Guia de Laboratorio de Parásitos Emergentes

8/16/2019 Guia de Laboratorio de Parásitos Emergentes

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Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico|Guía para Laboratorio de Parásitos

Emergentes, Re-emergentes y Exóticos. Parasitología

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Facultad de SaludEscuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico

Programa Académico de Bacteriología y Laboratorio ClínicoGuía de laboratorios de parásitos emergentes, re-emergentes y exóticos

CONTENIDO

1. Laboratorio 1: Diagnóstico de Protozoarios intestinales y tisulares.

2. Laboratorio 2: Diagnóstico de Helmintos: Céstodos, Digéneos y Nematodos.

3. Laboratorio 3: Laboratorio de técnicas.

Normas básicas de seguridad en el laboratorio

En las prácticas de laboratorio se trabajará con agentes causantes de enfermedadesen humanos; por lo tanto, es importante tener en cuenta la siguiente premisa: “TODAmuestra fresca que se trabaje dentro del laboratorio está CONTAMINADA hastaque no se demuestre lo contrario”. Por ende, es necesario que para evitarinconvenientes se trabaje siguiendo detalladamente las recomendaciones debioseguridad.Antes de empezar a trabajar es indispensable reconocer, entender y aplicar lasprincipales normas de bioseguridad. A continuación, se dan a conocer las normas quedeben cumplir los estudiantes.

Vestuario

Ingresar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Utilizar siempre zapatos cerrados. NO utilizar vestimenta corta ni joyas y mantener el cabello recogido.

Comportamiento

Utilizar los elementos de Bioseguridad pertinentes (Bata, guantes,gafas, tapabocas, etc.) NO fumar, comer, beber o mascar chicle NO pipetear con la boca. NO correr, gritar, empujarse o causar pánico. NO arrojarse líquidos o reactivos. Está PROHIBIDO el uso de teléfonos celulares y computadores

portátiles dentro del laboratorio. Utilizar los elementos del laboratorio únicamente dentro de este. Conocer la ficha técnica de un reactivo previa manipulación. NO utilizar los equipos del laboratorio sin conocer las instrucciones demanejo. En caso de embarazo NO manipular sustancias tóxicas Informar inmediatamente de cualquier accidente o derrame ocurrido enel laboratorio.

Bioseguridad


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Está PROHIBIDO manipular el microscopio con los guantes puestos.NO es permitido manipular las manijas de las puertas con los guantespuestos NO tocarse el rostro, los ojos, la nariz, la boca, el cabello o la piel engeneral con los guantes puestos.

Manejo de equipos y Materiales

Cada estudiante es responsable de su área de trabajo, por lo tantodebe realizar aseo de la misma ANTES y DESPUÉS de la práctica conEtanol al 70%.Cada estudiante es responsable de su microscopio, por lo tanto deberevisarlo cuidadosamente ANTES de iniciar la práctica e informar sipresenta irregularidades.Al terminar las prácticas, cada estudiante debe realizar aseo (etanol al70%) de las siguientes partes del microscopio: platina, pinza de la

platina, tornillos macrométrico y micrométrico.NO trabajar lejos de la mesa de laboratorio, no colocar objetos en elborde Verificar que el material de vidrio esté en buenas condiciones en elmomento de recibirlo y devolver el material astillado o quebrado a lapersona responsable.Depositar el material de vidrio roto en el lugar apropiado para tal fin.Reportar al profesor el material/equipo: quebrado, extraviado o dañado

Desechar los guantes usados ÚNICAMENTE en la bolsa roja.Cumplir con el programa de vacunación establecido por la Universidad,

para el ingreso a los laboratorios. Seguir los procedimientos establecidos por el profesor, para el manejode preparados y micropreparados.Si sus manos han entrado en contacto con la muestra, debe lavarse lasmanos con agua y jabón. NO introducir ningún elemento a la boca. Identificar la ubicación de la ducha lavaojos, extintores y salidas deemergencia.En caso de emergencia, de aviso al profesor o persona encargada dellaboratorio y siga el protocolo para obtener ayuda.

Introducción.

La parasitología es el área de la zoología encargada del estudio de las relacionessimbióticas parasitarias que se presentan entre organismos pertenecientes adiferentes especies, en las cuales uno de los organismos, el parásito, usa al otro, elhospedero (también llamado hospedador), como su sitio de residencia(medioambiente), su fuente de alimento y en algunos casos puede incluso haber unadependencia a nivel fisiológico. De esta relación, el parásito saca provecho para sualimentación, sobrevivencia y reproducción, y el hospedero puede verse afectado enmayor o menor grado, con lo cual pueden alterarse algunas de sus funcionesbiológicas (crecimiento, tasa reproductiva y/o supervivencia).


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Los humanos, al igual que muchos otros seres vivos de los reinos Animal y Vegetal,hemos establecido relaciones de tipo parasitario con organismos pertenecientes a losreinos Monera, Chromista, Protista, Hongo y Animal; incluso con los virus tenemosrelaciones de tipo parasitario, de hecho, estos constituyen uno de los ejemplosextremos de este tipo de relación. Sin embargo, el término Parásito se emplea, en un

espectro menos amplio, básicamente para describir organismos eucariotas, uni omulticelulares, de los reinos Chromista, Protista y Animal.

Los parásitos que afectan al hombre se cuentan entre las principales causas de morbi-mortalidad en los países tropicales y sub-tropicales. En las últimas décadas del sigloXX con la aparición del VIH-SIDA, la masificación de las transfusiones y los trasplantesde órganos, el uso indiscriminado de antibióticos (antibacterianos, antifúngicos yantiparasitarios), así como los fenómenos conducentes al cambio climático hanfacilitado la aparición de nuevas entidades (Emergentes), entre las que se cuentan lasMicrosporidiosis y las infecciones por Cyclospora cayetanensis y Cryptosporidium sp.,o el resurgimiento de enfermedades que se creía estaban controladas en algunasáreas (Re-emergentes), como la TBC y la Malaria, por citar algunos ejemplos. El

personal médico y médico-asistencial (enfermeras, bacteriólogos, microbiólogosclínicos, laboratoristas) debe conocer cuáles son los posibles agentes parasitariospresentes en diferentes circunstancias e individuos y estar en capacidad de realizaruna correcta toma y manipulación de la muestra para obtener un resultado confiable, yestablecer qué técnica se ha de emplear para ofrecer un diagnóstico acertado de lasenfermedades parasitarias. De este modo se logra una atención oportuna, eficiente yadecuada del paciente.

1. Laboratorio 1: Diagnóstico de Protozoarios intestinales y t isulares.

1.1. ProtozoariosEl hombre es hospedero de varias especies de protozoarios, algunos actúan comocomensales, otros lo hacen como parásitos obligados y unos cuantos más sonparásitos oportunistas. Dependiendo de su localización, el tiempo de evolución y elcuadro clínico del paciente se debe decidir cual es la muestra óptima a utilizar paradiagnosticar todas aquellas infecciones, que se sospecha, son causadas porprotozoos. Igualmente, dependiendo de la muestra, hay diferentes tipos de pruebasque el laboratorio debe aplicar para determinar la presencia del patógeno, bien sea demanera directa o indirecta. Sin embargo, en la mayoría de los casos el diagnóstico delas infecciones por protozoos tiene como base la determinación de la presencia delagente y su correcta identificación con base en sus características morfológicas, por lotanto, una gran parte del diagnóstico recae en el examen directo, con o sincoloraciones especiales. En otros casos, como en las infecciones por Toxoplasma

gondii y Trypanosoma cruzi, son de gran utilidad las pruebas indirectas, aquellas quemiden indirectamente la presencia del parásito al establecer el nivel de respuestainmune del paciente ante la presencia del patógeno, bien sea determinando lapresencia de anticuerpos o la respuesta inmune celular.

Entre los protozoos que afectan al hombre encontramos algunos de localizaciónintestinal, bien en intestino delgado o grueso, mientras otros son hemáticos o tisulares.Entre estos últimos, algunos se localizan en piel, otros en diferentes órganos y unosmás pueden incluso ser multi-sistémicos. Entre los parásitos intestinales seencuentran Cryptosporidium sp. y Giardia duodenalis, los cuales por su prevalencia,generan alta morbilidad, principalmente en población infantil y en edad escolar.


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Además, Cryptosporidium y los Microsporidios están asociados con diarreas crónicasen pacientes con inmunocompromiso, incluidos VIH+. De los parásitos tisulares son degran importancia T. gondii y T. cruzi. El primero puede ocasionar cuadros clínicosagudos o crónicos en fetos, recién nacidos y pacientes con diferentes tipos deinmunosupresión, mientras el segundo generalmente se detecta en pacientes con

cuadros crónicos; en ambos casos se puede comprometer la vida del paciente ogenerar alta morbi-mortalidad. También son importantes Leishmania, por el efectodesfigurante de sus lesiones en piel y mucosas, además de la mortalidad infantil en loscuadros viscerales, y Plasmodium por la posibilidad de malaria severa, malariacomplicada y mortalidad tanto de adultos como de niños.

1.2. Generalidades del diagnóstico de las infecciones por protozoarios.

1.2.1. Protozoos intestinales: Las parasitosis intestinales son una de lasprincipales causas de morbilidad en población infantil. Entre los protozoos másfrecuentemente informados como causantes de infección intestinal en humanos

se encuentran Iodamoeba buetschlii, Endolimax nana y varias especies deEntamoeba, en el grupo de las amibas; Giardia duodenalis, Chilomastix mesnili y Trichomonas hominis entre los flagelados; Balantidium coli como el únicociliado y Blastocystis sp. como el único Chromista. Entre las coccidiasintestinales se encuentran Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora (Sin.Isospora) belli, Sarcocystis bovihominis, S. suihominis y varias especies deCryptosporidium.

Las amibas, los flagelados, B. coli, C. belli y Blastocystis se diagnostican usualmentepor examen microscópico de muestras de materia fecal en directo con solución salinay coloración temporal con lugol (Figura 1) y concentración o enriquecimiento porsedimentación o flotación. En el caso de las coccidias intestinales se emplean técnicasde coloración ácido alcohol resistente como Ziehl-Neelsen y Kinyoun, o la coloraciónde Safranina (Figura 2). Sin embargo, el examen morfológico no puede en ocasionesdiferenciar las especies involucradas (especialmente en los géneros Entamoeba sp, yCryptosporidium sp.), por lo cual se requieren técnicas moleculares. La definición de laespecie es importante para poder establecer la fuente de infección y las medidas decontrol.

Figura 1. Para el diagnóstico por examen coprológico es necesario realizar el montaje de dos

soluciones homogenizadas de la muestra de materia fecal, una con solución salina y la otra

con lugol. Al realizar este procedimiento debe verificarse que se pueda leer un texto impreso

a través de la preparación. Si queda muy gruesa será imposible discernir entre artefactos y

formas parasitarias. Si queda muy delgada es posible que no haya suficiente muestra y los

parásitos estén ausentes en la preparación.

Imagen tomada de: http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/stool/microexam.html


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1.2.2. Cultivo y aislamiento: En algunos casos se recomienda la realizaciónde cultivos tanto para protozoos intestinales como tisulares, pero no están alacceso de todos los pacientes pues usualmente se realizan en laboratoriosespecializados. Estos cultivos pueden ser xénicos, axénicos o en cultivoscelulares (para los intracelulares obligados) y permiten obtener un mayornúmero de organismos para realizar con ellos la identificación morfológica, asícomo otras pruebas diagnósticas o de genotipificación molecular. También sepuede hacer cultivo in vivo o inoculación en animales de laboratorio, peroigualmente esto solo se logra en laboratorios de referencia y a unos costos noasequibles para muchos de los pacientes.

1.2.3. Control de calidad: Los laboratorios requieren de controles internos yexternos para asegurar la calidad del diagnóstico. Para ello se remitenmuestras conocidas por la entidad encargada de realizar los controles externospero desconocidas para el personal del laboratorio. Estas muestras deben serevaluadas y los resultados entregados a la entidad acreditadora. Cuando serealiza este tipo de procedimientos se deben también implementar las técnicasde coloración de extendidos de materia fecal, bien sea con HematoxilinaFérrica o Colorante Tricrómico de Wheatley, consideradas estándares de orodel diagnóstico coprológico.

1.3. Morfología de protozoarios intestinales que infectan humanos.

(Las características detalladas que identifican los diferentes protozoarios intestinales,hemáticos y tisulares deben ser estudiadas en los textos complementarios sugeridosen clase). Cabe recordar que los protozoarios intestinales presentan los estadios detrofozoito, quiste, ooquiste y varias morfologías en Blastocystis. En el caso de lasamibas, el trofozoito tiene una forma irregular, cuando la materia fecal está fresca sepuede apreciar la movilidad de sus seudópodos y se debe identificar la morfología de

Figura 2. Para el diagnóstico de las coccidias intestinales se recomiendan las coloraciones

AAR (Ziehl-Neelsen y Kinyoun) (derecha) y de Safranina (izquierda).

Imagen tomada de: http://www.cdc.gov/dpdx/cryptosporidiosis/index.html


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sus núcleos, pues estos varían entre los diferentes géneros y especies. Los quistes delas amibas varían en su forma, su tamaño, su número y la apariencia de los núcleos.Las coccidias intestinales: se diferencian por la morfología y tamaño de susooquistes, así como por diferencias en la captación del colorante cuando se realiza lacoloración AAR. De las coccidias Cystoisospora belli es la única que puede ser

diagnosticada solo con base en sus características morfológicas en examen directo.Cryptosporidium y Cyclospora cayetanensis deben ser diagnosticadas por medio decoloraciones especiales, las cuales no se incluyen en el examen coprológico de rutina,por lo cual el médico tratante debe hacer la solicitud expresa de la coloración en laorden que se envía al laboratorio. Se debe tener en cuenta que la mayoría de expertosrecomienda la realización de al menos dos exámenes, usualmente tres, en días noconsecutivos para lograr una mayor sensibilidad en el examen coprológico.

Los flagelados intestinales: presentan trofozoito y quiste, con excepción del géneroTrichomonas, en el cual solo se encuentra el estadio de trofozoito. Los flagelados engeneral tienen forma piriforme en estadio de trofozoito y cuando están viables seaprecia el movimiento de los flagelos. Los quistes varían en tamaño y forma y son

fácilmente distinguibles unos de otros.

El Chromista: Blastocystis es bastante pleomórfico tanto en tamaño (varía entre 5 µmy 40 µm), como en sus múltiples formas (vacuolar o de cuerpo central, granular,multivacuolar, ameboide y quiste, entre otras), de las cuales la más fácilmentereconocible es la forma de cuerpo central, en la cual hay una gran vacuola en el centrodel trofozoito que deja un muy delgado halo de citoplasma en el cual se distribuyen losnúcleos.


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1.3.1. Morfología microscópica de Coccidias intestinales

PROTOZOOS INTESTINALES: Coccidias

Nombre: Cryptosporidium sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Cyclospora cayetanensis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Cyclospora cayetanensis

¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Cystoisospora belli



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1.3.2. Morfología microscópica de Flagelados y Cromistas

PROTOZOOS INTESTINALES: Flagelados y Cromistas

Nombre: Giardia duodenalis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Giardia duodenalis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Blastocystis sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Blastocystis sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:


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1.3.3. Morfología microscópica de Sarcodinos e Incertae sedis

PROTOZOOS INTESTINALES: Sarcodinos e Incertae sedis

Nombre: Entamoeba histolytica/E.dispar/E. moshkovskii ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Entamoeba histolytica/E.dispar/E. moshkovskii ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Urbanorum sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

1.4. Protozoos tisulares y hemáticos: Estos protozoos requierenprocedimientos de toma de muestras más invasivos, técnicas más complejas y,en la mayoría de los casos, el diagnóstico recae más en las técnicas indirectas(determinación de anticuerpos). En los casos en que se pueden empleartécnicas directas se requiere el apoyo de coloraciones para lograr un buen


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diagnóstico. Para los protozoos hemáticos también se recurre a lascoloraciones para facilitar la identificación específica con base en lascaracterísticas morfológicas de los diferentes estadios.

Los flagelados tisulares: presentan las formas de amastigote, epimastigote,

promastigote y tripomastigote. Hay diferencias entre los géneros Leishmania yTrypanosoma en cuanto a cuáles de estas formas están presentes en su ciclo de vida.Para la realización del examen directo se recurre frecuentemente a la coloración deGiemsa, con la cual se resaltan las características morfológicas de los organismos.Esta misma coloración se emplea para los parásitos sanguíneos y para coloreartaquizoitos de Toxoplasma gondii obtenidos por aislamiento en cultivo o en ratón.

Las leishmaniasis son enfermedades zoonóticas producidas por parásitos del géneroLeishmania y transmitidas por insectos vectores hematófagos. Las leishmaniasiscomprenden un amplio espectro que incluye infecciones subclínicas (asintomáticas oinaparentes), localizadas (lesiones en piel) y diseminadas (cutánea, mucosa ovisceral). Afecta a más de 88 países en el mundo y se estima que anualmente 1.5 – 2.0 millones entre niños y adultos desarrollan la enfermedad. Aproximadamente 350millones de personas están en riesgo de adquirir la enfermedad y más de 12 millonesestán actualmente infectadas. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad estánasociadas con la especie del parásito y, por consiguiente, con el área endémica.Existen más de doce especies diferentes de Leishmania que producen enfermedad enhumanos.

Leishmania es un parásito unicelular obligado que sobrevive intracelularmente encélulas fagocíticas (principalmente macrófagos) del hospedero. Es trasmitido aanimales mamíferos y al hombre (hospederos) a través de la picadura de insectosvectores infectados (principalmente Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomyia en el

Nuevo Mundo). Las formas promastigotes del parásito (flageladas), presentes en elinsecto, son inoculadas en la piel durante la picadura. En el hospedero infectan losmacrófagos de la piel y se transforman en amastigote (aflagelado). Los amastigotes sereproducen dentro del macrófago. En el sitio de inoculación puede desarrollarse unalesión y/o, dependiendo de la especie, el parásito puede migrar a otros tejidos delcuerpo (mucosa o vísceras).

El diagnóstico presuntivo de la leishmaniasis se basa en la presentación clínica de laenfermedad, aspectos epidemiológicos relacionados con la transmisión del parásito, yen algunos casos, en el resultado de la prueba intradérmica de leishmanina oMontenegro. Sin embargo, el diagnóstico definitivo solo se logra a través de lavisualización del agente etiológico de la enfermedad. El examen directo permite hacer

el diagnóstico inmediato visualizando la forma intracelular, amastigote, en unextendido de una muestra tomada de una lesión representativa. El aislamiento orecuperación de formas repetitivas flageladas, promastigotes, se realiza inoculandomuestras clínicas en medios de cultivo selectivos para tripanosomas.

El cultivo es un método específico y constituye el estándar de oro de los métodos dediagnóstico para leishmaniasis y es utilizado en segunda instancia para el diagnóstico,después del examen directo. Es útil no solo en el diagnóstico clínico sino también eninvestigación, permitiendo la posterior identificación de la especie utilizandoelectroforesis de isoenzimas, anticuerpos monoclonales o técnicas moleculares, y ladeterminación in vitro de la sensibilidad del parásito a medicamentos. La evaluación de


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una biopsia histopatológica de lesión representativa también permite la detección delparásito en tejidos, pero es menos sensible que los dos métodos antes descritos. Ladetección y aislamiento de los parásitos también puede realizarse mediante lainoculación de un aspirado de la lesión en el hámster dorado, pero esta prueba es demás difícil realización, por lo cual es poco utilizada.

Existen herramientas diagnósticas indirectas, basadas en respuesta inmune, talescomo pruebas serológicas y pruebas intradérmicas, que contribuyen a definir eldiagnóstico clínico y el tratamiento, pero que no confirman la presencia del parásito;son de gran utilidad para el desarrollo de estudios epidemiológicos.

La malaria o paludismo : es una enfermedad transmitida a través de la picadura demosquitos Anopheles infectados, es considerada un problema de salud pública envarios países del mundo, con elevados casos de mortalidad. Entre los síntomas que sepresentan se destacan fiebre, cefalea y escalofrío, que suelen aparecer 10 a 15 díasdespués de la picadura del vector. Si no se recibe tratamiento oportuno, la malaria

puede poner en riesgo la vida del paciente en corto tiempo, especialmente por malariacomplicada y malaria cerebral. Entre las medidas de control de la enfermedad seencuentran el diagnóstico y tratamiento rápido y eficaz, el uso de toldillos impregnadosde insecticida y la fumigación con insecticidas de acción residual que buscan controlarlos vectores.

La malaria es causada por parásitos del género Plasmodium. En el humano esproducida principalmente por cuatro especies: P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P.ovale. Recientemente se ha descrito la infección por P. knowlesi, una especie queinfecta monos, y ocasionalmente se informan otras especies zoonóticas. El parásito estransmitido de humano a humano a través de la picadura del mosquito, de madre ahijo congénitamente, por transplante de órganos o vía transfusión sanguínea.

El ciclo de vida del parásito comprende dos fases, la asexual que se desarrolla en elhumano y la sexual en el invertebrado. La infección inicia cuando el mosquito infectadoinyecta esporozoitos a través de la saliva al torrente sanguíneo del humano, estosalcanzan el hígado, donde desarrollan su ciclo extraeritrocítico. Los merozoitosliberados de los esquizontes tisulares alcanzan el torrente sanguíneo y dan inicio alciclo eritrocítico. Dado que no se cuenta con una vacuna que prevenga la infección,gran parte de las medidas de control de la enfermedad están dirigidas al diagnósticooportuno y al tratamiento adecuado. El diagnóstico es crucial para decidir eltratamiento antimalárico, para el cual no sólo se tiene en cuenta la especie causal sinotambién el grado de resistencia de los parásitos en la zona.

1.4.1. Diagnóstico microscópico de los protozoos tisulares y hemáticos

El diagnóstico oportuno de malaria es crítico dado que la infección se puede complicara medida que los parásitos se van multiplicando en el tiempo. La identificaciónmicroscópica es el principal método diagnóstico para malaria y permite establecer laespecie de Plasmodium y el recuento parasitario, criterios importantes para eltratamiento y control del paciente. Cada una de las especies que infectan al humanotiene características morfológicas que permiten el diagnóstico diferencial.


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Las pruebas de diagnóstico rápido para malaria (PDRs), surgen como una alternativaa la gota gruesa, en situaciones en que el uso de la microscopía es limitado o pocofactible. Las PDRs diagnostican malaria al reconocer antígenos específicos delparásito presentes en la sangre del paciente y algunas de ellas permiten ladiferenciación entre especies de manera clara (pruebas de cuatro bandas), pero tienen

limitaciones para establecer la carga parasitaria y siguen siendo positivas variassemanas post-tratamiento, lo que dificulta el seguimiento al paciente. Por ello, serecomienda usarlas simultáneamente con la GG.

Para el diagnóstico de la leishmaniasis se emplea como estrategia inicial el examenmicroscópico de frotis realizados con material tomado del borde activo de la lesión,posterior a su tinción con Giemsa. Esta técnica tiene como inconvenientes que puedeser poco sensible, requiere buen entrenamiento para su análisis y no permiteidentificar la especie de Leishmania. Existen técnicas moleculares y pruebasinmunocromatográficas, con mayor sensibilidad.

1.4.1.1. La gota gruesa y el extendido

El examen de Gota Gruesa (GG) sigue siendo considerado el estándar de oro y lamejor técnica para el diagnóstico de la malaria en las zonas endémicas (Figuras 3 y 4).Las técnicas moleculares presentan una mayor sensibilidad y especificidad, pero elacceso a ellas es limitado en las zonas rurales, no solo por su no disponibilidad sinotambién por sus costos. La GG se considera una técnica de concentración, en la cualse puede apreciar una cantidad de sangre representativa para establecer la presenciade formas de los parásitos causantes de malaria (Plasmodium sp), tripanosomiasisamericana y africana (Trypanosoma sp), filariasis linfáticas y apatógenas (Wuchereriabancrofti, Brugia sp y Mansonella), babesiosis (Babesia sp) y, excepcionalmente,leishmaniasis visceral (Leishmania sp) en pacientes inmunocomprometidos. Estatécnica se realiza generalmente en conjunto con un Extendido en capa fina (Ext.), estepermite ver la morfología típica de las diferentes especies de Plasmodium y relaciónentre el parásito y la célula hospedera, con lo cual es muy útil para la determinación dela especie; mientras que la GG es útil para la determinación específica y permitedetectar pacientes con bajas cargas parasitarias. Cuando no es posible establecer laespecie en la GG, bien porque el paciente ha tomado medicamentos que alteran lamorfología del parásito o por la sospecha de malarias mixtas, se recurre al Ext. paradefinir la especie.

Figura 3: Para elaborar la gota gruesa debe tenerse en cuenta que es la lámina portaobjetos

la que se lleva hacia la gota de sangre para ser tomada del dedo.

(Tomado de:http://emergenmedhb.blogspot.com.co/2015/06/malaria-o-paludismo-

enfermedad-de-los.html)


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1.4.1.2. Evaluación de los frotis para el diagnótico de la leishmaniasis .Se debe realizar la toma de la muestra a partir del borde de la lesión más reciente(Figura 5) que le haya aparecido al paciente. Es deseable que esta lesión esté libre decoinfección por bacterias. Se deben realizar tres frotis con el material recuperado enuna misma lámina portaobjetos (Figura 6) y al menos tres láminas por paciente. Elmaterial puede ser obtenido con un bisturí o una jeringa de insulina (Figuras 5 y 7).Este material también puede ser usado para cultivo, inoculación de animales opruebas moleculares

Figura 5. Foto de una lesión de leishmaniasis cutánea. Para el examen directo, la incisión se realiza

con la hoja de bisturí en el borde de la lesión

Figura 6. Frotis extendidos de forma circular en la lámina portaobjeto

Figura 4: En algunas áreas del mundo se hacen la GG y el Ext. en la misma lámina. En nuestromedio lo usual es emplear láminas independientes, realizando dos GG en una misma lámina.

(Tomado de: https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/12/practica-no10-preparacion-de-gota-gruesa/)

https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/12/practica-no10-preparacion-de-gota-gruesa/https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/12/practica-no10-preparacion-de-gota-gruesa/https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/12/practica-no10-preparacion-de-gota-gruesa/https://practicasdehematologiaycitologia.wordpress.com/2014/11/12/practica-no10-preparacion-de-gota-gruesa/


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Figura 7. Toma de aspirado a partir de la lesión con jeringa de tuberculina


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1.4.2. Morfología microscópica de protozoos tisulares y hemáticos

PROTOZOOS TISULARES

Nombre: Microsporidios¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Leishmania sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Trichomonas sp


Nombre: Toxoplasma gondii



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PROTOZOOS HEMÁTICOS

Nombre: Babesia sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Trypanosoma cruzi¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Plasmodium falciparum


Nombre: Plasmodium falciparum



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Nombre: Plasmodium vivax ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Plasmodium vivax ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:


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ocasionar cuadros de diseminación e hiperinfección que llegan a ser fatales. Otrosnematodos son de localización en tejido subcutáneo (Onchocerca volvulus) olinfática (Wuchereria bancrofti, Brugia sp) asociándose el primero a cuadros dedermatitis y ceguera y los segundos a elefantiasis. De las tenias o cestodos losmás frecuentes son Hymenolepis nana, H. diminuta, Taenia saginata, T. solium y

T. asiatica. Fasciola hepatica, Paragonimus sp, Clonorchis sinensis, Schistosomamansoni, S. haematobium y S. japonicum son de los digéneos másfrecuentemente asociados a infección en humanos, siendo de localización mástisular que luminal en intestino. Para otros helmintos, el hombre sirve de hospederointermediario y los cuadros clínicos pueden ser incapacitantes e incluso fatales,entre estos parásitos se encuentran varias especies de Echinococcus, de lascuales en Colombia se encuentran E. vogeli y E. oligarthrus, y el estadio larvariode T. solium, que ocasiona cuadros de cisticercosis con diferentes localizaciones,siendo de gran importancia su ubicación en sistema nervioso central(neurocisticercosis).

Las infecciones por helmintos, al igual que las infecciones por protozoarios,dependen de la localización del parásito para definir el tipo y número de muestrasy el tipo de prueba que se pueda emplear. Para aquellos de localización intestinal,la muestra ideal es materia fecal en examen seriado. El número de muestras varíaentre 3 ( Ascaris, Trichuris) y 10 (Strongyloides,Taenia) dependiendo del parásitoinvolucrado. Para las infecciones por oxiuros (Enterobius vermicularis) y Taenia spse puede tomar una impresión de la región perianal con una cinta pegantetransparente (Método de Graham).

Para los helmintos de localización pulmonar (Paragonimus) así como para los quehacen migración por este órgano en su ciclo de vida (uncinarias, Ascaris yStrongyloides) puede ser útil tomar muestras seriadas de esputo. TantoParagonimus como los de localización en vías hepáticas y biliares (Fasciola yClonorchis) también pueden diagnosticarse por medio de examen coprológico. Enalgunos casos pueden ser usadas muestras como aspirados duodenales, de bilis olavados broncoalveolares para el diagnóstico de estos helmintos.

Los helmintos de localización linfática (filarias como Wuchereria y Brugia) sediagnostican por medio de muestras de sangre en las cuales se deben buscar lasmicrofilarias. Para Onchocerca volvulus la muestra de elección es una bopsia depiel tomada en las zonas correspondientes a los huevos planos (escápula y crestailíaca o cerca de los nódulos subcutáneos). Otras helmintiasis son más difíciles dediagnosticar y se requiere emplear técnicas indirectas, que permitan detectar

anticuerpos en los pacientes infectados. Sin embargo, en algunos casos esnecesario tener en cuenta no solo los resultados de los exámenes de laboratorio sino también los resultados de pruebas imaginológicas (RMN y TAC), losantecedentes epidemiológicos y los signos y síntomas que presenta el pacientepara poder realizar un diagnóstico certero. Entre estas infecciones se encuentranla neurocisticercosis, la equinococosis y la fascioliasis. Entre las pruebas paradetección de anticuerpos se encuentran ELISA, IB o WB (inmunoblot o westernblot), dot-ELISA, hemoaglutinación, entre otras. En algunos casos se empleanantígenos crudos para las pruebas indirectas pero se presentan con frecuenciaproblemas de reacción cruzada y falsos positivos con otras infecciones; paraminimizar estas reacciones cruzadas se han estandarizado técnicas que emplean


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antígenos purificados en columnas de sefarosa con lectina de lenteja (cisticercosis)o antígenos recombinantes (Toxocara, Onchocerca, Echinococcus), lo cual haasegurado una mayor especificidad de las pruebas diagnósticas.

Es importante recordar que las infecciones por nematodos ( Ascaris, Trichuris y

uncinarias) deben informarse con recuento de los huevos, bien sea porpreparación o por gramo de materia fecal y que la técnica recomendada por laOMS como la de elección para cuantificar los huevos de helmintos es la de Kato-Katz. En el caso de las infecciones por cestodos o digeneos no se hace recuento,excepto para los casos de esquistosomiasis.

Morfología de helmintos que infectan humanos.

Las características detalladas que identifican los diferentes helmintos intestinales ytisulares deben ser estudiadas en los textos complementarios sugeridos en clase.Cabe recordar que los helmintos intestinales pueden diagnosticarse por medio de

la indentificación de huevos, larvas o adultos que se encuentran presentes en lamateria fecal, sangre, esputo u otras muestras. En el caso de los helmintosintestinales, el diagnóstico se basa principalmente en la identificación de loshuevos, cuya morfología varía según la especie involucrada.

Los huevos de Ascaris poseen una estructura caracterizada por la presencia deunas proyecciones globosas llamadas mamelones en su cubierta externa (algunoshuevos pueden carecer de ella y se les llama decorticados) y una sola masacentral o blastómero, a partir de la cual se formará la larva. En el caso de Trichuris, los huevos tienen forma de barril y en los extremos poseen abultamientostraslúcidos que se conocen como tapones polares. Los huevos de uncinarias( Ancylostoma y Necator ) son indiferenciables entre los dos géneros y presentanuna cubierta externa delgada y la masa de células sale con su proceso de divisiónya adelantado, por lo que se aprecian varios blastómeros. Los huevos de oxiurostienen forma de letra D o grano de arroz y se encuentran con la larva ya casitotalmente formada en su interior.

Las filarias linfáticas se diagnostican por la presencia de microfilarias en sangreperiférica y la diferenciación de especie se basa en la morfología que incluyepresencia o no de vaina y la distribución de los núcleos a lo largo del cuerpo. Eldiagnóstico de Toxocara canis se basa en la presencia de anticuerpos, bien ensuero o humores vítreo y acuoso, y en otros exámenes complementarios. Lasinfecciones por Strongyloides se detectan por coprológico seriado de al menos 7

muestras, pero son más sensibles las técnicas de embudo de Baerman y cultivo enagar. En algunos casos de diseminación se puede detectar en esputo o enbiopsias de tejido. En esta infección se pueden apreciar tanto las larvas filariformescomo las rabditiformes y se debe hacer el diferencial con larvas de uncinarias.Ocasionalmente se pueden apreciar hembras parasíticas y huevos en materiafecal.

La infección por Taenia, Hymenolepis o Dipylidium se diagnostica por presencia dehuevos en materia fecal, pero para Taenia también es útil la cinta de Graham yaque los proglótidos al salir activamente por el ano dejan un rastro de huevos en laregión perianal. Los huevos de Taenia se caracterizan por la presencia de una


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cubierta gruesa radiada (embrioforo) que en su interior contiene la oncosfera, consus típicos ganchos. Los huevos de Hymenolepis nana se caracterizan porpresentar una forma ligeramente ovalada, una pared delgada y filamentos polaresmientras que los de H. diminuta son algo más grandes y redondos y carecen defilamentos polares. Los huevos de Dipylidium se aprecian en paquetes conocidos

como cápsulas ovígeras, las cuales continenen entre 12 y 26 huevos. En todos loscasos se aprecia la oncosfera en el interior de los huevos.

Los huevos de Fasciola son ovalados, operculados y de color ámbar, mientras quelos de Paragonimus son mucho más pequeños, cafés, operculados y presentan unengrosamiento de su pared en el extremo contrario al opérculo.

Los gusanos adultos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y Enterobiusvermicularis presentan dimorfismo sexual, siendo las hembras más grandes quelos machos. Ascaris se caracteriza por su gran tamaño (hembras hasta 32 cm ymachos hasta 27 cm), su color entre crema y rosado y los machos por su extremoposterior curvo y la presencia de espículas. Los adultos de Trichuris presentan el

extremo anterior mucho más delgado que el posterior y los machos un grancurvamiento de su extremo caudal. Los adultos de Enterobius presentan aletascefálicas y el macho su extremo caudal curvo y espículas. En el caso de losadultos de uncinarias hay que identificar la presencia de placas cortantes ( Necator )o dientes ( Ancylostoma) en la cavidad oral, tanto en machos como hembras; losmachos además presentan la bursa copulatoria o copulatriz en el extremo caudal,la cual es característica de cada especia, y espículas. Los adultos de Toxocara seencuentran en el intestino de perros y gatos. Sus huevos al salir al ambiente seencuentran no embrionados y cuando embrionan se vuelven infectivos tanto parasu hospedero definitivo como para muchos otros vertebrados que sirven dehospederos paraténicos. Los gusanos se caracterizan por la presencia de aletascefálicas y labios en la región anterior y dimorfismo sexual, siendo las hembrasmás grandes que los machos (15 cm vs 8 cm).

Los proglótidos de Taenia en estado grávido presentan un útero con ramificacionesconspicuas, cuyo número varía entre T. solium (hasta 12 ramificaciones) y T.saginata (más de 12 ramificaciones). Los adultos de Fasciola presentan lasventosas oral y ventral (llamada también acetábulo), un intestino en forma deciegos ramificados, espinas en el cono cefálico y los órganos reproductoresmasculinos y femeninos.

2. Morfología microscópica de protozoos tisulares y hemáticos

HELMINTOS INTESTINALES Y TISULARES

Nombre: Paragonimus mexicanus Nombre: Schistosoma mansoni


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Nombre: Clonorchis sinensis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____

Técnica:

Nombre: Echinococcus sp¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Toxocara canis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

Nombre: Strongyloides stercoralis ¿Estadio?:¿Infectivo?: Si _____ No _____Técnica:

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