Instituto Politécnico Nacional - xoch.info · Xóchitl Domínguez Benetton. Asesor Interno: M. en...

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Proyecto de Investigación

Bioelectroquímica de Biopelículas y su Influencia en Materiales Metálicos

Para obtener el Título de Ingeniero Biotecnólogo

Presenta: Dalinda Ramírez Espinosa

Director de Tesina: Xóchitl Domínguez Benetton.

Asesor Interno: M. en C. Gloria López Jiménez

México

2007

I

Índice de Contenido

RESUMEN ................................................................................................................................................ VII

AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................... VIII

PARTE I ............................................................................................................................................... XIV

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ XIV

I. 1 INTRODUCCIÓN Y PERSPECTIVAS DEL TRABAJO............................................................................................. 1 I. 2 MARCO TEÓRICO ...................................................................................................................................... 4 I.2.1 BIOPELÍCULAS ........................................................................................................................................ 4

I.2.1.1 Formación de una Biopelícula....................................................................................................... 5 I.2.1.2 Estructura y Arquitectura de una Biopelícula .................................................................................. 6 I.2.1.3 Importancia General de las Biopelículas ...................................................................................... 10

I.2.1.3.1 Importancia de las biopelículas en la Industria Petrolera ................................................................... 11 I.2.2 FUNDAMENTOS GENERALES DE LA BIOCORROSIÓN ..................................................................................... 13

I.2.2.1 Técnicas Electroquímicas para el Estudio de la Biocorrosión ........................................................ 16 I.2.2 .1.1 Potencial de Circuito Abierto .......................................................................................................... 19 I.2.2 .1.2 Espectroscopía por Impedancia Electroquímica .............................................................................. 20

PARTE II ................................................................................................................................................. 26

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................................. 26

II.1 HIPÓTESIS ............................................................................................................................................. 27 II. 2 ALCANCES Y JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO .............................................................................................. 28 II. 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 30 II. 4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................................................... 31 II.5 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................ 32 II.5.1 PROCEDIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS ..................................................................................................... 33

II.5.1.1 Obtención de Muestras ............................................................................................................ 33 II.5.1.2 Medios de Cultivo e Inóculos .................................................................................................... 33 II.5.1.3 Aislamiento de Bacterias Anaerobias ........................................................................................ 35 II.5.1.4 Caracterización en Microcopio Óptico ........................................................................................ 37

II.5.1.4.1 Determinación de la Pureza de Cultivos .......................................................................................... 37 II.5.1.4.2 Determinación de la Morfología Microscópica .................................................................................. 37

II.5.1.5 Caracterización Macroscópica ................................................................................................... 38 II.5.1.5.1 Formación de biopelículas gas-electrolito ........................................................................................ 38 II.5.1.5.2 Pruebas de Adhesión .................................................................................................................... 38 II.5.1.5.2.1 Análisis superficial ...................................................................................................................... 40

II.5.1.6 Caracterización Cinética a partir de cultivos con sustratos específicos .......................................... 40 II.5.1.6.1 Cultivos con sustratos específicos .................................................................................................. 40 II.5.1.6.2 Cinéticas de Producción de CO2 y Degradación de Compuestos BTX ............................................... 41

II.5.1.7 Caracterización Bioquímica ....................................................................................................... 42 II.5.2 PROCEDIMIENTOS ELECTROQUÍMICOS ..................................................................................................... 44

II.5.2.1 Celdas Electroquímicas ............................................................................................................ 45 II.5.2.2 Potencial de Circuito Abierto ...................................................................................................... 45

II

II.5.2.3 Impedancia .............................................................................................................................. 46 II.5.2.4 Circuitos equivalentes ............................................................................................................... 46

PARTE III. .............................................................................................................................................. 47

RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 47

III. 1 BIOCOMPLEJIDAD Y ESTRATEGIAS MULTICELULARES MICROBIANAS EN GASOLINODUCTOS ............................... 48 III.1.1 RESULTADOS DE LOS CULTIVOS SEMILLA ................................................................................................ 49

III.1.1.1. Cultivos semilla en medio de enriquecimiento ENR .................................................................... 49 III.1.1.2. Cultivos semilla en medio MIN con sustratos específicos ........................................................... 49

III.1.2 RESULTADOS DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE TUBO RODADO ................................................................. 50 III.1.2.1 RESULTADOS CON MICROORGANISMOS PUROS .................................................................................... 50

III.1.2.2 Resumen de Microorganismos Puros ........................................................................................ 64 III.1.3 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULA EN CULTIVOS MICROBIANOS .......................................................................... 67 III.1.4 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE CO2 Y DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS BTX ................................................ 69 II.1.5 RESULTADOS DE PRUEBAS DE ADHESIÓN CON CULTIVOS MIXTOS ARTIFICIALES ........................................... 71 II.1.6 ESTRATEGIAS MULTICELULARES ............................................................................................................. 75 III.2.1 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE IMPEDANCIA ...................................................................................... 77 III.2.2 ANÁLISIS CON CIRCUITOS EQUIVALENTES ............................................................................................... 80

PARTE IV. .............................................................................................................................................. 87

CONCLUSIÓN GENERALES ............................................................................................................... 87

IV. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 88

PARTE V. ............................................................................................................................................... 90

REFERENCIAS ...................................................................................................................................... 90

V. REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 91

III

Índice de Tablas

Tabla 1. Características de algunas técnicas electroquímicas para la detección de corrosión y efecto de

biopelículas en materiales metálicos. ...................................................................................................... 17

Tabla 2. Datos proporcionados por la tinción de Gram. .......................................................................... 37

Tabla 3. Matriz experimental para los cultivos sustrato-específicos. ..................................................... 41

Tabla 4. Matriz Experimental de los cultivos utilizados para realizar las cinéticas microbianas. ........... 41

Tabla 5. Pruebas bioquímicas que integran la tira API20A .................................................................... 43

Tabla 6. Crecimiento microbiano en fuentes específicas de carbono. ..................................................... 50

Tabla 7. Resultados de la caracterización de la cepa 63-P1. ................................................................... 51

Tabla 8. Resultados de la caracterización de la cepa 64-2 P1 ................................................................. 51

Tabla 9. Resultados de la caracterización de la cepa 64-1 P2 ................................................................ 52

Tabla 10. Resultados de la caracterización de la cepa 68-1 .................................................................... 52

Tabla 11. Resultados de la caracterización de la cepa 68-2 ................................................................... 53



Tabla 14. Resultados de la caracterización de la cepa 74 -2 .................................................................. 54








Tabla 22. Resultados de la caracterización de la cepa 89-P2 .................................................................. 58



Tabla 25. Resultados de la caracterización de la cepa 135 ...................................................................... 60

Tabla 26. Resultados de la caracterización de la cepa 137 ..................................................................... 60

Tabla 27. Resultados de la caracterización de la cepa SEB10. ............................................................... 61

Tabla 28. Resultados de la caracterización de la cepa SEB5. ................................................................. 61



Tabla 31. Resultados de la caracterización de la cepa SEB1 .................................................................. 63

Tabla 32. Resultados de morfología macroscópica y microscópica ........................................................ 64

IV

Tabla 33. Pruebas de adhesión realizadas a cultivos posiblemente puros. .............................................. 66

Tabla 34. Cepas con los mismos resultados en las pruebas bioquímicas y morfología microscópica. ... 66

Tabla 35. Resultados de los microorganismos aislados de muestras de gasolinoductos. ........................ 67

Tabla 36. Crecimiento con sustratos específicos, crecimiento planctónico o en biopelícula. ................. 68

Tabla 37. Nombres completo de los cultivos mixtos , y nombre designado para reportar los datos. ...... 71

Tabla 38. Resultados de las pruebas de adhesión a cultivos mixtos de microorganismos aerobios y

anaerobios. ............................................................................................................................................... 72

Tabla 39. Tabla comparativa de los distintos valores arrojados por el programa Zview en el ajuste de

datos experimentales para diferentes tiempos, para el sistema abiótico. ................................................. 83


datos experimentales para diferentes tiempos, en el sistema biótico. ...................................................... 83

V

Índice de Figuras

Figura 1. Esquema de teórico de la formación de una biopelícula sobre una superficie inerte. ................ 6

Figura 2. Representación de la arquitectura heterogénea de una biopelícula ............................................ 8

Figura 3. Representación de la estructura teórica de una biopelícula. ....................................................... 9

Figura 4. Infraestructura de la industria petrolera sobre la que pueden crecer las biopelículas. ............. 12

Figura 5. Los sistemas de distribución (ductos) como bioreactores ........................................................ 13

Figura 6. Modelo teórico de consorcios de bacterias que influyen en la corrosión ................................. 15

Figura 7. Esquema de una biopelícula en el cual los diferentes tipos de microorganismos presentes

inducen un proceso de corrosión localizada]. .......................................................................................... 16

Figura 8. Representación teórica de una celda electroquímica en donde existe la presencia de una

biopelícula. .............................................................................................................................................. 18

Figura 9. Variaciones de OCP dependientes del tiempo influenciadas por Desulfovibrio capillatus y D.

gabonensis en cultivo mixto en agua de mar artificial. ........................................................................... 20

Figura 10. Gráfica que representa una señal sinusoidal a partir de la cual se obtiene la impedancia ..... 20

Figura 11. Esquemas de los tres diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una

celda electroquímica ................................................................................................................................ 23

Figura 12. Estrategia experimental del proyecto. ................................................................................... 31

Figura 13. Preparación de medio de cultivo anaerobio. .......................................................................... 34

Figura 14. Técnica de tubo rodado donde se observan los pasos de la misma ........................................ 35

Figura 15. Esquema general de cómo se aísla una colonia tomada de un tubo rodado y se deposita en un

frasco serológico ...................................................................................................................................... 36

Figura 16. a) Acero al carbón SAE5 1018. b) Cupones cortados. ........................................................... 39

Figura 17. Representación gráfica de la tira de reactivos API20A.......................................................... 42

Figura 18. Ilustración de conexiones entre la celda y el equipo de medición ......................................... 44

Figura 19. a) Equipo de medición (potenciostato y FRA) y b) celda electroquímica. ............................ 45

Figura 20. Fotografía de biopelículas creciendo en la interfaz líquido-gas, se observa una capa mucoide

creciendo entre el medio de cultivo, y la atmósfera de nitrógeno. .......................................................... 65

Figura 21. Tinciones de Gram de diferentes muestras de biopelículas anaerobias obtenidas de los

aislamientos realizados en el laboratorio con la técnica de tubo rodado. ................................................ 67

Figura 22. Cinética de degradación de compuestos BTX de de cultivos tomados directamente de las 13

muestras resembradas en medio MIN con sustratos específicos. ............................................................ 70

Figura 23. Cinéticas de producción de CO2 de cultivos tomados directamente de las 13 muestras

resembradas en medio MIN con sustratos específicos. ........................................................................... 70

VI

Figura 24. a) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio

con lactato. b) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en

medio con compuestos BTX. .................................................................................................................. 72

Figura 25. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Testigo; Cupón de Acero al carbón sin

microorganismos. .................................................................................................................................... 73

Figura 26. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Muestras DGC11, 400x y DGC17, 2500x

respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con microorganismos. ..................................... 74

Figura 27. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental de muestras de cultivos mixtos de bacterias

aerobias y anaerobias. .............................................................................................................................. 74

Figura 28. Posibles estrategias multicelulares en gasolinoductos. .......................................................... 75

Figura 29. Diagrama complejo de los datos experimentales para el sistema abiótico............................. 77

Figura 30. Diagrama complejo obtenido de las mediciones realizadas al sistema biótico. .................... 78

Figura 31. Diagrama de Bode que muestra el ángulo de fase obtenido de los datos experimentales de un

sistema abiótico(a) y un sistema biótico (b). ........................................................................................... 80

Figura 32. Circuitos equivalentes utilizados para el ajuste de datos de impedancia, a) sistema abiótico,

b) sistema con biopelícula. ...................................................................................................................... 82

Figura 33. Diagrama complejo con ajuste de datos de un sistema abiótico ............................................ 85

Figura 34. Diagrama complejo, datos experimentales con ajustes de datos para el sistema abiótico. ... 86

VII

Resumen

El presente trabajo comprende un estudio de biopelículas microbianas que crecen sobre

materiales metálicos, particularmente sobre acero al carbón, por ser el material más utilizado en la

infraestructura de la Industria Petrolera.

Uno de los objetivos principales fue aislar y caracterizar parte de la flora microbiana anaerobia

presente en ductos que transportan gasolina, así como estudiar su influencia bio-electroquímica sobre

acero al carbón SAE 1018, especialmente cuando ocurre la formación de biopelículas. La

determinación de algunas estrategias multicelulares a través de las cuales esta flora anaerobia influye

en la corrosión cuando está en contacto con bacterias degradadoras de benceno, tolueno, xileno,

pentano, MTBE y TBA, fue otro de los objetivos centrales de este trabajo.

Para cumplir dichos objetivos se realizó el aislamiento de algunas bacterias capaces de crecer

en condiciones anaerobias utilizando distintos aceptores de electrones y cultivos sustrato-específicos.

Posteriormente se realizó la caracterización macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética de

algunos de los cultivos obtenidos, y se finalizó con la caracterización electroquímica, utilizando la

técnica de Espectroscopía por Impedancia Electroquímica.

Los resultados obtenidos con el monitoreo electroquímico se aproximaron utilizando un análisis

con circuitos eléctricos equivalentes, para simular el efecto de la influencia microbiana en la corrosión

del acero, con el fin de estudiar el comportamiento de la impedancia en el sistema experimental

electrodo-interfaz biológica-electrolito. Además de la Espectroscopia por Impedancia Electroquímica

se utilizó el método electroquímico de medición del Potencial de Circuito Abierto, para complementar

la caracterización del sistema tanto en presencia como en ausencia de biopelículas.

Los resultados que se obtuvieron con este estudio comprenden los aislamientos y de la

caracterización de flora microbiana anaerobia, desde las perspectivas macroscópica, microscópica y

bioquímica, así como la caracterización macroscópica y cinética de cultivos mixtos artificiales, la

caracterización electroquímica con EIS, y los datos obtenidos a partir de un modelo con circuitos

eléctricos equivalentes para la simulación de los resultados de impedancia, todo esto se realizó para

determina el rol de algunas de las biopelículas microbianas estudiadas en la corrosión del acero al

carbón y su relación con las estrategias multicelulares y la biocomplejidad.

VIII

Agradecimientos Formación académica:

La UPIBI ha sido la recta final de una etapa de mi vida que está por concluir, y estoy orgullosa de salir de una escuela que si bien no es extremadamente difícil, tampoco es fácil, requiere básicamente dedicación, trabajo, TIEMPO… La manera en que uno tome las cosas a lo largo de su vida, en todos los ámbitos es cuestión de perspectivas, yo no puedo decir cuál es el nivel académico exacto de la UPIBI; uno lo va construyendo generación tras generación al llevar sus estudios ya sea de manera mediocre o sacando el mayor provecho de cada cosa. Vivimos en país donde en donde la mayoría hace el mínimo esfuerzo, y donde nadie se cree la idea de que las nuevas generaciones somos el futuro y el presente del país, del mundo, y cada quién lo va creando día a día con su manera de vivir, cada quién decide el grado de mediocridad o de productividad que le da a su vida. A las personas que laboran en la UPIBI, de ustedes depende al igual que del alumno el crecimiento del nivel académico y porqué no, del mismo país. Yo aprendí mucho en esta escuela, de los buenos y los malos ejemplos, y agradezco de manera general a todos los profesores que creen en ella, que la quieren y que trabajan por transmitir esa motivación ese buen ejemplo. El nivel de la escuela, depende en gran medida de sus alumnos, pero ustedes son los que nos impulsan y motivan a fijarnos metas. A quienes realmente dan su esfuerzo y dedicación a tener una vida productiva, y transmitir esas ganas a los estudiantes, es a quienes doy gracias. Proyecto Terminal Yo no pensé poder aprender tanto de mí en una materia externa, pero así fue, mi Proyecto Terminal es el primero (espero), de muchos proyectos que deseo realizar con el mismo o más cariño con que realicé éste, y espero siempre contar con una persona que me impulse a buscar lo mejor de mí, que le interese no solo publicar y sacar estudiantes, sino cambiar el entorno de las cosas, que busque no solo las soluciones del problema, sino la manera de integrarlo a la vida diaria, porque si no es así, la investigación se convierte en otra manera lucrativa de vivir y pierde su verdadero significado. Agradezco sinceramente a la persona que me ayudó a formarme esta idea, por el apoyo, la dedicación y paciencia de mi directora de Tesina Xóchitl Domínguez Benetton, de quien he aprendido mucho, y la cual me hizo ver nuevas perspectivas en mi vida académica, y me ha ayudado de manera directa e indirecta a definir más mi rumbo y el tipo de persona que quiero llegar a ser. Por ser además de mi directora de tesina una persona a la cual estimo, admiro y respeto profundamente, por su ejemplo, su esfuerzo y el tiempo dedicado a mis trabajos y a mi formación.

Mil gracias.

A mi asesora interna la Maestra en Ciencias, Gloria López Jiménez, por respetar mis ideas y mi trabajo, por su tiempo dedicado, por su apoyo y sus sugerencias que siempre me fueron de utilidad, por su comprensión y paciencia.

Muchas gracias. A mi evaluadora Maria Elena Rosas, por su apoyo, amabilidad, y esa sonrisa que siempre ha mostrado hacia mí y hacia todos mis compañeros.

Gracias.

IX

A mi familia

A la cual amo profundamente, y que es el núcleo y la columna que me sostiene; gracias, porque todos los sentimientos más nobles los aprendí a su lado.

A mi madre, por se mi mamá y mi amiga, por respetar mis ideas, por apoyarme siempre y en todo

momento, por todas las cosas que nos has dado y enseñado, por nunca dejarnos solas y por tener el

valor de continuar siempre cuando las cosas se ponían más difíciles, por ese gran valor tuyo mamá,

de mirar siempre adelante y querernos como nos quieres, espero de alguna forma regresarte con

creces ese cariño y esfuerzo, espero que te sientas tan orgullosa de mi como yo me siento de ti.

Te amo.

A mis tías; Por ese apoyo incondicional que me brindan, por los cuidados, por los regaños, por todo el tiempo

invertido en mi, por las palabras de aliento, por los abrazos, por ayudarme a crecer en TODOS los

momentos de mi vida, por aguantarme y adaptar de cierto modo su mundo a nosotras, por ese gran

ejemplo de superación que siempre me han inspirado, y por ser para mi y mi hermana uno de los

pilares de nuestra vida, nuestras segundas madres.

Gracias por su enorme cariño, yo he aprendido mucho de ustedes, y sin su presencia la vida

hubiera sido y sería muy diferente.

Muchas gracias por siempre estar ahí al pie del cañón.

A mi hermana, por ser mi mejor amiga, mi confidente y cómplice desde pequeñas, por ser también

un ejemplo y fuente de inspiración para esta carrera, por aguantarme, por regalarme las tardes de

ocio más agradables, y por apoyarme aunque no este de acuerdo siempre con lo que hago, eres la

mejor hermana que pude haber tenido, te quiero.

Gracias por ser siempre constante en mi vida.

A mi familia en general, abuelos maternos y paternos a los cuales adoro, y que siempre logran

hacerme sentir bien, a ambas familias en general les agradezco porque de manera indirecta me

impulsan a crecer, y me dan ánimos, una gran disculpa por desaparecerme parcialmente estos

cuatro años, pero siempre los tengo presentes, y siempre consiguen que una gran sonrisa se forme

en mi rostro, espero se sientan orgullosos de mi.

A Hugo Enrique, que ha sido y será una persona de suma importancia en mi vida, a la cual

quiero y agradezco de manera particular por su apoyo durante la carrera, y en la vida

personal, por que de el obtuve muchas cosas buenas, y crecí a lo largo de este tiempo, por todo

ese apoyo incondicional que nunca voy a olvidar, gracias.

X

A todos mis amigos, a los cuales no alcanzo a nombrar, por falta de espacio, y de palabras, los

quiero mucho, y son para mi el lugar donde me envanezco, porque todos ustedes siempre me

dan palabras de aliento, y yo se, que en muchas ocasiones no son objetivos, pero sus palabras

me llenan de nuevas fuerzas, me ayudan a crecer y me hacen una mejor persona.

Por enseñarme el valor de un texto viejo y gastado de “lo esencial es invisible a los ojos”,

porque cada uno me hace muy feliz al recordarle, y tengo un mundo entero de cosas que me

ligan a ustedes.

A toda la gente que ha creído en mi a lo largo del tiempo, que conoce la infinidad de defectos que tengo, y que sigue apoyándome, a la gente que hace posible que yo quiera ser siempre una mejor persona, a esa que me impulsa con su cariño y ejemplo a superarme día con día. A todas las personas que quiero, a mi familia, a mis amigos, profesores, a toda esa gente que aunque lejos siempre la siento cerca, y de la cual siempre he obtenido una palabra de aliento cuando me encuentro triste. Yo no tengo palabras para decirles lo especial e importante que me hacen sentir. Es tanta y a la vez tan poca la gente que hace que mi vida gire, y que mi indiferencia se convierta en un enorme cariño, y que saque a flote lo mejor de mi, a todos sus abrazos, y sus platicas, y su infinita paciencia para conmigo, a toda la colección de momentos que me han regalado y me regalan. A todos ustedes es a quienes en gran mediada, les debo no solo terminar una etapa más de mi vida escolar, sino ser la persona que soy. A toda esa gente que crece conmigo muy junta o a distancia. Simplemente GRACIAS.

XI

Lista de Símbolos y Abreviaturas EIS Por sus siglas en inglés (Electrochemical Impedance Spectroscopy), Espectroscopía por

Impedancia Electroquímica.

OCP Por sus siglas en inglés (Open Circuit Potential), Potencial de Circuito

SPE Sustancias Poliméricas Extracelulares

BTX Compuestos BTX; Por sus siglas (Benceno, Tolueno y Xileno)

TBA Por sus siglas en ingles, Tertiary-Butyl Alcohol

MTBE Por sus siglas en ingles (Methyl tert-butyl ether)

GSE Por sus siglas en ingles (Gaseous Secondary Electrón), Detector de Electrones Secundarios.

EDS Por sus siglas en ingles (Energy Dispersion Spectroscopy), Espectroscopía por Dispersión de

Energía.

ENA Por sus siglas en ingles (Electrochemical Noise Analysis), Análisis por Ruido Electroquímico.

ESEM Por sus siglas en ingles (Environmental Scanning Electron Microscope), Microscopia

Electrónica de Barrido Ambiental.

MIN Abreviatura de Medio Mínimo; Medio de cultivo con poca concentración de nutrientes.

ENR Abreviatura de Medio Enriquecido; Medio de cultivo con alta concentración de nutrientes.

Z Impedancia.

ω Frecuencia.

φ Ángulo de Fase.

I Corriente.

E Potencial.

RP Por sus siglas en ingles (Redox Potential), Potencial Redox.

TE Por sus siglas en ingles (Tafel Extrapolation), Extrapolación de Tafel.

XII

Léxico técnico

Abiótico: Componentes o factores del medio ambiente que carecen de vida pero que

condicionan la existencia de seres vivos en un determinado entorno, por

ejemplo: fuentes de carbono, minerales, sales

Biocomplejidad: Se refiere al las interacciones complejas del comportamiento biológico, social,

químico y fisiológico de los organismos vivos en su ambiente. El término y el

campo de la investigación son relativamente nuevos y abarcan otros dominios

como biodiversidad, ecología etc.

Biótico: Término para denominar todo lo viviente.

Biopelícula: Conglomerado de microorganismos que posee gran heterogeneidad y que se

forma con capas de células microbianas (aunque también pueden asociarse

organismos mayores) y productos celulares, que son capaces de adherirse a una

superficie sólida, o bien a una interfaz.

Celda electroquímica: Dispositivo aislado en donde se llevan a cabo reacciones de óxido-reducción,

en interacción con un material electroactivo, y que pueden ser medidas por

medio de los componentes presentes en el dispositivo.

Corrosión localizada: Proceso en el cual las áreas anódicas (de oxidación) y las catódicas (de

reducción) están separadas unas de otras dando lugar a la disolución del metal

en un área restringida.

Electrolito: Sustancia que al disolverse en agua, da lugar a la formación de iones.

Microorganismos sésiles: Microorganismos que crecen sobre superficies o se asocian a interfases a las

que pueden adherirse por medio de las sustancias poliméricas celulares (matriz

extracelular, glicocálix) o bien mediante la utilización de flagelos o pili, entre

otros mecanismos.

Microorganismos planctónicos: Microorganismos de vida libre, que viven dispersos en un ambiente, en

el que no se han adherido a una superficie o interfaz.

XIII

Millardo: Un millardo es el número natural equivale a 109 (1 000 000 000) cuyo nombre

usual es mil millones.

Mineralización: Proceso en el cual compuestos orgánicos son oxidados hasta compuestos

inorgánicos, por medio de reacciones metabólicas de microorganismos, por

ejemplo: la conversión del benceno hasta CO2 y H2O es un proceso de

mineralización.

Pasivación: Término utilizado en corrosión para definir la protección de un dispositivo en

estado sólido. Sucede cuando crece una capa de oxido (u otro producto de

corrosión) en la superficie de una superficie electroactiva o semiconductora

para proveer estabilidad eléctrica al sistema y se refleja en un cambio de

potencial a un valor mucho más positivo que aquél del material en su estado

activo.

XIV

PARTE I

INTRODUCCIÓN

1

I. 1 Introducción y Perspectivas del Trabajo

La organización característica de las comunidades microbianas ocurre en forma de biopelículas,

tanto en los ambientes naturales como en aquellos establecidos por el hombre, debido a que la mayoría de

las superficies o interfases pueden proporcionar grandes ventajas para la vida microbiana que las vuelven

un hábitat potencialmente colonizable, como son: una alta concentración de nutrientes, protección contra

el esfuerzo de corte, protección contra compuestos antimicrobianos, posibilidades para el intercambio de

material genético, entre otros factores.

Las biopelículas han demostrado utilidad para diversas aplicaciones, por ejemplo, en el

tratamiento de aguas residuales o efluentes, en procesos industriales de biotransformación para la

producción de metabolitos secundarios, en sistemas para producción de energía y en la bioremediación de

contaminantes [GERARD H. MARKX y col., 1990], entre otras aplicaciones. Sin embargo, también es

conocido que las biopelículas frecuentemente causan o influyen en serios problemas, como el

bioensuciamiento, el biodeterioro, la biocorrosión, la contaminación de procesos o implantes médicos, las

enfermedades infecciosas, que generalmente se asocian a grandes pérdidas humanas, ambientales y

económicas [DOMÍNGUEZ B. X., 2007].

Dentro de los problemas más relevantes, en cuestión de pérdidas económicas, se encuentra la

biocorrosión, en la que las biopelículas influyen en los procesos de degradación metálica que resultan en

la disolución de los metales, lo cuál repercute en una gran variedad de industrias, como la del papel, la

naval, la petrolera, la geotérmica, en las cuales el mantenimiento de las instalaciones, a consecuencia de la

corrosión, es un egreso económico significativo. Tan solo en los Estados Unidos de Norte América

(EUA) los costos relacionados con la corrosión metálica se estimaron para el año 2001 en 276 millardos

de dólares por año [CC TECHNOLOGIES y col., 2001], lo cual equivale aproximadamente al 3.2% del

Producto Interno Bruto (PIB, PPA) de ese país en ese año [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Una de las industrias más susceptibles a la corrosión es la industria petrolera, debido a que gran

parte de su infraestructura se encuentra expuesta al ambiente, y muchas veces en contacto con agua no

estéril que permite la proliferación de microorganismos. Se ha estimado que en esta industria algunas de

las pérdidas relacionadas con la presencia microbiana pueden llegar a representar entre 10 % y 50 % del

daño total por corrosión, lo cuál para el caso de EUA se traduce en pérdidas de 27.6 millardos a 138

millardos de dólares por año.

2

En México no se tienen estadísticos reportados al respecto, sin embargo, se estima que las

pérdidas económicas relacionadas con la corrosión se aproximan al 5% del PIB (PPA) [DOMÍNGUEZ B.

X, 2007], el cuál para el año 2006 correspondió a 1072 millardos de dólares [CENTRAL INTLLIGENCE

AGENCY, 2007] y por consecuencia, la biocorrosión podría haber representado aproximadamente de

5.36 millardos a 26.8 millardos de dólares tan sólo para ese año en nuestro país [DOMÍNGUEZ B. X.,

2007].

La biocorrosión originada por el bioensuciamiento en la industria petrolera se produce en los

procesos de extracción, procesamiento, distribución, almacenamiento y transporte [SANDERS P.J. y col.,

2005], tanto de productos crudos como refinados. En dichas operaciones de la industria del petróleo los

problemas originados por la actividad de microorganismos son particularmente difíciles de diagnosticar,

evaluar y controlar. Por ello, resulta necesario estudiar y desarrollar nuevos métodos y herramientas para

obtener información de los fenómenos relacionados con estas estructuras biológicas que tienen influencia

en la corrosión.

La caracterización de las comunidades microbianas nativas de esta industria (y otras) y la

determinación de sus posibles interacciones y complejidad, asociadas al ambiente al que se encuentran

expuestas (biocomplejidad), son importantes para incrementar el conocimiento de las especies

microbianas involucradas en los problemas de corrosión, con el fin de obtener información que permita

desarrollar nuevas estrategias para su detección, monitoreo y control. Esto es de especial importancia en

aquellos sistemas de la industria petrolera para los que se carece de dicha información o que ésta es

mínima, por ejemplo, los poliductos (que transportan diesel, gasolina y otros productos), las torres de

enfriamiento y los tanques de almacenamiento de productos terminados, entre otros.

Por otra parte, el seguimiento en tiempo real de la influencia de biopelículas en materiales

metálicos es uno de los puntos críticos que se necesitan abatir para poder obtener información acerca de la

influencia microbiana en los sistemas industriales, para lo cuál las técnicas electroquímicas proporcionan

una alternativa, cuyo uso se ha incrementado debido a la los resultados y análisis que permiten obtener,

debido a la naturaleza electroquímica de estos sistemas [THOMAS R. J. y col. 2002; DOMÍNGUEZ B.

X, 2007]. La Espectroscopía por Impedancia Electroquímica (EIS) ha sido utilizada previamente en

estudios de biocorrosión [MANSFELD F. y col., 1990; MANSFELD F. y col., 1991; MONFORT N,

2001; DUBIEL M., y col., 2002], entre otras investigaciones, ya que permite calcular información

fenomenológica y mecanística de los eventos involucrados en estos procesos (reacciones en fase

homogénea, difusión, adsorción) [CHEN G. y col., 1997; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

3

A pesar de ello, la mayoría de los estudios de biopelículas que se han realizado al presente con EIS son

analizados mediante la aproximación de su comportamiento con circuitos eléctricos equivalentes

[RIVERO-HUDEC M. A., 2004; ÖRNEK D., 2002B; ZUO R. y col., 2004], sin considerar la distribución

de corriente y potencial que ocurre a lo largo del sistema, sino considerando contribuciones globales, que

usualmente ofrecen un análisis poco sustancial a cerca del comportamiento de estas estructuras biológicas

y las reacciones electroquímicas que suceden asociadas a las mismas [DOMÍNGUEZ B. y col., 2007].

Un análisis más profundo utilizando este tipo de aproximación requiere realizar muchos cálculos y

conocimientos avanzados de electroquímica.

Como consecuencia de los aspectos mencionados anteriormente, es que se realizó este trabajo de

investigación, el cuál se presenta en este documento dividido en dos partes: 1) el aislamiento y

caracterización de parte de la flora microbiana anaerobia presente en ductos que transportan gasolina—lo

cual no se ha encontrado reportado en documentos de dominio público o científico hasta el momento—

desde los puntos de vista macroscópico microscópico, bioquímico y cinético, cuyos resultados y discusión

se presentan en la sección III.1 de este documento, a partir de lo cuál se determina parte de la potencial

biocomplejidad y algunas de las estrategias multicelulares a través de las cuales la flora microbiana

anaerobia proveniente de estos sistemas puede influir en la corrosión, cuando está en contacto con

bacterias degradadoras de benceno, tolueno, xileno, pentano, MTBE y TBA; y 2) la caracterización

electroquímica, utilizando las técnicas de potencial de circuito abierto y de espectroscopía por impedancia

electroquímica, cuyos resultados se analizan a través de el uso de circuitos eléctricos equivalentes para

determinar la influencia de algunas de las biopelículas estudiadas en la corrosión del acero al carbón,

cuyos resultados y discusión de presentan en la sección III.2 de este documento.

4

I. 2 Marco Teórico

I.2.1 Biopelículas

El crecimiento microbiano asociado a superficies o interfases es el estilo de vida predominante de

estos seres vivos: aproximadamente el 95% de los microorganismos lo realizan en condiciones naturales

y son capaces de formar una biopelícula, siempre y cuando haya presente al menos una mínima

concentración de agua que contenga los nutrientes necesarios, asociada al medio en el que se encuentran

[EVANS L. V., 2000].

Una biopelícula se puede definir como un conglomerado de naturaleza biológica que posee gran

heterogeneidad y que se forma con capas de células microbianas (aunque también pueden asociarse

organismos mayores) y productos celulares, que son capaces de adherirse a una superficie sólida (viva o

inerte), o bien a una interfaz (líquido-sólido, líquido-gas). Estas estructuras biológicas se forman a partir

de microorganismos sésiles que producen una matriz (glicocálix) de sustancias poliméricas extracelulares

(SPE), la cuál les brinda posibilidades de adhesión, soporte y protección ante las diferentes formas de

estrés a las que los microorganismos pueden estar expuestos [DAVEY M. E. y col., 2000; COSTERRON

J. W., 1999; WATNICK P., y col., 2000; CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING., 2006;

PICIOREANU C., 1999; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Los microorganismos contenidos en una biopelícula pueden pertenecer a una misma o diversas

especies distribuidas en su estructura, siendo la matriz de SPE lo que mantiene la cohesión y las

posibilidades de interacción entre ellos [HARRISON J.J., y col., 2005].

El crecimiento en una biopelícula provee grandes ventajas en comparación con el crecimiento

planctónico (de vida libre), la proximidad física de distintas células favorece las interacciones

sinérgicas—especialmente cuando se forman consorcios microbianos complejos—cuyas células se

distribuyen naturalmente de acuerdo con sus requerimientos de crecimiento (aerobias estrictas, aerobias

facultativas, anaerobias estrictas, acidófilas, oligotróficas).

5

Como consecuencia, dentro de las biopelículas se pueden originar distintas condiciones y

gradientes, por ejemplo: zonas de aireación diferencial, zonas de acidificación diferencial, zonas de

concentración de iones que favorecen el establecimiento de estas complejas comunidades simbióticas

[HARRISON. J. J., y col., 2005; DOMÍNGUEZ B. X., 2004].

La incorporación de un microorganismo a una biopelícula le provee de grandes ventajas, como

son: la posibilidad de transferencia horizontal de material genético entre su misma y otras especies, la

utilización conjunta de subproductos metabólicos, una mayor tolerancia a compuestos antimicrobianos,

protección ante los cambios del microambiente y una defensa frente al sistema inmunitario o

depredadores, según sea el caso, lo cuál depende del ambiente en el que se forme la biopelícula

[HARRISON. J. J., y col., 2005].

I.2.1.1 Formación de una Biopelícula

La formación de una biopelícula comienza con la acumulación de nutrientes en una superficie (o

una interfaz) debido a la porosidad del material, a las interacciones electrostáticas, a fenómenos de

adsorción y a factores electroquímicos, que propician que haya un aumento en la concentración de

nutrientes [DOMÍNGUEZ BENETTON, 2007; DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Posteriormente ocurre la

adsorción reversible de algunas células planctónicas a la superficie pre-acondicionada; en un principio las

células se adsorben débilmente, posteriormente se forman pequeñas colonias que, si no son rápidamente

removidas, comienzan un proceso de adhesión irreversible a la superficie [VIDELA H. A. 1996].

Los primeros microorganismos que se establecen en una biopelícula, formando colonias, facilitan

la llegada de otras células al generar más sitios a los cuales éstas pueden adherirse, aumentando así la

producción de las SPE que mantendrán a la biopelícula unida [PRAKASH B. y col., 2003].

Cuando la biopelícula ha alcanzado un estado maduro y una determinada concentración de

microorganismos ocurre el desprendimiento de algunas células o conglomerados celulares—proceso

principalmente activado por moléculas de señalización (fenómeno de percepción de quórum o quorum

sensing); dichas células migran para repetir el proceso y formar nuevas biopelículas o asociarse a otras ya

establecidas, de las cuales incrementan su complejidad, la Figura 1 ilustra el proceso de la formación de

una biopelícula [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING, 2005].

6

Figura 1. Esquema de teórico de la formación de una biopelícula sobre una superficie inerte

[HARRISON J. J. y col., 2005].

Una vez que la biopelícula alcanza un estado maduro puede tener diferentes propiedades

heterogéneamente distribuidas, las estructuras que llegan a formar son muy diversas, y éstas dependen en

gran medida de los factores ambientales a los que la biopelícula se encentre expuesta.

I.2.1.2 Estructura y Arquitectura de una Biopelícula

Durante los procesos de formación y maduración de las biopelículas éstas se tornan únicas, tanto

en estructura como en arquitectura, aunque pueden hacerse algunas consideraciones universales para

describirlas. Factores abióticos, tales como el pH, la temperatura, la concentración de nutrientes, la

viscosidad del medio, la concentración de oxigeno, determinan el tipo de distribución que la biopelícula

adoptará.

Las biopelículas no son monocapas continuas de microorganismos, sino microcolonias que crecen

distribuidas heterogéneamente; como consecuencia, dentro de la biopelícula pueden ocurrir diferentes

interacciones entre microorganismos, ubicándose cada uno en las condiciones que resultan óptimas para

su crecimiento.

Así, en la estructura madura de una biopelícula están contenidas las colonias desarrolladas de

bacterias embebidas en SPE, que pueden encontrarse separadas por vacíos intersticiales o canales que se

7

forman en presencia de un fluido (estático o en movimiento) al que la biopelícula esta expuesto (Figura

2), estos canales favorecen el transporte de nutrientes, oxígeno, e incluso agentes antimicrobianos,

principalmente por difusión [DONLAN M. R. y col., 2002].

Esta forma de crecimiento resulta en heterogeneidades desde diferentes perspectivas, desde su

arquitectura, que puede resultar en tapices (tapetes microbianos), agregados, promontorios o incluso

microcolonias de mayor complejidad que generan formaciones con aspecto de tallos o setas, dependiendo

del entorno, hasta heterogeneidades de los siguientes tipos [PICIOREANU C., 1999]:

o Heterogeneidad geométrica: espesor de la biopelícula, su rugosidad superficial,

su porosidad, la cobertura superficial del sustrato

o Heterogeneidad química: diversidad de los solutos químicos (nutrientes,

productos metabólicos, inhibidores), gradientes de oxigeno y pH, diversidad de reacciones

(aerobias/anaerobias), gradientes iónicos

o Heterogeneidad biológica: diversidad de especies microbianas y su distribución

espacial, densidad celular, diferencias es la actividad celular (fase de crecimiento,

producción de SPE, células muertas), diversidad metabólica (metanogénesis, sulfato-

reducción, nitrato-reducción)

o Heterogeneidad física: densidad, permeabilidad, viscoelasticidad, fuerza,

difusividad, presencia de sólidos abióticos, propiedades de las SPE, propiedades magnéticas

y eléctricas del sustrato

o Heterogeneidad electroquímica: Diferencias de potencial, distribución de ánodos

y cátodos, propiedades conductivas, condiciones de potencial y de pH, distribución de cargas,

distribución de sitios activos, zonas electroactivas, estructuras metalúrgicas heterogéneas,

localización de defectos [DOMIGUEZ B. X., 2007].

Todos estos tipos de heterogeneidades son consecuencia de los procesos característicos de

adhesión que presentan las biopelículas.

8

Figura 2. Representación de la arquitectura heterogénea de una biopelícula [Reproducido de:

EHP, 1998].

Por otra parte, la matriz de SPE de una biopelícula puede ser considerada similar a un hidrogel—

un polímero complejo hidratado—cuyo contenido acuoso supera en gran medida su propio peso seco

[HARRISON J. J., 2005]. Estas características confieren a la biopelícula fluidez y elasticidad

(propiedades viscoelásticas) suficientes para que ésta soporte los cambios en el esfuerzo de corte cuando

se encuentra expuesta a un fluido circundante en movimiento.

Así, en la estructura y arquitectura heterogéneas de las biopelículas están contenidas las células,

que ocupan entre 5% y 25% del espacio total, y el glicocálix, formado por polímeros, ADN y proteínas,

que ocupa entre 50% y 90% [HARRISON. J. J., y col., 2005; DONLAN M. R. y col., 2002]. Además de

los componentes celulares y la matriz polimérica, las biopelículas también están compuestas de materia

adsorbida y absorbida, solutos orgánicos, iones metálicos y partículas inorgánicas [DILLON C. P., 1982,

DOMÍNGUEZ B. X., 2007], entre otros (Figura 3).

Las SPE y las células están generalmente dotadas de carga negativa [HARRISON J. J. y col.,

2005; PAPAVINASAM S., 2007] (Figura 3), lo cuál favorece el atrapamiento de partículas que sirven

como alimento a las células, además de arcilla y otros minerales. La materia atrapada genera nichos

microscópicos con microentornos distintos.

9

Figura 3. Representación de la estructura teórica de una biopelícula [Modificado de: HARRISON

J. J. y col., 2005].

Los microorganismos que son afines o manifiestan sus propias necesidades individuales se

agrupan en estas microzonas que les proporcionan las condiciones que más los favorecen, formando así

un consorcio microbiano diversificado [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING (2006), MONTANA

STATE UNIVERSITY].

Adicionalmente, la estructura y arquitectura de las biopelículas permiten que se lleve a cabo un

mecanismo de comunicación intracelular, conocido como quorum sensing (QS), ó fenómeno de

percepción de quórum, el cual consiste en la producción de moléculas señalizadoras por las células

[WATERS M. C. y col., 2005]. Este mecanismo es uno de los aspectos más importantes, y sin embargo

aún altamente enigmáticos, de las comunidades de bacterias que viven en estas estructuras biológicas.

El QS provee a los microorganismos en una biopelícula de un sistema de comunicación mediante

señales bioquímicas (llamados autoinductores o feromonas), utilizando moléculas como las N-acyl

homoserin lactonas (AHL); existen evidencias de que algunas de estas señales producidas por las células

y transmitidas a otras membranas extracelulares pueden ser interpretadas no sólo por los miembros de la

misma especie, sino también por otros géneros microbianos [ BASSLER B. L. , 2006; UNQSR, 2006].

La función principal de este mecanismo de señalización es regular el crecimiento de la población a través

de la detección de la concentración celular crítica dentro de la biopelícula [CENTER FOR BIOFILM

ENGINEERING (2006), MONTANA STATE UNIVERSITY; MILLER M. B. y col., 2001].

10

I.2.1.3 Importancia General de las Biopelículas

Las biopelículas son capaces de crecer en una gran diversidad de condiciones, incluyendo lugares

altamente inhóspitos; pueden crecer en ríos, sobre la superficie de los dientes, en algunas estructuras de

plantas, en el tracto digestivo de algunos animales, en tejidos humanos, en lentes de contacto, en torres de

enfriamiento, en los cascos de los barcos, en implantes médicos, en instalaciones de la industria

alimenticia, en ductos y tuberías [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING (2006), MONTANA

STATE UNIVERSITY].

La capa viscosa que recubre las rocas de un río o de un arroyo corresponde a una biopelícula, la

quilla de acero de un barco en alta mar se recubre con biopelículas que incrementan la resistencia al

movimiento del buque y afectan, por tanto, su velocidad. Algunas biopelículas, formadas por especies de

Archaea, línea ancestral de procariotas (organismos carentes de núcleo), sobreviven incluso en

ambientes extremos como los manantiales termales y fumarolas volcánicas submarinas [HARRISON J. J.

y col., 2005]. Otras biopelículas causan estragos en la industria petrolera, al promover la corrosión de los

metales y reducir el tiempo de vida de los ductos y tanques de almacenamiento [VIDELA H. A. 1996;

DOMÍNGUEZ B. X., y col., 2007]. En su amplia capacidad para desarrollarse casi en cualquier

ambiente radica su importancia, principalmente, debido a que en muchos casos este crecimiento tiene

repercusiones económicas.

Las biopelículas causan arriba del 80% de las infecciones microbianas que afectan a la salud

humana en EUA, el costo asociado con el tratamiento de estas infecciones es de más de un millardo de

dólares por año. Asimismo, las biopelículas contribuyen a las infecciones en implantes médicos, tales

como catéteres, las cuáles en EUA han ocasionado hasta 10,000 muertes por año y representan un costo

de más de 11 millardos de dólares anuales en hospitales [FINE D., 2005]. El 20% de los catéteres que

han sido implantados (en vías urinarias), en más de 5 millones de pacientes en Estados EUA, han

adquirido infecciones por biopelículas, lo cuál ha resultado en costos de 1.6 millardos de dólares por año

[DOMÍNGUEZ B. X., 2007]. Además, alrededor de 70,000 personas en el mundo han sido

diagnosticadas con fibrosis quística, enfermedad causada por biopelículas de Pseudomonas aeruginosa

[MBEC BIOPRODUCTS, 2006]; tan solo en esta enfermedad anualmente se gastan de 5 a 7 millardos de

dólares en cuidados médicos [DOMÍNGUEZ B. X., 2007].

11

Una de las industrias más susceptibles a la corrosión es la industria petrolera, debido a que gran

parte de su infraestructura se encuentra expuesta al ambiente, y muchas veces en contacto con agua no

estéril que permite la proliferación de microorganismos. Tan solo en los EUA los costos relacionados con

la corrosión metálica se estimaron para el año 2001 en 276 millardos de dólares por año [CC

TECHNOLOGIES, NACE INTERNATIONAL, 2001], lo cual equivale aproximadamente al 3.2% del

Producto Interno Bruto (PIB, PPA) de ese país en ese año [DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Se ha estimado

que en esta industria algunas de las pérdidas relacionadas con dicha presencia microbiana pueden llegar a

representar entre un 10 % y 50 % del daño total por corrosión, lo cuál para el caso de EUA se traduce en

pérdidas de 27.6 millardos a 138 millardos de dólares por año. En México no se tienen datos estadísticos

reportados al respecto, sin embargo, se estima que las pérdidas económicas relacionadas con la corrosión

se aproximan al 5% del PIB (PPA) [DOMÍNGUEZ B. X, 2007], el cuál para el año 2006 correspondió a

1072 millardos de dólares [THE WORLD FACTBOOK., 2007] y por consecuencia, la biocorrosión

podría haber representado aproximadamente de 5.36 millardos a 26.8 millardos de dólares tan sólo para

ese año en nuestro país [DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. También en EUA, en la industria de refinación de

petróleo, se estima que las pérdidas causadas por bioensuciamiento han excedido los 1.4 millardos de

dólares anuales [KNUDSEN J. G, 1981; DOMÍNGUEZ B. X., 2007].

La formación de biopelículas en intercambiadores de calor ha causado perdidas económicas de

millones de dólares anuales a nivel mundial, debido a que el bioensuciamiento limita la transferencia de

calor en estos sistemas [PHILIP-CHANDY R. y col., 2000], en los que es necesario remover las

biopelículas por medio de agentes químicos o mecánicos.

En general, los gastos ocasionados por el crecimiento de biopelículas en industrias, ciudades y

hospitales son aproximadamente de 500 millardos de dólares anuales sólo en EUA, debido a daños en los

equipo, a la contaminación de productos, a las pérdidas de energía y a las infecciones médicas

[DOMÍNGUEZ B. X., 2007].

I.2.1.3.1 Importancia de las biopelículas en la Industria Petrolera

Como se ha mencionado anteriormente en este documento, entre los contextos susceptibles a la

formación de biopelículas se encuentran algunos ambientes industriales, como los procesos de tratamiento

de aguas, la industria de manufactura del papel y la industria petrolera, entre otras. En la industria del

petróleo, las biopelículas pueden estar implicadas en una gran diversidad de procesos, desde la extracción

del crudo, hasta los tanques de almacenamiento de producto terminado [PADILLA V. A. A., 2002;

12

DOMINGEZ B. X., 2005], donde pueden producir ácido sulfhídrico (que tiene efectos en la corrosión de

los metales), producir importantes masas de SPE que pueden llegar a obstruir el paso de fluidos en

tuberías, canales de circulación, o filtros, (proceso conocido como bioensuciamiento), y pérdidas en la

transferencia de calor en intercambiadores, entre otros problemas [VIDELA H. A., 1995].

La industria petrolera cuenta con una amplia infraestructura en donde pueden crecer las

biopelículas [PADILLA V. A. A., 2002]. En la Figura 4 se pueden apreciar algunas de las estructuras de

esta industria que son potenciales de ser invadidas por biopelículas, las cuáles son, principalmente,

estructuras que están en contacto con agua no estéril o con fluidos que tienen un porcentaje de agua no

estéril asociado.

Figura 4. Infraestructura de la industria petrolera sobre la que pueden crecer las biopelículas.

[PADILLA V. A. A., 2002; DOMINGUEZ B. X., 2005; Reproducido de: DOMIGUEZ B. X., 2007]

En México, la industria petrolera cuenta con más de 50,000 km de ductos (más de 12,000 tan sólo

en la industria de refinación) [PEMEX, 2006], de los cuales se ha reportado que aproximadamente el 68

% son considerados de alto riesgo—en términos de corrosión—debido a sus condiciones de operación y

mantenimiento [IMP, 2004].

13

En el caso de ductos que transportan gasolina (gasolinoductos) puede ocurrir que por cada gramo

de gasolina que es transportada pueda haber 0.01 o más, e incluso hasta un 1% de agua (en algunos casos

puede estar presente en mayor o menor cantidad) [DOMÍNGUEZ B. X. y col., 2007]; estas

concentraciones pueden ser suficientes para que el desarrollo de microorganismos se lleve a cabo,

incluyendo a aquellos capaces de formar biopelículas [DOMÍNGUEZ B. X. y col., 2007].

En los gasolinoductos la actividad de las biopelículas puede potencialmente ocasionar

bioensuciamiento y biocorrosión—uno de los principales daños en los que influyen—tanto dentro como

fuera de los ductos y en el equipo asociado o utilizado en los mismos [CENTER FOR BIOFILM

ENGINEERING, MONTANA STATE UNIVERSITY., 2006; DOMÍNGUEZ B. X, 2007; DOMÍNGUEZ

BENETON X. y col., 2007 ], ya que en dichos sistemas los microorganismos podrían encontrar los

nutrientes y condiciones abióticas que hacen a estos sistemas funcionar como grandes bioreactores que

favorecen el establecimiento de las complejas comunidades simbióticas, como ocurre en otros sistemas de

distribución (Figura 5).

Figura 5. Los sistemas de distribución (ductos) como bioreactores [CENTER FOR BIOFILM

ENGINEERING., 2006].

I.2.2 Fundamentos Generales de la Biocorrosión

La forma en que una biopelícula se desarrolla depende de los factores presentes en el ambiente en

el que crece y de los microorganismos que la conforman. En la industria petrolera, por ejemplo, ocurre la

interacción entre la biopelícula y el sustrato metálico sobre el que crece—con nutrientes adsorbidos a la

superficie—por lo que se crea un nuevo ambiente físico-químico con influencia biológica en donde

existen tres fases: un metal, una biopelícula incorporada con productos de corrosión y un electrolito. El

14

proceso de biocorrosión ocurrirá siempre y cuando se encuentren presentes estos tres elementos

[DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

La biocorrosión se refiere al proceso de degradación metálica en el que la actividad microbiana es

un factor con influencia significativa en el proceso de disolución. Dentro de los procesos de biocorrosión

ocurren diferentes reacciones electroquímicas, de las cuales las más importantes (cuando el material

metálico es acero) son la oxidación del hierro (Fe) y la reducción del agua (H2O), ya que son las

reacciones limitantes del proceso de corrosión [STOECKER II J. G., 2001], como se muestra a

continuación:

Reacción de oxidación:

−++↔ eFeFe 22

Evolución del hidrógeno:

222 HeH ↔+ −+

Reacción de reducción:

En medio alcalino:

−− +→+ OHHeOH 222 22

En medio ácido:

OHeHO 22 244 →++ −+

En medio neutro:

−−→++ OHeOHO 222 22

Sin embargo, bajo la presencia de una biopelícula, existen además otros procesos que pueden

controlar directa o indirectamente el proceso de corrosión, ya que cuando ésta crece sobre una superficie

metálica es capaz de generar un metabolismo cooperativo integral (Figura 5) que contribuye al

establecimiento de diferencias de potencial favorables para la ocurrencia y mantenimiento de los procesos

electroquímicos implicados en la biocorrosión [CHARACKLIS W. G. y col., 1983; DOMÍNGUEZ

BENETTON X y col., 2005,], además de afectar en los procesos difusionales [DOMÍNGUEZ B. y col.,

2007; DOMÍNGUEZ B. y col 2005].

15

Figura 6. Modelo teórico de consorcios de bacterias que influyen en la corrosión [Elaboración personal a

partir de: STOECKER II J.G., 2001; CHOUDHARY S.G., 1998].

Debido a la gran complejidad de las biopelículas, mencionada anteriormente, se establecen zonas

de gran heterogeneidad estructural sobre la superficie del metal, que desde el punto de vista de la

corrosión favorecen la separación de cátodos y ánodos—sobre los últimos es que se favorece la formación

de las colonias microbianas—incrementando los procesos de corrosión localizada. Cuando existe una

colonización bacteriana no uniforme, como ocurre en presencia de una biopelícula, se pueden formar

zonas en las que se crean gradientes de concentración de oxigeno, entre otros, generando diferencias de

potencial y por consecuencia de corrientes de corrosión, lo cual conduce a la disolución del metal; esto

también puede ocurrir cuando existen consorcios en los que se ven involucrados productos de corrosión

tales como el ácido sulfhídrico producido por las BSR (Bacterias Sulfato Reductoras), las cuales suelen

incrementar las posibilidades de que ocurran fenómenos de corrosión localizada como se observa en la

Figura 6 [MONFORT M. N., 2001].

Para la biocorrosión, generalmente se utilizan productos antimicrobianos, usualmente en ductos,

torres de enfriamiento, u otras estructuras de la industria petrolera, con el fin de eliminar la fuente de

biocorrosión; sin embargo, estor productos no logran desaparecer por completo la carga microbiana, ya

que la presencia del exopolímero afecta la difusión de estos compuestos, que en condiciones de

laboratorio regularmente se prueban solamente con microorganismos planctónicos, cuando en una

biopelícula sólo solo acabarían con microorganismos en algunas regiones más susceptibles, por su

posición en la biopelícula, por el retardo en la difusión del compuesto y por su degradación [RODNEY

M. D., 2002].

16

Figura 7. Esquema de una biopelícula en el cual los diferentes tipos de microorganismos presentes

inducen un proceso de corrosión localizada (BSR: Bacteria Sulfato Reductoras, NR: Bacterias Nitrato

Reductoras, TSR: Bacterias Tiosulfato Reductoras, FeR: Bacterias Reductoras de Hierro) [DOMÍNGUEZ

B. X., 2003].

I.2.2.1 Técnicas Electroquímicas para el Estudio de la Biocorrosión

El seguimiento en tiempo real de la influencia de biopelículas es uno de los aspectos más

importantes dentro de este proyecto. Las técnicas electroquímicas existentes proporcionan una alternativa

para la medición de la influencia en la corrosión de los sistemas con biopelículas presentes (Tabla 1).

Por medio de estas técnicas se pueden estudiar sistemas donde exista la interacción electrodo-

interfaz-electrolito, incluyendo aquellos sistemas donde existe una biopelícula presente, la cual puede

convertirse en un factor que acelera o retarda las reacciones de corrosión (dependiendo de la naturaleza de

la biopelícula que se forme). Cuando los microorganismos influyen en la corrosión, se considera la

adición de un factor más en una celda electroquímica, en la cuál la biopelícula tiene una incidencia directa

en los procesos que en ella se llevan a cabo—que pueden ser estudiados mediante las técnicas

electroquímicas enlistadas anteriormente—debido a que las biopelículas modifican la velocidad y la

naturaleza de las reacciones electroquímicas que controlan la corrosión.

17

Tabla 1. Características de algunas técnicas electroquímicas para la detección de corrosión y efecto de

biopelículas en materiales metálicos [Reproducido de: DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Técnica Principios de Medición y Ventajas Desventajas

Potencial de

Equilibrio

(Eeq)

o

Potencial de Circuito

abierto

(OCP)

Mide el potencial en el cual no hay corriente inducida (la diferencia de potencial contra un electrodo de referencia). Es fácil de medir. Útil para obtener algunos parámetros termodinámicos.

Interpretación difícil para biocorrosión, debido a la complejidad de los procesos involucrados. Posible sobre-interpretación de los resultados si no se realiza en conjunción con otras técnicas y análisis electroquímicos.

Potencial Redox

(RP)

Mediciones (en Voltios) de la afinidad de una sustancia por los electrones (electronegatividad) comparada con hidrógeno (el cual se fija en 0). Útil en combinación con mediciones de OCP y Rp .

Limitada para seguir cambios por biocorrosión.

Extrapolación de Tafel

(TE)

La corriente se fija y el potencial resultante es medido (o viceversa), puede ser utilizada para determinar el Ecorr y la Icorr, el potencial libre de corrosión, y la corriente de corrosión. Interpretación fácil de los resultados.

Existe incertidumbres para identificar las regiones de Tafel. Es una técnica intrusiva.

Resistencia a la

Polarización

(Rp)

Un potencial (típicamente 10-20 mV) es aplicado y la corriente ("líneal") resultante es medida. La resistencia a la polarización es el cociente del potencial aplicado y de la respuesta de corriente resultante. Esta “resistencia” es inversamente proporcional a la velocidad de corrosión uniforme. Útil para obtener información en casos de corrosión uniforme.

Desventajas en electrolitos resistivos, altas velocidades de corrosión o corrosión localizada.

Espectroscopía por Impedancia

Electroquímica (EIS)

Análisis de la respuesta en frecuencia de un potencial de corriente alterna (CA) aplicado a una celda electroquímica, midiendo la corriente de respuesta a través de ésta. Se requiere de un electrodo en estado estacionario desde el punto de vista de la corrosión y la biopelícula.

Difícil interpretación de datos. Pobres resultados para estudiar un proceso localizado aislado, como el seguimiento de una picadura.

Análisis de Ruido Electroquímico

(ENA)

Mide las fluctuaciones de corriente y potencial. Requiere análisis estadístico para la correcta interpretación de los resultados.

Es muy sensible a cualquier perturbación externa.

Técnica del Bi-

electrodo

Permite obtener una cartografía de la densidad de corriente debida a corrosión localizada.

Sus aplicaciones son limitadas al laboratorio.

18

En la Figura 8 se presenta un ejemplo de una celda electroquímica que hace a su vez la función de

bioreactor para el crecimiento microbiano en forma de biopelícula; los componentes de este sistema son:

a) un electrodo de trabajo, que consiste en el material de estudio sobre el que crece la biopelícula, b) un

contra electrodo o electrodo auxiliar, cuya función es permitir la conexión eléctrica al electrolito con el

fin de poder aplicar una corriente al electrodo de trabajo (dado que el proceso que ocurre sobre este

electrodo no es de importancia, suele emplearse un material inerte para evitar su disolución), c) un

electrodo de referencia, el cuál tiene un potencial de equilibrio estable y conocido y es utilizado para

medir el potencial contra otros electrodos, d) un electrolito, que se refiere a una sustancia que conduce la

corriente eléctrica, en la que se observa que las soluciones que lo componen se transforman químicamente

a consecuencia de ello, y e) la biopelícula, que afecta los procesos físicos, químicos y electroquímicos

que ocurren en el sistema [GABRIELLI C., 1998].

Figura 8. Representación teórica de una celda electroquímica en donde existe la presencia de una

biopelícula.

Los resultados obtenidos con técnicas electroquímicas en los últimos años, en casos donde se ven

implicados microorganismos, involucran principalmente estudios de potencial de corrosión, potencial a

circuito abierto (OCP), potencial redox, resistencia a la polarización (Rp), espectroscopía por impedancia

electroquímica y análisis de ruido electroquímico (ENA) [MANSFELD F. y col., 1990]; no obstante, los

conceptos electroquímicos utilizados para el análisis de los resultados obtenidos deben ser adaptados de

acuerdo con las características de la superficie acondicionada bióticamente. En las secciones siguientes

se explicarán los principios de dos de estas técnicas electroquímicas, OCP y EIS, debido a que son las

técnicas utilizadas en este trabajo.

19

I.2.2 .1.1 Potencial de Circuito Abierto

El potencial de circuito abierto (OCP) se mide mediante la diferencia de potencial entre el metal

de estudio (electrodo de trabajo) y un electrodo de referencia (electrodo estándar de calomel SCE,

electrodo estándar de hidrógeno SHE) inmersos en un electrolito (Figura 8).

La magnitud y el sentido del potencial medido dependen de la naturaleza del sustrato metálico,

de la composición química del electrolito, de la temperatura, de características hidrodinámicas del

sistema, de la naturaleza de los microorganismos presentes y del resto de los componentes o parámetros

que puedan incidir en el sistema [DOMÍNGUEZ B. X, 2007; ROSAS C. O., 2003].

Las mediciones de OCP pueden obtenerse experimentalmente mediante la utilización de un

circuito potenciométrico, un vólmetro de alta impedancia o un potenciostato. Esta técnica tiene como

ventaja la simplicidad para aplicarla, su utilización puede hacerse fuera del laboratorio y permite la

diferenciación entre un fenómeno de pasivación y un proceso de corrosión localizada.

Una de las desventajas de realizar mediciones de OCP es la posible sobre-interpretación de los

resultados, debido a que la técnica no proporciona información mecanística, por lo que se recomienda

utilizar técnicas alternativas en conjunto con esta para determinar la influencia catódica y anódica en un

proceso electroquímico (ya que en las mediciones de OCP las monitorean en conjunto) o bien un

mecanismo de corrosión [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Esta técnica se ha utilizado para monitorear la influencia de la corrosión por metabolitos sobre el

acero y la influencia de biocidas [KERESZTES Z. y col., 1998], la influencia de la corrosión por BSR

[BOOTH G. H., 19997], la influencia de biopelículas sobre aceros inoxidables en agua de mar [DEXTER

S. C., 1995] y la influencia de biopelículas de BSR sobre la corrosión del acero al carbón en agua de mar

artificial (Figura 9) [DOMÍNGUEZ B. y col., 2005], entre otros estudios.

20

Figura 9. Variaciones de OCP dependientes del tiempo influenciadas por Desulfovibrio capillatus y D.

gabonensis en cultivo mixto en agua de mar artificial [DOMÍNGUEZ y col., 2005].

I.2.2 .1.2 Espectroscopía por Impedancia Electroquímica

La impedancia de un sistema está definida por la relación entre la corriente y el voltaje (función

de transferencia), físicamente la impedancia es el análogo de una resistencia en corriente alterna. En

sistemas donde se estudia la corrosión y el efecto de biopelículas, habitualmente se utilizan pruebas

potenciostáticas, es decir a la entrada se aplica un barrido de potencial a diferentes frecuencias y como

respuesta se obtienen valores de corriente, para cada una de estas frecuencias.

Figura 10. Gráfica que representa una señal sinusoidal a partir de la cual se obtiene la impedancia, que es

la relación entre una señal de entrada (voltaje, E) y una señal de salida (corriente, I), las cuales están

desfasadas (por una ángulo de fase, φ).

21

La medición de la función de transferencia a diferentes frecuencias constituye un espectro de

impedancia, el cuál se obtiene experimentalmente al aplicar una mínima polarización alterna a la celda

electroquímica manteniendo un estado pseudo-estacionario, con el objeto de medir la respuesta cinética,

mecanística, de fenómenos de trasporte y de distribución de los fenómenos electroquímicos que ocurren

en un sistema [GAGRIELLI C., 1998; DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Esta técnica está basada en el análisis

de la respuesta en frecuencia del sistema electroquímico a una variación sinusoidal superpuesta a un

potencial continuo (Figura 8) o una corriente directa. A la entrada del sistema, para el caso de pruebas

potenciostáticas, se impone una perturbación sinusoidal en potencia E(t) de baja amplitud E0 (por

ejemplo, 10 miliVoltios), sobre el electrodo de trabajo, en un dominio de frecuencias (ω) entre los 10

mHz y 100MHz:

)sin()( 0 tEtE ω= (1)

ó

)(0)( ϕω +

=tj

eEwE (2)

La respuesta obtenida para cada frecuencia es una corriente sinusoidal I(t) de fase φ y de amplitud I0:

)sin()( 0 ϕω += tItI (3)

ó

)(0)( ϕωω +

=tj

eII (4)

Donde ω representa la pulsación (igual a 2πf, siendo f la frecuencia en Hz) y j el número

imaginario 1− . Las ecuaciones (2) y (4) son el equivalentes a (1) y (3), respectivamente, pero se

escriben en la forma de números complejos para simplificar los cálculos o dependiendo del análisis

requerido.

A partir de las ecuaciones anteriores, se construye la función de transferencia de la impedancia,

definida como la relación de la señal de entrada con respecto a la señal de salida, Z = E/I, que una vez

simplificada y separada en sus partes real (ReZ) e imaginaria (ImZ), puede representarse de la siguiente

forma:

)(Im)(Re)( ωωω ZjZZ += (5)

22

Al aplicar la señal sinusoidal de entrada (E) y obtener la señal sinusoidal de salida (I), éstas están

desfasadas por un ángulo de fase ϕ (Figura 10), debido a que la interfaz entre el metal y electrolito retarda

la señal de salida con respecto a la de entrada. Matemáticamente, el ángulo de fase se representa por la

relación:

Re

Imtan 1

Z

Z−=ϕ (7)

Y el módulo de la impedancia por:

( ) ( )22 ImRe ZZZ += (8)

A partir de estas ecuaciones, se obtienen 3 diagramas (Figura 11), que son los comúnmente

utilizados para el análisis de la respuesta en frecuencia de sistemas electroquímicos.

El Diagrama de Nyquist (Figura 11 a) se refiere a la gráfica de la parte real de la impedancia

contra el negativo de la parte imaginaria y describe la relación entre los diferentes componentes que están

presentes en el sistema electroquímico, ya que estos pueden tener un comportamiento análogo a uno

resistivo, cuya magnitud aumenta sobre el eje real de la impedancia, mientras que aquellos elementos que

tienen un comportamiento análogo a uno capacitivo se manifiestan en la componente imaginaria.

El diagrama del módulo de la impedancia (Figura 11b izquierda) permite identificar las

constantes de tiempo debidas al sistema de estudio. Esta variable representa la magnitud del vector

conformado por las partes real e imaginaria, conjuntas en una sola función, como un valor absoluto de la

variable compleja, como se muestra en la Figura 11a.

En el diagrama de ángulo de fase (Figura 9b, derecha) se puede observar el desfasamiento entre la

señal de entrada y la señal de salida. Físicamente, una forma de interpretar las variaciones del ángulo de

fase, se logra al comprender el hecho de que la energía aplicada al sistema debe ser almacenada

(analógicamente a un termino capacitivo) o disipada (términos resistivos). Si el sistema de estudio es

análogo a únicamente un capacitor la corriente se adelanta del potencial por π/2 radianes; es decir, la

diferencia potencial es de 90°; sin embargo, si el sistema de estudio es análogo a únicamente un resistor,

el ángulo de la fase es 0°.

23

Los sistemas biológicos verdaderos, a una frecuencia dada, se comportan como los resistores y

capacitores en serie o en paralelo, de modo que el ángulo de fase puede tomar valores entre 0° y 90°

[DAVEY C. L. y col., 1995].

(a)

(b)

Figura 11. Esquemas de los tres diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una

celda electroquímica. a) Diagrama de Nyquist o diagrama complejo y

b) Diagramas de Bode referentes al módulo de la Impedancia (izquierda) y al ángulo de fase (derecha)

[Reproducido de: DOMIGUEZ B. X., 2007].

El intervalo de frecuencias (105 a 10-4 Hz), que la técnica proporciona, ayuda a identificar los

elementos de la celda cuando la corriente se desfasa del voltaje; por ejemplo en altas frecuencias se puede

medir la resistencia de la solución, mientras que a bajas frecuencias se pueden identificar efectos

difusionales o fenómenos de adsorción y desorción interfacial [GABRIELLIC C., 1998; PADILLA V. A.

A., 2002; X., 2004].

24

Una particularidad de EIS es su capacidad para utilizarse en medios semiconductores o

conductores, donde las técnicas electroquímicas de corriente directa son limitadas debido a la caída

ohmica del medio, además de que la variable independiente se encuentra en el dominio del tiempo y no se

establece la velocidad de barrido, que es diferente para cada sistema (pinturas orgánicas, películas de

óxidos metálicos, inhibidores, biopelículas etc.) [GRAGRIELLIC., 1998; SCULLY J. R. y col., 1993].

Muchas de las películas biológicas que se adsorben sobre superficies metálicas expuestas a

medios acuosos son conductoras de electrones, por lo que el análisis de su formación e influencia

mediante EIS es potencialmente útil para determinar algunas de sus propiedades, como pueden ser su

espesor y su influencia en la corrosión, considerando que estas películas modifican la interfaz

electroquímica metal- electrolito [GRAGRIELLI C., 1998; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Una desventaja de esta técnica es que se requiere de instrumentación compleja y costosa. Así

mismo se requiere tener un buen conocimiento electroquímico para poder realizar la interpretación de los

resultados. Comúnmente, se realiza una modelación o interpretación de los resultados mediante el uso de

circuitos eléctricos equivalentes, que son difíciles de interpretar para sistemas en los que se estudian

biopelículas, debido a que son entidades dinámicas y al metabolismo microbiano, lo cual puede resultar

en una respuesta con fluctuaciones en periodos cortos y ataque localizado, que por medio de este análisis

no puede ser descrito [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

Los circuitos equivalentes simples son útiles para reproducir en forma global la respuesta de un

sistema electroquímico analizado con EIS; sin embargo, presentan algunos inconvenientes para la

interpretación y análisis cuando se trata de sistemas con gran heterogeneidad, además de proveer

información limitada.

Entre las desventajas del uso de los circuitos equivalentes, es que existe un número infinito de

combinaciones de elementos pasivos que pueden reproducir el mismo comportamiento, esta problemática

puede resolverse seleccionando aquel arreglo que permita una explicación física acorde con el sistema de

estudio [MACDONALD D. D., 1991; GALVAN M. R., 2004; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].

No obstante, los circuitos equivalentes simples no describen la distribución de corriente o

potencial en forma discretizada para cualquier sistema, lo cual es de especial importancia para el estudio

de sistemas porosos, fallas locales, sistemas macroscópicos e interfases con gran heterogeneidad

estructural como las biopelículas [MACDONALD D. D. y col., 1994; CASTANEDA H., 2001;

25

URQUIDI-MACDONALD M. y col. (1999); WARAKSA C. C. y col., 2003; DOMÍNGUEZ B. X, 2007;

DOMINGUEZ B. X., y col, 2007, DOMIGUEZ B. X., 2007].

El análisis de impedancia puede también interpretarse o modelarse mediante otros métodos

análogos a elementos eléctricos, como los modelos determinísticos de líneas de transmisión, modelos

mecanísticos de funciones de transferencia, modelos semiempíricos, modelos determinísticos modernos,

modelos estadísticos y modelos estocásticos [MACDONALD D. D., 1991; DOMÍNGUEZ B. X, 2007],

entre otros.

26

PARTE II

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN

27

II.1 Hipótesis En los sistemas de distribución de gasolina (gasolinoductos ) existen microorganismos que son capaces de

formar biopelículas complejas sobre el acero al carbón, debido a que en la gasolina existen compuestos

que estos seres vivos pueden utilizar como fuentes de carbono y energía. Estas comunidades microbianas

son altamente diversas, heterogéneas y pueden originar problemas como el bioesuciamiento y la

biocorrosión mediante complejas estrategias multicelulares.

28

II. 2 Alcances y justificación del proyecto

La caracterización de la flora microbiana anaerobia formadora de biopelículas asociada a

gasolinoductos tiene gran relevancia debido no solo a la influencia que esta puede tener en los procesos

de corrosión, como ya se ha descrito ampliamente en anteriores capítulos, sino también potencialmente en

procesos de bioremediación, ya que en estos sistemas la flora microbiana puede potencialmente crecer en

y degradar algunos de los compuestos presentes en la gasolina (BTX, TBA, y MTBE), los cuales son

nocivos para la salud humana, animal, vegetal y ambiental.

La caracterización bioquímica, y cinética de la flora microbiana anaerobia, materia de este

trabajo, puede aportar nuevos conocimientos sobre las interacciones de consorcios formados en ambientes

indocumentados, donde puedan degradar compuestos recalcitrantes para convertirlos a compuestos

orgánicos más simples o a CO2 mediante un proceso de mineralización, que además de afectar a los

procesos de corrosión cuando se encuentran en el interior de sistemas como los gasolinoductos, los hace

potencialmente aplicables a procesos de bioremediación de sitios contaminados con gasolina debido a la

adaptación sobrellevada por estas comunidades microbianas. Parámetros obtenidos de la caracterización

microbiana, bioquímica y cinética, como son la velocidad de degradación de los compuestos presentes en

el sistema, la capacidad de adherirse a superficies (y sus consecuencias), y las interacciones involucradas

en el desarrollo de biopelículas, pueden ser de gran utilidad para dar seguimiento a los procesos de

corrosión en los que influyen y a su control cuando se aplican productos antimicrobianos. Con los datos

presentados previamente en este documento queda clara la importancia y el impacto que tiene el estudio

de las biopelículas provenientes de la industria petrolera, y específicamente provenientes de

gasolinoductos.

Con base en lo anterior se realizó un estudio de las poblaciones microbianas de gasolinoductos

que tiene como principales alcances determinar parte de la diversidad microbiana, y su posible influencia

sobre la corrosión de dichos sistemas. Debido a que en la literatura pública y científica no se han

encontrado datos reportados sobre el crecimiento de biopelículas en gasolinoductos, por tal motivo se

llevaron a cabo aislamientos de muestras tomadas de material de arrastre de estos sistemas, y se realizó la

caracterización macroscópica y microscópica de parte de la flora microbiana anaerobia, así como su

caracterización cinética y bioquímica, y el monitoreo de la influencia electroquímica que la biopelículas

ejercen en los procesos de corrosión.

29

Esto permite aportar una contribución científica a la biotecnología ambiental que, al carecer de

esta información, se ve limitada en las medidas que puede tomar con respecto a estos problemas o a

potenciales aplicaciones de estos microorganismos. Por otra parte, en la mayoría de los estudios de

biopelículas en los que el análisis de EIS se realiza mediante circuitos eléctricos equivalentes, se ha

proporcionado una descripción poco sustancial a cerca de la influencia de estas estructuras biológicas y de

las reacciones electroquímicas asociadas a las mismas. En este trabajo se presenta un análisis sustancial

con circuitos eléctricos equivalentes, con el fin de de ampliar el conocimiento al respecto. Asimismo, no

ha sido extensivo el uso de líneas de transmisión para el análisis de EIS, por lo que en este trabajo se

desarrolla un modelo unidimensional al respecto, con el fin de permitir un análisis comparativo con los

resultados obtenidos al utilizar circuitos equivalentes.

Los resultados de este trabajo aportan conocimiento relevante para el estudio de comunidades

microbianas en biopelículas mediante la EIS. Se provee información que puede servir como apoyo en el

desarrollo de métodos para la detección temprana de biopelículas, que permitieran aplicar planes de

prevención y contención apropiados en aquellos sistemas en los que existan riesgos de afectación por

bioensuciamiento, biodeterioro o biocorrosión.

La investigación se presenta en dos etapas, cuyas actividades serán descritas posteriormente en

este documento. La etapa I comprendió el cultivo, aislamiento, y caracterización microbiológica, desde

las perspectivas macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética, de flora microbiana anaerobia. Para

ello, se utilizaron 13 muestras que fueron tomadas de material de arrastre de gasolinoductos y

resembradas en medio enriquecido, en el cuál crecieron los microorganismos a partir de los cuáles se

realizó el aislamiento anaerobio. Con los microorganismos aislados, se realizaron cultivos sustrato-

específicos con diferentes compuestos (benceno, tolueno, xileno, pentano, TBA, MTBE, lactato y

acetato), pruebas para la formación de biopelículas en la interfaz líquido-gas y pruebas de adhesión en la

interfaz sólido-líquido, cinéticas de degradación de benceno, tolueno y xileno y producción de CO2 (para

determinar el grado de mineralización con cultivos mixtos) y una caracterización bioquímica. Los

resultados obtenidos en la etapa I permiten determinar parte de la posible biocomplejidad microbiana,

además de algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes con gasolina.

Posteriormente, en la etapa II se llevó a cabo la caracterización electroquímica de sistemas abióticos y

bióticos, por medio de las técnicas de EIS y OCP. A partir de los datos obtenidos con estas mediciones se

realizó un análisis con circuitos eléctricos equivalentes. Con los datos obtenidos en esta etapa se realizó

un análisis de la influencia microbiana de algunas de las biopelículas obtenidas en la corrosión del acero

al carbón.

30

II. 3 Objetivos

Generales:

• Aislar y caracterizar flora microbiana anaerobia de gasolinoductos, desde las perspectivas

macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética.

• Estudiar la influencia bio-electroquímica de microorganismos anaerobios formadores de

biopelículas, sobre acero al carbón, utilizando la Espectroscopía por Impedancia Electroquímica.

• Determinar algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes con

gasolina.

Particulares:

• Aislar microorganismos anaerobios formadores de biopelículas crecidas a partir de muestras de

gasolinoductos.

• Realizar la caracterización microscópica, macroscópica (formación de biopelículas) y bioquímica

de parte de la flora microbiana anaerobia aislada.

• Realizar cultivos y cinéticas sustrato-específicas para determinar la utilización de compuestos

BTX, MTBE, TBA y pentano, por las bacterias anaerobias.

• Monitorear el la influencia de las biopelículas anaerobias aisladas y en consorcios utilizando la

espectroscopía por impedancia electroquímica y la medición del potencial a circuito abierto.

• Realizar el análisis de impedancia con circuitos para describir el la influencia electroquímica de

las biopelículas sobre acero al carbón.

31

II. 4 Estrategia Experimental

La estrategia experimental utilizada en este trabajo se muestra en la Figura 12, en donde de se

presenta un esquema con las actividades que se llevaron a cabo durante del proyecto de investigación. En

resumen, se realizó el aislamiento y la caracterización microscópica, macroscópica, cinética, bioquímica

y electroquímica de bacterias anaerobias formadoras de biopelículas a partir de muestras tomadas de

gasolinoductos, toda la metodología se llevó a cabo por duplicado, y se presentan como resultado el

promedio o unificación de las mismas.

Figura 12. Estrategia experimental del proyecto.

La estrategia experimental se presenta en dos etapas, cuyas actividades serán descritas

posteriormente. La etapa I comprendió el cultivo, aislamiento, y caracterización microbiológica, desde las

perspectivas macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética, de flora microbiana anaerobia.

ETAPA I

ETAPA II

32

Para ello, se utilizaron 13 muestras que fueron tomadas de material de arrastre de gasolinoductos

y resembradas en medio enriquecido, en el cuál crecieron los microorganismos a partir de los cuáles se

realizó el aislamiento anaerobio.

Con los microorganismos aislados, se realizaron cultivos sustrato-específicos con diferentes

compuestos (benceno, tolueno, xileno, pentano, TBA, MTBE, lactato y acetato), pruebas para la

formación de biopelículas en la interfaz líquido-gas y pruebas de adhesión en la interfaz sólido-líquido,

cinéticas de degradación de benceno, tolueno y xileno y producción de CO2 (para determinar el grado de

mineralización con cultivos mixtos) y una caracterización bioquímica.

Los resultados obtenidos en la etapa I permiten determinar parte de la posible biocomplejidad

microbiana, además de algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes

con gasolina.

Posteriormente, en la etapa II se llevó a cabo la caracterización electroquímica de sistemas

abióticos (medio de cultivo estéril) y bióticos (cultivos microbianos diversos), por medio de las técnicas

de EIS y OCP. A partir de los datos obtenidos con el monitoreo electroquímico se realizó un análisis con

circuitos eléctricos equivalentes para el análisis de impedancia. Con los datos obtenidos en esta etapa se

realizó un análisis de la influencia microbiana de algunas de las biopelículas obtenidas en la corrosión del

acero al carbón.

La experimentación de este trabajo se realizó principalmente en los Laboratorios de

Microbiología, Bioreactores, Biotecnología General, Biocatálisis y Electroquímica del Instituto Mexicano

del Petróleo, entre otras instalaciones del mismo. Para el estudio de biocomplejidad se colaboró con la M.

en C. Verónica Nava Ramírez y con el Estudiante de Ing. Biotecnológica Cristian Mata Rodríguez

(UPIBI), quienes realizaron estudios con la contraparte aerobia de este trabajo, de los cuáles no se

presentan los métodos experimentales ni los resultados específicos obtenidos de dicha contraparte.

II.5 Materiales y Métodos

Los procedimientos utilizados para cada una de las etapas expuestas en esta estrategia

experimental (Figura 12), se encuentran descritos en las siguientes secciones.

33

II.5.1 Procedimientos Microbiológicos

En esta sección se describirán aquellas técnicas que fueron utilizadas para aislar microorganismos

anaerobios a partir de muestras de gasolinoductos, realizar cultivos sustrato-específicos y cinéticas de

degradación de algunos de estos compuestos, realizar la caracterización microscópica y macroscópica

(formación de biopelículas y pruebas de adhesión) y realizar la caracterización bioquímica de parte de la

flora microbiana anaerobia aislada.

II.5.1.1 Obtención de Muestras

Para la elaboración de este trabajo, se obtuvieron 13 muestras distintas provenientes de ductos de

distribución de gasolina obtenidas a partir de los sedimentos y gasolina presentes en material de arrastre

extraído de los gasolinoductos mediante un diablo instrumentado. Las muestras fueron colocadas en

recipientes estériles y mantenidas en refrigeración a 4° C, hasta su uso. El origen de las muestras no se

hace explícito en este documento, debido a políticas de confidencialidad del donante.

II.5.1.2 Medios de Cultivo e Inóculos

Se utilizaron dos tipos de medio de cultivo con diferentes propósitos, que comprenden

principalmente el cultivo y aislamientos de microorganismos en un medio con suficientes nutrientes

(medio ENR), y la realización de pruebas de degradación de compuestos recalcitrantes de la gasolina

(medio MIN), entre otros compuestos. Dichos propósitos se especificaran en las secciones subsiguientes

del documento.

Medio ENR:

Medio basal enriquecido para los diferentes microorganismos anaerobios presentes en las

muestras obtenidas, cuya composición (por litro de agua destilada) es la siguiente: NH4Cl (1 g), K2HPO4

(0.3 g), KH2PO4 (0.3 g), MgCl2, 6H2O (0.2 g), NaCl (2 g), CaCl2, 2 H2O (0.1 g), extracto de levadura

Difco (1 g), triptona-peptona Difco (1 g), solución de oligoelmentos de Balch (10 mL), cisteína-HCl (0.4

g), NaHCO3 (0.02 g) y resazurina al 0.1% (1 mL), pH 7.2.

34

Para la preparación de este medio se añadieron los reactivos del medio en un matraz después de

ser pesados correctamente. Se añadió el agua destilada y se agitó hasta homogeneizar. Se ajustó el pH

del medio con NaOH 1M. El matraz se marcó a la altura del medio y se añadió un volumen extra de

aproximadamente 10% del volumen total. Se homogeneizó el medio. Se cubrió la boca del matraz que

contiene el medio con papel aluminio con un orificio de aproximadamente el diámetro de la manguera del

N2 con la que posteriormente se realizó un cambio de atmósfera. Se calentó cuidando que no se

derramara. El calentamiento del medio cesó al alcanzarse el nivel que tenia el medio antes de agregar el

10% extra de agua (la coloración del medio se tornó de rosa o azul al color del medio antes de agregar la

resazurina). Inmediatamente se hizo fluir una corriente de N2 puro dentro del medio, haciéndolo

burbujear hasta que bajó la temperatura. Se envasó el medio en porciones de 25 m bajo ambiente de N2

puro en frascos tipo Hungate o serológicos.

Figura 13. Preparación de medio de cultivo anaerobio. Una vez envasado el medio (en frascos tipo Hungate o serológicos) se introdujo a través del tapón

de goma una aguja conectada al gas por el cual se cambió la atmósfera (99.95% N2); una vez que el gas

fluía al recipiente se colocó otra aguja por la que éste pudiera fluir al exterior, evitando que se incremente

demasiado la presión en el frasco. Después de 30 s o 1 min se retiró la aguja con la que se introducía el

gas, la otra se retiró cuando la salida de gas había cesado. Posterior al cambio de atmósfera se esterilizó

el medio de cultivo a 15lb / 121 °C / 15 min. [DOMÍNGUEZ B. X., 2003].

Medio MIN:

El medio mínimo se utilizó, para el cultivo de microorganismos anaerobios degradadores de

compuestos específicos como: benceno, tolueno, xileno, MTBE, TBA, pentano, lactato y acetato, algunos

de ellos forman parte de la formulación de la gasolina. La composición de este medio (por litro de agua

destilada) es la siguiente: NH4Cl (0.75 g), K2HPO4 (1 g), KH2PO4 (2 g), CaCl2 (0.018 g), MgSO4 (0.5 g),

NaHCO3 (0.02 g), cisteína-HCl (0.4 g), resazurina al 0.1% (1 mL) y solución de elementos traza de Fortin

y Deshusses (1 mL).

35

El medio de cultivo se preparó en forma anaerobia (como se especifica en la preparación de

medio enriquecido). Los compuestos CaCl2 y MgSO4, se prepararon por separado en 125 mL cada uno y

se añadieron una vez que el medio estaba caliente para evitar la precipitación de los compuestos.

Posteriormente se expuso a flujo de nitrógeno, se vació en frascos serológicos y se esterilizó.

Posteriormente se adicionó 2µL de fuentes de sustrato específicas (benceno, tolueno, xileno, MTBE,

TBA, o pentano), o bien la cantidad necesaria para alcanzar una concentración de 20 mM de lactato o

acetato (a partir de soluciones estériles), por frasco con 20 mL de medio, según fuera la fuente de carbono

a utilizar para cada caso. Para añadir las fuentes de carbono (compuestos de la gasolina) al medio estéril,

se utilizó una jeringa de vidrio de 20 µL, la cual se enfrió previamente para evitar que los compuestos se

volatilizaran todo esto se realizó en una campana de flujo laminar.

Ambos medios fueron utilizados para realizar cultivos semilla a partir de las muestras de

gasolinoductos. En ambos casos se inocularon 2 mL de muestra en 20 mL de medio de cultivo sin fuente

de carbono y se incubaron a una temperatura de 30° C durante 48 horas.

II.5.1.3 Aislamiento de Bacterias Anaerobias

Se utilizaron tubos de ensaye de 16x150 en los cuales se añadió 0.05g de agar noble y 4.5 mL de

medio de cultivo líquido ENR (para este caso); los tubos se taparon con tapón de goma (butírica o

neopreno), y se esterilizaron por autoclave.

Figura 14. Técnica de tubo rodado donde se observan los pasos de la misma; a) Tubos con medio de

cultivo enriquecido y agar a 50° C. b) Inoculación de microorganismos en el tubo. c) Tubo inoculado en

girador mecánico. d) Tubo inoculado en girador mecánico, mientras este gira un hielo se pone en las

paredes del tubo para que el medio gelifique. d) Aspecto de un tubo rodado después del procedimiento

36

Posteriormente los tubos se incubaron a 50 ° C para prevenir la solidificación del medio de agar,

hasta el momento de su uso. Se inoculó 0.5 mL de la muestra, y se puso en un girador mecánico (especial

para la técnica de tubo rodado), se colocó hielo alrededor del tubo para que el agar gelificase formando

una película sobre de las paredes internas del tubo, donde posteriormente crecieron las colonias

embebidas en el agar, misma que fueron aisladas.

Las colonias de microorganismos embebidas en el agar fueron separadas en nuevos frascos

serológicos para favorecer la producción de biomasa de aquellas colonias probablemente puras. Para

favorecer esta biomasa se trabajó con cultivos tipo Hungate dentro de la cámara de anaerobiosis.

Se tomó el tubo donde había crecimiento de colonias aisladas y con pipetas Pasteur se tomaron las

colonias con la ayuda de una perilla de succión, posteriormente se depositaron en un frasco serológico.

Se incubaron a 30° C y se realizó tinción de Gram para observar si el cultivo estaba puro [HUNGATE, R.

E., 1950].

Figura 15. Esquema general de cómo se aísla una colonia tomada de un tubo rodado y se deposita en un

frasco serológico; a) Cámara de anaerobiosis. b) Fotografía de cómo se toma una colonia aislada de un

tubo rodado. c) La colonia tomada se deposita en un frasco serológico. d) Crecimiento de biopelícula de

una muestra aislada por este método, después de un periodo de incubación.

37

II.5.1.4 Caracterización en Microcopio Óptico

Se realizó la caracterización microscópica óptica, utilizando un microscopio Nikon E800, para

determinar la pureza de los cultivos sometidos a aislamiento y determinar la morfología microscópica de

bacterias puras aisladas. Las observaciones se realizaron utilizando el objetivo de inmersión en aceite

(100x).

II.5.1.4.1 Determinación de la Pureza de Cultivos

A los cultivos obtenidos después del aislamiento se les realizaron tinciones de Gram y

posteriormente se observaron al microscopio. Aquellas muestras que presentaron diversidad morfológica

y variación de Gram se sometieron a un segundo o tercer proceso de aislamiento por tubo rodado.

Los cultivos aparentemente puros, se resembraron por triplicado y secuencialmente en tiempo,

para verificar su mantenimiento en la morfología y ausencia de contaminación; a todos estos cultivos se

les realizaron también tinciones de Gram, comparando la ausencia de variación en las mismas, algunas de

aquellas bacterias que no variaron en la tinción de Gram y en la morfología se seleccionaron para realizar

pruebas de crecimiento de biopelículas, pruebas de adhesión y pruebas bioquímicas.

II.5.1.4.2 Determinación de la Morfología Microscópica

A los cultivos puros se les realizaron dos tipos de tinciones; la tinción de Gram y la tinción de

esporas. La tinción de Gram proporcionó datos a cerca de su morfología, como se expresa en la Tabla 2,

en tanto que la tinción de esporas, realizada con verde de malaquita, permitió saber si los cultivos puros

eran capaces de producirlas.

Tabla 2. Datos proporcionados por la tinción de Gram.

Tinción de Gram

Coloración Gram +, Gram - Morfología

Bacilos, cocos, diplococos, estreptococos, cocobacilos, fusiformes. Bacilos Rectos, o Curvos

Tamaño de los microorganismos. Presencia de polímeros asociados a las bacterias.

38

II.5.1.5 Caracterización Macroscópica

Se llevó a cabo el seguimiento visual de la formación de biopelículas en dos tipos de sistemas;

aquellas crecidas en la interfaz gas-electrolito (atmósfera de hidrógeno-medio de cultivo), y aquellas

crecidas en la interfaz sólido-líquido (pruebas de adhesión). Aquellas crecidas en la interfaz gas-

electrolito se derivan de la tendencia natural de las bacterias en un medio líquido a formar biopelícula en

un ambiente carente de movimiento, en tanto que las crecidas en la interfaz sólido líquido son

consecuencia de las interacciones que estas presentan en presencia de Acero al carbón SAE 1018, ambos

sistemas son descritos en los puntos posteriores.

II.5.1.5.1 Formación de biopelículas gas-electrolito

Por una parte, los cultivos de microorganismos en frascos serológicos, fueron observados

periódicamente, estos se llevaron a cabo en condiciones estacionarias (sin agitación o movimiento) y en

poca cantidad de medio de cultivo ENR o MIN (15 mL). Se observó periódicamente el desarrollo o

ausencia de biopelícula, y se llevó un control de los cultivos que fueron capaces de desarrollar formación

de biopelícula, cuya presencia se evidenció al observar una capa parecida a una mucosidad creciendo en

la interfaz gas-electrolito (entre la atmósfera y el medio de cultivo) o en algunos casos adherida al vidrio

por medio de una capa viscosa (transparente o colorida, de aspecto mucoide o sedimentaria).

II.5.1.5.2 Pruebas de Adhesión

Para el análisis de las biopelículas en la interfaz sólido-líquido se utilizaron muestras metálicas

rectangulares de acero al carbón SAE 1018 (composición: C 0.15-0.20 %, Mn 0.60 - 0.90 %, P 0.030 %,

S 0.035, acero de medio contenido de carbono para uso estructural) denominadas en este trabajo como

cupones de acero al carbón (Figura 16b), de 1 cm x 0.5 cm x 0.2 cm. esterilizadas bajo luz ultravioleta

(UV), durante 30 minutos (15 minutos por lado), las cuáles fueron introducidas en los frascos serológicos,

con medio MIN, medio ENR, o ENR suplementado con sustratos BTX o MTBE, dentro de una campana

de flujo laminar para evitar la contaminación del mismo. Esta introducción fue realizada rápidamente para

evitar la penetración de una cantidad de oxígeno considerable, cerciorando que el indicador de óxido-

reducción presente en el medio no tomara una coloración rosada para garantizar condiciones suficientes

de anaerobiosis para el crecimiento bacteriano.

39

a)

Figura 16. a) Acero al carbón SAE5 1018. b) Cupones cortados.

Se llevaron a cabo dos pruebas diferentes de adhesión: a) con las colonias aisladas y b) con

cultivos mixtos formados artificialmente, en algunos casos también se realizaron cultivos mixtos

artificiales con las bacterias derivadas de la colaboración con la contraparte aerobia de este trabajo. En

las listas siguientes se desglosan los sistemas de estudio, en los que se determinó cualitativamente el

crecimiento microbiano y la formación de biopelículas.

Los cultivos puros que se sembraron con muestras de acero al carbón se presentan a continuación,

en los que se determinó cualitativamente el crecimiento microbiano y la formación de biopelículas.

• 64-1 P2 • 92-1 • 89-P2 • 94-2 • 86-2 • 92-3 • 64-2 P1 • 87-1 • 96-2 • 63-P1 • 78-1 • 93-1 • 82-1 • 66 P2 • 92-2

Los cultivos mixtos formados artificialmente en los cuales se llevaron a cabo las pruebas de

adhesión se presentan en la siguiente lista:

� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio con Lactato, inóculo para consorcio de BTX,

� Cultivo Mixto de BTX sin sustrato, Anaerobios BTX + Anaerobios Lactato .

� Cultivo Mixto de BTX + sustrato, AnaerobioBTX+ Anaerobio Lactato,

� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio Lactato Imp. gas.

� Cultivo Mixto de BTX sin sustrato Anaerobio BTX+ Anaerobio Lactato.

� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio Lactato 18 de Sep. consorcio.

� Cultivo Mixto de BTX medio Aerobio + Anaerobio BTX.

� Cultivo Mixto de lactato M3,1,1, M1,2,1, M13,21.

� M3,1,1, Lactato, CMR, 15/09/06.

� M1,2,1 Lactato, 15/09/06 CMR.

� Cultivo Mixto de BTX Muchas M, M3,1,2 O-X, M3T’.

b)

40

En estas pruebas se evaluó el grado de bioensuciamiento por turbidez y formación de biopelícula,

después de dos semanas de crecimiento en estos sistmas a 30° C, y de estas mismas muestras se tomaron

algunos de los cupones presentes en los cultivos y se realizó un análisis superficial.

II.5.1.5.2.1 Análisis superficial

Para el análisis superficial del acero al carbón SAE 1018, expuesto al sistema con biopelículas y

al medio de cultivo estéril sin inocular, respectivamente, se utilizaron la microscopia electrónica de

barrido ambiental (ESEM) y análisis químico por espectroscopía por dispersión de energía (EDS).

Después de dos semanas de exposición al medio de cultivo estéril o al medio con los cultivos

puros o cultivos mixtos microbianos, las muestras metálicas fueron extraídas con pinzas metálicas

estériles y puestas inmediatamente en el microscopio, sin recibir ningún otro tipo de tratamiento. Se

utilizó un detector de electrones secundarios (GSE) en el modo ambiental (bajo vacío), con un spot de 5.0,

Acc V de 30.0 kV y a una presión de 3.6 Torr.

II.5.1.6 Caracterización Cinética a partir de cultivos con sustratos

específicos

Se realizaron algunas cinéticas microbianas para determinar la posibilidad de mineralización, que

se refiere a la degradación de algunos compuestos de la gasolina (compuestos BTX) hasta compuestos

orgánicos (CO2). Las cinéticas realizadas se llevaron a cabo a partir de cultivos con sustratos específicos,

estos cultivos son descritos a continuación.

II.5.1.6.1 Cultivos con sustratos específicos

Se preparó una serie de 104 frascos serológicos con medio MIN adicionado una de las siguientes

fuentes de carbono específicas: benceno, tolueno, xileno (BTX), MTBE (MTBE; por sus siglas en inglés

methyl tert-butyl ether), TBA (TBA; por sus siglas en inglés tert-butyl alcohol), lactato, acetato o

pentano, que se inocularon con 3 ml de los cultivos semilla en medio MIN, de cada muestra de

gasolinoductos. La matriz experimental de los 104 cultivos realizados se muestra a continuación en la

Tabla 3.

41

Tabla 3. Matriz experimental para los cultivos sustrato-específicos.

Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13

Benceno � � � � � � � � � � � � � Tolueno � � � � � � � � � � � � � Xileno � � � � � � � � � � � � � TBA � � � � � � � � � � � � �

MTBE � � � � � � � � � � � � � Pentano � � � � � � � � � � � � � Lactato � � � � � � � � � � � � � Acetato � � � � � � � � � � � � �

Posterior a su crecimiento a 30° C, se seleccionaron aquellos cultivos cuyo crecimiento

microbiano tuvo mayor cantidad de biomasa. A partir de estos, se realizaron las cinéticas para cuantificar

la degradación de benceno, tolueno y xileno, y la producción de CO2. Los cultivos seleccionados se

muestran en la tabla 4 (todos se hicieron por duplicado).

Tabla 4. Matriz Experimental de los cultivos utilizados para realizar las cinéticas microbianas.

Muestras Benceno Tolueno Xileno Pentano

M1 � � M6 � � M7 � M8 � M9 � M10 �

La selección cuantitativa se basó en la concentración de biomasa de las muestras, la cual fue

determinada por el método de cuantificación de proteína.

II.5.1.6.2 Cinéticas de Producción de CO2 y Degradación de Compuestos

BTX

El seguimiento de las cinéticas de degradación de compuestos BTX se llevó a cabo en un

cromatógrafo de gases marca Agilent. 0.1 ml de la fase gaseosa fueron inyectados al equipo, en el cual se

mide la disminución en el área del pico estándar de cada compuesto. Mientras que la producción de CO2

fue cuantificada por análisis del espacio libre usando un cromatógrafo de gases Gow Mac, con un detector

de ionización de flama, en el cual se sensan los incrementos del área del pico, y se interpolan con los

valores de una curva tipo pre-estandarizada de concentraciones conocidas de CO2.

42

II.5.1.7 Caracterización Bioquímica

Para la caracterización bioquímica se utilizó la tira de reactivos API 20 A para la identificación de

bacterias anaerobias. Cada tira reactiva consiste en una serie de 20 pruebas de identificación bioquímica,

como se muestra en la Figura 17. De manera general, se inocularon viales con medio de cultivo (que la

tira de reactivos API 20A proporciona), hasta alcanzar una concentración de 3 a 4 McFarland, y se

inocularon los pozos de la galería con pipetas Pasteur estériles, evitando la formación de burbujas, para el

prueba GEL (ver Tabla 5), se llenó el tubo y la cúpula, y para el la prueba de IND se llenó la cúpula con

aceite de parafina. Previo a esto la base de la tira se llenó con 5 mL de agua destilada, para mantener

hidratada la muestra al momento de la incubación (24-48horas, a 34 o 38 C).

El revelado de las pruebas bioquímicas se llevó a cabo con púrpura de bromocresol para todos los

microtubos que contenían carbohidratos (GLU, MAN, LAC, SAC, MAL, SAL, XYL, ARA, GLY, CEL,

MNE, MLZ, RAF, SOR, RHA, TRE). Una coloración amarilla o verde-amarillenta indicó una reacción

positiva, para la prueba IND, se agregó una gota de xileno, se mezcló y esperó de 2-3 minutos., y se

agregó una gota del reactivo EHR. Un color rojo indica una reacción positiva, y en la prueba CAT, la

producción de catalasa se hace evidente después de exponer la galería al aire libre durante 30 minutos y

agregar dos gotas de H2O2 al 3% en un pozo positivo. La aparición de burbujas indica una reacción

positiva.

Figura 17. Representación gráfica de la tira de reactivos API20A, la cual comprende 20 pruebas

bioquímicas en la tira, y cuatro pruebas externas.

Para la lectura de estas pruebas se utilizó la base de datos APIWeb de Biomerieux y el Manual

Bergey de Bacteriología. Las pruebas realizadas se muestran en la Tabla 5, así como sus reacciones

básicas, componentes activos, y una manera sencilla de la interpretación de resultados. Los resultados de

las pruebas bioquímicas se presentan en la sección III.1.2.1.

43

Tabla 5. Pruebas bioquímicas que integran la tira API20A

Prueba

Componentes

Activos

Reacciones

Enzimáticas

Resultados

Negativo Positivo

IND L-triptofano Formación de Indol Amarillo Rojo

URE Urea Ureasa Amarillo Rojo

GLU D-Glucosa Acidificación (Glucosa) Púrpura Verde

MAN D-Manitol Acidificación (Manitol) Púrpura Verde

LAC D-Lactosa Acidificación (Lactosa) Púrpura Verde

SAC D-Sacarosa Acidificación (Sacarosa) Púrpura Verde

MAL D-Maltosa Acidificación (Maltosa) Púrpura Verde

XYL D-Xilosa Acidificación (Xilosa) Púrpura Verde

ARA L-Arabinosa Acidificación (Arabinosa) Púrpura Verde

GEL Gelatina Hidrólisis (Proteasa) (Gelatina) Sin difusión Difusión

ESC Esculina Hidrólisis (ß-glucosidasa) (Esculina) Amarillo Marrón-Negro

GLY Glicerol Acidificación (Glicerol) Púrpura Verde

CEL D-Celobiosa Acidificación (Celobiosa) Púrpura Verde

MNE D-Manosa Acidificación (Manosa) Púrpura Verde

MLZ D-Melicitosa Acidificación (Melicitosa) Púrpura Verde

RAF D-Rafinosa Acidificación (Rafinosa) Púrpura Verde

SOR D-Sorbitol Acidificación (Sorbitol) Púrpura Verde

RHA L-Rhamnosa Acidificación (Rhamnosa) Púrpura Verde

TRE D-Trehalosa Acidificación (Trehalosa) Púrpura Verde

CAT H2O2 Catalasa Presencia de

Burbujas

Ausencia de

Burbujas

SPOR ---- Esporas Ausencia Presencia

GRAM ---- Coloración de Gram Rosa Violeta

COCC ---- Morfología Bacilo Coco

44

II.5.2 Procedimientos Electroquímicos

Las mediciones electroquímicas se llevaron a cabo utilizando dos equipos: un potenciostato y un

analizador de frecuencias Solartron conectados a una computadora, la cual tiene los siguientes programas

computacionales: a) CorrWare, en el que se determina la matriz de experimentos electroquímicos a

realizar en forma consecutiva, b) CorrView, que permite visualizar las mediciones de OCP, y c) Zview

que permite presentar en forma gráfica y analizar con circuitos equivalentes las mediciones que se

realizan del monitoreo de impedancia electroquímica. Para la colección de datos electroquímicos se

utilizó el sistema que se muestra en la Figura 18.

Figura 18. Ilustración de conexiones entre la celda y el equipo de medición [Modificado de:

DOMINGUEZ BENETTON, 2007].

Se verificó el buen funcionamiento del equipo calibrado utilizando una dummy cell, que consiste

en un circuito capacitivo y resistivo del cual se conocen los valores que deben de registrarse dentro del

programa ZView.

45

En un sistema similar al mostrado en la Figura 13, se conectó la celda electroquímica eligiendo en

el programa CorrWare los tipos de mediciones a realizar (en este caso OCP y EIS), y se asignaron los

valores de los parámetros de trabajo, de acuerdo con lo que se presenta en las secciones siguientes. En la

Figura 19 se presenta una fotografía del equipo de medición y la celda electroquímica utilizados.

Figura 19. a) Equipo de medición (potenciostato y FRA) y b) celda electroquímica.

II.5.2.1 Celdas Electroquímicas

La celda electroquímica utilizada para la experimentación es una celda de dos electrodos (Figura

19a). La celda consiste en un compartimiento de vidrio en el cual están inmersos los electrodos, cuyas

caras de exposición están completamente cubiertas por electrolito al realizar las mediciones. El electrodo

de trabajo, consiste en una pieza circular de acero al carbón SAE 1018 con 28.27 cm2 de superficie

expuesta, y el contraelectrodo consiste en una pieza circular de platino/oro (95%/5%) con 28.27 cm2 de

superficie expuesta.

II.5.2.2 Potencial de Circuito Abierto

Las mediciones de OCP se llevaron a cabo como una secuencia de experimentos en función del

tiempo, por duplicado, tanto para un sistema en condiciones abióticas (medio de cultivo estéril) como

para diversos cultivos microbianos (Tabla 6), cada medición se llevó a cabo por duplicado. El tiempo de

adquisición para las mediciones de OCP fue de 1 punto/segundo en periodos aleatorios de 20 minutos,

distribuidos durante el tiempo total de experimentación para cada celda de estudio que se seleccionaron

para el análisis (1249 horas).

46

II.5.2.3 Impedancia

Las mediciones de impedancia se llevaron a cabo como una secuencia de experimentos en

función del tiempo, para el sistema abiótico y diferentes sistemas bióticos, por duplicado. Se utilizó un

potenciostato acoplado con un analizador de la respuesta en frecuencia (FRA) Solartron. Las mediciones

de EIS se realizaron alrededor de los valores de OCP; la amplitud de la onda sinusoidal utilizada fue de

10 mV, el intervalo de frecuencias de 10 kHz a 10 mHz, con 5 puntos por década logarítmica.

Para efectos de análisis de resultados se trabajó con solo dos sistemas; el sistema abiótico, el cual

contenía medio de cultivo ENR estéril, y el medio biótico el cual contenía medio de cultivo MEFALTA

LO Q CONTENIA EL SISTEMA 17 SAND.

II.5.2.4 Circuitos equivalentes

El ajuste de datos se llevó a cabo utilizando el programa Zview en donde los datos fueron

ajustados a dos circuitos equivalentes, los cuales se mostrarán posteriormente en la sección de resultados.

Para el sistema abiótico se realizó un ajuste de datos con un circuito equivalente que consta de dos

resistencias; R1, R2, y un CPE (Constant Phase Element), denominado como elemento de fase constante.

En tanto que en el sistema biótico, se ajustó con otro sistema que comprende de 3 resistencias y 2

elementos de fase constante.

Después del ajuste de datos se llevó a cabo un análisis de sensibilidad, por medio de

ssimulaciones mediante las cuales se buscó observar los cambios en los resultados obtenidos con base en

variaciones de sus principales parámetros los de los circuitos equivalentes para cada tiempo, con el fin de

complementar el análisis de resultados al observar dichas variaciones al graficarpara y evaluar el efecto

de cada parámetro sobre el resultado original

47

PARTE III.

RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

48

III. Resultados

En la primera sección, llamada “Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares Microbianas en

Gasolinoductos” se presentan los resultados, análisis y discusión derivados de la caracterización

microbiológica, la cual comprende los resultados de los aislamientos a partir de las muestras del material

de arrastre de gasolinoductos, su caracterización bioquímica, macro y microscópica, además de los

resultados cinéticos y de adhesión con los diversos cultivos mixtos artificiales.

La segunda sección, llamada “Bioelectroquímica de Biopelículas”, presenta los resultados,

análisis y discusión derivados de la caracterización electroquímica con OCP y EIS, en ella se describen

los datos obtenidos a partir de un modelo con circuitos eléctricos equivalentes para la simulación de los

resultados de impedancia; al final de esta sección se determina el rol de algunas de las biopelículas

microbianas estudiadas en la corrosión del acero al carbón y su relación con las estrategias multicelulares

y la biocomplejidad determinadas en la sección de “Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares

Microbianas en Gasolinoductos”.

III. 1 Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares

Microbianas en Gasolinoductos

Dentro de esta sección se describirán los resultados obtenidos de los aislamientos y de la

caracterización de flora microbiana anaerobia, desde las perspectivas macroscópica, microscópica y

bioquímica, así como la caracterización macroscópica y cinética de cultivos mixtos artificiales. La

caracterización microscópica para los microorganismos aislados comprende los resultados del uso de

microscopía óptica para la observación de la morfología microbiana, su de tinción Gram y esporas. La

caracterización macroscópica se presenta separada para los cultivos puros y los cultivos mixtos

artificiales, la cual consistió en la determinación cualitativa de la formación de biopelículas en dos tipos

de interfases: a) líquido-gas (medio de cultivo con una fase gaseosa de nitrógeno) y b) adhesión sólido-

líquido (acero al carbón con medio de cultivo). Para las prueba de adhesión sólido-líquido se presenta un

análisis superficial por ESEM y EDS.

49

La caracterización bioquímica se presenta para los microorganismos aislados, y la caracterización

cinética de degradación de compuestos BTX y producción de CO2 para los cultivos mixtos provenientes

de los cultivos con sustratos específicos.

III.1.1 Resultados de los Cultivos Semilla

A continuación se muestran los resultados obtenidos al realizar cultivos directamente de las

muestras de gasolinoductos, a partir de los cuales se desarrolló el resto de la experimentación para esta

tesis.

III.1.1.1. Cultivos semilla en medio de enriquecimiento ENR

Previo al trabajo de esta tesis se habían realizado cultivos, a partir de las muestras de

gasolinoductos, con el medio de cultivo ENR utilizando diferentes aceptores de electrones, a partir de los

cuáles se seleccionaron para el trabajo posterior y el aislamiento aquellos cultivos que presentaron mayor

crecimiento (determinado por la turbidez), provenientes de las muestras identificadas como M1, M3, M5,

M7, M8, M9 y M11, las cuales provienen de 7 de los 13 de los diferentes gasolinoductos. De los cultivos

restantes, que no se trabajaron para esta tesis, no se conoce la diversidad biológica ni el resto de los

parámetros presentados en este trabajo. Para los cultivos sustrato-específicos si se trabajó con las 13

muestras, debido a que se tenía un menor número de resultados con crecimiento que en el medio ENR.

En secciones posteriores se mostrarán los resultados de aquellos microorganismos aislados a partir de

estos cultivos.

III.1.1.2. Cultivos semilla en medio MIN con sustratos específicos

104 cultivos se llevaron a cabo utilizando diferentes sustratos (benceno, tolueno, xileno, TBA,

MTBE, pentano, lactato y acetato), para las 13 muestras con 8 sustratos. Dichos cultivos se pasaron a una

segunda resiembra para garantizar la ausencia de restos de gasolina que los microorganismos pudieran

estar utilizando para su crecimiento y que sólo tuvieran el sustrato específico adicionado como única

fuente de carbono y energía. Los resultados de este crecimiento se muestran en la Tabla 7, en donde se

observa que en sólo 33 no hubo crecimiento, mientras que en 71 cultivos los microorganismos fueron

capaces de utilizar los sustratos específicos como única fuente de carbono y energía.

50

Tabla 6. Crecimiento microbiano en fuentes específicas de carbono.

Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12

Benceno + + + + + + + ----- + + ----- +

Tolueno + + + + + ----- ----- ----- + + + +

Xileno + ----- + + + + + + ----- + + +

TBA + + + + + + + ----- + + + +

MTBE + + + + + ----- + ----- + + + +

Pentano + ----- + + + ----- + ----- ----- + + +

Lactato + + + ----- ----- ----- + + ----- ----- ----- -----

Acetato + + + + ----- ----- + + ----- + ----- +

A partir de los dos tipos de cultivos positivos presentados en las secciones II.1.1.1 y II.1.1.2 es

que se realizaron los aislamientos y el resto de los estudios para esta tesis.

III.1.2 Resultados de los Aislamientos Mediante Tubo Rodado

A los cultivos semilla que se obtuvieron (presentados en la sección II.1.1) se les realizó la técnica

de tubo rodado, a partir de lo cuál se aislaron algunas de las colonias obtenidas hasta comprobar su

purificación después de revisar la morfología microscópica constante en 3 subcultivos.

De los cultivos semilla con medio ENR se obtuvieron 142 cultivos con la técnica de tubo rodado,

a partir de los cuáles se aislaron y caracterizaron (por los métodos mencionados previamente) 21

bacterias; mientras que de los cultivos con medio MIN y sustratos específicos se tomaron 8 cultivos por

duplicado (de los que presentaron mayor concentración de biomasa de la Tabla 7, esto se evaluó por el

método de cuantificación de proteína) que se sometieron a la técnica de tubo rodado, a partir de los cuáles

se aislaron y caracterizaron 7 bacterias. En las secciones subsiguientes se presentan los resultados de la

caracterización de dichas bacterias aisladas.

III.1.2.1 Resultados con Microorganismos Puros

En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos con los microorganismos puros

obtenidos a partir de gasolinoductos. Se presenta su caracterización microscópica (Gram + ó -,

morfología microscópica, presencia de polímero asociado), macroscópica (formación de biopelícula) y

bioquímica, en donde �, indica una prueba positiva, y � una negativa.

51

Tabla 7. Resultados de la caracterización de la cepa 63-P1 aislada a partir de los cultivos semilla de la

muestra 2M8, 10-4 en medio ENR.

Caracterización Microscópica ↓

Morfología y tamaño → Bacilos, 1µm Presencia de Polímero → �

Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �

Caracterización Macroscópica ↓

Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de

estudio Turbidez

Producción de

pp negro

Bioensuciamiento

Vidrio Metal Interfaz

L-G

Formación de biopelícula líquido-gas →

� �� N/A N/A N/A N/A

Formación de biopelícula líquido-sólido →

� ��

Caracterización bioquímica ↓

Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + - - Donde N/A: No aplica y L-G: Líquido Gas,

Tabla 8. Resultados de la caracterización de la cepa 64-2 P1 aislada a partir de los cultivos semilla de la

muestra 4M3 10-4 D1,2 en medio ENR.


Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

pp negro

Bioensuciamiento


L-G


� � N/A N/A N/A N/A


� ��


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - - -

52

Tabla 9. Resultados de la caracterización de la cepa 64-1 P2 aislada a partir de los cultivos semilla de la







estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� ��


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → + - + + - - + - + + - + + + + + + + + + - + - -

Tabla 10. Resultados de la caracterización de la cepa 68-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la

muestra 3 M1D210-1 en medio ENR.


Morfología y tamaño → Cocos, 1 µm Presencia de Polímero → �

Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �



estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G


� �� N/A* N/A N/A N/A


N/R+ N/R N/R N/R N/R N/R


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - + + * N/A: No aplica, +N/R: No reportado.

53




Morfología y tamaño → Cocos, 1µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G


� �� N/A � N/A �


N/R N/R N/R N/R N/R N/R


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + - - - - + + + + + + + + - + + +








estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G


� � N/A � N/A �


� ��


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + - -

54


muestra 3M8 D210-4 en medio ENR.


Morfología y tamaño → Cocos, 0.1 µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� ��


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +

Tabla 14. Resultados de la caracterización de la cepa 74 -2 aislada a partir de los cultivos semilla de la







estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G






Pruebas →

IND

U

RE

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -

55


muestra 1M1 10-4 D1, 2 en medio ENR.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� � � � � �


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +


muestra 1M710-3 D1, 2 en medio ENR.


Morfología y tamaño → Bacilos, 1 µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G






Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -

56




Morfología y tamaño → Bacilos, 1 µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G






Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -


muestra 1M8 D2 10-3 en medio ENR.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G


�� N/A N/A N/A N/A


� ��


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + -

57




Morfología y tamaño → Bacilos, .0.3 µm Presencia de Polímero → �




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




��


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

G

RA

M

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - - -


muestra 4M1 D 10-1 en medio ENR.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� � � � � �


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -

58




Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → N/R




estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G


N/R N/R N/A N/A N/A N/A




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - + - -

Tabla 22. Resultados de la caracterización de la cepa 89-P2 aislada a partir de los cultivos semilla de la

muestra 6M3D110-4 en medio ENR.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� � ��


Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → + - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - - - +

59


muestra 8M8 10-4 Rep en medio ENR.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




��


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

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Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + - - + - - - - - - - - - + + -








estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




� ��


Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + - - - - - - - - + + + + + + + + - + - +

60

Tabla 25. Resultados de la caracterización de la cepa 135 aislada a partir de los cultivos semilla de la







estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G






Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +

Tabla 26. Resultados de la caracterización de la cepa 137 aislada a partir de los cultivos semilla de la







estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G






Pruebas → IN

D

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +

61

Tabla 27. Resultados de la caracterización de la cepa SEB10 aislada a partir de los cultivos con sustratos

específicos, muestra PM1 10-4 1 en medio MIN con pentano como sustrato específico.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -


específicos, muestra TBAM3 10-51 en medio MIN con TBA como sustrato específico.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + + - + + + + + + + + - - -

62


específicos, muestra PM1 10-3 2en medio MIN con pentano como sustrato específico.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -

Tabla 30. Resultados de la caracterización de la cepa SEB6 a partir de los cultivos con sustratos

específicos, muestra TBAM3 10-52en medio MIN con TBA como sustrato específico.






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -

63

Tabla 31. Resultados de la caracterización de la cepa SEB1 a partir de los cultivos con sustratos

específicos, muestra TBAM3 10-3 en medio MIN con TBA como sustrato específico






estudio Turbidez

Producción de

precipitado negro

Bioensuciamiento


L-G




Pruebas →

IND

UR

E

GL

U

MA

N

LA

C

SA

C

MA

L

SA

L

XY

L

AR

A

GE

L

ES

C

GL

Y

CE

L

MN

E

ML

Z

RA

F

SO

R

RH

A

TR

E

CA

T

SP

OR

GR

AM

CO

CC

Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -

64

III.1.2.2 Resumen de Microorganismos Puros

En general en la caracterización microscópica se encontró gran diversidad de microorganismos

aislados, se observa que gran parte de los cultivos puros provienen de la muestra M1, y que el 46.4% de

las estructuras observadas son bacilos gram -, seguidos de bacilos y cocos gram + los cuales representan

un 21.4%, y 25% respectivamente, y solo el 7.2% presentan morfología de cocos gram -. La gran mayoría

forma esporas, sobre todo aquellas que se fueron aisladas a partir de cultivos con sustratos específicos.

Tabla 32. Resultados de morfología macroscópica y microscópica.

Nombre Origen de la Muestra

Cocos o Bacilos

Gram Tamaño (µµµµm)

Esporas Biopelícula L-G

Medio

63 P1 2M8, 10-4 Bacilos - 1 + + ENR

64-2 P1 4M3 10-4 D1,2 Bacilos - 0.5 - N/R ENR

64-1 P2 4M3 10-4 D1,2 Bacilos - 0.3 + N/R ENR

68-1 3 M1D210-1 Cocos + 1 - + ENR

68-2 3M1 10-1 D1,2 Cocos + 1 + + ENR

69-1 3M1 10-2 D1,2 Bacilos - 0.5 + + ENR

69-2 3M1 10-2 D1,2 Bacilos + 0.5 - + ENR

71-2 3M8 D210-4 Cocos + 0.1 + + ENR

74-2 3M1 10-2 D1,2 Bacilos - 0.5 + - ENR

78-1 1M1 10-4 D1, 2 Cocos + 0.2 + - ENR

80-1 1M710-3 D1, 2 Bacilos - 1 + + ENR

80-2 1M710-3 D1, 2 Bacilos + 1 + + ENR

82-1 1M8 D2 10-3 Bacilos + 1.5 + + ENR

86-2 1M7 D2 10-4 Bacilos - 0.3 - + ENR

87-1 4M1 D 10-1 Cocos + 0.2 - - ENR

88-2 1M710-3 D1, 2 Bacilos - 0.5 + N/R ENR

89P2 6M3D110-4 Cocos - 0.1 + - ENR

93-1 8M8 10-4 Rep Bacilos + 0.7 + + ENR

94-2 3M3 D2 10-4 Cocos - 0.1 + + ENR 135 4M1 D 10-1 Cocos + 0.2 + - ENR

137 4M1 D 10 Cocos + 0.1 + - ENR

SEB10 PM1 10-4 1 Bacilos - 0.5 + - MIN

SEB8 PM1 10-3 1 Bacilos + 0.5 + + MIN

SEB5 TBAM3 10-51 Bacilos - 0.5 + - MIN

SEB9 PM1 10-3 2 Bacilos - 0.3 + + MIN

SEB1 TBAM3 10-3 Bacilos - 0.3 + - MIN

SEB2 TBAM3 10-41 Bacilos + 0.5 + - MIN SE19-2 BM8C 10-21 Bacilos - N/R + + MIN

SE19-1 BM8C 10-22 Bacilos + N/R + - MIN

SE22-1 TM6C 10-11 Cocos - N/R N/R - MIN

SEB6 TBAM3 10-52 Bacilos - 0.3 + + MIN

65

La diversidad biológica encontrada y descrita a partir de la microscopía óptica, así como la

presencia de biopelícula y el medio en el cual crecieron las bacterias se resume en la Tabla 33, en donde

de manera general se muestran las morfología de las bacterias entre otras de sus características. Las

bacterias a las cuales se les ha denominado como SEB provienen de los aislamientos realizados a los

cultivos con sustratos específicos, en tanto que las primeras 21 bacterias descritas en la tabla anterior

corresponden a los aislamientos en medio ENR, en la misma tabla se observa el origen de la bacteria

aislada a partir de alguna de las 13 muestras tomadas de gasolinoductos (M”X”), en donde se indica el

número del subcultivo y la dilución (D).

En los resultados obtenidos a partir de la caracterización macroscópica se encontró que el 60 % de

los microorganismos puros fueron capaces de desarrollar biopelícula en la interfaz gas electrolito, lo cual

se evidenció como una capa viscosa creciendo entre el medio de cultivo y la atmósfera de nitrógeno

existente en el frasco serológico, en la Figura 20 se alcanza a apreciar la formación de una biopelícula

creciendo en la interfaz líquido gas.

Figura 20. Fotografía de biopelículas creciendo en la interfaz líquido-gas, se observa una capa mucoide

creciendo entre el medio de cultivo, y la atmósfera de nitrógeno.

En tanto que, en los cultivos puros a los cuales se les realizó pruebas de adhesión con acero al

carbón, se encontró que el 93% de los microorganismos anaerobios desarrollaron una biopelícula con

mucosidad densa adherida al cupón de acero al carbón, la placa metálica se vio cubierta de precipitado de

productos de corrosión de Fe, adquiriendo, en la mayoría de los casos, un color negro, el 53% de los

cultivos presentaron precipitación estos productos, y muchos de estos fueron capaces de incluso adherir el

cupón al vidrio.

Las pruebas de adhesión solo fueron realizadas para algunos de los microorganismos puros

aislados a partir de los subcultivos en medio enriquecido, y no así para los microorganismos aislados de

cultivos con sustratos específicos.

66

Los microorganismos aislados a los cuales se les realizaron las pruebas de adhesión y sus

resultados se muestran de manera más explícita en la Tabla 34, cabe destacar que la mayoría de estas no

presentaba aspecto de bioensuciamiento masivo.

Tabla 33. Pruebas de adhesión realizadas a cultivos posiblemente puros.

Muestra Adherencia Turbidez Producción de Fe

(color negro) Biopelícula

Vidrio Biofouling 63-P1 + +++ + + ~

64-1 P2 + ++ ++ + ~ 64-2 P1 ++ ++ +++ +++ M

66P2 ++ +++ +++ +++ ~ 78-1 + + + - ~ 82-1 + + + + ~ 86-2 ++ + + - ~ 87-1 + + + - ~

89-P2 ++ ++ ++ - ~ 92-1 +++ +++++ +++++ + M 92-2 +++ +++ +++ + ~ 92-3 ++ ++++ ++++ +++ ~ 93-1 +++ +++ ++++ +++ M 94-2 + ++ + + ~ 96-2 +++ +++ +++ +++ +

M y “~” se refieren a la apariencia de bioensuciamiento en el medio y no así en toda la placa, y a la débil apariencia de

bioensuciamiento, respectivamente. Biofouling, se refiere a bioensuciamiento.

En la caracterización bioquímica, la mayoría de los cultivos presentaron resultados

completamente distintos, de los 28 aislados, 4 de ellos están repetidos y los resultados se presentan en la

Tabla 34.

Tabla 34. Cepas con los mismos resultados en las pruebas bioquímicas y morfología microscópica.

Cepas con los mismos resultados Pruebas Bioquímicas Morfología Microscópica 68-1, 87-1 � � 74-2, 80-1 � � 78-1, 135 � �

72-1, 137 � �

Estos resultados nos hablan de una gran diversidad microbiana en el sistema de estudio, ya que se

aislaron tan solo 28 bacterias de los 142 cultivos, y solo 4 de estas están posiblemente repetidas, dando un

total de 24 bacterias con diferentes resultados. De acuerdo con la literatura, solo el 1% de los

microorganismos son cultivables en el laboratorio, por lo que se estima que toda esta diversidad es menor

al 1% de la que potencialmente existe en los gasolinoductos. La interpretación de los resultados para

67

definir la identificación microbiana no se presenta en este trabajo, debido a que no es parte de los

objetivos del mismo.

III.1.3 Formación de Biopelícula en cultivos microbianos

Por otro lado, en los resultados de los aislamientos realizados en la primera etapa, de los 142

cultivos mixtos obtenidos, más del 44% presentó formación de biopelícula (Tabla 35). Se observó la

morfología colonial de la biopelícula, generalmente crecida en la interfase gas-electrolito.

La flora microbiana presente en gasolinoductos resultó ser muy vasta, y con una gran capacidad

de formar biopelícula, en las micrografías de la Figura 21 es posible observar microorganismos

distribuidos en forma heterogénea en el exopolímero.

Figura 21. Tinciones de Gram de diferentes muestras de biopelículas anaerobias obtenidas de los

aislamientos realizados en el laboratorio con la técnica de tubo rodado.

La siguiente tabla muestra los resultados del crecimiento microbiano obtenido a partir de los

aislamientos realizados de las 13 muestras de sedimentos de gasolinoductos, por la técnica de tubo

rodado, se observa que solo 7 de las 13 muestras mostraron crecimiento en medio ENR, lo cual contrasta

con los cultivos en sustratos específicos.

Tabla 35. Resultados de los microorganismos aislados de muestras de gasolinoductos.

Crecimiento M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13

Biopelícula 5 - 18 - 2 - 14 20 4 - - - -

Crecimiento s/B 12 - 27 - 7 - 15 8 8 - 2 - -

• Las Muestras (M) para las cuáles no se realizó el aislamiento, se representan con un signo -.

68

La muestra con mayor proporción de biopelículas formadas en la interfaz gas electrolito fue M8,

aunque el crecimiento de los microorganismos presentes en esta muestra disminuyó notablemente al

cambiar el medio de cultivo.

En las pruebas con sustratos específicos se observó crecimiento microbiano capaz de formar

dichas estructuras, se encontró que, como se observa en la Tabla 36, de los 104 cultivos sembrados, 58

cultivos presentaron crecimiento planctónico, 13 cultivos evidenciaron la presencia de biopelículas

creciendo en la interfase gas- electrolito y 33 cultivos no presentaron crecimiento.

Dentro de la misma tabla se aprecia un gran número de muestras capaces de crecer en sustratos

específicos, y solo la muestra 13 no presentó crecimiento en estos sistemas y es por ello que no se

muestra en la Tabla 36.

Tabla 36. Crecimiento con sustratos específicos, crecimiento planctónico o en biopelícula.

Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12

Benceno C/P1 C/P C/P C/P Biofilm C/P C/P ----- C/P C/P ----- C/P

Tolueno Biofilm2 C/P C/P C/P C/P ----- ----- ----- Biofilm C/P C/P C/P

Xileno C/P -----3 C/P Biofilm Biofilm C/P C/P C/P ----- C/P C/P C/P

TBA Biofilm C/P Biofilm Biofilm C/P Biofilm C/P ----- C/P C/P ----- C/P

MTBE C/P C/P C/P Biofilm Biofilm ----- C/P ----- C/P C/P C/P C/P

Pentano C/P ----- C/P C/P C/P ----- C/P ----- ----- C/P C/P C/P

Lactato C/P C/P C/P ----- ----- ----- C/P C/P ----- ----- ----- -----

Acetato Biofilm C/P Biofilm C/P ----- ----- C/P C/P ----- C/P ----- C/P 1Crecimiento Planctónico 2 Biopelícula 3 Sin Crecimiento

El hecho de que en sustratos específicos se haya generado un vasto crecimiento sugiere que las

bacterias presentes en estos gasolinoductos son capaces de degradar algunos de los compuestos

recalcitrantes de la gasolina, y que están mejor adaptadas al crecimiento dentro de un sistema con estas

fuentes de carbono, que a un medio con nutrientes más convencionales para cultivo de bacterias. Para

comprobar dicha hipótesis se llevaron a cabo cinéticas de degradación de compuestos BTX, los resultados

de las mismas son presentados en la siguiente sección.

69

III.1.4 Cinéticas de producción de CO2 y degradación de compuestos BTX

A continuación se presentan los resultados de las cinéticas de degradación de compuestos BTX, y

producción de CO2, que se realizaron para observar si las bacterias presentes en los sistemas de estudio

eran capaces de degradar compuestos BTX, estas se realizaron con los microorganismos presentes en

algunos de los cultivos con sustratos específicos.

Como ya se ha mencionado, los cultivos se hicieron por duplicado, para los datos obtenidos de los

cromatógrafos se obtuvieron las desviaciones estándar y en cada caso estas fueron menores a 5. La

duración de las cinéticas fue 48 días, las cinéticas indicaron una velocidad de crecimiento muy lenta, lo

cual es normal, como se sabe las velocidades de crecimiento de microorganismos anaerobios suelen ser

menores que los sistemas que involucran microorganismos aerobios, además del tipo de sustrato en el

estos crecieron.

Se observó claramente la disminución de los picos de estos compuestos a través del tiempo, la

concentración inicial de los compuestos se encuentra en función de la concentración inicial de biomasa

presente en el cultivo, así pues se observa que para el caso de las muestras con benceno como única

fuente de carbono, la concentración disminuye de 77 ppm a 30 ppm para el caso de la muestra BM8,

mientras que en BM9 la concentración disminuye de 71 ppm a 28 ppm. Para el caso de las muestras con

tolueno y xileno como única fuente de carbono las concentraciones disminuyen, en promedio, de 40 ppm

a 5 ppm, y de 19.45 ppm a 3.5 ppm, respectivamente. En la Figura 22, se observa la clara tendencia de

disminución en la concentración de dichos compuestos, lo cual nos indica que el sustrato (compuestos

BTX) esta siendo consumido por los microorganismos presentes.

Para el caso de las cinéticas realizadas para evidenciar la presencia de CO2, se observó un

incremento en la concentración de este compuesto con respecto al tiempo. En la figura 23 se aprecia la

tendencia de la cinética, esta muestra un incremento desde 9 mg de CO2 hasta 18 mg, como es el caso del

cultivo BM9. A su vez, dentro de la gráfica se observan variaciones en la concentración de CO2 lo cual

indica que la cinética no sigue el comportamiento cinético de Monod, esto puede deberse a que el cultivo

contiene más de un género microbiano, y es de esperarse que la cinética tenga variaciones en su

comportamiento, ya que dentro de un cultivo mixto se pueden dar interacciones complejas en las cuales

los productos de algunos microorganismos sean consumidos por otros, tal podría ser el caso del CO2, así

como la posibilidad de que no se esté llevando a cabo una completa mineralización de los compuestos

70

utilizados como sustratos y en su lugar se estén obteniendo intermediarios solubles, como el lactato o

catecoles.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300 400 500 600 700

Tiempo (hrs)

ppm

BT

X

BM8

BM9

TM7

TM6

XM6

XM11

Figura 22. Cinética de degradación de compuestos BTX de de cultivos tomados directamente de las 13

muestras resembradas en medio MIN con sustratos específicos.

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 100 200 300 400 500 600 700

tiempo (hrs)

mg

CO

2

BM8BM9TM7TM6XM6XM11PM1PM10

Figura 23. Cinéticas de producción de CO2 de cultivos tomados directamente de las 13 muestras

resembradas en medio MIN con sustratos específicos.

71

El ajuste de estos datos a un modelo cinético no se presenta en este documento debido a que no forma

parte de los objetivos de esta investigación.

II.1.5 Resultados de Pruebas de adhesión con Cultivos Mixtos Artificiales

En las pruebas con cultivos mixtos aerobios y anaerobios artificiales se encontró una morfología

macroscópica de las biopelículas diferente de la encontrada con los cultivos de microorganismos puros; se

observó que en un medio aerobio con compuestos BTX como fuente principal de carbono los

microorganismos son capaces de crecer, pero el bioensuciamiento disminuye y no se forma una

biopelícula tan invasiva como en el medio aerobio con lactato como fuente de carbono. Cuando se tiene

medio anaerobio la turbidez aumenta y se tiene un precipitado negro bastante evidente, pero la formación

de biopelícula que ensucia la superficie metálica no es tanta como en los medios aerobios con lactato.

Los nombres asignados a cada consorcio para reportar los resultados se muestran previamente en

la Tabla 37, mientras que en la Tabla 38 se describen los resultados de las pruebas de adhesión aplicadas

a cultivos mixtos.

Tabla 37. Nombre completo de los cultivos mixtos, y nombre designado para reportar los datos.

Nombre original del Cultivo Mixto Nombre Asignado

Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio Lactato 18 de Sep. consorcio Cultivo Mixto 1

Cultivo Mixto de BTX sin sustrato, Anaerobios BTX + Anaerobios Lactato Cultivo Mixto 2

Cultivo Mixto de BTX + sustrato, AnaerobioBTX+ Anaerobio Lactato Cultivo Mixto 3

Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio Lactato Imp. gas Cultivo Mixto 4

Cultivo Mixto de BTX sin sustrato Anaerobio BTX+ Anaerobio Lactato Cultivo Mixto 5

Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio con Lactato, inóculo para consorcio de BTX Cultivo Mixto 6

Cultivo Mixto; de BTX medio Aerobio + Anaerobio BTX Cultivo Mixto 7

Cultivo Mixto de lactato M3,1,1, M1,2,1, M13,21 Cultivo Mixto 8

M3,1,1, Lactato, CMR, 15/09/06 Cultivo Mixto 9

M1,2,1 Lactato, 15/09/06 CMR Cultivo Mixto 10

Cultivo Mixto de BTX, M, M3,1,2 O-X, M3T’ Cultivo Mixto 11

72

Tabla 38. Resultados de las pruebas de adhesión a cultivos mixtos de microorganismos aerobios y

anaerobios.

Consorcio Medio Bacterias Adherencia Turbidez Producción de Fe (color negro)

Biopelícula

Cultivo Mixto 1 ENR A/An ++ ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 2 MIN+BTX+lact A/An ++ ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 3 MIN+BTX+lact A/An + ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 4 MIN+BTX+lact A/An ++ ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 5 MIN+BTX A/AN BTEX + ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 6 ENR A/An +++ ++++ +++ Pasiva

Cultivo Mixto 7 MIN+BTX A/ BTEX, +++++(vidrio) ++++ NO Biofouling

Cultivo Mixto 8 ENR Aerobios - +++ + ++ Pasiva

Cultivo Mixto 9 MIN+ BTX Aerobio puro ++++ ++++ +++ Biofouling

Cultivo Mixto 10 MIN+BTX Aerobio puro +++++(placa) + ++++ Biofouling

Cultivo Mixto 11 MIN+BTX Aerobios de BTEX

+++++(vidrio) + NO Pasiva

La principal observación en este sistema es la coloración de la biopelícula, en medio mínimo con

compuestos BTX sin lactato es blanca-amarillenta mientras que con medio de cultivo de enriquecimiento

con lactato como fuente de carbono da una coloración negra, lo cual podría atribuirse a la diferencia entre

una biopelícula protectora y una biopelícula corrosiva.

En la Figura 24 es posible observar la diferencia entre un consorcio de bacterias aerobias y

anaerobias creciendo en un medio con lactato (Figura 24a), y un consorcio de la misma naturaleza, pero

creciendo en medio MIN con compuestos BTX (Figura 24b) A algunos de estos cultivos mixtos se

les realizó la un análisis superficial por medio de

.

Figura 24. a) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio

con lactato. b) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio

con compuestos BTX.

a) b)

73

A algunos de estos cultivos mixtos se les realizó la un análisis superficial por medio de

Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM, por sus siglas en inglés). Así, se muestran

algunas de las microscopías electrónicas que se tomaron de los cultivos a los cuales se les realizaron

pruebas de adhesión. Se observa que para este caso del cupón testigo (esto es: un cupón de acero al

carbón SAE 1018, con medio de enriquecimiento con lactato pero sin la presencia microbiana), los

productos tienen una distribución poco ordenada en una película fina y poco adherente, no se observa una

distribución homogénea ni que cubre todas la superficie.

Dados los resultados del análisis elemental con EDS (no presentados), se observa que algunos de

los elementos que componen los productos de corrosión son en su mayoría carbono, oxigeno, silicio, y

una gran concentración de fosfatos, cloro y calcio.

En los cupones que se inocularon con microorganismos (Figura 26), sobre una superficie invadida

por lo que podría ser exopolímero producido por microorganismos, lo cual sugiere el crecimiento de una

biopelícula sobre la superficie del cupón; se observa una gran diferencia entre las micrografías

presentadas debido a que los sistemas con bacterias presentan zonas de composición y estructura muy

diversas.

En los cultivos mixtos de bacterias aerobias y anaerobias creciendo en medio mínimo (Figura 27)

se observa la formación de productos de corrosión. Llama la atención la manera en la que los productos

de corrosión se distribuyen sobre la superficie del cupón, por la geometría que estos presentan

Figura 25. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Testigo; Cupón de Acero al carbón sin microorganismos.

. A la izquierda se ven productos de corrosión cúbicos que según los datos obtenidos por la

microscopía están formados principalmente de carbono, cloruro de sodio, silicio y azufre (diagramas no

presentados). En el centro se observan estructuras esféricas que bien podrían ser estructuras formadas

74

por productos de corrosión asociados a conglomerados de biopelícula. De acuerdo con las microscopías

ópticas se observaron microorganismos muy pequeños (de 0.1 a 0.5 micras) creciendo embebidos en la

biopelícula y la biopelícula podría estar acoplándose esa forma geométrica, el tamaño también podría

explicar las dificultades para observar los perfiles de los microorganismos.

Figura 26. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Muestras DGC11, 400x y DGC17, 2500x respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con microorganismos.

Por último, a la derecha, en la misma muestra, diferente micrografía (Figura 27), se observan

protuberancias sobre la superficie, se cree que esta también podría ser biopelícula que crece en forma de

heterogénea, y que los conglomerados de productos en la estructura que se observan son exopolímero

producido en la biopelícula.

Figura 27. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental de muestras de cultivos mixtos de

bacterias aerobias y anaerobias. A la izquierda formación de sales, productos de corrosión y biopelícula

en medio enriquecido con lactato 400x. Centro, formación de sales y biopelícula en medio mínimo con

compuestos BTX como única fuente de carbono muestra BTXMA02, 1250x, y derecha; misma muestra,

micrografía BTXMA06, 1000x respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con posible

biopelícula.

75

II.1.6 Estrategias Multicelulares

Con base en los resultados de las cinéticas, se sabe que los microorganismos son capaces de

degradar compuestos BTX, siendo capaces de mineralizarlos, y crecer en presencia de MTBE, TBA o

pentano como única fuente de carbono. Se llevó a cabo una revisión bibliográfica de las rutas de

degradación de estos compuestos, con el fin de determinar algunas de las posibles interacciones que

podrían existir en el sistema de estudio [BIOCATALISIS/BIODEGRADATION DATABASE, 2007].

Según lo anterior, los compuestos recalcitrantes que forman parte de la composición de la

gasolina son degradados a compuestos orgánicos tales como acetil-CoA, acetaldehído, piruvato, L-lactato,

y formiato, además de ser posible la mineralización de estos compuestos hasta CO2 y H2O. Cabe

mencionar que la mayoría de estos rutas metabólicas están descritas para un número limitado de bacterias,

y es posible que las interacciones en nuestro sistema de estudio sean diferentes, pero básicamente se

proponen algunas estrategias multicelulares con base en la formación de una biopelícula en donde los

tipos microbianas potenciales de crecer bajo las condiciones de estudio son capaces de interaccionar

simbióticamente, tomando en cuenta las rutas metabólicas publicadas en la literatura.

Figura 28. Posibles estrategias multicelulares en gasolinoductos.

Previo a este trabajo se había evidenciado la presencia de bacterias sulfato reductoras, nitrato

reductoras, fermentativas, reductoras de Fe, metanogénicas, productoras de ácidos orgánicos, y

productoras de acetato en las muestras de gasolinoductos; con base en esto, se proponen distintas

76

interacciones en el sistema, en la Figura 28 se observan algunos de los productos de estas interacciones,

de los cuáles algunos favorecen el aceleramiento del proceso de corrosión, como son, la liberación del N2,

de NH3, la producción de acetato y otros ácidos orgánicos, el CO2, y la producción de H2S que tiene una

gran influencia en corrosión localizada. Es posible que dentro de los gasolinoductos existan consorcios

de bacterias capaces de seguir un comportamiento cercano a la estrategia expuesta en la Figura 28.

Además de las interacciones metabólicas, la formación de la sustancias poliméricas extracelulares que dan

cuerpo a la biopelícula podrían albergar una amplia gama de compuestos que den lugar a otras secuencias

metabólicas y que permitan a las bacterias ser protegidas contra el esfuerzo de corte, así como crear

gradientes de concentración, de oxígeno y de acidificación diferencial.

En estudios posteriores, sería de gran interés analizar las rutas metabólicas y las enzimas

presentes dentro de la degradación de cada compuesto, ya que es un sistema que no se ha estudiado a

fondo, especialmente para el caso de microorganismos anaerobios.

77

III.2 Bioelectroquímica de Biopelículas

En esta sección se presentan los resultados de la caracterización electroquímica con OCP y EIS,

de un sistema abiótico y de un sistema biótico, así como el análisis de los datos por medio de circuitos

eléctricos equivalentes y un modelo computacional sencillo.

III.2.1 Resultados Experimentales de Impedancia

Se obtuvieron más de 1000 mediciones de impedancia y OCP a lo largo del monitoreo, sin

embargo para efectos de simplicidad, solo se muestra en esta parte el análisis de dos de los sistemas de

estudios, el primero consta de un sistema abiótico con medio ENR, mientras que el otro consta de medio

ENR con algunas de las bacterias presentes en los cultivos mixtos de las pruebas de adhesión. Los

resultados de OCP no se presentan explícitos en este documento, sin embargo todos los valores de

impedancia que se muestran fueron medidos con respecto a este valor.

-140000

-120000

-100000

-80000

-60000

-40000

-20000

0

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000

Z' (Ohm)

Z "

(Ohm

)

t = 0 h

t = 4 h

t = 12.5 h

t = 51 h

t = 75 h

t = 83 h

t = 234 h

Figura 29. Diagrama complejo de los datos experimentales para el sistema abiótico (izquierda), obtenido

de las mediciones a una celda con medio de cultivo enriquecido estéril, y su correspondiente acercamiento

a altas frecuencias (derecha).

78

En los datos experimentales graficados (Figura 28, 29 y 30) se aprecian las diferencias entre el

comportamiento electroquímico del sistema abiótico y el sistema biótico. En el diagrama complejo

(Nyquist) del sistema sin bacterias (Figura 28) se observa que hay tanto un aumento en la impedancia real

como en la imaginaria con respecto al tiempo en el que el electrodo metálico está expuesto al electrolito

(medio de cultivo ENR). La interfaz electroquímica provoca una gran resistencia al paso de corriente lo

cuál se observa en las grandes magnitudes obtenidas, especialmente para la impedancia imaginaria, lo

cuál es un indicativo de que la interfase se está formando por productos de corrosión tanto orgánicos

como inorgánicos del hierro, es altamente resistiva. Este comportamiento es característico de la

formación de una capa pasiva. El incremento de las magnitudes de la parte real de impedancia indica que

la velocidad del proceso de disolución (activación) decrece a través del tiempo, esto podría ser debido al

crecimiento de la capa que se forma con los productos de corrosión que impide la reacción directa del

metal con los componentes del medio de cultivo o que las especies electroactivas se agotan

-40000

-35000

-30000

-25000

-20000

-15000

-10000

-5000

0

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000

Z'(Ohms)

Z ''

(Ohm

s)

t = 0 h

t = 23 h

t = 94 h

t = 202 h

t = 218 h

t = 470.5 h

t = 488.5 h

t = 1149 h

t = 1242 h

Figura 30. Diagrama complejo obtenido de las mediciones realizadas al sistema biótico.

Para el caso del sistema biótico se observa que las magnitudes de la impedancia real y la

imaginaria en principio comienzan a aumentar con respecto al tiempo, hasta llegar a un punto en donde la

tendencia cambia y las magnitudes comienzan a decrecer.

79

Es posible que en un principio la reacción de corrosión se viera controlada por un proceso de

pasivación al igual que en el sistema abiótico, principalmente debido al lento crecimiento que presentan

en su mayoría de las ocasiones los microorganismos anaerobios que no supera la influenza de las

reacciones termodinámicas que se llevan a cabo, hasta llegar a un punto en el cual las bacterias establecen

una biopelícula que induce limitaciones por procesos de transferencia de masa, es decir de difusión a

través de la interfaz, a partir de este punto el fenómeno de activación que se observa en el sistema abiótico

ya no es el factor limitante en los procesos electroquímicos de corrosión que ocurren en la interfaz. Las

fluctuaciones en el comportamiento de este sistema

En la figura 29 en el diagrama complejo las magnitudes de ambos ejes con respecto al tiempo

disminuyen a partir de las 218 h de experimentación y posteriormente fluctúan en comportamiento,

especialmente para la impedancia real, la cual sugiere la formación de una biopelícula que alcanza un

estado de crecimiento máximo y posteriormente se desprende una parte haciendo que la interfaz se vuelva

más conductiva, y a su vez el decremento en el diámetro de los semicírculos en los tiempos más largos es

un indicativo de que la velocidad de corrosión para el sistema biótico aumenta.

En los diagramas de Bode que muestran el ángulo de fase (Figura 30), se muestra que en el

sistema biótico (Figura 30b), en comparación con el sistema con medio estéril (Figura 30a), conforme

transcurre el tiempo se observa que a bajas frecuencias el comportamiento simétrico de este diagrama se

ve alterado lo cuál puede interpretarse como la formación de una película con distribución heterogénea en

la interfaz, lo cuál puede deberse a una distribución heterogénea de la biopelícula sobre el metal y a los

productos de corrosión heterogéneamente distribuidos en ella, podría ser que la presencia del exopolímero

provoque que la interfase sea más conductiva.

Asimismo se observa que en el sistema abiótico las variaciones del ángulo de fase varían en

forma creciente en su valor máximo de 70 a 80 grados, mientras que para el sistema biótico varían de 65 a

80, pero además s recorren los valores máximos hacia frecuencias más bajas, con respecto al tiempo, lo

cuál puede deberse a que la presencia de la biopelícula induce la limitación de las reacciones

electroquímicas por procesos de transporte distintos a los de la interfaz abiótica, como se relacionó

previamente a la difusión. El cambio en la amplitud de los picos que con respecto al tiempo ocurren

abarcando más frecuencias en presencia de la biopelícula son un indicativo de que en presencia de la

biopelícula ocurre una secuencia de reacciones electroquímicas y procesos a diferentes velocidades que

tienen una influencia más continua en el acero al carbón que las que ocurren en el sistema abiótico.

80

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

1.00E-02 1.00E-01 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05

Frecuencia (Hz)

Áng

ulo

de

Fas

e (º

)

t = 0 h

t = 4 h

t = 12.5 h

t = 51 h

t = 75 h

t = 83 h

t = 234 h

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

1.00E-02 1.00E-01 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05Frecuencia (Hz)

Áng

ulo

de F

ase

(°)

t = 0 h

t = 23 h

t = 94 ht = 202 h

t = 218 ht = 470.5 h

t = 488.5 ht = 1149 h

t = 1242 h

Figura 31. Diagrama de Bode que muestra el ángulo de fase obtenido de los datos experimentales de un

sistema abiótico(a) y un sistema biótico (b).

III.2.2 Análisis con Circuitos Equivalentes

Los circuitos equivalentes son una combinación de elementos eléctricos tales como: resistores,

capacitares, inductores y elementos de fase constante, entre otros, los cuales pueden dar una respuesta

correspondiente a la del sistema electroquímico para todo el intervalo de frecuencias. Los circuitos

equivalentes o ajuste de datos a circuitos equivalentes es un paso para analizar los datos obtenidos con

EIS. Los valores de los componentes de los circuitos son usados para proveer información a cerca de la

velocidad de corrosión o los mecanismos de corrosión. Un ejemplo simple es cuando usas la resistencia a

la polarización (Rp) para estimar la velocidad de corrosión (icorr).

a)

b)

81

Los ajustes de los datos se realizan al sobreponer los datos experimentales con el comportamiento

de un circuito equivalente dado y hay muchas combinaciones de elementos que pueden dar el mismo

comportamiento en el espectro de impedancia, y la decisión a cerca del circuito más apropiado, debe

relacionarse con el y/o los procesos de corrosión que se están llevando a cabo en el sistema de estudio

[COTTIS y col., 1999].

Para hacer más fácil el uso de circuitos equivalentes para ajustar o modelar datos, al elegir un

circuito se debe hacer con elementos que tengan significado físico y lógico en el sistema. El circuito RC

equivalente más simple, contiene una resistencia del electrolito, una capacitancia de la doble capa, y una

resistencia a la transferencia de carga, que constituyen la impedancia de Faraday y están asociados a los

procesos que ocurren en la interfaz formada sobre el electrodo.

La impedancia de Faraday está hecha de combinaciones paralelas de impedancia de las reacciones

catódicas y anódicas. Para estimar la respuesta que puede estar ocurriendo se puede relacionar esta

impedancia con los diferentes procesos que controlan un proceso [COTTIS y col., 1999].

Hay muchos fenómenos que controlan un proceso de corrosión, uno de ellos es la impedancia de

difusión, que pude modelarse entre otras formas con la Impedancia de Warburg o con los elementos de

fase constante (CPE). La difusión en muchos casos es lo que controla el proceso de corrosión, siendo el

tiempo que tarda una partícula o carga en ser difundida del medio a la superficie del metal, y no así la

reacción de oxido-reducción que sucede al momento de hacer contacto con la superficie, conocida como

activación. Existen otros tipos de fenómenos en corrosión capaces de controlar un proceso, la pasivación

de un sistema, por ejemplo, se puede interpretar como la protección de un dispositivo en estado sólido,

sucede cuando crece una capa de oxido en la superficie de un semiconductor para proveer estabilidad

eléctrica al sistema, debido a que en cierto modo funciona como un aislante que protege al sistema de de

algunas reacciones químicas en el ambiente, lo cual reduce la velocidad de corrosión en un sistema [

COTTIS y col., 1999].

De esta manera, para poder llevar a cabo un ajuste de datos, es necesario tener conocimiento de

los diferentes fenómenos que controlan un proceso de corrosión, que activan o retardan la velocidad de

las reacciones en el sistema de estudio.

Los resultados experimentales de esta investigación se analizaron utilizando un ajuste con

circuitos eléctricos equivalentes. Para el sistema abiótico se realizó un ajuste de datos con el circuito

82

equivalente de la Figura 28a, el cual consta de dos resistencias: R1, la cual esta asociada a la resistencia

del electrolito (RE), y R2, la cual se relaciona con la resistencia a la transferencia de carga (RTQ), y un

CPE (Constant Phase Element), denominado elemento de fase constante, el cual es directamente

proporcional a la capacitancia de la doble capa (Qdc). Se ajustó con este circuito equivalente debido a que

en un sistema abiótico se tienen 3 principales componentes, esto es el electrolito, el metal, y la velocidad

de reacción entre ambos componentes que van a determinar la velocidad de corrosión de nuestro sistema.

En tanto que el sistema biótico (Figura 28b), se ajustó con un circuito equivalente de 3 resistencias y 2

elementos de fase constante: R1, asociada a la resistencia del electrolito (RE), R2, la cual esta asociada a

la resistencia de la biopelícula (RB), y R3, esta asociado a la transferencia de carga (RTC), en tanto que

CPE1 esta asociado a la capacitancia de la biopelícula (QB), CPE2 se asocia a la capacitancia de película

de corrosión (QPC).

Figura 32. Circuitos equivalentes utilizados para el ajuste de datos de impedancia, a) sistema abiótico, b) sistema con biopelícula.

La representación matemática de la impedancia del CPE está definida por la ecuación (9).

nCPEQj

Z⋅⋅

=ω

1

(9)

En donde ω es igual a la frecuencia, j es el número imaginario 1− , Q es la magnitud del CPE,

proporcional a la capacitancia, y n es un parámetro numérico entre 1 y 0. Cuando n se acerca al valor de

1 el CPE se comporta como un capacitor, y esto refleja la distribución homogénea de algunas propiedades

del sistema, y cuando n tiende a 0 algunas propiedades del sistema están heterogéneamente dispersas

[DEVOS O. y col., 2006].

Los resultados de los parámetros obtenidos con dicho ajuste son mostrados en las tablas 39 y 40,

para cada elemento del circuito equivalente correspondiente.

83


datos experimentales para diferentes tiempos, para el sistema abiótico.

Tiempo RE QDC n RTC 0 h 29.1 0.000277 0.87109 13835 4 h 30.92 0.000281 0.82746 2.05E+05

12.5 h 31.23 0.000257 0.84495 2.81E+05 51 h 31.57 0.000241 0.86519 1.54E+05 75 h 33.12 0.000244 0.86276 1.89E+05 83 h 34.72 0.000231 0.87756 2.09E+05

234 h 31.48 0.000235 0.88043 4.92E+05

Para el sistema abiótico se observa que la resistencia del electrolito (RE) aumenta de 29.1 a 31.48

con respecto al tiempo, esto puede deberse a un aumento en la resistividad del electrolito.

La formación de una capa pasiva de productos de corrosión, como ya se ha descrito

anteriormente, se ve reflejada en las magnitudes de QDC, que disminuyen de 0.000277 a 0.000235, y de la

RTC que aumenta de 1.3 E4 a 4.92 E5. El valor de n se incrementa de 0.871 a 0.880, lo cuál indica que la

película pasiva se distribuye homogéneamente con respecto al tiempo, siendo ésta la que controla el

proceso de corrosión por activación. El aumento en los valores de la resistencia a la transferencia de

carga es un indicativo cualitativo de que la velocidad de corrosión disminuye con respecto al tiempo para

este sistema.


datos experimentales para diferentes tiempos, en el sistema biótico.

Tiempo RE QB nB RB QPC n PC RTC 0 h 23.73 0.00026319 0.75258 24100 ------- ------- -------

23 h 31.38 0.00012209 0.51205 5.54E-08 8.14E-05 0.84672 1.45E+05 94 h 28.92 0.00028752 0.77706 1.846 6.97E-05 0.77351 74697

202 h 26.97 0.00044386 0.85146 3.03E-05 8.13E-05 0.86828 139250 218 h 28.95 0.00089212 0.75217 4.866 0.0003552 0.87538 136330

470.5 h 28.42 0.00051069 0.80791 32815 2.53E-05 0.88821 33619 488.5 h 29.53 0.00047889 0.83153 5129 6.96E-05 0.69412 53035 1149 h 25.7 0.00011939 0.77597 11.42 0.00015564 0.95696 85260 1242 h 26.97 6.63E-05 0.6227 7.254 0.00020224 0.95374 1.42E+05

Para el sistema con bacterias el tiempo 0 se ajustó con el mismo circuito equivalente que el

sistema abiótico, debido a que en este tiempo aun no hay crecimiento de microorganismos. Se observa

que la resistencia del electrolito varía con respecto al tiempo, de 23.73 a 26.97 ohms, mientras que el

parámetro asociado a la capacitancia de la biopelícula (QB), que es proporcional a la acumulación de

cargas, varia con respecto al tiempo, las magnitudes en principio suben y posteriormente decrecen, esto

84

puede asociarse a la presencia de una biopelícula inestable, o bien, que el consorcio pasa por diferentes

etapas con lo cual experimenta más de un fenómeno de control de las reacciones de corrosión, es decir, el

incremento de los valores puede asociarse a un fenómeno de activación, que al paso del tiempo es

controlado por difusión, lo cual explicaría la disminución de valores y el comportamiento de los

parámetros mostrados en la Tabla 40, que tienden a incrementarse y decrecer. En el parámetro nB, es

proporcional a la distribución de biopelícula en la interfaz, se observa que este parámetro fluctúa con

valores entre 0.51 a 0.85, pero no existe una tendencia definida de los mismos, comportamiento que

puede deberse a la formación de la película, al bloqueo de sus espacios libres con productos de corrosión

y al aleatorio desprendimiento de porciones de la misma, reactivando así la superficie metálica expuesta

al electrolito en sitios localizados.

La resistencia de la biopelícula disminuye con respecto al tiempo, esto quiere decir que la

conductividad entre el medio y la biopelícula va aumentando, lo cual puede favorecer los procesos de

corrosión, en tanto que la capacitancia de la película de corrosión (QPC) finalmente aumenta, al igual que

nPC, de manera general, esto se correlaciona con una distribución más homogénea de la película de

productos de corrosión. Por lo que refiere a RTC, se observa que disminuye con respecto al tiempo, las

magnitudes mostradas para ambos casos (sistema abiótico y biótico) son más grandes para el premier

sistema, lo cual nos habla de una disminución en la resistencia a la transferencia de carga para el sistema

biótico, y se traduce de manera cualitativa, en un incremento de velocidad de corrosión con respecto al

sistema abiótico.

En la Figura 33 se observa la gráfica del diagrama complejo para un sistema abiótico, donde se

muestra la calidad de los ajustes con respecto a los datos experimentales para tres de los tiempos de

experimentación, así como la simulación que se les realizó por medio del ajuste con circuitos equivalentes

para los tiempos 0 h, 4 h, 83 h.

Con los parámetros obtenidos del ajuste de los datos se llevó a cabo un análisis de sensibilidad, en

el cual se varió cada parámetro en cinco diferentes magnitudes del orden de 10-1, 10-2, y 101 y 102, para

cada parámetro, esto ayudó a identificar qué parámetros son los que tienen mayor influencia en la

impedancia del sistema de estudio. Con base en el análisis de sensibilidad se encontró que aquellos

parámetros que tuvieron mayor influencia en el sistema de estudio fue, para el sistema abiótico, la

resistencia a la transferencia de carga. Como se pudo apreciar en la Figura 31a, en el diagrama de Bode

del ángulo de fase, las variaciones se dan a bajas frecuencias, estas van aumentando con respecto al

tiempo, el análisis de sensibilidad se observó un desfasamiento similar al aumentar las dimensiones del la

85

resistencia a la transferencia de carga, que es lo mismo que ocurrió en el sistema con RTC (Tabla 39), en

donde se observa un incremento de esta magnitud con respecto al tiempo, esto se interpreta como una

disminución en la velocidad de corrosión con respecto al tiempo. Cabe mencionar que no es una

evaluación cuantitativa, sino cualitativa, partiendo del principio en que la resistencia a la transferencia de

carga es inversamente proporcional a la velocidad de corrosión.

-120000

-110000

-100000

-90000

-80000

-70000

-60000

-50000

-40000

-30000

-20000

-10000

0

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000

Z' (Ohms)

Z "

(Ohm

s)

t = 0 h

Simulación t = 0 h

t = 12.5 h

Simulación t = 12.5 h

t = 83 h

Simulación t = 83 h

Figura 33. Diagrama complejo con ajuste de datos de un sistema abiótico

En la figura 34 se alcanza observa el ajuste de parámetros con respecto de los datos

experimentales, para este caso, no se muestran todos los tiempos, solo aquellos en los cuales se puede

observar la tendencia que estos muestran con respecto al tiempo.

Para el caso del sistema abiótico la mayor contribución de los cambios en el sistema se centra en

3 de parámetros; la acumulación de cargas de la biopelícula (QB), la capacitancia de la película de

corrosión (QPC), y la resistencia a la transferencia de carga (RTC).

86

-70000

-63000

-56000

-49000

-42000

-35000

-28000

-21000

-14000

-7000

0

0 7000 14000 21000 28000 35000 42000 49000 56000 63000 70000

Z ' (Ohms)

Z "

(O

hm

s)

t = 0 h

t = 94 h

t = 202 h

t = 470.5 h

t = 1242 h

Simulación t = 0 h



Simulación t = 470.5 h

Simulación t =1242 h

Figura 34. Diagrama complejo, datos experimentales con ajustes de datos para el sistema

biótico.

Para el primer caso, se observa (Figura 31) que a bajas frecuencias el diagrama presenta grandes

variaciones, dicho comportamiento también se pudo observar en el análisis de sensibilidad al disminuir

los valores de QB, lo cual quiere decir que la acumulación de cargas en la biopelícula va disminuyendo,

esto puede asociarse a que los procesos de corrosión están sucediendo de manera más rápida, y que la

formación de biopelícula incrementa la transferencia de carga en el sistema. En el caso de QPC, se

observó un comportamiento similar al aumentar los valores de este parámetro, quiere decir que el la

acumulación de cargas en la película de corrosión es uno de los parámetros que controlan los procesos

que se desarrollan en nuestro sistema. Por último, la RTC; las variaciones en este parámetro son similares

a las del sistema de estudio, para este caso solo se observa que la velocidad de transferencia de carga varía

con respecto al tiempo, y se puede asociar a los diferentes procesos que se pueden estar llevando a cabo

en el sistema.

87

PARTE IV.

CONCLUSIÓN GENERALES

88

IV. Conclusiones

� Los resultados obtenidos en el aislamiento que se llevaron a cabo en medio de cultivo ENR y MIN

con sustratos específicos sugieren una gran diversidad microbiana presente en los gasolinoductos,

considerando que solo el 1 % de la flora microbiana nativa es cultivable en laboratorio (misma que no

ha sido ampliamente estudiada). Más del 44% de estos microorganismos son capaces de formar

biopelículas, las cuales tienen influencia en corrosión y son capaces de degradar algunos compuestos

recalcitrantes de la gasolina (pentano, BTX, TBA y MTBE).

� Se obtuvieron cultivos de microorganismos que son capaces de crecer utilizando compuestos de la

gasolina, que además son capaces de producir CO2. Los microorganismos anaerobios, a partir de una

estimación cualitativa de las cinéticas, muestran una baja velocidad de crecimiento y consumo de

sustrato para los compuestos recalcitrantes benceno, tolueno y xileno. Sin embargo, a pesar de que

ocurre la mineralización completa de los sustratos utilizados, no todo el sustrato que se degradó sigue

este proceso. Para estimar con mayor detalle la producción de CO2 es necesario hacer pruebas de

respiración endógena.

� Las biopelículas de cultivos mixtos microbianos estrictamente anaerobios capaces de crecer en medio

anaerobio presentan menor producción de polímero en comparación con las biopelículas mixtas que

crecen en consorcio con bacterias aerobias.

� La flora microbiana anaerobia presenta una gran capacidad de adherencia a sobre acero al carbón

SAE 1018, y gran producción de productos de corrosión en forma de precipitado negro lo cual sugiere

la formación de biopelículas con influencia corrosiva.

� En presencia de compuestos BTX, con medio aerobio, el crecimiento microbiano se observa menos

invasivo que en medio con lactato, y la coloración cambia de negro a un tono blanco-amarillento, lo

cual sugiere la formación de biopelículas compactas protectoras de la corrosión.

� En el sistema con biopelículas, los productos en la interfase metal-electrolito tienden a agregarse en

estructuras más ordenadas en zonas localizadas, y no a distribuirse en toda la interfase como ocurre

con el sistema abiótico.

89

� La caracterización de los microorganismos encontrados en el material de arrastre de gasolinoductos,

es de gran importancia debido a que es un tipo de sistema que no se había caracterizado

anteriormente, además centra su importancia en aquellos microorganismos que son capaces de formar

biopelícula, los cuales tienden a acelerar el proceso de corrosión con influencia microbiológica.

� Se observó que existe la posibilidad que ocurra una red compleja de interacciones dentro de las

biopelículas, potenciales de ser formadas en gasolinoductos, en donde los metabolitos y productos

presentes permiten el establecimiento de comunidades microbianas altamente complejas y

simbióticas.

� Comparativamente desde el punto de vista electroquímico, en un sistema abiótico se observa que la

velocidad de corrosión es menor que en presencia de las biopelículas anaerobias que crecen con

lactato como principal fuente de carbono. En el caso del sistema abiótico existe un control por

procesos de activación, mientras que en el sistema con biopelículas el control de la corrosión esta

dado por procesos de transporte de masa (difusionales) que promueve la presencia de estas

estructuras biológicas.

� Se validó la hipótesis de este trabajo, al aislar y caracterizar una gran cantidad de microorganismos

provenientes de gasolinoductos, cuya diversidad y heterogeneidad permiten el establecimiento de

Biopelículas complejas con influencia en la corrosión.

90

PARTE V.

REFERENCIAS

91

V. Referencias • AVENDAÑO M. M. (2005). 8 mil kilómetros de terror, Presente Diario del Sureste, http://www.presente.com.mx/Portal/ArticleView.php?article_id=28912 • BASSLER B., LOSICK R. (2006). Bacterially Speaking, Cell, Vol. 125, Issue 2, p. p. 237-246. • BOOTH, G. H. (1971). Microbiological corrosion, Mills and Boon Limited, London, UK. • BRYANT M. P. (1972). Commentary on the Hungate Technique for Culture of Anaerobic Bacteria, Am. J. Clin. Nutr., Vol. 25, p. 1324-1328. • CASTANEDA H. (2001), Location of coating defects and assessment of level of cathodic protection on underground pipelines using AC impedance, Deterministic and nondeterministic models, Chapter 6,

Ph. D. Thesis, Penn State University, EUA. • CC TECHNOLOGIES, NACE INTERNATIONAL (2001). Costs of Corrosion, http://www.corrosioncost.com/home.html. • CBE, CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING (2006), Biofilms: The Hypertextbook, Montana State University, www_erc_montana_edu-biofilmbook • CENTRAL INTLLIGENCE AGENCY (2007). The World Factbook, https://www.cia.gov/cia/publications/factbook/geos/mx.html • CHARACKLIS W. G. COOKSEY K.E. (1983). Biofilms and Microbial Fouling, Advances in

Applied Microbiology, Vol. 29, p. 93-108. • CHEN G.; PALMER R.J.; WHITE D.C. (1997). Instrumental Analysis of Microbiologically Influenced Corrosion, Biodegradation, Vol. 8, Issue 3, pp. 189-20 • CHOUDHARY S.G. (1998). Emerging Microbial Control Issues in Cooling Water Systems. Hydrocarbon Processing, p. 91-102. • COSTERRON J. W., STEWART P. S., GREENBERG E. P. (1999). Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections, Science, Vol. 284, p. 1318-1322. • DAVEY M. E., O’ TOOLE GEORGE A. (2000). Microbial Biofilms: From Ecology to Molecular Genetics, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 64, No. 4, p.847-867. • DEVOS O., GABRIELLI C., TRIBOLLET B. (2006). Simultaneous EIS and in situ microscope observation on a partially blocked electrode application to scale electrodeposition, Electrochimica Acta, Vol. 51, pp. 1413-1422. • DEXTER S. C. (1995). Microbiological effects, Corrosion, Test and Standards, Application and Interpretation, Robert Baboian (Ed.), ASTM Manual Series, MNL 20.

92

• DILLON C. P. (Ed) (1982). Forms of Corrosion: Recognition and Prevention, NACE Handbook1, Vol. 1, NACE International, Houston Tx. • DONLAN M. R. (2002). Biofilms: Microbial Life on Surfaces, Emerg. Infect. Dis., http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol8no9/02-0063.htm • DOMÍNGUEZ -BENETTON X., RAMIREZ ESPINOSA D. (2007). Biocomplexity and Bioelectrochemical Influence of Anaerobic Biofilms in Gasoline Distribution Pipelines, Electrochemical

Society Transactions, Vol. 3., Corrosion of Infrastructure. • DOMÍNGUEZ BENETTON X. (2007). Biocomplexity and Bioelectrochemical Influence of Gasoline Pipelines Biofilms, in Carbon Steel Deterioration: A Transmission Lines and Transfer Functions

Approach, Tesis de Doctorado, Instituto Mexicano del Petróleo, Mexico.

• DUBIEL M., HSU C. H., CHIEN C. C., MANSFELD F., NEWMAN D. K. (2002). Microbial Iron Respiration Can Protect Steel from Corrosion, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, No. 3, p. 1440–1445.

• EHP: ENVIRONMENTAL HEALTH PERSPECTIVES (1998). Studying Slime, Vol. 106, http://ehpnet1.niehs.nih.gov/docs/1998/106-12/innovations.html • EVANS, LEONARD VERNON. (2000). Biofilms; Recent Advances in their Study and Control. ISBN 90-5823-093-7, p. 1-57. • FINE D. (2005). Advancing Oral Health Through Industry/Academic Partnerships, Center for Oral

Infectious Diseases, UMDNJ-New Jersey Dental School. • GABRIELLI C., (1998). Identification of Electrochemical Processes by Frequency Response Analysis, Solartron, Technical Report No. 004/83. • GALVAN M.R. (2004). Estudio de la Influencia del Flujo Turbulento sobre la Corrosión de un Acero al Carbono en Medios Acuosos que Contienen H2S Disuelto (amargos), Tesis Doctoral, Universidad Autónoma de México (UNAM), Facultad de Química, México. • GERARD H. MARKX AND DOUGLAS B. KELL (1990). Dielectric Spectroscopy as a Tool for the Measurement of the Formation of Biofilms and of their Removal by Electrolytic Cleaning Pulses and Biocides, Biofouling, Vol. 2, p.p. 211-227.

• HARRISON J. JOE, RAYMOND J. TURNER, LYRIUM L. R. MARQUES, HOWARD CERI, (2005). Biofilms, American Scientist, Vol. 93 No. 6, p. 508. • HUNGATE, R. E. (1950). The Anaerobic Mesophilic Cellulolytic Bacteria. Bact. Rev., Vol. 14, p. 1-49. • HUNGATE R. E. (1969). A Roll-Tube Method for the Cultivation of Strict. Anaerobes, Methods in

Microbiology, Vol. 3 B, p 117, Ed. By J. R. Norris and D. W. Ribbons, London, Academia Press. • IMP (2004). Investigación, Programa de investigación y desarrollo de ductos.

http://www.imp.mx/investigacion/ductos/ductos.htm

93

• KERESZTES Z. TELEGDI J., BECZNER J. KÁLMÁN E. (1998). The Influence of Biocides on the Microbiology Influence Corrosion of Mild Steel and Brass, Electrochimica Acta, Vol.42, p.77. • KNUDSEN J. G, (1981). Fouling of Heat Transfer Surfaces, In Power Condenser, Heat Transfer

Technologies 57-82, Hemisphere Publishing, Co., New York.

• KRAIGSLEY A., RONNEY P. D., STEVEN E. FINKEL (2002), Study report: Hydrodynamic influences on biofilm formation and growth, http://carambola.usc.edu/research/biophysics/Biofilms4Web.html • MACDONALD D. D. (1991). Application of Electrochemical Impedance Spectroscopy in Electrochemistry and Corrosion Science, In: Techniques for Characterization of Electrodes and Electrochemical Processes, R. Varma and J. R. Selman (Eds.), John Wiley and Sons Inc., Chapter 11, p. 515-580, ISBN 0-471-82499-2. • MACDONALD D .D., Y. A. E1-TANTAWY, R. C. ROCHA-FILHO AND M. URQUIDI- MACDONALD, (1994)., Evaluation of Electrochemical Impedance Techniques for Detecting Corrosion on Rebar in Reinforced Concrete, Report SHRP-ID/UFR-91-524, SRI International.

• MACY J. M., J. E. SNELLEN AND R. E. HUNGATE (1972). Use of Syringe Methods for Anaerobiosis, Am. J. Clin. Nutr., Vol. 25, p. 1318-1323.

• MANSFELD F., LITTLE B. (1990). The Application of Electrochemical Techniques for the Study of MIC—a Critical Review, Corrosion 90, Paper No. 108, NACE. • MANSFELD F., LITTLE B. (1991), A Technical Review of Electrochemical Techniques Applied to Microbiologically Influenced Corrosion, Corrosion Science, Vol. 32, No. 3, p. 247-272.

• MBEC BioProducts (2006). Biofilms efficient, http://www.mbec.ca/biofilmproblemnew.htm

• MILLER MB, BASSLER BL. (2001). Quorum Sensing in Bacteria, Annual Reviews Department of

Molecular Biology, Princeton University, Princeton, Vol, 55. pag, 165-99, EUA.

• MONFORT M. N. (2001). Corrosion Localisée des Aciers au Carbone Induite par des Bactéries Sulfato-Réductrices: Développement d’un Capteur Spécifique, Thèse de Doctorat, Université Paris VI, Spécialité: Electrochimie. • ÖRNEK D., JAYARAMAN A., SYRETT B. C., HSU C.-H., MANSFELD F.B., WOOD T.K. (2002). Pitting Corrosion Inhibition of Aluminum 2024 by Bacillus Biofilms Secreting Polyaspartate or γ-Polyglutamate, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58, p. 651–657. • PADILLA V. A. A., (2002). Evaluación de la velocidad de Corrosión de acero por bacterias reductoras de sulfato mediante técnicas Gravimétricas y Elctroquímicas. Tesis de Maestría, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB). • PAPAVINASAM S., WINSTON R. R., SOOKNAH R. D. (2007). Modeling the occurrence of Microbiologically Influenced Corrosion, Oral Presentation of Paper 07514, Corrosion 2007, NACE. • PEMEX (2006). Anuario estadístico 2006: www.pemex.com/files/content/Anuario__2.pdf

94

• PHILIP-CHANDY R., SCULLY P. J., ELDRIDGE P., KADIM H. J., GRAPIN M. G., JONCA M. G., D’AMBROSIO M. G. AND COLIN F. (2000). An Optical Fiber Sensor for Biofilm Measurement Using Intensity Modulation and Image Analysis, IEEE Journal on Selected Topics in Quantum

Electronics, Vol 6. No. 5, p. 764-772. • PRAKASH B VEEREGOWDA B. M., G. KRISHNAPPA. (2003). Biofilms: A Survival Strategy of Bacteria, College, Current Science, Vol. 85, No. 9, p. 1299-1307, India. • PICIOREANU C. (1999). Multidimensional Modeling of Biofilm Structure. Doctoral Thesis: Delft University of Technology Faculty of Applied Sciences, ISBN 9090133100. • RIVERO-HUDEC M.A., RICHARD BROWN1 AND SZE C. YANG. (2004). Replacement of Chromates In Paints And Corrosion Protection Systems. University Of Rhode Island Uritc Project No. 536158 http://www.uritc.uri.edu/media/finalreportspdf/536158.pdf • RODNEY M. D., (2002) Biofilms: Microbial Life on Surfaces from Emerging Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA • ROSAS C.O. (2003). Influencia de la Bacteria Ferrimonas sp. En la corrosión de un acero bajo carbono mediante la técnica de Ruido Electroquímico. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Mécico (UNAM), Facultad de Química, México. • SANDERS STURMAN P.J. (2005). Biofouling, The oil industry, Pretroleum microbiology, Olivier B. and Magot M. (ed, ASM PRESS, WASHINGTON D.C: 1771-198)

• STOECKER II J.G., ed. (2001). A Practical Manual on Microbiologically Induced Corrosion Volume

2, 2nd ed. Houston, TX: NACE, , p. 1.1. • SCULLY J. R., SILVERMAN D. C., KENDING M.W. (1993). ASTM STP-1188 Electrochemical Impedance: Analysis and Interpretation, ASTM. • THOMAS R. J., NOVA CHEMICALS LTD. (2002). Biological Corrosion Failures, ASM Handbook, Vol. 11, Failure Analysis And Prevention, P. 881-898. • UNIVERSITY OF MINNESOTA, BIOCATALISIS/BIODEGRADATION DATABASE., 2007. http://umbbd.msi.umn.edu/index.html • UNQSR, University of Nottingham Quorum Sensing Research Group (2006), The Quorum Sensing Site, http://www.nottingham.ac.uk/quorum/introduction.htm • VIDELA H. A. (1996). Manual of Biocorrosion, Lewis Publisher, Boca Raton, p. 47, 48.

• VIDELA H. A., FERRARI M. D., DE MELE M. F. L. (eds.) (1995). Manual Práctico de Biocorrosión y Biofouling para la Industria, Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el

Desarrollo, Red Temática XVc. Biocorrosión, p. 8. • WARAKSA C. C., G. CHEN AND D. D. MACDONALD, (2003), EIS Studies of Porous OxygenElectrodes with Discrete Particles II. Transmission Line Modeling, Journal of The

Electrochemical Society, 150, 9, p. 429-437

95

• WATERS M. CHRISTOPHER, BONNIE L. BASSLER. (2005). QUORUM SENSING: Cell-to-Cell Communication in Bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology, Vol. 21, Pages 319-346

• WATNICK P., KOLTER, R. (2000). Biofilm, City of Microbes, Journal of Bacteriology, Vol. 182, No. 10, p. 2675-2679. • WOLFE R. S. (1971). Microbial Formation of Methane, Adv. Microbiol. Physiol., Vol.6, pp.107-146. • ZUO R., ÖRNEK D., SYRETT B. C., GREEN R. M., HSU C.-H., MANSFELD F. B., WOOD T. K. (2004). Inhibiting Mild Steel Corrosion from Sulfate-Reducing Bacteria using Antimicrobial-Producing Biofilms in Three-Mile-Island Process Water, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64, p. 275–283.

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