UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICAS

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ACRYLAMIDA EN MUESTRAS DE PAPAS FRITAS POR

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

EJECUTOR(A):

GIANCARLO BENAVENTE MOTTA

ASESOR(A):

NORA HERRERA

LIMA, 2015

Validation of a method for quantification of acrylamide samples of potato chips by high efficiency liquid chromatography

Validation of a method for quantifying of acrylamide samples of potato chips by high efficiency liquid chromatography

Resumen

Se elaboró dos métodos para la cuantificación de acrilamida en muestras de

papas fritas por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). El primer

método comprende una extracción con acetona y agua usando un baño de

ultrasonido y una columna C18 (4x150mm) de fase reversa utilizando como fase

móvil acetona: agua (2:8). El segundo método usa para la extracción soluciones

Carrez I y II , usando como fase móvil metanol: fosfato de sodio deshidrogenado.

Dos tipos de muestras se utilizarán en el estudio, papas fritas de pollería y papas

fritas enlatadas. Los parámetros a desarrollar para la validación serán:

Repetibilidad , exactitud , Linealidad , límite de cuantificación y límite de detección.

Palabras clave: Validación, HPLC, acrylamida, acetona

Abstract

Two methods for the quantitation of acrylamide in potato chips samples by High

Performance Liquid Chromatography (HPLC ) was developed. The first method

comprises extraction with acetone and water using an ultrasonic bath and a C18

column ( 4x150mm ) reverse phase using development acetone: water ( 2: 8) . The

second method used for extraction Carrez I and II solutions , using as mobile

phase methanol : sodium dihydrogen phosphate . Two types of samples were used

in the study, fries and canned poultry fries. Develop parameters for validation are:

repeatability , accuracy, linearity , limit of quantification and detection limit

Key words: Validation, HPLC, acrylamide , acetone

INDICE

CARÁTULARESUMEN ABSTRACT ÍNDICE INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO I: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ………………………………6

1.1.Descripción de la realidad problemática …………………………………. 61.2.Formulación del problema ………………………………………………….. 71.3.Objetivos ……………………………………………………………………. 7

1.3.1. Objetivo general ………………………………………………………. 71.3.2. Objetivos específicos …………………………………………………. 7

1.4. Justificación e importancia de la investigación …………………………… 8

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ……………………………………………………9

2.1 Antecedentes de la investigación ………………………………………….. 92.2 Bases teóricas ………………………………………………………………. 112.3 Formulación de hipótesis y variables ………………………………………12

CAPÍTULO III: MÉTODO ……………………………………………………………. 12

3.1. Población y Muestra ……………………………………………………….. 12 3.2. Diseño (s) utilizados en el estudio ……………………………………….. 13 3.4. Materiales, reactivos y equipos …………………………………………… 14 3.5 Procedimiento ………………………………………………………………… 14

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………………… 16

INTRODUCCIÓN

En el año 2002 la Administración Nacional de Alimentos de Suecia detectó altas

concentraciones de acrilamida que se formaba durante el calentamiento a altas

temperaturas de alimentos ricos en almidón, como las papas fritas, pan, galletas,

alimentos extruídos, etc. Este descubrimiento es de interés público, porque la

acrilamida es genotóxico y ha sido clasificada como “probable carcinogénico para

humanos” (Grupo 2A) por la Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer

(IARC) (IARC, 1994, De Wilde et al. 2005).

Las conclusiones a la fecha muestran que la acrilamida se forma durante la

preparación culinaria e industrial de alimentos, ricos en carbohidratos que se fríen,

hornean o extruyen a temperaturas que exceden los 120º C, como producto de la

reacción de la asparagina y glucosa que corresponde a la conocida reacción de

Maillard.

CAPÍTULO I: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1Descripción de la realidad problemática

En Junio de 2010 la Unión Europea publicó una serie de recomendaciones

cuya finalidad era el control de los niveles de acrilamida en los alimentos,

por parte de los estados miembros (2010/307/UE). Esta publicación surgió

a partir del estudio de los niveles de acrilamida en determinados alimentos

recopilados entre 2003 y 2006, los cuales resultaron excesivos. El estudio

publicado demostraba la presencia acrilamida en alimentos ricos en

carbohidratos sometidos a altas temperaturas, cuando hasta el momento se

pensaba que la contaminación humana por acrilamida sólo procedía de la

industria del plástico y otros materiales. Otro estudio realizado por el Área

de Seguridad Alimentaria de la Conselleria de Sanitat indicaba que el

contenido medio de acrilamida en patatas fritas de la Comunidad

Valenciana es de 916 µg/Kg (Zubeldia y Gomar, 2007).

La acrilamida es un compuesto de bajo peso molecular altamente

hidrosoluble con carácter tóxico de índole cancerígena. De ahí, la

necesidad de controlar su incidencia en los alimentos y su formación

durante el procesado.

1.2 Formulación del problema

En el Perú existe una gran cantidad de consumidores de comida rápida, entre ellos se encuentra las papas fritas. Dependiendo del tiempo de cocción, de la temperatura de freído y de la relación papa: aceite dará lugar a altas concentraciones de acrilamida.

Es importante dar a conocer el contenido de acrilamida en las muestras de papas fritas que circulan en nuestro país a través de resultados confiables utilizando un método más simple y con menos costo.

1.5.Objetivos

1.5.1. Objetivo general:

Dar a conocer el contenido de acrilamida de las muestras de papas fritas de

locales de comida rápida a través de un método de bajo costo y más

sencillo

1.5.2. Objetivos Específicos:

Cuantificación de la acrilamida por HPLC Determinación de los parámetros de validación

1.5.3. Justificación e importancia de la investigación:

En 2002, estudios realizados en Suecia demostraron por primera vez la formación

no intencional de concentraciones relativamente elevadas de acrilamida durante la

fritura o el horneado de patatas y productos a base de cereales (a temperaturas

superiores a 120 ºC). Aunque se desconocían las consecuencias sanitarias de las

concentraciones de acrilamida que aparecen en los alimentos, ello hizo temer por

la salud pública. A raíz del estudio sueco, la FAO y la OMS celebraron en 2002

una reunión consultiva especial de expertos para examinar los datos disponibles.

Los expertos concluyeron entonces que era preciso realizar nuevos estudios para

evaluar debidamente la toxicidad y los efectos en la salud de la exposición a la

acrilamida presente en los alimentos

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes de la investigación

El primer método de análisis de la acrilamida en diversos alimentos cocidos y

procesados se publicó en mayo de 2002. Se basa en el uso de la dilución

isotópica en cromatografía líquida con espectrometría de masas (LC-MS/MS)

(Rosén y Hellenäs, 2002). Desde entonces, se han publicado en revistas

científicas o se han presentado en las reuniones internacionales, varios métodos

analíticos que describen el análisis de acrilamida en alimentos procesados (Wenzl

et al., 2003).

El nivel de acrilamida en diversos alimentos ha informado ampliamente . El

contenido de acrilamida eran en el rango de 0 a 4.000 mg / kg , y la patata ricos en

carbohidratos alimentos contenía alto nivel acrilamida , que podría ser de hasta

varios miles de microgramos por kilogramo. La acrilamida proviene principalmente

de la reacción del pato silvestre en el procesamiento de alimentos , y algunos

precursores y las condiciones de reacción que implica la formación de acrilamida

han informado . La reducción de azúcar (tales como fructosa y glucosa) y

asparagina se correlacionaron positivamente con la formación de acrilamida ( Zhu

et al. , 2010)

La acrilamida muestra algunos efectos negativos sobre la salud . El neurotóxico

característica significativa síntomas, incluyendo el aumento de splay talón, y la

disminución de la fuerza de agarre y en la actividad locomotora , fueron

encontrados en las ratas tratadas con acrilamida ( Guo et al, 2007 ; . . Seale et al ,

2011)

Muchos métodos analíticos, tales como GC , GC- MS , LC, LC- MS , CE, ELISA y

biosensor , se han desarrollado para estudiar la formación , la distribución y el

contenido de acrilamida en diferentes alimentos . Además, diferentes estrategias

de reducción de acrilamida en los alimentos se han sugerido, como el control del

tiempo de procesamiento y la temperatura ( Mizukami et al., 2008 )

Entre la variedad de métodos desarrollados, buena sensibilidad y la selectividad

son reportadas a ser alcanzado por métodos cromatográficos junto con una

técnica de masas. Aunque es diferente se han desarrollado métodos para el

análisis de AA en una número de matrices de alimentos, no hay procedimientos de

extracción y limpieza "universales" se han reportado sea válida para muchos

diferentes matrices alimentarias. Productos de la papa, y especialmente de la

patata patatas fritas, se ha demostrado que incluyen altos niveles de AA en

diferentes investigaciones; por lo tanto, nuestro trabajo se centra en la

determinación de AA en las papas fritas. Tener en cuenta que técnicas de masas

por lo general requieren derivatización mucho tiempo de medida y / o limpieza

exhaustiva para lograr la detección selectiva a un bajo peso molecular, el principal

objetivo del presente trabajo es para desarrollar un bajo costo y un método sencillo

para la HPLC análisis de AA en las patatas fritas con una buena sensibilidad y

fiabilidad que es necesario para el control rutinario de AA . (Khoshnam et al.)

2.2 Bases teóricas

El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios y Contaminantes

de los Alimentos se reunió del 8 al 17 de febrero para examinar los posibles

riesgos para la salud asociados a la acrilamida y otros cinco contaminantes de los

alimentos. El Comité concluyó que, según las pruebas realizadas en animales, el

cáncer es el principal efecto tóxico de la acrilamida y que el consumo de alimentos

con este contaminante en las concentraciones en que aparece actualmente puede

ser preocupante en relación con la salud pública. El Comité afirmó que la

conclusión se basó en una evaluación conservadora y que aún hay importantes

dudas acerca del mecanismo de la toxicidad de la acrilamida, los supuestos

utilizados para comparar los datos animales más pertinentes para la situación en

el ser humano y la extrapolación de las estimaciones de la ingesta.

2.3 Formulación de hipótesis y variables

Si el contenido de acrilamida depende del tiempo de cocción, de la temperatura de freído y de la relación papa: aceite, entonces en las muestras de comida rápida como las pollerías existiría una alta concentración de acrilamida ocasionando efectos tóxicos en las personas.

2.3.1 Variable independiente

Altas concentraciones de acrilamida

2.3.2 Variable dependiente

Efectos tóxicos en las personas

CAPÍTULO III: MÉTODO

3.1. Población y Muestra

Se seleccionó dos tipos de procedencia de muestras, una proveniente de pollería

y la otra en latada.

3.2. Diseño (s) utilizados en el estudio

3.4. Materiales, reactivos y equipos

Materiales de vidrio

6 fiolas de 100 mL

3 matraces de 200 mL

1 probeta de 100 mL

3 vasos precipitados de 50 y 100 mL 1 vagueta

Reactivos

Acrilamida 99.9 % Agua grado HPLC Acetona grado HPLC

Equipos:

Una balanza analítica Un horno Un equipo HPLC con detector uv

3.5 Procedimiento

Para el primer método:

Se pesaron 4 gramos de muestra para luego secarlas en el horno a 40 °C Una vez la muestra seca se procedió a desengrasar añadiendo 10 ml de

hexano dos veces con agitación. Para la extracción de la acrilamida , la muestra seca y desengrasada se

le añadieron 100 ml de agua y 20 ml de acetona , se le llevo a un baño de ultrasonido por 40 minutos a 20°C

Una vez lista se filtró la acetona. 10 ml del filtrado se evaporó Luego se le agregó 3 ml de agua y se inyecto a la columna del HPLC un

volumen de 10 uL

Para el segundo método

Se pesó 1 gramo de muestra . Se prepararon dos soluciones Carrez Solucion Carrez I : 15g potasio hexacianoferrato en 100 ml de agua Solución Carrez II : 30 g de sulfato de zinc en 100 ml de agua. Se agregaron las dos soluciones a la muestra , para luego ser llevado a

un baño de ultrasonido. Se desengraso con 15 ml de hexano , se inyecto a la columna la fase

acuosa

Para ambos métodos se utilizó una curva de calibrado que consta de:

Solución stock : 0.1 g en 100 ml de agua

Se prepararon las siguientes concentraciones:

20 , 40 , 80 , 160 y 240 ppb

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Swedish National Food Administration, Information about acrylamide in food, 24 April, 2002.

http://www.slv.se

D.S. Mottram, B.L.Wedzicha and A.T. Dodson. Acrylamide is formed in the Maillard

reaction. Nature 419: 448–449 (2002). 7. R.H. Stadler, I. Blank, N. Varga, F. Robert, J.

Hau, and P.A. Guy. Acrylamide from Maillard reaction products. Nature 419: 449–450

(2002).

J. Rosén and K.E. Hellenäs. Analysis of acrylamide in cooked foods by liquid

chromatography tandem mass spectrometry. The Analyst 127: 880–882 (2002).

J. Iran. Chem 2010 Acetone Extraction and HPLC Determination of Acrylamide in Potato

Chips Soc., Vol. 7, No. 4, December 2010, pp. 853-858. JOURNAL OF THE

Iranian Chemical Society

Rydberg, P., Eriksson, S., Tareke, E., Karlsson, P., Ehrenberg, L., and Tornqvist, M.

(2005). Factors that influence the acrylamide content of heated foods. Adv. Exp. Med.

Biol., 561: 317-328.

Soares, C., Cunha, S., and Fernandes, J. (2006). Determination of acrylamide in coffee and

coffee products by GC-MS using an improved SPE clean-up. Food Addit. Contam., 23:

1276-1282.

Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, S., Eriksson, S., and Tornqvist, M. (2002). Analysis of

acrylamide, a carcinogen formed in heated foodstuffs. J. Agric. Food Chem., 50: 4998-

5006.

Yang, S., Zhang, H., Wang, J., and Chen, F. (2011). Quantification of acrylamide in foods

by gaschromatography-mass spectrometry coupled with pro-column derivatization. Chin. J.

Chromatogr.,29: 404-408.

Zhang, Y., Dong, Y., Ren, Y., and Zhang, Y. (2006). Rapid determination of acrylamide

contaminant in conventional fried foods by gas chromatography with electron capture

detector. J. Chromatogr. A, 1116: 209-216.

Zhang, B., Qi, Y., Gao, H., and Bao, J. J. (2010). Application of solid phase extraction disk

in the determination of acrylamide in tap water. Chin. J. Chromatogr., 28: 1196-1199.