La Scienza del Proteoma:

un ponte tra

Ricerca di

base

Applicazioni in

biomedicina

••The term The term PROTEOMEPROTEOME was coined in 1994 in Siena by Marc Wilkins was coined in 1994 in Siena by Marc Wilkins ((MacquireMacquire University, Sydney).University, Sydney).

PROTEOMEPROTEOMEThe complete set of proteins that is expressed, and modified The complete set of proteins that is expressed, and modified

following expression, by the entire genome in the lifetime of a following expression, by the entire genome in the lifetime of a cell or a tissue.cell or a tissue.

PROTEOMICAÈ lo studio del proteoma mediante tecnologie che prevedono un’analisi su larga scala delle proteine, delle loro interazioni e delle modificazioni a cui vanno incontro in un organismo

•Livello quantitativo•Localizzazione spaziale•Cambiamenti temporali•Interazioni

Migliaia di proteine

Dipendente dal tipo di cellula e dallo stato della cellula

JOE SUTLIFF

Stanley Fields: Proteomics in Genomeland, Science 291, 1221, (2001).

ProteomicsProteomics, , likelike itsits precursorprecursor genomicsgenomics, , thusthus representsrepresents the the emergenceemergence of a of a new way of new way of doingdoing researchresearch thatthat isis notnot dependentdependent on the on the testingtesting of of specificspecificmodelsmodels of of cellularcellular behaviorbehavior. . ThisThis style of science style of science obviouslyobviously doesdoes notnot replacereplace, , butbut ratherrather willwill increasinglyincreasingly operate operate withwith traditionaltraditional biologicalbiological methodsmethods..

SELDI : surface enhanced laser desorption ionization

PROTEOMICS WORLDPROTEOMICS WORLD

BIOINFORMATICSBIOINFORMATICS

Sample preparation Sample preparation PrefractionationPrefractionation

HighHigh--Throughput Protein SeparationThroughput Protein Separation2D2D--ELECTROPHORESISELECTROPHORESIS

Computerized Image AnalysisComputerized Image Analysis

HighHigh--throughput Protein Identification and throughput Protein Identification and Characterization (e.g. postCharacterization (e.g. post--translational modifications)translational modifications)

MASS SPECTROMETRYMASS SPECTROMETRY

Strategie utilizzate per la proteomica

•Analisi con elettroforesi bidimensionale di lisati cellulari: caratterizzazione delle proteine

•Comparazione tramite elettroforesi bidimensionale dell’espressione di proteine

PrinciplePrinciple of 2of 2--D D ElectrophoresisElectrophoresis1. First 1. First dimensiondimension::denaturingdenaturing isoelectricisoelectricfocusingfocusingseparationseparation accordingaccordingtoto the pIthe pI

2. 2. SecondSecond dimensiondimension::SDS SDS electrophoresiselectrophoresisseparationseparation accordingaccording totothe MWthe MW

ImmobilineDryStrip pH 3–11 NL, 24 cmusing 0.5% IPG Buffer 3–11 NL,

pH 3–5.6 NL pH 5.3–6.5 pH 6.2–7.5, pH 7–11 NL

1° Dimensione IEFpH 3.5………………………………………..…pH 10

2°Dim

ension

e PA

GE

Mw (Kd)

200

100

50

30

10

Potere di risoluzione:≅ 1000 proteine/gel

2D2D--PAGEPAGE

Strumento per la 1°dimensione su gradiente di pH immobilizzato

1

2

3

4

5

Preparazione del campione per la prima dimensione

2° Dimensione

MetodiMetodi di di rivelazionerivelazioneLe proprietà più importanti di un colorante sono:

•Elevata sensibilità

•Elevato range di linearità

•Riproducibilità

•Compatibilità con i metodi di identificazione delle proteine

Metodi

Universali (blu coomassie)

Specifici (metodi di rivelazione di modificazioni post traduzionali)

2D-DiGE(2-D fluorescence difference gel electrophoresis)

Derivatizzazione delle proteine con molecole fluorescenti

(aventi differenti λ ecc. & λ emiss.)

Separazione proteine tramite 2D gels

Visualizzazione mediante speciali scanner

La colorazione (labelling) avviene prima della corsa

elettroforetica

Campioni proteici “marcati” in modo

differenziale possono essere separati sul

medesimo gel bidimensionale

- minimizzare veariazionigel-gel-

Impostando le opportune lunghezze d’onda d’eccitazione

e di emissione è possibile visualizzare le proteine

derivanti dal campione 1, quelle dal campione 2 oppure ottenere

un’immagine relativa alla sovrapposizione dei due

campioni

BIOINFORMATICSBIOINFORMATICS

Bioinformatica e creazione di Banche Dati

Up Up toto 36 2D36 2D--databases databases are are nownow availableavailable in in internetinternet

Lymphoma

Promyelocytic leukemiacells

Kidney

HepG2

Liver

gel image, see reference or download the tiff file.

1 protein has been found in the clicked spot (2D-0007BI): General information about the entryView entry in original SWISS-2DPAGE formatEntry nameALBU_HUMAN Primary accession number P02768 Entered in SWISS-2DPAGE inRelease 00, August 1993Last modified inRelease 17, March 2004Name and origin of the protein Description Serum albumin.Gene name(s)ALBFromHomo sapiens (Human). [TaxID: 9606]TaxonomyEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.

Clinical proteomics: A need to define thefield and to begin to set adequateStandardsHarald Mischak1, Rolf Apweiler2, Rosamonde E. Banks3, Mark Conaway4, Joshua Coon5, Anna Dominiczak6, Jochen H. H. Ehrich7, Danilo Fliser8, Mark Girolami9, Henning Hermjakob2,Denis Hochstrasser10, 11, Joachim Jankowski12, Bruce A. Julian13, Walter Kolch14, Ziad A. Massy15, Christian Neusuess16, Jan Novak17, Karlheinz Peter18, Kasper Rossing19, Joost Schanstra20, O. John Semmes21, Dan Theodorescu22, Visith Thongboonkerd23, Eva M. Weissinger24, Jennifer E. Van Eyk25 and Tadashi Yamamoto26Proteomics Clin. Appl. 2007, 1, 148–156

Clinical proteomics should be defined asthe application of proteomic analysis withthe aim of solving a specific clinical problemwithin the context of a clinical study (Yamamoto et al. 2007)

Proteomica clinica:

•Scoperta di nuovi target di farmaci

•Sviluppo di farmaci

•Sviluppo di vaccini

•Biomarkers

Biomarkers: specifico polipeptide atto ad indicareo misurare la presenza o la progressione di una patologia o l’effetto del suo trattamento

•Inquadrare il problema clinico

•Necessario?

•Selezione dei pazienti

•Selezione del tipo di campione

•Solida analisi statistica

An ideal single biomarker may not exist for each disease

Fase di scoperta

Fase di validazione

Marker multipli: “ molecular signature”

Campione estremamente complesso da caratterizzare:

• elevati livelli di albumina (55%)• proteine presenti in un ampio range dinamico • eterogeneità di proteine glicosilate.

Proteoma del Plasma

Proteine secrete da tessuti e organiAd esempio la proteine secrete dal fegato e dall’intestino

Immunoglobuline

Ligandi che agiscono a lunga distanzaAd es. ormoni peptidici o proteici.

Ligandi ad azione localeAd es. citochine

Proteine tissutaliProteine cellulari che possono essere rilasciate nel sangue a seguito di un danno cellulare

Proteine di secrezione aberranti Ad es. le proteine rilasciate da tumori

Proteine esogeneAd es. proteine provenienti da agenti infettivi

Albumina: 35-50 mg/ml Interleuchina 6: 0-5-pg/ml

ElettroforesiElettroforesi del plasmadel plasma

PLASMA

Proteoma dell’urina

Vantaggi: campione biologico ideale (facile da reperire, non invasivo)

Problemi: bassa concentrazione proteica, alta concentrazione di sali, elevata variabilità inter e intraindividuale

1-Disegno dello studio

2- Selezionare la tecnologia proteomicaappropriata

3- Raccolta del campione

4-Utilizzo di inibitori di proteasi o conservanti

5-Rimozione di detriti cellulari o cellule

6- Conservazione del campione

7-Preparazione del campione

2- Selezionare la tecnologia proteomica appropriata

3-Raccolta del campione• random

• mattina

• 24 ore

4-Utilizzo di inibitori di proteasi o conservanti

•In condizioni normali, cioè di bassa concentrazione proteica èmeglio non usare inibitori

•Conservanti (Sodio Azide, acido borico) il loro utilizzo previene la crescita batterica

5-Rimozione di detriti cellulari o cellule

Immediatamente dopo la raccolta centrifugare l’urina in modo da eliminare l’eventuale presenza di globuli rossi, linfociti, frammenti cellulari

6-Conservazione del campione

• 6 ore a temperatura ambiente

• 3 giorni a 4 gradi

• Per anni a -70°C

7-Preparazione del campione

La concentrazione delle proteine nell’urine delle 24 ore è inferiore a 150 mg in condizioni normaliCome concentrarle?

• precipitazione

•Liofilizzazione

• Filtrazione

•Ultracentrifugazione

Un singolo metodo permette di evidenziare 100-200 spot, combinando i diversi protocolli si puòevidenziare fino a 700 spot diversi

Differenze interindividuali (maschi)

Differenze interindividuali (femmine)

Differenze intraindividuali

Spot che compaiono solo dopo l’assunzione di acqua

Spot che la cui intensitàè fortemente ridotta dopo l’assunzione di acqua

ProteomaProteoma del CSFdel CSF

Contiene proteine derivanti dallContiene proteine derivanti dall’’attivitattivitàà secretoria delle secretoria delle cellule nervose e proteine derivanti dal plasma mediante cellule nervose e proteine derivanti dal plasma mediante trasporto (pinocitosi) attraverso la barriera trasporto (pinocitosi) attraverso la barriera ematoencefalicaematoencefalica. (0,2. (0,2--0,8 mg/ml)0,8 mg/ml)

Scoperta di Scoperta di biomarkerbiomarker di disordini neurodegeneratividi disordini neurodegenerativi

D’Aguanno S. et al. 2007

50% albumina

15% Igs

ALCUNI ESEMPI

CSF di pazienti affetti da sindrome Creutzfeldt-Jakob

GlicosilazioneGlicosilazione: applicazione nello studio dei disordini : applicazione nello studio dei disordini congeniti di congeniti di glicosilazioneglicosilazione (CDG)(CDG)

α1 acid glycoprotein

SELDI e carcinoma nasofaringeoSELDI e carcinoma nasofaringeo

Cellule provenienti da linfonodi di controllo e da linfonodi di un paziente con un linfoma non Hodgkin (MCL)

WB contro statmina (Op18)

D’Aguanno S. et al. 2007

87% introdotte prima del 1993

22% dal 1993 ad oggi

Si osserva quindi una grande discrepanza tra le aspettative create dalla genomica e dalla proteomica e il reale incremento di test clinici

?