Diagnostic in infectia cu virusuri gripale

ORTHOMIXOVIRUSURI-V. GRIPALE A, B, Cmyxa-mucus

tip A, B, C : NP, M subtipuri: HA si NA –16 tipuri de HA si 9 de NA

Matrice

Nucleocapsida helicoidalaARNss

HA - hemaglutinina

transcriptaza

anvelopa

NA - neuraminidaza

Diagnostic clinic de gripa

• Debut brusc, febra (3-5 zile),frison, mialgii, cefalee, astenie (>2 saptamani), tuse uscata, faringita, rinoree.

• Gripa nu se diagnosticheaza clinic. Simptomatologie

asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusul respirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale, si Legionella spp.

ETIOLOGIE

POSIBILA

Produs

Patolog

IZOLARE Dg. DIRECT

=detectie directa

Dg. INDIRECT

=serologie

V GRIPALE A, B, CENF

ANF

ATB

•OGE•Culturi celulare

DA – PCR

Si IF

DA studii epidemoiologice

Produse patologice :

a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.

b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic. c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat

• Sputa recoltata în urma tusei, lichidul veziculelor din mucoasa bucalä sau materialul recoltat postmortem (plamân) nu sunt indicate în diagnosticul virozelor respiratorii.

Diagnostic de laborator in gripa Directii de diagnostic

• IZOLARE+IDENTIFICARE

OGE, RHA+ RHAI

• DETECTIE directa PCR si RIF

• DIAGNOSTIC SEROLOGIC

1. -pe culturi primare de rinichi de maimuta rhesus. -pe linia continua epiteliala de rinichi de ciine = =MDCK - Madin-Darby Canine Kidney.

2. pe ou de gaina embrionat,de 9-11 zile, inoculat intraamniotic sau intraalantoidian.

Izolare virala. - examenul optim pentru diag. gripei

Hemadsorbtiedemonstreaza izolarea v.gripale

pe culturi de celule• Virusurile gripale nu sunt

citopatogene.• La 48 ore dupa inocularea

v. gripal se incearca detectia virusului prin hemadsorbtie, obisnuit cu eritrocite de cobai la 4 C.

• Hemadsorbtia rezulta din incorporarea in membrana plasmatica celulara a HA virale. Hematiile adsorbite specific rozeteaza la periferia celulelor infectate.

Izolarea pe OGE

• Izolarea se demonstreaza prin proprietatea v. gripale de a aglutina hematii

Etape:

•ag. viral dilutii binare

•suspensie de hematii

•Se incubeaza la temperatura camerei

•Se citesc rezultatele in 60 minute

•Martorul reactiei contine suspensie hematii

Rol RHA:Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinantTitrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutino-inhibare

UHA

DEMONSTRAREA PREZENTEI VIRUSULUI

REACTIA DE HEMAGLUTINARE

IDENTIFICAREA V. GRIPALER. HEMAGLUTINO-INHIBARE

Tehnica reactiei:

dilutii binare din serul testat o cantitate constanta de ag. viral hemaglutinant Se lasa la incubat 30 min la 37°C.Se adauga sistemul indicator = suspensia de hematii.Se incubeaza 60 min la temperatura camerei.

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI

Reactia deHEMAGLUTINARE si HEMAGLUTINO-INHIBARE

NAT (nucleic acid tests)

• Quick Diagnosis of Flu Strains Possible with New Microchip Test (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) - FluChip,

• Inexpensive Test Detects influenza Infections Quickly and Accurately (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) – MChip

• FDA Approves New Laboratory Test To Detect Human Infections With Avian Influenza A/H5 Viruses (Food and Drug Administration)

Diagnosticul serologic

• Necesita recoltarea de probe de ser pereche de la acelasi pacient.

• Nu se practica in mod curent decit in caz de epidemii, pentru diagnostic retrospectiv.

• Diagnosticul necesita demonstrarea unei cresteri semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac specifici antivirali intre proba de faza acuta, recoltata la o saptamana de la debutul bolii si cea din convalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai tarziu.

• Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor anti virali specifici este hemaglutinoinhibarea.

Matrice

Nucleocapsida helicoidalaARNss

HA - hemaglutinina

transcriptazaanvelopa

NA - neuraminidaza

DIAGNOSTIC SEROLOGIC = Tulpini de referinta + ser pacient

Diagnostic in infectia cu alfaherpesvirusuri

PRODUSE PATOLOGICE

• Recoltare recomandata in cazul leziunilor active (50% sanse de izolare virala)

• Lichid vezicular

• Tampon conjunctival

• Tampoane vaginale, lavajul cervico-vaginal, tampon uretral

Alegerea tipului de dg depinde de prezentarea clinica

• Izolare virala = Cultura virala

• Diagnostic direct = – PCR– Imunofluorescenta directa

• Diagnostic indirect - valoarea testelor serologice

DIAGNOSTIC DE ELECTIE Izolare virala -HSV 1 si 2: ECP apare la 2-3 zile cu raspandire rapida-VVZ: ECP apare lent, focalizat cu raspandire in 1-2 saptamani

• HEp2

• HEK

• NCI-H292

• RD

• MR-5

• Culturi primare de rinichi de iepure

• Culturi diploide de fibroblaste

Sincitiu = celule balonizate, multinucleateIncluzii intranucleare acidofile = corpii Cowdry A

Sanse crescute de izolare -in primoinfectie -in stadii incipiente vs. in cazul aparitiei crustelor-in cazul leziunilor veziculare fara suprainfectie

Imunofluorescenta directa – test specific, reproductibil, ieftin

Recoltare - pp. lichid vezicular

• Stadiu vezicular – izolare virala (recoltare cu siringa cu ac)

• Raclaj de celule bazale si parabazale de la nivelul leziunii veziculare (recoltare cu un tampon cu cap de vata. A nu se contamina cu sange)

Extemporaneu fixare

Fixare pe lamaamprente (HSV)

• Amprenta se va usca bine:

1.pp. amprentat direct pe lama

2. sedimentul celular obtinut prin recoltare cu MTV

• Imersie in acetona la 2-8°C timp de 10 minute si uscare.

• Se lucreaza sau depoziteaza la -20°C cu desicanti

ID

PP

Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei

• Incubare (15min la 37° C)• Spalare • Montare• Citire

ID

PP

Anticorpi monoclonali marcati ITCF anti epitopi specifici de la nivelul anvelopei-gp C si ICP35 (HSV1) =110-120kd-polipeptide (HSV2) =78-82kd

IFD in celule epiteliale

Celule negative

Testul este

1. pozitiv daca pe lama sunt cel putin 2 celule fluorescente

2. negativ daca sunt cel putin 20 de celule fara fluorescenta

3. invalid daca nu sunt cel putin 20 de celule pe lama

Real time PCR-metode mai sensibile de confirmare a dg. de infectie cu HSV

• PCR este util mai ales in:-detectia HSV in excretia asimptomatica

-evaluarea riscului transmiterii HSV in cupluri discordante-eficienta supresiei replicarii virale in terapia antivirala

-encefalita herpetica

• PCR NU ESTE DG DE PRIMA ELECTIE IN MULTE LABORATOARE DE REFERINTA DEOARECE:

-costul testelor comerciale este crescut vs izolare virala-lipseste uniformitatea validarii testelor PCR ca metoda

comerciala de dg. din pp. diferite de LCR

Teste serologice specifice Serologia singura nu este considerata ca dg de confirmare ci se alatura testelor de dg. direct.

Exista mai multe tipuri de teste EIA aprobate de FDA. Se utilizeaza in urmatoarele cazuri:

• In dg de infectie cu HSV-2 sau HSV-1 la pacientii simptomatici ce prezinta culturi virale negative sau care nu au fost testati in momentul evaluarii initiale.

• Identifica infectia acuta sau latenta cu HSV-1 sau HSV-2 la pacientii cu prezentare clinica atipica.

• Se efectueaza la partenerii sexuali ai pacientilor cu dg. confirmat pentru a determina o posibila infectie subclinica sau asimptomatica

• Diagnosticarea femeilor insarcinate asimptomatice cu infectie HSV-2 sau HSV-1 la nivel genital pentru a preveni riscul transmiterii materno-fetale in momentul traversarii canalului de nastere

• Determinarea tipului de HSV pentru semnificatie prognostica. Recurentele sunt mai frecvente in cazul infectiei cu HSV-2 decat cu HSV-1.

Diagnostic in infectia cu betaherpesvirusuri

CMV• Izolare virala pe fibroblaste diploide umane sau prin metode rapide

tip: "spin enhanced culture", in care produsul patologic este inoculat pe lame individuale acoperite cu monostrat celular confluent, care sunt centrifugate la viteza mica pentru a favoriza adsorbtia. Dupa 2 zile se poate realiza detectia antigenelor timpurii prin IF. Pp în functie de simptomatologie: lavaj bronhoalveolar; LCR, leucocite, biopsii tisulare; singe pe anticoagulant, urina, (in orice boala generalizata, inclusiv boala cu incluzii CMV a nou nãscutului)

• IF directã pentru detectia atigenelor pp65. Pp fractia limfocitara (Se dilueaza sangele anaparte cu ser fiziologic. Se amesteca 1/3 mediu de separare limfocitar si 2/3 sange diluat in prealabil. Se centrifugheaza la temperatura camerei 20 minute la 1500 g. Se recupereaza plasma care este recentrifugata. Se reia inelul care contine celulele mononucleate periferice (PBMC) in 3 ml TFS, se amesteca, se spala in 20-25 ml TFS, prin centrifugare la 400 g, 10 minute. Se reiau celulele in mediu de cultura fara ados de ser vitel si se calculeaza numarul de celule/ml.)

• PCR pentru ADN CMV. Pp sange pe anticoagulant, lichid amniotic

• ELISA de capturã pentru anticorpi anti CMV IgM; ELISA cantitative pentru evidentierea seroconversiei in anticorpi anti CMV IgG pe probe pereche de ser.

ECP CMV

Diagnostic serologic al infectiei cu CMV la gravide

PRIMA TESTARE

Diagnostic in infectia cu gamaherpesvirusuri

EBV

• EIA si IF

• anticorpi anti capsidari IgM (anti VCA)

• anticorpi anti nucleari (anti EBNA) (pp=ser)

• PCR pentru ADN EBV

(pp=biopsie tisulara, sânge integral)