Analisi comparativa della presenza/localizzazionedi un enzima apoptotico, la DNasi I,

nelle cellule follicolari di alcuni vertebrati ectotermi

MOTTA CHIARA MARIA, GRAZIANO RITA

TAMMARO STEFANIA, FILOSA SILVANA

Dipartimento di Biologia Evolutiva e ComparataUniversità degli Studi di Napoli Federico II

AbstractDNase I is the endonuclease responsible for the internucleosomal DNA fragmentation.

It, therefore, plays a fundamental role in apoptosis, the process of cell suicide. In thepresent paper we have determined its presence/localization in the ovarian follicle cells offew cold blooded vertebrates. Results obtained have been discussed in relation to thedifferent roles played in the different species, by follicle cells during oogenesis.

IntroduzioneL’epitelio follicolare svolge numerose funzioni essenziali nel corso dell’ovogenesi

in quanto non solo protegge meccanicamente l’ovocita ma anche contribuisce almantenimento di un microambiente adatto alla sua sopravvivenza. Questo impli-ca che, per esempio, l’epitelio traduce le informazioni che provengono dal restodel corpo: la presenza sulle sue cellule di recettori per le gonadotropine, gli steroidi,i vari fattori di crescita etc.. è stata riportata in moltissimi vertebrati (Borrelli etal., 2000; Cardenas et al., 2001; Kumar et al., 2001; Jensen & Johnson, 2001;Spicer, 2001). Le cellule follicolari, in aggiunta, producono esse stesse fattori cheesplicano la loro azione non solo localmente ma anche per via sistemica influen-zando così una grande varietà di funzioni ovariche e non (Campbell & Bairdt,2001; Glister et al., 2001; Sica et al., 2001).L’organizzazione dell’epitelio follicolare è molto differente nelle diverse classi divertebrati. Nei pesci ossei (Guraya et al., 1977; Fusco et al., 2000), negli Anuri(Thornton & Evennet, 1973), negli Urodeli (Joly & Picheral, 1972) e nei Cheloni(Rahil & Narbaitz, 1973) esso è sempre monostratificato e monomorfico, com-posto da cellule più o meno appiattite. Negli uccelli, l’epitelio è pure monomorficoe monostratificato ma le cellule si sovrappongono parzialmente così che esso assu-me un aspetto pseudostratificato (Gorbik & Gabaeva, 1975). Nella maggior partedei pesci cartilaginei (Chieffi, 1961), nelle lucertole e nei serpenti (Andreuccetti,

I Vertebrati ectotermidel Parco Regionale del Matese, 2002A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp. 65-71

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1992) l’epitelio follicolare è inizialmente monostratificato ma presto diventapluristratificato e polimorfico, con due o tre tipi cellulari facilmente riconoscibilisia per la loro taglia che per l’ultrastruttura. Le cellule piccole svolgono funzionestaminale mentre quelle grandi, specialmente negli Squamati, hanno certamenteun ruolo nutrice (Taddei, 1972; Motta et al., 1995) essendo interconnesse conl’ovocita mediante un ponte citoplasmatico (Andreuccetti, 1992). Anche nei mam-miferi l’epitelio è composto da differenti tipi cellulari, la granulosa e le cellule delcumulo, che si organizzano a formare un epitelio complesso e multistratificato(Greenwald & Roy, 1994).Nel corso del presente lavoro è stata analizzata la presenza/localizzazione della DNasiI nel follicolo ovarico di alcuni vertebrati ectotermi, ovvero, del Gasterosteus aculeatus(Teleosteo), di Rana italica e Triturus italicus (Anfibi) e di Podarcis sicula e P. muralis(Squamati). Tutti gli esemplari sono stati catturati nell’area protetta del parco delMatese, nell’Italia centro meridionale. Lo scopo era quello di chiarire se nelle cellulefollicolari di queste specie fosse presente apoptosi. La DNasi I, infatti, è l’endonucleasiresponsabile della frammentazione internucleosomica del DNA durante il processodi suicidio cellulare. L’enzima attivo induce una tipica laddering che rappresentauno dei segni distintivi dell’apoptosi (Peitsch et al., 1993; Cain et al., 1994). Lapresenza dell’enzima è stata investigata in situ mediante immunocitochimica, uti-lizzando un anticorpo disponibile commercialmente, prodotto contro la proteinabovina, la cui specificità è stata in precedenza dimostrata (Motta et al., 2001).L’attività dell’enzima è stata stimata, invece, sulla base della sua localizzazione inquanto è noto che essa è ristretta al solo nucleo.

Materiali e metodiLe ovaie al momento del prelievo sono state immediatamente trattate per l’in-

clusione seguendo una procedura standard (Mazzi, 1977). Dopo sparaffinatura, lesezioni sono state lavate con siero normale seguito da anticorpo primario (antiDNasi I bovina, in coniglio, Upstate, diluito 1:50) per 2-4 giorni, a 4° C. Doporipetuti lavaggi in PBS, è stato applicato l’anticorpo secondario (anti coniglio co-niugato con POX, Sigma, diluito 1:500), per 2h a temperatura ambiente. Le se-zioni sono state quindi trattate con PAP (Sigma) e rivelate usando Sigma FastTablets. Vari campioni di controllo sono stati preparati omettendo l’anticorpoprimario. Per le osservazioni sulla morfologia dell’epitelio sono state invece prepa-rate sezioni colorate con emallume eosina.

Risultati e discussioneIn G. aculeatus l’epitelio follicolare è piatto, monostratificato e composto da cel-

lule regolarmente disposte (Fig. 1) il cui citoplasma si marca significativamente con

DNasi nel follicolo ovarico 67

Fig. 1-4: epitelio monomorfico e monostratificato di G. aculeatus.

Fig. 1: aspetto delle cellule follicolari (▲) dopo colorazione con emallume-eosina. Fig. 2: cellulefollicolari con citoplasma marcato (▲) dall’anticorpo anti-Dnasi. Fig. 3: marcatura (▲) sul citoplasmadi un ovocita con alveoli (A). Fig. 4: follicolo vitellogenico in cui si nota la tipica marcatura (▲) deilunghi prolungamenti citoplasmatici che attraversano l’involucro vitellino (VE). Oo: ovocita.

Fig. 5-6: epitelio monomorfico e monostratificato di Rana italica.

Fig. 5: colorazione delle cellule follicolari con emallume-eosina. Fig. 6: cellule follicolari (▲) concitoplasma marcato.

Fig. 7-8: epitelio polimorfico e pluristratificato di Podarcis muralis.

Fig. 7: colorazione delle cellule piriformi (P) con emallume-eosina. Fig. 8: marcatura citoplasmaticaperinucleare (▲) delle cellule piriformi; evidente, invece, la negatività delle cellule piccole (*) e tecali(T).

Fig. 9: epitelio monomorfico e monostratificato di Podarcis sicula in cui si nota l’assenza di marcaturasull’epitelio (*) e sulle cellule tecali (T). ZP: zona pellucida.

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l’anticorpo anti DNasi I (Fig. 2 e 4). Una significativa marcatura è presenteanche sul citoplasma dell’ovocita, soprattutto durante lo stadio alveolato (Fig.3) e, negli ovociti vitellogenici, sopra i grossi processi citoplasmatici che le cellu-le follicolari proiettano verso l’ovocita, attraverso la membrana vitellina (Fig. 4).In Rana italica, l’epitelio è piatto, monostratificato e composto da cellule allun-gate (Fig. 5) il cui citoplasma si colora intensamente con l’anticorpo (Fig. 6).Una debole positività può essere osservata anche nel cortex ovocitario, special-mente nei follicoli di maggiori dimensioni. In Triturus si nota una situazionesostanzialmente comparabile (dato non mostrato).Nelle due specie di Podarcis l’organizzazione dell’epitelio è identica: le cellulepiccole sono disposte all’esterno, vicino alla teca mentre le grosse piriformi,caratterizzate dalla forma a fiasco, sono disposte nell’epitelio, vicino all’ovocita(Fig. 7). Dopo il trattamento con l’anti DNasi, le piriformi mostrano unapositività significativa sopra al citoplasma perinucleare mentre le cellule piccolesi presentano sempre non marcate (Fig. 8). Nei grossi follicoli, in cui l’epitelio ècomposto solo dalle cellule piccole, non si osserva mai alcuna marcatura (Fig.9). Questi risultati suggeriscono che la DNasi sia presente nelle cellule follicolaridi tutti i vertebrati ectotermi. Una tale situazione era attesa solo per le Podarcisin quanto da tempo è noto che in queste specie, verso la fine della previtellogenesi,l’epitelio va incontro ad un processo di rimodellamento che comporta la scom-parsa delle piriformi mediante apoptosi (Motta et al., 1995; De Caro et al.,1998). Nei pesci e negli Anfibi, viceversa, l’epitelio non si rimodella, rimanen-do monomorfico e monostratificato durante tutta l’ovogenesi (Guraya, 1978).Ma allora, perchè c’è DNasi in queste cellule follicolari? Per trovare una spiega-zione bisogna tener conto del fatto che la presenza di enzima di per se nonindica che le cellule stiano già degenerando. In effetti, l’enzima è localizzato nelcitoplasma e non nel nucleo, dove è noto essere attivo, e, poi, non ci sono evi-denze morfologiche di alterazioni apoptotiche quali cromatina condensata operdita di contatto tra cellule adiacenti. L’accumulo di DNasi in assenza di mortecellulare suggerisce che le cellule follicolari si stiano solo preparando per unafutura fase di regressione, quella che, per esempio, si realizza quando il follicolopostovulatorio viene riassorbito.L’accumulo anticipato di enzima rappresenterebbe, quindi, una strategia speci-ficamente adottata per alleggerire il lavoro della cellula nel momento in cui ilvero e proprio processo di degenerazione comincia. La presenza di DNasi nelcitoplasma degli ovociti in accrescimento può essere spiegata in accordo conquesta ipotesi e giustificata considerando che tale endonucleasi risulterà moltoutile, durante lo sviluppo, per rimodellare i tessuti embrionali.

DNasi nel follicolo ovarico 69

ConclusioniLa DNasi I, nucleasi coinvolta nel processo apoptotico, è presente nelle cellule

follicolari di tutte le specie di vertebrati eterotermi finora studiate. Negli squama-ti, essa è localizzata nelle piriformi ed è perciò facile concludere che sia utilizzataalla fine della previtellogenesi, durante il rimodellamento dell’epitelio. Nei Pescie negli Anfibi non è stato possibile, invece, trovare un ruolo immediato per l’enzima;sembra verosimile, tuttavia, che esso sia accumulato per essere usato in un secon-do tempo, durante la fase di riassorbimento del follicolo postovulatorio.

RingraziamentiLavoro finanziato dalla Regione Campania. Esemplari catturati con autorizzazio-ne del 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell’Ambiente.

RiassuntoLa DNasi I è una endonucleasi tipicamente coinvolta nel processo di frammentazione

internucleosomica del DNA. Essa, pertanto, svolge un ruolo importantissimo nell’apoptosi,il processo di suicidio cellulare. Nel presente studio ne abbiamo indagata l’eventuale pre-senza/localizzazione nel follicolo ovarico in alcune specie di vertebrati ectotermi. Il suoruolo nelle differenti specie esaminate è stato quindi discusso in relazione al ruolo giocatodalle cellule epiteliali durante l’ovogenesi.

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