Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)

7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)

1/30

FILTRASI

Kelompok 3

Nur Azizah Ibnu Umaruddin

Rinaldi Anhari N Husnul Khotimah

Tatu Ruhamalia M Bayu Aji atrio

Dosen : Sandra Hermanto, M.Si


2/30

Apa itu Kromati!ra" #el$iltrasi%%%

&serin! disebut kromato!ra" eksklusi atau !el pe'hromato!raphy( merujuk kepada perbedaan siberupa ukuran*bobot molekul dari komponen a

kromato!ra" !el "ltrasi adalah metode kromatdimana pemisahan didasari perbedaan bentuk da

molekul &BM( dari setiap komponen analit dalam'ampuran+ kromato!ra" !el "ltrasi mampu mem

molekul dari ukuran ,-- .a hin!!a ,/-+---


3/30

Ba!aimana 0rinsip dasar Kromato!ra" #el $il


4/30

$ase #erak pada Kromato!ra" 1ks

$ase !erak 12 untukprotein dan polimer larut

air )ase !erak yan!

di!unakan disesuaikanden!an )ase diam yan!

di!unakan+

$ase !eraak 12 polimer polar dan p

larut dalm pelaor!ani'+


5/30

4enis Kolom pada Kromato!ra" 1ks

Bahan kolom seten!ahkaku ini merupakan

turunan dari polistirenyan! telah berikatan

silan! den!an di5inilbenzene+ 2ontoh )asediam yan! di!unakanuntuk kolom seten!ahpadat ini misalnya !el

styra!el dan !el TKuntuk memisahkan

Ko

bdi!

memse

laseb

di!

pe

Bahanuntuk

kolom kakuini terbuatdari sili'a

sertatersedia

dalamberba!ai

ukuran poridan

ber!aris

ten!ah

Kolom KakuKoKolom eten!ah

Kaku


6/30

$ase .iam dalam Kromato!ra" #el $il

Fase diam terdiri dari partikel inert yan! memiliki ukura

tertentu+


7/30

Komponen dalam Kromato!ra" $iltra


8/30

i)at $isik dalam Kromato!ra" #el $il

8imit1kslusi

$ra'tional

ran!e

9aterre!ain

and

bed5olume

#elparti'leshape

andsize

15


9/30

0reparasi #el dan 0enyimpanan

ebelum di!unakan !el dekstran dan akrilamid diredam

air selama 37: jam+ Untuk mendapatkan ikatan silan! yan!sempurna perendaman dilakukan ;< jam khususnya untuktipe 073-- atau #7


10/30

0reparasi khusus den!an men!!unakan pompa5akum dan 6ater aspirator ju!a bisa dilakukanuntuk men!hilan!kan !elembun!* !as pen!otor&biasanya , samapai < jam(+

0enambahan anti mi'robial ju!a perlu disebelum prose penyimpanan terutama unhydrated !el misalnya den!an penambahazida -+-


11/30

Kelebihan dan Kekuran!an K#$

Kromatograf gel memiliki beberapa keunt

dalam penggunaannya:

hanya terjadi masalah da

deakti5asi k

tidak kehilan!an'uplikan* reaksiselamapemisahan+

Har!a Trsesuai den!anukuran'uplikan+

6aktupemisahanmudahdiramalkan+

6aktu pemisapendek+

pita7pitasempit+


12/30

Kromatograf gel memiliki beberapa kelem

dalam penggunaannya:

Kelebihan dan Kekuran!an K#$

kapter

tidak dapatdi!unakan untukanalit den!an BMhampir sama+

prinsippemisahan

tidak sepertikromato!ra"

lain


13/30

Aplikasi Kromato!ra" #el $iltr

Analisis 'ampuran den!an BM berbeda

0emisahan asam7asam nukleat dannukleotida

0en!eluaran #aram

0emisahan polisakarida !ula danprotein dari senya6a den!an BMrendah


14/30

Purifkasi L-Asparaginase Dari BawangBombay (Allium cepa L.) Menggunakan

Kromatograf Filtrasi el Sephadex -!"

Ayu Sri Rahayu Setiawan, Wuryanti, Agustina Lina Nurul AminiLab !i"#imia, $urusan Kimia, Fa#ultas Sains %an Matemati#a,&ni'e

(i)"neg"r" $alan *r"+ S"e%art", Tembalang, Semarang -./, Tel0-.12/1/1/1 setiawanayu3gmail4"m


15/30

ABTRAKTelah dilakukan purifikasi L-asparaginase dari bawang bombay (Allium cepa L.). Tahapan pe

isolasi L-asparaginase menghasilkan ekstrak kasar yang selanjutnya difraksinasi dengan a

dialisis, dan kromatografi filtrasi gel sephade !-"## sehingga menghasilkan L-asparkemurnian lebih tinggi. Analisis L-asparaginase pada ekstrak kasar, hasil fraksinasi amonium

kromatografi filtrasi gel sephade !-"## dilakukan dengan penentuan aktifitas en$im dengan

dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry sehingga dapat ditentukan aktifitas sp

analisis diperoleh ekstrak kasar L-asparaginase dari bawang bombay (Allium cepa L.) dengan

sebesar '#,# unit*mg protein. Aktifitas spesifik tertinggi dari fraksi amonium sulfat berad

"##) sebesar '#,'" unit*mg protein. + (#-"##) selanjutnya dimurnikan dengan kromato

sephade !-"## sehingga diperoleh aktifitas spesifik tertinggi berada pada fraksi "# sebesar

protein dengan tingkat kemurnian lebih dari ## kali dibandingkan dengan ekstrak kasar.

/ata kunci 0 Allium cepa L., L-asparaginase, uji aktifitas en$im, kromatografi filtrasi gel


16/30

0endahuluan

1n$im merupakan biokatalisator yang

mempercepat reaksi kimia dalam sistem

biologi. 1n$im bersifat spesifik terhadap

substratnya (Lehninger, "2).

1n$im L-asparaginase adalah en$im yang

mengkatalisis reaksi hidrolisis L-asparagin

menjadi L-aspartat dan amonia (&andler dan&ill, "23). L-asparaginase dapat menghambat

pertumbuhan sel kanker (/oneen4 dkk., ##5).

6ada penelitian ini d

pemurnian lebih lanjut L asparagi

bawang bombay meng

kromatografi filtrasi gel sephade

/romatografi filtrasi gel sephade

merupakan metode pemisahan

didasarkan atas perbedaan ukuran

(Lehninger, "2). L asparagina

akan diperoleh dari kromatograf

gel sephade !-"## diharapkan ja

murni dikarenakan L aspa

dipisahkan dari molekul prot

didasarkan perbedaan ukuran mol


17/30

M1T>.1 K1R4A

Alat : Alat-alat gelas laboratorium, Timbangan (/ern 555-5), p&meter (17T18& 9nstrum

"#), :lender (6hilip), ;entrifus (8entrific- ), /ulkas (;harp), 6engaduk magnet (emmert), /romatografi kolom sephade

dll.

Bahan : :awang bombay, bufer tris-hidroksimetil aminometan, amonium sulfat, membran

asparagin, Trichloro acetate (T8A), :o?ine serum albumin (:;A), +ollin ciocalteau, ;epha

"##, akuades, akuabides, dll.


18/30

2ARA K1R4A

Isolasi L!sparaginase

:awang bombay diiris-iris @bufer tris-hidroksimetilaminometan (#, > p& ,2)

Bi blender selama #menit.

&asil blender didiamkan "- jam pada suhu o8

disaring dan filtratnya disentrifus pada '5## rpm selama "menit

+iltrat yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar en$im L-

asparaginase.


19/30

2ARA K1R4AFraksinasi dengan "aram !monium Sul#at

Amonium sulfat yang telahditimbang dimasukkan ke

dalam ekstrak kasar sambildiaduk

8ampuran dibiarkansemalam dalam keadaan

dingin,

disentrifug

kecepatan '5## menit, dipe

fraksi #-#filtra

1ndapan dipisahkankemudian disuspensikan

dengan bufer.

+iltrat yang dihasilkandiperlakukan sama sehingga

didapatkan fraksi dengantingkat kejenuhan #-5#(+), 5#-# (+'), #-#

(+5), #-"## (+(+

&asil fraksinadidialisis

didapatkan bebas amo


20/30

2ARA K1R4A

$enentuan !ktiftas L!sparaginase

Lalu absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer 7=-=is pada ma 5#

#, mL filtrat diambil @ 5, mL akuades dan #, mL pereaksi %essler

diinkubasi pada suhu '3 o8 selama '# menit. ;etelah itu, ditambah #, mL larutan disentrifugasi.

;ebanyak "mL larutan L-asparagin #," >, @ #, mL en$im hasil fraksinasi, dan dibufer tris-hidroksimetil aminometan #, > p& ,2


21/30

2ARA K1R4A

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

/adar protein hasil fraksinasi amonium sulfat

ditentukan dengan metode Lowry menggunakan

larutan :o?ine serum albumin (:;A) sebagai protein

standar.

Absorbansi larutan diukur dengan

spektrofotometer 7=-=is. /adar protein diukur

ditentukan secara regresi linier terhadap kur?a

standar :;A.

Pemurnian dengan

Kromatografi

Filtrasi Gel Sephadex G

+raksi amonium sulfat yang

aktifitas spesifik tertinggi diaplika

dalam kolom sephade !-"## (" cm

yang sebelumnya telah diekuilibra

bufer tris hidroksimetil aminometan ,2 dengan laju elusi yaitu # mL*jam

+raksi fraksi yang didapat

ditampung dan dianalisis kandunga

dan aktifitas en$im L-asparaginaseny


22/30

HAI8 .AN 01MBAHAAN

Lasparaginase pada Fraksi !monium Sul#at

1kstrak kasar 8ebih sedikit#ra"k kadar protein )raksi amoniu

8ebih banyak

$, sebesar ,


23/30

>enurut 8haplin (##5), protein yang mengandung asam-asam amino hi

mengendap pada konsentrasi garam yang lebih rendah dibandingkan protein yang meng

asam amino hidrofilik. &al tersebut dikarenakan pada tingkat kejenuhan garam amo

# ion-ion garam amonium sulfat berikatan dengan molekul air, sedangkan

mengandung asam amino hidrofobik paling banyak akan mengendap. 6rotein denga

hidrofilik tidak akan mengendap dan berada pada filtrat. 6rotein yang bersifat lebih

mengendap jika sudah berada pada tingkat kejenuhan garam tertinggi (#-"##).

6ada gambar 999. protein yang paling banyak mengendap berada pada kadar amo

# (+") yang bersifat lebih hidrofobik dibandingkan protein yang mengendap pa

garam #-"##.


24/30

)raksi yan! memiliki akti"tas enzim tin!!iadalah $, dan $/ den!an akti"tas enzimlebih dari


25/30

Lasparaginase Hasil KromatografFiltrasi "el Sephadex "%&&

/romatografi filtrasi gel yaitu me

protein yang berdasarkan per

molekul dari suatu protein. 6romenggunakan matriks gel berpor

dalam kolom dan dikelilingi oleh

yang mengandung campuran mo

kecil dilewatkan ke dalam k

protein yang lebih kecil dapat

dalam pori-pori butiran dan kar

selama aliran ke bawah kolom. >yang besar tidak dapat menembus

pori butiran dan melewati kolo

>olekul protein yang berukuran

mengalir ke bawah pada ke

tergantung pada kemampuann

butiran (Lehninger, "2).


26/30


27/30

+raksi "# memiliki aktifitas en$im yang tertinggi, yaitu sebesar ,#'' unit*mL, deng

protein terendah sebesar #,##5 mg*mL, sehingga aktifitas spesfiknya sangat tinggi, yait

#,# unit*mg protein. &al ini berarti fraksi "# mengandung L-asparaginase dengan kemur

tinggi dibandingkan dengan fraksi-fraksi sebelumnya. L-asparaginase pada fraksi "# m

peningkatan kemurnian lebih dari ## kali dibandingkan dengan data aktifitas spesifik eks

'#,# unit*mg protein. &al tersebut berarti hasil pemurnian Lasparaginase menggunakan kro

filtrasi gel sephadex !-"## lebih efektif dibandingkan dengan hasil pemurnian dengan

amonium sulfat.

Bari data tersebut tampak bahwa tiap-tiap fraksi hasil kromatografi filtrasi gel sepha

terdapat L-asparaginase meskipun besar aktifitas en$imnya berbeda-beda. &al ini bukan berarti

mengandung L-asparaginase dengan ukuran molekul yang berbeda-beda. Tiap-tiap fraksi meng

asparaginase mungkin dikarenakan molekul L-asparaginase menempel pada molekul-molek

lainnya yang memiliki ukuran molekul lebih besar daripada ukuran molekul dari L-asparaginas

aktifitas en$im L-asparaginase terukur di tiap fraksi. &al ini dibuktikan dari gambar 999. dan

menunjukkan fraksi " hingga fraksi 2 memiliki aktifitas en$im yang cukup tinggi, tetapi memil

spesifik yang sangat rendah dibandingkan dengan aktifitas spesifik fraksi "#. &al ini dikarenak

hingga fraksi 2 mengandung molekul-molekul protein selain L-asparaginase yang telah ditunj

profil kadar protein pada gambar 999..


28/30

KesimpulanL-asparaginase ekstrak bawang bombay (Allium cepa L.) difraksinasi dengan am

menghasilkan fraksi dengan aktifitas spesifik tertinggi berada pada + (#-"##) se

unit*mg protein. &asil tersebut selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi filtrasi g

!-"## sehingga didapat aktifitas spesifik tertinggi berada pada fraksi "# yaitu sebe

unit*mg protein dengan tingkat kemurnian lebih dari ## kali jika dibandingkan ekstra


29/30

.a)tar 0ustaka

:asha, %.;., Cekha, C., /omala, >., dan Cuby, ;., ##2, 6roduction of 1tracellular Antileukaemic 1n$yme L-aspar

>arine Actinomycetes by ;olid- state and ;ubmerged +ermentation0 6urification and 8haracterisation, Tropical

Pharmaceutical Research, (5), '

8haplin, >.+., :ucke 8., "22#,Enzyme Technology, -, 8ambridge 7ni?. 6r., %ewDork

Be?lin, Thomas >., "22', Textbook of Biochemistry with linical orrelations! edisi ke-', ', A Eohn Filey and ;oDork

1l-;ayed, 1l-;ayed, >., 1l-;ayed, ;.T., Fafaa, ;housa, !., ;hehata A.%., dan &anafy, ;.;., #"", 6urification, 8hara

Antitumor Acti?ity of L-asparaginase from 8hicken Li?er,Journal of American "cience , 3 ("), 55

&andler, 6., &ill, C.L., "23,Principles of Biochemistry! edisi ke-, 32-3'#, >c!raw- &ill /ogakusha, LTB., %ew D

/oneen4,6., /lejdus, :., &rstko?il, &., ##5, >onitoring The Asparaginase Acti?ity and Asparagine Le?els in 8hild

Acute Lymphoblastic Leukaemia Treated with Bifferent Asparaginase 6reparations, "cripta #edica $BR%&', 33 (),

Lehninger, A.L., "2,(asar)(asar Biokimia! Jilid * , 5-52, 6enerbit 1rlangga, Eakarta ;copes, C./., "23, Prote

Principles! and Practice, edisi ke-, "-, 3, ;pringer =erlag, %ew Dork

Farangkar, ;.8., dan /hobragade, 8.%., ##2, 6urification, 8haracteri$ation, and 1ffect of Thiol 8ompounds on Ac

Erwinia caroto+ora L-Asparaginase,Enzyme Research, 5


30/30

Terimakasih

Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)

Documents

Transcript of Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)