11

LABORATORIO NACIONAL DE LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA REFERENCIA PARA

ENFERMEDADES DE LOS ENFERMEDADES DE LOS PECESPECES

LCV-ALGETE

N. FRIAS SORIANOP. FERNANDEZ SOMALO

22

ORGANIGRAMAORGANIGRAMAMMAMRM

Secretaría de Estado de Medio Rural y Agua

Secretaría de Estado de Cambio Climático

Se.G. DE MEDIO RURAL Se.G. DEL MAR

D.G. RECURSOS AGRÍCOLAS Y GANADEROS

S.G. SANIDAD DE LA PRODUCCION PRIMARIA

LCV

LNR Enfermedades Peces

JACUMAR.

33

Coordinadora Generalde Laboratorios

Laboratorio Central de Veterinaria de Algete

Lab.. Central de Sanidad Animal de Santa Fe

Servicio de Garantía de Calidad

Servicio deApoyo

Directora Técnica deSanidad Animal

Director Técnico deGenética Molecular

Servicio de I+D

Servicio deBiobancos

Director Adjunto deSanidad Animal

Dpto. de Patologíade Mamíferos y

Control de Biológicos

Dpto. de Patología deAves y otras Especies

Dpto. Ictiopatología

Dpto. de EnfermedadesEmergentes

Dpto. de Bacteriología

Dpto. P.C.R.

Dpto. Salmonelosis

Dpto. Animalario

Dpto. EncefalopatíasEspongiformesTransmisibles

Director Adjunto deGenética Molecular

Dpto. de Gestión deRecursos Zoogenéticos

Dpto. de IdentificaciónGenética

Dpto. de Controlde O.G.M.

Dpto. Genotipado

44

COODINADORA

DIRECTORA SANIDAD ANIMAL DIRECTOR GENÉTICA MOLECULAR

ICTIOPATOLOGIA

BACTERIOLOGIA

ANATOMÏA PATOLÓGICA

PCR

INVESTIGACIÓN+ DESORROLLO

ANIMALARIO

VIROLOGIA

PARASITOLOGIA

PECES

55

Edificio Central Edificio Central

Laboratorio de EETLaboratorio de EET’’ss

Laboratorio de Laboratorio de GenotipadoGenotipado

66

Referencias a nivel nacional

Laboratorio Nacional de Referencia de Peste Equina Africana (R.D. 29/12/89)Laboratorio Nacional de Referencia de Leucosis Enzoótica Bovina(O.M.28/2/86)Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Peces (R.D. 22/9/94)Laboratorio Nacional de Referencia de Aujeszky (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Influenza Aviar (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Newcastle (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Salmonelosis en animales (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de EET´s ( UE 2005)Laboratorio Nacional de Referencia para el análisis del gen resistente a las ETTsLaboratorio Nacional de Referencia de Filiaciones en Equidos (R.D. 25/5/07)Laboratorio Nacional de Referencia de Fiebre Aftosa (R.D. 17/11/04)Laboratorio Nacional de Referencia para distintas zoonosis (R.D. 01/10/04)

Referencias a nivel internacional

Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la UE (DOCCEE 10/6/92)Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la OIE (10/3/93)

REFERENCIAS LCVLNR EN LCVLNR EN LCV

77

Red de Laboratorios de animales Red de Laboratorios de animales acuacuááticosticos

Laboratorios Nacionales de ReferenciaLaboratorios Nacionales de ReferenciaEnfermedades de los peces y crustEnfermedades de los peces y crustááceosceos: : Laboratorio Central de Sanidad Animal del Laboratorio Central de Sanidad Animal del MMARMMMARMAlgeteAlgete (Madrid).(Madrid).

Enfermedades de los moluscos bivalvosEnfermedades de los moluscos bivalvos: : Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC, Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC, Vigo (Pontevedra). Vigo (Pontevedra).

88

LABORATORIO DESIGNADO Asturias LABORATORIO DESIGNADO Asturias SERIDA (GijSERIDA (Gijóónn))LABORATORIO DESIGNADO Cantabria (Santander)LABORATORIO DESIGNADO Cantabria (Santander)LABORATORIOLABORATORIO DESIGNADO Galicia (Lugo)DESIGNADO Galicia (Lugo)LABORATORIOLABORATORIO DESIGNADO AragDESIGNADO Aragóón n FV (ZaragozaFV (Zaragoza))LABORATORIO DESIGNADO Castilla LeLABORATORIO DESIGNADO Castilla Leóón (Soria)n (Soria)

Red de Laboratorios de animales Red de Laboratorios de animales acuacuááticosticos

99

R.DR.D. 1614/2008 Anexo IV: . 1614/2008 Anexo IV: Lista de Enfermedades de peces Lista de Enfermedades de peces

EXEXÓÓTICASTICASNecrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Epizootica (NHE o tica Epizootica (NHE o EHN)EHN)SSííndrome Ulceroso Epizondrome Ulceroso Epizoóótico (SUE o EUS)tico (SUE o EUS)

NO EXNO EXÓÓTICASTICASSepticemia HemorrSepticemia Hemorráágica Viral (SHV o VHS)gica Viral (SHV o VHS)Necrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Infecciosa (NHI o IHN)tica Infecciosa (NHI o IHN)Enfermedad del Herpes virus Koi (KHV o EHVK)Enfermedad del Herpes virus Koi (KHV o EHVK)Anemia Infecciosa del SalmAnemia Infecciosa del Salmóón (AIS o ISA)n (AIS o ISA)

1010

Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (I)Nacionales de Referencia (I)

Comprometerse a informar al organismo Comprometerse a informar al organismo competente, cuando sospechen la competente, cuando sospechen la apariciaparicióónn de de cualquiera de las cualquiera de las enfermedadesenfermedades que figuran en el que figuran en el anexoanexo IV del IV del R.DR.D..

Garantizar la Garantizar la confirmaciconfirmacióónn de los resultados de los resultados positivospositivos de todos los focos de enfermedades de todos los focos de enfermedades exexóóticasticas, as, asíí como de los focos primarios de como de los focos primarios de enfermedades enfermedades no exno exóóticasticas enumerados en el anexo enumerados en el anexo IVIV

1111

Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Nacionales de Referencia(IIReferencia(II))

Facilitar el Facilitar el adiestramientoadiestramiento o la puesta al do la puesta al díía de a de expertosexpertos en diagnen diagnóóstico de laboratorio.stico de laboratorio.

Coordinar los mCoordinar los méétodostodos empleados en Espaempleados en Españña para a para diagnosticar las enfermedades de las que son diagnosticar las enfermedades de las que son responsables.responsables.

Organizar periOrganizar perióódicamente dicamente pruebas comparativas pruebas comparativas nacionalesnacionales (pruebas de anillo) de los procedimientos (pruebas de anillo) de los procedimientos de diagnde diagnóóstico con los laboratorios oficiales de las stico con los laboratorios oficiales de las CCAACCAA..

1212

Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Nacionales de Referencia(IIIReferencia(III))

El MMAMRM podrEl MMAMRM podráá autorizar que un laboratorio autorizar que un laboratorio nacional de referencia situado en Espanacional de referencia situado en Españña a aprovecheaprovechelas las competenciascompetencias y la capacidad de y la capacidad de otrosotroslaboratorioslaboratorios respecto a una o varias de las respecto a una o varias de las enfermedades de que se encargan, siempre que enfermedades de que se encargan, siempre que dichos laboratorios cumplan los requisitos dichos laboratorios cumplan los requisitos pertinentes establecidos. pertinentes establecidos. No obstante, el laboratorio nacional de referencia No obstante, el laboratorio nacional de referencia seguirseguiráá siendo el punto de contacto para el citado siendo el punto de contacto para el citado Ministerio y para el laboratorio comunitario de Ministerio y para el laboratorio comunitario de referencia.referencia.

1313

Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (IV)Nacionales de Referencia (IV)

CooperarCooperar con el con el laboratorio comunitario de laboratorio comunitario de referenciareferencia y participar en las pruebas comparativas y participar en las pruebas comparativas organizadas por ellosorganizadas por ellos

FuncionarFuncionar y ser evaluados y acreditados con arreglo y ser evaluados y acreditados con arreglo a la norma a la norma EN ISO/IEC 17025:2005EN ISO/IEC 17025:2005 ““Requisitos Requisitos generales relativos a la competencia de los generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracilaboratorios de ensayo y calibracióónn””, o aquella que , o aquella que la sustituya o desarrolle.la sustituya o desarrolle.

1414

ACTIVIDADES DE DIAGNOSTICOACTIVIDADES DE DIAGNOSTICO

El diagnóstico esta dirigido, fundamentalmente, a

detectar enfermedades incluidos en el Anexo IV del RD

1614/2008

Diagnóstico bacteriológico

Diagnóstico parasitológico.

Diagnóstico virológico.

1515

ENFERMEDADES BACTERIANAS DE LOS PECES

Principales enfermedades bacterianas que se diagnostican en el laboratorio:

YERSINIOSISBKD ó enfermedad bacteriana renalFURUNCULOSISVIBRIOSISESTREPTOCOCOSISFLAVOBACTERIOSISPASTEURELOSISEDWARDSIELLOSISSEPTICEMIA por AEROMONAS móviles

LCV-ALGETE

1616

METODOS DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICOS

•Examen microscópico directo sobre cortes, improntas o extensiones de las muestras utilizando diferentes tipos de tinciones•Siembras en medios generales y selectivos (TSA, BHI, Cytophaga, TCBS.….)•Incubación a temperaturas entre 15 - 22ºC •Identificación: morfológica y mediante pruebas bioquímicas, serológicas e inmunoenzimáticas•Confirmación por pruebas moleculares: PCR y secuenciación parcial del 16s RNA

1717

1818

1919

LNRLNR

BACTERIOLOGBACTERIOLOGÍÍAAICTIOPATOLOGICTIOPATOLOGÍÍAA

VIROLOGVIROLOGÍÍAAPARASITOLOGPARASITOLOGÍÍAA

ANATOMANATOMÍÍA PATOLA PATOLÓÓGICAGICAPCRPCRNUEVOS DESARROLLOSNUEVOS DESARROLLOSANIMALARIOANIMALARIO

2020

PARASITOLOGPARASITOLOGÍÍAA

AnAnáálisis de las muestras remitidas.lisis de las muestras remitidas.Recogidas por servicios oficiales de CCAA Recogidas por servicios oficiales de CCAA que no disponen de laboratorios de peces.que no disponen de laboratorios de peces.

AnAnáálisis para emisilisis para emisióón de certificados de n de certificados de exportaciexportacióón:n:

Ausencia de determinados parAusencia de determinados paráásitos en sitos en pescado congelado utilizado como cebo.pescado congelado utilizado como cebo.

2121

MMÉÉTODOS DE DIAGNTODOS DE DIAGNÓÓSTICO STICO PARASITOLPARASITOLÓÓGICOSGICOS

Examen macroscExamen macroscóópicopicoExamen microscExamen microscóópico de muestras en frescopico de muestras en fresco

Raspados intestinales Raspados intestinales FlotaciFlotacióón (recuento de huevos en heces)n (recuento de huevos en heces)MMúúsculo, hsculo, híígado, ggado, góónadasnadasAletas, branquias. Aletas, branquias. Arcos branquiales (digestiArcos branquiales (digestióón n áácida/bcida/báásica) sica)

Examen hematolExamen hematolóógicogicoExamen histopatolExamen histopatolóógico gico

2222

ParParáásitossitos

Ooquiste deGoussia

Ooquiste Eimeria

2323

ACTIVIDADES VIROLOGACTIVIDADES VIROLOGÍÍA (I)A (I)Diagnóstico de muestras de los programas de vigilancia remitidos por algunas CCAA. Confirmación de los resultados positivos de todos los focos de enfermedades de las que son responsables.Mantenimiento de un cepario de casos confirmados.Suministrar a los laboratorios designados reactivos para el diagnóstico.

CélulasCepas de referenciaAntisueros

Cooperación con el Laboratorio Comunitario de Referencia para la elaboración de encuestas epidemiológicas de las enfermedades listadas en colaboración con las CCAA.

2424

ACTIVIDADES VIROLOGACTIVIDADES VIROLOGÍÍA (II)A (II)Facilitar el Facilitar el adiestramientoadiestramiento o la puesta al do la puesta al díía de a de expertos en diagnexpertos en diagnóósticos de laboratorio.sticos de laboratorio.ParticipaciParticipacióónn en en RingRing TestTest para las para las enfermedades listadas:enfermedades listadas:

NHI, SHV, NPI y VPC LCR (Aarhus DK) NHI, SHV, NPI y VPC LCR (Aarhus DK) KHV OIE (CEFAS) KHV OIE (CEFAS) WeymouthWeymouth UKUKISA Por determinar ISA Por determinar EHN LCR (Aarhus DK) en 2009 EHN LCR (Aarhus DK) en 2009

OrganizaciOrganizacióónn de de RingRing TestTest con los laboratorios con los laboratorios designados por las designados por las CCAACCAA..

2525

DIAGNOSTICO VIROLOGICODIAGNOSTICO VIROLOGICO

Enfermedades incluidas en el ”Anexo IV”del RD 1614/2008 Necrosis Pancreática InfecciosaViremia Primaveral de la Carpa y otros rhabdovirus relacionados.Enfermedad del SueñoNodavirus VER

2626

Anexo IV: Lista de Enfermedades Anexo IV: Lista de Enfermedades de pecesde peces

EXEXÓÓTICASTICASNecrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética tica EpizooticaEpizootica (NHE o EHN)(NHE o EHN)SSííndrome Ulceroso Epizondrome Ulceroso Epizoóótico (SUE o EUS)tico (SUE o EUS)

NO EXNO EXÓÓTICASTICASSepticemia HemorrSepticemia Hemorráágica Viral (SHV o VHS)gica Viral (SHV o VHS)Necrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Infecciosa (NHI o IHN)tica Infecciosa (NHI o IHN)Enfermedad del Enfermedad del HerpesvirusHerpesvirus KoiKoi (KHV o EHVK)(KHV o EHVK)Anemia Infecciosa del SalmAnemia Infecciosa del Salmóón (AIS o ISA)n (AIS o ISA)

2727

METODOS DE DIAGNOSTICO METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLOGICOVIROLOGICO

NHI y SHV, en el Real Decreto 138/1997 (2001/183/CE). Aislamiento vírico en cultivos celulares.Identificación del virus:

SeroneutralizaciónInmunofluorescencia Técnicas Inmunoenzimáticas (ELISA)

Técnicas de PCR

2828

AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES I

Las líneas celulares más habituales en los programas de vigilancia de SHV y NHI, son:EPC (Epithelioma papulosum cyprini) Son células epiteliales de piel de carpa.FHM (celulas epiteliales), junto con EPC se emplean para las encuestas de vigilancia. RTG-2 (tejido gonadal de trucha arcoiris) Son células de gónadas y tienen una forma fibroblástica.BF-2 (fibroblastos de alevín de bluegill).

2929

AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES II

SSNSSN--11(Fhis striped snakehead fry), (Fhis striped snakehead fry), se emplea se emplea para el aislamiento para el aislamiento del virus de la del virus de la encefalopatencefalopatííaay y retinopatretinopatííaa de la de la lubinalubina (VER o VNN). (VER o VNN).

SHKSHK--11( Atlantic salmon head kidney) se ( Atlantic salmon head kidney) se empleaempleaen el en el aislamientoaislamiento de la de la AnemiaAnemia infecciosainfecciosa del del salmsalmóónn (ISA)(ISA)

KFKF ( ( KoiKoi fin) En el fin) En el aislamientoaislamiento de Herpes Virus de Herpes Virus KoiKoi (KHV)(KHV)

3030

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

3131

SERONEUTRALIZACIONSERONEUTRALIZACION

Consiste en Neutralizar el virus con su Consiste en Neutralizar el virus con su antisueroantisueroespecespecíífico impidiendo por tanto el ECP.fico impidiendo por tanto el ECP.

Si SNSi SN

No SNNo SN

3232

SDV CPE BFSDV CPE BF--2 CELLS2 CELLS

SDV CPE in BF2-cells BF2-cells

3333

INMUNOFLUORESCENCIAINMUNOFLUORESCENCIASobre cultivos infectados y fijados.Sobre cultivos infectados y fijados.AdiciAdicióón de anticuerpos n de anticuerpos PabPab o o MabMabTinciTincióón con n con antisueroantisuero conjugado con conjugado con fluorocromofluorocromo..

2º Ab

1 º Ab

Célula

Virus

3434

ELISA DETECCIELISA DETECCIÓÓN N AgAg

KitsKits Comerciales:Comerciales:SHVSHVNHINHINPINPISVCSVC

3535

PCRPCRApoyo a los distintos departamentos.Apoyo a los distintos departamentos.ConfirmaciConfirmacióón de aislados. n de aislados.

Para todas las enfermedades listadas Para todas las enfermedades listadas VERVERSDVSDVIPNIPNSVCSVCBKDBKD

SecuenciaciSecuenciacióón parcial del 16s RNAn parcial del 16s RNA

3636

682pb548pb

697pb

GELES DE ELECTROFORESIS PARA PRODUCTOS DE AMPLIFICACION EN PCRs DE NHI Y SHV

Necrosis Hematopoyética Septicemia HemorrágicaMarcador Marcador Marcador

de DNA 1ª PCR de DNA 2ª PCR de DNA 1ª PCR

LCV-ALGETE

3737

INVESTIGACION + DESARROLLOINVESTIGACION + DESARROLLO

ImplementaciImplementacióón de nuevas tn de nuevas téécnicascnicasPCR PCR MultiplexMultiplex para NHI, SHV y NPIpara NHI, SHV y NPI

Puesta a punto de PCR tiempo realPuesta a punto de PCR tiempo realGenotiparGenotipar: :

SHV: I, II, III, IVSHV: I, II, III, IVNHI: G, MNHI: G, MIPN:IPN:VPC: I, II, III, IVVPC: I, II, III, IV

SecuenciaciSecuenciacióón Caracterizacin Caracterizacióónn

3838

PCR PCR MultiplexMultiplex para VHS, IHN e IPNpara VHS, IHN e IPN

VHSV

IHNV

IPNV

3939

ANIMALARIOANIMALARIO

ObtenciObtencióón de anticuerpos n de anticuerpos policlonalespoliclonales, , mediante inyeccimediante inyeccióón de virus purificados en n de virus purificados en conejos.conejos.

GRACIAS POR SU GRACIAS POR SU ATENCIATENCIÓÓNN