11
LABORATORIO NACIONAL DE LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA REFERENCIA PARA
ENFERMEDADES DE LOS ENFERMEDADES DE LOS PECESPECES
LCV-ALGETE
N. FRIAS SORIANOP. FERNANDEZ SOMALO
22
ORGANIGRAMAORGANIGRAMAMMAMRM
Secretaría de Estado de Medio Rural y Agua
Secretaría de Estado de Cambio Climático
Se.G. DE MEDIO RURAL Se.G. DEL MAR
D.G. RECURSOS AGRÍCOLAS Y GANADEROS
S.G. SANIDAD DE LA PRODUCCION PRIMARIA
LCV
LNR Enfermedades Peces
JACUMAR.
33
Coordinadora Generalde Laboratorios
Laboratorio Central de Veterinaria de Algete
Lab.. Central de Sanidad Animal de Santa Fe
Servicio de Garantía de Calidad
Servicio deApoyo
Directora Técnica deSanidad Animal
Director Técnico deGenética Molecular
Servicio de I+D
Servicio deBiobancos
Director Adjunto deSanidad Animal
Dpto. de Patologíade Mamíferos y
Control de Biológicos
Dpto. de Patología deAves y otras Especies
Dpto. Ictiopatología
Dpto. de EnfermedadesEmergentes
Dpto. de Bacteriología
Dpto. P.C.R.
Dpto. Salmonelosis
Dpto. Animalario
Dpto. EncefalopatíasEspongiformesTransmisibles
Director Adjunto deGenética Molecular
Dpto. de Gestión deRecursos Zoogenéticos
Dpto. de IdentificaciónGenética
Dpto. de Controlde O.G.M.
Dpto. Genotipado
44
COODINADORA
DIRECTORA SANIDAD ANIMAL DIRECTOR GENÉTICA MOLECULAR
ICTIOPATOLOGIA
BACTERIOLOGIA
ANATOMÏA PATOLÓGICA
PCR
INVESTIGACIÓN+ DESORROLLO
ANIMALARIO
VIROLOGIA
PARASITOLOGIA
PECES
55
Edificio Central Edificio Central
Laboratorio de EETLaboratorio de EET’’ss
Laboratorio de Laboratorio de GenotipadoGenotipado
66
Referencias a nivel nacional
Laboratorio Nacional de Referencia de Peste Equina Africana (R.D. 29/12/89)Laboratorio Nacional de Referencia de Leucosis Enzoótica Bovina(O.M.28/2/86)Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Peces (R.D. 22/9/94)Laboratorio Nacional de Referencia de Aujeszky (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Influenza Aviar (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Newcastle (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de Salmonelosis en animales (R.D. 28/4/95)Laboratorio Nacional de Referencia de EET´s ( UE 2005)Laboratorio Nacional de Referencia para el análisis del gen resistente a las ETTsLaboratorio Nacional de Referencia de Filiaciones en Equidos (R.D. 25/5/07)Laboratorio Nacional de Referencia de Fiebre Aftosa (R.D. 17/11/04)Laboratorio Nacional de Referencia para distintas zoonosis (R.D. 01/10/04)
Referencias a nivel internacional
Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la UE (DOCCEE 10/6/92)Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la OIE (10/3/93)
REFERENCIAS LCVLNR EN LCVLNR EN LCV
77
Red de Laboratorios de animales Red de Laboratorios de animales acuacuááticosticos
Laboratorios Nacionales de ReferenciaLaboratorios Nacionales de ReferenciaEnfermedades de los peces y crustEnfermedades de los peces y crustááceosceos: : Laboratorio Central de Sanidad Animal del Laboratorio Central de Sanidad Animal del MMARMMMARMAlgeteAlgete (Madrid).(Madrid).
Enfermedades de los moluscos bivalvosEnfermedades de los moluscos bivalvos: : Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC, Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC, Vigo (Pontevedra). Vigo (Pontevedra).
88
LABORATORIO DESIGNADO Asturias LABORATORIO DESIGNADO Asturias SERIDA (GijSERIDA (Gijóónn))LABORATORIO DESIGNADO Cantabria (Santander)LABORATORIO DESIGNADO Cantabria (Santander)LABORATORIOLABORATORIO DESIGNADO Galicia (Lugo)DESIGNADO Galicia (Lugo)LABORATORIOLABORATORIO DESIGNADO AragDESIGNADO Aragóón n FV (ZaragozaFV (Zaragoza))LABORATORIO DESIGNADO Castilla LeLABORATORIO DESIGNADO Castilla Leóón (Soria)n (Soria)
Red de Laboratorios de animales Red de Laboratorios de animales acuacuááticosticos
99
R.DR.D. 1614/2008 Anexo IV: . 1614/2008 Anexo IV: Lista de Enfermedades de peces Lista de Enfermedades de peces
EXEXÓÓTICASTICASNecrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Epizootica (NHE o tica Epizootica (NHE o EHN)EHN)SSííndrome Ulceroso Epizondrome Ulceroso Epizoóótico (SUE o EUS)tico (SUE o EUS)
NO EXNO EXÓÓTICASTICASSepticemia HemorrSepticemia Hemorráágica Viral (SHV o VHS)gica Viral (SHV o VHS)Necrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Infecciosa (NHI o IHN)tica Infecciosa (NHI o IHN)Enfermedad del Herpes virus Koi (KHV o EHVK)Enfermedad del Herpes virus Koi (KHV o EHVK)Anemia Infecciosa del SalmAnemia Infecciosa del Salmóón (AIS o ISA)n (AIS o ISA)
1010
Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (I)Nacionales de Referencia (I)
Comprometerse a informar al organismo Comprometerse a informar al organismo competente, cuando sospechen la competente, cuando sospechen la apariciaparicióónn de de cualquiera de las cualquiera de las enfermedadesenfermedades que figuran en el que figuran en el anexoanexo IV del IV del R.DR.D..
Garantizar la Garantizar la confirmaciconfirmacióónn de los resultados de los resultados positivospositivos de todos los focos de enfermedades de todos los focos de enfermedades exexóóticasticas, as, asíí como de los focos primarios de como de los focos primarios de enfermedades enfermedades no exno exóóticasticas enumerados en el anexo enumerados en el anexo IVIV
1111
Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Nacionales de Referencia(IIReferencia(II))
Facilitar el Facilitar el adiestramientoadiestramiento o la puesta al do la puesta al díía de a de expertosexpertos en diagnen diagnóóstico de laboratorio.stico de laboratorio.
Coordinar los mCoordinar los méétodostodos empleados en Espaempleados en Españña para a para diagnosticar las enfermedades de las que son diagnosticar las enfermedades de las que son responsables.responsables.
Organizar periOrganizar perióódicamente dicamente pruebas comparativas pruebas comparativas nacionalesnacionales (pruebas de anillo) de los procedimientos (pruebas de anillo) de los procedimientos de diagnde diagnóóstico con los laboratorios oficiales de las stico con los laboratorios oficiales de las CCAACCAA..
1212
Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Nacionales de Referencia(IIIReferencia(III))
El MMAMRM podrEl MMAMRM podráá autorizar que un laboratorio autorizar que un laboratorio nacional de referencia situado en Espanacional de referencia situado en Españña a aprovecheaprovechelas las competenciascompetencias y la capacidad de y la capacidad de otrosotroslaboratorioslaboratorios respecto a una o varias de las respecto a una o varias de las enfermedades de que se encargan, siempre que enfermedades de que se encargan, siempre que dichos laboratorios cumplan los requisitos dichos laboratorios cumplan los requisitos pertinentes establecidos. pertinentes establecidos. No obstante, el laboratorio nacional de referencia No obstante, el laboratorio nacional de referencia seguirseguiráá siendo el punto de contacto para el citado siendo el punto de contacto para el citado Ministerio y para el laboratorio comunitario de Ministerio y para el laboratorio comunitario de referencia.referencia.
1313
Funciones de los Laboratorios Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (IV)Nacionales de Referencia (IV)
CooperarCooperar con el con el laboratorio comunitario de laboratorio comunitario de referenciareferencia y participar en las pruebas comparativas y participar en las pruebas comparativas organizadas por ellosorganizadas por ellos
FuncionarFuncionar y ser evaluados y acreditados con arreglo y ser evaluados y acreditados con arreglo a la norma a la norma EN ISO/IEC 17025:2005EN ISO/IEC 17025:2005 ““Requisitos Requisitos generales relativos a la competencia de los generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracilaboratorios de ensayo y calibracióónn””, o aquella que , o aquella que la sustituya o desarrolle.la sustituya o desarrolle.
1414
ACTIVIDADES DE DIAGNOSTICOACTIVIDADES DE DIAGNOSTICO
El diagnóstico esta dirigido, fundamentalmente, a
detectar enfermedades incluidos en el Anexo IV del RD
1614/2008
Diagnóstico bacteriológico
Diagnóstico parasitológico.
Diagnóstico virológico.
1515
ENFERMEDADES BACTERIANAS DE LOS PECES
Principales enfermedades bacterianas que se diagnostican en el laboratorio:
YERSINIOSISBKD ó enfermedad bacteriana renalFURUNCULOSISVIBRIOSISESTREPTOCOCOSISFLAVOBACTERIOSISPASTEURELOSISEDWARDSIELLOSISSEPTICEMIA por AEROMONAS móviles
LCV-ALGETE
1616
METODOS DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICOS
•Examen microscópico directo sobre cortes, improntas o extensiones de las muestras utilizando diferentes tipos de tinciones•Siembras en medios generales y selectivos (TSA, BHI, Cytophaga, TCBS.….)•Incubación a temperaturas entre 15 - 22ºC •Identificación: morfológica y mediante pruebas bioquímicas, serológicas e inmunoenzimáticas•Confirmación por pruebas moleculares: PCR y secuenciación parcial del 16s RNA
1717
1818
1919
LNRLNR
BACTERIOLOGBACTERIOLOGÍÍAAICTIOPATOLOGICTIOPATOLOGÍÍAA
VIROLOGVIROLOGÍÍAAPARASITOLOGPARASITOLOGÍÍAA
ANATOMANATOMÍÍA PATOLA PATOLÓÓGICAGICAPCRPCRNUEVOS DESARROLLOSNUEVOS DESARROLLOSANIMALARIOANIMALARIO
2020
PARASITOLOGPARASITOLOGÍÍAA
AnAnáálisis de las muestras remitidas.lisis de las muestras remitidas.Recogidas por servicios oficiales de CCAA Recogidas por servicios oficiales de CCAA que no disponen de laboratorios de peces.que no disponen de laboratorios de peces.
AnAnáálisis para emisilisis para emisióón de certificados de n de certificados de exportaciexportacióón:n:
Ausencia de determinados parAusencia de determinados paráásitos en sitos en pescado congelado utilizado como cebo.pescado congelado utilizado como cebo.
2121
MMÉÉTODOS DE DIAGNTODOS DE DIAGNÓÓSTICO STICO PARASITOLPARASITOLÓÓGICOSGICOS
Examen macroscExamen macroscóópicopicoExamen microscExamen microscóópico de muestras en frescopico de muestras en fresco
Raspados intestinales Raspados intestinales FlotaciFlotacióón (recuento de huevos en heces)n (recuento de huevos en heces)MMúúsculo, hsculo, híígado, ggado, góónadasnadasAletas, branquias. Aletas, branquias. Arcos branquiales (digestiArcos branquiales (digestióón n áácida/bcida/báásica) sica)
Examen hematolExamen hematolóógicogicoExamen histopatolExamen histopatolóógico gico
2222
ParParáásitossitos
Ooquiste deGoussia
Ooquiste Eimeria
2323
ACTIVIDADES VIROLOGACTIVIDADES VIROLOGÍÍA (I)A (I)Diagnóstico de muestras de los programas de vigilancia remitidos por algunas CCAA. Confirmación de los resultados positivos de todos los focos de enfermedades de las que son responsables.Mantenimiento de un cepario de casos confirmados.Suministrar a los laboratorios designados reactivos para el diagnóstico.
CélulasCepas de referenciaAntisueros
Cooperación con el Laboratorio Comunitario de Referencia para la elaboración de encuestas epidemiológicas de las enfermedades listadas en colaboración con las CCAA.
2424
ACTIVIDADES VIROLOGACTIVIDADES VIROLOGÍÍA (II)A (II)Facilitar el Facilitar el adiestramientoadiestramiento o la puesta al do la puesta al díía de a de expertos en diagnexpertos en diagnóósticos de laboratorio.sticos de laboratorio.ParticipaciParticipacióónn en en RingRing TestTest para las para las enfermedades listadas:enfermedades listadas:
NHI, SHV, NPI y VPC LCR (Aarhus DK) NHI, SHV, NPI y VPC LCR (Aarhus DK) KHV OIE (CEFAS) KHV OIE (CEFAS) WeymouthWeymouth UKUKISA Por determinar ISA Por determinar EHN LCR (Aarhus DK) en 2009 EHN LCR (Aarhus DK) en 2009
OrganizaciOrganizacióónn de de RingRing TestTest con los laboratorios con los laboratorios designados por las designados por las CCAACCAA..
2525
DIAGNOSTICO VIROLOGICODIAGNOSTICO VIROLOGICO
Enfermedades incluidas en el ”Anexo IV”del RD 1614/2008 Necrosis Pancreática InfecciosaViremia Primaveral de la Carpa y otros rhabdovirus relacionados.Enfermedad del SueñoNodavirus VER
2626
Anexo IV: Lista de Enfermedades Anexo IV: Lista de Enfermedades de pecesde peces
EXEXÓÓTICASTICASNecrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética tica EpizooticaEpizootica (NHE o EHN)(NHE o EHN)SSííndrome Ulceroso Epizondrome Ulceroso Epizoóótico (SUE o EUS)tico (SUE o EUS)
NO EXNO EXÓÓTICASTICASSepticemia HemorrSepticemia Hemorráágica Viral (SHV o VHS)gica Viral (SHV o VHS)Necrosis HematopoyNecrosis Hematopoyéética Infecciosa (NHI o IHN)tica Infecciosa (NHI o IHN)Enfermedad del Enfermedad del HerpesvirusHerpesvirus KoiKoi (KHV o EHVK)(KHV o EHVK)Anemia Infecciosa del SalmAnemia Infecciosa del Salmóón (AIS o ISA)n (AIS o ISA)
2727
METODOS DE DIAGNOSTICO METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLOGICOVIROLOGICO
NHI y SHV, en el Real Decreto 138/1997 (2001/183/CE). Aislamiento vírico en cultivos celulares.Identificación del virus:
SeroneutralizaciónInmunofluorescencia Técnicas Inmunoenzimáticas (ELISA)
Técnicas de PCR
2828
AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES I
Las líneas celulares más habituales en los programas de vigilancia de SHV y NHI, son:EPC (Epithelioma papulosum cyprini) Son células epiteliales de piel de carpa.FHM (celulas epiteliales), junto con EPC se emplean para las encuestas de vigilancia. RTG-2 (tejido gonadal de trucha arcoiris) Son células de gónadas y tienen una forma fibroblástica.BF-2 (fibroblastos de alevín de bluegill).
2929
AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES II
SSNSSN--11(Fhis striped snakehead fry), (Fhis striped snakehead fry), se emplea se emplea para el aislamiento para el aislamiento del virus de la del virus de la encefalopatencefalopatííaay y retinopatretinopatííaa de la de la lubinalubina (VER o VNN). (VER o VNN).
SHKSHK--11( Atlantic salmon head kidney) se ( Atlantic salmon head kidney) se empleaempleaen el en el aislamientoaislamiento de la de la AnemiaAnemia infecciosainfecciosa del del salmsalmóónn (ISA)(ISA)
KFKF ( ( KoiKoi fin) En el fin) En el aislamientoaislamiento de Herpes Virus de Herpes Virus KoiKoi (KHV)(KHV)
3030
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
3131
SERONEUTRALIZACIONSERONEUTRALIZACION
Consiste en Neutralizar el virus con su Consiste en Neutralizar el virus con su antisueroantisueroespecespecíífico impidiendo por tanto el ECP.fico impidiendo por tanto el ECP.
Si SNSi SN
No SNNo SN
3232
SDV CPE BFSDV CPE BF--2 CELLS2 CELLS
SDV CPE in BF2-cells BF2-cells
3333
INMUNOFLUORESCENCIAINMUNOFLUORESCENCIASobre cultivos infectados y fijados.Sobre cultivos infectados y fijados.AdiciAdicióón de anticuerpos n de anticuerpos PabPab o o MabMabTinciTincióón con n con antisueroantisuero conjugado con conjugado con fluorocromofluorocromo..
2º Ab
1 º Ab
Célula
Virus
3434
ELISA DETECCIELISA DETECCIÓÓN N AgAg
KitsKits Comerciales:Comerciales:SHVSHVNHINHINPINPISVCSVC
3535
PCRPCRApoyo a los distintos departamentos.Apoyo a los distintos departamentos.ConfirmaciConfirmacióón de aislados. n de aislados.
Para todas las enfermedades listadas Para todas las enfermedades listadas VERVERSDVSDVIPNIPNSVCSVCBKDBKD
SecuenciaciSecuenciacióón parcial del 16s RNAn parcial del 16s RNA
3636
682pb548pb
697pb
GELES DE ELECTROFORESIS PARA PRODUCTOS DE AMPLIFICACION EN PCRs DE NHI Y SHV
Necrosis Hematopoyética Septicemia HemorrágicaMarcador Marcador Marcador
de DNA 1ª PCR de DNA 2ª PCR de DNA 1ª PCR
LCV-ALGETE
3737
INVESTIGACION + DESARROLLOINVESTIGACION + DESARROLLO
ImplementaciImplementacióón de nuevas tn de nuevas téécnicascnicasPCR PCR MultiplexMultiplex para NHI, SHV y NPIpara NHI, SHV y NPI
Puesta a punto de PCR tiempo realPuesta a punto de PCR tiempo realGenotiparGenotipar: :
SHV: I, II, III, IVSHV: I, II, III, IVNHI: G, MNHI: G, MIPN:IPN:VPC: I, II, III, IVVPC: I, II, III, IV
SecuenciaciSecuenciacióón Caracterizacin Caracterizacióónn
3838
PCR PCR MultiplexMultiplex para VHS, IHN e IPNpara VHS, IHN e IPN
VHSV
IHNV
IPNV
3939
ANIMALARIOANIMALARIO
ObtenciObtencióón de anticuerpos n de anticuerpos policlonalespoliclonales, , mediante inyeccimediante inyeccióón de virus purificados en n de virus purificados en conejos.conejos.
GRACIAS POR SU GRACIAS POR SU ATENCIATENCIÓÓNN
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