guia de microbiologia practicas 2014.pdf

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS

DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGIA

GUIA DE PRÁCTICAS

DE

MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA GENERAL Y ESTOMATOLOGICA

DOCENTES:

BLGO. CHAVEZ SALAS, IVONNE

BLGO. RONDON CHAMBI, ROMINA

BLGO. VASQUEZ BEZADA, GEORGE

AREQUIPA – PERU

2014

Facultad de Medicina Humana y Ciencias de la Salud Escuela Profesional de Estomatología Cátedra de Microbiología y Parasitología General y Estomatológica Msc. Blgos: Chávez Salas, Ivonne, Rondón Chambi, Romina y Vasquez Bezada, George

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MANUAL DE PRACTICAS

CONCEPTOS Y APLICACIONES

NOMBRES : __________________________________________________

MATERIA : MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA GENERAL

Y ESTOMATOLOGICA

AÑO : II° SEMESTRE: III

ESCUELA : PROFESIONAL Y ACADEMICA DE ESTOMATOLOGIA

FACULTAD : MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

UNIVERSIDAD : ALAS PERUANAS – FILIAL AREQUIPA

DIRECCION : ___________________________________________________

TELEFONO : ___________________________________________________

E-MAIL : ___________________________________________________

FECHAS DE EXAMENES:

TEORIA PRACTICAS

_____________________ ______________________________

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INDICE

Práctica 1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA _______________4

Practica 2. MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA ____________9

MICROSCOPIA

Practica 3. ESTERILIZACION Y DESINFECCION DEL MATERIAL DE LABORATORIO _________________15

Practica 4. TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS _________________________24

Práctica 5. MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICO (clasificación, preparación y usos) ____________33

Práctica 6. SIEMBRA, AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS _____________________________36

Práctica 7. ANTIBIOGRAMA ___________________________________________________________48

Práctica 8. REACCIONES SEROLOGICAS __________________________________________________55

Práctica 9. IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS ________________________________58

Práctica 10. IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS _______________________________60

Práctica 11. METABOLISMO BACTERIANO ________________________________________________62

Práctica 12. IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS __________________________________________69

Practica 13 METODOS DE DIAGNOSTICO EN MICOLOGIA____________________________________72

Practica 14 DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO______________________________________________76


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PRACTICA 1

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Una de las responsabilidades más importantes que tiene el personal del área de salud es el de controlar y prevenir las infecciones hospitalarias, ya sea en los pacientes internados o a sí mismos.

Es necesario actuar con conciencia en la manipulación de materiales y equipos que se utilizan en los distintos procedimientos ya que pueden ser potenciales portadores de agentes infecciosos y además tomar todas las precauciones de barrera en el tratamiento de los pacientes y el manejo de los materiales con ellos utilizados, como así también el material orgánico que provenga de los pacientes (sangre, orina, etc.).

Esto es importante también en la etapa corno estudiantes de enfermera, donde estarán en contacto con agentes patógenos, por lo tanto deben conocer a la perfección las Normas de Bioseguridad en un hospital y en el laboratorio.

BIOSEGURIDAD

El objetivo general de Bioseguridad es minimizar el riesgo potencial de accidentes laborales en el manejo de los residuos patogénicos. El conjunto de medidas, normas y procedimientos destinados a minimizar y/o controlar dicho riesgo biológico es la Bioseguridad, quedando claro que el riesgo cero NO EXISTE.

Debe entenderse como una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la salud de adquirir infecciones en el medio laboral. Compromete también a todas aquellas otras personas que se encuentran en el ambiente asistencial, ambiente éste que debe estar diseñado en el marco de una estrategia de disminución de riesgos.

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A. UNIVERSALIDAD: Las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los servicios, independientemente de conocer o no su serología. Todo el personal debe seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las personas, independientemente de presentar o no patologías.

B. USO DE BARRERAS: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente.

C. MEDIOS DE ELIMINACIÓN DE MATERIAL CONTAMINADO: Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en la atención de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo.

LIQUIDOS POTENCIALMENTE INFECTANTES:

1. Sangre. 2. Semen. 3. Secreción vaginal. 4. Leche materna. 5. Líquido cefalorraquídeo. 6. Líquido sinovial.

7. Líquido pleural. 8. Líquido amniótico. 9. Líquido peritoneal.

10. Líquido pericárdico. 11. Cualquier otro liquido contaminado con sangre.

PRECAUCIONES ESTANDAR INCLUYEN:

1. Barreras de protección: Lavado de manos, Guantes, Barbijo, Lentes y Mandil. 2. Desinfección y esterilización. 3. Manejo y eliminación de desechos. 4. Ventilación e iluminación adecuada. 5. Limpieza y desinfección de ambientes. 6. Clasificación y distribución de pacientes hospitalizados.


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7. Prevención de accidentes ocupacionales

OBJETIVOS:

1. Conocer y aplicar las normas de Bioseguridad de un laboratorio de Microbiología y Parasitología.

2. Conocer y aplicar las normas de Bioseguridad como estudiantes de enfermería en un Centro Asistencial.

3. Reconocer los materiales de un laboratorio de Microbiología y Parasitología, así como el manejo y uso de los mismos.

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD.

Mantener el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.

Deberán ser utilizadas las cocinetas designadas por el hospital para la preparación y el consumo de alimentos, no es permitido la preparación y consumo de alimentos en las áreas asistenciales y administrativas.

No guardar alimentos en las neveras ni en los equipos de refrigeración de sustancias contaminantes o químicos.

Las condiciones de temperatura, iluminación y ventilación de los sitios de trabajo deben ser confortables.

Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales deben aplicarse con todos los pacientes independientemente del diagnóstico, por lo que se hace innecesario la clasificación específica de sangre y otros líquidos corporales como "infectada o no infectada".

Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno.

Utilice en forma sistemática guantes plásticos o de látex en procedimientos que conlleven manipulación de elementos biológicos y cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atención de pacientes. Hacer lavado previo antes de quitárselos y al terminar el procedimiento.

Utilice un par de guantes nuevos por paciente.

Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte de su cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.

Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras o gotitas aerosoles de sangre u otros líquidos corporales.

Use delantal plástico en aquellos procedimientos en que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros líquidos orgánicos.

Evite deambular con los elementos de protección personal fuera de su área de trabajo.

Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.

Utilice equipos de reanimación mecánica, para evitar el procedimiento boca-boca.

Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.

Si presenta alguna herida, por pequeña que sea, cúbrala con esparadrapo o coritas.

Mantenga actualizado su esquema de vacunación contra Hepatitis B.

Las mujeres embarazadas que trabajan en ambientes hospitalarios expuestas a factor de Riesgo Biológico de transmisión parenteral deberán ser muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y, cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en áreas de menor riesgo.

Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia necesarias. Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.

Maneje con estricta precaución los elementos cortopunzantes y deséchelos en lugares destinados para estos en cada servicio. Los basureros deberán estar firmemente sujetos de tal manera que pueda desechar las agujas halando la jeringa para que caigan entre el recipiente, sin necesidad de utilizar para nada la otra mano.


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Cuando no sea posible la recomendación anterior, evite desenfundar manualmente la aguja de la jeringa. Deseche completamente la jeringa.

No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a ota-V.

Absténgase de doblar o partir manualmente la hoja de bisturí, cuchillas, agujas o cualquier otro material cortopunzante.

Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bisturí.

Todo equipo que requiera reparación técnica debe ser llevado a mantenimiento, previa desinfección y limpieza por parte del personal encargado del mismo.

El personal del área de mantenimiento debe cumplir las normas universales de prevención y control del factor de riesgo Biológico.

Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo, al final de cada procedimiento y al finalizar la jornada de acuerdo a el proceso descrito en el manual de limpieza y desinfección.

En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros líquidos corporales sobre superficies de trabajo. Cubra con papel u otro material absorbente, luego vierta hipoclorito de sodio a 5000 partes por millón sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.

En caso de ruptura del material de vidrio contaminado con sangre u otro liquido corporal los vidrios se deben recoger con escoba y recogedor-, nunca con las manos

Los recipientes para transporte de muestras debe ser de material irrompible y cierre hermético. Debe tener preferiblemente el tapón de rosca

Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes herméticos de plástico o acrílicos que detengan fugas o derrames accidentales. Además deben ser fácilmente lavables.

En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe lavarse con hipoclorito de sodio a 1000 partes por millón y secarse.

En las áreas de alto riesgo biológico el lavamos debe permitir accionamiento con el pié, la rodilla o el codo.

Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal necesarios y a los niños.

La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material orgánico debe ser enviado a la lavandería en bolsa plástica roja.

Disponga el material patógeno en las bolsas de color rojo, rotulándolas con el símbolo de riesgo biológico

En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el autoreporte inmediato del presunto accidente de trabajo.

Los trabajadores sometidos a tratamiento con inmunosupresores no deben trabajar en áreas de alto riesgo biológico.

REGLAS GENERALES DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA:

1. El uso del mandil blanco es obligatorio para la asistencia a las sesiones prácticas, el cual debe ser largo y estar abotonado.

2. No se permite el ingreso al laboratorio de alumnas (os) con sandalias o falda.

3. Para los alumnos(as) con cabello largo debe ser recogido antes de colocarse el gorro.

4. No se permite comer ni beber en el laboratorio.

5. Evite Llevarse objetos a la boca (lapiceros, dedos, cuadernos, etc.) durante su permanencia en el laboratorio.


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6. Lávese las manos las manos con agua y jabón al término de cada sesión de práctica.

7. Si por accidente se derrama un cultivo de microorganismos, ocurre algún accidente inesperado, hágalo saber inmediatamente al profesor.

8. No ponga sobre la mesa de trabajo: útiles, prendas, etc., colóquelos en un lugar designado para ello.

9. Al concluir la práctica DEJE SIEMPRE EL MICROSCOPIO CON LOS OBJETIVOS LIMPIOS DE ACEITE DE INMERSIÓN Y CON EL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO.

10. Tanto el ambiente como la mesa al finalizar el trabajo debe dejarlo limpio y los asientos deben estar encima de la mesa.

ACTIVIDADES.

1. Traer para todas las sesiones de prácticas:

INDIVIDUAL: MESON:

Mandil. 1 Encendedor. 3 agujas descartables.

Gorro. 1 Frasco de jabón líquido. 3 lancetas.

Guantes. 1 Alcohol 95° (1 litro). 1 plumón de tinta indeleble.

Barbijo, tapaboca. 1 Alcohol de 70° (1 litro). 3 jeringas de 5 ml.

Mechero. 1 Bolsa de algodón de 100 grs. 1 rollo cinta maskin tape.

Toalla individual (campo). 1 metro de gasa. 1 pinza de acero inoxidable

Guía de prácticas. 1 Tijera. 1 rollo de pabilo.

Zapatos cerrados de cuero. 30 hisopos largos. Lápiz de cera o marcad or.

SALON: CADA 2 PERSONAS:

1 botella de lejía. 1 pliego de papel kraff

2 o 3 pulverizadores. 1 rollo de papel toalla.

1 caja de portaobjetos.

1 caja de cubreobjetos.

1 paquete de bolsas rojas.

2. Observe y manipule cuidadosamente materiales de laboratorio que-estén sobre la mesa de trabajo.

Pipetas graduadas (1 ml, 5ml, 10ml.).

Pipetas Pasteur.

Placas Petri.

Tubos de ensayo.

Asas de microbiología.

Mechero de alcohol.

Matraz.

Probeta.

Estufa u horno.

Autoclave u olla a presión.

Termómetro ambiental.

Gradillas.

Pinzas.

Porta láminas.

Láminas portaobjetos - Láminas cubreobjetos.

Aceite de inmersión.

Microscopio óptico.

Campo.

Lápiz de cera.

Batería de coloración de Gram.

3. Traer para la siguiente sesión de práctica lo indicado por los profesores.


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CUESTIONARIO.

1. Que comprende la bioseguridad? 2. Cuáles son los principios de la bioseguridad? 3. A que se llama accidente de exposición a sangre o fluidos corporales? 4. Que tipos de fluidos humanos conoce que puedan transmitir contagio? 5. Cuáles son las precauciones estándares o universales en bioseguridad? 6. En qué momento se recomienda el lavado de manos para prevenir contaminaciones cruzadas? 7. Que artículos conoce para protección contra contaminación? 8. Que precauciones se deben tomar durante los procedimientos invasivos? 9. Como se procede con la ropa contaminada?

10. Cuáles son las recomendaciones prácticas para desarrollar tareas vinculadas a la atención del paciente con referencia a bioseguridad?

11. Como se descontaminan los utensilios de uso con el paciente ?(pinzas, espejos, hisopos, etc) 12. Como se descartan y donde, los materiales de curación usados ?(Gasas y corto punzantes )


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PRACTICA 2

MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN

EL LABORATORIO DE MICROBILOGIA

I MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA.

En un laboratorio de Microbiología y Parasitología se utilizan una serie de materiales:

A. Materiales químicos, colorantes tales como los de la coloración de Gram, cristal violeta y Safranina. Indicadores como el rojo fenol; reactivas y soluciones como lugol, alcohol, fenol y acido acético además de medios de cultivo como el caldo peptonado.

B. Materiales de vidrio, como tubos de ensayo, placas petri, probetas, matraz, pipetas, mechero y laminas portaobjetos y cubreobjetos.

C. Materiales varios, como escobillas, papel indicador de Ph, gradillas, lápiz de cera y papel filtro.

D. Equipos como estufas, autoclave, termómetro, centrifuga, microscopio óptico y de fluorescencia.

Los materiales básicos son:

Tubo de ensayo: Ahí se observan las reacciones de las sustancias que se depositan en él. Los hay de diferentes medidas y también sirven para preparar cultivos de bacterias y hongos.

Caja de Petri: En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias; también puede usarse para seleccionar muestras de animales.

Embudo: Es útil para separar sustancias por medio de filtración y para evitar su desperdicio o derramamiento al ser cambiadas de un recipiente a otro.

Portaobjetos: Son laminillas de cristal planas pero también pueden ser cóncavas, en ellas se depositan sustancias para su observación.

Cubreobjetos: Cubren y protegen las preparaciones u objetos que se observarán al microscopio e impiden que se desprendan o muevan al ser observados.

Lupas: Son lentes convexos para la observación detallada de objetos pequeños; como partes de plantas, insectos, etcétera.

Lámpara de alcohol: Se emplea como fuente de calor cuando se requiere calentamiento lento. Al usarla debe cuidarse que la mecha esté limpia y recortada para que el calor que proporcione sea adecuado

Vidrio de reloj: Sobre él se depositan sustancias en pequeña cantidad. Son útiles para cubrir vasos de precipitados y para colocar en agua cortes transversales muy delgados, los cuales, serán seleccionados con una aguja de disección para ser observados al microscopio.

Mechero de gas: Se emplea para el calentamiento rápido de sustancias.

Microscopio: Hace visibles al ojo humano objetos diminutos. Es de suma importancia en un laboratorio. Con él se han hecho avances notables en medicina, química, biología, etcétera.

Mortero: Sirve para moler, triturar sólidos o mezclar dos o más sustancias sólidas.

Estuche de disección: Contiene bisturí, agujas de disección, pinzas, tijeras, etcétera.

Beaker: Se usan para preparar, disolver o calentar directamente sobre rejillas o planchas de calentamiento

Matraz Erlenmeyer: Se utiliza para montar sistemas generadores de gases

Matraz Aforado: Sirve para preparar volúmenes exactos de concentraciones

Bureta: Son tubos de vidrios calibrados que suelen terminar en una llave y sirven para medir volúmenes de líquidos con mayor precisión y exactitud.


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Termómetro: Con él se mide la temperatura a diversas sustancias reaccionantes (reactivos).

Balanza: Con ella se conoce el peso de objetos

Baño María: Es un dispositivo que permite calentar sustancias en forma indirecta, es decir, sustancias que no pueden ser expuestos a fuego directo.

Vasos de precipitados: Permite calentar sustancias y obtener precipitados de ellas.

Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar líquido.

Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volúmenes exactos de soluciones

Agitador: Se usa para agitar mezclas reactivas y como accesorio en el trasvase de líquidos

Cápsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar líquidos, fundir cristalizar sólidos

Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir sólidos.

Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar sólidos.

Espátula: Sirve para trasegar sólidos y tomar nuestras de sólidos.

Soporte universal: Pieza básica en el montaje de los sistemas y aparatos como pinzas y anillos de metal

Rejilla de Metal con Centro de Asbesto: Sirve para calentar indirectamente ya que la llama del mechero se concentra en el anillo.

Trípode: Soporte de vaso de precipitado, matraces, etc

Pinza para soporte universal: Sirve para sujetar instrumentos en el montaje de sistemas

Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo.

II MICROSCOPIA.

Es una de las herramientas más utilizadas en la microbiología y es la que permitió el desarrollo de esta ciencia. La habilidad en el manejo del microscopio es muy importante en la identificación de los microorganismos. Los pasos básicos en el manejo del microscopio son la iluminación, el enfoque y la observación de las preparaciones. El microscopio posee dos clases de objetivos, el objetivo seco interpone el aire entre la lente frontal y la superficie de la muestra (laminilla). Estos objetos pueden ser de


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2, 5, 10 y 40 aumentos; el objetivo húmedo o de inmersión usa un liquido transparente (aceite de inmersión) y permite aprovechar la mayor cantidad de luz (100 a 120 aumentos). El tamaño final de la imagen se puede calcular multiplicando el valor del lente objetivo por el del ocular usado y se expresa en diámetros o aumentos.

OBJETIVOS:

1. Reconocer los materiales de un laboratorio de Microbiología y Parasitología, así como el manejo y uso de los mismos.

2. Lograr destreza en el manejo del microscopio óptico.

MATERIALES:

Pipetas graduadas (1 ml, 5ml, 10ml.)

Pipetas Pasteur

Placas Petri.

Tubos de ensayo.

Asas de microbiología.

Mechero de alcohol.

Matraz.

Probeta.

Estufa u horno.


Termómetro ambiental.

Gradillas.

Pinzas.

Porta láminas.

Láminas portaobjetos - Láminas cubreobjetos.



Campo.

Lápiz de cera.

Batería de coloración de Gram.

PROCEDIMIENTO:

A. Observe y manipule cuidadosamente materiales de laboratorio que estén sobre la mesa de trabajo.

B. Reconocer y rotular en la figura las partes del microscopio.

C. Observe una muestra de agua estancada y de mucosa oral siguiendo correctamente las siguientes instrucciones de manejo del microscopio:

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo micrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo, de la preparación con el micrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina y subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de X40.

c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.


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e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

g. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay croe bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

h. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.

i. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

ACTIVIDADES:

1. Esquematice los materiales de laboratorio observados e indique cual es su función.

2. Identifique y esquematice las muestras observadas en el microscopio, rotulando correctamente el esquema.


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MUESTRA:………………………………….

COLORACION:…………………………….

AUMENTO:…………………………………

OBSERVACION:…………………………..

MUESTRA:………………………………….


AUMENTO:…………………………………


MUESTRA:………………………………….


AUMENTO:…………………………………


MUESTRA:………………………………….


AUMENTO:…………………………………



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CUESTIONARIO.

1. Características del material de vidrio utilizado en el laboratorio de microbiología 2. ¿Qué recipientes son indicados para someterlos al calor y cuáles no? 3. Cuáles son las características y parámetros de una buena cámara de siembra? 4. Que es una micropipeta, cuando y como se usa? 5. Mencione los materiales necesarios para pesar 5 g de una medio de cultivo en polvo. Mencione 2

precauciones a tomar en cuenta.


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PRACTICA 3

ESTERILIZACION Y DESINFECCION

DEL MATERIAL DE LABORATORIO

INTRODUCCION:

No se puede hablar de esterilización sin considerar el concepto de microorganismo. Un microorganismo es un agente microscópico vivo e imperceptible a los sentidos que generalmente está agrupado en colonias, aunque bien puede estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se desarrolla en un medio apropiado para formar colonias perceptibles. Los microorganismos pueden ser patógenos (productores de ciertas enfermedades) o banales (los habitualmente hallados en los alimentos, el aire, el polvillo ambiental), que no perjudican al hombre.

El hecho de que existan distintos tipos de gérmenes en el medio ambiente, crea grandes dificultades en los estudios bacteriológicos, cuando es necesario obtener las especies microbianas en estado de pureza, ya que tanto el instrumental como los medios de cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del medio ambiente.

Con el fin de subsanar estos inconvenientes se practica la esterilización, procedimiento que consiste en destruir todos los gérmenes vivos que existan sobre los objetos o sustancias que se desean libre de ellos (asépticos).

Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes, que son los resistentes al frío y termorresistentes o resistentes a las altas temperaturas, aunque la clasificación más común es por la temperatura a la que se reproducen. Así se los puede clasificar en Criófilos (-5 a 14 °C); Mesófilos (25 a 47 °C) y Termófilos (50 hasta 113 °C). Por ejemplo, muchos hongos se destruyen con la temperatura, pero sus esporas aún son viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes y humedad, se reproducen. Por tal motivo la tecnología para su destrucción debe considerar éstas variables.

ESTERILIZACIÓN: Esta operación comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y

químicos, que se emplean para destruir, inactivar o retener gérmenes en general y patógenos en particular. A través de esta, los materiales de laboratorio para determinados diagnósticos y los elementos quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.

DESINFECCION: No se destruyen todos los microorganismos, dependiendo del desinfectante, pueden

sobrevivir algunas formas resistentes y permanecer relativamente viables. No obstante, los términos esterilización y desinfección se utilizan indistintamente.

CLASES DE ESTERILIZACION:

A. MÉTODOS FÍSICOS:

1. Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura.

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

a. Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirúrgicos o jeringas hipodérmicas para esterilizarlas. El agua a 100 °C no garantiza una adecuada esterilización, no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a ésta temperatura.

Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos años para esterilizar jeringas de vidrio y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de bronce ó en el mejor de los casos, platino, hirviéndolos en agua.

b. Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

http://www.monografias.com/trabajos10/teca/teca.shtml

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http://www.monografias.com/trabajos/celula/celula.shtml


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Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias líquidas).

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen o con alcohol con el objeto que se desea esterilizar. Cuando éste es de metal se deja permanecer en el área de reducción de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc). Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio aséptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la esterilización nunca es perfecta.

Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los objetos en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire interior a una temperatura entre 150 y 190 °C. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de Pasteur, que luego se sustituyó por estufas de aire caliente. Estas constan de una doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas variables, siendo la más aconsejadas 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados de par bimetálico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatación. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la resistencia calefactora.

Ventajas del calor seco:

No es corrosivo para metales e instrumentos.

Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas:

Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

c. Calor Húmedo: Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión en autoclave. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

El equipo consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave: Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal.

Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.

Atmósferas Grados Centígrados

0 100

http://www.monografias.com/trabajos16/lipidos/lipidos.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/vidrio/vidrio.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/volfi/volfi.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/restat/restat.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/coma/coma.shtml

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http://www.monografias.com/trabajos/seguinfo/seguinfo.shtml


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1/2 112

1 120

1 1/2 128

2 135

Este proceso de esterilización es el que mejor resultados dá en microbiología. El vapor de agua a fuerte presión actúa a mayores temperaturas:

Tiempos de esterilización en autoclave: Del tiempo, temperatura y presión usadas en la esterilización depende el éxito alcanzado. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados, y el único factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su textura, porosidad, y otras características propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirúrgico necesitan más. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilización de 250ºF (121ºC) a 15-20 PSI.

Guantes de Caucho (Hule). 15 minutos.

Sondas (base tejida). 15 minutos.

Sondas (látex). 15 minutos.

Frascos de Vidrio, Cristalería en General. 20 minutos.

Agua en frascos. 20 minutos.

Jeringas de Vidrio. 20 minutos.

Bandeja. 30 minutos.

Equipo de transfusión. 30 minutos.

Paquetes de maternidad. 30 minutos.

Ropa. 30 minutos.

Torundas. 30 minutos.

Paquete quirúrgico. 45 minutos.

Instrumental de acero inoxidable. 45 minutos.

Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que haya buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización. Ej.: lencería y vidrio.

El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.

Como Cargar el Autoclave:

Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).

Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. También facilita el secado.

Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.

Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.

La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba).

Ventajas del calor húmedo:

Rápido calentamiento y penetración

Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo

No deja residuos tóxicos

Hay un bajo deterioro del material expuesto

Económico

http://www.monografias.com/trabajos14/administ-procesos/administ-procesos.shtml#PROCE

http://www.monografias.com/trabajos14/microbiol-historia/microbiol-historia.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/llave-exito/llave-exito.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/basda/basda.shtml

http://www.monografias.com/trabajos35/caucho-sbr/caucho-sbr.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/hidra/hidra.shtml#fa

http://www.monografias.com/trabajos15/mantenimiento-industrial/mantenimiento-industrial.shtml

http://www.monografias.com/trabajos12/dispalm/dispalm.shtml

http://www.monografias.com/trabajos901/debate-multicultural-etnia-clase-nacion/debate-multicultural-etnia-clase-nacion.shtml

http://www.monografias.com/


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Desventajas:

No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

d. Tyndalización: Método de esterilización en el que el calor se utiliza intermitentemente, dejando un tiempo entre dos calentamientos para permitir el desarrollo de las esporas que son destruidas más fácilmente en el siguiente calentamiento.

Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall. Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.

Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

2. Filtración: Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse, la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede efectuarse mediante presión o aspiración.

Se basa en el pasaje de líquidos a través de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de paredes de espesor variable.

En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar

http://www.monografias.com/trabajos14/soluciones/soluciones.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/termodi/termodi.shtml#teo

http://www.monografias.com/trabajos11/tebas/tebas.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/virus/virus.shtml


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aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

B. MÉTODOS QUÍMICOS: Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

En comparación con los procedimientos físicos, estos métodos tienen una importancia secundaria. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que, al actuar sobre los gérmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre todas las células, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros actúan sobre algunas especies bacterianas, mostrándose como venenos específicos. Este método es óptimo para la antisepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir gérmenes que puedan caer en lugares de trabajo.

Agentes químicos: La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antisépticos útiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).

Estufas de esterilización por óxido de etileno: Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos, incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro artículos de goma, plástico, metal, madera, lana, piel, papel, productos farmacéuticos.

El óxido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetración, efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable se mezcló con CO2 en una proporción de 7,15 veces el volumen de óxido de etileno.

El tiempo de esterilización que requiere el material depende de múltiples variables, el vacío que se produce, la humedad, la concentración del gas expresado en gs./l y la temperatura, es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposición requerido.

El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de líquido a gas a 10º C.

Todos los artículos deberán airearse por 6 hs. después de una esterilización.

El Óxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.

Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plástico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.

Con aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas.

Glutaraldehído: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.

Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

Antisépticos

Alcoholes

Iodo

Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros

Órgano Mercuriales

Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro y Compuestos clorados

Aldehídos

Óxido de Etileno

Compuestos Fenólicos

Ácidos y Álcalis

Formaldehido: Se utilizan las pastillas de paraformaldehído, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en Estufas de Formol, llamadas también de formalina, que son cajas de doble fondo, en cuya base se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma, plásticos, etc.

http://www.monografias.com/trabajos13/ladrogcc/ladrogcc.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/lasvitam/lasvitam.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/celula/celula.shtml

http://www.monografias.com/trabajos34/el-trabajo/el-trabajo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/cani/cani.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/plasti/plasti.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/transformacion-madera/transformacion-madera.shtml

http://www.monografias.com/trabajos12/elproduc/elproduc.shtml

http://www.monografias.com/trabajos35/el-poder/el-poder.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/grupo/grupo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos16/industria-ingenieria/industria-ingenieria.shtml


http://www.monografias.com/trabajos14/bombas/bombas.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/enzimo/enzimo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos29/algodon-peruano/algodon-peruano.shtml#intro



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Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:

1. Preparar el material de laboratorio antes de ser esterilizados o desinfectado.

2. Adquirir experiencia en aplicar métodos de esterilización y desinfección utilizando distintos agentes.

MATERIALES:

Material de laboratorio: pipetas, placas petri, tubos de ensayo, frascos u otros materiales de vidrio.

Asas microbiológicas.

Estufa u horno.


Mechero de Bunsen o alcohol.

Alcohol etílico, alcohol yodado, isodine, fenol, hipocloritos, ácido paraacético.

Medios de cultivo sólidos y líquidos.

Agua destilada.

Papel filtro.

Papel kraff.

Gasa.

Algodón.

Pabilo.

Detergente, cepillo.

Lápiz de cera.

PROCEDIMIENTO:

I PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO.

Para conservar la asepsia se debe preparar previamente el material antes de ser esterilizado:

Lavar y cepillar con detergente todo el material y darle el primer enjuague con agua de caño.

Posteriormente enjuagarlo con agua destilada y secarlo externamente con papel toalla.

A. ELABORACIÓN DE TAPONES DE ALGODÓN.

Los tapones son utilizados en los diferentes tamaños de tubos y matraces.

1. Tapón para matraz de 500 ml.:

Recortar una tira de algodón de (15 —20 cm. de largo, 3 cm. de ancho y un grosor de 0.5 cm.) aproximadamente.

Envolver este algodón con una gasa de 10 x 10 cm. presionando con los dedos para que quede duro y amarrar con pabilo fuertemente.

Luego probar en la boca del matraz de tal manera que quede el tamaño exacto y no caiga hacia dentro del matraz.


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2. Tapón para tubo de ensayo:

Se corta una tira de algodón, de largo adecuado al tamaño de la boca del tubo.

Con una pinza de disección se prensa uno de los extremos.

Se enrolla el algodón en la pinza, de una manera que quede firme el enrollado.

Por otro lado, se corta el cuadro de gasa adecuado al tamaño requerido y se amarra con pabilo fuerte, luego probar que no caiga hacia dentro del tubo.

B. PREPARACIÓN PARA LA ELABORACIÓN DE LOS GORROS:

Para tener una base para el cálculo del gorro tenemos que cortar un cuadrado de 30 X 30 cm aproximadamente de papel Kraff, se obtiene un gorro adecuado para tapar un matraz de 500 ml.

Pasos:

Se dobla el papel por la mitad el cuadrado y se obtendrá un rectángulo vuelva a doblar y será un cuadrado con 4 puntas. Luego se doblan las puntas de encima de ambas caras (superior e inferior) y las puntas restantes (medio) se doblan dentro de la cavidad que quedó al doblar las primeras puntas. Finalmente se abre el gorro, se coloca encima de la boca del matraz, cubriendo el tapón y se asegura con pabilo por encima.

C. PREPARACIÓN Y ENVOLTURAS DE PIPETAS:

Se lavan perfectamente con agua y detergente. Se enjuaga con la pizeta de agua destilada.

Se coloca un pequeño tapón de gasa o algodón en la boquilla de la pipeta dejando un trozo libre para que el taponcito no se quede perdido dentro de la pipeta, Este tapón tiene una doble función, una es para evitar que en un descuido de succión forzada, por. obstrucción de la pipeta, ingiera el alumno el producto succionado al destaparse bruscamente, y1a segunda razón es para evitar que por la boquilla de succión entren microorganismos que alteren el trabajo realizado.

Se corta una tira de papel crack de aproximadamente 5 cm de ancho y 30 cm de largo.

Se dobla el extremo inferior aproximadamente 2 cm. Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior y con un ángulo de aproximadamente 25 - 30 grados de inclinación con respecto a la posición del papel crack. Se le hace un segundo doblez, tapando la punta de la pipeta con la porción de papel que sobresale a la punta de la pipeta. Se le hace un tercer doblez a la punta de la pipeta que queda en el ángulo de inclinación.

Se dá vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolviéndola en forma de espiral. Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con respecto a la forma de la pipeta. En la parte superior, doblar hacia abajo el papel sobresaliente.

Cubrir con cinta adhesiva dicho doblez.


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Rotular indicando el volumen de la pipeta.

D. PROCEDIMIENTO PARA LA ENVOLTURA DE PLACAS PETRI:

Al utilizar placas Petri en los cultivos microbianos, tienen que ser esterilizadas para poder vaciar dichos medios de cultivo que servirán de nutriente a los microorganismos tratados. Estas placas se pueden esterilizar por calor húmedo o calor seco, siendo más recomendable el calor seco, por ser más confiable su efectividad.

Es necesario envolver placas Petri antes de esterilizarlas para evitar que al término de la esterilización estén expuestas al medio ambiente y se contaminen, de nuevo.

Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilíndrico de metal o envolviéndolas en papel

Kraff.

La manera de envolver las placas se describe a continuación: Se corta un cuadrado de papel Kraff de aproximadamente 20 X 20 cm, se coloca una de las tapas en el centro y se lleva las puntas hacia el centro, presionando para reducir el volumen del papel.

E. A LOS FRASCOS TAMBIÉN COLOCAR TAPONES DE CORCHO O CON GASA Y SE CUBRE CON PAPEL.

F. OTROS MATERIALES DE VIDRIO SE TAPONAN CON ALGODÓN O PAPEL ALUMINIO Y SE CUBREN CON PAPEL KRAFF.

G. EL INSTRUMENTAL TAMBIÉN SE ENVUELVE CON PAPEL ALUMINIO O PAPEL KRAFF.

II ESTERILIZACIÓN FÍSICA.

A. POR CALOR SECO:

1. Esterilizar a la llama directa de un mechero. Es en forma breve y temporal. Se esteriliza asas microbiológicas u otro material que contenga directamente material biológico.

2. Esterilizar por aire caliente, utilizando una estufa u horno de esterilización, se realiza a una temperatura de 165° - 170° C durante media hora. Se esteriliza material de vidrio, porcelana, instrumental.

B. POR CALOR HÚMEDO:

1. Autoclavar a 121 'C durante 15 minutos y a presión superior a la atmosférica (15 libras de presión). Se pueden esterilizar material de vidrio, medios de cultivo, material biológico.

2. Esterilizar el instrumental utilizando un recipiente con agua en ebullición.

C. POR FILTRACIÓN: Se realiza para medios líquidos, los microorganismos y micelas orgánicas son retenidas en el papel filtro o gasa.

D. POR CENTRIFUGACIÓN: Se puede emplear previo a la filtración, separa los gérmenes del líquido en que se encuentran suspendidos.

III ESTERILIZACIÓN QUÍMICA.

1. Pasar un algodón o gasa empapado de alcohol, alcohol yodado. fenol o isodine sobre toda la superficie del instrumental.

2. Alternativamente, remojar por 20 minutos el material biológico o instrumental en hipoclorito de sodio al 5%, luego enjuagar en agua destilada por tres veces.


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ACTIVIDADES:

1. Explique el fundamento de cada uno de los tipos de esterilización.

2. Describa el efecto sobre los microorganismos de cada uno de los tipos de esterilización.

CUESTIONARIO: 1. ¿Qué método de esterilización utilizaría para desinfectar su instrumental si se encuentra en alejado de la

ciudad?. 2. ¿Cuál es la diferencia entre los métodos de ebullición y autoclavado?. 3. ¿Qué sustancia química es más eficiente para la desinfección de tejidos vivos?. 4. ¿Qué es un desinfectante, cuál es su mecanismo, y cuál es su importancia en el laboratorio de

microbiología? 5. ¿Cuáles son los diferentes efectos que se producen sobre los microorganismos sometidos a procesos de

esterilización? 6. En qué lugares se aplica la esterilización con luz ultravioleta? Qué cuidados debe tenerse en cuenta con

el empleo de la luz ultravioleta? 7. ¿Qué tipo de materiales se deben esterilizar con filtros? 8. ¿Cuál es la diferencia entre esterilización, desinfección y asepsia? 9. ¿Cuáles son los efectos nocivos que provocan los desinfectantes sobre los microorganismos?

10. ¿Cuáles son las condiciones óptimas de esterilización por calor húmedo?, se pueden modificar estos parámetros, sin afectar la eficacia de la esterilización. Explica cómo.


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PRACTICA 4

TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

MICROBIOLOGICAS

INTRODUCCION.

Las funciones más importantes del laboratorio de Microbiología Clínica Medica son examinar y cultivar

muestras en busca de microorganismos, identificar con certeza especies involucradas en aislamientos

importantes y llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibióticos en caso de ser indicadas.

CICLO DIAGNOSTICO. En el siguiente cuadro se muestra el ciclo de diagnostico microbiológico.

Paciente consulta al medico con

signos/sintomas de enfermedad

infecciosa

El medico examina al paciente y

formula un diagnostico clínico

presuntivo

El medico interpreta el informe e

instaura la terapia apropiada

La muestra apropiada es tomada

para cultivo. Todos los recipientes

son rotulado correctamente

Se prepara el informe final y se

envia al medico tratante

Al recibir la muestra en el

laboratorio, se transcriben los

datos a un libro de registro o

computadora

Se examina los subcultivos y

resultados de los sistemas de

identificacion

La muestra es examinada

directamente. Pueden prepararse

o no montajes para microscopio,

extendidos y tinciones

Luego de la incubación, los

cultivos son examinados. Se

preparan sistemas de

identificación definitiva

Las muestras son procesadas.

Los medios de cultivo son

seleccionados, inoculados e

incubados

I TOMA DE MUESTRA:

La toma apropiada de una muestra para cultivo es posiblemente el paso más importante en la confirmación final de que un microorganismo es responsable de un proceso de enfermedad infecciosa. Una muestra mal tomada no solo puede resultar en la recolección fallida de microorganismos importantes, sino también conducir a una terapia equivocada y aun dañina si el tratamiento es dirigido hacia un comensal o contaminante.

Se debe tomar en cuenta las siguientes consideraciones para la toma de muestras:


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1. La muestra debe ser de material del sitio real de infección, y tiene que ser tomada con el mínimo de contaminación de los tejidos, órganos o secreciones adyacentes.

2. Debe establecerse los momentos óptimos para la toma de muestras, a fin de contar con las mejores oportunidades de recuperación de microorganismos causantes de enfermedad. El conocimiento de la historia natural de la enfermedad y de la fisiopatología del proceso de enfermedad infecciosa es importante para la determinación del momento óptimo de recolección de la muestra.

3. Debe obtenerse una cantidad de muestra suficiente para llevar a cabo las técnicas de cultivo solicitadas.

4. Debe utilizarse una serie adecuada de dispositivos de recuperación, envases para muestras y medios de cultivo. Para la toma de la mayoría de muestras deberían usarse recipientes de cultivo. También es importante que el recipiente facilite la toma, particularmente si el paciente debe obtener su propia muestra. Ejemplo botellas de boca ancha para muestras de esputo y orina. Los recipientes deben tener tapas herméticas para evitar derrames o contaminaciones durante el transporte.

5. Siempre que sea posible obtener los cultivos antes de la administración de antibióticos.

6. El recipiente de cultivo debe estar adecuadamente rotulado.

1. TOMA DE MUESTRAS DE FARINGE: La faringitis aguda es la infección más común del tracto respiratorio superior. Entre las causas más comunes deben considerarse los estreptococos, los virus y la difteria. Para obtener la muestra de hisopado de garganta debe enfocarse en la cavidad oral una luz brillante por encima del hombro del que toma la muestra de modo que el hisopo pueda guiarse a la faringe posterior y el área amigdalina. Se indica al paciente que incline la cabeza hacia atrás y que respire profundamente. La lengua se baja con una espátula (bajalengua) para lengua para visualizar la fosa amigdalina y la faringe posterior. El hisopo se extiende entre los pilares tonsilares y debajo de la úvula. Se debe tener cuidado para no tocar las paredes laterales de la cavidad bucal o de la lengua y así minimizar contaminaciones con bacterias comensales. Un largo "ah" producido por el paciente sirve para elevar la úvula y evitar náuseas. El área amigdalina y faringe posterior deben ser frotadas con firmeza con el hisopo. Así mismo, es preciso un muestreo de cualquier exudado purulento.

2. MUESTRAS NASOFARÍNGEAS: Se obtienen por observación directa usando iluminación por encima del hombro. Con el pulgar de la mano, se eleva delicadamente la punta de la nariz. Se humedece la punta de un hisopo nasofaríngeo con agua o solución salina estéril y se lo inserta con suavidad en uno de los orificios nasales. El hisopo se guía hacia atrás y hacia arriba a lo largo del septo hasta encontrar resistencia, que indica que se ha llegado a la faringe posterior. El hisopo se retira con delicadeza.

INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR.

MUESTRAS DE ESPUTO: Inmediatamente antes de obtener la muestra de esputo el paciente debe lavar sus dientes y garganta con agua, para reducir el número de bacterias contaminantes de la orofarínge o bucofarínge. Deben obtenerse las muestras de esputo temprano por la mañana, porque ellas contienen el conjunto de las secreciones de la noche. Pueden utilizarse frascos de boca ancha con tapas herméticas a rosca. Se le indicará al paciente que presione el reborde del recipiente debajo del labio inferior para tomar la muestra de tos expectorada.


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II TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:

El objetivo primario en el transporte de muestras de diagnóstico, es mantener la muestra tan próxima a su estado original como sea posible, con deterioro mínimo y minimizando el riesgo que afrontan quienes transportan la muestra, mediante el uso de recipientes herméticamente cerrados.

La mayor parte de muestras liquidas deben ser transportadas al laboratorio hasta un máximo de 2 horas. El medio de transporte Carey-Blair es uno de los más usados, este medio es esencialmente una solución de tampones con carbohidratos, peptonas y otros nutrientes, con exclusión de factores de crecimiento, y han sido planeados para preservar la viabilidad de las bacterias durante el transporte sin permitir la multiplicación.

TECNICAS DE COLORACIÓN.

TINCIONES: Generalmente se requieren tinciones biológicas para visualizar bacterias en forma adecuada y poner en evidencia las estructuras externas e internas. Según Erhlich los colorantes pueden ser:

1. Ácidos: Que tienen la parte acida coloreada y la básica incolora, tienen afinidad por los elementos protoplasmáticos (básicos) de la célula. Ejemplo: eosina, fluorescencia, fucsina acida, etc.

2. Básicos: Tienen la parte básica coloreada y la parte acida incolora, son muy usados en bacteriología pues los microorganismos están constituidos en gran parte por compuestos ácidos de sustancia nuclear. Ejemplo: violeta de genciana, safranina, fucsina básica, azul de metileno, verde de malaquita, etc.

MÉTODOS DE COLORACIÓN:

1. SIMPLES: Emplean un solo colorante y se aplican en una sola operación. Se usan para apreciar morfología.

Coloración Azul de Metileno o Safranina:

a. Hacer el frotis: Si la muestra el liquida se coloca sobre el portaobjetos y si es sólida entonces colocar primero sobre el porta una gota de agua.

b. Fijar a la llama.

c. Cubrir la preparación con solución acuosa al 3% de Azul de Metileno, durante 5 minutos.

d. Lavar con agua y secar a la llama.

e. Observar con objetivo de inmersión.

2. COMPUESTOS: Intervienen 2 o más colorantes y se efectúa en varios tiempos.

a. Coloración de Gram: Descubierta por Hans Christian Gram, se usa para el examen microscópico directo de muestras y subcultivos. El procedimiento es el siguiente:

Hacer un delgado extendido del material para estudio, y permitir que seque al aire (si la muestra


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el liquida se coloca sobre el portaobjetos y si es sólida entonces colocar primero sobre el porta una gota de agua).

Fijar el material al portaobjeto, pasándolo 3 o 4 veces a través de la llama de un mechero de Bunsen, de modo que el material no se lave durante la tinción.

Colocar el extendido en una bandeja o rejilla para teñido, y cubrir la superficie con solución de cristal violeta o violeta de genciana.

Luego de un minuto lavar con agua destilada.

Cubrir con lugol durante 2 minutos. Lavar nuevamente con agua.

Cubrir con alcohol cetona al 95% por 10 segundos o hasta que no se arrastre más violeta.

Lavar y cubrir son safranina en solución acuosa al 0.75% durante un minuto. Lavar.

Dejar secar al aire libre y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

b. Coloración Alcohol-ácido: Las micobacterias están cubiertas por material grueso, seroso, que resiste la tinción; no obstante una vez que se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten la decoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol-ácido. Consecuentemente dichas bacterias son conocidas como resistentes al ácido, un fenómeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1881.

Para que la carbolfucsina penetre en el material ceroso de los bacilos resistentes al ácido se utiliza calor. El procedimiento es el siguiente:

Hacer frotis y fijar al calor.

Cubrirlo con fucsina fenicada de Ziehl, y calentar suavemente hasta emisión de vapores blancos, repetir la operación dos o tres veces más, mantener así durante 5 minutos. Restituir el colorante evaporado y evitar que se seque sobre la preparación.

Lavar con agua corriente.

Decolorar con alcohol de 95° más 3% de ácido clorhídrico (alcohol-ácido) hasta que la preparación quede incolora. Lavar.

Teñir con Azul de Metileno 30 segundos. Lavar.

Secar. Examinar con inmersión.

PROCEDIMIENTO:

Tomar la muestra del paciente, según las indicaciones del cuadro de abajo. Prepare su mesa de trabajo con todos los instrumentos y materiales que necesita. Recuerde mantener las medidas de bioseguridad e higiene.

MUESTRA INSTRUMENTO DE

MUESTREO ENJUAGUE AGUA FROTIS FIJACION

Mucosa Faríngea Hisopo No Si Si Si Mucosa oral Hisopo Si Si Si Si Dorso de la lengua Baja lenguas Si Si Si Si Superficie dental Hisopo Si Si Si Si Superficie interdental Punta de papel Si Si Si Si Surco gingival Punta de papel Si Si Si Si Saliva Asa microbiológica No No Si Si Agua estancada Asa microbiológica No No Si Si


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Coloración GRAM


- 29 -

ACTIVIDADES: Siga los procedimientos de coloración simple y gram, según se le indique, con cada

una de las muestras tomadas.

Dibuje la mucosa faríngea

Muestra :………………………………………..

Coloración :………………………………………..

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………

Dibuje la mucosa oral

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………


- 30 -

Dibuje el dorso de la lengua

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………

Dibuje la superficie dental.

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………


- 31 -

Dibuje el surco interdental

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………

Dibuje el de surco gingival

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………


- 32 -

Muestra :………………………………………… Muestra :………………………………

Coloración :………………………………………… Coloración :………………………………

Aumento :………………………………………… Aumento :………………………………

Observación :………………………………………… Observación :………………………………

CUESTIONARIO:

1. Refiérase a las diferentes causas que pueden afectar la representatividad de una muestra. 2. ¿Qué implicaciones puede tener la demora en la realización de la siembra? 3. Explique los diferentes métodos empleados para la conservación de las muestras. 4. ¿Qué importancia tiene para usted, la cantidad de muestra a tomar? 5. ¿En qué momento se debe tomar la muestra? 6. ¿Qué indicaciones le daría al paciente para recolectar una muestra de esputo con calidad?

7. Mencione dos ventajas y dos desventajas de las coloraciones compuestas.

8. Explique el fundamento de la coloración de Gram. Haga un dibujo del paso a paso.


- 33 -

PRACTICA 5

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION.

Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto solo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.

Además, los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar el agua y los alimentos, en la microbiología industrial y en muchas otras actividades.

MEDIO DE CULTIVO: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y

otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La

diversidad metabólica de los microorganismos es enorme; por ello la variedad de medios de cultivo es

grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.

Un medio de cultivo debe contener en forma asimilable: nitrógeno y proteínas (peptonas), lípidos, hidratos de carbono, distintas sales minerales, factores de crecimiento (ej. vitaminas, sangre, etc), agua, extractos de carne o levadura agentes solidificantes (agar o gelatina).

CLASIFICACION.

I TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO POR SU CONSISTENCIA: Los medios de cultivo pueden ser:

A. Líquidos.

B. Sólidos o semisólidos.

Los medios sólidos o semisólidos pueden contener los mismos ingredientes que los medios líquidos, pero poseen además agentes solidificantes que pueden ser agar, gelatina o sílica gel.

a. El agar proviene de las algas rojas Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis, Ceratium y Pterocladia y químicamente es un polímero de azúcares que posee interesantes propiedades que lo hacen ideal para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Se funde a altas temperaturas (87°C) y solidifica a 40- 45°C. Además no es degradado por la mayoría de las bacterias. Se usa a una concentración del 1.5-2%.

b. La gelatina tiene el inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas y muchos microorganismos la utilizan como fuente de carbono y nitrógeno. Se utiliza a una concentración del 5-10%.

c. La sílica gel se emplea para algunos microorganismos que se inhiben en presencia de agar.

II TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO POR SU USO:

A. COMUNES: Medios que permiten el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos.

a. Medio sintético: Son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.

b. Medio mínimo: Son los medios que presentan la mínima cantidad de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de los microorganismos.

c. Medio complejo: Medios que contienen nutrientes de composición química variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de sustancias. Se forman a partir de extractos animales, vegetales, etc. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos.

B. MEJORADOS O ESPECIALES: Aquel que permite el crecimiento de un determinado tipo e microorganismos que nos permite diferenciar ciertas cualidades de los microorganismos.

a. Medio enriquecido: Medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Ejemplo: Agar chocolate (ACHO),


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Agar sangre (PAS) (permite visualizar la síntesis de hemolisinas), Agar cerebro-corazón (BHI), etc.

b. Medio selectivo: Medio que sólo permite el crecimiento de un grupo o tipo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Ejemplo SS (shigella y salmonella), Agar Mac Conkey, Agar Chapman (permite el crecimiento de ciertos Staphilococcus).

c. Medio diferencial: Medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. Levine o EMB (permite visualizar la fermentación de lactosa por viraje de un indicador ácido-base).

d. Medio selectivo-diferencial: Permite conocer las características culturales y fisiológicas de un determinado microorganismo como EMB (agar eosina azul de metileno).

III PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS:

Una vez que una muestra para cultivo ha sido recibida, deben tomarse las siguientes decisiones claves para recuperar e identificar los microorganismos que puedan estar presentes:

1. Seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de muestra en particular.

2. Determinar la temperatura y la atmósfera de incubación, para recuperar todos los microorganismos potencialmente significativos.

3. Determinar cuál de los aislamientos recuperados en el medio primario requiere una caracterización posterior.

4. Determinar si se requieren pruebas de susceptibilidad antimicrobianos, una vez que se ha identificado al organismo.

La decisión de hasta dónde hay que procesar los cultivos de muestras individuales debe estar basada en un profundo conocimiento de las relaciones huésped-parásito que se aplique a cada caso.

SELECCIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO PRIMARIO:

La inoculación en caldos de cultivo debería estar limitada sólo a aquéllas muestras, como las de líquidos corporales, las biopsias puntuales o las aspiraciones profundas de tejido, en que hasta la recuperación de unos pocos microorganismos en baja concentración, o para los cuales es razonable la posibilidad de recuperar un anaerobio, puede ser significativa.

Los medios pueden ser selectivos o no selectivos. Los no selectivos no presentan inhibidores, y sustentan el crecimiento de la mayoría de los microorganismos. El agar sangre es el medio no selectivo más comúnmente usado, permite observar hemólisis y brindar una pista para la identificación presuntiva.

El agar MacConkey es el medio de cultivo selectivo más comúnmente utilizado para inhibir el crecimiento de organismos Grampositivos.

El caldo de enriquecimiento es utilizado para recuperar microorganismos patógenos de muestras tales como materia fecal, donde hay elevada concentración de microorganismos comensales. Por ejemplo E. coli y otros comensales "entéricos" son mantenidos en una prolongada fase de retardo del crecimiento por los inhibidores del caldo de enriquecimiento, permitiendo que las relativamente pocas células bacterianas de especies de Salmonella y Shigella, entren en una fase logarítmica de crecimiento no inhibida.

OBJETIVOS:

1. Reconocer los requerimientos nutricionales que necesitan los microorganismos para su desarrollo.

2. Prepara un medio de cultivo microbiológico.

3. Conocer algunos medíos de cultivo cuyo uso es frecuente en microbiología.

MATERIALES:

Medio de cultivo: sólidos (agar sangre, MS, MacConkey, agar cuenta colonias, TSI, LIA, etc) y líquidos (caldo de selenito, indol,etc)

Placas Petri.

Tubos de Ensayo 10ml con tapones.

Probetas 100, 250ml.

Matraces 100ml, 250ml.

Pipetas de 5 y 10ml.


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Mecheros.

Agar MacConkey Scharlau CEIME (medio deshidratado).

Agar base Sangre Scharlau CEIME (medio deshidratado).

Jeringas de 5ml.

Agua destilada.

Balanza y espátula.

Baño María.

Cocinilla eléctrica.

Termómetro.

Papel crack.

Pabilo.

Lápiz de cera.

Algodón.

Alcohol 70 grados.

Guantes.

Gasas.

Tijera.

Baguetas.

Tiras para medio Ph.

PROCEDIMIENTO:

Preparación del medio de cultivo deshidratado:

Preparar placas Petri y tubo de cultivo asépticos (lo que el profesor requiera en la práctica).

Pesar el medio de cultivo deshidratado.

Suspender el agar en los ml de agua destilada de acuerdo a lo indicado.

Agitar y calentar hasta ebullición.

ACTIVIDADES:

A. Reconocer, caracterizar medios sólidos y líquidos de uso frecuente, mostrados por el profesor, indicando que microorganismo crecen en los distintos medios de cultivo.

B. Indicar la fórmula de los medios de cultivo.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué medios de cultivo se indican para bacterias anaerobias? 2. ¿Qué medidas de control de calidad se deben de tomar en cuenta para la preparación de medios de

cultivo? 3. ¿Qué microorganismos específicamente crecen en el medio de agar Mac Conkey? 4. ¿Por qué necesitamos que la hemoglobina se separe del eritrocito en la preparación del agar chocolate? 5. Indique que medio de cultivo se utiliza para el crecimiento de hongos. 6. ¿Por qué el medio salado manitol cambia a amarillo en presencia de S.aureus? 7. ¿En qué consiste la acción selectiva y diferencial de los medios de cultivo? 8. Haga una lista de 3 medios selectivos y 3 medios diferenciales, explicando para qué grupo o grupos de

microorganismos se emplean. 9. ¿Por qué se omite la glucosa en la formulación de medios de cultivos de aislamiento primarios como el

Agar EMB o el Agar MacConkey? ¿Qué pasaría si no se omitiera este carbohidrato en estos medios?.


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PRACTICA 6

SIEMBRA, RECUENTO Y AISLAMIENTO

DE BACTERIAS

INTRODUCCION.

Para estudiar los diferentes microorganismos, primero se necesita poder cultivarlos en condiciones de laboratorio para su posterior aislamiento. Generalmente al laboratorio llegan muestras clínicas que presentan los siguientes inconvenientes:

Las muestras contienen varios tipos de microorganismos, muchos de los cuales son contaminantes.

No existe la suficiente cantidad de microorganismo en la muestra.

Para el cultivo de los microorganismo se realiza la siembra del inóculo (cantidad representativa de la muestras). Que consiste en acondicionar a los microorganismos a un medio de cultivo fértil, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación, puedan desarrollarse y multiplicarse in Vitro.

Aislamiento: Es la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere de un medio sólido de gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio generen su progenie (cepa) mediante la formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá características especiales.

Transplante: Es la separación previa de la cepa a un medio de cultivo adecuado en un tubo, el medio puede ser liquido o sólido. La cepa pura se conserva por subsiguientes transplantes en medios especiales, para lograr conocer las propiedades culturales y bioquímicas, resultando en la exacta identificación.

En la primera siembra se obtiene un cultivo mixto primario, del cual se extrae un aislamiento inicial, seleccionando uno más colonias para sembrarse en un cultivo secundario para obtener un cultivo puro, y así realizar la identificación del microorganismo patógeno.

I SIEMBRA EN PLACA: Siembra por agotamiento:

A. Estría simple: El inoculo se distribuye en un solo plano por todo el medio.

B. Estría Múltiple: Su finalidad es diluir el suficiente inóculo en la superficie del medio agariado de manera que se puedan obtener colonias bacterianas bien aisladas, denominadas unidades formadoras de colonias (UFC).


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II SIEMBRA EN TUBO: La mayoría de medios usados en bacteriología pertenecen a uno de los

siguientes tipos:

A. Siembra en medio liquido: Los caldos de cultivo en un tubo pueden ser inoculados por el método siguiente:

B. Siembra por picadura (tubo recto): Se utiliza para la siembra de cultivos semisólidos, como por ejemplo, el medio SIM, que es una prueba que permite la movilidad de las bacterias.

C. Siembra por estría (pico de flauta): Se realiza en medio sólido inclinado, es utilizado para conservar cepa durante largos periodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de la ureasa.

D. Siembra por picadura y estría (pico de flauta): Consiste en unir las dos técnicas anteriores. Se realiza cuando el medio es sólido e inclinado. Se lleva a cabo en medios tales como el TSA, LIA, Citrato de Simmons.


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OBJETIVOS:

Adquirir destreza en los diferentes tipos de siembra de microorganismos.

Aprender una técnica para separar a las bacterias de los demás microorganismos que se encuentran en una muestra.

Mantener y aislar cepas microbianas de interés clínico.

MATERIALES:

Placas Petri y tubos de ensayo con medios de cultivo: Agar nutritivo, Agar sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate.

Probetas 100, 250ml.

Muestras biológicas: secreción faríngea, mucosa oral, piel, orina y heces.

Estufa.

Mecheros.

Solución Salina.

Termómetro.

Lápiz de cera.

Asas microbiológicas (asas de Kohlle)

Hisopos.

Algodón.

Alcohol 70.

Guantes.

10 tubos de ensayo con la solución salina previamente esterilizada.

11 pipetas estériles de 1 ml.

1 bagueta.

6 placas Petri con Agar Cuenta Colonias.

PROCEDIMIENTO:

A. SIEMBRA EN PLACA:

Puede utilizarse asas microbiológicas o un hisopo para la toma de muestra, si se realizan más de una estría, las siguientes se harán con el asa.

Esterilizar previamente el asa a la llama del mechero cada vez que se tome la muestra y se incline una nueva estría

Evitar romper el medio.

1. Estría simple:

Con el asa de siembra estéril se distribuye el inóculo por estrías en zig-zag, con escasa separación de unas a otras (1 a 3mm).

2. Estría Múltiple:

Depositar el inoculo en el extremo superior de la placa extendiéndose de un lado a otro solo de la parte superior. Volver a flamear el asa, y sin coger muestras, girar la placa en ángulo de 90°, se repite lo anterior, lo que nos permite arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedo la muestra hasta el otro extremo siguiendo la misma dirección, hasta que el último tramo se realizará hacia el interior de la placa.

Para el recuento semicuantitativo de colonias esparcir la muestra cubriendo toda la superficie del agar.


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- 40 -

B. SIEMBRA EN TUBOS:

1. Siembra por Picadura: Introducir el asa en e[ medio de cultivo del tubo hasta el fondo de este y en posición central.


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2. Siembra por Estría: Se realiza en la parte superficial del medio con movimiento ascendente en zigzag desde la base hasta la parte superior exterior, sin rasgar el medio.

3. Siembra por Picadura y Estría: Se inocula primero por punción en profundidad del agar, seguido por un estriado del pico de flauta desde el fondo hacia la parte superior con un movimiento en S a medida que se retira el asa.

4. Siembra en medios líquidos: Emulsionar la muestra problema con el asa microbiológica, y agitar vigorosamente en inóculo en el tubo.

Rotular las placas y tubo sembrados.

Llevar a la estufa a 37°C de temperatura durante 24 a 48 horas aproximadamente.

C. AISLAMIENTO DE BACTERIAS:

Lo que se debe hacer para poder aislar las bacterias es; (si es un líquido se agarra 1 ml de la muestra directamente y si es un sólido, se pesa 1 gr y se diluye en agua), con una pipeta estéril se toma 1 ml de la solución y se vacía en el primer tubo con solución salina previamente flameada la boca del tubo y en área estéril, entonces ya se tiene 10ml, luego con otra pipeta a estéril se toma 1ml del tubo donde se agregó la muestra (pura) y se pone en el otro tubo, luego se agarra otra pipeta estéril, se destapa el tubo se flamea la boca del tubo anterior, se agarra 1 ml de la muestra, se tapa, tomas el siguiente tubo le quitas el tapón y lo flameas. Luego agregara la muestra, este tubo se vuelve a flamear y se vuelve a tapar de nuevo y así sucesivamente hasta terminar con los 10 tubos.

Una vez que se haya puesto la muestra en los 10 tubos, se seleccionar 3 tubos: el más diluido, el menos diluido y uno del medio. Entonces lo que se va hacer es poner las bacterias en las placas Petri con agar para que crezcan, esto se hace por separado y por duplicado.

Primero se agarra el más diluido, se toma 0.1 ml de la muestra del tubo y se coloca en la placa Petri, la varilla de vidrio se remoja en el alcohol y se pasa en la flama, luego se deja que se enfríe por 10 segundos y se esparce la muestra por toda la placa, luego se agarra el tubo de en medio y se toma 0.1 ml de la muestras, se coloca en la placa Petri y se realiza el mismo procedimiento con la varilla de vidrio y después se esparce por toda la placa. Por último se toma el tubo que tiene más muestra de los tres, se agarra 0.1 ml de la muestra y se la pone en la placa Petri, se agarra la varilla de vidrio y se esparce pro toda la placa.


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Una vez terminado el trabajo, se flamea muy bien la varilla de vidrio, se envuelven las placas con papel crack y se guarda en la estufa para esperar que crezcan las bacterias.

D. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS:

Para el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) elegimos la primera placa que se supone que es la menos diluida, debe haber más colonias de bacterias que en las otras dos placas.

En los cultivos procedentes de las otras diluciones aparecen muchísimas colonias.

El recuento tenemos que multiplicar por el factor de dilución, por la cantidad de diluciones. Por Ejemplo: 30 colonias, 10 diluciones y se estudio el tubo más diluido 10

10

30 x 10 x 1010

= esto nos da la cantidad de células viables por mililitro de solución.

ACTIVIDADES:

Complete las tablas para la lectura de medios de cultivo líquido.

CALDO PEPTONADO

CARACTERISTICA TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

Nombre del medio

Fecha

Muestra

Superficie

Turbidez

Sedimento

Color


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CALDO GLICOLATO

CARACTERISTICA TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

Nombre del medio

Fecha

Muestra

Superficie

Turbidez

Sedimento

Color

Complete las tablas para la lectura de las colonias en los medios de cultivo.

CODIGO DE LA PLACA:

Medio de cultivo Hemólisis

Color de la colonia Tamaño de la colonia

Luz trasmitida Margen

Superficie Elevación

Forma Presencia de núcleo

Prueba de la catalasa Viscosidad

BACTERIA O GRUPO BACTERIANO

CODIGO DE LA PLACA:








CODIGO DE LA PLACA:









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CODIGO DE LA PLACA:








CODIGO DE LA PLACA:








CODIGO DE LA PLACA:








Esquematizar los procedimientos y los resultados.


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CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es una cepa? 2. ¿Cómo es el asa de Digarsky y para qué sirve? 3. ¿Para qué se emplea agar SIM? 4. ¿Cómo se interpreta los resultados de un cultivo? 5. ¿Cómo se interpreta los resultados de un cultivo? 6. Se obtendría el mismo resultado si cuantificáramos las bacterias de una muestra por siembra en

superficie y siembra en profundidad? 7. Se toman 2.5 g de tierra y se re suspenden en solución salina estéril hasta un volumen final de 50 ml. A

continuación, se hacen diluciones decimales y se siembran 0.2 ml de cada una sobre un medio adecuado. Tras la incubación, en la placa de la dilución 10-6 crecen 200 colonias. Calcule el número probable de UFC por gramo de tierra

8. ¿Por qué deben realizarse varios pases de una colonia antes de su identificación? 9. ¿Por qué los microorganismos presentan diferencias morfológicas al ser sembradas en diferentes medios

teniendo en cuenta los medios que sembró cada grupo?


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PROTOCOLO DE SIEMBRAS DE CULTIVO

MUESTRA

AGAR

MAC

CONKEY

AGAR

SANGRE

(PAS)

AGAR

MANITOL

SALADO

AGAR

TIOGLICOLATO

AGAR

CHOCOLATE

(ACHO)

CALDO

SELENITO

CALDO

CEREBRO

CORAZON

(BHI)

AGAR

SABORAUND

UROCULTIVO X X

ESPERMOCULTIVO X X X X X

COPROCULTIVO X X

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO

X X X X X X X

LIQ. PERITONEAL X X X X X

LIQ. ASCITICO X X X X X

LIQ. SINOVIAL X X X X X

LIQ. PLEURAL X X X X X

ABSCESO ABDOMINAL X X X X X

SEC. FARINGEA X X X

SEC. OCULAR X X X X X X

SEC. OTICA X X X X X X

SEC. URETRAL X X X X

SEC. PROSTATICA X X X X

SEC. VAGINAL X X X X X X

SEC. BILIAR X X X X X

SEC. TRACTO RESPIRATORIO

(ESPUTO, ASPIRADOS BRONQUIALES)

X X X

SEC. HERIDA X X X X

PUNTA CATETER VENOSO CENTRAL

X X X X X

PUNTA SONDA VESICAL

X X X X X


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PRACTICA 7

ACCION DE LOS ANTIBIOTICOS SOBRE

EL CRECIMIENTO BACTERIANO:

ANTIBIOGRAMA

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA.

Los agentes quimioterápicos han demostrado inhibir y detener el crecimiento de las bacterias, sin embargo ellas han desarrollado la capacidad de resistencia a esos fármacos. Cuando se selecciona un agente antimicrobiano para la terapia, se debe tener en cuenta las características farmacológicas de varias drogas, así como ver el efecto antimicrobiano relativo; para lo cual debe proveerse de la información de laboratorio, a través de pruebas in vitro estandarizadas. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana in vitro tienen valor para seleccionar los agentes quimioterápicos activos contra el germen causal. Existen 3 métodos para este tipo de prueba:

1. Pruebas de difusión , método más ampliamente usado, da resultados cualitativos

2. Pruebas de dilución, da información además cuantitativa, pero su interpretación es mas compleja y no se puede realizar de muestras directas.

3. Pruebas automatizadas, facilita su ejecución y lectura, pero es de mayor costo.

PRUEBA DE DIFUSIÓN: ANTIBIOGRAMA

Utiliza los principios de difusión del agar, en la que los microorganismos son categorizados como resistentes, intermedios o susceptibles para cada antibiótico. Estos agentes antimicrobianos son comúnmente aplicados a las placas de prueba en discos de papel filtro seco. Cuando el disco es aplicado en la superficie inoculada, estos discos absorben el agua del medio de agar, disolviendo así la droga. Según la difusión del antibiótico progrese, también procede la multiplicación antimicrobiana. No aparecerá crecimiento en la zona donde la droga ejerza su acción.


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OBJETIVOS:

1. Demostrar "in vitro" la sensibilidad de las bacterias frente a los antibióticos.

2. Interpretar los resultados del antibiograma, ayudándose con una tabla de estándares de las zonas de diámetro de difusión.

3. Conocer la importancia de las pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias infectantes.

MATERIALES:

Placas de cultivo primario en medio agar McConkey.

Placas de cultivo con medio agar sangre.

Discos de sensibilidad. Amoxicilina (25 ug). Ampicilina (25 ug). Dicloxacilina (10 ug). Estreptomicina (10 ug). Gentamicina (10 ug). Triometropin + Sulfametoxazol (25 ug).

Estufa.


Hisopos.

Pinzas.

Pipetas 1 ml.

Tubos de ensayo pequeños.

Mechero.

Alcohol etílico.

Agua destilada.

Papel toalla.

Jabón, detergente, cepillo secador.

Lápiz de cera.

Tabla de lectura de estándares de interpretación de la zona de diámetro para antibiograma.

PROCEDIMIENTO:

Pruebas de difusión antimicrobiana: antibiograma.

1. Siembra de la muestra:

a. Directa:

Tomar una muestra faríngea.

Sembrar en una placa de agar sangre.

Aplicar los discos de sensibilidad en forma equidistante.

Rotular y colocar en la estufa a 37 ° C por 6 a 24 horas.

b. De un cultivo primario:

Tomar una colonia de una placa de agar McConkey.

Sembrarla en una placa de agar Mueller Hinton.

Aplicar lo discos de sensibilidad en forma equidistante.

Rotular y colocar en la estufa a 37C por 6 a 24 horas.

2. Lectura e interpretación de resultados:

Medir el diámetro de la zona para cada antibiótico.

Interpretar con la ayuda de una tabla estandarizada de la zona de diámetro.

ACTIVIDADES:

1. Esquematizar y rotular la zona para cada antibiótico.

2. Colocar los resultados en una tabla.

3. Explicar cada resultado.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el espectro de acción de la amoxicilina? 2. ¿Cuál es el espectro de acción de la gentamicina? 3. Los antibióticos con lectura intermedia ¿Se deben aplicar en un tratamiento? 4. La dinámica del antimicrobiano frente al germen es la misma in vitro que en nuestros organismos ¿de qué

depende?


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ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA ENTEROBACTERIAS

A N T I M I C R O B I A N O CONTENIDO

DEL DISCO

D I A M E T R O E N mm.

R I S

PENICILINAS

Ampicilina = Amoxicilina 10 µg ≤ 13 14 – 16 ≥ 17 CEFALOSPORINA

Cefalotina 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Cefuroxima axetil (oral) 30 µg ≤ 14 15 – 22 ≥ 23

Cefuroxima sodium (parenteral) 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Cefoxitina 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Cefotaxima 30 µg ≤ 14 15 – 22 ≥ 23

Ceftriaxona 30 µg ≤ 13 14 – 20 ≥ 21

Ceftazidima 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Cefixima 5 µg ≤ 15 16 – 18 ≥ 19

Cefpirome 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Cefepime 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 Β LACTAMICOS / INHIBIDOR DE BETALACTAMASA

Ampicilina / Sulbactam 10 / 10 µg ≤ 11 12 – 14 ≥ 15

Amoxicilina / Acido Clavulanico 20 / 10 µg ≤ 13 14 – 17 ≥ 18

Cefoperazona / sulbactam + 75 / 30 µg ≤ 15 16 – 20 ≥ 21 MONOBACTAMS

Aztreonam 30 µg ≤ 15 16 – 21 ≥ 22 CARBAPENEMS

Imipenem 10 µg ≤ 13 14 – 15 ≥ 16

Meropenem 10 µg ≤ 13 14 – 15 ≥ 15 AMINOGLUCOSIDOS

Gentamicina 10 µg ≤ 12 13 – 14 ≥ 15

Amikacina 30 µg ≤ 14 15 – 16 ≥ 17 QUINOLONAS

Acido nalidixico 30 µg ≤ 13 14 – 18 ≥ 19

Norfloxacina 10 µg ≤ 12 13 – 16 ≥ 17

Ciprofloxacina 5 µg ≤ 15 16 – 20 ≥ 21

Ofloxacina 5 µg ≤ 12 13 – 15 ≥ 16 TETRACICLINA

Tetraciclina 30 µg ≤ 14 15 – 18 ≥ 19 OTROS

Cloramfenicol 30 µg ≤ 12 13 – 17 ≥ 18

Trimetoprim / Sulfametoxasol 1,25/23,75 µg ≤ 10 11 – 15 ≥ 16


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ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA Staphylococcus spp.


DEL DISCO


R I S

PENICILINAS

Penicilinas 10 U ≤ 28 – ≥ 29

S aureus:

Oxacilina 1 ug ≤ 10 11 – 12 ≥ 13

Cafoxitina 30 ug ≤ 21 – ≥ 22

S. cuagulasa negativos

Oxacilina 1 ug ≤ 17 – ≥ 18

Cafoxitina 30 ug ≤ 24 – ≥ 25

GLICOPEPTIDOS

Vancomicina 30 ug - - ≥ 15

Teicoplanina 30 ug ≤ 10 11 - 13 ≥ 14

AMINOGLUCOSIDOS

Gentamicina 10 ug ≤ 12 13 – 14 ≥ 15

Amikacina 30 ug ≤ 14 15 – 16 ≥ 17

Kanamicina 10 ug ≤ 13 14 - 17 ≥ 18

Tobramicina 10 ug ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 MACROLIDOS

Eritromicina 15 ug ≤ 13 14 - 22 ≥ 23

Azitromicina 15 ug ≤ 13 14 – 17 ≥ 18

Claritromicina 15 ug ≤ 13 14 - 17 ≥ 18 FLUOROQUINOLONAS

Norfloxacina 10 ug ≤ 12 13 - 16 ≥ 17

Ciprofloxacina 5 ug ≤ 15 16 - 20 ≥ 21

Levofloxacina 5 ug ≤ 15 16 - 18 ≥ 19

Ofloxacina 5 ug ≤ 14 15 - 17 ≥ 18

Moxifloxacina 5 ug ≤ 20 21 - 23 ≥ 24 NITROFURANTOINAS

Nitrofurantoina 300 ug ≤ 14 15 - 16 ≥ 17 LINCOSAMIDAS

Clindamicina 2 ug ≤ 14 15 - 20 ≥ 21 INHIBIDORES DE LA VIA DE LOS FOLATOS

Trimetoprim / sulfametoxasol 1,25/23,75 µg ≤ 10 11 – 15 ≥ 16 FENICOLES

Cloramfenicol 30 ug ≤ 12 13 – 17 ≥ 18 ANSIMICINAS

Rifampicina 5 ug ≤ 16 17 – 19 ≥ 20 ESTREPTOGRAMINAS

Quinupristina / dalfopristina 15 ug ≤ 15 16 – 18 ≥ 19 OXAZOLIDINONAS

Linezolid 30 ug ≤ 20 – ≥ 21


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ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA

Streptococcus pneumoniae.


DEL DISCO


R I S

PENICILINAS

Oxacilina 1 ug - - ≥ 20

GLICOPEPTIDOS

Vancomicina 30 ug - - ≥ 15 MACROLIDOS

Eritromicina 15 ug ≤ 15 16 – 20 ≥ 21

Azitromicina 15 ug ≤ 13 14 – 17 ≥ 18

Claritromicina 15 ug ≤ 16 17 - 20 ≥ 21 TETRACICLINAS

Tetraciclina 30 ug ≤ 18 19 - 22 ≥ 23 FLUOROQUINOLONAS

Levofloxacina 5 ug ≤ 13 14 – 16 ≥ 17

Moxifloxacina 5 ug ≤ 14 15 – 17 ≥ 18

Ofloxacina 5 ug ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 INHIBIDORES DE LA VIA DE LOS FOLATOS

Trimetoprim / sulfametoxasol 1,25/23,75 µg ≤ 15 16 – 18 ≥ 19 LINCOSAMIDAS

Clindamicina 2 ug ≤ 15 16 - 18 ≥ 19 FENICOLES

Cloramfenicol 30 ug ≤ 20 - ≥ 21 ANSIMICINAS

Rifampicina 5 ug ≤ 16 17 – 18 ≥ 19 OXAZOLIDINONAS

Linezolid 30 ug - – ≥ 21


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Streptococcus spp. β - hemolíticos.


DEL DISCO


R I S

PENICILINAS

Ampicilina 10 ug - - ≥ 24

Penicilina 10 U - - ≥ 24 CEFALOSPORINAS DE USO PARENTERAL

Cefotaxima 30 ug - - ≥ 24

Ceftriaxona 30 ug - - ≥ 24

Cefepime 30 ug - - ≥ 24

GLICOPEPTIDOS


Eritromicina 15 ug ≤ 15 16 – 20 ≥ 21

Azitromicina 15 ug ≤ 13 14 – 17 ≥ 18

Claritromicina 15 ug ≤ 16 17 - 20 ≥ 21 TETRACICLINAS



Ofloxacina 5 ug ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 FENICOLES

Cloramfenicol 30 ug ≤ 17 18 - 20 ≥ 21 LINCOSAMIDAS

Clindamicina 2 ug ≤ 15 16 - 18 ≥ 19 OXAZOLIDINONAS

Linezolid 30 ug - – ≥ 21


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Streptococcus spp. GRUPO Viridans.


DEL DISCO


R I S

CEFALOSPORINAS DE USO PARENTERAL

Cefotaxima (viridans) 30 ug ≤ 25 26 - 27 ≥ 28

Ceftriaxona 30 ug ≤ 24 25 - 26 ≥ 27

Cefepime 30 ug ≤ 21 22 - 23 ≥ 24

GLICOPEPTIDOS


Eritromicina 15 ug ≤ 15 16 – 20 ≥ 21

Azitromicina 15 ug ≤ 13 14 – 17 ≥ 21 TETRACICLINAS



Ofloxacina 5 ug ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 FENICOLES

Cloramfenicol 30 ug ≤ 17 18 - 20 ≥ 21 LINCOSAMIDAS

Clindamicina 2 ug ≤ 15 16 - 18 ≥ 19 OXAZOLIDINONAS

Linezolid 30 ug - - ≥ 21


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PRACTICA 8

REACCIONES SEROLOGICAS

La serología estudia la detección de anticuerpos (Ac) y antígenos (Ag) específicos en los líquidos corporales, habitualmente en el suero. También llamadas reacciones inmunológicas, se basan en las reacciones de antígeno – anticuerpo, las cuales constituyen una base de mucha importancia para el diagnostico de las enfermedades infecciosas, puesto que ocurren in Vitro como in vivo. La validez de una reacción serológica está condicionada por su sensibilidad y especificidad.

La sensibilidad de una prueba viene determinada por el número de muestras que es capaz de detectar como positivas entre un grupo de muestras que son realmente positivas. Por ejemplo, una prueba con sensibilidad de 95% es capaz de detectar 95 de cada 100 muestras positivas. Por lo cual existirán 5 falsos negativos.

La especificidad de una reacción viene determinada por el número de muestras que es capaz de detectar como negativas entre un grupo de ellas que son realmente negativas. En este caso, una especificidad de 95% proporciona un 5% de falsos positivos.

Las pruebas serológicas básicamente pueden tener tres categorías:

1. Pruebas de unión primaria: Las cuales miden directamente la captación M antígeno por parte del anticuerpo. Son las de mayor sensibilidad y entre estas están las pruebas de ELISA y los radio inmunoensayos.

2. Pruebas de unión secundaria: Son menos sensibles que las primarias, pero son más fáciles de realizar, miden los resultados de la unión antígeno – anticuerpo realizada in Vitro. Estas incluyen las pruebas de precipitación de los antígenos solubles, la aglutinación de los antígenos que se encuentran en forma de partículas, así como la activación de la cascada del complemento.

3. Pruebas de unión terciaria o in vivo: Miden el efecto protector de los anticuerpos. Se realiza generalmente en animales.

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN:

Es el fenómeno que ocurre cuando se pone en contacto un Ag, es decir el Ag se halla en la superficie celular, en contacto con su anticuerpo correspondiente. La reacción Ag-Ac conlleva a una agregación de las partículas o células que son visibles microscópicamente. Se pueden detectar antígenos partiendo de anticuerpos conocidos, se emplea para conocer Ag en bacterias aisladas y para el estudio de grupos sanguíneos. Se pueden detectar anticuerpos en sueros problema (se desconoce si presentan Ac frente a determinados Ag). Partiendo de los antígenos específicos para ellos.

Grupos sanguíneos: la aglutinación de los eritrocitos se denomina hemoaglutinación, En la superficie de los eritrocitos se encuentran los antígenos A y B, existen 4 combinaciones de los antígenos: tipo A, tipo B, tipo AB, tipo O. el suero tiene anticuerpos contra los Ag ausentes. Las personas con sangre tipo O tendrán Ac anti - A y anti - B, los de tipo A tendrán Ac anti B. para el factor Rh es semejante, si en la superficie del eritrocito hay antígenos Rh, el tipo sanguíneo será Rh positivo, y viceversa, Rh negativo.

REACCIÓN DE PRECIPITACIÓN:

Se produce cuando entran en contacto antígenos solubles con sus anticuerpos específicos, formándose un precipitado visible, dando una apariencia de grumos. Es una reacción muy específica pero poco a poco sensible, ya que se necesitan cantidades relativamente elevadas de anticuerpos para que se detecte.


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TITULACIÓN O CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS:

Luego de realizar pruebas cualitativas que resulten positivas en los tipos de reacciones antes mencionadas, en muchos casos se necesita evaluar la tasa de anticuerpos presentes en un suero problema. Esta se realiza en tubos o posillos de placas serológicas mediante diluciones progresivas de suero y cantidades constantes de antígeno. Permite detectar el titulo de la reacción como la mayor dilución de suero en la que aparece el fenómeno visible. Esto es posible gracias a que ¡lega un momento en el que en las diluciones del suero hay poca cantidad de anticuerpos, que ya no están en proporción con el antígeno, por lo que no se observa reacción.

OBJETIVOS:

1. Demostrar reacciones de aglutinación determinando grupos sanguíneos ABO y factor Rh en gotas de sangre problema.

2. Demostrar reacciones de precipitación determinando la reacción de VDRL o RPR en sueros problema.

3. Detectar el título en sueros positivos de una reacción RPR.

MATERIALES:

Muestras de sangre problema

Muestras de suero problema

Láminas portaobjetos

Laminas cubreobjetos

Suero Anti A (color azul)

Suero anti B (color amarillo)

Suero anti D o anti Rh (incoloro)

Kit de determinaciones VDRL o RPR

Liguilla de jebe Lancetas o agujas estériles

Mondadientes Alcohol Etílico Lápiz de cera

Algodón

Suero Fisiológico

Pipetas 1 mí.

Tubos de Ensayo.

PROCEDIMIENTO:

1. Reacción de Aglutinación: grupos sanguíneos ABO y factor Rh.

a. Rotular una lámina portaobjeto.

b. Limpiar el pulpejo de un dedo.

c. Punzar con 1 lanceta o aguja y colocar 3 gotas de sangre en el portaobjetos.

d. Añadir el anti suero Anti A a la primera gota de sangre, empezando por la izquierda., El Anti B a la segunda gota y por último el Anti D a la tercera gota.


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e. Inmediatamente con un mondadientes u otro dispositivos estéril mezclar la primera gota de sangre con el suero, con otros mondadientes mezclar la segunda y tercera gota.

f. Observar cuales aglutinan.

g. Identificar los grupos sanguíneos interpretando la aglutinación o no aglutinación.

2. Reacción de Precipitación: reacción VDRL o RPR:

a. Tomar una muestra de sangre venosa, aproximadamente 3ml.

b. Centrifugar a 10 000 rpm/min.

c. Tomar una a dos gotas del suero obtenido (suero problema) y colocarlo en un portaobjetos.

d. Colocar una a dos gotas del reactivo de determinación de RPR sobre las gotas del suero problema y mezclar.

e. Rotar suavemente durante dos a tres minutos.

f. Observar a la luz, si hay grumos de precipitación en la base de la mezcla el suero problema será positivo. El control negativo no formara grumos y servirá de comparación con los sueros problema.

3. Titulación:

a. Colocar en tubos diluciones progresivas de suero positivo a la prueba anterior 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y un control negativo (suero fisiológico), las diluciones realizadas con suero fisiológico, por ejemplo 1/2, colocar en un tubo la mitad de suero positivo y la mitad de suero fisiológico.

b. Rotular 6 láminas portaobjetos con las diluciones indicadas y colocar una gota de cada dilución de suero en cada uno.

c. Colocar cantidades constantes del antígeno sin diluir (frasco de reacción del Kitt RPR), una gota, en las láminas portaobjetos con el suero.

d. Mezclar y rotar suavemente por dos a tres minutos

e. Observar los grumos de precipitación

f. Hasta la mayor o última dilución donde se formen los grumos, este será el título de la reacción o la cantidad de concentración de anticuerpos en el suero positivo.

ACTIVIDADES:

1. Esquematizar y rotular los procedimientos

2. Explicar cada resultado.

CUESTIONARIO:

1. ¿A qué se refiere la sensibilidad de las pruebas serológicas? 2. ¿Por qué en los sueros positivos en diluciones altas no se da la reacción AgAc? 3. ¿Por qué una sangre tipo O no puede donarse a un paciente con sangre tipo A, B o AB?


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PRACTICA 9

IDENTIFICACION DE BACTERIAS

GRAMPOSITIVAS

ESTREPTOCOCOS Y ESTAFILOCOCO.

El género Streptococcus son cocos Gram positivos, catalasa negativos, que se agrupan en cadenas o algunas veces en parejas, Son organismos frágiles que sólo crecen en medios enriquecidos o especiales como en agar Sangre, agar azida. Está ampliamente distribuido en el ambiente, tales como alimentos, agua, polvo, así como en la boca e intestinos del hombre y animales. Hay una variedad de especies saprófitas y comensales. Entre patógenos de importancia en el hombre se encuentran Streptococcus pyogenes, del grupo A, que produce β hemólisis en el agar sangre; y Streptococcus viridans que produce a hemólisis. Streptococcus pneumoníae, forman diplococos lanceolados que forman cápsula, se desarrolla en el tracto respiratorio alto en humanos causando neumonías, otitis, sinusitis, etc.

El género Staphylococcus son cocos Gram positivos generalmente agrupados en forma de racimos de uva; además de su forma que se visualiza en el microscopio, se diferencian de los estreptococos en que son catalasa positivos, son de fácil crecimiento como por ejemplo en agar sangre, agar triptosa y varios otros medios de cultivo; producen pigmentaciones que van desde el blanco a amarillo dorado. Se encuentran en ambientes variados como alimentos, agua, suelo, ropa, y en el hombre en la piel, mucosas bucal y nasofaríngea e intestinos. Staphylococcus aureus es el de mayor importancia por su patogenicidad, en el hombre causa infecciones purulentas, abscesos, supuraciones e intoxicación por alimentos contaminados, produce β. hemólisis, pigmentación amarilllo - dorada, y es coagulasa positiva a diferencia de otras especies de Staphylococcus, como S. epídermidis y S. saprophyticus. Staphylococcus epidermidis pertenece a la flora normal de las mucosas y piel, pero puede producir infecciones oportunistas, da α hemólisis y pigmentación amarillo claro-blanquecina.

OBJETIVOS:

1. Identificar bacterias del género Streptococcus y bacterias del género Staphylococcus.

2. Observar las características culturales de las colonias de dichas bacterias.

MATERIALES:

Material biológico: muestras de secreción faríngea y de cavidad oral.

Material biológico: placas con cultivo de Grampositivos en agar Sangre y agar Triptosa.

Batería de coloración Gram.


Pipetas Pasteur.


Hisopos, bajalenguas.

Estufa.

Mecheros.

Láminas portaobjetos y cubreobjetos.


Guantes.

Barbijo.

Papel toalla.

Lápiz de cera.

PROCEDIMIENTO:

1. Observación macroscópica: En placas con agar sangre y agar tripticasa soya observar las características culturales de las colonias de especies de Streptococcus y Staphylococcus.

2. Observación microscópica: Tomar una muestra de secreción faríngea con ayuda de bajalenguas e hisopo.

Colocar la muestra y hacer un frotis en una lámina portaobjetos, rotular.

Realizar la coloración de Gram a la muestra.

Observar la morfología bacteriana en el microscopio con el objetivo de 100X e identificar Streptococcus y Staphylococcus.


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Tomar una muestra de secreción gingival con un mondadientes, y realizar el mismo procedimiento anterior.

3. Pruebas bioquímicas:

a. Prueba de la catalasa: Colocar en un portaobjetos una colonia y adicionarle una gota de peróxido de hidrógeno al 3% (10 volúmenes). La formación de burbujas indica que la prueba es positiva, debido a la formación de O2.

b. Prueba de la coagulasa: Prueba en portaobjetos o coagulasa unida. Colocar una gota de solución salina en 2 portaobjetos, rotular uno como C (Control) y el otro como P (plasma), emulsionar una buena cantidad de bacterias en ambas gotas: agregar una gota de solución salina a C, y una gota de plasma a P, mezclar moviendo los portaobjetos por 1 minuto.

Positivo: si P aglutina y C no aglutina.

Negativo: si ambos no aglutinan.

ACTIVIDADES:

1. Anotar, esquematizar y rotular lo observado

2. Identificar a la bacteria en ambas pruebas.

CUESTIONARIO.

1. ¿Qué significa α hemolisis? 2. ¿Qué significa β hemolisis? 3. ¿Porque se produce aglutinación en la prueba de la coagulasa? 4. ¿En qué medios de cultivo se desarrolla Staphylococcus aureus.?


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PRACTICA 10

IDENTIFICACION DE BACTERIAS

GRAMNEGATIVAS

Las bacterias Gram negativas presentan generalmente una envoltura celular de tres capas: la mas interna llamada membrana citoplasmática, luego esta una delgada capa de peptidoglicano formando la pared celular, seguida a esta se encuentra el espacio periplasmático, en el cual se encuentran proteínas como enzimas sintetizadores, y la membrana externa, en la cual se proyectan hacia afuera las moléculas de lipopolisacáridos, consideradas como endotoxinas debido ni fuerte carácter antigénico que proporciona a las gran negativas desencadenando respuestas en el sistema inmune que pueden llevar al shock e in cluso a la muerte del hospedero

ENTEROBACTERIAS:

Son bacilos Gram negativos que son parte del a flora normal de nuestro cuerpo o causan enfermedades gastrointestinales. Todas ellas pueden desarrollarse bien en medio de cultivo con inhibidores de Gram positivos, como en los agares MacConkey y EMB.

ENTEROBACTERIACEAE TRANSMISION METABOLISMO VIRULENCIA DIAGNOSTICO

Escherichia coli

Fecal – oral Migración a la uretra. Colonización de catéteres

Indol + Β hemolíticos Lactosa +

Fimbrias: factor de colonización. Capsula (Ag K). Flagelos (AG H). Sideroforos. Adhesinas.

Gram. MacConkey. Colonias rosado – purpureas. Crece hasta 45.5°C.

Proteus vulgaris

Indol - Ureasa +

Móviles.

Ph alto por la ureasa. Cultivo: bacilos se movilizan.

Shigella dysenteriae Fecal – oral. No produce H2S. Invade submucosa de tracto intestinal.

Cultivo heces: no es parte de la flora normal.

Salmonella typhi Fecal – oral. Produce H2S. Móviles capsula.

Prueba de Widal.

OBJETIVOS:

1. Reconocer las características culturales y morfológicas de las bacterias Gram negativas,

2. Conocer y analizar las características metabólicas de las bacterias Gram negativas

MATERIALES:

Tubos con medios de cultivo diferenciales: TSI, LIA, Citrato, Caldo peptonado inoculados.

Tubos con medios de cultivo diferenciales: TSI, LIA, Citrato, Caldo peptonado no inoculados.

Gradillas.

Placas Petri con cultivo de gran negativas.


Láminas portaobjetos.

Batería de coloración gran.

Microscopios ópticos.

Mecheros.

Suero fisiológico.

Lápiz de cera.

Alcohol 70°.

Guantes.

Tiras para medir Ph.


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PROCEDIMIENTO:

1. Características culturales y morfológicas de las bacterias Gram negativas.

Observe las características culturales de las colonias de la placa proporcionada con medio agar McConkey e identifique las bacterias.

Coloque en un portaobjetos con el asa microbiológica una gota de suero fisiológico.

Tome con el asa una colonia de la placa y dilúyala en la gota de la lámina haciendo una emulsión.

Extender, fijar y dejar secar.

Colorear con la batería de Gram.

Observar las características morfológicas de las bacterias en el microscopio óptico.

2. Análisis e interpretación de pruebas bioquímicas:

Observe las características de los tubos proporcionados con medios diferenciales inoculados, interprete e identifique las bacterias con la ayuda de las tablas (ver PRÁCTICA 12 y anexo 1)

a. TSI:

Fermentación de carbohidratos Producción de gas Producción de sulfuro de hierro

b. LIA:

K/K R/A K/A A/A

c. Caldo peptonado (prueba indol):

d. Citrato de Simmons:

e. SIM.

ACTIVIDADES:

1. Esquematice y caracterice las colonias bacterianas analizadas.

2. Esquematice los tubos observados con las distintas reacciones y su identificación.

3. Realice una tabla de Ios caracteres bioquímicos de enterobacterias.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué características presentan las enterobacterias. 2. ¿Qué pruebas utilizaría para diferencias Escherichia coli de Klebsiella sp?


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PRACTICA 11

METABOLISMO BACTERIANO

Si bien es cierto que los caracteres culturales y morfológicos, nos dan indicios de orientación muy significativos para llegar a la identificación de un microorganismo; sin embargo, una serie de especies bacterianas pueden presentar similitud en sus caracteres culturales y morfológicos, pero son totalmente diferentes en sus caracteres bioquímicos (metabólicos). Precisamente en esta práctica estudiaremos y analizaremos el comportamiento bioquímico de los microorganismos; para ello es necesario añadir a los medios de cultivo que conocemos, sustratos adecuados como: carbohidratos, proteínas, aminoácidos, peptonas, etc. , los productos formados y las modificaciones producidas en estos medios se manifiestan por el cambio de color debido al reactivo indicador que llevan, en otros casos dicho indicador es añadido después de la inoculación como en el caso de la prueba del indol.

Por ejemplo en la acción bioquímica de los microorganismos sobre los aminoácidos, algunos poseen determinadas enzimas que le dan la capacidad de desnaturalizar los aminoácidos, dando lugar a la formación de otros elementos o compuestos, los cuales se ponen de manifiesto gracias a los indicadores incorporados al medio, por su viraje o cambio de color original.

Asimismo, según la acción de los microorganismos sobre los carbohidratos; gran número de ellos gracias a las enzimas que tienen, muy específicas por cierto, fermentan los carbohidratos, con producción de ácidos orgánicos y gas, otros solamente ácidos y hay algunos que no tienen esta capacidad, la presencia de ácido, se evidencia agregando al medio base, el carbohidrato como: glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, etc. y un indicador específico de pH. La presencia de gas nos indica que la fermentación del carbohidrato ha sido completa, con formación final de CO2 y agua, y se manifiesta por el resquebrajamiento del medio sólido en el lugar o sitio de inoculación, como por formación de una cavidad en el fondo del tubo inclusive, si la cantidad de gas es bastante el medio es desplazado hacia la parte superior del medio, dejando un gran espacio en el fondo del tubo.

En fin la acción metabólica de los organismos es fascinante e ilimitada debido a que se diferencia en la capacidad para actuar y desnaturalizar una infinidad de sustancias y de compuestos como: proteínas, carbono, nitrógeno, carbohidratos, nitratos, nitritos, peróxido de hidrógeno, cianuro, petróleo, sulfuros, etc.

TSI (Triple azúcar hierro).

Este es un medio diferencial de agar con 3 azúcares (glucosa, sacarosa y lactosa) y hierro, donde se observa el metabolismo de los carbohidratos.

1. Composición: Cuatro proteínas derivativas: extracto de carne, extracto de levadura, peptona y proteasa peptona; carbohidratos (glucosa 1g, lactosa 10g, sacarosa 10g), cloruro de sodio, sulfato ferroso, tiosulfato de sodio, el indicador es rojo de fenol y agaragar. No poseen inhibidores permitiendo el crecimiento de casi todas las bacterias (excepto anaerobios obligados).

2. Principio: Para demostrar la fermentación de los carbohidratos está el indicador rojo de fenol que es amarillo a un pH de 6,08, ya que el medio sin inocular es bufferado a pH de 7,4, cantidades relativamente pequeñas de producción de ácido resultan en un visible cambio de color. El sulfato ferroso es un detector de H2S, algunos microorganismos reducen el tiosulfato hasta hidrógeno sulfurado y este al contactar con el sulfato ferroso da lugar a la formación de sulfuro de hierro. También se observa si hay producción de gas debido a la fermentación completa de glucosa en CO2 y H2O.

LIA (Agar con Lisina y Hierro).

1. Base Bioquímica: La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos lisina descarboxilasa positivos que la transforman en la diamina Cadaverina, la cual alcaliniza todo el medio, intensificando el medio a color violeta; este proceso se realiza debido a que ellos presentan la enzima lisina descarboxilasa. La lisina puede ser desaminada por microorganismos lisina desaminasa positivos, es decir presentan la enzima lisina desaminasa, que por desaminación oxidativa transforma a la lisina en un alfa-cetoácido, el cual es naranja en presencia de sales férricas y se torna rojo granate por el indicador púrpura de bromocresol en la parte superficial del tubo.

2. Principio: Mide la capacidad de un organismo para descarboxilar (rompiendo el radical carboxilo) o desaminar (rompiendo el radical amino) la lisina para formar aminasa o cetoácidos con la alcalinidad y acidez respectiva.


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CALDO PEPTONADO (Prueba del indol).

1. Base Bioquímica: Es un medio de cultivo diferencial líquido (caldo) que tiene como ingrediente fundamental el aminoácido triptófano incorporado a la peptona, produciendo una serie de sustancias volátiles como amoniaco, ácido pirúvico, indol, etc.

2. Principio: Sirve para demostrar la desnaturalización del triptófano al añadir un reactivo específico al medio (reactivo de Kovac's o de Erlich's). Se forma un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo para – dimetil - aminobenzaldehído, en un medio ácido, produciendo en la superficie del tubo un anillo de color rojo grosella

CITRATO SIMMONS

1. Base Bioquímica: El citrato de sodio, única fuente de carbono, es una sal de ácido cítrico, un compuesto simple obtenido en el ciclo de Krebs, algunas bacterias obtienen energía de este compuesto como única fuente de carbono. Este medio está libre de proteínas y carbohidratos para detectar el uso del citrato por una bacteria.

2. Principio: El uso del citrato por una bacteria se identifica por la producción de productos secundarios alcalinos. El indicador de esto es el azul de bromotimol, que es amarillo a pH menor a 6.0 y azul a ph mayor de 7,6.

SIM (H2S, Indol, Movilidad)

1. Base Bioquímica: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

2. Principio: En este medio se estudian 3 procesos además que el medio puede ser de transporte por ser semisólido, las pruebas son: la producción de hidrogeno sulfurado (H2S), indol y motilidad, pero las dos primeras pruebas significan que el medio exista por naturaleza los aminoácidos cisteína y triptófano, la primera para liberar las moléculas de H2S y la segunda para dar indol, la motilidad se observa por solo desarrollo invasivo del medio a temperatura ambiente, pH neutro, sin la presencia de ácidos, alcohol ni acetona por lo que el medio carece de carbohidratos.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

OBJETIVOS:

1. Reconocer las características culturales y morfológicas de las bacterias Gram negativas.

2. Conocer y analizar las características metabólicas del as bacterias Gram negativas.

3. Adquirir destreza en la identificación de microorganismos.

MATERIALES:

Tubos con medios de cultivo diferenciales: TSI, LIA, SIM, Citrato, caldo peptonado inoculados.

Tubos con medios de cultivo diferenciales: TSI, LIA, SIM, Citrato, caldo peptonado no inoculados.

Gradillas.

Placas Petri con cultivo de Gram negativas.

Asa microbiológicas.

Láminas portaobjetos.


Microscopios ópticos.

Mecheros.

Suero fisiológico.

Lápiz de cera.

Alcohol 70°.

Guantes.

Tiras para medir pH.

PROCEDIMIENTO:

1. Características culturales y morfológicas de bacterias Gram Negativas:

Observe las características culturales de las colonias de la placa proporcionada con medio agar McConkey e identifique las bacterias.


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Coloque en un portaobjetos con el asa microbiológica una gota de suero fisiológico.

Tome con el asa una colonia de la placa y dilúyala en la gota de la lámina haciendo una emulsión.

Extender, fijar y dejar secar.

Colorear con la batería de Gram.

Observar las características morfológicas de las bacterias en el microscopio óptico.

2. Análisis e Interpretación de Pruebas Bioquímicas:

Observe las características de los tubos proporcionados con medios. diferenciales inoculados, interprete e identifique las bacterias con la ayuda de las tablas (ver Anexo 1):

TSI.- Este medio al inicio es de color rojo ladrillo.

a. Fermentación de carbohidratos:

K/K: ó N/N: Una reacción alcalina en todo el tubo, es decir no hay viraje de color, indica que hay una falta de producción de ácidos e incapacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos, por lo tanto el microorganismo no pertenece a la familia Enterobacteriaceae.

K/A: Fermentación sólo de glucosa, el viraje muestra un color rojizo en el bisel y color amarillo en el fondo (alcalinidad sobre acidez), quiere decir negativo a la lactosa y sacarosa y positivo a la glucosa.

A/A: Los microorganismos son capaces de fermenta los tres azúcares, hay un viraje en todo el medio al color amarillo (acidez sobre acidez), quiere decir positivo a lactosa, sacarosa y glucosa.

b. Producción de gas:

Positivo: Si hay producción de gas, por resquebrajamiento del medio en el sitio de la inoculación o hay una formación de burbuja en el fondo del tubo, a veces la producción de gas es tan abundante que hay un desplazamiento del medio hacia arriba.

Negativo: No hay producción de gas.

c. Producción de sulfuro de hierro:

Positivo: Si hay producción sulfuro de hierro, se observa una coloración negruzca, que va desde una + hasta ++++ si hay mucha cantidad.

Negativo: No hay producción de H2S.

LIA: Este medio antes de ser inoculado es de color lila pálido (pH neutro). La prueba positiva significa desnaturalización de la lisina, presentándose los siguientes casos:

a. K/K: Todo el medio virado a violeta, se lee alcalino sobre alcalino (descarboxilación).

b. R/A: Bisel pardo rojizo, fondo amarillo, se lee rojo sobre ácido (desaminación).

c. K/A: Bisel violeta por efecto de la incubación, el fondo vira a amarillo por la acidez producida por fermentar al glucosa, se lee alcalino sobre ácido (lisina negativa).

d. A/A: A veces el medio se presenta amarillo en su totalidad, se lee alcalino sin cambio (lisina negativa).

Caldo peptonado (Prueba de Indol):

a. Positivo: Si se produce el anillo rojo grosella en la superficie del medio, indol positivo.

b. Negativo: No hay producción del anillo, es decir indol negativo.

Citrato de Simmons:

a. Positivo: Citrato positivo si hay un viraje al color azul en todo el medio o en la línea de inoculación

b. Negativo: Citrato negativo si el medio permanece de color verde.

SIM.

a. Prueba del indol: Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de indol reactivo Kovac´s o de Erlich.

b. Producción de SH2:

Positivo: Ennegrecimiento del medio de cultivo a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.

Negativo: El medio permanece sin cambio de color.


- 65 -

c. Movilidad:

Positivo: Presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.

Negativo: Crecimiento solamente en la línea de siembra.

ACTIVIDADES:

1. Esquematice y caracterice las colonias bacterianas analizadas.

2. Esquematice los tubos observados con las distintas reacciones y su identificación.

3. Complete la tabla de cada grupo de los caracteres bioquímicos de enterobacterias.

MESON 1 TSI LIA CITRATO SIM

LECTURA EN

CODIGOS

LECTURA EN PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL


LECTURA EN

CODIGOS

LECTURA EN PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL


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LECTURA EN PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL


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INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL


LECTURA EN

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INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL


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LECTURA EN

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LECTURA EN PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS PROBABLES

BACTERIA FINAL

CUESTIONARIO:

1. ¿Es posible identificar un microorganismo recurriendo sólo a sus caracteres bioquímicos?. 2. ¿Qué características presentan las enterobacterias?. 3. ¿Qué pruebas utilizaría para diferenciar Escherichia coli de Klebsiella sp.?. 4. ¿Cómo se produce la formación de gas en el TSI? 5. ¿En qué otra forma se puede evidenciar la formación de ácido sulfhídrico, aparte del uso de los medios

de TSI y LIA?


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REACCIONES DE ENTEROBACTERIACEAE EN AGAR TRIPLE AZUCAR (TSI) Y EN AGAR HIERRO LISINA (LIA) (Edwards – Ewing)

GENERO Y

ESPECIE

T S I L I A CITRATO S I M

Inclinado Profundo Gas H2S Inclinado Profundo Gas H2S H2S Indol Motilidad

ESCHERICHIA A (K) A + (-) - K K o N - o + - - - + +

SHIGELLA K A - - K A - - - - + -

SALMONELLA K A + (-) +++ (-

) K K o H - + (-) - + - +

S. TYPHI K A - + (-) K K - + o - - + - +

S. PARATYPHI K A + (-) - K A + o - - - - - +

ARIZONA K (A) A + +++ K K o H - + (-)

CITROBACTER K (A) A + +++ K A - o + +

ADWARSIELA K A + +++ K K - o + +

KLEBSIELLA A A ++ - K o H K o H + o - - + - - -

ENTEROBACTER A A ++ - + - - +

E. CLOACAE A A + - K o H A + o - - + - - +

E. AEROGENES A A + - K K o H + o - -

E. HAPNIAE K A + - K K o H - o + -

SERRATIA K o A A - - K K o H - -

P. VULGARIS A (K) A + +++ R A - - (+) v + + +

P. MIRABILIS K (A) A + +++ R A - - (+)

P. MORGANII K A - (+) - K o R A - -

P. RETTGERI K A - (+) - R A - -

PROVIDENCIA K A + o - - R A - -

A : Acido. K : Alcalino N : Neutro R : Desaminación oxidativa.

Los símbolos en paréntesis indican reacciones adicionales. Una reacción alcalina o neutra en lo profundo del medio indica descarboxilación.


- 69 -

PRACTICA 12

IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS

El género Mycobacterium son bacilos muy delgados curvos o rectos de metabolismo aeróbico, no móviles a los cuales se les denomina bacilos alcohol ácido resistentes (BAAR) ya que presentan alto contenido de lípidos y ácidos grasos, sobretodo ácido micólico en su pared celular. Incluye más de 54 especies conocidas, en el hombre son especies patógenas tales como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, y especies oportunistas como Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium fortuitum etc.

Para la identificación de los BAAR en muestras sospechosas de micobacterias patógenas se utilizan métodos de coloración ácido alcohol resistentes como la de Ziehl Neelsen y la de Kinyoun, esta técnica es rápida, sencilla y económica sin embargo es de baja sensibilidad y no es exclusiva de las micobacterias la búsqueda de estos bacilos y su conteo resulta en un diagnostico presuntivo para la tuberculosis y se le denomina baciloscopía.

La tuberculosis es una enfermedad causada por el bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis), se desarrolla solo en el hombre siendo un patógeno obligado e intracelular facultativo, generalmente se transmite por inhalación de aerosoles que contienen la bacteria expulsados por la persona infectada. Generalmente afecta los pulmones causando tuberculosis pulmonar, pero también se presenta la tuberculosis extrapulmonar, que afecta a otros órganos como intestino, riñones, meninges, pleura, etc. Su diagnóstico definitivo se establece a través del aislamiento en cultivo e identificación bioquímica de Mycobacterium tuberculosis obtenidas a partir de muestras biológicas representativas de la zona afectada,

OBJETIVOS:

1. Conocer La importancia del proceso microbiológico para el diagnóstico clínico de Mycobacterium tuberculosis

2. Conocer un procedimiento de coloración ácido alcohol resistente (Ziehl- Neelsen) para micobacterias

3. Identificar bacilos de Mycobacterium tuberculosis e interpretar resultados de la baciloscopía.

MATERIALES:

Muestras de esputo.

Láminas con frotis de BAAR s/c coloración alcohol ácido resistente.

Batería de coloración de Ziehl Neelsen Microscopio óptico.

Lamina portaobjetos.

Bajalenguas.

Frascos estériles con tapa de boca ancha.

Mechero.

Portaláminas.

Guantes.

Barbijo.

Lápiz de cera.

PROCEDIMIENTO:

1. Toma de muestra:

Colocarse guantes y barbijo, utilizar material estéril.

Seleccionar un envase de plástico transparente con tapa rosca y boca ancha.

Etiquetar o rotular el envase con el nombre del paciente, tipo de muestra fecha y hora de recolección de la muestra, así como el número de registro del paciente.

Obtener una muestra de esputo, de preferencia a primera hora de la mañana, en cantidad suficiente para que la muestra sea representativa.

No usar fijadores ni preservantes y transportarlas de inmediato para su procesamiento (de lo contrario conservarla a 4 ° C).

2. Coloración de Ziehl Neelsen:

Con la ayuda de un bajalenguas mezclar la muestra y realizar un frotis a lo largo de la lámina


- 70 -

portaobjetos, expandir lo suficiente, fijar con mechero dejar secar y rotular.

Colocar el frotis en el portaláminas.

Cubrirlo con fucsina fenicada por 5 minutos, mientras pasa por debajo de la lámina la llama de un mechero, hasta la emisión de vapor, evitando que la fucsina hierva, agregue más colorante si se consumió con la evaporación.

Enjuagar la lámina con agua de caño.

Decolorar con alcohol ácido por 1 minuto.

Enjuagar la superficie con agua de caño.

Cubrir el frotis con azul de metileno durante 1 minuto.

Enjuagar con agua de caño y dejar secar.

Observar al microscopio con objetivo de 100X.

Identificar los bacilos BAAR que se colorean de color vino tinto.

3. Baciloscopía:

Realizar la observación al microscopio de la lámina coloreada con Ziel Neelsen contando el número de BAAR.

Reportar lo observado guiándose de la tabla a continuación

N° DE BACILOS OBSERVADOS REPORTE

No se observan BAAR en 300 campos Negativo ( - )

De 1 a 2 bacilos en 300 campos Dudoso(repetir)

De 1 a 9 bacilos /campo en promedio en 100 campos observados Positivo (+)

De 1 a 9 bacilos en promedio /campo en 10 campos observados Positivo (2+)

De 1 a 9 bacilos en promedio/campo Positivo (3+)

Más de 9 bacilo en promedio /campo Positivo (4+)

ACTIVIDADES:

1. Analizar el procedimiento de toma de muestra.

2. Esquematizar y rotular los procedimientos de las técnicas de coloración.

3. Colocar el reporte de la lámina positiva para M. tuberculosis.

Prueba :………………………………………..

Muestra :………………………………………..

Coloración :………………………………………..

Aumento :………………………………………..

Observación :………………………………………..


- 71 -

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué pruebas bioquímicas se pueden realizar para diferenciar M. tuberculosis? 2. ¿En qué medios de cultivo se desarrolla M. tuberculosis, durante cuánto tiempo y en qué condiciones

físicas?


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PRACTICA 13

METODOS DE LABORATORIO EN

MICOLOGIA

La micología trata del estudio de los hongos. Existen más de 50000 especies de hongos, de los cuales la mayor parte son benéficos para la humanidad. Las infecciones causadas por hongos son las micosis. La mayor parte de hongos patógenos son exógenos, siendo sus hábitats naturales el agua, el suelo y los desechos orgánicos. Las micosis más frecuentes son la candidiasis, y la dermatofitosis, causada por flora microbiana normal que está muy adaptado para sobrevivir en el hospedero humano.

Básicamente existen dos formas de crecimiento de los hongos : levaduras , las cuales son unicelulares y presentan pared celular gruesa y mohos (hongos filamentosos) los cuales son multicelulares formando filamentos denominadas hifas y esporas que son estructuras para la reproducción.

La mayor parte de hongos crece con facilidad sobre fuentes simples de nitrógeno y carbohidratos. Clásicamente se usa agar de Sabourand que contiene glucosa y peptona a pH 7.0 debido a que no apoya fácilmente el crecimiento de bacterias. El protocolo de laboratorio para el diagnóstico de estos organismos incluye:

1. Demostración directa de células micóticas contenidas en tejidos o fluido sanguíneo.

2. Aislamiento del hongo en cultivo puro.

3. Identificación por procedimientos convencionales, tales como la observación de formación de micelio o levaduras.

OBJETIVOS:

1. Aislar hongos en cultivo de agar Sabourand y otros cultivos.

2. Identificar y observar la morfología de hongos levaduriformes realizando la coloración de Gram.

3. Identificar y observar la morfología de hongos filamentosos realizando la coloración de azul de lactofenol.

MATERIALES:

Material biológico: frutos o plantas hongueadas

Material biológico: placas con cultivo de Candida albicans, placas con cultivo de hongos filamentosos.


Batería de coloración azul de lactofenol.

Hidróxido de potasio al 10%.


Pipetas Pasteur.

Asas microbiológicas en escuadra y en aro.

Estufa.

Mecheros.

Lamina portaobjetos y cubreobjetos.


Guantes, barbijo.

Papel toalla.

Lápiz de cera.

PROCEDIMIENTO:

1. Levaduras.

Colocarse guantes y barbijo, utilizar material estéril.

Con el asa microbiológica en aro tomar una a dos colonias de Candida albicans.

Realizar un frotis y fijar.

Realizar la coloración de Gram.

Observar al microscopio 100X.

2. Hongos filamentosos.

Tomar una muestra de un fruto hongueado con el asa microbiológica en escuadra.


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Cultivar a 37 °C por 4 días.

Luego con el asa microbiológica en escuadra tomar una muestra del cultivo en agar Sabourand.

Realizar un frotis y fijar.

Realizar la coloración de Gram.

Observar al microscopio a 100X.

3. Hongos dermatofitos.

Realizar un raspado de uñas o piel.

Colocar las muestras en un portaobjetos en una gota de KOH al 10 a 20 %.

Colocar un cubreobjetos y examinar la muestra al microscopio.

Repetir el examen 20 minutos después.

ACTIVIDADES:

Muestra :……………………………………….. Muestra :…………………………………………

Coloración :……………………………………….. Coloración :…………………………………………

Aumento :……………………………………….. Aumento :…………………………………………

Observación :……………………………………….. Observación :…………………………………………

Hongo :……………………………………….. Hongo :…………………………………………

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Aumento :…………………………………………

Observación :…………………………………………

Hongo :…………………………………………


- 74 -

Muestra :……………………………………….. Muestra :…………………………………………


Aumento :……………………………………….. Aumento :…………………………………………


Hongo :……………………………………….. Hongo :…………………………………………

Muestra :……………………………………….. Muestra :…………………………………………


Aumento :……………………………………….. Aumento :…………………………………………


Hongo :……………………………………….. Hongo :…………………………………………


- 75 -

Muestra :……………………………………….. Muestra :…………………………………………


Aumento :……………………………………….. Aumento :…………………………………………


Hongo :……………………………………….. Hongo :…………………………………………

Muestra :……………………………………….. Muestra :…………………………………………


Aumento :……………………………………….. Aumento :…………………………………………


Hongo :……………………………………….. Hongo :…………………………………………

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué características contiene el agar Saboraund? 2. ¿En qué medios de cultivo se desarrollan las levaduras? 3. ¿A qué temperatura pueden desarrollarse los hongos filamentosos? 4. ¿A qué temperatura pueden desarrollarse los hongos dermatofitos?


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PRACTICA 14

DIAGNOSTICO PÁRASITOLOGICO

La parasitología estudia a la biología de los parásitos y sus relaciones con el hospedero. Entre los parásitos de humanos están los protozoarios y los metazoarios. Los primeros son unicelulares y se dividen en diversos grupos de los cuales algunos flagelados, amebas y esporozoarios parasitan al ser humano; los segundos son pluricelulares y pertenecen a los helmintos (nematodos, céstodos y tremátodos) y a los artrópodos.

El diagnóstico de parásitos causantes de enfermedades se puede realizar mediante 2 métodos, los directos y los indirectos. Los métodos directos con los cuales se observa directamente al parásito en una o más formas de transmisión. Estos incluyen al examen directo macroscópico (observación de partes o la totalidad de algunos helmintos y artrópodos) y microscópico (huevos, quistes, larvas, trofozoítos de parásitos), los que pueden ser al fresco, muestras preservadas o mediante coloraciones, mediante cultivo de las muestras biológicas o la inoculación experimental de animales que multipliquen o faciliten la detección del parásito. Los métodos indirectos, los que generalmente son serológicos ponen de manifiesto la respuesta del hospedero frente al parásito, como por ejemplo la detección de anticuerpos. Es importante conocer bien el ciclo biológico del parásito en relación con las fases de la enfermedad parasitaria, para interpretar y validar los resultados de laboratorio.

Las muestras biológicas son diversas dependiendo del tipo de parasitosis: enteroparasitosis (causado por parásitos del sistema digestivo y anexos), hemoparasitosis, parasitosis cutánea y parasitosis hísticas.

OBJETIVOS:

1. Conocer Las diferentes técnicas de diagnóstico para la identificación de parásitos.

2. Observar la morfología microscópica de protozoarios parásitos en muestras preservadas y frescas.

3. Observar la morfología macroscópica y microscópica de helmintos parásitos en muestras preservadas.

MATERIALES:

Material biológico:

Muestras frescas y/o preservadas de heces conteniendo enteroparásitos.

Láminas preservadas de Entamoeba sp. Láminas preservadas de Trichomonas

vaginalis en secreción,vaginal. Muestras preservadas de helmintos. Láminas preservadas de huevos de

Enterobius vermicularis.

Microscopio óptico

Suero fisiológico (o ClNa al 0,85 % )

Éter etílico

Aceite de inmersión

Tubos de ensayo con tapón

Láminas portaobjetos y cubreobjetos

Pipetas Pastear

Pipetas graduadas

Gasa quirúrgica

Bajalenguas

Guantes, barbijo

PROCEDIMIENTO:

1. Concentración de parásitos en muestras fecales:

Las técnicas de concentración de heces concentran y recuperan los elementos parasitarios que se hallan dispersos en las muestras frescas de heces.

Una técnica que sedimenta los parásitos por fuerza de gravedad es la técnica de Telemann modificado, que consiste en:

Tomar la muestra de heces en emulsión y tamizarla a través de una gasa quirúrgica.

Llevarla a un tubo de ensayo y centrifugarla a 1500 rpm durante 3 minutos.

Eliminar el sobrenadante.

Suspender el sedimento con una pipeta Pasteur en suero fisiológico.


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Repetir las centrifugaciones hasta obtener un sobrenadante relativamente limpio.

Tomar 1 a 2 gotas y hacer una preparación directa sin tinción y observar al microscopio.

Luego verter aproximadamente 10 ml de la emulsión fecal tamizada en un tubo de centrífuga, agregarle 2 ml de éter etílico y agitar enérgicamente.

Centrifugar por 4 minutos a 1500 rpm.

Eliminar el sobrenadante.

Preparar 2 muestras concentradas, realizar el frotis y teñirlas con lugol.

Observar al microscopio óptico a 40 y 100X.

2. Observación de enteroparásitos:

Observar la lámina preparada de Entamoeba sp. en el microscopio con el objetivo de 40 y 100X.

Identificar la especie.

Identificar las estructuras celulares.

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Parásito :…………………………………………

Forma :…………………………………………

Aumento :………………………………………..

Parasitolsis :………………………………………..

3. Observación de Trichomonas:

Observar la lámina preparada de Trichomonas en el microscopio con el objetivo de 40 y 100X.

Identificar la especie.

Identificar las estructuras celulares.

Muestra :…………………………………………

Coloración :…………………………………………

Parásito :…………………………………………

Forma :…………………………………………

Aumento :………………………………………..

Parasitosis :………………………………………..


- 78 -

4. Observación de Platelmintos: Observar la muestra preservada del helminto macroscópicamente, identifique la especie e identifique sus estructuras.

Muestra :………………………………… Muestra :……………………………….

Parásito :………………………………… Parásito :……………………………….

Clase …………………………………. Clase :……………………………….

Forma :………………………………… Forma :……………………………….

Aumento :………………………………… Aumento :……………………………….

Parasitosis :………………………………… Parasitosis :……………………………….

Hospedero :………………………………… Hospedero :……………………………….

Muestra :………………………………… Muestra :………………………………

Parásito :………………………………… Parásito :………………………………

Clase …………………………………. Clase :……………………………….

Forma :………………………………… Forma :………………………………

Aumento :………………………………… Aumento :………………………………

Parasitosis :………………………………… Parasitosis :………………………………



- 79 -

5. Observación de nematodos: Observar la muestra del nematodo microscópicamente con el objetivo de 40X, identifique la especie e identifique las estructuras.

Muestra :………………………………… Muestra :………………………………

Coloración :………………………………… Coloración :……………………………….


Forma :………………………………… Forma :………………………………

Aumento :………………………………… Aumento :………………………………



Muestra :………………………………… Muestra :………………………………

Coloración :………………………………… Coloración :……………………………….


Forma :………………………………… Forma :………………………………

Aumento :………………………………… Aumento :………………………………




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ACTIVIDADES:

Esquematizar y rotular los procedimientos

Parásito :………………………………… Parásito :……………………………….

Phyllum :………………………………… Phyllum :……………………………….

Clase :………………………………… Clase :……………………………….

Forma evolutiva :………………………. Forma evolutiva :………………...……


Importancia :………………………………… Importancia :……………………………….


Clase :………………………………… Clase :……………………………….

Forma evolutiva :………………………. Forma evolutiva :………………...……


Importancia :………………………………… Importancia :……………………………….

Parasitosis :………………………………… Parasitosis :…………………………….....


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CUESTIONARIO:

1. ¿Qué y Cuáles son los enteroparásitos de mayor difusión en nuestro medio? 2. ¿Qué técnicas diagnósticas se realizan para identificar al hemoparásito de la enfermedad de Chagas? 3. ¿Qué elementos parasitarios se identifican con la técnica de Telemann Modificado? 4. ¿Qué parásitos cutáneos conoce?

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