabla 4.2. y figura 4.3a y 4.3b.).

Ejemplo determinación del valor D por el método de los tubos TDT:

Tabla 4.2. Ejemplo del recuento de supervivientes a 58°C durante 10 minutos.

Tiempo

(minutos)

Recuento supervivientes

UFC/ml Log10 UFC/ml

0 10000000 7,00

2 ½ 6900000 6,84

5 540000 5,73

7 ½ 23000 4,36

10 1000 3

Figura 4.3a. Gráfica TDT para la determinación del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.

()

m = -0,4191R2 = 0,9481R = 0,9737


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Figura 4.3b. Gráfica TDT para la determinación del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.

Tal y como puede verse en la figura 4.3a el coeficiente de correlación para todos los datos desupervivientes vs tiempo es de 0,9737 mientras que para los datos de la figura 4.3b (tiempos2 ½ hasta 10 min) dicho valor fue 0,9988. De acuerdo con lo anterior, el valor D seestablecerá como el recíproco de la pendiente para la figura 4.3b; correspondiendo este valorD58°C a 1,94 minutos.

4.2.4. Determinación del valor D por el método de presencia – ausencia o de Halvorson yZiegler: También existe otra metodología para calcular el valor D en aquellos casos donde, seemplee un método semi-cuantitativo (Número más Probable). Para dicho procedimiento seempleara una serie de tubos expuestos a diferentes temperaturas y tiempos, paraposteriormente incubarlos y determinar ausencia o presencia de crecimiento. Esta técnica fuedescrita por Halvorson y Ziegler en 1933, la cual es ampliamente utilizada enTermobacteriología. Cuando una gran cantidad de unidades de un lote que contienen N0 demicroorganismos vivos se somete a un tratamiento letal, la letalidad del tratamiento es medidapor comparación del N0 y el nivel de organismos supervivientes Ns. De acuerdo con Halvorson yZiegler (1933) el número promedio esperado de microorganismos por unidad experimentalsometidos a tratamientos letales o no] puede ser calculado solo si una fracción de las unidadesexperimentales [tubos, latas, tarros, frascos, etc.] es estéril, es decir, no contiene organismosvivos. La relación de Halvorson y Ziegler [Hz] para determinar el número de supervivientes es lasiguiente (ecuación 4.8a y 4.8b):

2,303 (4.8a)

Donde P0 = relación entre el número total de muestras sometidas a calentamiento (n) y elnúmero total de muestras sin crecimiento (r).Reemplazando n y r en P0, tenemos la siguiente expresión:

()

m = -0,5155R2 = 0,9976R = 0,9988


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2,303 (4.8b)

Donde:n = número total de muestras sometidas a calentamientor = número de muestras sin crecimientoHz = número promedio esperado de microorganismos/unidad de muestra, cuando la fracción demuestras estériles [es decir, los que no presentaron crecimiento] es igual a Po.

Para este tipo de ensayo es necesario conocer la población inicial antes de iniciado el tiempo desostenimiento del calentamiento.

Después de obtener el Hz para cada tiempo se calcula el valor D para la temperatura en cuestióncon la ecuación 4.9 (la cual es una modificación de la ecuación 4.4).

(4.9)La ecuación 4.9 tiene una aplicación muy amplia en Termobacteriología, donde usualmentemuchas unidades simples [tubos, tubos capilares, viales, frascos, latas, etc.] se someten de unaa un tratamiento térmico y la supervivencia se mide por la frecuencia de alteración de lasunidades almacenadas y sin abrir después de un tiempo y temperatura adecuada. Esta técnicaes muy valiosa porque permite evaluar la probabilidad de supervivencia a un tratamiento dado en

el mismo sustrato donde se aplica la condición letal. Es decir que refleja lo que ocurre en lapráctica.

El método:• Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli ), para obtener un

recuento total alrededor de 3x108 células por ml. (Esto puede ser determinado por conteomicroscópico, o por nefelometría o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sidocalibrados usando conteos microscópicos.

• Colocar 10 ml de esta dilución en 5 sets de 5 tubos de ensayo estériles de 150 x 16 mm

(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno) cada uno. Adicionalmente colocar 10ml de la dilución de trabajo en otro tubo de ensayo estéril y marcarlo como N0.

• Colocar simultáneamente los tubos preparados anteriormente en un baño de agua a 58°Ccon un tubo control de temperatura conteniendo un termómetro y 10 ml de diluyente. Cuandola temperatura del contenido del tubo control alcance 1°C por debajo de la temperatura delbaño, remueva uno de los sets de 5 tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempodesde este momento. Al mismo tiempo retire el tubo marcado como N0 y enfriar todos lostubos removidos en agua refrigerada. A partir del tubo N0 preparar seis diluciones decimales yrealizar un recuento total en placa con todas estas diluciones, de esta forma determinamos la

población al inicio del calentamiento.


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• Retirar otro set de 5 tubos después de cada una de los siguientes tiempos: 2 ½ minutos, 5minutos, 7 ½ minutos y 10 minutos.

• Incubar tanto las placas como los 5 sets de 5 tubos a 35°C ± 2°C durante 24 – 48 horas.• Con los recuentos obtenidos en las placas calcular la población inicial (t0).• Determinar para cada set de tubos en cuántos de ellos se presenta crecimiento (turbidez) y

en cuántos de ellos no hay crecimiento.• A partir de la ecuación 4.8 determine la relación Hz para cada tiempo, y con estos datos

cuantifique el valor D58°C (en minutos) a través de la ecuación 4.9.

Con los datos ilustrados en la tabla 4.3., vamos a calcular el valor D con este segundo método.

Tabla 4.3. Ejemplo para el cálculo del valor D por el método de Halvorson y Ziegler.

Temperatura (ºC) Tiempo de calentamiento (min)Número de tubos

Calentadas Crecimiento Ausencia

58

0 5 5 0

2,5 5 4 1

5 5 3 2

7,5 5 2 3

10 5 1 4

Para el cálculo del valor D vamos a partir con el supuesto de que la población inicial (tubo N0) es1*107 ufc/ml (7,00 log10 ufc/ml).

Para el tiempo 0 minutos se obtuvo 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/5).Para el tiempo 2,5 minutos se obtuvo 4 de 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/1).Para el tiempo 5 minutos se observa que 3 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/2).Para el tiempo 7,5 minutos se observa que 2 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/3).Para el tiempo 10 minutos se observa que 1 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/4).

, 2,303 51 Hz (2,5min) = 1,61

2,303 52 Hz (5min) = 0,917

, 2,303 5

3

Hz (7,5min) = 0,511


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2,303

5

4

Hz (10min) = 0,223

En segundo lugar, procedemos a calcular el log10 para cada Hz:Log10Hz (2,5min) = 0,207Log10Hz (5min) = -0,038Log10Hz (7,5min) = -0,292Log10Hz (10min) = -0,652

Para calcular el valor D usaremos la ecuación 4.9 para el primer intervalo de tiempo.

2,5 0 10000000 1,61

2,57 0,207

0,368

Repetimos la operación anterior con cada intervalo de tiempo faltante:

5 0 7 0,038 0,71

7,5 0

7 0,292 1,03

10 0

7 0,652 1,31


30 tubos con 9 ml de caldo BHI (opcional agua peptonada est

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